新規微生物並びにそれを用いた水素製造方法、１，３−プロパンジオール製造方法及びバイオディーゼル廃液の処理方法
【課題】高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができる新規な微生物を提供すること。
【解決手段】クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物。
【解決手段】クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物並びにそれを用いた水素製造方法、１，３−プロパンジオール製造方法及びバイオディーゼル廃液の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼルは、植物性油脂や廃油等の油脂（トリグリセリド）を主原料として製造される脂肪酸エステルのことであり、軽油等の代替燃料として期待されている。バイオディーゼルを製造する方法として、現在化学触媒法が広く用いられている。化学触媒法は、油脂にメタノールと触媒（アルカリ）を加えてエステル交換反応を行い、脂肪酸メチルエステル（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｍｅｔｈｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＦＡＭＥ）をバイオディーゼルとして得るものである。その反応は下記化学式（１）で表される。
【０００３】
【化１】
【０００４】
一方、上記化学式（１）に示されるように、副産物としてグリセロールを高濃度で含有する廃液（バイオディーゼル廃液）が生じ、その処理が問題となっている。このバイオディーゼル廃液を原料とし、これから生物学的にエネルギーや有用物質を生産する、いわゆるバイオリファイナリーが試みられている。
【０００５】
例えば、特許文献１及び２には、グリセロールを資化して水素及びエタノールを産生するエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する菌を利用して、グリセロールから水素及びエタノールを製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１８３１６２号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バイオディーゼル廃液には、非常に高濃度でグリセロールが含まれている。ところが、特許文献１及び２に開示されたエンテロバクター・アエロゲネスに属する菌は、グリセロール濃度が高いとき、グリセロールを資化する能力が著しく阻害されるため、バイオディーゼル廃液のような高濃度でグリセロールを含有する試料を効率よく処理することができないという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができる新規な微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物を提供する。
【００１０】
本発明の微生物は、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及びグリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成する能力を有する。そのため、グリセロールを原料としたバイオリファイナリーに用いることができる。さらに、本発明の新規微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、バイオリファイナリーの効率を高めることができる。
【００１１】
上記微生物は、１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できることが好ましい。また、上記微生物として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８号）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で２０１０年６月１８日に受託されているクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ｓｐ．ＰＥＧ２株とすることができる。
【００１２】
上記微生物は、グリセロールを資化して水素ガスを生成することができる。上記微生物はまた、グリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成することができる。そこで、本発明は、グリセロールを基質として、上記微生物に水素ガスを生成させる水素製造方法を提供する。本発明はまた、グリセロールを基質として、上記微生物に１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法も提供する。
【００１３】
上記水素製造方法及び１，３−プロパンジオール製造方法においては、上記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものであることが好ましい。上記微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、グリセロールが高濃度で含まれるバイオディーゼル廃液を効率よく処理することができる。
【００１４】
本発明はまた、上記微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法も提供する。
【００１５】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、上記分解工程において生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収することが好ましい。上記微生物はグリセロールを分解して、エネルギー又は有用物質として利用できる水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成できるため、これらを回収することによって効率よくバイオリファイナリーを行うことができる。
【００１６】
本発明はさらに、バイオディーゼル廃液を含む原料液と上記微生物とを接触させ、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法を提供する。
【００１７】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の新規微生物によれば、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、高濃度でグリセロールが含まれるバイオディーゼル廃液等の処理を効率よく行うことができる。
【００１９】
また、本発明の新規微生物は、グリセロールを資化して水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生成することができる。そのため多種多様なエネルギー物質や有用物質を製造することができ、グリセロールを原料としたバイオリファイナリーをより効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】簡易分子系統解析結果を示す図である。
【図２】実施例４の結果を示すグラフである。
【図３】実施例５の結果を示すグラフである。
【図４】実施例７の結果を示すグラフである。
【図５】実施例８の結果を示すグラフである。
【図６】実施例９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の微生物は、クレブシエラ属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力、グリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成する能力、及び１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化する能力を備えるものである。
【００２２】
上記微生物は、グリセロール耐性を有しており、高濃度のグリセロール存在下でも生存することができ、またグリセロールを資化することができる。なお、グリセロール耐性とは、グリセロール存在下においても、生存又は増殖することができる性質をいう。グリセロール存在下においても、グリセロールを資化することができる性質は、グリセロール耐性の一例である。
【００２３】
上記微生物は、より高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化できることが好ましく、１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できるものであることが好ましい。また、２０質量％、２５質量％又は３０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できるものであることがさらに好ましい。
【００２４】
上記微生物は、また、表１の菌学的性質を示すことが好ましい。
【表１】
【００２５】
上記微生物は、ＬＢ寒天培地上で、３０℃、４８時間培養したときに直径２．０−３．０ｍｍの周縁全縁の円形、表面の形状がスムーズ、レンズ状で、不透明な淡黄色コロニーを形成することが好ましい。
【００２６】
また、上記微生物は、配列番号１で特定される塩基配列に対して９９．７％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することが好ましく、９９．８％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することがより好ましく、９９．９％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することがさらに好ましい。
【００２７】
上記微生物として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で特定されるクレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株とすることができる。クレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株は、高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化して水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成する能力に加え、マンニトールを資化して水素ガスを生成する能力も有している。マンニトールは、バイオマスの有力候補である海藻に多く含まれる成分であるため、クレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株は、海藻を原料としたバイオマスエネルギーの生産にも用いることができる。なお、「バイオマス」とは、エネルギー等として利用することができる生物に由来する資源を意味する。
【００２８】
上記微生物によれば、グリセロールを資化して水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生成することができる。また、このグリセロールを資化する能力は高濃度のグリセロールが存在しても維持される。したがって、例えば、高濃度のグリセロールが含まれるバイオディーゼル廃液等の処理を効率よく行うことができ、また、その処理と同時に水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生産することもできる。
【００２９】
本発明の微生物は、このような特性を有していればよく、したがって、高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化して水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有するクレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株の変異株であってもよい。
【００３０】
本発明の微生物は、例えば、バイオディーゼル製造工場からの排水等から採取したサンプル（微生物群）を、グリセロール存在下で増殖する能力を指標としたスクリーニングを行うことにより単離することができる。さらに、グリセロール存在下で増殖する能力に加え、グリセロール存在下での水素ガス生成能力又は１，３−プロパンジオール生成能力を指標として併用してスクリーニングを行ってもよい。
【００３１】
具体的な方法としては、例えば、炭素源としてグリセロールのみを１〜２０質量％の濃度で含む培地（例えば、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）を培養フラスコに添加し、更にバイオディーゼル製造工場からの排水等から採取したサンプルを微生物源として少量添加する。これを適切な条件下（例えば、嫌気条件下、３７℃、２４時間、静置又は微生物が沈降しない程度に攪拌）で培養する。これにより、グリセロール資化性を有し、更にグリセロール耐性を有する微生物を優先的に増殖させることができる。
【００３２】
また、培養後、培養フラスコに含まれる水素ガスを定量し、水素ガスを生成するサンプルを選定することもできる。水素ガスの定量は、例えば、培養フラスコに接続したガス捕集バックに捕集されたガス量の測定及びガスクロマトグラフィーによる捕集されたガスの組成分析により行うことができる。また、培養後、培養液に含まれる１，３−プロパンジオールを定量し、１，３−プロパンジオールを生成するサンプルを選定することもできる。１，３−プロパンジオールの定量は、例えば、液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００３３】
培養により増殖した微生物群から、純粋分離により、本発明に係る微生物を単離することができる。純粋分離は当業者によく知られた方法で実施することが可能であり、例えば、寒天培地上に接種して培養することにより、純粋分離されたコロニーを形成させることができ、そのコロニーをピックアップすることで目的とする微生物を単離することができる。寒天培地にはグリセロールを含ませておくことが好ましい。
【００３４】
また、培養後に培養液の一部を、新鮮なグリセロールを含む培地を添加した培養フラスコに再度接種して、再度培養を行うこともできる。培養後のサンプルに対し、上述の純粋分離を行うこともできるし、再びこの培養サイクルを繰り返すこともできる。培養サイクルを増やすことにより、目的とする微生物を集積させることができる。
【００３５】
上述のようにして単離した微生物の同定、性状及び性質等の解析は、公知の種々の同定試験方法又は市販されている同定キットを用いて行うことができる。また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列をシークエンスし、相同性検索、分子系統解析により、微生物の同定を行うこともできる。
【００３６】
クレブシエラ属に属する微生物は、上述のように決定した１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を相同性検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラム）を用いて、塩基配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性検索を行い、他のクレブシエラ属に属する微生物と高い相同性を示す微生物を選抜することによって得ることができる。また、菌学的性質に基づいて（例えば、表１に示した菌学的性質）、クレブシエラ属に属する微生物を選抜することにより得ることもできる。さらに、これらを組み合わせて選抜することが好ましい。
【００３７】
本発明は、上記微生物にグリセロールを基質として水素ガスを生成させる水素製造方法又は上記微生物にグリセロールを基質として１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法とすることもできる。
【００３８】
上記水素製造方法においては、上記微生物と基質となるグリセロールを含有する原料液とを接触させて、上記微生物に水素発酵を行わせる。水素発酵の方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。
【００３９】
また、原料液を供給する方法によって異なる培養方法を採用することができる。具体的には、例えば、一定の速度で原料液を供給し、同時に同量の原料液を抜き取りながら連続的に培養する方法（灌流培養法）、一回毎に新たな原料液を用意し、培養中に原料液（成分）の添加や抜き取りを行わずに培養する方法（回分培養法）、培養中に原料液（成分）の添加や抜き取りを行わずに回分培養と同様にして培養を行った後、培養液の一部に新たな原料液を供給して回分培養を繰り返す方法（繰り返し回分培養法）、回分培養と原則同じ操作を行うが、培養中に原料液中の特定の成分のみを追加的に添加する培養方法（流加培養法）等が挙げられる。このうち、上記水素製造方法においては、副産物による水素ガス生成効率の低下を回避する観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００４０】
水素製造に用いる原料液としては、グリセロールを含有するものであれば、特に制限はなく、具体的には、石鹸製造廃液、バイオディーゼル廃液等が挙げられる。これらの中でも、バイオディーゼル廃液が好ましい。バイオディーゼル廃液は、多量にグリセロールを含んでいるうえ、含有するグリセロールに有用な用途がないことから、上記水素製造方法における原料として好ましく利用可能である。なお、原料液に含まれるバイオディーゼル廃液の含有量は、例えば、グリセロール濃度換算で０．１〜４５質量％の間で、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００４１】
また、原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００４２】
水素発酵の際の反応条件（培養条件）として、反応温度（発酵温度）を１０〜５０℃の間で設定することができ、１５〜４５℃の間で設定することが好ましく、３０〜４０℃の間で設定することがより好ましい。具体的には、例えば、反応温度を３５℃（±３℃）とすると増殖効率及び水素ガス生成効率が高くなるため、好ましい。また、ｐＨは３．０〜９．０の間で設定することができ、４．０〜８．０の間で設定することが好ましい。さらに、本発明の上記微生物は、酸性条件の方が水素ガス生成効率が高いため、ｐＨを５．５〜６．５の間で設定することがより好ましい。反応時間は、例えば、６〜４８時間とすることもできるし、原料液中のグリセロールの濃度をリアルタイムで計測し、グリセロールが予め設定した濃度以下となったところで反応を終了してもよい。反応液中のグリセロール濃度を定量する方法としては、例えば、上述した液体クロマトグラフィーにより測定する方法等が挙げられる。また、「予め設定した濃度」は、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。例えば、１．０質量％とすることや、０．５質量％とすることができる。また、０質量％（グリセロールの完全分解）としてもよい。
【００４３】
本明細書において、バイオディーゼル廃液とは、油脂をメチル（又はエチル）エステル化して、脂肪酸メチル（又はエチル）エステル（バイオディーゼル）を取り除いた後のグリセロールを含む廃液を意味する。
【００４４】
上記油脂としては、特に限定されるものではないが、例えば、菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、コメ油、ヘンプ・オイル（大麻油）等の植物油、魚油や豚脂、牛脂などの獣脂及び廃食用油（いわゆる天ぷら油等）等が挙げられる。
【００４５】
上記１，３−プロパンジオール製造方法においては、上記微生物と基質となるグリセロールを含有する原料液とを接触させて、上記微生物に１，３−プロパンジオール発酵を行わせる。１，３−プロパンジオール発酵の方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。
【００４６】
原料液の供給方法としては、例えば、灌流培養法、回分培養法、繰り返し回分培養法、流加培養法等が挙げられる。このうち、上記１，３−プロパンジオール製造方法においては、副産物による１，３−プロパンジオール生成効率の低下を回避する観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００４７】
１，３−プロパンジオール製造に用いる原料液としては、グリセロールを含有するものであれば、特に制限はなく、具体的には、石鹸製造廃液、バイオディーゼル廃液等が挙げられる。これらの中でも、バイオディーゼル廃液が好ましい。原料液に含まれるバイオディーゼル廃液の含有量は、例えば、グリセロール濃度換算で０．１〜４５質量％の間で、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００４８】
また、原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００４９】
１，３−プロパンジオール発酵の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００５０】
さらに、本発明は、上記微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法とすることができる。
【００５１】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、分解工程で、上記微生物と基質となるグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液とを接触させて、上記微生物にグリセロールの資化を行わせる。バイオディーゼル廃液は、所定のグリセロール濃度となるよう希釈して、バイオディーゼル廃液を含む原料液を調製してから上記微生物と接触させることが好ましい。所定のグリセロール濃度としては、例えば、０．１〜４５質量％の間で、バイオディーゼル廃液の処理効率（コスト等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００５２】
グリセロールの資化方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。また、原料液の供給方法としては、例えば、灌流培養法、回分培養法、繰り返し回分培養法、流加培養法等が挙げられる。このうち、上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、副産物による処理効率の低下への影響をより小さく抑えることができるという観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００５３】
原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００５４】
グリセロールの資化の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００５５】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、グリセロールの分解に伴って生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収する回収工程を有することが好ましい。水素ガス又は１，３−プロパンジオールの回収は、分解工程と並行して行ってもよいし、分解工程が終了してから行ってもよい。水素ガスの回収は、例えば、反応容器（培養容器）に水素ガスを回収するための管を配置して、分解工程と並行して回収することができる。また、１，３−プロパンジオールの回収は、例えば、分解工程後の原料液を回収して、蒸留等により行うことができる。
【００５６】
さらに本発明は、バイオディーゼル廃液を含む原料液と上記微生物とを接触させ、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法を提供する。上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法とすることができる。
【００５７】
バイオディーゼル廃液は、所定のグリセロール濃度となるよう希釈して、バイオディーゼル廃液を含む原料液を調製してから上記微生物と接触させることが好ましい。所定のグリセロール濃度としては、例えば、０．１〜４５質量％の間で、バイオディーゼル廃液の処理効率（コスト等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００５８】
グリセロールの資化方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。また、本実施形態においては、回分培養を繰り返し行うこと（繰り返し回分培養法）を特徴としている。
【００５９】
原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００６０】
グリセロールの資化の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００６１】
また、グリセロールの分解に伴って生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収することが好ましい。水素ガスの回収は、反応容器（培養容器）に水素ガスを回収するための管を配置して、グリセロールの分解と並行して回収することができる。また、１，３−プロパンジオールの回収は、反応後（培養後）の原料液を回収して、蒸留等により行うことができる。
【実施例】
【００６２】
〔実施例１〕
（グリセロール資化性水素生産菌の探索）
バイオディーゼル（ＦＡＭＥ）製造工場の排水を微生物源として、集積培養により、グリセロール資化性水素生産菌の探索を行った。
【００６３】
ＦＡＭＥ培地（組成；バイオディーゼル廃液 グリセロール濃度換算で１質量％となるように添加、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に、バイオディーゼル製造工場の排水を加え、嫌気条件下、３７℃で、２４時間、ガス捕集袋を取り付けたメジウムボトル内にて集積培養した。ガス捕集袋に捕集されたバイオガス量の測定及びガスクロマトグラフィー（島津社製 ＧＣ−１４Ｂ）によるガス組成分析を行い、水素ガス量を決定した。ガス組成分析条件は以下のとおりである。
・検出器：ＴＣＤ （６０ｍＡ）
・カラム：ポラパックＮ，モレキュラーシーブ１３Ｘ，ポラパックＱ
・キャリアガス：アルゴン
・カラム温度：６０℃
・インジェクション温度：６０℃
・ディテクター温度：８０℃
【００６４】
培養後の培養液５０ｍｌを新しいＦＡＭＥ培地２００ｍｌに添加することによって継代し、水素ガスの発生量が安定するまで、培養を繰り返した。水素ガスが安定して発生するようになったところで、培養液をグリセロール寒天培地（グリセロール １０ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、３７℃のインキュベーター中で、４８時間嫌気培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーを単離し、１０ｍｌのＦＡＭＥ培地を含有する２０ｍｌバイアルに播種し、密閉された状態で、嫌気条件下、３７℃で、２４時間培養した。培養後、バイアルの空寸部に含まれる水素ガスを上述の方法によって定量し、水素ガスを生成した菌株を選択した。
【００６５】
〔実施例２〕
（ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析による同定）
実施例１で取得した菌株のひとつであるＰＥＧ２株について、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列解析により菌株の同定を行った。
【００６６】
ＰＥＧ２株からＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより、全長１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンスを実施した。サイクルシークエンスを実施したサンプルは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘ１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社製）装置を用いて塩基配列データを分析し、分析データをＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ１．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．）ソフトウェアを用いて解析し、塩基配列を決定した（配列番号１）。各実験手順は、それぞれのキットに付属のマニュアルの記載にしたがった。
【００６７】
決定したＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列について、アポロンＤＢ−ＢＡ ｖｅｒ５．０（テクノスルガ・ラボ社製）データベース又は国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対する、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索を実施した。アポロンＤＢ−ＢＡ ｖｅｒ５．０データベースを用いた検索の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ１３８８３株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９９．４％の相同率を示した（表２）。また、国際塩基配列データベースを用いた検索の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に由来する１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示した（表３）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
次に、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と、表２に示した上位１５株及びＳｅｒｒａｔｉａ属の基準株であるＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＤＳＭ３０１２１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用い、アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社製）ソフトウェアを用いた簡易分子系統解析を実施した。
【００７１】
簡易分子系統解析の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の種及びＳ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列で形成されるクラスターに含まれた（図１）。また、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はこのクラスターの中で、単独で系統枝を形成した（図１）。なお、図１中、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。
【００７２】
以上の結果から、ＰＥＧ２株は属レベルではＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に含まれると考えられる。一方、単独で系統枝を形成したように、近縁となる既知種が認められないことから、種レベルでの帰属分類群を推定することはできず、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．とすることが妥当であると考えられる。
【００７３】
〔実施例３〕
（ＰＥＧ２株の菌学的性質の解析）
ＰＥＧ２株について、光学顕微鏡（ＢＸ５０Ｆ４、オリンパス社製）による形態観察、Ｂａｒｒｏｗらの方法（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３年，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）に基づいた、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）の試験を実施した。また、フェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬社製）を用いてグラム染色性解析を実施した。さらに、ＡＰＩ２０Ｅキット（ビオメリュー社製）を用い、表４及び５に示した各項目についての試験を実施した。各項目の判定はキットに添付のマニュアルに従った。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
ＰＥＧ２株をＬＢ寒天培地で、３０℃、４８時間培養し、形態観察を行った。その結果、ＰＥＧ２株は、直径２．０−３．０ｍｍの周縁全縁の円形、表面の形状がスムーズ、レンズ状で、不透明な淡黄色コロニーを形成した。
【００７７】
ＰＥＧ２株の菌学的性質の解析結果を表４及び５に示した。ＰＥＧ２株は、運動性を有しないグラム陰性短桿菌で、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性という性状を示した（表４及び５）。これらの性状は、腸内細菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の性状と一致すると考えられた（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３年，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）。
【００７８】
一方、ＰＥＧ２株は、β−ガラクトシダーゼ及びリシンデカルボキシラーゼ活性を示し、アルギニンジヒドロラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ及びウレアーゼ活性を示さず、クエン酸を利用し、アセトインを産生し、ゼラチンを加水分解せず、Ｄ−マンニトール、イノシトール及びＬ−ラムノースを発酵し、４℃で生育せず、ＫＣＮ培地で生育し、乳糖及びα−メチル−Ｄ−グルコシドを酸化し、Ｌ−アラビトールを酸化しなかった（表４及び５）。これらの性状は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の既知種の性状と類似性は認められるものの、完全に一致する種は認められなかった（坂崎利一他，腸内細菌，下巻，近代出版，１９９２年）。
【００７９】
以上、実施例２及び３の結果から、ＰＥＧ２株はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に含まれると考えられるが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の既知種とは、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列及び菌学的性質に明確な相違点があることから、新規微生物であると考えられる。よって、ＰＥＧ２株をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥＧ２株であると結論した。
【００８０】
〔実施例４〕
（回分培養によるグリセロールからの水素及び１，３−プロパンジオール生産）
ＬＢ培地中、３７℃で１１時間振とう培養したＰＥＧ２株５０ｍｌを、４５０ｍｌの原料液（組成；酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、バイオディーゼル廃液（グリセロールの含有量が約５質量％となるように添加）、ｐＨ６）を含む１Ｌ容ミニジャーに添加した。窒素ガスでミニジャー中のガスを置換し、１Ｌファーメンター（ＢＭＪ−０１ＰＩ、ＡＢＬＥ＆Ｂｉｏｔｔ社製）を用い、嫌気条件下、３４℃、１５０ｒｐｍの振とう速度で培養を行った。１３時間培養した後、培養液を約５０ｍｌ残し、４５０ｍｌの新しい原料液を加えて、培養を繰り返した。経時的に培養液及びガスのサンプリングを行い、水素ガスの生成量、１，３−プロパンジオールの生成量、エタノール生成量及び残留グリセロール量の測定を行った。
【００８１】
１，３−プロパンジオール、エタノール、グリセロールは高速液体クロマトグラフィーにより以下の分析条件で定量した。なお、水素ガスの定量方法は実施例１に記載した通りである。
・移動液：純水
・カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ（島津社製）
・カラム温度：７０℃
・流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
・検出器：示唆屈折計
【００８２】
図２は回分培養によるグリセロールからの水素及び１，３−プロパンジオール生産の結果を示すグラフである。培養時間の経過とともにグリセロール残存量が減少した。これは、ＰＥＧ２株によってグリセロールが分解されたことを示している（図２）。また、グリセロールの分解に伴って、水素ガス、１，３−プロパンジオール及びエタノールが生成した（図２）。
【００８３】
〔実施例５〕
（グリセロール濃度の影響）
酵母エキスを２．５ｇ／Ｌ、ペプトンを２．５ｇ／Ｌ、２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳ）を０．２Ｍ、及びグリセロールを１．０％、２．５％、５．０％、７．５％、１０．０％、１５．０％、２０．０％、２５．０％、３０．０％、３５．０％、４０．０％（いずれも質量％）含む原料液１０ｍｌ（ｐＨ６．５）を２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で２２時間静置培養した。培養後の水素ガス生成量とＯＤ６６０値を測定し、グリセロール濃度による影響を解析した。
【００８４】
図３は水素生産に及ぼすグリセロール濃度の影響を示すグラフである。ＰＥＧ２株はグリセロールが１０質量％という高い濃度で存在した場合でも生育に問題はなく、また、水素ガスの生成量は、１．０質量％のときの７２．６％を維持していた（図３）。さらに、グリセロール濃度が１５．０質量％、２０．０質量％、２５．０質量％、３０．０質量％、３５．０質量％、４０．０質量％となった場合でも、それぞれ１．０質量％のときの約４９．３％、約３０．７％、約１７．２％、約５．８％、約１．８％、約０．５％の水素ガスの生成量を維持していた（図３）。
【００８５】
特許文献１に開示されているエンテロバクター・アエロゲネス菌株では、グリセロール濃度が８質量％を超えるとほとんど水素ガスを生成しない。したがって、上述の高濃度グリセロール耐性は、従来のグリセロール分解菌には見られなかった特性である。
【００８６】
〔実施例６〕
（回分培養によるバイオディーゼル廃液の処理）
ＬＢ培地中、３７℃で終夜振とう培養したＰＥＧ２株３０ｍｌを、１５Ｌの原料液（組成；酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、バイオディーゼル廃液（グリセロールの含有量が約２質量％となるように添加）、ｐＨ６．３）に添加した。嫌気条件下、３７℃、１００ｒｐｍの振とう速度で約１６時間培養を行った後、水素ガスの生成量、１，３−プロパンジオールの生成量及び残留グリセロール量の測定を行った。
【００８７】
表６に測定結果を示した。
【表６】
【００８８】
約１６時間の培養で、ＰＥＧ２株によりグリセロールを完全分解することができた。なお、経時変化は観察していないため、より短時間でグリセロールを完全分解できた可能性がある。また、グリセロールの分解により、水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生産することができた。この結果より、ＰＥＧ２株はグリセロールを原料としたバイオリファイナリーの実施に適した菌株であることが示された。
【００８９】
〔実施例７〕
（培地ｐＨの影響）
培地ｐＨの影響は、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、グリセロール １質量％及び０．６Ｍ Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒを含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で１９．５時間培養を行い、ｐＨ３．０〜９．０としたときの水素ガスの生成量を測定することにより解析した。なお、Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒとして、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５及び７．０のときはＭＥＳを、ｐＨ７．５及び８．０のときは２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を、ｐＨ８．５及び９．０のときはＮ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＥＳ）を用いた。また、ｐＨ３．０、３．５、４．０及び４．５のときはＧｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒを添加しなかった。
【００９０】
図４は培地ｐＨの影響を示すグラフである。ｐＨ３．５〜８．５のとき水素ガス生成が可能であった。また、ｐＨ４．０〜６．５のとき菌密度（ＯＤ６６０）に比例した水素ガス生成が可能であった。菌密度と水素ガス生成量との関係から、培地ｐＨが酸性であった方が水素ガス生成に有利であった（図４）。
【００９１】
〔実施例８〕
（発酵温度の影響）
発酵温度の影響は、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、グリセロール １質量％及び０．２Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃及び５０℃で１９時間培養を行い、水素ガスの生成量を測定することにより解析した。
【００９２】
図５は発酵温度の影響を示すグラフである。発酵温度が３５℃付近であるときに水素ガス生成量が極大となり、それよりも発酵温度が高く又は低くなるにつれ、水素ガス生成量が減少した（図５）。
【００９３】
〔実施例９〕
（発酵基質の影響）
発酵基質をグルコース、グリセロール又はマンニトールとした場合の水素ガスの生成量を測定した。酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、発酵基質 １質量％及び０．２Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で１９．３時間培養を行い、水素ガスの生成量を測定した。
【００９４】
図６は発酵基質の影響を示すグラフである。ＰＥＧ２株はグリセロールのみならず、グルコース及びマンニトールを発酵基質として水素ガスを生成する能力を有していた。特に、マンニトールを発酵基質とした場合の水素ガス生成量はグリセロールを発酵基質とした場合の水素ガス生成量に匹敵するものであった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の新規微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、バイオディーゼル廃液の処理に好適に用いることができる。さらに、本発明の新規微生物はグリセロールを資化して水素ガス、１，３−プロパンジオールを生成することができる。これらはエネルギー源又は樹脂原料等として利用することができ、例えば、水素ガスは、燃料電池の燃料として用いることができ、１，３−プロパンジオールは、合成繊維原料の一種であるポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）の原料として用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物並びにそれを用いた水素製造方法、１，３−プロパンジオール製造方法及びバイオディーゼル廃液の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼルは、植物性油脂や廃油等の油脂（トリグリセリド）を主原料として製造される脂肪酸エステルのことであり、軽油等の代替燃料として期待されている。バイオディーゼルを製造する方法として、現在化学触媒法が広く用いられている。化学触媒法は、油脂にメタノールと触媒（アルカリ）を加えてエステル交換反応を行い、脂肪酸メチルエステル（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｍｅｔｈｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＦＡＭＥ）をバイオディーゼルとして得るものである。その反応は下記化学式（１）で表される。
【０００３】
【化１】
【０００４】
一方、上記化学式（１）に示されるように、副産物としてグリセロールを高濃度で含有する廃液（バイオディーゼル廃液）が生じ、その処理が問題となっている。このバイオディーゼル廃液を原料とし、これから生物学的にエネルギーや有用物質を生産する、いわゆるバイオリファイナリーが試みられている。
【０００５】
例えば、特許文献１及び２には、グリセロールを資化して水素及びエタノールを産生するエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）に属する菌を利用して、グリセロールから水素及びエタノールを製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１８３１６２号公報
【特許文献２】特開２００６−１８０７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バイオディーゼル廃液には、非常に高濃度でグリセロールが含まれている。ところが、特許文献１及び２に開示されたエンテロバクター・アエロゲネスに属する菌は、グリセロール濃度が高いとき、グリセロールを資化する能力が著しく阻害されるため、バイオディーゼル廃液のような高濃度でグリセロールを含有する試料を効率よく処理することができないという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができる新規な微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物を提供する。
【００１０】
本発明の微生物は、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及びグリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成する能力を有する。そのため、グリセロールを原料としたバイオリファイナリーに用いることができる。さらに、本発明の新規微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、バイオリファイナリーの効率を高めることができる。
【００１１】
上記微生物は、１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できることが好ましい。また、上記微生物として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８号）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で２０１０年６月１８日に受託されているクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ｓｐ．ＰＥＧ２株とすることができる。
【００１２】
上記微生物は、グリセロールを資化して水素ガスを生成することができる。上記微生物はまた、グリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成することができる。そこで、本発明は、グリセロールを基質として、上記微生物に水素ガスを生成させる水素製造方法を提供する。本発明はまた、グリセロールを基質として、上記微生物に１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法も提供する。
【００１３】
上記水素製造方法及び１，３−プロパンジオール製造方法においては、上記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものであることが好ましい。上記微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、グリセロールが高濃度で含まれるバイオディーゼル廃液を効率よく処理することができる。
【００１４】
本発明はまた、上記微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法も提供する。
【００１５】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、上記分解工程において生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収することが好ましい。上記微生物はグリセロールを分解して、エネルギー又は有用物質として利用できる水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成できるため、これらを回収することによって効率よくバイオリファイナリーを行うことができる。
【００１６】
本発明はさらに、バイオディーゼル廃液を含む原料液と上記微生物とを接触させ、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法を提供する。
【００１７】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の新規微生物によれば、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、高濃度でグリセロールが含まれるバイオディーゼル廃液等の処理を効率よく行うことができる。
【００１９】
また、本発明の新規微生物は、グリセロールを資化して水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生成することができる。そのため多種多様なエネルギー物質や有用物質を製造することができ、グリセロールを原料としたバイオリファイナリーをより効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】簡易分子系統解析結果を示す図である。
【図２】実施例４の結果を示すグラフである。
【図３】実施例５の結果を示すグラフである。
【図４】実施例７の結果を示すグラフである。
【図５】実施例８の結果を示すグラフである。
【図６】実施例９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の微生物は、クレブシエラ属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力、グリセロールを資化して１，３−プロパンジオールを生成する能力、及び１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化する能力を備えるものである。
【００２２】
上記微生物は、グリセロール耐性を有しており、高濃度のグリセロール存在下でも生存することができ、またグリセロールを資化することができる。なお、グリセロール耐性とは、グリセロール存在下においても、生存又は増殖することができる性質をいう。グリセロール存在下においても、グリセロールを資化することができる性質は、グリセロール耐性の一例である。
【００２３】
上記微生物は、より高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化できることが好ましく、１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できるものであることが好ましい。また、２０質量％、２５質量％又は３０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化できるものであることがさらに好ましい。
【００２４】
上記微生物は、また、表１の菌学的性質を示すことが好ましい。
【表１】
【００２５】
上記微生物は、ＬＢ寒天培地上で、３０℃、４８時間培養したときに直径２．０−３．０ｍｍの周縁全縁の円形、表面の形状がスムーズ、レンズ状で、不透明な淡黄色コロニーを形成することが好ましい。
【００２６】
また、上記微生物は、配列番号１で特定される塩基配列に対して９９．７％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することが好ましく、９９．８％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することがより好ましく、９９．９％以上の相同率を示す１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有することがさらに好ましい。
【００２７】
上記微生物として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で特定されるクレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株とすることができる。クレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株は、高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化して水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成する能力に加え、マンニトールを資化して水素ガスを生成する能力も有している。マンニトールは、バイオマスの有力候補である海藻に多く含まれる成分であるため、クレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株は、海藻を原料としたバイオマスエネルギーの生産にも用いることができる。なお、「バイオマス」とは、エネルギー等として利用することができる生物に由来する資源を意味する。
【００２８】
上記微生物によれば、グリセロールを資化して水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生成することができる。また、このグリセロールを資化する能力は高濃度のグリセロールが存在しても維持される。したがって、例えば、高濃度のグリセロールが含まれるバイオディーゼル廃液等の処理を効率よく行うことができ、また、その処理と同時に水素ガス、エタノール及び１，３−プロパンジオールを生産することもできる。
【００２９】
本発明の微生物は、このような特性を有していればよく、したがって、高濃度のグリセロール存在下でグリセロールを資化して水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有するクレブシエラｓｐ．ＰＥＧ２株の変異株であってもよい。
【００３０】
本発明の微生物は、例えば、バイオディーゼル製造工場からの排水等から採取したサンプル（微生物群）を、グリセロール存在下で増殖する能力を指標としたスクリーニングを行うことにより単離することができる。さらに、グリセロール存在下で増殖する能力に加え、グリセロール存在下での水素ガス生成能力又は１，３−プロパンジオール生成能力を指標として併用してスクリーニングを行ってもよい。
【００３１】
具体的な方法としては、例えば、炭素源としてグリセロールのみを１〜２０質量％の濃度で含む培地（例えば、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）を培養フラスコに添加し、更にバイオディーゼル製造工場からの排水等から採取したサンプルを微生物源として少量添加する。これを適切な条件下（例えば、嫌気条件下、３７℃、２４時間、静置又は微生物が沈降しない程度に攪拌）で培養する。これにより、グリセロール資化性を有し、更にグリセロール耐性を有する微生物を優先的に増殖させることができる。
【００３２】
また、培養後、培養フラスコに含まれる水素ガスを定量し、水素ガスを生成するサンプルを選定することもできる。水素ガスの定量は、例えば、培養フラスコに接続したガス捕集バックに捕集されたガス量の測定及びガスクロマトグラフィーによる捕集されたガスの組成分析により行うことができる。また、培養後、培養液に含まれる１，３−プロパンジオールを定量し、１，３−プロパンジオールを生成するサンプルを選定することもできる。１，３−プロパンジオールの定量は、例えば、液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００３３】
培養により増殖した微生物群から、純粋分離により、本発明に係る微生物を単離することができる。純粋分離は当業者によく知られた方法で実施することが可能であり、例えば、寒天培地上に接種して培養することにより、純粋分離されたコロニーを形成させることができ、そのコロニーをピックアップすることで目的とする微生物を単離することができる。寒天培地にはグリセロールを含ませておくことが好ましい。
【００３４】
また、培養後に培養液の一部を、新鮮なグリセロールを含む培地を添加した培養フラスコに再度接種して、再度培養を行うこともできる。培養後のサンプルに対し、上述の純粋分離を行うこともできるし、再びこの培養サイクルを繰り返すこともできる。培養サイクルを増やすことにより、目的とする微生物を集積させることができる。
【００３５】
上述のようにして単離した微生物の同定、性状及び性質等の解析は、公知の種々の同定試験方法又は市販されている同定キットを用いて行うことができる。また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列をシークエンスし、相同性検索、分子系統解析により、微生物の同定を行うこともできる。
【００３６】
クレブシエラ属に属する微生物は、上述のように決定した１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を相同性検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴプログラム）を用いて、塩基配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性検索を行い、他のクレブシエラ属に属する微生物と高い相同性を示す微生物を選抜することによって得ることができる。また、菌学的性質に基づいて（例えば、表１に示した菌学的性質）、クレブシエラ属に属する微生物を選抜することにより得ることもできる。さらに、これらを組み合わせて選抜することが好ましい。
【００３７】
本発明は、上記微生物にグリセロールを基質として水素ガスを生成させる水素製造方法又は上記微生物にグリセロールを基質として１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法とすることもできる。
【００３８】
上記水素製造方法においては、上記微生物と基質となるグリセロールを含有する原料液とを接触させて、上記微生物に水素発酵を行わせる。水素発酵の方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。
【００３９】
また、原料液を供給する方法によって異なる培養方法を採用することができる。具体的には、例えば、一定の速度で原料液を供給し、同時に同量の原料液を抜き取りながら連続的に培養する方法（灌流培養法）、一回毎に新たな原料液を用意し、培養中に原料液（成分）の添加や抜き取りを行わずに培養する方法（回分培養法）、培養中に原料液（成分）の添加や抜き取りを行わずに回分培養と同様にして培養を行った後、培養液の一部に新たな原料液を供給して回分培養を繰り返す方法（繰り返し回分培養法）、回分培養と原則同じ操作を行うが、培養中に原料液中の特定の成分のみを追加的に添加する培養方法（流加培養法）等が挙げられる。このうち、上記水素製造方法においては、副産物による水素ガス生成効率の低下を回避する観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００４０】
水素製造に用いる原料液としては、グリセロールを含有するものであれば、特に制限はなく、具体的には、石鹸製造廃液、バイオディーゼル廃液等が挙げられる。これらの中でも、バイオディーゼル廃液が好ましい。バイオディーゼル廃液は、多量にグリセロールを含んでいるうえ、含有するグリセロールに有用な用途がないことから、上記水素製造方法における原料として好ましく利用可能である。なお、原料液に含まれるバイオディーゼル廃液の含有量は、例えば、グリセロール濃度換算で０．１〜４５質量％の間で、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００４１】
また、原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００４２】
水素発酵の際の反応条件（培養条件）として、反応温度（発酵温度）を１０〜５０℃の間で設定することができ、１５〜４５℃の間で設定することが好ましく、３０〜４０℃の間で設定することがより好ましい。具体的には、例えば、反応温度を３５℃（±３℃）とすると増殖効率及び水素ガス生成効率が高くなるため、好ましい。また、ｐＨは３．０〜９．０の間で設定することができ、４．０〜８．０の間で設定することが好ましい。さらに、本発明の上記微生物は、酸性条件の方が水素ガス生成効率が高いため、ｐＨを５．５〜６．５の間で設定することがより好ましい。反応時間は、例えば、６〜４８時間とすることもできるし、原料液中のグリセロールの濃度をリアルタイムで計測し、グリセロールが予め設定した濃度以下となったところで反応を終了してもよい。反応液中のグリセロール濃度を定量する方法としては、例えば、上述した液体クロマトグラフィーにより測定する方法等が挙げられる。また、「予め設定した濃度」は、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。例えば、１．０質量％とすることや、０．５質量％とすることができる。また、０質量％（グリセロールの完全分解）としてもよい。
【００４３】
本明細書において、バイオディーゼル廃液とは、油脂をメチル（又はエチル）エステル化して、脂肪酸メチル（又はエチル）エステル（バイオディーゼル）を取り除いた後のグリセロールを含む廃液を意味する。
【００４４】
上記油脂としては、特に限定されるものではないが、例えば、菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、コメ油、ヘンプ・オイル（大麻油）等の植物油、魚油や豚脂、牛脂などの獣脂及び廃食用油（いわゆる天ぷら油等）等が挙げられる。
【００４５】
上記１，３−プロパンジオール製造方法においては、上記微生物と基質となるグリセロールを含有する原料液とを接触させて、上記微生物に１，３−プロパンジオール発酵を行わせる。１，３−プロパンジオール発酵の方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。
【００４６】
原料液の供給方法としては、例えば、灌流培養法、回分培養法、繰り返し回分培養法、流加培養法等が挙げられる。このうち、上記１，３−プロパンジオール製造方法においては、副産物による１，３−プロパンジオール生成効率の低下を回避する観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００４７】
１，３−プロパンジオール製造に用いる原料液としては、グリセロールを含有するものであれば、特に制限はなく、具体的には、石鹸製造廃液、バイオディーゼル廃液等が挙げられる。これらの中でも、バイオディーゼル廃液が好ましい。原料液に含まれるバイオディーゼル廃液の含有量は、例えば、グリセロール濃度換算で０．１〜４５質量％の間で、水素製造の効率（コスト、収率等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００４８】
また、原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００４９】
１，３−プロパンジオール発酵の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００５０】
さらに、本発明は、上記微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法とすることができる。
【００５１】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、分解工程で、上記微生物と基質となるグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液とを接触させて、上記微生物にグリセロールの資化を行わせる。バイオディーゼル廃液は、所定のグリセロール濃度となるよう希釈して、バイオディーゼル廃液を含む原料液を調製してから上記微生物と接触させることが好ましい。所定のグリセロール濃度としては、例えば、０．１〜４５質量％の間で、バイオディーゼル廃液の処理効率（コスト等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００５２】
グリセロールの資化方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。また、原料液の供給方法としては、例えば、灌流培養法、回分培養法、繰り返し回分培養法、流加培養法等が挙げられる。このうち、上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、副産物による処理効率の低下への影響をより小さく抑えることができるという観点から、繰り返し回分培養法が好ましい。
【００５３】
原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００５４】
グリセロールの資化の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００５５】
上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、グリセロールの分解に伴って生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収する回収工程を有することが好ましい。水素ガス又は１，３−プロパンジオールの回収は、分解工程と並行して行ってもよいし、分解工程が終了してから行ってもよい。水素ガスの回収は、例えば、反応容器（培養容器）に水素ガスを回収するための管を配置して、分解工程と並行して回収することができる。また、１，３−プロパンジオールの回収は、例えば、分解工程後の原料液を回収して、蒸留等により行うことができる。
【００５６】
さらに本発明は、バイオディーゼル廃液を含む原料液と上記微生物とを接触させ、上記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法を提供する。上記バイオディーゼル廃液の処理方法においては、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法とすることができる。
【００５７】
バイオディーゼル廃液は、所定のグリセロール濃度となるよう希釈して、バイオディーゼル廃液を含む原料液を調製してから上記微生物と接触させることが好ましい。所定のグリセロール濃度としては、例えば、０．１〜４５質量％の間で、バイオディーゼル廃液の処理効率（コスト等）等を勘案して適宜設定してよい。
【００５８】
グリセロールの資化方法としては、上記微生物を種培養した後、又は種培養することなく、原料液中で液体培養する方法や、上記微生物を固定化した支持体又は担体を原料液中に添加する方法等が挙げられる。また、本実施形態においては、回分培養を繰り返し行うこと（繰り返し回分培養法）を特徴としている。
【００５９】
原料液中には、グリセロールの他に、栄養成分（グリセロール以外の炭素源、窒素源等）、発育促進剤、抗生物質等の殺菌剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、消泡剤等を含んでいてもよい。
【００６０】
グリセロールの資化の際の反応条件（培養条件）としては、上述の水素発酵の際の反応条件（培養条件）と同様に設定することができる。
【００６１】
また、グリセロールの分解に伴って生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収することが好ましい。水素ガスの回収は、反応容器（培養容器）に水素ガスを回収するための管を配置して、グリセロールの分解と並行して回収することができる。また、１，３−プロパンジオールの回収は、反応後（培養後）の原料液を回収して、蒸留等により行うことができる。
【実施例】
【００６２】
〔実施例１〕
（グリセロール資化性水素生産菌の探索）
バイオディーゼル（ＦＡＭＥ）製造工場の排水を微生物源として、集積培養により、グリセロール資化性水素生産菌の探索を行った。
【００６３】
ＦＡＭＥ培地（組成；バイオディーゼル廃液 グリセロール濃度換算で１質量％となるように添加、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に、バイオディーゼル製造工場の排水を加え、嫌気条件下、３７℃で、２４時間、ガス捕集袋を取り付けたメジウムボトル内にて集積培養した。ガス捕集袋に捕集されたバイオガス量の測定及びガスクロマトグラフィー（島津社製 ＧＣ−１４Ｂ）によるガス組成分析を行い、水素ガス量を決定した。ガス組成分析条件は以下のとおりである。
・検出器：ＴＣＤ （６０ｍＡ）
・カラム：ポラパックＮ，モレキュラーシーブ１３Ｘ，ポラパックＱ
・キャリアガス：アルゴン
・カラム温度：６０℃
・インジェクション温度：６０℃
・ディテクター温度：８０℃
【００６４】
培養後の培養液５０ｍｌを新しいＦＡＭＥ培地２００ｍｌに添加することによって継代し、水素ガスの発生量が安定するまで、培養を繰り返した。水素ガスが安定して発生するようになったところで、培養液をグリセロール寒天培地（グリセロール １０ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、３７℃のインキュベーター中で、４８時間嫌気培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーを単離し、１０ｍｌのＦＡＭＥ培地を含有する２０ｍｌバイアルに播種し、密閉された状態で、嫌気条件下、３７℃で、２４時間培養した。培養後、バイアルの空寸部に含まれる水素ガスを上述の方法によって定量し、水素ガスを生成した菌株を選択した。
【００６５】
〔実施例２〕
（ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析による同定）
実施例１で取得した菌株のひとつであるＰＥＧ２株について、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列解析により菌株の同定を行った。
【００６６】
ＰＥＧ２株からＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより、全長１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンスを実施した。サイクルシークエンスを実施したサンプルは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘ１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステム社製）装置を用いて塩基配列データを分析し、分析データをＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ１．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．）ソフトウェアを用いて解析し、塩基配列を決定した（配列番号１）。各実験手順は、それぞれのキットに付属のマニュアルの記載にしたがった。
【００６７】
決定したＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列について、アポロンＤＢ−ＢＡ ｖｅｒ５．０（テクノスルガ・ラボ社製）データベース又は国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対する、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた相同性検索を実施した。アポロンＤＢ−ＢＡ ｖｅｒ５．０データベースを用いた検索の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ１３８８３株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９９．４％の相同率を示した（表２）。また、国際塩基配列データベースを用いた検索の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に由来する１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と高い相同性を示した（表３）。
【００６８】
【表２】
【００６９】
【表３】
【００７０】
次に、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と、表２に示した上位１５株及びＳｅｒｒａｔｉａ属の基準株であるＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ｓｕｂｓｐ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＤＳＭ３０１２１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を用い、アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社製）ソフトウェアを用いた簡易分子系統解析を実施した。
【００７１】
簡易分子系統解析の結果、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の種及びＳ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列で形成されるクラスターに含まれた（図１）。また、ＰＥＧ２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はこのクラスターの中で、単独で系統枝を形成した（図１）。なお、図１中、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を示す。
【００７２】
以上の結果から、ＰＥＧ２株は属レベルではＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に含まれると考えられる。一方、単独で系統枝を形成したように、近縁となる既知種が認められないことから、種レベルでの帰属分類群を推定することはできず、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．とすることが妥当であると考えられる。
【００７３】
〔実施例３〕
（ＰＥＧ２株の菌学的性質の解析）
ＰＥＧ２株について、光学顕微鏡（ＢＸ５０Ｆ４、オリンパス社製）による形態観察、Ｂａｒｒｏｗらの方法（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３年，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）に基づいた、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）の試験を実施した。また、フェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬社製）を用いてグラム染色性解析を実施した。さらに、ＡＰＩ２０Ｅキット（ビオメリュー社製）を用い、表４及び５に示した各項目についての試験を実施した。各項目の判定はキットに添付のマニュアルに従った。
【００７４】
【表４】
【００７５】
【表５】
【００７６】
ＰＥＧ２株をＬＢ寒天培地で、３０℃、４８時間培養し、形態観察を行った。その結果、ＰＥＧ２株は、直径２．０−３．０ｍｍの周縁全縁の円形、表面の形状がスムーズ、レンズ状で、不透明な淡黄色コロニーを形成した。
【００７７】
ＰＥＧ２株の菌学的性質の解析結果を表４及び５に示した。ＰＥＧ２株は、運動性を有しないグラム陰性短桿菌で、グルコースを発酵し、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性という性状を示した（表４及び５）。これらの性状は、腸内細菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の性状と一致すると考えられた（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９９３年，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）。
【００７８】
一方、ＰＥＧ２株は、β−ガラクトシダーゼ及びリシンデカルボキシラーゼ活性を示し、アルギニンジヒドロラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ及びウレアーゼ活性を示さず、クエン酸を利用し、アセトインを産生し、ゼラチンを加水分解せず、Ｄ−マンニトール、イノシトール及びＬ−ラムノースを発酵し、４℃で生育せず、ＫＣＮ培地で生育し、乳糖及びα−メチル−Ｄ−グルコシドを酸化し、Ｌ−アラビトールを酸化しなかった（表４及び５）。これらの性状は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の既知種の性状と類似性は認められるものの、完全に一致する種は認められなかった（坂崎利一他，腸内細菌，下巻，近代出版，１９９２年）。
【００７９】
以上、実施例２及び３の結果から、ＰＥＧ２株はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に含まれると考えられるが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の既知種とは、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列及び菌学的性質に明確な相違点があることから、新規微生物であると考えられる。よって、ＰＥＧ２株をＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥＧ２株であると結論した。
【００８０】
〔実施例４〕
（回分培養によるグリセロールからの水素及び１，３−プロパンジオール生産）
ＬＢ培地中、３７℃で１１時間振とう培養したＰＥＧ２株５０ｍｌを、４５０ｍｌの原料液（組成；酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、バイオディーゼル廃液（グリセロールの含有量が約５質量％となるように添加）、ｐＨ６）を含む１Ｌ容ミニジャーに添加した。窒素ガスでミニジャー中のガスを置換し、１Ｌファーメンター（ＢＭＪ−０１ＰＩ、ＡＢＬＥ＆Ｂｉｏｔｔ社製）を用い、嫌気条件下、３４℃、１５０ｒｐｍの振とう速度で培養を行った。１３時間培養した後、培養液を約５０ｍｌ残し、４５０ｍｌの新しい原料液を加えて、培養を繰り返した。経時的に培養液及びガスのサンプリングを行い、水素ガスの生成量、１，３−プロパンジオールの生成量、エタノール生成量及び残留グリセロール量の測定を行った。
【００８１】
１，３−プロパンジオール、エタノール、グリセロールは高速液体クロマトグラフィーにより以下の分析条件で定量した。なお、水素ガスの定量方法は実施例１に記載した通りである。
・移動液：純水
・カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ（島津社製）
・カラム温度：７０℃
・流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
・検出器：示唆屈折計
【００８２】
図２は回分培養によるグリセロールからの水素及び１，３−プロパンジオール生産の結果を示すグラフである。培養時間の経過とともにグリセロール残存量が減少した。これは、ＰＥＧ２株によってグリセロールが分解されたことを示している（図２）。また、グリセロールの分解に伴って、水素ガス、１，３−プロパンジオール及びエタノールが生成した（図２）。
【００８３】
〔実施例５〕
（グリセロール濃度の影響）
酵母エキスを２．５ｇ／Ｌ、ペプトンを２．５ｇ／Ｌ、２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＥＳ）を０．２Ｍ、及びグリセロールを１．０％、２．５％、５．０％、７．５％、１０．０％、１５．０％、２０．０％、２５．０％、３０．０％、３５．０％、４０．０％（いずれも質量％）含む原料液１０ｍｌ（ｐＨ６．５）を２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で２２時間静置培養した。培養後の水素ガス生成量とＯＤ６６０値を測定し、グリセロール濃度による影響を解析した。
【００８４】
図３は水素生産に及ぼすグリセロール濃度の影響を示すグラフである。ＰＥＧ２株はグリセロールが１０質量％という高い濃度で存在した場合でも生育に問題はなく、また、水素ガスの生成量は、１．０質量％のときの７２．６％を維持していた（図３）。さらに、グリセロール濃度が１５．０質量％、２０．０質量％、２５．０質量％、３０．０質量％、３５．０質量％、４０．０質量％となった場合でも、それぞれ１．０質量％のときの約４９．３％、約３０．７％、約１７．２％、約５．８％、約１．８％、約０．５％の水素ガスの生成量を維持していた（図３）。
【００８５】
特許文献１に開示されているエンテロバクター・アエロゲネス菌株では、グリセロール濃度が８質量％を超えるとほとんど水素ガスを生成しない。したがって、上述の高濃度グリセロール耐性は、従来のグリセロール分解菌には見られなかった特性である。
【００８６】
〔実施例６〕
（回分培養によるバイオディーゼル廃液の処理）
ＬＢ培地中、３７℃で終夜振とう培養したＰＥＧ２株３０ｍｌを、１５Ｌの原料液（組成；酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、バイオディーゼル廃液（グリセロールの含有量が約２質量％となるように添加）、ｐＨ６．３）に添加した。嫌気条件下、３７℃、１００ｒｐｍの振とう速度で約１６時間培養を行った後、水素ガスの生成量、１，３−プロパンジオールの生成量及び残留グリセロール量の測定を行った。
【００８７】
表６に測定結果を示した。
【表６】
【００８８】
約１６時間の培養で、ＰＥＧ２株によりグリセロールを完全分解することができた。なお、経時変化は観察していないため、より短時間でグリセロールを完全分解できた可能性がある。また、グリセロールの分解により、水素ガス及び１，３−プロパンジオールを生産することができた。この結果より、ＰＥＧ２株はグリセロールを原料としたバイオリファイナリーの実施に適した菌株であることが示された。
【００８９】
〔実施例７〕
（培地ｐＨの影響）
培地ｐＨの影響は、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、グリセロール １質量％及び０．６Ｍ Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒを含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で１９．５時間培養を行い、ｐＨ３．０〜９．０としたときの水素ガスの生成量を測定することにより解析した。なお、Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒとして、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５及び７．０のときはＭＥＳを、ｐＨ７．５及び８．０のときは２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を、ｐＨ８．５及び９．０のときはＮ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＥＳ）を用いた。また、ｐＨ３．０、３．５、４．０及び４．５のときはＧｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒを添加しなかった。
【００９０】
図４は培地ｐＨの影響を示すグラフである。ｐＨ３．５〜８．５のとき水素ガス生成が可能であった。また、ｐＨ４．０〜６．５のとき菌密度（ＯＤ６６０）に比例した水素ガス生成が可能であった。菌密度と水素ガス生成量との関係から、培地ｐＨが酸性であった方が水素ガス生成に有利であった（図４）。
【００９１】
〔実施例８〕
（発酵温度の影響）
発酵温度の影響は、酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、グリセロール １質量％及び０．２Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃及び５０℃で１９時間培養を行い、水素ガスの生成量を測定することにより解析した。
【００９２】
図５は発酵温度の影響を示すグラフである。発酵温度が３５℃付近であるときに水素ガス生成量が極大となり、それよりも発酵温度が高く又は低くなるにつれ、水素ガス生成量が減少した（図５）。
【００９３】
〔実施例９〕
（発酵基質の影響）
発酵基質をグルコース、グリセロール又はマンニトールとした場合の水素ガスの生成量を測定した。酵母エキス ２．５ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、発酵基質 １質量％及び０．２Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）を含む原料液１０ｍｌを２０ｍｌバイアルに入れ、ＰＥＧ２株を播種して、３４℃で１９．３時間培養を行い、水素ガスの生成量を測定した。
【００９４】
図６は発酵基質の影響を示すグラフである。ＰＥＧ２株はグリセロールのみならず、グルコース及びマンニトールを発酵基質として水素ガスを生成する能力を有していた。特に、マンニトールを発酵基質とした場合の水素ガス生成量はグリセロールを発酵基質とした場合の水素ガス生成量に匹敵するものであった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の新規微生物は、高濃度のグリセロール存在下でもグリセロールを資化することができるため、バイオディーゼル廃液の処理に好適に用いることができる。さらに、本発明の新規微生物はグリセロールを資化して水素ガス、１，３−プロパンジオールを生成することができる。これらはエネルギー源又は樹脂原料等として利用することができ、例えば、水素ガスは、燃料電池の燃料として用いることができ、１，３−プロパンジオールは、合成繊維原料の一種であるポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）の原料として用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物。
【請求項２】
１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で特定される微生物。
【請求項４】
グリセロールを基質として、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に水素ガスを生成させる水素製造方法。
【請求項５】
前記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものである、請求項４に記載の水素製造方法。
【請求項６】
グリセロールを基質として、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法。
【請求項７】
前記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものである、請求項６に記載の１，３−プロパンジオール製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項９】
前記分解工程において生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収する、請求項８に記載のバイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項１０】
バイオディーゼル廃液を含む原料液と請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物とを接触させ、前記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項１１】
前記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、請求項１０に記載のバイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項１】
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属に属し、グリセロールを資化して水素ガスを生成する能力及び１，３−プロパンジオールを生成する能力を有し、かつ、１０質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる微生物。
【請求項２】
１５質量％のグリセロール存在下でグリセロールを資化することのできる、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−９５６で特定される微生物。
【請求項４】
グリセロールを基質として、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に水素ガスを生成させる水素製造方法。
【請求項５】
前記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものである、請求項４に記載の水素製造方法。
【請求項６】
グリセロールを基質として、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に１，３−プロパンジオールを生成させる１，３−プロパンジオール製造方法。
【請求項７】
前記グリセロールが、バイオディーゼル廃液に含まれるものである、請求項６に記載の１，３−プロパンジオール製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物に、バイオディーゼル廃液中に含まれるグリセロールを分解させる分解工程を有するバイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項９】
前記分解工程において生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収する、請求項８に記載のバイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項１０】
バイオディーゼル廃液を含む原料液と請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物とを接触させ、前記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させた後、グリセロールが減少した原料液の少なくとも一部を、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、バイオディーゼル廃液の処理方法。
【請求項１１】
前記バイオディーゼル廃液中のグリセロールを分解させることで、グリセロールを予め設定した濃度まで減少させるとともに、生成する水素ガス又は１，３−プロパンジオールを回収した後、バイオディーゼル廃液を含む他の原料液と交換する、請求項１０に記載のバイオディーゼル廃液の処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−４４８８１（Ｐ２０１２−４４８８１Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８７４３５（Ｐ２０１０−１８７４３５）
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
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