新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ、ＢおよびＭ物質
本発明は、抗真菌活性を有する新規化合物ＰＦ１２３７Ａ、ＰＦ１２３７ＢおよびＰＦ１２３７Ｍ物質、およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するＰＦ１２３７生産菌株を培養することによる当該新規化合物の製造方法ならびに当該新規化合物を含有する抗真菌剤を提供する。本発明の新規化合物群は、抗真菌活性を有するため、医薬、農薬、衛生用品の分野で、抗真菌剤として使用することができる。特に真菌感染症の治療薬としての活用が期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの塩、それらの製造法ならびにそれらを有効成分とする抗真菌剤に関するものである。
【背景技術】
１９５０年代以降の抗生物質に関する研究開発の急速な進歩およびその広範な普及により、細菌性の感染症に対する多くの治療薬が開発されてきた。その一方で、平素は無害な弱病原性微生物による感染症、いわゆる日和見感染症が近年大きな問題になりつつある。この日和見感染症は免疫不全症や悪性腫瘍等の疾病、または免疫抑制剤や抗炎症剤等の投与によって免疫機能が低下した場合、また抗生物質の投与による共生菌の抑制から生じる菌交代などが原因とされている。このような日和見感染症の中で真菌が原因である症例が数多く報告されている。また、本発明によるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質と物理化学的性状が類似する化合物として、パプラカンジンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ（Ｐａｐｕｌａｃａｎｄｉｎｓ）［トラキセラー（Ｔｒａｘｌｅｒ）ら、ジャーナルオブアンティバイオティックス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）３０：２８９−２９６，１９７７］、カエティアカンジン（Ｃｈａｅｔｉａｃａｎｄｉｎ）［コモリ（Ｋｏｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３８：４５５−４５９，１９８５］、Ｌ−６８７，７８１［ヴァンミドルスワース（Ｖａｎｍｉｄｄｌｅｓｗｏｒｔｈ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４４：４５−５１，１９９１］、Ｂｕ−４７９４Ｆ［アオキ（Ａｏｋｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６：９５２−９６０，１９９３］、サリカンジン（Ｓａｒｉｃａｎｄｉｎ）［ランダール（Ｒａｎｄａｌ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４９：５９６−５９８，１９９６］等が知られているが、抗真菌物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質はこれらの物質とは物理化学的性状が異なり明確に区別される。
現在使用されている主な抗真菌剤としては、ポリエンマクロライド系、アゾール系およびフルシトシン等がある。表在性真菌症の治療には、主に外用剤が使用され、それらには多種のイミダゾールやトリアゾール系の抗真菌剤を始め、アリルアミン系の抗真菌剤が用いられている。一方、深在性真菌症の治療においては、トリアゾール系薬剤であるフルコナゾールが、その高い安全性から多用されているが、これは抗菌スペクトルが狭いことが難点とされている。また、ポリエンマクロライド系薬剤であるアムホテリシンＢは抗菌スペクトルが広く、抗真菌活性は強いが同時に毒性も高く、安全性の面での問題が残されている。
このような背景からより有効かつ安全な抗真菌剤の提供とその有利な製造法は常に求められる課題である。本発明者らは、以上のような点に着目し、抗真菌活性を有する新規な化合物を提供するとともに、微生物の培養法を用いたそれらの製造法を提供することを目的とした。また、本発明の別の目的は、当該新規化合物を含有する医薬組成物および抗真菌剤の提供である。
【発明の開示】
本発明者らは、より有効かつ安全な新規抗真菌活性物質を見い出すため、幅広く微生物の探索を行った結果、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する菌を培養することによって、抗真菌活性を示す物質が培養物中に生産、蓄積されることを見い出した。
次いで、本発明者らは培養物中から式（１）で表される有効物質ＰＦ１２３７Ａ物質、式（２）で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質、および式（３）で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質をそれぞれ単離、精製し、これらの物理化学的性状からこれらの物質が新規物質であることを明らかにし、抗真菌活性を有することを確認した。これらの知見に基づいて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供するものである。
式（１）
で表されるＰＦ１２３７Ａ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（２）
で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（３）
で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質または薬理学的に許容されるその塩。
また、本発明は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属し、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を蓄積させ、当該培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の製造法を提供するもので。
さらに、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物および抗真菌剤に関する。
＜発明の実施の態様＞
本発明の第１の要旨とするところは、前述式（１）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質にある。
１．ＰＦ１２３７Ａ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ４１Ｈ６０Ｏ１６
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１５．２°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘ ｎｍ（ε）：２０７（１４２０），２２５（６４０），２６７（１４１０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘｃｍ−１：３４４０，２９３０，２８６０，１７１７，１６３６，１６１０，１４５８，１２４４，１１５４，１０７０，１０３６，１０１０，９７８，８４３，７４５
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．１６−１．５５（７Ｈ，ｍ），１．９７（３Ｈ，ｓ），１．９０−２．０３（３Ｈ，ｍ），２．２７−２．４１（４Ｈ，ｍ），３．４０−３．６３（４Ｈ，ｍ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），３．９４−４．１５（５Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１５．１Ｈｚ），５．４７（２Ｈ，ｍ），６．１１−６．２４（３Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１４．８Ｈｚ），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７５．７，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．７，７２．６，７２．０，６９．９，６４．１，６１．５，３９．９，３９．６，３９．３，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２８．３，２１．０，１４．３，１３．１，１２．２，９．５
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない。
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第２の要旨とするところは、前述式（２）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｂ物質にある。
２．ＰＦ１２３７Ｂ物質の物理化学的性状
（１）色および性状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ４２Ｈ６２Ｏ１６
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１９．８°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０８（１６００），２２５（７６０），２６７（１８５０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘｃｍ−１：３４３２，２９３２，２８７６，１７１７，１７０２，１６３６，１６１１，１２４６，１１５４，１０７１，９７８，８４３
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１０−１．５２（７Ｈ，ｍ），１．５８−１．７０（２Ｈ，ｍ），１．９７−２．１２（３Ｈ，ｍ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．３０−２．５０（４Ｈ，ｍ），３．４８−３．７３（４Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），４．０２−４．１４（４Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１０．５Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２６．１Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２５．７Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，３０．０Ｈｚ），５．４０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．１８−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１５．７Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７４．９，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．８，７２．６，７２．０，７０．０，６４．１，６１．５，３９．８，３９．６，３９．３，３７．０，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１９．５，１４．３，１４．１，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第３の要旨とするところは、前述式（３）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｍ物質にある。
３．ＰＦ１２３７Ｍ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ３８Ｈ５６Ｏ１５
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１０．０°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘ ｎｍ（ε）：２０６（１１５０），２２５（４７０），２６７（９４０）
（６）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘ ｃｍ−１：３４１０，２９３０，１７００，１６４０，１６１０，１４６０，１２４０，１１５０，１０７０，９８０，７４０
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１５−１．６５（７Ｈ，ｍ），１．９７−２．１５（３Ｈ，ｍ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．４４（２Ｈ，ｍ），３．４４−３．７２（６Ｈ，ｍ），３．８４−３．９２（２Ｈ，ｍ），４．０２−４．１６（３Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１，１４．９Ｈｚ），５．２７−５．４０（２Ｈ，ｍ），６．２３−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２，１５．８Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７０．２，１６１．６，１５４．６，１４５．５，１４１．３，１４０．０，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２６．９，１１６．５，１１２．０，１０５．２，１０３．０，１００．０，７７．１，７６．７，７６．３，７５．５，７５．０，７４．９，７３．９，７２．９，７２．０，６９．７，６１．７，６１．７，３９．８，３９．５，３９．４，３３．９，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１４．４，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第４の要旨とするところは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するＰＦ１２３７物質群を生産する菌を培養し、その培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とする、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の製造法である。
上記のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としては、例えば本発明者らが新たに分離したＰＦ１２３７株が挙げられる。なお、本発明で用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌は、本明細書に記載の微生物に限定されるものではない。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有している菌であればＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としていずれを用いてもよい。使用できる微生物の好適な例としては、ＰＦ１２３７株、あるいはこの菌株の継代培養物、人工変異株ならびに自然変異株、遺伝子組換え株などが挙げられる。ＰＦ１２３７株の菌学的性状は以下の通りである。
ＰＦ１２３７株の菌学的性状
（１） コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５３ｍｍに達する。濃黄色、放射状のしわを生じ、密な菌糸層からなり、束状の気生菌糸を中央に、なわ状の気生菌糸を周辺に生じる。分生子は形成しない。裏面は濃黄色となる。ツァペック寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５２ｍｍに達する。白色、平坦、薄い菌糸層からなる。分生子を疎らに形成する。裏面は白色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育しない。
（２） 形態的性状
菌糸は太く２．５μｍ以上である。フィアライドは無色、円筒形、菌糸側面より直立に生じ、先端は細まり、基部はややくびれ、４．０〜８．０ｘ１．５〜２．５μｍである。分生子は無色、楕円形〜円筒形、滑面、３．５〜７．５ｘ１．５〜２．５μｍ、フィアライドの先端に粘塊状に生じる。
以上の菌学的性状より、大分生子を形成しないが、ＰＦ１２３７株を不完全菌類のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌と同定した。なお、本菌株は以下のように独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６として国際寄託されている。
▲１▼寄託機関：国際寄託機関、独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託セ
ンター
住所： 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便
番号 ３０５−８５６６）
▲２▼寄託日： 原寄託日：平成１４年３月２９日
移管請求日：平成１５年６月２４日（平成１４年３月２９日に寄託さ
れたＦＥＲＭ Ｐ−１８７９８号より移管）
▲３▼寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６
生産菌の培養法
本発明の菌株を用いてＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する培養方法としては、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地を用い、一般に実施されている方法に従って培養することが可能である。
栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、デキストリン、でんぷん、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での培養法、特に液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は２５〜３０℃であるが、多くの場合２６℃付近で培養する。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産は、培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても、通常２〜１４日間でその蓄積が最高に達する。培養液中のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離、精製する。
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の精製法
本発明によって得られる新規抗真菌物質は主に菌体中に存在するので、菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂への吸脱着法、若しくは分配あるいはゲルろ過等のカラムクロマトグラフィーを単独又は組み合わせて行うことにより精製できる。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども精製に利用可能である。好ましい分離、精製の方法としては以下の方法が挙げられる。培養液から遠心分離により菌体を得る。得られた菌体からメタノールやアセトン等により活性成分を抽出する。この菌体抽出液を減圧下で溶媒を留去後酢酸エチル、クロロホルム等の水と混和し難い有機溶媒を用いて抽出する。抽出液を濃縮乾固後クロロホルム−メタノールの混液を溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー、次いで水−アセトニトリルの混液を溶出液とするＯＤＳカラムクロマトグラフィー、次にメタノールを溶出液としたセファデックスＬＨ２０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、さらに水−アセトニトリルの混液を溶出液とする高速液体クロマトグラフィー、を行うことにより目的とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を得ることが出来る。
本発明の要旨とするところは、本発明で得られる新規な抗真菌活性物質または薬理学的に許容されるその塩を含有する医薬組成物を提供することにある。薬理学的に許容しうる塩の典型例としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の有機アミン塩等を挙げることができる。
本発明に用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を医薬組成物として使用するには種々の投与形態あるいは使用形態に合わせて、公知の担体を組み合わせて製剤化すればよい。公知の担体としては、賦形剤（例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、ラクトース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびそのカルシウム塩、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等）潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリン酸ナトリウム等）、芳香剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ紛等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸など）懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）、分散剤（例えば界面活性化剤）などの医薬用として常用される種々の有機および無機の担体物質が上げられる。
本発明の化合物は、抗真菌剤として皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、坐薬等による非経口投与あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与などの全身投与のほか、軟膏剤、ローション剤、膣坐薬等の局所投与の形態を例示することができる。農薬用または衛生用品として本発明の化合物を活用する場合には、各分野で常用される調製方法を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
【実施例１】
種培地として、でんぷん２．０％、グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、小麦胚芽０．６％、酵母エキス０．３％、大豆粕０．２％および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。また、生産培地としては、グルコース５．０％（別に殺菌）、肉エキス０．４％、大豆粕１．０％、ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．２５％および炭酸カルシウム０．５％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
前記の種培地８０ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これにＰＦ１２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６）の斜面寒天培養の３〜４白金耳を植菌後、２６℃で３日間振とう培養した。次いで、種培地５００ｍＬを分注した２０００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これに上記種培養液を１０ｍＬずつ植菌し２６℃で２日間振とう培養した。さらに、生産培地６０Ｌを仕込んだ１００Ｌ容ジャーファメンター（福嶋鉄工（株）製）を１２１℃で３０分間殺菌し、これに上記種培養液を１．５Ｌ植菌し、撹拌数は最初１５０ｒｐｍ、２４時間後に１８０ｒｐｍ、通気量６０Ｌ／分、２６℃で５日間培養した。
こうして得られた培養液９０Ｌを遠心分離し菌体の沈殿物２０Ｌを得た。この菌体にメタノール４０Ｌを加え室温で１２０分攪拌した後、遠心分離により菌体を除去しメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液を減圧下に約５Ｌに濃縮し７Ｌの酢酸エチルを加え室温で６０分攪拌し沈殿物を除去することにより得られた酢酸エチル抽出液６Ｌを減圧下に濃縮し２８．８ｇの粗抽出物を得た。
得られた粗抽出物に４００ｍＬのヘキサンと２００ｍＬのメタノールを加え攪拌した後メタノール層を分離し減圧下に濃縮し２５．８ｇの粗抽出物を得た。これを７０ｍＬのメタノールに溶解し、１００ｇのシリカゲル（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬社製）を加えた後、減圧下でメタノールを留去した。得られた粗抽出物をシリカゲルに均一に吸着させた。これをグラスフィルター上のシリカゲル１００ｇに重層し、クロロホルム／メタノール溶液（メタノール濃度が０％を２．４Ｌ次いで１，１０，５０，１００％をそれぞれ２Ｌ）で溶出し活性画分を集めて減圧濃縮により残渣１８．８ｇを得た。
得られた残渣を１００ｍＬのアセトニトリルに溶解し２００ｍＬの蒸留水を加え懸濁させた。これをアセトニトリル／蒸留水＝３／７の混合溶媒にて平衡化したグラスフィルター上のコスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製）２００ｇに吸着した。本カラムを、アセトニトリル／蒸留水＝３／７ １．６Ｌ、アセトニトリル／蒸留水＝３／２ １．６Ｌ、およびメタノール５００ｍＬにて順じ溶離した。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む分画から有機溶媒を留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し減圧濃縮により残渣１．６５ｇを得た。
得られた残渣をメタノールを溶離液とするセファデックスＬＨ２０カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製、内径５ｃｍ、長さ８０ｃｍ）にかけ活性画分を濃縮乾固することにより粗物質７２１ｍｇを得た。
得られた粗物質を７．２ｍＬのメタノールに溶解し、その一部を用いアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で充填した高速液体クロマトグラフィー（カラム：イナートシルＯＤＳ−２、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社製）に注入しアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で溶出することを繰り返すことによりＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む画分をそれぞれ得た。得られた画分はそれぞれアセトニトリルを留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し濃縮乾固することによりＰＦ１２３７Ａ物質３４．６ｍｇ、ＰＦ１２３７Ｂ物質１３３ｍｇおよびＰＦ１２３７Ｍ物質６３．９ｍｇをそれぞれ無色粉末として得た。
試験例 １
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の抗真菌活性を液体培養試験法により、各種菌株に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）として測定した。
培地としてＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）に１６５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ナカライテスク社製）を加えｐＨ７．０に調製したものを用い、３５℃で２４時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓについては７２時間、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓについては３０℃、４８時間）培養した。その測定結果を表１に示す。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年８月０２日出願の日本特許出願（特願２００２−２２５５４０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質は、表１に示したように、医療上問題になっているＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを含む各種真菌に対し抗真菌活性を有しており、これらを有効成分とする抗真菌剤は各種真菌を起因菌とする真菌症の治療に有用である。
【技術分野】
本発明は新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの塩、それらの製造法ならびにそれらを有効成分とする抗真菌剤に関するものである。
【背景技術】
１９５０年代以降の抗生物質に関する研究開発の急速な進歩およびその広範な普及により、細菌性の感染症に対する多くの治療薬が開発されてきた。その一方で、平素は無害な弱病原性微生物による感染症、いわゆる日和見感染症が近年大きな問題になりつつある。この日和見感染症は免疫不全症や悪性腫瘍等の疾病、または免疫抑制剤や抗炎症剤等の投与によって免疫機能が低下した場合、また抗生物質の投与による共生菌の抑制から生じる菌交代などが原因とされている。このような日和見感染症の中で真菌が原因である症例が数多く報告されている。また、本発明によるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質と物理化学的性状が類似する化合物として、パプラカンジンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ（Ｐａｐｕｌａｃａｎｄｉｎｓ）［トラキセラー（Ｔｒａｘｌｅｒ）ら、ジャーナルオブアンティバイオティックス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）３０：２８９−２９６，１９７７］、カエティアカンジン（Ｃｈａｅｔｉａｃａｎｄｉｎ）［コモリ（Ｋｏｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ３８：４５５−４５９，１９８５］、Ｌ−６８７，７８１［ヴァンミドルスワース（Ｖａｎｍｉｄｄｌｅｓｗｏｒｔｈ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４４：４５−５１，１９９１］、Ｂｕ−４７９４Ｆ［アオキ（Ａｏｋｉ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４６：９５２−９６０，１９９３］、サリカンジン（Ｓａｒｉｃａｎｄｉｎ）［ランダール（Ｒａｎｄａｌ）ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ４９：５９６−５９８，１９９６］等が知られているが、抗真菌物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質はこれらの物質とは物理化学的性状が異なり明確に区別される。
現在使用されている主な抗真菌剤としては、ポリエンマクロライド系、アゾール系およびフルシトシン等がある。表在性真菌症の治療には、主に外用剤が使用され、それらには多種のイミダゾールやトリアゾール系の抗真菌剤を始め、アリルアミン系の抗真菌剤が用いられている。一方、深在性真菌症の治療においては、トリアゾール系薬剤であるフルコナゾールが、その高い安全性から多用されているが、これは抗菌スペクトルが狭いことが難点とされている。また、ポリエンマクロライド系薬剤であるアムホテリシンＢは抗菌スペクトルが広く、抗真菌活性は強いが同時に毒性も高く、安全性の面での問題が残されている。
このような背景からより有効かつ安全な抗真菌剤の提供とその有利な製造法は常に求められる課題である。本発明者らは、以上のような点に着目し、抗真菌活性を有する新規な化合物を提供するとともに、微生物の培養法を用いたそれらの製造法を提供することを目的とした。また、本発明の別の目的は、当該新規化合物を含有する医薬組成物および抗真菌剤の提供である。
【発明の開示】
本発明者らは、より有効かつ安全な新規抗真菌活性物質を見い出すため、幅広く微生物の探索を行った結果、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する菌を培養することによって、抗真菌活性を示す物質が培養物中に生産、蓄積されることを見い出した。
次いで、本発明者らは培養物中から式（１）で表される有効物質ＰＦ１２３７Ａ物質、式（２）で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質、および式（３）で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質をそれぞれ単離、精製し、これらの物理化学的性状からこれらの物質が新規物質であることを明らかにし、抗真菌活性を有することを確認した。これらの知見に基づいて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供するものである。
式（１）
で表されるＰＦ１２３７Ａ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（２）
で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（３）
で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質または薬理学的に許容されるその塩。
また、本発明は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属に属し、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を蓄積させ、当該培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の製造法を提供するもので。
さらに、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物および抗真菌剤に関する。
＜発明の実施の態様＞
本発明の第１の要旨とするところは、前述式（１）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質にある。
１．ＰＦ１２３７Ａ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ４１Ｈ６０Ｏ１６
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１５．２°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘ ｎｍ（ε）：２０７（１４２０），２２５（６４０），２６７（１４１０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘｃｍ−１：３４４０，２９３０，２８６０，１７１７，１６３６，１６１０，１４５８，１２４４，１１５４，１０７０，１０３６，１０１０，９７８，８４３，７４５
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．１３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．１６−１．５５（７Ｈ，ｍ），１．９７（３Ｈ，ｓ），１．９０−２．０３（３Ｈ，ｍ），２．２７−２．４１（４Ｈ，ｍ），３．４０−３．６３（４Ｈ，ｍ），３．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），３．９４−４．１５（５Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ），５．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，１５．１Ｈｚ），５．４７（２Ｈ，ｍ），６．１１−６．２４（３Ｈ，ｍ），６．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１４．８Ｈｚ），７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７５．７，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．７，７２．６，７２．０，６９．９，６４．１，６１．５，３９．９，３９．６，３９．３，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２８．３，２１．０，１４．３，１３．１，１２．２，９．５
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない。
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第２の要旨とするところは、前述式（２）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｂ物質にある。
２．ＰＦ１２３７Ｂ物質の物理化学的性状
（１）色および性状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ４２Ｈ６２Ｏ１６
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１９．８°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトルメタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０８（１６００），２２５（７６０），２６７（１８５０）
（６）赤外線吸収スペクトルＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘｃｍ−１：３４３２，２９３２，２８７６，１７１７，１７０２，１６３６，１６１１，１２４６，１１５４，１０７１，９７８，８４３
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．１０−１．５２（７Ｈ，ｍ），１．５８−１．７０（２Ｈ，ｍ），１．９７−２．１２（３Ｈ，ｍ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．３０−２．５０（４Ｈ，ｍ），３．４８−３．７３（４Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），４．０２−４．１４（４Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１０．５Ｈｚ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２６．１Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２５．７Ｈｚ），５．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．２，３０．０Ｈｚ），５．４０−５．５６（２Ｈ，ｍ），６．１８−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１５．７Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７４．９，１７０．２，１６１．６，１５４．５，１４５．５，１４１．２，１３９．９，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２７．０，１１６．５，１１２．０，１０５．０，１０３．０，１００．０，７７．０，７６．４，７５．４，７４．９，７４．７，７３．９，７３．８，７２．６，７２．０，７０．０，６４．１，６１．５，３９．８，３９．６，３９．３，３７．０，３４．０，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１９．５，１４．３，１４．１，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第３の要旨とするところは、前述式（３）で表され、下記の物理化学的性状を有する新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ｍ物質にある。
３．ＰＦ１２３７Ｍ物質の物理化学的性状
（１）色および形状：無色粉末
（２）分子式：Ｃ３８Ｈ５６Ｏ１５
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５＝＋１０．０°（ｃ１．０，ＣＨ３ＯＨ）
（５）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した結果を以下に示す。
λｍａｘ ｎｍ（ε）：２０６（１１５０），２２５（４７０），２６７（９４０）
（６）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠での測定結果を以下に示す。
νｍａｘ ｃｍ−１：３４１０，２９３０，１７００，１６４０，１６１０，１４６０，１２４０，１１５０，１０７０，９８０，７４０
（７）１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、測定溶媒中に含まれるＣＨＤ２ＯＤのＨのシグナルを３．３８ｐｐｍとした時の化学シフト値、積分強度、多重度、結合定数を示す。）
δ（ｐｐｍ）：０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１５−１．６５（７Ｈ，ｍ），１．９７−２．１５（３Ｈ，ｍ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．４４（２Ｈ，ｍ），３．４４−３．７２（６Ｈ，ｍ），３．８４−３．９２（２Ｈ，ｍ），４．０２−４．１６（３Ｈ，ｍ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ），５．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１，１４．９Ｈｚ），５．２７−５．４０（２Ｈ，ｍ），６．２３−６．３３（３Ｈ，ｍ），６．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．２，１５．８Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）
（８）１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ、重メタノールの１３Ｃのシグナルを４９．０ｐｐｍとした時の化学シフト値を示す。）
δ（ｐｐｍ）：１７０．２，１６１．６，１５４．６，１４５．５，１４１．３，１４０．０，１３７．５，１２９．８，１２９．０，１２６．９，１１６．５，１１２．０，１０５．２，１０３．０，１００．０，７７．１，７６．７，７６．３，７５．５，７５．０，７４．９，７３．９，７２．９，７２．０，６９．７，６１．７，６１．７，３９．８，３９．５，３９．４，３３．９，３３．９，３１．０，２８．５，２１．０，１４．４，１３．１，１２．２
（９）溶解性：メタノールに溶け、アセトン、酢酸エチルに溶けにくく、水にほとんど溶けない
（１０）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性物質
本発明の第４の要旨とするところは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属するＰＦ１２３７物質群を生産する菌を培養し、その培養物からＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を採取することを特徴とする、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の製造法である。
上記のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としては、例えば本発明者らが新たに分離したＰＦ１２３７株が挙げられる。なお、本発明で用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌は、本明細書に記載の微生物に限定されるものではない。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する能力を有している菌であればＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質生産菌としていずれを用いてもよい。使用できる微生物の好適な例としては、ＰＦ１２３７株、あるいはこの菌株の継代培養物、人工変異株ならびに自然変異株、遺伝子組換え株などが挙げられる。ＰＦ１２３７株の菌学的性状は以下の通りである。
ＰＦ１２３７株の菌学的性状
（１） コロニーの性状
ツァペック酵母エキス寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５３ｍｍに達する。濃黄色、放射状のしわを生じ、密な菌糸層からなり、束状の気生菌糸を中央に、なわ状の気生菌糸を周辺に生じる。分生子は形成しない。裏面は濃黄色となる。ツァペック寒天培地上で生育良く、２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は５０〜５２ｍｍに達する。白色、平坦、薄い菌糸層からなる。分生子を疎らに形成する。裏面は白色となる。３７℃の培養では、どの培地上でも生育しない。
（２） 形態的性状
菌糸は太く２．５μｍ以上である。フィアライドは無色、円筒形、菌糸側面より直立に生じ、先端は細まり、基部はややくびれ、４．０〜８．０ｘ１．５〜２．５μｍである。分生子は無色、楕円形〜円筒形、滑面、３．５〜７．５ｘ１．５〜２．５μｍ、フィアライドの先端に粘塊状に生じる。
以上の菌学的性状より、大分生子を形成しないが、ＰＦ１２３７株を不完全菌類のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌と同定した。なお、本菌株は以下のように独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６として国際寄託されている。
▲１▼寄託機関：国際寄託機関、独立行政法人産業技術総合研究所特許生産寄託セ
ンター
住所： 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便
番号 ３０５−８５６６）
▲２▼寄託日： 原寄託日：平成１４年３月２９日
移管請求日：平成１５年６月２４日（平成１４年３月２９日に寄託さ
れたＦＥＲＭ Ｐ−１８７９８号より移管）
▲３▼寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６
生産菌の培養法
本発明の菌株を用いてＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を生産する培養方法としては、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地を用い、一般に実施されている方法に従って培養することが可能である。
栄養源としては、従来カビの培養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、デキストリン、でんぷん、グリセロール、糖蜜、動植物油等を使用し得る。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用し得る。その他必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産を促進するような有機及び無機物を適当に添加することができる。
培養法としては、好気的条件での培養法、特に液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は２５〜３０℃であるが、多くの場合２６℃付近で培養する。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の生産は、培地や培養条件によって異なるが、静置培養、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても、通常２〜１４日間でその蓄積が最高に達する。培養液中のＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の蓄積が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離、精製する。
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の精製法
本発明によって得られる新規抗真菌物質は主に菌体中に存在するので、菌体より通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂への吸脱着法、若しくは分配あるいはゲルろ過等のカラムクロマトグラフィーを単独又は組み合わせて行うことにより精製できる。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーなども精製に利用可能である。好ましい分離、精製の方法としては以下の方法が挙げられる。培養液から遠心分離により菌体を得る。得られた菌体からメタノールやアセトン等により活性成分を抽出する。この菌体抽出液を減圧下で溶媒を留去後酢酸エチル、クロロホルム等の水と混和し難い有機溶媒を用いて抽出する。抽出液を濃縮乾固後クロロホルム−メタノールの混液を溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー、次いで水−アセトニトリルの混液を溶出液とするＯＤＳカラムクロマトグラフィー、次にメタノールを溶出液としたセファデックスＬＨ２０を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、さらに水−アセトニトリルの混液を溶出液とする高速液体クロマトグラフィー、を行うことにより目的とするＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を得ることが出来る。
本発明の要旨とするところは、本発明で得られる新規な抗真菌活性物質または薬理学的に許容されるその塩を含有する医薬組成物を提供することにある。薬理学的に許容しうる塩の典型例としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属、アンモニウム塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン等の有機アミン塩等を挙げることができる。
本発明に用いられるＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を医薬組成物として使用するには種々の投与形態あるいは使用形態に合わせて、公知の担体を組み合わせて製剤化すればよい。公知の担体としては、賦形剤（例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、ラクトース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびそのカルシウム塩、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等）潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリン酸ナトリウム等）、芳香剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ紛等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸など）懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）、分散剤（例えば界面活性化剤）などの医薬用として常用される種々の有機および無機の担体物質が上げられる。
本発明の化合物は、抗真菌剤として皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、坐薬等による非経口投与あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与などの全身投与のほか、軟膏剤、ローション剤、膣坐薬等の局所投与の形態を例示することができる。農薬用または衛生用品として本発明の化合物を活用する場合には、各分野で常用される調製方法を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
【実施例１】
種培地として、でんぷん２．０％、グルコース１．０％、ポリペプトン０．５％、小麦胚芽０．６％、酵母エキス０．３％、大豆粕０．２％および炭酸カルシウム０．２％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。また、生産培地としては、グルコース５．０％（別に殺菌）、肉エキス０．４％、大豆粕１．０％、ポリペプトン０．４％、酵母エキス０．１％、塩化ナトリウム０．２５％および炭酸カルシウム０．５％の組成からなる培地（殺菌前ｐＨ７．０）を用いた。
前記の種培地８０ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これにＰＦ１２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１６）の斜面寒天培養の３〜４白金耳を植菌後、２６℃で３日間振とう培養した。次いで、種培地５００ｍＬを分注した２０００ｍＬ容三角フラスコを１２０℃で２０分間殺菌し、これに上記種培養液を１０ｍＬずつ植菌し２６℃で２日間振とう培養した。さらに、生産培地６０Ｌを仕込んだ１００Ｌ容ジャーファメンター（福嶋鉄工（株）製）を１２１℃で３０分間殺菌し、これに上記種培養液を１．５Ｌ植菌し、撹拌数は最初１５０ｒｐｍ、２４時間後に１８０ｒｐｍ、通気量６０Ｌ／分、２６℃で５日間培養した。
こうして得られた培養液９０Ｌを遠心分離し菌体の沈殿物２０Ｌを得た。この菌体にメタノール４０Ｌを加え室温で１２０分攪拌した後、遠心分離により菌体を除去しメタノール抽出液を得た。メタノール抽出液を減圧下に約５Ｌに濃縮し７Ｌの酢酸エチルを加え室温で６０分攪拌し沈殿物を除去することにより得られた酢酸エチル抽出液６Ｌを減圧下に濃縮し２８．８ｇの粗抽出物を得た。
得られた粗抽出物に４００ｍＬのヘキサンと２００ｍＬのメタノールを加え攪拌した後メタノール層を分離し減圧下に濃縮し２５．８ｇの粗抽出物を得た。これを７０ｍＬのメタノールに溶解し、１００ｇのシリカゲル（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬社製）を加えた後、減圧下でメタノールを留去した。得られた粗抽出物をシリカゲルに均一に吸着させた。これをグラスフィルター上のシリカゲル１００ｇに重層し、クロロホルム／メタノール溶液（メタノール濃度が０％を２．４Ｌ次いで１，１０，５０，１００％をそれぞれ２Ｌ）で溶出し活性画分を集めて減圧濃縮により残渣１８．８ｇを得た。
得られた残渣を１００ｍＬのアセトニトリルに溶解し２００ｍＬの蒸留水を加え懸濁させた。これをアセトニトリル／蒸留水＝３／７の混合溶媒にて平衡化したグラスフィルター上のコスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製）２００ｇに吸着した。本カラムを、アセトニトリル／蒸留水＝３／７ １．６Ｌ、アセトニトリル／蒸留水＝３／２ １．６Ｌ、およびメタノール５００ｍＬにて順じ溶離した。ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む分画から有機溶媒を留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し減圧濃縮により残渣１．６５ｇを得た。
得られた残渣をメタノールを溶離液とするセファデックスＬＨ２０カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製、内径５ｃｍ、長さ８０ｃｍ）にかけ活性画分を濃縮乾固することにより粗物質７２１ｍｇを得た。
得られた粗物質を７．２ｍＬのメタノールに溶解し、その一部を用いアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で充填した高速液体クロマトグラフィー（カラム：イナートシルＯＤＳ−２、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社製）に注入しアセトニトリル／蒸留水＝５５／４５の混合溶液で溶出することを繰り返すことによりＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質を含む画分をそれぞれ得た。得られた画分はそれぞれアセトニトリルを留去し、得られた水層を酢酸エチルで抽出し濃縮乾固することによりＰＦ１２３７Ａ物質３４．６ｍｇ、ＰＦ１２３７Ｂ物質１３３ｍｇおよびＰＦ１２３７Ｍ物質６３．９ｍｇをそれぞれ無色粉末として得た。
試験例 １
ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質の抗真菌活性を液体培養試験法により、各種菌株に対する最小阻止濃度（ＭＩＣ）として測定した。
培地としてＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）に１６５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ナカライテスク社製）を加えｐＨ７．０に調製したものを用い、３５℃で２４時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓについては７２時間、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓについては３０℃、４８時間）培養した。その測定結果を表１に示す。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年８月０２日出願の日本特許出願（特願２００２−２２５５４０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明の新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質は、表１に示したように、医療上問題になっているＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓを含む各種真菌に対し抗真菌活性を有しており、これらを有効成分とする抗真菌剤は各種真菌を起因菌とする真菌症の治療に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
で表されるＰＦ１２３７Ａ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（２）
で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質または薬理学的に許容されるその塩。
【請求項３】
式（３）
で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質または薬理学的に許容されるその塩。
【請求項４】
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌を培養し、該培養物より有用物質を採取することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも１つを有効成分として含有する抗真菌剤。
【請求項１】
式（１）
で表されるＰＦ１２３７Ａ物質または薬理学的に許容されるその塩。
式（２）
で表されるＰＦ１２３７Ｂ物質または薬理学的に許容されるその塩。
【請求項３】
式（３）
で表されるＰＦ１２３７Ｍ物質または薬理学的に許容されるその塩。
【請求項４】
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する糸状菌を培養し、該培養物より有用物質を採取することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の製造法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載されている新規抗真菌活性物質ＰＦ１２３７Ａ物質、ＰＦ１２３７Ｂ物質およびＰＦ１２３７Ｍ物質あるいはそれらの薬理学的に許容される塩の少なくとも１つを有効成分として含有する抗真菌剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１３３４２
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【発行日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２５８２２（Ｐ２００４−５２５８２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００９８２２
【国際出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【発行日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００９８２２
【国際出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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