新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法
【課題】リグノセルロース系バイオマスから、高効率で糖化液を得るための手段を提供することを目的とする。
【解決手段】上記課題は、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物、好ましくは、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはＳ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）により解決される。
【解決手段】上記課題は、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物、好ましくは、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはＳ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）により解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、リグノセルロース系バイオマスから効率よく糖化液を製造することができる新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業革命以来、エネルギー資源として、石油、石炭、および天然ガスなどの化石燃料が大量に使用されてきた。その結果、今日、二酸化炭素などの温室効果ガスによる地球温暖化は、もはや一刻の猶予もないほど深刻化している。さらに、これまでの主要なエネルギー資源であった石油の可採年数が数十年との予測がされており、これらの化石燃料に取って代わる、地球に優しい新たなエネルギー資源の確保が急務となっている。
【０００３】
これらの問題の一つの解決策として、バイオマス（再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの）から燃料や、生分解性ポリマーなどの原料となる化成品を生産する、バイオリファイナリーの研究・開発が世界各地で進められている。
【０００４】
こうしたバイオリファイナリーの中でも、特に、バイオマスエタノール（以下、「バイオエタノール」とも称する）の生産は既に実用化されており、トウモロコシやサトウキビなどの可食部に含まれるデンプン質または糖質を用いたエタノール生産が、米国やブラジルなどで大規模に行われている。しかしながら、これらの食糧資源をバイオエタノールの原料とすることで、食糧価格の高騰や、発展途上国での深刻な食糧不足を引き起こすことが懸念されている。本発明者は、こうした状況を鑑みて、作物の非可食部である葉や茎など（ソフトバイオマス）、あるいは木材など（ハードバイオマス）に含まれるリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオリファイナリー技術の開発に取り組んできた。
【０００５】
一般に、バイオリファイナリーのプロセスは、（ｉ）バイオマスに含まれる多糖類を糖化（加水分解）することによって単糖類を含む糖化液を得る工程と、（ｉｉ）得られた糖化液に含まれる単糖類に、微生物または酵素を作用させることによって各種の有用化合物に変換する工程との２つの工程を含む。しかしながら、作物の葉や茎または木材のようなリグノセルロース系バイオマスは、構造性多糖であるセルロースに芳香族化合物の重合体であるリグニンおよびヘミセルロースが強固に結合する構造を有しており、デンプン質や糖質を主成分とするデンプン系バイオマスや糖質系バイオマスと比較して、加水分解反応の効率が著しく低いことが知られている。そこで、リグノセルロース系バイオマスを高効率で糖化するための前処理または加水分解反応に関する技術開発が進められている。
【０００６】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解法は、主に酸または塩基を用いる化学的加水分解法と、微生物等が生産する酵素（セルラーゼ）を用いる生物学的加水分解法の２種に大別される。後者の生物学的加水分解法によると、温和な条件で、発酵阻害物質が少ない高濃度の糖化液を得ることができる。そこで、より高活性なセルラーゼを産生する微生物の探索が進められている。
【０００７】
例えば、特許文献１ではリグノセルロース系バイオマスに含まれる結晶性セルロースに対して高い加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）および該微生物の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１６６８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記特許文献１に記載のトリコデルマ・リーゼイを用いても、糖化効率が未だ不十分であり、さらなる改良が望まれているのが現状である。
【００１０】
そこで本発明は、高効率で糖化液を得るための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を用いることによってリグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酵素活性および安定性に対する温度の影響を表すグラフである。
【図２】酵素活性および安定性に対するｐＨの影響を表すグラフである。
【図３】稲わらの糖化反応における反応溶液中の全糖量、グルコース量、キシロース量、および糖化率の経時変化を表すグラフである。
【図４】稲わら糖化液中でのリゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養における、全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を表すグラフである。
【図５】コーンコブの糖化反応における反応溶液中の全糖量およびグルコース量の経時変化を表すグラフである。
【図６】コーンコブ糖化液中でのリゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養における、全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好ましい形態を説明する。なお、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。
【００１６】
＜微生物＞
本形態の微生物は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属し、リグノセルロース系バイオマス分解能を有する微生物である。該微生物はリグノセルロース系バイオマスの分解活性に優れるため、リグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造することができる。このようなペニシリウム属に属する微生物のうち、本発明者によって新たに見出されたペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）であることが好ましい。なお、本明細書において、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１を略して「菌株Ｍ１」と、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２を略して「菌株Ｍ２」と、それぞれ称する場合がある。以下で、菌株Ｍ１および菌株Ｍ２について説明する。
【００１７】
［１次スクリーニング］
中国東北部で生産されたトウモロコシのコーンコブを入手した。該コーンコブの表面の一部にはカビが観察された。該コーンコブを室温で約２ヵ月間風乾し、金切ばさみで１〜５ｃｍ程度に切断した。そして、これを家庭用ミキサーに５分間かけることにより粗粉砕した。該粗粉砕物をさらにボールミル（ＡＮＳ−６０Ｓ、日陶科学社製）を用いて微粉化した。得られたコーンコブ粉砕物の粒径分布を下記表１に示す。なお、本明細書において「粒径」とは、粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離を意味する。また、粒径の値は、試験用ふるいによって測定した値を採用する。下記表１の各粒径における粉砕物の割合の求め方は以下のとおりである。まず、３種類の試験用ふるい（呼び寸法０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．７ｍｍ；ＳＡＮＰＯ社製）を呼び寸法が小さいものが下になるように順次重ね、最上部のふるいに上記粉砕物５ｇを入れた。これを間欠的に５分間ふるい、それぞれのふるいに残存した粉砕物の質量を測定し、それぞれの割合を求めた。
【００１８】
【表１】
【００１９】
該コーンコブ粉砕物のうち、粒径が１．０ｍｍ未満の粉砕物１ｇを試験管に取り、滅菌水道水１０ｍｌを加えて懸濁し、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで７日間振盪培養した。培養後の各試験管中の培養液を一部サンプリングし、培養液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により分析して、全糖量が特に多かった培養液を選定した。全糖量が多かった培養液では、コーンコブに付着した微生物が、コーンコブに含まれるリグノセルロースを効率よく糖化したものと考えられた。なお、本明細書において、フェノール硫酸法による分析は、中村道徳編、貝沼圭二編、「生物化学実験法（２５）澱粉・関連糖質酵素実験法」、学会出版センター版、１９８９年１０月発行、２０６頁に記載の方法に準じて行った。
【００２０】
［１次スクリーニングした菌の単胞子分離］
上記で選定した培養液を滅菌水で適当に希釈し、下記表２に示す組成のＰＤＹ寒天培地（オートクレーブにて１２１℃、２０分間滅菌）に塗布し、３２℃のインキュベーター中でプレート培養した。培養開始から１４日後に培地上にコロニーの形成が認められた。このうち、明らかにカビ以外の微生物であると思われるコロニーを除外し、カビ状でかつ形状が大きなコロニーを選別した。
【００２１】
【表２】
【００２２】
［２次スクリーニング］
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表３に示す組成のＡ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ａ培地に上記１次スクリーニングで選定した菌株を１白金耳接種した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した。
【００２３】
【表３】
【００２４】
次に、２００ｍｌ三角フラスコに下記表４に示す組成のＢ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｂ培地に、上記で培養した前培養液を５（ｖ／ｖ）％植菌した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで６日間振盪培養した。
【００２５】
【表４】
【００２６】
（本培養）
上記１次スクリーニングで調製した粒径が１．０ｍｍ未満のコーンコブ粉砕物０．２ｇを、上記培養液のろ液を適当に水道水で希釈した希釈培養液２０ｍｌに懸濁し、５０℃で３日間糖化を行った。得られた糖化液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により分析し、全糖量が多かった糖化液に対応した２菌株を、リグノセルロース系バイオマスの糖化力に優れている菌株として選定した。これらをそれぞれ菌株Ｉおよび菌株ＩＩと称した。
【００２７】
［分類学的性質］
上記でスクリーニングした菌株Ｉおよび菌株ＩＩの分類学的性質を以下で述べる。
【００２８】
（１）菌株Ｉ
（ａ）形態的性質
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）培地において、２５℃で３週間培養後のコロニーの形態を観察した。なお、以下の表５〜８において、色調の括弧内の英数文字は「Ｋｏｒｎｅｒｕｐ ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）」で用いられている色のコード ナンバーを表す。
【００２９】
（ｉ）ポテトデキストロース寒天培地（商品名：ダイゴ、日本製薬社製）
【００３０】
【表５】
【００３１】
（ｉｉ）２％ 麦芽寒天培地（Ｍａｌｔ Ａｇａｒ）
【００３２】
【表６】
【００３３】
（ｉｉｉ）バクトオートミール寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ、ベクトン ディッキンソン社製）
【００３４】
【表７】
【００３５】
（ｉｖ）ＬＣＡ（三浦培地）
【００３６】
【表８】
【００３７】
その他の微視的観察結果を表９に示す。
【００３８】
【表９】
【００３９】
（ｂ）同定
アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、菌株Ｉの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｃｕｌｅａｔｕｍの塩基配列と９９．５％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株Ｉの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦ（この菌種名の「ｃｆ．」は、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに類似する菌株であることを表す）、Ｐ． ａｃｕｌｅａｔｕｍ、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍの塩基配列と高い相同率を示した。アポロンＤＢ−ＦＵおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦと同一の系統枝を形成した。
【００４０】
菌株ＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、子嚢菌類の一種である、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ の塩基配列と９８．８％の相同率を示した。また、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｐ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍの塩基配列と１００％の相同率を示した。国際塩基配列データベースおよびアポロンＤＢ−ＦＵに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍと同一の系統枝を形成した。
【００４１】
したがって、２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果から、菌株ＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに近縁であるものの、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の解析で本検体と同一系統枝を形成した２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列のデータが登録されてないことから、本検体の種レベルの推定は困難であると思われた。よって、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の一種であると考えられた。なお、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍとＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍとは、分類学的に非常に近縁であることが知られている。
【００４２】
コロニー性状および形態観察の結果、菌株Ｉは赤褐色〜茶褐色系のコロニーを形成し、培地中に顕著な赤色系の可溶性色素を産出した。また、有隔壁の栄養菌糸のみの形成が観察された。今回の観察結果では、胞子などの生殖器官の形成が観察されなかったことから、分類群の推定はできなかった。なお、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析結果より菌株Ｉと近縁を推定されるＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍはまれに赤色系の色素を産出することが知られている。
【００４３】
以上の２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２およびＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析、ならびにコロニー性状および形態観察の結果から総合的に鑑みて、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に帰属する新規な菌であると判断し、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１）と命名した。
【００４４】
なお、本菌株は、２００８年１２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３として、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１の名称で寄託されている。
【００４５】
（２）菌株ＩＩ
（ａ）形態的性質
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）培地において、２５℃で３週間培養後のコロニーの形態を観察した。なお、以下の表１０〜１３において、色調の括弧内の英数文字は「Ｋｏｒｎｅｒｕｐ ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）」で用いられている色のコード ナンバーを表す。
【００４６】
（ｉ）ポテトデキストロース寒天培地（商品名：ダイゴ、日本製薬社製）
【００４７】
【表１０】
【００４８】
（ｉｉ）２％ 麦芽寒天培地（Ｍａｌｔ Ａｇａｒ）
【００４９】
【表１１】
【００５０】
（ｉｉｉ）バクトオートミール寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ、ベクトン ディッキンソン社製）
【００５１】
【表１２】
【００５２】
（ｉｖ）ＬＣＡ（三浦培地）
【００５３】
【表１３】
【００５４】
その他の微視的観察結果を表１４に示す。
【００５５】
【表１４】
【００５６】
（ｂ）同定
アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、菌株ＩＩの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｃｕｌｅａｔｕｍの塩基配列と９９．５％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩＩの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦ（この菌種名の「ｃｆ．」は、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに類似する菌株であることを表す）、Ｐ． ａｃｕｌｅａｔｕｍ、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍの塩基配列と高い相同率を示した。アポロンＤＢ−ＦＵおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦと同一の系統枝を形成した。
【００５７】
菌株ＩＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、子嚢菌類の一種である、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ の塩基配列と９８．８％の相同率を示した。また、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｐ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍの塩基配列と１００％の相同率を示した。国際塩基配列データベースおよびアポロンＤＢ−ＦＵに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍと同一の系統枝を形成した。
【００５８】
したがって、２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果から、菌株ＩＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに近縁であるものの、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の解析で本検体と同一系統枝を形成した２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列のデータが登録されてないことから、本検体の種レベルの推定は困難であると思われた。よって、菌株ＩＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の一種であると考えられた。なお、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍとＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍとは、分類学的に非常に近縁であることが知られている。
【００５９】
コロニー性状および形態観察の結果、菌株ＩＩは白色〜赤黄色系のコロニーを形成し、有隔壁の栄養菌糸のみの形成が観察された。今回の観察結果では、胞子などの生殖器官の形成が観察されなかったことから、分類群の推定はできなかった。上述の菌株Ｉのコロニー性状とは顕著な違いが認められたが、菌糸の形状において差異は認められなかった。
【００６０】
以上の２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２およびＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析、ならびにコロニー性状および形態観察の結果から総合的に鑑みて、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に帰属する新規な菌であると判断し、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２）と命名した。
【００６１】
なお、本菌株は、２００８年１２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４として、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２の名称で寄託されている。
【００６２】
また、本発明の微生物として、より好ましくは、より高効率で糖化液を得られるよう、菌株Ｍ１または菌株Ｍ２に公知の変異処理を施すことによって得られた変異株であることが好ましい。変異処理の方法は、特に制限はないが、例えば、紫外線照射やニトロソグアニジンなどの変異誘発剤を使用することによって変異誘導処理する方法が挙げられる。そして、変異処理を施した菌株から、リグノセルロース系バイオマスの分解活性に優れる菌株を選定する。
【００６３】
＜酵素＞
本発明の他の形態としては、上述の微生物に由来する酵素が挙げられる。該酵素は、リグノセルロース系バイオマスに対して優れた加水分解活性能を有するので、該酵素をリグノセルロース系バイオマスに作用させることにより高効率で糖化液を製造することができる。
【００６４】
本形態の酵素は、上述の微生物の培養物から、従来公知の酵素採取手段および精製手段を用いて調製することができる。酵素採取法としては、例えば、微生物を含む培養物を遠心分離またはろ過することによって、菌体とろ液とを分離する。そして、該菌体およびろ液から、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法（メタノール、エタノール、アセトン、およびイソプロパノールなど）によりタンパク質である酵素を沈殿させたり、限外ろ過により濃縮したりする方法が挙げられる。
【００６５】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解には、上記の方法によって得られる粗酵素を用いてもよいが、必要によりさらに精製した酵素を用いることもできる。酵素の精製法としては、例えば、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを単独で、または２種以上を組み合わせた精製法が挙げられる。
【００６６】
＜糖化液の製造方法＞
本発明の他の形態にかかる糖化液の製造方法は、上述の本発明の微生物をリグノセルロース系バイオマスを含む培地中で培養する工程、または上述の本発明の酵素をリグノセルロース系バイオマスに作用させることにより加水分解する工程を含む。
【００６７】
本形態の糖化液の製造方法で用いるリグノセルロース系バイオマスは、セルロースおよびヘミセルロース、ならびにリグニンを含む有機資源であれば植物性でも動物性でも特に制限はなく、農作物、草木類、および海藻類、ならびにこれらの処理物または廃棄物などが含まれる。より具体的には、稲わら、籾殻、麦わら、ふすま、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、コットン、ラミー、ケナフ、ビート、大豆粕、コーヒー粕、雑草、木材、竹、バクテリアセルロース、パルプ、紙、セルロース粉末、結晶セルロース、レーヨン、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース、およびカルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。なお、本発明の微生物または酵素は、上記リグノセルロース系バイオマスの糖化能に優れるだけでなく、でんぷん系バイオマスまたは糖質系バイオマスに対しても優れた糖化能を示す。
【００６８】
上記リグノセルロース系バイオマスは、微生物の培養または酵素による加水分解に供する前に、糖化効率を高めるための前処理を行うことが好ましい。前処理としては、例えば、脱水処理または乾燥処理、粉砕処理、および蒸煮処理などの従来公知の技術を適宜採用することができる。特に、稲わら、麦わら、とうもろこしの茎葉、コーンコブなどの農作物の非可食部などのリグノセルロース系バイオマスを用いる場合は、まず、風乾によりバイオマス中に含まれる水分を除く。その後、切断装置や粉砕装置を用いて、好ましくは１．０ｍｍ以下であり、より好ましくは０．０１〜１．０ｍｍであり、さらに好ましくは０．１〜１．０ｍｍの粉末状とすることが好ましい。
【００６９】
上記リグノセルロース系バイオマスは、微生物の培養または酵素による加水分解に供するために、水性媒体に懸濁して用いる。水性媒体は微生物の増殖または酵素反応の進行が可能な範囲においては特に制限はないが、水、緩衝液、酸性水溶液、またはアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の濃度は、水性媒体に対して、通常、５０〜３００ｇ／Ｌであり、好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。
【００７０】
上述の本発明の微生物を用いて糖化液を製造する場合、本発明の微生物は、上記懸濁液のみを培地とした場合であっても、十分な増殖能力を有するが、必要によっては炭素源、窒素源、または無機物などを懸濁液に補充したものを培地として用いることも可能である。これらの栄養源は、微生物の数を増やすための前培養の培地に添加してもよいし、本培養の培地に添加しても構わない。
【００７１】
炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロースなどの単糖、マルトース、ラクトース、およびスクロースなどの二糖、グリセリンおよびキシリトールなどの糖アルコールといった糖類が挙げられ、これらを単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。特に、前培養の培地の培地にグルコースを添加することにより、本培養のときの微生物のリグノセルロース系バイオマスの分解活性をより向上させることができる。
【００７２】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、あるいは尿酸などの無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。さらに、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）などの窒素含有天然物を使用してもよい。これらのうち、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、尿酸などの無機あるいは有機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなの窒素含有天然物が好ましい。これらの窒素源は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの窒素源のうち、大豆粉末またはコーンスティープリカーを使用することが好ましい。
【００７３】
無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウムなどの、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄および亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩などが用いられる。そのほか、チアミン、ビオチンなどのビタミン類、さらに必要に応じて、アデニン、ウラシルなどの核酸関連物質が使用されてもよい。これらの無機物は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００７４】
微生物の培養方法は、本発明の微生物の増殖が実質的に阻害されず、リグノセルロース系バイオマスから単糖類を生産可能な範囲であれば、特に制限なく当業者によって適宜調整されうるが、培養温度は、通常２０〜５０℃であり、好ましくは２８〜３７℃である。また、培地のｐＨは、通常３〜９であり、好ましくは４〜７である。培養前または培養中にｐＨが４未満となる場合は、アンモニアなどを用いてｐＨ制御を行うことが好ましい。本発明の微生物を培養する場合は、一定量の酸素を供給することが必要である。供給方法は、特に制限はないが、フラスコ培養の場合は回転振盪による攪拌、バイオリアクターを用いる培養の場合は通気攪拌をすることによって培地に酸素を供給する。
【００７５】
一方、本発明の酵素を用いた加水分解反応は、リグノセルロース系バイオマスを含む懸濁液中に酵素を添加し、懸濁液を攪拌下、インキュベートすることによって行われうる。懸濁液に添加する酵素量は、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の質量に対して、好ましくは０．１〜３質量％、より好ましくは１〜２質量％である。かような量の酵素を用いることによって、通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間で加水分解反応が完了しうる。また、加水分解条件は、用いる酵素の至適条件を用いることが好ましい。ｐＨは通常３〜６であり、好ましくは３．５〜５である。また、反応温度は通常３０〜６０℃であり、好ましくは４０〜６０℃である。
【００７６】
微生物の培養、または酵素による加水分解により得られた糖化液は、糖化液中の不溶物を適宜ろ過してもよいし、そのままの状態で、微生物代謝産物（エタノール、乳酸などの有用化合物）を産生する他の微生物の培養に供しても構わない。撹拌効率および収率向上の観点の観点からは、糖化液中の不溶物を予めろ過することが好ましい。
【００７７】
他の微生物としては、特に制限はないが、例えば、乳酸を産生するＲｉｚｏｐｕｓ属、イタコン酸を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、エタノールを産生するＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、フマル酸を産生するＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、リンゴ酸を産生するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、ピルビン酸を産生するＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ、キシリトールを産生するＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓが挙げられる。本発明によって得られる糖化液を含む倍中でこれらの微生物を培養することによって、燃料や化成品を工業的規模で製造するが可能である。
【実施例】
【００７８】
本発明の作用効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００７９】
＜菌株Ｍ１および菌株Ｍ２の稲わら分解活性の評価＞
［実施例１］
１．生産菌の培養
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表１５に示す組成のＣ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｃ培地に菌株Ｍ１および菌株Ｍ２をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した（混合培養）。
【００８０】
【表１５】
【００８１】
(本培養)
次に、下記表１６の組成を有する各培地を調製した。下記表１６において、対象なる成分が含まれている場合を「○」であらわし、含まれていない場合を「×」で表す。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
なお、上記表１６における稲わらは、粒径が１．０ｍｍ未満の粉砕物を用いた。稲わらの粉砕方法は以下のとおりである。稲わらを室温で約２ヵ月間風乾し、金切ばさみで１〜５ｃｍ程度に切断した。そして、これを家庭用ミキサーに５分間かけることにより粗粉砕した。該粗粉砕物をさらにボールミル（ＡＮＳ−６０Ｓ、日陶科学社製）を用いて微粉化し、稲わら粉砕物を得た。
【００８４】
次に、上記の培地１〜６を２００ｍｌ三角フラスコにそれぞれ２０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該培地１〜６に、上記前培養液を７（ｖ／ｖ）％植菌した。これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで６日間振盪培養した。
【００８５】
２．稲わら分解活性の評価（糖化）
上述の方法で得た粒径が１．０ｍｍ未満の稲わら粉砕物２ｇを水道水９ｍｌに懸濁した。該懸濁液に、上記培地１〜６で培養した培養液、またはそのろ液を希釈した酵素液１ｍｌを加え、５０℃で２４時間糖化した。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、稲わら分解活性を下記式（１）より算出した。なお、酵素活性は１［Ｕ］は、（１／６０）［μｋａｔ］に相当する。
【００８６】
【数１】
【００８７】
［比較例１］
菌株Ｍ１および菌株Ｍ２に変えて、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＢＲＣ３１３２９を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で稲わら分解活性を求めた。
【００８８】
結果を下記表１７に示す。
【００８９】
【表１７】
【００９０】
表１７の結果より、本発明の菌株Ｍ１およびＭ２は、従来優れたセルラーゼ産生菌として知られるトリコデルマ・リーゼイ ＮＢＲＣ３１３２９よりも顕著な稲わら分解活性能を有することが示された。
【００９１】
また、前培養の培地に、窒素源として大豆粉を、炭素源としてグルコースを添加することにより、本培養のときの微生物の増殖を促進し、微生物のリグノセルロース系バイオマスの分解活性をより向上させることができることが示された。
【００９２】
＜酵素活性の評価＞
［実施例２］
１．酵素の調製
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表１８に示す組成のＤ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｄ培地に菌株Ｍ１および菌株Ｍ２をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した（混合培養）。
【００９３】
【表１８】
【００９４】
（本培養）
次に、３Ｌジャーファーメンター（３ＭＤＬ型、丸菱バイオエンジ社製）に下記表１９に示す組成のＥ培地１．５Ｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｂ培地に、上記で培養したＤ培地を７（ｖ／ｖ）％植菌した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数６００ｐｐｍ、通気量２ｖｖｍで６日間培養した。
【００９５】
【表１９】
【００９６】
上記の６日間の培養中、培養開始から０（培養開始直後）、２４、４８、７２、および８４時間後の培養液を１ｍｌ取り出し、上記実施例１の３．稲わら分解活性の評価と同様の方法で、各時間の培養液の稲わら分解活性を評価した。結果を下記表２０に示す。
【００９７】
【表２０】
【００９８】
６日間培養後の培養液をろ過し、ケーキ（残渣）を水洗した。ろ液とケーキの水洗液とをあわせて濃縮乾固した。次に、この濃縮乾固物を５℃の冷水２００ｍｌに溶解し、不溶分をろ別した後、これにアセトンを１０００ｍｌ加えて、アセトン沈殿物を得た。そして、これを凍結乾燥して酵素（「酵素Ｍ１Ｍ２」と称する）を得た。なお、上記の各工程で得られた生成物の収量、酵素活性または比活性、総活性、および収率を下記表２１に示す。なお、酵素活性は上記実施例１の分解活性の評価と同様の方法を用いて測定した。
【００９９】
【表２１】
【０１００】
２．酵素化学的性質の評価
（安定性に対する温度の影響）
０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）９ｍｌに、上記で得た酵素Ｍ１Ｍ２１ｇを溶解したものを酵素溶液とした。ふた付試験管に該酵素溶液１ｍｌと、上記酢酸バッファー９ｍｌとを入れ、それぞれ所定の温度で１０時間振盪した後、試験管を５℃に冷却した。ついで、この試験管に上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えた１０℃における分解活性に対する、それぞれの温度における活性を百分率で表した。結果を図１に示す。
【０１０１】
（糖化活性に対する温度の影響）
ふた付試験管に、上記酵素溶液１ｍｌと、上記酢酸バッファー９ｍｌとを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、所定の温度で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えた５５℃における分解活性に対する、それぞれの温度における活性を百分率で表した。結果を図１に示す。
【０１０２】
（安定性に対するｐＨの影響）
ふた付試験管に上記酵素溶液１ｍｌと、それぞれ所定のｐＨに調整した０．０５Ｍ酢酸バッファー９ｍｌを入れ、５０℃で１０時間振盪した後、試験管を５℃に冷却した。ついで、この試験管に上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えたｐＨ３．７における分解活性に対する、それぞれのｐＨにおける活性を百分率で表した。結果を図２に示す。
【０１０３】
（糖化活性に対する温度の影響）
ふた付試験管に、上記酵素溶液１ｍｌと、それぞれ所定のｐＨに調整した０．０５Ｍ酢酸バッファー９ｍｌを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えたｐＨ４．５における分解活性に対する、それぞれのｐＨにおける活性を百分率で表した。結果を図２に示す。
【０１０４】
［実施例３］
Ｄ培地に接種した微生物を菌株Ｍ１のみとしたことを除いては、実施例２と同様の方法で酵素を調製した。得られた酵素を「酵素Ｍ１」と称する。そして、実施例２と同様の方法で酵素Ｍ１の比活性を測定した。
【０１０５】
［実施例４］
Ｄ培地に接種した微生物を菌株Ｍ２のみとしたことを除いては、実施例２と同様の方法で酵素を調製した。得られた酵素を「酵素Ｍ２」と称する。そして、実施例２と同様の方法で酵素Ｍ２の比活性を測定した。
【０１０６】
［比較例２］
アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０７】
［比較例３］
メイセラーゼ（明治製菓社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０８】
［比較例４］
スミチーム（新日本化学工業社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０９】
酵素の比活性の結果を下記表２２に示す。
【０１１０】
【表２２】
【０１１１】
表２２の結果より、本発明の酵素Ｍ１Ｍ２、酵素Ｍ１、および酵素Ｍ２は、従来のセルラーゼよりも優れた稲わら分解活性を有することが示された。
【０１１２】
＜酵素Ｍ１Ｍ２を用いた稲わら糖化液の製造、および該糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例５］
３Ｌジャーファーメンター（ＭＤＬ−３型、丸菱バイオエンジ社製）に水道水１．０Ｌを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）２００ｇを懸濁し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした。該懸濁液のｐＨを、２５％塩酸を用いて４．５に調整した。そして、実施例２で得た酵素Ｍ１Ｍ２を２０Ｕ／ｍｌとなるように添加し、５０℃で攪拌（２００ｒｐｍ）下、７２時間糖化反応を行った。反応液中の全糖量、グルコース量、キシロース量、および糖化率の経時変化を図３に示す。
【０１１３】
得られた糖化液を３Ｌジャーファーメンターに仕込み、これにリン酸一カリウムを０．３（ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウムを０．２５（ｇ／Ｌ）となるように添加した。該糖化液をオートクレーブを用いて１２１℃で１０分間滅菌した。次に、予め３００ｍｌ三角フラスコで前培養したリゾプス エスピー（Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養液１００ｍｌを添加し、回転数３００ｒｐｍ、通器量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃で７２時間培養した。培養中、２５％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを６．０に制御した。全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を図４に示す。リゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養により、全糖９０ｇ／Ｌから４２ｇ／ＬのＬ−乳酸が得られた。また、稲わら粉末からのＬ−乳酸の収率は２１（ｗ／ｗ）％であった。
【０１１４】
＜酵素Ｍ１Ｍ２を用いたコーンコブ糖化液の製造、および該糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例６］
稲わら粉末に変えて、上述の［１次スクリーニング］で調製したコーンコブ粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を用い、糖化時間を４８時間、Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養時間を９６時間としたことを除いては、実施例５と同様の方法で、Ｌ−乳酸を生産した。糖化反応液中の全糖量、グルコース量の経時変化を図５に示す。また、Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養液中の全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を図６に示す。Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養により、全糖１０２ｇ／Ｌから４６ｇ／ＬのＬ−乳酸が得られた。また、コーンコブ粉末からのＬ−乳酸の収率は２１（ｗ／ｗ）％であった。
【０１１５】
＜稲わら糖化液を用いたエタノールの製造＞
硫酸玉つきガラス管を備えた１００ｍｌ三角フラスコに、実施例５と同様の方法で製造した稲わら糖化液および下記表２３に示す添加物を加えた培養液２０ｍｌを準備した。これにパン酵母（オリエンタルドライイースト、オリエンタル酵母工業社製）０．５ｇを加え、３０℃で静置培養を行った。経時的にフラスコ全体の重量を測定し、その重量の減少量を下記式（２）にあてはめ、各培養時間後のエタノール量を算出した。下記式（２）において、フラスコの重量の減少量はエタノール発酵による炭酸ガス発生量（ｇ）を意味する。アルコール発酵により、グルコース１モルからエタノール２モルと炭酸ガス（ＣＯ２
）２モルが生産されることから、炭酸ガス発生量（ｇ）に１．０４７（４６．０６８／４４．００９５）を乗じて得られる値が、エタノール量（ｇ）となる。そして、培養開始前の糖化液中のグルコース量に対するエタノール量を百分率で表し、各培養時間におけるエタノール収率（％）とした。結果を下記表２３に示す。
【０１１６】
【数２】
【０１１７】
【表２３】
【０１１８】
表２３の結果より、本発明の酵素Ｍ１Ｍ２を用いて製造された糖化液は、酵母エキス、乾燥酵母、尿素、硫安などの窒素源を補填することのなく、４６％の高収率でエタノールを製造できることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、リグノセルロース系バイオマスから効率よく糖化液を製造することができる新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業革命以来、エネルギー資源として、石油、石炭、および天然ガスなどの化石燃料が大量に使用されてきた。その結果、今日、二酸化炭素などの温室効果ガスによる地球温暖化は、もはや一刻の猶予もないほど深刻化している。さらに、これまでの主要なエネルギー資源であった石油の可採年数が数十年との予測がされており、これらの化石燃料に取って代わる、地球に優しい新たなエネルギー資源の確保が急務となっている。
【０００３】
これらの問題の一つの解決策として、バイオマス（再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの）から燃料や、生分解性ポリマーなどの原料となる化成品を生産する、バイオリファイナリーの研究・開発が世界各地で進められている。
【０００４】
こうしたバイオリファイナリーの中でも、特に、バイオマスエタノール（以下、「バイオエタノール」とも称する）の生産は既に実用化されており、トウモロコシやサトウキビなどの可食部に含まれるデンプン質または糖質を用いたエタノール生産が、米国やブラジルなどで大規模に行われている。しかしながら、これらの食糧資源をバイオエタノールの原料とすることで、食糧価格の高騰や、発展途上国での深刻な食糧不足を引き起こすことが懸念されている。本発明者は、こうした状況を鑑みて、作物の非可食部である葉や茎など（ソフトバイオマス）、あるいは木材など（ハードバイオマス）に含まれるリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオリファイナリー技術の開発に取り組んできた。
【０００５】
一般に、バイオリファイナリーのプロセスは、（ｉ）バイオマスに含まれる多糖類を糖化（加水分解）することによって単糖類を含む糖化液を得る工程と、（ｉｉ）得られた糖化液に含まれる単糖類に、微生物または酵素を作用させることによって各種の有用化合物に変換する工程との２つの工程を含む。しかしながら、作物の葉や茎または木材のようなリグノセルロース系バイオマスは、構造性多糖であるセルロースに芳香族化合物の重合体であるリグニンおよびヘミセルロースが強固に結合する構造を有しており、デンプン質や糖質を主成分とするデンプン系バイオマスや糖質系バイオマスと比較して、加水分解反応の効率が著しく低いことが知られている。そこで、リグノセルロース系バイオマスを高効率で糖化するための前処理または加水分解反応に関する技術開発が進められている。
【０００６】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解法は、主に酸または塩基を用いる化学的加水分解法と、微生物等が生産する酵素（セルラーゼ）を用いる生物学的加水分解法の２種に大別される。後者の生物学的加水分解法によると、温和な条件で、発酵阻害物質が少ない高濃度の糖化液を得ることができる。そこで、より高活性なセルラーゼを産生する微生物の探索が進められている。
【０００７】
例えば、特許文献１ではリグノセルロース系バイオマスに含まれる結晶性セルロースに対して高い加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）および該微生物の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１６６８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記特許文献１に記載のトリコデルマ・リーゼイを用いても、糖化効率が未だ不十分であり、さらなる改良が望まれているのが現状である。
【００１０】
そこで本発明は、高効率で糖化液を得るための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物を用いることによってリグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酵素活性および安定性に対する温度の影響を表すグラフである。
【図２】酵素活性および安定性に対するｐＨの影響を表すグラフである。
【図３】稲わらの糖化反応における反応溶液中の全糖量、グルコース量、キシロース量、および糖化率の経時変化を表すグラフである。
【図４】稲わら糖化液中でのリゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養における、全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を表すグラフである。
【図５】コーンコブの糖化反応における反応溶液中の全糖量およびグルコース量の経時変化を表すグラフである。
【図６】コーンコブ糖化液中でのリゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養における、全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好ましい形態を説明する。なお、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。
【００１６】
＜微生物＞
本形態の微生物は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属し、リグノセルロース系バイオマス分解能を有する微生物である。該微生物はリグノセルロース系バイオマスの分解活性に優れるため、リグノセルロース系バイオマスから高効率で糖化液を製造することができる。このようなペニシリウム属に属する微生物のうち、本発明者によって新たに見出されたペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）であることが好ましい。なお、本明細書において、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１を略して「菌株Ｍ１」と、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２を略して「菌株Ｍ２」と、それぞれ称する場合がある。以下で、菌株Ｍ１および菌株Ｍ２について説明する。
【００１７】
［１次スクリーニング］
中国東北部で生産されたトウモロコシのコーンコブを入手した。該コーンコブの表面の一部にはカビが観察された。該コーンコブを室温で約２ヵ月間風乾し、金切ばさみで１〜５ｃｍ程度に切断した。そして、これを家庭用ミキサーに５分間かけることにより粗粉砕した。該粗粉砕物をさらにボールミル（ＡＮＳ−６０Ｓ、日陶科学社製）を用いて微粉化した。得られたコーンコブ粉砕物の粒径分布を下記表１に示す。なお、本明細書において「粒径」とは、粒子の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の距離を意味する。また、粒径の値は、試験用ふるいによって測定した値を採用する。下記表１の各粒径における粉砕物の割合の求め方は以下のとおりである。まず、３種類の試験用ふるい（呼び寸法０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．７ｍｍ；ＳＡＮＰＯ社製）を呼び寸法が小さいものが下になるように順次重ね、最上部のふるいに上記粉砕物５ｇを入れた。これを間欠的に５分間ふるい、それぞれのふるいに残存した粉砕物の質量を測定し、それぞれの割合を求めた。
【００１８】
【表１】
【００１９】
該コーンコブ粉砕物のうち、粒径が１．０ｍｍ未満の粉砕物１ｇを試験管に取り、滅菌水道水１０ｍｌを加えて懸濁し、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで７日間振盪培養した。培養後の各試験管中の培養液を一部サンプリングし、培養液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により分析して、全糖量が特に多かった培養液を選定した。全糖量が多かった培養液では、コーンコブに付着した微生物が、コーンコブに含まれるリグノセルロースを効率よく糖化したものと考えられた。なお、本明細書において、フェノール硫酸法による分析は、中村道徳編、貝沼圭二編、「生物化学実験法（２５）澱粉・関連糖質酵素実験法」、学会出版センター版、１９８９年１０月発行、２０６頁に記載の方法に準じて行った。
【００２０】
［１次スクリーニングした菌の単胞子分離］
上記で選定した培養液を滅菌水で適当に希釈し、下記表２に示す組成のＰＤＹ寒天培地（オートクレーブにて１２１℃、２０分間滅菌）に塗布し、３２℃のインキュベーター中でプレート培養した。培養開始から１４日後に培地上にコロニーの形成が認められた。このうち、明らかにカビ以外の微生物であると思われるコロニーを除外し、カビ状でかつ形状が大きなコロニーを選別した。
【００２１】
【表２】
【００２２】
［２次スクリーニング］
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表３に示す組成のＡ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ａ培地に上記１次スクリーニングで選定した菌株を１白金耳接種した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した。
【００２３】
【表３】
【００２４】
次に、２００ｍｌ三角フラスコに下記表４に示す組成のＢ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｂ培地に、上記で培養した前培養液を５（ｖ／ｖ）％植菌した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで６日間振盪培養した。
【００２５】
【表４】
【００２６】
（本培養）
上記１次スクリーニングで調製した粒径が１．０ｍｍ未満のコーンコブ粉砕物０．２ｇを、上記培養液のろ液を適当に水道水で希釈した希釈培養液２０ｍｌに懸濁し、５０℃で３日間糖化を行った。得られた糖化液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により分析し、全糖量が多かった糖化液に対応した２菌株を、リグノセルロース系バイオマスの糖化力に優れている菌株として選定した。これらをそれぞれ菌株Ｉおよび菌株ＩＩと称した。
【００２７】
［分類学的性質］
上記でスクリーニングした菌株Ｉおよび菌株ＩＩの分類学的性質を以下で述べる。
【００２８】
（１）菌株Ｉ
（ａ）形態的性質
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）培地において、２５℃で３週間培養後のコロニーの形態を観察した。なお、以下の表５〜８において、色調の括弧内の英数文字は「Ｋｏｒｎｅｒｕｐ ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）」で用いられている色のコード ナンバーを表す。
【００２９】
（ｉ）ポテトデキストロース寒天培地（商品名：ダイゴ、日本製薬社製）
【００３０】
【表５】
【００３１】
（ｉｉ）２％ 麦芽寒天培地（Ｍａｌｔ Ａｇａｒ）
【００３２】
【表６】
【００３３】
（ｉｉｉ）バクトオートミール寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ、ベクトン ディッキンソン社製）
【００３４】
【表７】
【００３５】
（ｉｖ）ＬＣＡ（三浦培地）
【００３６】
【表８】
【００３７】
その他の微視的観察結果を表９に示す。
【００３８】
【表９】
【００３９】
（ｂ）同定
アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、菌株Ｉの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｃｕｌｅａｔｕｍの塩基配列と９９．５％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株Ｉの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦ（この菌種名の「ｃｆ．」は、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに類似する菌株であることを表す）、Ｐ． ａｃｕｌｅａｔｕｍ、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍの塩基配列と高い相同率を示した。アポロンＤＢ−ＦＵおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦと同一の系統枝を形成した。
【００４０】
菌株ＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、子嚢菌類の一種である、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ の塩基配列と９８．８％の相同率を示した。また、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｐ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍの塩基配列と１００％の相同率を示した。国際塩基配列データベースおよびアポロンＤＢ−ＦＵに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍと同一の系統枝を形成した。
【００４１】
したがって、２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果から、菌株ＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに近縁であるものの、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の解析で本検体と同一系統枝を形成した２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列のデータが登録されてないことから、本検体の種レベルの推定は困難であると思われた。よって、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の一種であると考えられた。なお、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍとＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍとは、分類学的に非常に近縁であることが知られている。
【００４２】
コロニー性状および形態観察の結果、菌株Ｉは赤褐色〜茶褐色系のコロニーを形成し、培地中に顕著な赤色系の可溶性色素を産出した。また、有隔壁の栄養菌糸のみの形成が観察された。今回の観察結果では、胞子などの生殖器官の形成が観察されなかったことから、分類群の推定はできなかった。なお、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析結果より菌株Ｉと近縁を推定されるＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍはまれに赤色系の色素を産出することが知られている。
【００４３】
以上の２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２およびＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析、ならびにコロニー性状および形態観察の結果から総合的に鑑みて、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に帰属する新規な菌であると判断し、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１）と命名した。
【００４４】
なお、本菌株は、２００８年１２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３として、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１の名称で寄託されている。
【００４５】
（２）菌株ＩＩ
（ａ）形態的性質
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）培地において、２５℃で３週間培養後のコロニーの形態を観察した。なお、以下の表１０〜１３において、色調の括弧内の英数文字は「Ｋｏｒｎｅｒｕｐ ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）」で用いられている色のコード ナンバーを表す。
【００４６】
（ｉ）ポテトデキストロース寒天培地（商品名：ダイゴ、日本製薬社製）
【００４７】
【表１０】
【００４８】
（ｉｉ）２％ 麦芽寒天培地（Ｍａｌｔ Ａｇａｒ）
【００４９】
【表１１】
【００５０】
（ｉｉｉ）バクトオートミール寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｏａｔｍｅａｌ Ａｇａｒ、ベクトン ディッキンソン社製）
【００５１】
【表１２】
【００５２】
（ｉｖ）ＬＣＡ（三浦培地）
【００５３】
【表１３】
【００５４】
その他の微視的観察結果を表１４に示す。
【００５５】
【表１４】
【００５６】
（ｂ）同定
アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）相同性検索の結果、菌株ＩＩの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｃｕｌｅａｔｕｍの塩基配列と９９．５％の相同率を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩＩの２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は子嚢菌類の一種であるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦ（この菌種名の「ｃｆ．」は、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに類似する菌株であることを表す）、Ｐ． ａｃｕｌｅａｔｕｍ、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍの塩基配列と高い相同率を示した。アポロンＤＢ−ＦＵおよび国際塩基配列データベースに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ ＲＳ７ＰＦと同一の系統枝を形成した。
【００５７】
菌株ＩＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、アポロンＤＢ−ＦＵに対するＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、子嚢菌類の一種である、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ の塩基配列と９８．８％の相同率を示した。また、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬなどの国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においては、菌株ＩＩのＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｐ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍの塩基配列と１００％の相同率を示した。国際塩基配列データベースおよびアポロンＤＢ−ＦＵに対する相同性検索で得られた上位の塩基配列をもとに作成した系統樹において、菌株ＩＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍと同一の系統枝を形成した。
【００５８】
したがって、２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析結果から、菌株ＩＩはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｍ ｃｆ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに近縁であるものの、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の解析で本検体と同一系統枝を形成した２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列のデータが登録されてないことから、本検体の種レベルの推定は困難であると思われた。よって、菌株ＩＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の一種であると考えられた。なお、Ｐ． ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍとＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍとは、分類学的に非常に近縁であることが知られている。
【００５９】
コロニー性状および形態観察の結果、菌株ＩＩは白色〜赤黄色系のコロニーを形成し、有隔壁の栄養菌糸のみの形成が観察された。今回の観察結果では、胞子などの生殖器官の形成が観察されなかったことから、分類群の推定はできなかった。上述の菌株Ｉのコロニー性状とは顕著な違いが認められたが、菌糸の形状において差異は認められなかった。
【００６０】
以上の２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２およびＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析、ならびにコロニー性状および形態観察の結果から総合的に鑑みて、菌株ＩはＰ． ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍに近縁なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に帰属する新規な菌であると判断し、ペニシリウム Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２）と命名した。
【００６１】
なお、本菌株は、２００８年１２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４として、Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ２の名称で寄託されている。
【００６２】
また、本発明の微生物として、より好ましくは、より高効率で糖化液を得られるよう、菌株Ｍ１または菌株Ｍ２に公知の変異処理を施すことによって得られた変異株であることが好ましい。変異処理の方法は、特に制限はないが、例えば、紫外線照射やニトロソグアニジンなどの変異誘発剤を使用することによって変異誘導処理する方法が挙げられる。そして、変異処理を施した菌株から、リグノセルロース系バイオマスの分解活性に優れる菌株を選定する。
【００６３】
＜酵素＞
本発明の他の形態としては、上述の微生物に由来する酵素が挙げられる。該酵素は、リグノセルロース系バイオマスに対して優れた加水分解活性能を有するので、該酵素をリグノセルロース系バイオマスに作用させることにより高効率で糖化液を製造することができる。
【００６４】
本形態の酵素は、上述の微生物の培養物から、従来公知の酵素採取手段および精製手段を用いて調製することができる。酵素採取法としては、例えば、微生物を含む培養物を遠心分離またはろ過することによって、菌体とろ液とを分離する。そして、該菌体およびろ液から、塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法（メタノール、エタノール、アセトン、およびイソプロパノールなど）によりタンパク質である酵素を沈殿させたり、限外ろ過により濃縮したりする方法が挙げられる。
【００６５】
リグノセルロース系バイオマスの加水分解には、上記の方法によって得られる粗酵素を用いてもよいが、必要によりさらに精製した酵素を用いることもできる。酵素の精製法としては、例えば、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを単独で、または２種以上を組み合わせた精製法が挙げられる。
【００６６】
＜糖化液の製造方法＞
本発明の他の形態にかかる糖化液の製造方法は、上述の本発明の微生物をリグノセルロース系バイオマスを含む培地中で培養する工程、または上述の本発明の酵素をリグノセルロース系バイオマスに作用させることにより加水分解する工程を含む。
【００６７】
本形態の糖化液の製造方法で用いるリグノセルロース系バイオマスは、セルロースおよびヘミセルロース、ならびにリグニンを含む有機資源であれば植物性でも動物性でも特に制限はなく、農作物、草木類、および海藻類、ならびにこれらの処理物または廃棄物などが含まれる。より具体的には、稲わら、籾殻、麦わら、ふすま、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、コットン、ラミー、ケナフ、ビート、大豆粕、コーヒー粕、雑草、木材、竹、バクテリアセルロース、パルプ、紙、セルロース粉末、結晶セルロース、レーヨン、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース、およびカルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。なお、本発明の微生物または酵素は、上記リグノセルロース系バイオマスの糖化能に優れるだけでなく、でんぷん系バイオマスまたは糖質系バイオマスに対しても優れた糖化能を示す。
【００６８】
上記リグノセルロース系バイオマスは、微生物の培養または酵素による加水分解に供する前に、糖化効率を高めるための前処理を行うことが好ましい。前処理としては、例えば、脱水処理または乾燥処理、粉砕処理、および蒸煮処理などの従来公知の技術を適宜採用することができる。特に、稲わら、麦わら、とうもろこしの茎葉、コーンコブなどの農作物の非可食部などのリグノセルロース系バイオマスを用いる場合は、まず、風乾によりバイオマス中に含まれる水分を除く。その後、切断装置や粉砕装置を用いて、好ましくは１．０ｍｍ以下であり、より好ましくは０．０１〜１．０ｍｍであり、さらに好ましくは０．１〜１．０ｍｍの粉末状とすることが好ましい。
【００６９】
上記リグノセルロース系バイオマスは、微生物の培養または酵素による加水分解に供するために、水性媒体に懸濁して用いる。水性媒体は微生物の増殖または酵素反応の進行が可能な範囲においては特に制限はないが、水、緩衝液、酸性水溶液、またはアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の濃度は、水性媒体に対して、通常、５０〜３００ｇ／Ｌであり、好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。
【００７０】
上述の本発明の微生物を用いて糖化液を製造する場合、本発明の微生物は、上記懸濁液のみを培地とした場合であっても、十分な増殖能力を有するが、必要によっては炭素源、窒素源、または無機物などを懸濁液に補充したものを培地として用いることも可能である。これらの栄養源は、微生物の数を増やすための前培養の培地に添加してもよいし、本培養の培地に添加しても構わない。
【００７１】
炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロースなどの単糖、マルトース、ラクトース、およびスクロースなどの二糖、グリセリンおよびキシリトールなどの糖アルコールといった糖類が挙げられ、これらを単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。特に、前培養の培地の培地にグルコースを添加することにより、本培養のときの微生物のリグノセルロース系バイオマスの分解活性をより向上させることができる。
【００７２】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、あるいは尿酸などの無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。さらに、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）などの窒素含有天然物を使用してもよい。これらのうち、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、尿酸などの無機あるいは有機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなの窒素含有天然物が好ましい。これらの窒素源は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの窒素源のうち、大豆粉末またはコーンスティープリカーを使用することが好ましい。
【００７３】
無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウムなどの、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄および亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩などが用いられる。そのほか、チアミン、ビオチンなどのビタミン類、さらに必要に応じて、アデニン、ウラシルなどの核酸関連物質が使用されてもよい。これらの無機物は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００７４】
微生物の培養方法は、本発明の微生物の増殖が実質的に阻害されず、リグノセルロース系バイオマスから単糖類を生産可能な範囲であれば、特に制限なく当業者によって適宜調整されうるが、培養温度は、通常２０〜５０℃であり、好ましくは２８〜３７℃である。また、培地のｐＨは、通常３〜９であり、好ましくは４〜７である。培養前または培養中にｐＨが４未満となる場合は、アンモニアなどを用いてｐＨ制御を行うことが好ましい。本発明の微生物を培養する場合は、一定量の酸素を供給することが必要である。供給方法は、特に制限はないが、フラスコ培養の場合は回転振盪による攪拌、バイオリアクターを用いる培養の場合は通気攪拌をすることによって培地に酸素を供給する。
【００７５】
一方、本発明の酵素を用いた加水分解反応は、リグノセルロース系バイオマスを含む懸濁液中に酵素を添加し、懸濁液を攪拌下、インキュベートすることによって行われうる。懸濁液に添加する酵素量は、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の質量に対して、好ましくは０．１〜３質量％、より好ましくは１〜２質量％である。かような量の酵素を用いることによって、通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間で加水分解反応が完了しうる。また、加水分解条件は、用いる酵素の至適条件を用いることが好ましい。ｐＨは通常３〜６であり、好ましくは３．５〜５である。また、反応温度は通常３０〜６０℃であり、好ましくは４０〜６０℃である。
【００７６】
微生物の培養、または酵素による加水分解により得られた糖化液は、糖化液中の不溶物を適宜ろ過してもよいし、そのままの状態で、微生物代謝産物（エタノール、乳酸などの有用化合物）を産生する他の微生物の培養に供しても構わない。撹拌効率および収率向上の観点の観点からは、糖化液中の不溶物を予めろ過することが好ましい。
【００７７】
他の微生物としては、特に制限はないが、例えば、乳酸を産生するＲｉｚｏｐｕｓ属、イタコン酸を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、エタノールを産生するＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、フマル酸を産生するＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、リンゴ酸を産生するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、ピルビン酸を産生するＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ、キシリトールを産生するＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓが挙げられる。本発明によって得られる糖化液を含む倍中でこれらの微生物を培養することによって、燃料や化成品を工業的規模で製造するが可能である。
【実施例】
【００７８】
本発明の作用効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００７９】
＜菌株Ｍ１および菌株Ｍ２の稲わら分解活性の評価＞
［実施例１］
１．生産菌の培養
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表１５に示す組成のＣ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｃ培地に菌株Ｍ１および菌株Ｍ２をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した（混合培養）。
【００８０】
【表１５】
【００８１】
(本培養)
次に、下記表１６の組成を有する各培地を調製した。下記表１６において、対象なる成分が含まれている場合を「○」であらわし、含まれていない場合を「×」で表す。
【００８２】
【表１６】
【００８３】
なお、上記表１６における稲わらは、粒径が１．０ｍｍ未満の粉砕物を用いた。稲わらの粉砕方法は以下のとおりである。稲わらを室温で約２ヵ月間風乾し、金切ばさみで１〜５ｃｍ程度に切断した。そして、これを家庭用ミキサーに５分間かけることにより粗粉砕した。該粗粉砕物をさらにボールミル（ＡＮＳ−６０Ｓ、日陶科学社製）を用いて微粉化し、稲わら粉砕物を得た。
【００８４】
次に、上記の培地１〜６を２００ｍｌ三角フラスコにそれぞれ２０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該培地１〜６に、上記前培養液を７（ｖ／ｖ）％植菌した。これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで６日間振盪培養した。
【００８５】
２．稲わら分解活性の評価（糖化）
上述の方法で得た粒径が１．０ｍｍ未満の稲わら粉砕物２ｇを水道水９ｍｌに懸濁した。該懸濁液に、上記培地１〜６で培養した培養液、またはそのろ液を希釈した酵素液１ｍｌを加え、５０℃で２４時間糖化した。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、稲わら分解活性を下記式（１）より算出した。なお、酵素活性は１［Ｕ］は、（１／６０）［μｋａｔ］に相当する。
【００８６】
【数１】
【００８７】
［比較例１］
菌株Ｍ１および菌株Ｍ２に変えて、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＮＢＲＣ３１３２９を用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で稲わら分解活性を求めた。
【００８８】
結果を下記表１７に示す。
【００８９】
【表１７】
【００９０】
表１７の結果より、本発明の菌株Ｍ１およびＭ２は、従来優れたセルラーゼ産生菌として知られるトリコデルマ・リーゼイ ＮＢＲＣ３１３２９よりも顕著な稲わら分解活性能を有することが示された。
【００９１】
また、前培養の培地に、窒素源として大豆粉を、炭素源としてグルコースを添加することにより、本培養のときの微生物の増殖を促進し、微生物のリグノセルロース系バイオマスの分解活性をより向上させることができることが示された。
【００９２】
＜酵素活性の評価＞
［実施例２］
１．酵素の調製
（前培養）
２００ｍｌ三角フラスコに下記表１８に示す組成のＤ培地２０ｍｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｄ培地に菌株Ｍ１および菌株Ｍ２をそれぞれ１白金耳ずつ接種し、これを恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数２２０ｐｐｍで２４時間振盪培養した（混合培養）。
【００９３】
【表１８】
【００９４】
（本培養）
次に、３Ｌジャーファーメンター（３ＭＤＬ型、丸菱バイオエンジ社製）に下記表１９に示す組成のＥ培地１．５Ｌを入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した。該Ｂ培地に、上記で培養したＤ培地を７（ｖ／ｖ）％植菌した。これを、恒温振盪培養装置を用いて３２℃、回転数６００ｐｐｍ、通気量２ｖｖｍで６日間培養した。
【００９５】
【表１９】
【００９６】
上記の６日間の培養中、培養開始から０（培養開始直後）、２４、４８、７２、および８４時間後の培養液を１ｍｌ取り出し、上記実施例１の３．稲わら分解活性の評価と同様の方法で、各時間の培養液の稲わら分解活性を評価した。結果を下記表２０に示す。
【００９７】
【表２０】
【００９８】
６日間培養後の培養液をろ過し、ケーキ（残渣）を水洗した。ろ液とケーキの水洗液とをあわせて濃縮乾固した。次に、この濃縮乾固物を５℃の冷水２００ｍｌに溶解し、不溶分をろ別した後、これにアセトンを１０００ｍｌ加えて、アセトン沈殿物を得た。そして、これを凍結乾燥して酵素（「酵素Ｍ１Ｍ２」と称する）を得た。なお、上記の各工程で得られた生成物の収量、酵素活性または比活性、総活性、および収率を下記表２１に示す。なお、酵素活性は上記実施例１の分解活性の評価と同様の方法を用いて測定した。
【００９９】
【表２１】
【０１００】
２．酵素化学的性質の評価
（安定性に対する温度の影響）
０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）９ｍｌに、上記で得た酵素Ｍ１Ｍ２１ｇを溶解したものを酵素溶液とした。ふた付試験管に該酵素溶液１ｍｌと、上記酢酸バッファー９ｍｌとを入れ、それぞれ所定の温度で１０時間振盪した後、試験管を５℃に冷却した。ついで、この試験管に上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えた１０℃における分解活性に対する、それぞれの温度における活性を百分率で表した。結果を図１に示す。
【０１０１】
（糖化活性に対する温度の影響）
ふた付試験管に、上記酵素溶液１ｍｌと、上記酢酸バッファー９ｍｌとを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、所定の温度で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えた５５℃における分解活性に対する、それぞれの温度における活性を百分率で表した。結果を図１に示す。
【０１０２】
（安定性に対するｐＨの影響）
ふた付試験管に上記酵素溶液１ｍｌと、それぞれ所定のｐＨに調整した０．０５Ｍ酢酸バッファー９ｍｌを入れ、５０℃で１０時間振盪した後、試験管を５℃に冷却した。ついで、この試験管に上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えたｐＨ３．７における分解活性に対する、それぞれのｐＨにおける活性を百分率で表した。結果を図２に示す。
【０１０３】
（糖化活性に対する温度の影響）
ふた付試験管に、上記酵素溶液１ｍｌと、それぞれ所定のｐＨに調整した０．０５Ｍ酢酸バッファー９ｍｌを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を１ｇ加え、５０℃で２４時間糖化反応を行った。この後、それぞれの糖化液をろ過し、得られたろ液中に含まれる全糖量をフェノール硫酸法により測定した。そして、分解活性（糖化活性）を上記式（１）より算出した。得られた値のうち最も高い安定性を与えたｐＨ４．５における分解活性に対する、それぞれのｐＨにおける活性を百分率で表した。結果を図２に示す。
【０１０４】
［実施例３］
Ｄ培地に接種した微生物を菌株Ｍ１のみとしたことを除いては、実施例２と同様の方法で酵素を調製した。得られた酵素を「酵素Ｍ１」と称する。そして、実施例２と同様の方法で酵素Ｍ１の比活性を測定した。
【０１０５】
［実施例４］
Ｄ培地に接種した微生物を菌株Ｍ２のみとしたことを除いては、実施例２と同様の方法で酵素を調製した。得られた酵素を「酵素Ｍ２」と称する。そして、実施例２と同様の方法で酵素Ｍ２の比活性を測定した。
【０１０６】
［比較例２］
アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０７】
［比較例３］
メイセラーゼ（明治製菓社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０８】
［比較例４］
スミチーム（新日本化学工業社製）を用いて、実施例２と同様の方法で比活性を測定した。
【０１０９】
酵素の比活性の結果を下記表２２に示す。
【０１１０】
【表２２】
【０１１１】
表２２の結果より、本発明の酵素Ｍ１Ｍ２、酵素Ｍ１、および酵素Ｍ２は、従来のセルラーゼよりも優れた稲わら分解活性を有することが示された。
【０１１２】
＜酵素Ｍ１Ｍ２を用いた稲わら糖化液の製造、および該糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例５］
３Ｌジャーファーメンター（ＭＤＬ−３型、丸菱バイオエンジ社製）に水道水１．０Ｌを入れ、上記実施例１で調製した稲わら粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）２００ｇを懸濁し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした。該懸濁液のｐＨを、２５％塩酸を用いて４．５に調整した。そして、実施例２で得た酵素Ｍ１Ｍ２を２０Ｕ／ｍｌとなるように添加し、５０℃で攪拌（２００ｒｐｍ）下、７２時間糖化反応を行った。反応液中の全糖量、グルコース量、キシロース量、および糖化率の経時変化を図３に示す。
【０１１３】
得られた糖化液を３Ｌジャーファーメンターに仕込み、これにリン酸一カリウムを０．３（ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウムを０．２５（ｇ／Ｌ）となるように添加した。該糖化液をオートクレーブを用いて１２１℃で１０分間滅菌した。次に、予め３００ｍｌ三角フラスコで前培養したリゾプス エスピー（Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養液１００ｍｌを添加し、回転数３００ｒｐｍ、通器量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃で７２時間培養した。培養中、２５％アンモニア水を用いて培養液のｐＨを６．０に制御した。全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を図４に示す。リゾプス エスピー ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養により、全糖９０ｇ／Ｌから４２ｇ／ＬのＬ−乳酸が得られた。また、稲わら粉末からのＬ−乳酸の収率は２１（ｗ／ｗ）％であった。
【０１１４】
＜酵素Ｍ１Ｍ２を用いたコーンコブ糖化液の製造、および該糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例６］
稲わら粉末に変えて、上述の［１次スクリーニング］で調製したコーンコブ粉末（粒径１．０ｍｍ未満のもの）を用い、糖化時間を４８時間、Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養時間を９６時間としたことを除いては、実施例５と同様の方法で、Ｌ−乳酸を生産した。糖化反応液中の全糖量、グルコース量の経時変化を図５に示す。また、Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養液中の全糖量、グルコース量、およびＬ−乳酸量の経時変化を図６に示す。Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ． ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の培養により、全糖１０２ｇ／Ｌから４６ｇ／ＬのＬ−乳酸が得られた。また、コーンコブ粉末からのＬ−乳酸の収率は２１（ｗ／ｗ）％であった。
【０１１５】
＜稲わら糖化液を用いたエタノールの製造＞
硫酸玉つきガラス管を備えた１００ｍｌ三角フラスコに、実施例５と同様の方法で製造した稲わら糖化液および下記表２３に示す添加物を加えた培養液２０ｍｌを準備した。これにパン酵母（オリエンタルドライイースト、オリエンタル酵母工業社製）０．５ｇを加え、３０℃で静置培養を行った。経時的にフラスコ全体の重量を測定し、その重量の減少量を下記式（２）にあてはめ、各培養時間後のエタノール量を算出した。下記式（２）において、フラスコの重量の減少量はエタノール発酵による炭酸ガス発生量（ｇ）を意味する。アルコール発酵により、グルコース１モルからエタノール２モルと炭酸ガス（ＣＯ２
）２モルが生産されることから、炭酸ガス発生量（ｇ）に１．０４７（４６．０６８／４４．００９５）を乗じて得られる値が、エタノール量（ｇ）となる。そして、培養開始前の糖化液中のグルコース量に対するエタノール量を百分率で表し、各培養時間におけるエタノール収率（％）とした。結果を下記表２３に示す。
【０１１６】
【数２】
【０１１７】
【表２３】
【０１１８】
表２３の結果より、本発明の酵素Ｍ１Ｍ２を用いて製造された糖化液は、酵母エキス、乾燥酵母、尿素、硫安などの窒素源を補填することのなく、４６％の高収率でエタノールを製造できることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物。
【請求項２】
Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはＳ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物由来の酵素。
【請求項４】
リグノセルロース系バイオマスを含む培地中で請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の微生物を培養する培養工程を含む、糖化液の製造方法。
【請求項５】
前記培養工程の前に、リグノセルロース系バイオマスおよびグルコースを含む培地中で、前記微生物を前培養する工程をさらに含む、請求項４に記載の糖化液の製造方法。
【請求項６】
リグノセルロース系バイオマスを請求項３に記載の酵素により加水分解する、糖化液の製造方法。
【請求項７】
前記加水分解において、反応温度が３０〜６０℃であり、反応溶液のｐＨが３〜６である、請求項６に記載の糖化液の製造方法。
【請求項８】
前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、籾殻、麦わら、ふすま、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、コットン、ラミー、ケナフ、ビート、大豆粕、コーヒー粕、雑草、木材、竹、バクテリアセルロース、パルプ、紙、セルロース粉末、結晶セルロース、レーヨン、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース、およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマス分解能を有するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）に属する微生物。
【請求項２】
Ｓ１１Ｄ６６０８−Ｍ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８３）および／またはＳ１１Ｄ６６０８−Ｍ２（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０８４）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物由来の酵素。
【請求項４】
リグノセルロース系バイオマスを含む培地中で請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の微生物を培養する培養工程を含む、糖化液の製造方法。
【請求項５】
前記培養工程の前に、リグノセルロース系バイオマスおよびグルコースを含む培地中で、前記微生物を前培養する工程をさらに含む、請求項４に記載の糖化液の製造方法。
【請求項６】
リグノセルロース系バイオマスを請求項３に記載の酵素により加水分解する、糖化液の製造方法。
【請求項７】
前記加水分解において、反応温度が３０〜６０℃であり、反応溶液のｐＨが３〜６である、請求項６に記載の糖化液の製造方法。
【請求項８】
前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、籾殻、麦わら、ふすま、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、コットン、ラミー、ケナフ、ビート、大豆粕、コーヒー粕、雑草、木材、竹、バクテリアセルロース、パルプ、紙、セルロース粉末、結晶セルロース、レーヨン、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース、およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−５０３５９（Ｐ２０１１−５０３５９Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０４９４０（Ｐ２００９−２０４９４０）
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
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