新規栄養補助組成物
本発明は、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはそれらの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品としての使用について記載する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規栄養補助組成物に関する。
【０００２】
本発明はトリペプチドのメチオニン−アラニン−プロリン（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、以下「ＭＡＰ」）および／またはイソロイシン−スレオニン−プロリン（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、以下「ＩＴＰ」）を含んでなる組成物に関する。より具体的には、本発明は健康の改善または疾患の予防および／または処置のために使用されるＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物に関する。組成物は高い血圧（以下「高血圧症」）および心不全、または狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、および腎症などの関連病態の処置または予防に特に有用である。別の態様において、本発明は高血圧症および心不全の処置または予防における併用摂取用栄養補助組成物の製造におけるＭＡＰおよび／またはＩＴＰの使用に関する。なお別の態様において、本発明は高血圧症および心不全、または狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、および腎症などの関連の処置または予防の方法に関し、ここでＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる有効量の組成物がかかる処置を必要とする人に投与される。
【０００３】
高血圧症は世界の早世の予防可能な最重要原因の１つであることが知られている。さらには、正常範囲上限の血圧でさえ早世のリスクを増加させると見られている。高血圧症は冠動脈心疾患の主要な危険因子および脳卒中の最重要危険因子である。全心血管疾患のおよそ半数は高血圧症が一因であり、これは２００２年の全世界における死亡数１６７０万人に相当した。心血管疾患のリスクは拡張期血圧の１０ポイント増加につき、または収縮期血圧の２０ポイント増加につき、２倍になる。ほとんどの国で、成人の３分の１までが高血圧症に罹患している。高血圧症の有病率は年齢に伴い増加するとともにこの傾向は発展途上国において特に突出している。そのうえ、高血圧対象者の４０％が診断を下されていないままであると推定される。
【０００４】
現在、高血圧対象者に利用可能な治癒的療法はないとともに処置の主目標は血圧をより安全なレベルまで降下させることである。より多くの運動、塩分摂取の低減、および有効なストレス管理などの食事および生活習慣の改変もまた高血圧症の予防手段を代表し得る。これが次には、一般に乾性咳嗽から日常生活の活動エネルギーの喪失に及ぶ副作用を伴う投薬治療における必要量を減少させ得る。このように、安全であるとともに現在高血圧症の処置に使用されている薬物の副作用を伴わない食事補助剤による高血圧症の予防および処置に対する多大な需要がある。
【０００５】
現在、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、およびβ遮断薬が高血圧症の処置に広く使用されている。ＡＣＥ阻害剤は、血圧を上昇させることで知られるペプチドホルモンである、アンジオテンシンＩＩのレベルを低減する。アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬はアンジオテンシンＩＩのその受容体への結合を遮断するとともに、それにより血圧降下作用を及ぼす。カルシウムチャネル遮断薬はカルシウムの血管壁細胞への流入を低減するとともに、ひいては血管の収縮を減少させ、次には血圧を降下させる。利尿薬はナトリウムおよび水分の尿中排泄増加につながり、これが血圧の低減につながる。β遮断薬はノルエピネフリンおよびエピネフリンの効用をβアドレナリン受容体上で遮断し、それにより血管の収縮を低減するとともに血圧を降下させる。
【０００６】
本発明は、栄養補助物、好ましくは医薬品としての、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはそれらのＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩に関する。本発明はまた、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品としての使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、健康の改善または疾患の予防および／または処置のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、高血圧症および心不全などの心血管疾患の処置用の栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、前糖尿病または糖尿病の処置のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、肥満の処置または予防のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、血漿インスリンを増加させるための、または血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の血漿インスリンを増加させるための、または血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中グルコース濃度を降下させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中インスリン分泌を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰが食事補助剤の形態であるＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の局所適用における、好ましくはパーソナルケア適用における使用、およびＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、飼料およびペットフードにおける使用にも関する。ＭＡＰが好ましいトリペプチドであるとともに本発明の使用において好ましい。
【０００７】
さらに本発明は、１型および２型糖尿病の処置の、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者における２型糖尿病の予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法、および高血圧症または心不全に罹患している人々の処置またはそれらの予防の方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法に関する。
【０００８】
本発明のさらなる態様に従い、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の化学合成の方法が開示される。そのうえ本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる医薬品、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食事補助剤、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食品、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を医薬品として、または健康上の利益のため含んでなる組成物、健康上の利益がストレスの作用の処置である組成物であって、好ましくは該組成物が食品または飼料である組成物、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を局所剤としての使用のため、好ましくはパーソナルケアにおける使用のため含んでなる組成物、およびローション、ゲルまたはエマルジョンである組成物に関する。
【０００９】
本発明に従えば、驚くことに、ＭＡＰおよびＩＴＰの双方がアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するとともに、ひいては血圧降下作用を呈することが所見されている。ＡＣＥの阻害は結果として、血管収縮の低減、血管拡張の亢進、ナトリウムおよび水分排泄の改善をもたらし、これが次には末梢血管抵抗性および血圧の低減および局部血流の改善につながる。このように、本組成物はＡＣＥ阻害により影響され得る疾患の予防および処置に特に効果的であり、これらとしては、限定はされないが、高血圧症、心不全、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、腎症、腎不全、勃起機能不全、内皮機能不全、左室肥大、糖尿病性血管障害、体液貯留、および高アルドステロン症が挙げられる。本組成物はまた、胃腸障害（下痢、過敏性腸症候群）、炎症、真性糖尿病、肥満、認知症、癲癇、老人性錯乱、およびメニエール病の予防および処置においても有用であり得る。さらには、本組成物は、認知機能および記憶（アルツハイマー病を含む）、満腹感を亢進し、虚血性傷害を制限し、およびバイパス手術または血管形成術後の動脈の再閉塞を予防し得る。
【００１０】
真性糖尿病は現在に至るまで治療法を有しない広範な慢性疾患である。真性糖尿病の発症率および有病率は指数関数的に増加しているとともに、先進国および発展途上国において最も多く見られる代謝障害である。真性糖尿病は複数の原因因子に由来する複合疾患であるとともにインスリン分泌欠乏および／またはインスリン抵抗性に関連する炭水化物、タンパク質および脂質代謝障害により特徴づけられる。これは結果として空腹時および食後血清グルコース濃度の上昇をもたらし、無処置のまま放置すれば合併症につながる。疾患には２つの主要な分類、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｔ１ＤＭ）およびインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、Ｔ２ＤＭ）がある。Ｔ１ＤＭ＝１型真性糖尿病。Ｔ２ＤＭ＝２型真性糖尿病。
【００１１】
Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ糖尿病は、高血糖症、高コレステロール血症および高脂血症に関連する。Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭにおける、それぞれの絶対的インスリン欠乏およびインスリン非感受性は、肝、筋および脂肪組織によるグルコース利用性の低下および血糖値の上昇につながる。コントロール不良の高血糖症は、腎症、神経障害、網膜症、高血圧症、脳卒中、および心疾患を含む、微小血管および大血管疾患のリスク増加による死亡率増加および若年死亡率に関連する。最近、厳格な血糖コントロールがＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方におけるこれらの合併症の予防における主要因子であるという証拠が示された。それゆえ、薬物または治療レジメンによる最適な血糖コントロールが糖尿病の処置においては重要な手法である。
【００１２】
Ｔ２ＤＭの治療は初期に食事および生活習慣の変更を含み、それらの対策で適切な血糖コントロールを維持できない時、患者は経口血糖降下薬および／または外因性インスリンで処置される。現行のＴ２ＤＭの処置用薬理学的経口薬剤としては、インスリン分泌を増強するもの（スルホニル尿素剤）、肝中のインスリンの効用を改善するもの（ビグアナイド系薬剤）、インスリン増感剤（チアゾリジンジオン）およびグルコースの取り込みを阻害するべく効用する薬剤（α−グルコシダーゼ阻害剤）が挙げられる。しかしながら、現在利用可能な薬剤は概して、膵細胞機能の進行性喪失の結果として生じる高血糖の進行性悪化のため、適切な血糖コントロールを長期間維持できない。目標血糖値を維持できる患者の割合は時間が経つにつれ著しく減少し、追加的／代替的な薬理学的薬剤の投与が必要となる。さらには、薬物は望ましくない副作用を有し得るとともに高い原発性および続発性不全率に関連する。最終的には、血糖降下薬の使用は血糖値を調節するのに有効であり得るが、糖尿病の全ての合併症を予防するとは限らないといえる。このように、全ての型の真性糖尿病向け処置の現行の方法は正常血糖の理想値および糖尿病合併症の予防を実現できない。
【００１３】
それゆえ、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの処置において選択され得る治療は基本的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、糖尿病の処置および予防のための副作用が最小の安全かつ有効な栄養補助剤の必要性はある。多くの患者が高用量の薬物に関連する副作用を最小化するとともに付加的な臨床的利益を産み出すことができるであろう代替療法に関心を有している。真性糖尿病患者は、補助処置として使用され得る、穏和な抗糖尿病作用を伴うとともに主要な副作用を伴わない「自然」と考えられる処置に特に関心を有している。Ｔ２ＤＭは進行性かつ慢性的な疾患であり、インスリン産生を担う膵細胞（ランゲルハンス島のβ細胞）に重大な傷害が起こるまで通常認識されない。それゆえ、Ｔ２ＤＭを発症するリスクがある人々、特にそのリスクが高い高齢者において、β細胞傷害、ひいては顕性Ｔ２ＤＭへの進行を予防するべく使用され得る食事補助剤の開発に関心が高まっている。膵β細胞の保護は、グルコースおよび脂質がβ細胞に対し傷害作用を及ぼすとき血糖値および／または脂質値の低下により実現され得る。血糖値の低減は種々の機序を介して、例えばインスリン感受性を亢進することにより、および／または肝グルコース産生を低減することにより実現され得る。血中脂質値の低減もまた、種々の機序を介して、例えば脂質酸化および／または脂質貯蔵を亢進することにより実現され得る。膵β細胞を保護する別の考え得る方策は酸化的ストレスを低下させることであろう。酸化的ストレスもまた、続発するインスリン分泌の損失および顕性Ｔ２ＤＭへの進行を伴うβ細胞傷害を引き起こす。
【００１４】
それゆえ、Ｔ２ＤＭは複数の臓器部位に同時に存在する欠陥、すなわち筋および脂肪組織でのインスリンの効用に対する抵抗性、欠陥のある膵インスリン分泌、無制限の肝グルコース産生の結果として生じる複雑な疾患である。これらの欠陥は脂質異常および内皮機能不全に関連することが多い。Ｔ２ＤＭにおける複数の病態生理学的病変を所与とすれば、併用療法はその管理への魅力的な手法である。
【００１５】
本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる新規栄養補助組成物に関する。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる栄養補助組成物はまた、真性糖尿病、またはシンドロームＸなどの耐糖能障害に関連する他の病態の処置または予防のための活性成分として加水分解物、非加水分解タンパク質および炭水化物も含んでなることができる。別の態様において本発明はかかる組成物の前記処置または予防向け栄養補助剤としての、例えば、正常代謝機能の維持に必須であるが体内では合成されないビタミンおよびミネラルを含んでなるマルチビタミン調製剤への添加剤としての使用に関する。なお別の態様において、本発明は１型および２型の双方の真性糖尿病の処置および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者もしくは肥満者におけるＴ２ＤＭの予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物を投与するステップを含んでなる方法に関する。
【００１６】
本発明の組成物はＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方の処置、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者におけるＴ２ＤＭの予防が特に意図される。
【００１７】
本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰ、および場合によりタンパク質加水分解物を含んでなる組成物に関する。さらに本組成物はアミノ酸を含んでなり、好ましくは該アミノ酸はロイシンである。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ、および場合によりタンパク質加水分解物は血中の血漿インスリンを増加させるべく、好ましくは２型糖尿病または前糖尿病のため、有利に使用される。
【００１８】
驚くべきことに、本ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは２型糖尿病または前糖尿病向けに、好ましくは食後グルコース濃度を降下させるため、または食後の血中インスリン分泌を増加させるため使用され得ることが所見される。
【００１９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰとタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物との組み合わせを含んでなる組成物は相乗的にインスリン分泌を刺激するとともに脂肪組織、骨格筋および肝臓などのインスリン感受性標的組織へのグルコース排出を増加させ、ひいては、真性糖尿病の処置における相乗作用を提供する。
【００２０】
ストレス関連疾患、およびストレスの身体に対する負の作用が、多くの人々に重大な影響を有することが一般的に認知されている。近年ではストレスの作用、および様々な疾患および病態の発症へのその様々な関与は、医学界および科学界においてより広範な認知を得ている。消費者はいまやこれらの潜在的問題をますます意識するようになっているとともに自身の健康に対するストレスの考え得る負の影響の低減または予防にますます関心を有するようになっている。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、身体がストレスの作用に対処するのを補助する際の使用に好適である、食製品、またはそれに混入され得る成分を提供することである。
【００２２】
さらなる目的は、身体がストレスの負の作用に対処するのを補助するなどの、健康上の利益を提供する高濃度の成分を有する食製品を提供することである。
【００２３】
ある態様に従えば本発明はトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰおよび／またはそれらの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用を提供する。
【００２４】
特定のペプチドは抗ストレス作用を呈することが知られている。それゆえトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰおよび／またはそれらの塩はかかる健康上の利益の提供における使用に非常に好適であると考えられる。当業者は材料のかかる特性をいかに測定するかは十分に承知している。
【００２５】
用語の栄養補助物は本明細書中で使用されるとき栄養および医薬の双方の応用分野における有用性を意味する。このように、新規栄養補助組成物は食品および飲料に対する補助剤としての、およびカプセルまたは錠剤などの固形製剤、または溶液または懸濁液などの液体製剤であり得る経腸または非経口適用向け医薬製剤または医薬品としての使用を見出すことができる。前述から明らかであろうとおり、用語の栄養補助組成物はまたＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび場合によりタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物を含有する食品および飲料ならびに補助組成物、例えば前記活性成分を含有する食事補助剤も含んでなる。
【００２６】
用語の食事補助剤は本明細書中で使用されるとき日常食を補助することが意図される「食事成分」を含有する口から摂取される製品を意味する。これらの製品中の「食事成分」としては、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、および酵素、臓器組織、腺、および代謝産物などの物質が挙げられ得る。食事補助剤はまた、抽出物または濃縮物でもあり得るとともに、錠剤、カプセル、ソフトゲル、ジェルキャップ、液体、または粉末などの多々の形態にあってもよい。これらはまた、バーなどの、他の形態でもあり得るが、もしそうであるならば、該食事補助剤のラベル情報は一般に、製品を従来の食品または食事もしくは日常食の単一品目としては表示しないであろう。
【００２７】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは断片ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する任意の好適な基質の加水分解または発酵により製造されてもよい。有利にはタンパク質基質は断片ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの双方を含有する。好ましくはタンパク質基質はカゼインまたは乳である。トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）はまた、従来技術を使用する化学合成によっても製造され得る。
【００２８】
本発明によれば驚くことにＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物は膵インスリン分泌を刺激するとともにインスリン感受性標的組織へのグルコース排出を亢進することが所見されている。それゆえ、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物はＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方を予防または処置するために、および前糖尿病者、耐糖能障害（ＩＧＴ）者におけるＴ２ＤＭの予防のために使用され得る。
【００２９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰとタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物との組み合わせの使用は、それらが個別に種々の効用機序を及ぼし、糖尿病患者において目標血糖値を実現および維持するのに有効である。
【００３０】
上記に同定される活性成分の組み合わせは、それらの種々の効用により、相乗作用および多臓器作用の利点を活用すると思われる。個々の活性成分の異なる効用機序のため本組み合わせは血糖コントロールを改善するばかりでなく、結果としてある設定でより低用量の薬物投与をもたらすとともに有害作用を最小限にする。それらの効用の異なる機序および部位のため、上記で考察される食事補助剤の特異的組み合わせもまた相乗作用の利点を活用し、単剤で達成できるより大きなグルコース降下度を実現する。このように、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの治療処置は基本的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、然るべき栄養療法もまた糖尿病の処置の成功に主として重要である。
【００３１】
マルチビタミンおよびミネラル補助剤が本発明の栄養補助組成物に添加され、一部の日常食において不足する必須栄養素の適切量を調達してもよい。マルチビタミンおよびミネラル補助剤はまた、疾患予防および糖尿病において時に観察される生活習慣パターンおよび一般の不適切な食事パターンによる栄養損失および欠乏からの保護にも有用であり得る。そのうえ、酸化ストレスはインスリン抵抗性の発症に関係するとされている。活性酸素種はインスリン受容体シグナル伝達カスケードを妨害することによりインスリン刺激性グルコース取り込みを障害し得る。α−トコフェロール（ビタミンＥ）アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの抗酸化剤による酸化ストレスのコントロールは糖尿病の処置において価値があり得る。それゆえ、マルチビタミン補助剤の摂取が上述の活性物質に追加され、バランスの良い栄養を維持してもよい。
【００３２】
さらに、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）および／またはカリウム（Ｋ＋）などのミネラルとの組み合わせが、健康の改善および限定はされないながら心血管疾患および糖尿病を含む疾患の予防および／または処置に使用されてもよい。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、本発明の栄養補助組成物はＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物を含有する。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｇから体重１ｋｇ当たり約１ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．０５ｇから１食当たり約５０ｇのＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤はＭＡＰおよび／またはＩＴＰを１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．００１ｇから約１ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．０３５ｇから１日量当たり約７０ｇまでの量で含有してもよい。タンパク質加水分解物は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約３ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．１ｇから１食当たり約１００ｇのタンパク質加水分解物を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤はタンパク質加水分解物を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０１ｇから約５ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約２１０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３４】
本発明の別の好ましい態様において組成物は上記に定めるとおりのＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質を含有する。非加水分解タンパク質は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約３ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．１ｇから１食当たり約１００ｇの非加水分解タンパク質を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤は非加水分解タンパク質を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０１ｇから約５ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約２１０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３５】
本発明のさらに別の好ましい態様において組成物は上記に定めるとおりのＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質、および炭水化物を含有する。炭水化物は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約７ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．５ｇから１食当たり約２００ｇの炭水化物を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤は炭水化物を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０５ｇから約１０ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約４９０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３６】
本発明の好ましい栄養補助組成物はＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物、特に
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物および炭水化物、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質および炭水化物、
の組み合わせを含んでなり、
最も好ましくはＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物の組み合わせである。
【００３７】
用量範囲（７０ｋｇの人１人用）
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ：０．００５〜７０ｇ／日
タンパク質加水分解物：０．０７〜２１０ｇ／日
非加水分解タンパク質：０．０７〜２１０ｇ／日
炭水化物：０．１〜４９０ｇ／日
【００３８】
トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）は、化学合成、酵素加水分解およびタンパク質含有溶液の発酵を含む様々な方法により製造され得る。
【００３９】
タンパク質加水分解物または発酵の結果生じる液体などの複合混合物中の生物学的に活性なペプチドの同定は難題である。適正なタンパク質基質を使用しているか、適正な酵素を使用しているか、適正な微生物培養物を使用しているかといった基本的な懸案は別として、数個の生物学的に活性なペプチドが数千ペプチドを含有する複合試料中に存在すると推定され得る。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分画の反復サイクルおよび生化学的評価を用いる伝統的な同定手法は一般的に時間がかかるとともに存在する生物学的に活性なペプチドの損失が起こりやすく、関連する生物活性の検出を極めて困難にする。本研究においては非常に洗練された機器が使用され、多くの異なるタンパク質加水分解物および発酵ブロスがスクリーニングされたことで、最終的に我々はＡＣＥ阻害特性を有する２個の新規ペプチドであるＭＡＰおよびＩＴＰの同定に至った。我々の手法においては連続フロー生化学アッセイがオンラインでＨＰＬＣ分画装置と連結された。ＨＰＬＣカラム溶出液が連続フローＡＣＥバイオアッセイと化学分析技法（質量分析法）とに分割された。粗加水分解物および発酵ブロスがＨＰＣＬにより分離された後、生物学的に活性な化合物の存在がオンライン生化学アッセイによって検出された。生化学アッセイにおいてペプチドが陽性シグナルを示す時の構造情報が直ちに入手できるよう質量スペクトルが継続的に記録された。
【００４０】
上述される手法により同定されるとおりのトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは経済的に実行可能な産生経路を含む様々な方法により産生され得る。化学合成を介する産生が、例えばＮ．セウォルド（Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．Ｄ．ジャクブケ（Ｈ．Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ）編による「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、２００２年、第４章に記載されるとおりの従来技術を使用して可能である。大規模産生に好適な化学的ペプチド合成の特に費用対効果の高い方法は、Ｃ末端保護のためのメチルエステルおよびＮ保護のためのベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用と組み合わせたカルボン酸基の活性化のためのクロロギ酸アルキルまたは塩化ピバロイルの使用に基づく。例えば、ＭＡＰの場合に、Ｌ−プロリンメチルエステルはクロロギ酸イソブチル活性化Ｚ−Ａｌａと共役され得る；結果として生じるジペプチドは水素およびＣ上のＰｄを使用する水素化分解を通じてＺが脱保護され得るとともにクロロギ酸イソブチル活性化Ｚ−Ｍｅｔとさらに共役され得る；結果として生じるトリペプチドのメチルエステルはＮａＯＨを使用して加水分解されるとともに、水素化分解によるＺ脱保護の後、トリペプチドＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏが得られる。同様に、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏが合成され得るが、カップリング反応の間、Ｔｈｒのヒドロキシ官能基はベンジル保護を必要とする；最後のステップにおいてこの基は次に、Ｚ脱保護の間に同時に除去される。
【００４１】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰはまた、酵素加水分解または発酵手法によりアミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する任意のタンパク質基質を使用して製造され得る。有利には、タンパク質基質は双方の断片ＭＡＰおよびＩＴＰを含有する。かかる酵素または発酵手法に好ましいタンパク質基質はウシ乳またはウシ乳のカゼイン画分である。発酵または加水分解条件の最適化を通じ、生物学的に活性な分子ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの産生が最大化されてもよい。産生を最大化しようとする当業者は、加水分解／発酵時間、加水分解／発酵温度、酵素／微生物のタイプおよび濃度等といった、処理パラメータをいかに調節するかは周知であろう。
【００４２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物は有利には加水分解物であるとともに好ましくは次のステップ
（ａ）そのアミノ酸配列中にＭＡＰまたはＩＴＰを含んでなり、結果としてトリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる加水分解タンパク質産物をもたらす、好適なタンパク質基質の酵素加水分解、
（ｂ）加水分解タンパク質産物からのトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰリッチな画分の分離、および場合により
（ｃ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰリッチな濃縮液または固形物を得るための、ステップｂ）からの画分の濃縮および／または乾燥、を含む方法により製造される。
【００４３】
酵素加水分解ステップ（ａ）はタンパク質の加水分解に至る結果としてＭＡＰおよび／またはＩＴＰトリペプチドの遊離をもたらす好適なタンパク質基質の任意の酵素的処置であってもよい。酵素の数種の組み合わせがタンパク質基質から所望のトリペプチドを遊離するために使用され得るが、本方法において使用される好ましい酵素はプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリン特異的オリゴペプチダーゼである。好適なタンパク質基質はアミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを包含する任意の基質であってもよい。ＭＡＰを包含することで知られるタンパク質基質は、例えば、カゼイン、コムギグルテン、ヒマワリタンパク質分離物、米タンパク質、卵タンパク質である。好適なタンパク質基質は好ましくは、ウシβ−カゼイン、コムギグルテンのα−グリアジン画分中およびヒマワリタンパク質分離物の２Ｓ画分中に存在するとおりのアミノ酸配列ＡＭＡＰまたはＰＭＡＰを包含する。
【００４４】
カゼイン基質は相当量のβ−カゼインおよびα−ｓ２−カゼインを含有する任意の材料であってもよい。好適な基質の例は乳ならびにカゼイン、カゼイン粉末、カゼイン粉末濃縮物、カゼイン粉末分離物またはβ−カゼイン、またはα−ｓ２−カゼインである。好ましくは、カゼインタンパク質分離物（ＣＰＩ）などの、高含量のカゼインを有する基質である。
【００４５】
酵素は、結果として１個または複数のトリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰの遊離をもたらす、β−カゼインおよび／またはα−ｓ２−カゼインなどのタンパク質を加水分解できる任意の酵素または酵素の組み合わせであってもよい。
【００４６】
分離ステップ（ｂ）は当業者に周知の任意の方法で、例えば、沈殿、ろ過、遠心分離、抽出またはクロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせにより実行されてもよい。好ましくは分離ステップ（ｂ）は精密ろ過または限外ろ過の技法を使用して実行される。ろ過ステップにおいて使用される膜の孔径、ならびに膜の電荷がトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰの分離を制御するべく使用されてもよい。ＵＦ／ＮＦ荷電膜を使用するカゼインタンパク質加水分解物の分画がＹ．ポワロ（Ｙ．Ｐｏｉｌｏｔ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５８（１９９９年）１０５−１１４頁に記載される。
【００４７】
濃縮ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）により生成される画分のナノろ過または蒸発を含み、高濃縮液を産出してもよい。例えば低水分活性（Ａｗ）、低ｐＨおよび好ましくは安息香酸またはソルビン酸などの防腐剤を伴い、好適に調合される場合、かかる濃縮液組成物は本発明に従うトリペプチドの魅力的な貯蔵方法となる。場合により蒸発ステップの後に乾燥ステップ、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥が続き、高濃度のＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する固形物を産出する。
【００４８】
酵素処理は好ましくは単一の酵素インキュベーションステップを含んでなる。本発明に従う酵素処理はさらに、好ましくは夾雑酵素活性のないプロリン特異的プロテアーゼの使用に関する。プロリン特異的プロテアーゼはプロリンのカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼとして定義される。好ましいプロリン特異的プロテアーゼはプロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼである。プロリン特異的プロテアーゼは好ましくはポリペプチドまたはタンパク質それ自体のような巨大タンパク質分子の加水分解能を有する。本発明に従う方法は一般に、２４時間未満のインキュベーション時間、好ましくは１０時間未満のインキュベーション時間およびより好ましくは４時間未満のインキュベーション時間を有する。インキュベーション温度は一般に、３０℃より高く、好ましくは４０℃より高く、およびより好ましくは５０℃より高い。
【００４９】
本発明の別の態様はトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの加水分解タンパク質からの精製および／または分離である。本発明に従う加水分解タンパク質の大部分は好ましくは選択されたｐＨ条件下で沈殿能を有する。この精製処理はｐＨを加水分解および非加水分解タンパク質の大部分を沈殿させるｐＨに変性するステップおよび沈殿したタンパク質を溶液中に残留する（生物活性）トリペプチドから分離するステップを含んでなる。
【００５０】
カルボキシ末端側終端にプロリン残基を伴う本トリペプチドを得るためには、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断できるプロテアーゼの使用が好ましい選択肢を提示する。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）はペプチドをプロリン残基のカルボキシ側で選好的に切断する固有の可能性を有する。プロリルオリゴペプチダーゼはまた、ペプチドをアラニン残基のカルボキシ側で切断する可能性も有するが、この反応はプロリン残基を含むペプチド結合の切断より効率が悪い。哺乳動物ならびに微生物源から単離される適切にキャラクタライズされた全てのプロリン特異的プロテアーゼにおいては、酵素の活性部位から高分子ペプチドを排除する固有のペプチダーゼドメインが同定されている。事実、これらの酵素は約３０アミノ酸残基超を含有するペプチドを分解できないため、これらの酵素は今日「プロリルオリゴペプチダーゼ」と称される（フロップ（Ｆｕｌｏｐ）ら：Ｃｅｌｌ、第９４巻、１６１−１７０頁、１９９８年７月２４日）。結果としてこれらのプロリルオリゴペプチダーゼは加水分解の効用を及ぼし得る前に他のエンドプロテアーゼを伴う前加水分解を必要とする。しかしながら、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットに記載されるとおり、プロリルオリゴペプチダーゼのかかる別のエンドプロテアーゼとの組み合わせでさえ結果としてカルボキシ末端プロリン残基を伴うペプチドの割合の有意な亢進により特徴づけられる加水分解物をもたらす。このため、かかる加水分解物はインビトロでのＡＣＥ阻害作用ならびに胃腸管内タンパク質分解に対する改善された抵抗性を伴うトリペプチドの単離のための優れた出発点となる。
【００５１】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は本明細書においてペプチド結合を通じ連結される少なくとも２個のアミノ酸の鎖として定義される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は（一般に認識されるとおり）同義と考えられるとともに各用語は文脈上の必要に応じ可換的に使用され得る。「ポリペプチド」は本明細書において３０個を超えるアミノ酸残基を含有する鎖として定義される。本明細書中の全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、慣行に従い、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向として表記される。本明細書中で使用されるアミノ酸の１文字コードは当該技術分野において一般に周知であるとともにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）に見出され得る。
【００５２】
エンドプロテアーゼは本明細書においてポリペプチド中のペプチド結合をエンド様式で加水分解するとともにＥＣ３．４群に属する酵素として定義される。エンドプロテアーゼは触媒機序に基づきサブ−サブクラスに分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブ−サブクラスがある。エキソプロテアーゼは本明細書において末端α−アミノ基に隣接するペプチド結合を加水分解する酵素（「アミノペプチダーゼ」）、または末端カルボキシル基と末端から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合を加水分解する酵素（「カルボキシペプチダーゼ」）として定義される。
【００５３】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から得られる特異的プロテアーゼを記載する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素はプロリンのカルボキシ末端で選好的に切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端でも、およびより効率は低いが、アラニンのカルボキシ末端でも選好的に切断できる。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはまた、このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素と他の微生物または哺乳動物源由来の既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に明確な相同性が存在しないことも教示する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは対照的に、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は酸性の最適ｐＨ値を有する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼもＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素もいわゆるセリンプロテアーゼであるが、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は全く異なるサブファミリーに属する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）分泌酵素は、大部分の細胞質プロリルオリゴペプチダーゼが群化されているＳ９ファミリーよりむしろ、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであると見られる（ローリング，Ｎ．Ｄ．（Ｒａｗｌｉｎｇ，Ｎ．Ｄ．）およびバレット，Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２９８（１９９６年）１−３頁）。本発明の方法において使用されるとおりのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物は好ましくは本質的に純粋である、つまり純プロリン特異的エンドプロテアーゼに固有の内部タンパク質分解活性以外の有意な内部タンパク質分解活性が存在しない。我々はまた、好ましくは本発明に従い使用される我々のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物が外部タンパク質分解性の、より具体的にはアミノペプチド分解性の副次的な活性を一切含有しないことも実証する。好ましくは外部タンパク質分解活性は本発明の方法において使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物中に不在である。プロリン特異的内部タンパク質分解活性が非組換えアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株中に本質的に不在であるという概念についての実験的証明は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに見出され得る。本発明の方法はカゼイン基質をプロリン特異的エンドプロテアーゼのみを伴いインキュベートすることにより可能であることから、温度、ｐＨ等といった最適なインキュベーション条件は容易に選択され得るとともに、２個以上の酵素が利用される場合に想定されるような準最適条件で固定化される必要はない。さらに不要な副産物、例えば付加的な非生物活性ペプチドまたは肉汁臭い味につながる遊離アミノ酸などの形成を防止する。反応条件を選択する際により高い自由度を有すれば、より容易に他の基準を選択することが可能となる。例えば、微生物感染に対しより感受性が低い条件を今日選択すること、および続くタンパク質沈殿ステップに関するｐＨ条件を最適化することはさらに容易である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）酵素はオリゴペプチダーゼではないが、未処理タンパク質、高分子ペプチドならびにより低分子量のペプチド分子をアクセサリーエンドプロテアーゼの必要なしに加水分解できる真のエンドペプチダーゼである。この新しい、かつ驚くべき発見は、アクセサリーエンドプロテアーゼが必要とされないため、かつてない高含量のカルボキシ末端プロリン残基を備えるペプチドを伴う加水分解物の調製に向けたＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素の使用の可能性を切り開く。かかる新加水分解物は植物由来または動物由来であるにしろ種々のタンパク質性出発材料から調製され得る。かかる出発材料の例は、カゼイン、ゼラチン、魚または卵タンパク質、コムギグルテン、大豆およびエンドウ豆タンパク質ならびに米タンパク質およびヒマワリタンパク質がある。ナトリウムは高血圧症において重要な役割を果たすことが知られているため、ＡＣＥ阻害ペプチドの産生に好ましい基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩よりむしろ、カルシウムおよびカリウムである。
【００５４】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨ値は４．３前後である。この低い最適ｐＨ値のためウシ乳カゼイン塩をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼを伴いインキュベートするステップは自明ではない。ウシ乳カゼイン塩はｐＨが６．０未満に降下すれば沈殿するであろうが、ｐＨ６．０ではＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は限定的な活性のみを有する。このむしろ好ましからざる条件下でさえ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼを伴うインキュベーションはＩＰＰおよびＬＰＰなどの数個の既知のＡＣＥ阻害ペプチドを産出する。非常に驚くべきことにＶＰＰはこれらの条件下では一切産生されない。ウシ乳カゼインはβ−カゼインおよびκ−カゼインを含む多くの異なるタンパク質を混入する。既知のアミノ配列に従えば、β−カゼインはＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。κ−カゼインはＩＰＰのみを包含する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素が計測可能なアミノペプチダーゼ活性を一切含有しないという事実は、形成されるＩＰＰがκ−カゼイン中に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることを強く示唆する。おそらくＩＰＰのペプチド結合カルボキシ末端はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの主活性により切断されるが、一方先行するＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断はそのＡｌａ特異的副次活性により達成される。同様にＶＰＰの不在はアミノペプチダーゼ副次活性の不在に基づき説明され得る。ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−内のβ−カゼイン中に含有される。したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ＶＶＶＰＰ配列を切除するが、ＶＰＰを放出することはできない。
【００５５】
これらの結果は単純な１ステップ酵素処理においてカゼイン塩をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼとともにインキュベートすると得られる。タンパク質を含有する水溶液は、特に５．０を上回るｐＨ値および摂氏５０度以下の温度で何時間も保たれる場合に、高度に微生物感染しやすい。特にかかる長時間インキュベーションステップの間に産生され得る微生物毒素は、続く加熱ステップにも生残するとともに食品級の処理に対する潜在的な脅威となる恐れがある。本発明は好ましくは摂氏５０度を上回るインキュベーション温度を使用する。酵素インキュベーションの実行時間が２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは４時間未満である１ステップ酵素処理との組み合わせにおいて、本発明に従う方法は改善された微生物的安定性の利点を提供する。高温条件と組み合わせて本酵素基質比を使用すると、ＩＰＰおよびＬＰＰの切除は３時間のインキュベーション時間内に完了される。
【００５６】
ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰはカゼインから単一の、本質的に純粋なエンドプロテアーゼを使用して切除され得るため、本発明は結果として先行技術の方法より少数の水溶性ペプチドをもたらす。これらの水溶性ペプチドのなかでもＩＰＰおよびＬＰＰは多量に存在する。これは、他の多くの、しばしば低活性である化合物を伴わない高濃度のＡＣＥ阻害トリペプチドが必要とされる場合に特に重要である。
【００５７】
本方法に従えば、タンパク質中に存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＩＰＰまたはＬＰＰに変換される。
【００５８】
実施例において我々は新しい、かつ驚くべき精製ステップによる５倍の生物活性ペプチド精製作用を説明する。この精製処理の基本はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの固有の特性からなる。この酵素を伴うインキュベーションは基質分子のほとんどの生物活性部分を水溶性トリペプチドの形態で放出する。基質分子の非または低生物活性部分は大部分が基質分子の非切断かつそれゆえはるかに高分子量のペプチドまたはポリペプチド部分中に残留する。選択されたｐＨ条件下でのこれらの高分子ペプチドまたはポリペプチド部分の限定的な水溶性により、基質分子のこれらの非または低生物活性部分はさらにより高い可溶性の生物活性トリペプチドから容易に分離される。この方法において最初の加水分解物は摂氏５５度、ｐＨ６．０での短い酵素インキュベーション時間の間に形成されるとともに、次に場合により摂氏８０度を上回る温度まで加熱され、全ての汚染微生物を死滅させるとともにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化させる。続いて加水分解物が酸性化され、４．５または少なくとも５．０未満までのｐＨ降下を実現する。このｐＨ値では、酵素にとっての最適条件に相当するためＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化するためには使用され得ないが、カゼイン塩由来の全ての高分子ペプチドは沈殿するため溶液中にはより低分子量のペプチドのみが残留する。沈殿させたカゼイン塩はデカンテーションもしくはろ過ステップまたは低速（すなわち、５０００ｒｐｍ未満）遠心分離により容易に除去され得るため、水相はタンパク質の存在量に比べ高い割合の生物活性ペプチドを含有する。ケルダールデータによればカゼインタンパク質の８０〜７０％が低速遠心分離ステップにより除去され、これは４〜５倍のＡＣＥ阻害ペプチド精製を意味する。我々はこの精製原理がカゼイン以外のタンパク質性材料から得られる生物学的に活性なペプチドを得るためにも同様に有利に適用され得ることを発見している。また、酵素的に産生される加水分解物だけでなく、好適な微生物により発酵されるタンパク質も本方法に従い分離されるとともに精製され得る。基質が沈殿するであろうとともに酵素がなお活性である場合に近いｐＨ値で酵素および基質をインキュベートすることによりこの精製ステップは可能となるであろう。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの低い最適ｐＨ値から、ｐＨ１．５〜６．５の間の範囲での基質沈殿が考えられ得る。その特異的な沈殿挙動の点から見て、グルテン沈殿ｐＨ３．５超、ヒマワリタンパク質沈殿ｐＨ４．０超およびｐＨ６．０未満、卵白沈殿ｐＨ３．５超およびｐＨ５．０未満が、加水分解されたタンパク質が沈殿するとともに沈殿したタンパク質が加水分解されたタンパク質またはペプチドから分離され得る条件の例となる。
【００５９】
デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後、生物学的に活性なペプチドを含有する上清が精製された状態で回収され得る。続く蒸発および噴霧乾燥ステップは高生物活性の食品級ペーストまたは粉末を得るための経済的経路を産み出すであろう。記載されるとおりの方法に従いカゼイン塩を消化すると、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを伴う白色かつ無臭の粉末が得られる。あるいは蒸発またはナノろ過が使用され、生物活性ペプチドをさらに濃縮し得る。水分活性（Ａｗ）をｐＨ調整および安息香酸またはソルビン酸のような食品級防腐剤の添加と組み合わせて増加させることによるかかる濃縮物の適当な製剤は、血圧降下ペプチドの、微生物学的に安定な食品級の濃縮液を産出するであろう。正しいトリペプチド濃度まで然るべく希釈されたならば、ＡＣＥ阻害特性を備えるあらゆる種類の食品および飲料を供与するのに好適な多用途の出発材料が得られる。必要であれば、デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清がさらに処理され、最終産物の食味を改善し得る。例えば、上清は粉末状活性炭と接触させた後、続くろ過ステップで炭を除去し得る。最終産物の苦味を最小化するため、デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清はまた、サブチリシン、トリプシン、中性プロテアーゼまたはグルタミン酸特異的エンドプロテアーゼなどの別のプロテアーゼを伴うインキュベーションにも供され得る。必要であれば、生物活性成分ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの濃度は、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの特異的親水性／疎水性の特質の使用がなされる続く精製ステップによってさらにより高く上昇させ得る。好ましい精製方法としては、ナノろ過（サイズによる分離）、例えばヘキサンまたはブタノールを伴う抽出に続く蒸発／沈殿または得られるとおりの酸性化された加水分解物の、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤレンジ（ｒａｎｇｅ）（ローム（Ｒｏｅｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂との接触が挙げられる。ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により供給されるとおりのブチル−セファロース樹脂もまた使用され得る。
【００６０】
別の実施例において我々は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを新ペプチド精製方法と組み合わせて使用して調製されるカゼイン加水分解物中の新ＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定について記載する。この単一かつ（本質的に純粋な）エンドプロテアーゼを、非生物活性ペプチドの大部分の除去および高度に洗練された分離および同定機器と組み合わせて使用するだけで、我々はこれらの新ＡＣＥ阻害トリペプチドを探知するとともに同定することが可能となった。実施例に従い（沈殿後に）調製されるカゼイン由来生物活性ペプチド（ＣＤＢＡＰ）において、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは２．９ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ１グラム（４．８ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラム）および０．９ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ１グラム（１．４ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラム）に相当する分量で同定された。ＣＤＢＡＰについてのさらなる特質はモルベースで２４％のその異常に高いプロリン含量である。本実施例７に記載される試験は、修正マツイ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍａｔｓｕｉ）試験における２個の新トリペプチドについて非常に低いＩＣ５０値、すなわちＭＡＰについて０．５マイクロモル／ｌおよびＩＴＰについて１０マイクロモル／ｌを示す。この知見は、既知の最も有効な天然ＡＣＥ阻害ペプチドの１つであるＩＰＰがこの修正マツイ試験において２．０マイクロモル／ｌのＩＣ５０値を有することを我々が理解するならば、さらにより驚くべきものである。
【００６１】
本方法に従えば、タンパク質中に存在する−Ｍ−Ａ−Ｐ−または−Ｉ−Ｔ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％がそれぞれ、トリペプチドＭＡＰまたはＩＴＰに変換される。
【００６２】
新規に同定されたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの有用性が実施例のなかでさらに説明される。当該実施例において我々は双方のペプチドが、胃腸管中に典型的に所見される消化条件をシミュレートするインキュベーション条件で生残することを示す。これらのデータに基づき我々は、新規トリペプチドが哺乳動物（例えばヒト）胃腸管中で生残する可能性があると結論づけ、これは高血圧症を処置するため使用されるならば相当な経済的可能性を意味する。
【００６３】
実施例において我々は優れたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰが酵素加水分解実験において産生され得るのみならず、然るべき食品級微生物を伴い発酵される乳調製物においても検出されることを実証する。しかしながら、我々はかかる発酵産物中のペプチドＩＴＰの存在については実証できていない。
【００６４】
追加的なステップ（例えばクロマトグラフィー精製）の前または後のいずれかに得られるとおりのペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰが日常的に広く消費される食製品中に混入するべく使用されてもよい。かかる製品の例は、マーガリン、スプレッド、バターまたはヨーグルトまたはミルクまたは乳清含有飲料などの様々な乳製品である。かかる組成物は典型的には人間に投与されるが、それらはまた、動物、好ましくは哺乳動物に投与され高血圧症を軽減してもよい。さらには得られるとおりの製品中の高濃度のＡＣＥ阻害剤によりこれらの製品は丸薬、錠剤または高濃縮溶液またはペーストまたは粉末の形態で食事補助剤中に混入するのに非常に有用となる。ＡＣＥ阻害ペプチドの継続的放出を確実にするであろう徐放性食事補助剤は特に興味深い。本発明に従うＭＡＰおよび／またはＩＴＰペプチドは乾燥粉末として、例えば、丸薬、錠剤、顆粒、小袋またはカプセル中に調合されてもよい。あるいは本発明に従う酵素は液体として、例えば、シロップまたはカプセル中に調合されてもよい。様々な製剤において使用されるとともに本発明に従う酵素を含有する組成物はまた、生理学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、安定剤、緩衝剤および希釈剤からなる群より選択される少なくとも１個の化合物を混入してもよく、ここで用語はそれらの通常の意味において使用されることで、包装、送達、吸収、安定化、またはアジュバントの場合には、酵素の生理学的作用の亢進を補助する物質を指示する。本発明に従う酵素と組み合わせて粉末形状で使用され得る様々な化合物に関連する背景は「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２ マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に見出され得る。乾燥粉末として調合される本発明に従うＡＣＥ阻害ペプチドはかなり長期間保存され得るが、湿潤または湿気は、例えばアルミニウムブリスターなどの好適な包装を選定することにより避けなければならない。比較的新しい経口適用形態は、様々なタイプのゼラチンカプセルまたはゼラチンベース錠剤の使用である。
【００６５】
高血圧症に対抗するための天然ＡＣＥ阻害ペプチドの関連性の点から見て、この新しく、かつ費用対効果の高い経路は穏和な降圧性栄養補給用またはさらには動物用の製品に向けた魅力的な出発点を提供する。本経路もまた、驚くべきことに単純な精製ステップを含むため、血圧降下性濃縮食事補給剤の可能性もまた広がる。
【００６６】
本発明に従う、または本発明に従い使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼとは、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３に記載されるとおりのポリペプチドを意味する。それゆえこのプロリン特異的エンドプロテアーゼはプロリン特異的内部タンパク質分解活性を有するポリペプチドであり、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）６０ヌクレオチド超、好ましくは１００ヌクレオチド超が少なくとも８０％または９０％同一である配列番号１の核酸配列またはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、からなる群より選択される。配列番号１および配列番号２は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示されるとおり。好ましくはポリペプチドは単離形態である。
【００６７】
本発明に従い使用される好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、およびさらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するか、または配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列を有する。
【００６８】
好ましくはポリペプチドは、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、および最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の核酸配列またはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００６９】
用語「ハイブリダイズ能を有する」は、本発明の標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に上回るレベルでプローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはその断片、または配列番号１の相補体）とハイブリダイズできることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的であるヌクレオチド配列も含む。ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ、および最も好ましくは、ゲノムＤＮＡ配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択条件下で配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチドの連続配列を含んでなる。かかるヌクレオチドは当該技術分野において周知の方法に従い合成され得る。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体とバックグラウンドを有意に上回るレベルでハイブリダイズできる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリ中に存在する他のｃＤＮＡのため、起こり得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用により生成されるシグナルレベルは典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射標識することにより計測されてもよい。選択的ハイブリダイゼーションは典型的には、低ストリンジェンシー（約４０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）の条件を使用して実現されてもよい。
【００７１】
ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供するが、これを使用して同一性を計算してもよい（例えばそのデフォルト設定で使用される）。
【００７２】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ Ｎアルゴリズムもまた、配列同一性を計算するため、または配列を整列させる（例えば、これらのデフォルト設定で、同等な、または一致する配列を同定するなどの）ため使用され得る。
【００７３】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされる時、ある正値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定するステップを含む。Ｔは近縁ワードスコア閾値と称される。これらの初期近縁ワードヒットはそれらを含むＨＳＰを求めるための検索を開始するにあたっての元種として働く。ワードヒットは累積アラインメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットの伸長は次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から分量Ｘだけ下落する場合；１つまたは複数の負値スコアの残基アラインメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の終端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）は１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスアラインメント（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００７４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２本の配列間の類似性の統計的解析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であるならば、配列は他方の配列と類似していると考えられる。
【００７５】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の株は食品級の等級を有するとともにこれらの微生物に由来する酵素は疑いのない食品級源由来として知られる。別の好ましい実施形態に従えば、酵素は、非分泌性の、いわゆる細胞質ゾル細胞よりむしろ、その産生細胞によって分泌される。このように酵素は高価な精製ステップを伴わず本質的に純粋な状態で細胞ブロスから回収され得る。好ましくは酵素は一般的なｐＨおよび温度条件下でその基質に対し高親和性を有する。
【００７６】
本発明に従う栄養補助製品は任意の食品タイプであってもよい。それらは、然るべき量で、香味料、砂糖、果実、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等の、一般的な食品成分を食製品に加え含んでなってもよい。
【００７７】
好ましくは、栄養補助製品は５０〜２００ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または１５〜６０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または６〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋、より好ましくは、１００〜１５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３０〜５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１０〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋および最も好ましくは１１０〜１３５ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３５〜４５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１３〜２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋を含んでなる。これらの陽イオンは本発明に従う栄養補助製品中に混入されると血圧をさらに降下させる有益な作用を有する。
【００７８】
有利には、本栄養補助製品は１種または複数のビタミンＢ群を含んでなる。
【００７９】
ビタミンＢ群の葉酸は、ヒトの食事中のアミノ酸であるホモシステインの代謝に関与することが知られている。長年にわたり、高レベルなホモシステインは心血管疾患の高い発症率と相関してきた。ホモシステインの降下は心血管疾患のリスクを低減し得ると思われる。
【００８０】
ビタミンＢ６およびＢ１２はプリンおよびチアミンの生合成に干渉し、メチオニン産生のためのホモシステインメチル化の過程およびいくつかの成長過程におけるメチル基の合成に関与することで知られる。ビタミンＢ６（塩酸ピリドキシン）は既知のビタミン補助剤である。ビタミンＢ１２（シアノバラミン）は神経系の健康に寄与するとともに赤血球の産生に関わる。これはまた、食品補助剤中のビタミンとしても知られる。
【００８１】
心血管疾患リスクの低減に対するこれらの組み合わされた正の作用から、本発明に従う製品はビタミンＢ６およびビタミンＢ１２および葉酸を含んでなることが好ましい。
【００８２】
本栄養補助製品中のビタミンＢ群の量は以下に与えられるこれらのビタミンＢ群の１日量を基本として当業者により計算されてもよい：葉酸：２００〜８００μｇ／日、好ましくは２００〜４００μｇ／日；ビタミンＢ６：０．２〜２ｍｇ／日、好ましくは０５〜１ｍｇ／日およびビタミンＢ１２：０．５〜４μｇ／日、好ましくは１〜２μｇ／日。
【００８３】
好ましくは、本栄養補助製品は３〜２５ｗｔ％のステロール、より好ましくは７〜１５ｗｔ％のステロールを含んでなる。ステロールの混入の利点は、それがヒト血中のＬＤＬコレステロールレベルの低減を引き起こすであろう点であり、これは結果として心血管上のリスクの低減をもたらすであろう。
【００８４】
参照がステロールに対しなされる場合、これは飽和スタノールおよびステロール／スタノールのエステル化誘導体またはこれらのうち任意のものの混合物を含む。
【００８５】
本出願において参照がステロールエステルになされる場合、これもまた、それらの飽和誘導体、スタノールエステル、およびステロールエステルおよびスタノールエステルの組み合わせを含む。
【００８６】
ステロールまたはフィトステロールは、植物ステロール（ｐｌａｎｔ ｓｔｅｒｏｌまたはｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｓｔｅｒｏｌ）としても知られ、４−デスメチルステロール、４−モノメチルステロールおよび４，４’−ジメチルステロールの３群に分類され得る。油中でこれらは主に、遊離ステロールおよび脂肪酸のステロールエステルとして存在するが、ステロールグルコシドおよびアシル化ステロールグルコシドもまた存在する。３つの主要なフィトステロール、すなわちβ−シトステロール、スチグマステロールおよびカンペステロールがある。意図される構成成分の概略図は「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｎ Ｓｔｅｒｏｌｓ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｏｉｌｓ」、Ｓ．Ｐ．コチャール（Ｓ．Ｐ．Ｋｏｃｈｈａｒ）；Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２２：１６１−１８８頁に与えられるとおりである。
【００８７】
シトスタノール、カンペスタノールおよびエルゴスタノールおよびそれらの誘導体などのそれぞれの５α−飽和誘導体は本明細書中ではスタノールと称される。好ましくは（場合によりエステル化された）ステロールまたはスタノールはβ−シトステロールの脂肪酸エステル、β−シトスタノール、カンペステロール、カンペスタノール、スチグマステロール、ブラシカステロール、ブラシカスタノールまたはそれらの混合物を含んでなる群より選択される。
【００８８】
ステロールまたはスタノールは場合により少なくとも部分的に脂肪酸でエステル化される。好ましくはステロールまたはスタノールは１個または複数のＣ２−２２脂肪酸でエステル化される。本発明の目的上、用語Ｃ２−２２脂肪酸はＣ２−２２主鎖および少なくとも１個の酸性基を含んでなる任意の分子を参照する。本文意内では好ましくないが、Ｃ２−２２主鎖は部分的に置換されてもよく、または側鎖が存在してもよい。しかしながら、好ましくはＣ２−２２脂肪酸は末端基として１または２個の酸性基を含んでなる直鎖分子である。最も好ましくあるのは天然油中に存在するものと同様の直鎖Ｃ８−２２脂肪酸である。
【００８９】
任意のかかる脂肪酸の好適な例は酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸である。他の好適な酸は、例えばクエン酸、乳酸、シュウ酸およびマレイン酸である。最も好ましくあるのは、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、オレイン酸、セトレイン酸、エルカ酸、エライジン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【００９０】
所望であれば脂肪酸の混合物がステロールまたはスタノールのエステル化のために使用されてもよい。例えば、天然起源の脂肪または油を脂肪酸の原料として使用すること、およびエステル交換反応を介してエステル化を実行することが可能である。
【００９１】
上述された栄養補助成分は、心血管の健康を増加させることに寄与し、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、ビタミンＢ群（葉酸、Ｂ６、Ｂ１２）およびステロールは本明細書中ではまとめて心臓の健康成分と称される。
【００９２】
以下の実施例が本発明をさらに説明する。
【００９３】
Ａ．医薬組成物は従来の製剤手順により以下に指定される成分を使用して調製されてもよい：
実施例１
ソフトゼラチンカプセル
ソフトゼラチンカプセルは従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．１ｇ、タンパク質加水分解物０．３ｇ
他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物油
実施例２
ハードゼラチンカプセル
ハードゼラチンカプセルは従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．３ｇ、タンパク質加水分解物０．７ｇ
他の成分：
賦形剤：ラクトースまたはセルロース誘導体適量
潤滑剤：必要に応じてステアリン酸マグネシウム（０．５％）
実施例３
錠剤
錠剤は従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．４ｇ、タンパク質非加水分解物０．４ｇ
他の成分：微結晶性セルロース、二酸化シリコン（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム。
【００９４】
Ｂ．食品項目は従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製されてもよい：
実施例４
果汁３０％の清涼飲料
標準的な１食量：２４０ｍｌ
活性成分：
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物および炭水化物源としてのマルトデキストリンが本食品項目に混入される：
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ：０．５〜５ｇ／１食
タンパク質加水分解物：１．５〜１５ｇ／１食
マルトデキストリン：３〜３０ｇ／１食
【００９５】
Ｉ．「清涼飲料化合物」は以下の成分から調製される：
果汁濃縮物および水溶性香味料
［ｇ］
１．１ オレンジ濃縮物
６０．３°ブリックス、５．１５％酸性度 ６５７．９９
レモン濃縮物
４３．５°ブリックス、３２．７％酸性度 ９５．９６
オレンジ香味料、水溶性 １３．４３
アプリコット香味料、水溶性 ６．７１
水 ２６．４６
１．２ 着色料
β−カロチン１０％ＣＷＳ ０．８９
水 ６７．６５
１．３ 酸および抗酸化剤
アスコルビン酸 ４．１１
無水クエン酸 ０．６９
水 ４３．１８
１．４ 安定剤
ペクチン ０．２０
安息香酸ナトリウム ２．７４
水 ６５．６０
１．５ 油溶性香味料
オレンジ香味料、油溶性 ０．３４
蒸留オレンジ油 ０．３４
１．６ 活性成分
活性成分（これは上述される活性成分、すなわち上述される濃度におけるＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物およびマルトデキストリンを意味する）。
【００９６】
果汁濃縮物および水溶性香味料は空気の混入なしに混合される。着色料は脱イオン水中に溶解される。アスコルビン酸およびクエン酸は水中に溶解される。安息香酸ナトリウムは水中に溶解される。ペクチンは撹拌下で添加されるとともに煮沸しながら溶解される。溶液は冷却される。オレンジ油および油溶性香味料は予混合される。１．６に記述されるとおりの活性成分は乾燥混合されるとともに、次に好ましくは果汁濃縮混合物（１．１）中に撹拌される。
【００９７】
清涼飲料化合物を調製するため、３．１．１から３．１．６の全ての部分が共に混合された後トゥラックス（Ｔｕｒｒａｘ）および次に高圧ホモジナイザー（ｐ１＝２００バール、ｐ２＝５０バール）を使用してホモジナイズされる。
【００９８】
ＩＩ．「瓶詰めシロップ」は以下の成分から調製される：
［ｇ］
清涼飲料化合物 ７４．５０
水 ５０．００
液糖 ６０°ブリックス １５０．００
【００９９】
瓶詰めシロップの成分は共に混合される。瓶詰めシロップは１ｌのすぐに飲める飲料となるまで水で希釈される。
【０１００】
変形例：
安息香酸ナトリウムを使用する代わりに、飲料は低温殺菌されてもよい。飲料はまた、炭化されてもよい。
【０１０１】
実施例５
カゼインカリウムをＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼを伴いインキュベートすることによりＩＰＰおよびＬＰＰは急速に産出されるがＶＰＰは産出されない。
本実験においては、過剰産生され、かつ本質的に純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼがカゼインカリウムを伴いインキュベートされ、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰの遊離について試験された。使用されたエンドプロテアーゼは本質的に純粋であった、つまりプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有の内部タンパク質分解活性（すなわち、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端切断）以外の有意な内部タンパク質分解活性は存在しなかった。
【０１０２】
ＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウム取り込みを可能な限り制限するため、カゼインカリウムがこのインキュベーションにおける基質として使用された。
【０１０３】
カゼイン塩が１０％（ｗ／ｗ）タンパク質濃度で摂氏６５度の水中に懸濁された後、ｐＨがリン酸を使用して６．０に調整された。次に懸濁液が摂氏５５度まで冷却され、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが４ユニット／タンパク質１グラムの濃度で添加された（ユニットの定義については「材料および方法」の節を参照）。連続撹拌下でこの混合物は２４時間インキュベートされた。この間にさらなるｐＨ調整は実行されなかった。試料がインキュベーションの１、２、３、４、８、および２４時間後に採取された。各試料の酵素活性は、摂氏９０度まで５分間、該試料を即時加熱することにより終了させた。冷却後、各試料のｐＨをリン酸を使用して４．５まで速やかに降下させた後、懸濁液がヘレウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）卓上遠心分離機において３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離された。完全に清澄な上清がＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に使用され、上清中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦが定量化された（「材料および方法」の節を参照）。
【０１０４】
ウシ乳カゼインはβ−カゼインおよびκ−カゼインを含む多数の異なるタンパク質を混入する。既知のアミノ配列に従えば、β−カゼインはＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。β−カゼインにおいてＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−内に含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−内に含有され、およびＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−内に含有される。κ−カゼインは、β−カゼイン濃度のほぼ５０％のモル濃度における酸沈殿カゼイン塩調製物中に存在し、ＩＰＰのみを包含する。κ−カゼインにおいてＩＰＰは配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−内に含有される。カゼインの他のタンパク質構成物はＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含有しない。
【０１０５】
表２および３は、酸性化され、かつ遠心分離された上清中に存在するペプチドの、インキュベーション混合物に添加されるカゼインカリウム１グラム当たりで計算されるときの、濃度を示す。表２に示されるとおり、ＩＰＰはインキュベーションの１時間後にその最高濃度に到達する。そのうえＩＰＰ濃度はそれ以上は上昇しない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成はＩＰＰの生成と同じ動態を示す。理論的に予想されるとおり、ＶＶＶＰＰのモル収量はＬＰＰペプチドのモル収量と同様である。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの双方の収量は理論的に可能であろう収量のほぼ６０％に達する。ＬＰＰの最高濃度がインキュベーションのわずか３時間後に到達されるという事実は、β−カゼイン分子の特定部分の切断がことによると若干さらに困難であることを示唆する。ＶＶＶＰＰとは対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦは全く形成されない。この観測はプロリン特異的エンドプロテアーゼが効率的に−Ｐ−Ｆ−結合を切断し、それによりＶＶＶＰＰを生成することを示唆する。トリペプチドＩＰＰは即時形成されるが、そのモル収量はＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれかの最大モル収量の約３分の１を上回ることはない。ＩＰＰトリペプチドはβ−カゼインおよびκ−カゼインの双方の中に含有されるため、この結果は予想外である。この観測について可能な説明は、プロリン特異的プロテアーゼはＩＰＰを生成できるがカゼイン塩のκ−カゼイン部分からのみできるというものである。関連するκ−カゼインのアミノ酸配列の点から見て、これは−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合が酵素のアラニン特異的活性により切断されることを示唆する。これが真実ならば、遊離されるＩＰＰの量はκ−カゼイン中に存在する分量のおよそ４０％に達するが、理論的にβ＋κ−カゼイン中に存在するＩＰＰの約１０％は上回らない。ＩＰＰの放出についてのこの切断機序はまた、なぜＶＰＰがその前躯体分子ＶＶＶＰＰから形成され得ないのかについても説明する：所要の内部タンパク質分解活性が使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物中に単に存在しないのである。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
実施例６
酸カゼイン沈殿ステップの組込みは結果としてＡＣＥ阻害ペプチドの５倍の濃度をもたらす
実施例５に記載されるとおり、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質濃度のカゼインカリウムがｐＨ６．０でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを伴うインキュベーションに供された。様々なインキュベーション時間の後、試料は加熱されさらなる酵素活性が中断された後、ｐＨが４．５まで降下されカゼイン溶解度は最小化された。不溶カゼイン分子が低速遠心分離により除去された。表２および３において我々は１０％タンパク質の出発濃度に基づき計算されるＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供している。しかしながら、酸性化および続く遠心分離ステップの結果として、添加されたタンパク質の大部分が除去された。酸性化された上清のこれらの低減したタンパク質含量を考慮に入れるため、窒素（ケルダール）分析が実行された。このデータによれば様々な上清が表４に示されるタンパク質レベルを含有することが所見された。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
これらのデータを考慮に入れ、我々は各上清中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算しているが、今回はそれらの実際のタンパク質含量を使用した。これらの再計算データは表５に示される。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
表３および５に提示されるデータの比較は、単純な酸性化ステップに続く工業的に実施可能なデカンテーション、ろ過または低速遠心分離ステップが結果として特異的ＡＣＥ阻害ペプチドの濃度に５倍の増加をもたらすことを明確に示す。
【０１１３】
実施例７
濃縮カゼイン加水分解物中の新規かつ強力なＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定
存在する生物活性ペプチドのより徹底した分析を円滑にするため、純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼでの消化により得られるとともに酸沈殿により精製されるカゼイン加水分解物が調製用規模で調製された。この目的のため３０００グラムのカゼインカリウムが２５リットルの摂氏７５度の水中に懸濁された。徹底した均質化の後、ｐＨが希釈リン酸を使用して徐々に６．０まで調整された。摂氏５５度まで冷却後、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが４酵素ユニット／カゼイン塩１グラムの濃度で添加された（ユニットの定義については「材料および方法」の節を参照）。３時間、摂氏５５度でのインキュベーション（撹拌を伴う）後、ｐＨは濃縮リン酸を徐々に添加することにより４．５まで降下させた。この大規模な調製においては、方法のこの部分においてプロリン特異的エンドプロテアーゼを不活化する加熱処置ステップが省略された。次に懸濁液が速やかに摂氏４度まで冷却され、かつこの温度で一晩保管された（撹拌なし）。翌朝清澄な表層はデカントされ、４０％乾燥物質のレベルに達するまで蒸発させた。この濃縮液は摂氏１４０度、４秒間のＵＨＴ処置に供され、次に摂氏５０度で限外ろ過された。細菌ろ過後、液体は噴霧乾燥された。以下、この材料は「カゼイン由来生物活性ペプチド」（ＣＤＢＡＰ）と称される。「材料および方法」の節に概説されるＬＣ／ＭＳ手順を使用して、粉末産物中のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含量が測定された。その窒素含量に従えば、粉末産物は約６０％のタンパク質含量（６．３８の換算係数を使用して）を有する。粉末のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含量は表６に提供される。ＣＤＢＡＰ産物のアミノ酸組成は表７に提供される。極めて顕著であるのは、酸沈殿後に得られる噴霧乾燥材料のプロリンモル含量の、当初の１２％からおよそ２４％までという増加である。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
ＣＤＢＡＰ中の新規ＡＣＥ阻害ペプチドの存在が二次元クロマトグラフィー分離法をアットラインＡＣＥ阻害アッセイおよび同定用質量分析と組み合わせて使用することにより調査された。第１の分析においてペプチド混合物はＯＤＳ３液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラム上で分離され、および得られた様々な画分からＡＣＥ阻害プロファイルが生成された。第２の分析において高いＡＣＥ阻害を示す第１のカラムからの画分がバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）ＬＣカラム上で異なる勾配プロファイルを使用してさらに分離された。この第２のカラムから収集された画分が２つの部分に分割された：一方の部分はアットラインＡＣＥ阻害計測に使用され、他方の部分はＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析に供され存在するペプチドが同定された。
【０１１７】
全ての分析はデュアルトレースＵＶ検出器を装備するアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９５ＨＰＬＣ装置（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）を使用して実施された。ペプチドの同定のため、ＨＰＬＣ装置は同じ供給者製のＱ−ＴＯＦ質量分光計に連結された。試験において２０μｌのミリＱ水中の１０％（ｗ／ｖ）ＣＤＢＡＰ溶液が粒径５μｍを備える１５０×２．１イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）５のＯＤＳ３カラム（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、オランダ）上に注入された。移動相ＡはミリＱ水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ溶液からなった。当初の溶離液組成は１００％Ａであった。溶離液は１００％Ａで５分間保たれた。次に直線勾配が５％Ｂまで１０分内に開始された後、１０分内に３０％Ｂまで直線勾配が続いた。カラムはＢの濃度を７０％まで５分内に上昇させることにより洗い流され、７０％Ｂでさらに５分間保たれた。この後、溶離液が１分内に１００％Ａに交換され、９分間平衡化された。総実行時間は５０分間であった。溶離液流速は０．２ｍｌ・分−１であり、カラム温度は６０℃に設定された。ＵＶクロマトグラムが２１５ｎｍで記録された。溶離液画分が１分の時間間隔を使用して９６ウェルプレートに収集された結果、２００μｌの画分量がもたらされた。ウェル中の溶離液が８０μｌの含水水酸化アンモニウム（２５％）の０．０５％溶液の添加により中和された。溶媒は窒素下５０℃で乾燥するまで蒸発させた。この後、残留物は４０μｌのミリＱ水中で再構成され、１分間混合された。
【０１１８】
アットラインＡＣＥ阻害アッセイのため、ｐＨ７．４、塩素濃度２６０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３３．４ｍＵ・ｍｌ−１ＡＣＥ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した酵素）２７μｌが添加され、混合物は７００ＲＰＭの９６ウェルプレート撹拌機上での５分間のインキュベートが可能となった。インキュベーション時間の後、ＰＢＳ緩衝液中の０．３５ｍＭ馬尿酸−ヒスチジン−ロイシン（ＨＨＬ）溶液１３μｌが添加され、１分間、７００ＲＰＭで混合された。混合物はＧＣオーブン中での６０分間、５０℃での反応が可能となった。反応後、プレートは融氷中で冷却された。
【０１１９】
９６ウェルプレートは次に、フラッシュＨＰＬＣカラム上で分析された。各ウェル３０μｌの反応混合物が、同じ供給者製の１０×４．６ｍｍＲＰ１８ｅガードカラムを装備するクロムリス・フラッシュ（Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ）ＲＰ１８ｅの２５×４．６ｍｍＨＰＬＣカラム（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）上に注入された。アイソクラティックな移動相は水／アセトニトリル７９／２１の０．１％ＴＦＡ溶液からなった。溶離液流速は２ｍｌ・分−１であったとともに、カラム温度は２５℃であった。注入は１分の時間間隔で実施された。馬尿酸（Ｈ）およびＨＨＬが２８０ｎｍでモニタされた。ＨおよびＨＨＬのピーク高さが計測され、および各画分のＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）が次式に従い計算された：
【数１】
ＡＣＥＩα 分析物の阻害率
ＤＣｗ 水中でのＨおよびＨＬに対するＨＨＬのＡＣＥによる「切断度」
ＤＣａ 分析物についてのＨおよびＨＬに対するＨＨＬの「切断度」
「切断度」は、ＨおよびＨＨＬのピーク高さの合計の比としてのＨのピーク高さを求めることにより計算された。
【０１２０】
最高ＡＣＥ阻害は１８〜２６分間に溶離した画分中で計測された。この領域が収集され、粒径３μｍの１５０×２．１ｍｍバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）カラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）上に再注入された。移動相ＡはここではミリＱ水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂはメタノール中の０．１％ＦＡ溶液からなった。当初の溶離液組成は１００％Ａであった。溶離液は１００％Ａで５分間保たれた。この後、直線勾配が５％Ｂまで１５分内に開始された後、３０分内に６０％Ｂまで直線勾配が続いた。溶離液が６０％Ｂでさらに５分間保たれた。最終的に溶離液は１分内に１００％の移動相Ａまで低減され、１０分間平衡化された。総実行時間は６５分間であった。溶離液流速は０．２ｍｌ・分−１であり、カラム温度は６０℃に設定された。ＵＶトレースが２１５ｎｍで記録された。画分がバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）カラムから１０秒の時間間隔で収集された。画分は再び２つの部分に分割され、一方の部分は上記に記載されるアットラインＡＣＥ阻害方法を使用して活性を計測するために使用され、他方の部分はＭＳおよびＭＳ−ＭＳを使用して活性ペプチドを同定するために使用された。
【０１２１】
３２６．２０８０Ｄａの分子イオンでの２つのクロマトグラフピークおよび３３０．２０２９Ｄａおよび３１８．１４８８Ｄａの分子イオンでの２つの他のピークが１８〜２６分間の領域内で計測されたＡＣＥ阻害増加に相当した。ＭＳ−ＭＳを使用してこれらのペプチドが構造異性体ＩＰＰおよびＬＰＰ（−０．６ｐｐｍ）、ＩＴＰ（−４．８ｐｐｍ）およびＭＡＰ（＋２．８ｐｐｍ）としてそれぞれ同定された。ペプチドのタンパク質源はκ−カゼインｆ１０８−１１０（ＩＰＰ）、β−カゼインｆ１５１−１５３（ＬＰＰ）、α−ｓ２−カゼインｆ１１９−１２１（ＩＴＰ）およびβ−カゼインｆ１０２−１０４（ＭＡＰ）である。ＩＰＰおよびＬＰＰはＩＣ５０値がそれぞれ５および９．６μＭであるＡＣＥ阻害ペプチドとして以前に報告された（Ｙ．ナカムラ（Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ）、Ｍ．ヤマモト（Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ）、Ｋ．サカイ（Ｋ．Ｓａｋａｉ）、Ａ．オオクボ（Ａ．Ｏｋｕｂｏ）、Ｓ．ヤマザキ（Ｓ．Ｙａｍａｚａｋｉ）、Ｔ．タカノ（Ｔ．Ｔａｋａｎｏ）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８（１９９５年）７７７−７８３頁；Ｙ．アリョシ（Ｙ．Ａｒｙｏｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（１９９３年）１３９−１４４頁）。しかしながら、トリペプチドＩＴＰおよびＭＡＰは、我々の知る限りでは、これまで強力なＡＣＥ阻害ペプチドとして報告されたことは一度もない。
【０１２２】
ＭＡＰ、ＩＴＰおよびＩＰＰは化学的に合成されたうえ、各ペプチドの活性が以下に記載される修正マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）アッセイを使用して計測された。
【０１２３】
様々な試料中のＭＡＰおよびＩＴＰの定量化がポジティブ・エレクトロスプレーの多重反応モニタリングモードにおいて操作されるマイクロマス・クアトロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ）ＩＩ ＭＳ計器において実施された。使用されるＨＰＬＣ法は上記に記載されるものと同様であった。ＭＳ設定（ＥＳＩ＋）は次のとおりであった：コーン電圧３７Ｖ、キャピラリー電圧４ｋＶ、乾燥ガスは窒素で３００ｌ／ｈ。原料および噴霧器の温度：それぞれ、１００℃および２５０℃。合成ペプチドが、前駆イオン３１８．１および積算生成イオン２２７．２および３４７．２をＭＡＰ用に使用して、前駆イオン３２０．２および積算生成イオン２８２．２および５０１．２をＩＴＰ用に使用して検量線を準備するため使用された。これらの分析に従えば、新規ＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰはＣＤＢＡＰ産物中に２．９ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ１グラムまたは４．８ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラムおよび０．９ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ１グラムまたは（ｅｎ）１．４ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラムに相当する分量で存在する。
【０１２４】
ＭＡＰおよびＩＴＰのＡＣＥ阻害活性を測定するため、化学的に合成されたトリペプチドが、いくらかの細かな修正を伴うマツイ（Ｍａｔｓｕｉ）ら（マツイ，Ｔ（Ｍａｔｓｕｉ，Ｔ）ら（１９９２年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：５１７−５１８頁）の方法に従いアッセイされた。様々なインキュベーションが表８に示される。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
４つの試料の各々は、２００ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．３の２５０ｍＭのホウ酸塩溶液中に溶解される７５μｌの３ｍＭヒプリルヒスチジンロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有した。ＡＣＥはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手された。混合物は３７℃でインキュベートされ、３０分後に１２５μｌの０．５ＭのＨＣｌを添加することにより中断された。続いて、２２５μｌのビシン／ＮａＯＨ溶液（１ＭのＮａＯＨ：０．２５Ｍのビシン（４：６））が添加された後、２５μｌの０．１ＭのＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、スイス；０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４中）が続いた。３７℃、２０分間のインキュベーション後、０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４中の４ｍｌの４ｍＭのＮａ２ＳＯ３が添加され、４１６ｎｍでの光吸収度がＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＣＰＳコントローラを備えるシマヅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＶ−１６０１、オランダ）で計測された。
【０１２７】
ＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）の量が阻害剤の不在下でのＡＣＥの換算率と比較した阻害割合として次式に従い計算された：
ＡＣＥＩ（％）＝（（対照１−対照２）−（試料１−試料２））／（対照１−対照２））＊１００、式中、
対照１＝ＡＣＥ阻害構成成分を伴わない吸光度（＝最大ＡＣＥ活性）［ＡＵ］。
対照２＝ＡＣＥ阻害構成成分を伴わない、かつＡＣＥ（バックグラウンド）を伴わない吸光度［ＡＵ］。
試料１＝ＡＣＥおよびＡＣＥ阻害構成成分の存在下での吸光度［ＡＵ］。
試料２＝ＡＣＥ阻害構成成分の存在下だが、ＡＣＥを伴わない吸光度［ＡＵ］。
【０１２８】
得られたとおりの化学的に合成されたＭＡＰおよびＩＴＰトリペプチドのＩＣ５０が実験のスクリーニング相で使用されるアットライン計測において得られたＩＣ５０値とともに表９に示される。化学的に合成されたＩＰＰの計測値が様々な計測値の内部基準として含められた。
【０１２９】
【表８】
【０１３０】
実施例８
新規ＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰはヒト胃腸管内で生残する可能性がある
摂取後、食事性タンパク質およびペプチドは胃腸管内の様々な消化酵素処理にさらされる。新規に同定された生物活性ペプチドのヒト胃腸管内における安定性を評価するため、ＣＤＢＡＰ調製物（実施例７に記載されるとおり調製される）がヒト体内で典型的に所見される消化状態をシミュレートする胃腸処置（ＧＩＴ）に供された。ＧＩＴモデル系における様々なインキュベーション時間後に得られた試料がオンラインＨＰＬＣ−バイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙ）−ＭＳまたはＨＲＳ−ＭＳ装置を使用して分析され、任意の残留ＭＡＰおよびＩＴＰペプチドが定量化された。ＧＩＴ手順は、１００ｍｌフラスコ（米国バンケル（Ｖａｎｋｅｌ）により供給されるとおり）を組み込む規格混合機において実施された。水浴の温度は３７．５℃に設定され、撹拌速度は試料が懸濁液中に保たれるように選定された（１００ｒｐｍ）。
【０１３１】
約３．４グラムのＣＤＢＡＰ（タンパク質レベルはおよそ６０％）が１００ｍｌのミリＱ水中に溶解／懸濁された。胃のシミュレーション中、５ＭのＨＣｌが使用されｐＨを低下させた。胃のシミュレーションの最後および十二指腸の相中、５ＭのＮａＯＨが使用されｐＨを上昇させた。
【０１３２】
ＣＤＢＡＰ懸濁液が３７．５℃まで予熱されたうえ、５ｍｌの懸濁液が取り出され０．３１ｇのペプシン（フルカ（Ｆｌｕｋａ）注文番号７７１６１）を溶解させた。ｔ＝０分で既に溶解済みのペプシンを伴う５ｍｌが懸濁液に入れ戻された。次にＣＤＢＡＰ懸濁液のｐＨが次の計画案に従い別個のｐＨ計を使用して手動で徐々に調整された：
ｔ＝２０分 ｐＨを３．５に低下させる
ｔ＝４０分 ｐＨを３．０に
ｔ＝５０分 ｐＨを２．３に
ｔ＝６０分 ｐＨを１．８に
ｔ＝６５分 ｐＨを２．７に上昇させる
ｔ＝７５分 ｐＨを３．７に
ｔ＝８０分 ｐＨを５．３に
ｔ＝９０分、０．１３９ｇの８倍ＵＳＰパンクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）注文番号Ｐ７５４５）が別の５ｍｌのＣＤＢＡＰ懸濁液中に慎重に混合されたうえ、直ちに入れ戻された。インキュベーションが次の計画案に従い続行された：
ｔ＝９３分 ｐＨを５．５に
ｔ＝９５分 ｐＨを６．３に
ｔ＝１００分 ｐＨを７．１に
【０１３３】
実験はｔ＝１２５分で中断され、ｐＨが確認された（まだｐＨ７であった）。
【０１３４】
次に試料がビーカーに移され、煮沸するまでマイクロ波オーブン中に置かれた。続いて、試料はガラス管に移されたうえ、９５℃で６０分間インキュベートされ全てのプロテアーゼ活性が不活化された。冷却後、試料はファルコン管に入れられ、１０分間３０００×ｇで遠心分離された。上清が凍結乾燥された。得られたとおりの粉末のＮ総濃度が測定され、カゼインのケルダール係数（６．３８）を使用してタンパク質レベルに換算された。これらのデータに従えば、ＧＩＴ手順後のＣＤＢＡＰ調製物のタンパク質レベルは４８．４％であった。ＧＩＴ手順に従うタンパク質分解処置を生残するＭＡＰおよびＩＴＰのレベルが実施例７に記載されるとおり測定され、得られたデータは表１０に示される。
【０１３５】
実験の結果に従えば、ＭＡＰおよびＩＴＰの双方がＧＩＴ消化に対し高い抵抗性を呈する。これらのトリペプチドにおける低いＩＣ５０値（同様に実施例７において測定されるとおり）と組み合わせれば、データからは２個の新規ＡＣＥ阻害ペプチドの血圧降下ペプチドとしての相当な可能性が示唆される。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
実施例９
合成ＭＡＰおよびＩＴＰのインビトロ模擬胃腸消化
胃腸管（ＧＩ）内でのペプチドの安定性を計測するため、ミクロ溶解が使用された。この以下の試験が使用されＭＡＰおよびＩＴＰのＧＩ安定性が試験された。
【０１３８】
成分：
溶解のため次の溶液が使用された：
０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ
１ｍｏｌ／ｌのＮａＨＣＯ３
人工胃液；
５００ｍｌの水中１．０ｇの塩化ナトリウムおよび３．５ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ
（超音波浴中で１０分間、脱気される）
胃条件における酵素（総量１ｍｌ中に必要とされる量）：
５０μｌの人工胃液中に２．９ｍｇのペプシンおよび０．４５ｍｇのアマノリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｌｉｐａｓｅ）−ＦＡＰ１５
腸条件における酵素（総量１ｍｌ中に必要とされる量）：
５０μｌの１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＨＣＯ３中に９ｍｇのパンクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ８０９６）および０．１２５ｍｇの胆汁抽出物
【０１３９】
手順：
胃条件：
−各バイアルに次が充填された：
−０．８２ｍｌの模擬胃液＋７０μｌのミリＱ＋１０μｇの（１０倍希釈）混合物１、
−Ｔ＝３７．５℃（ｔ＝０）の時に試料を採取し、５０μｌのペプシン／リパーゼ混合物を添加（振盪）する。
−ｐＨが計測されるとともに３．５まで０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌで調整される。
−６０分間のインキュベーション、６０分後試料が採取される。
腸条件：
−５０μｌのパンクレアチン混合物が添加され、かつｐＨが計測されるとともに６．８までＨＣｌで調整される。
−試料はパンクレアチンの添加（振盪）後５分、３０分および６０分で採取される。
−全ての試料は９５℃で６０分間保たれ、酵素の活性が中断される。
−冷却後、試料は分析まで−２０℃で貯蔵される。
−試料は遠心分離されるとともにＨＰＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳで分析される。
【０１４０】
表１１および１２について、計測されたペプチド濃度がｎｇ／ｍｌで与えられ、ＭＡＰの相対濃度として計算される。
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
【表１１】
【０１４３】
【表１２】
【０１４４】
【表１３】
【０１４５】
上記の結果は、トリペプチドＭＡＰが胃腸条件下で、特に胃条件下１時間後に、良好な安定性を適度に呈することを実証する。ＭＡＰは腸の終端に達する前にさらなる分解を受けるにもかかわらず、ほとんどのペプチドは胃のすぐ後、すなわち十二指腸および空腸の近位で吸収される。しかしながら、ＭＡＰはカゼイン加水分解物内の他のペプチドの存在下でこの分解に対し保護されると考えられる。
【０１４６】
結果はまた、ＩＴＰの胃腸条件下での優れた安定性も実証する。この優れた安定性はＩＴＰのＡＣＥ阻害剤としてのいくらか低い効力を補い得る。
【０１４７】
これらの結果はトリペプチドＭＡＰが胃腸条件下で、特に胃条件下１時間後に、良好な安定性を適度に呈することを実証する。しかしながら、これは腸の終端に達する前に実にさらなる分解を受ける。しかしながら、ＭＡＰはカゼイン加水分解物内の他のペプチドの存在下でこの分解に対し保護されると考えられる。これは実施例８および９に示されるＭＡＰについての安定性における明らかな差異を説明する。
【０１４８】
実施例１０
ＭＡＰ含有発酵乳の調製
実施例７に記載されるとおり高度に強力なＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰが実施例７に記載される酵素的手順に従い調製されるカゼイン加水分解物中に同定された。しかしながら、我々はＭＡＰトリペプチドが一般的な手法である脱脂乳の発酵を使用しても得られ得るのではないかとの疑問を抱いた。これを試験するため、ＡＰＩ５０ＣＨＬ条片（ビオメリュー社（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ）、６９２８０ Ｍａｒｃｙ−ｌ‘Ｅｔｏｉｌｅ、フランスから入手可能）により特徴づけられるラクトバチルス株の使用がなされた。使用された株はＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロースおよびトレハロースを発酵することができた。ＡＰＩＬＡＢプラス（Ｐｌｕｓ）データバンク（バージョン５．０；同様にビオメリュー（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）から入手可能）に従い、株はラクトバチルス・デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ラクティス（Ｌａｃｔｉｓ）０５−１４として特徴づけられた。株はＣｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ、Ｂａａｒｎ、オランダに寄託された（ＣＢＳ１０９２７０）。
【０１４９】
実際の発酵実験用の前培養物を調製するため、無菌脱脂乳（ヨッパー・エクス・カンピナ（Ｙｏｐｐｅｒ ｅｘ Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）がラクトバチルス・デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ）株の培養物の２〜４％を接種され、２４時間摂氏３７度で成長させた。
【０１５０】
実際の発酵実験において、４．２％ＭＰＣ−８０の還元乳（カンピナ（Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）、０．５％ラクトースおよび０．３％ラクプロダン（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ）８０（カンピナ（Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）が２分間８０度で低温殺菌された。冷却後、乳は２ｗｔ％の前培養物を接種され、発酵が静止条件下で１５０ｍｌのジャー中で実施され、および４０℃でｐＨコントロールを伴わず実施された。
【０１５１】
２４時間後、試料が採取され、１０分間１４．０００ｇで遠心分離された。得られた試料のｐＨは５．３、およびＭＡＰ濃度は１８．３ｍｇ／Ｌであった。しかしながら、ＩＴＰは発酵乳中に検出できなかった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規栄養補助組成物に関する。
【０００２】
本発明はトリペプチドのメチオニン−アラニン−プロリン（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、以下「ＭＡＰ」）および／またはイソロイシン−スレオニン−プロリン（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、以下「ＩＴＰ」）を含んでなる組成物に関する。より具体的には、本発明は健康の改善または疾患の予防および／または処置のために使用されるＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物に関する。組成物は高い血圧（以下「高血圧症」）および心不全、または狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、および腎症などの関連病態の処置または予防に特に有用である。別の態様において、本発明は高血圧症および心不全の処置または予防における併用摂取用栄養補助組成物の製造におけるＭＡＰおよび／またはＩＴＰの使用に関する。なお別の態様において、本発明は高血圧症および心不全、または狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、および腎症などの関連の処置または予防の方法に関し、ここでＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる有効量の組成物がかかる処置を必要とする人に投与される。
【０００３】
高血圧症は世界の早世の予防可能な最重要原因の１つであることが知られている。さらには、正常範囲上限の血圧でさえ早世のリスクを増加させると見られている。高血圧症は冠動脈心疾患の主要な危険因子および脳卒中の最重要危険因子である。全心血管疾患のおよそ半数は高血圧症が一因であり、これは２００２年の全世界における死亡数１６７０万人に相当した。心血管疾患のリスクは拡張期血圧の１０ポイント増加につき、または収縮期血圧の２０ポイント増加につき、２倍になる。ほとんどの国で、成人の３分の１までが高血圧症に罹患している。高血圧症の有病率は年齢に伴い増加するとともにこの傾向は発展途上国において特に突出している。そのうえ、高血圧対象者の４０％が診断を下されていないままであると推定される。
【０００４】
現在、高血圧対象者に利用可能な治癒的療法はないとともに処置の主目標は血圧をより安全なレベルまで降下させることである。より多くの運動、塩分摂取の低減、および有効なストレス管理などの食事および生活習慣の改変もまた高血圧症の予防手段を代表し得る。これが次には、一般に乾性咳嗽から日常生活の活動エネルギーの喪失に及ぶ副作用を伴う投薬治療における必要量を減少させ得る。このように、安全であるとともに現在高血圧症の処置に使用されている薬物の副作用を伴わない食事補助剤による高血圧症の予防および処置に対する多大な需要がある。
【０００５】
現在、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、およびβ遮断薬が高血圧症の処置に広く使用されている。ＡＣＥ阻害剤は、血圧を上昇させることで知られるペプチドホルモンである、アンジオテンシンＩＩのレベルを低減する。アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬はアンジオテンシンＩＩのその受容体への結合を遮断するとともに、それにより血圧降下作用を及ぼす。カルシウムチャネル遮断薬はカルシウムの血管壁細胞への流入を低減するとともに、ひいては血管の収縮を減少させ、次には血圧を降下させる。利尿薬はナトリウムおよび水分の尿中排泄増加につながり、これが血圧の低減につながる。β遮断薬はノルエピネフリンおよびエピネフリンの効用をβアドレナリン受容体上で遮断し、それにより血管の収縮を低減するとともに血圧を降下させる。
【０００６】
本発明は、栄養補助物、好ましくは医薬品としての、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはそれらのＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩に関する。本発明はまた、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品としての使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、健康の改善または疾患の予防および／または処置のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、高血圧症および心不全などの心血管疾患の処置用の栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、前糖尿病または糖尿病の処置のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、肥満の処置または予防のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、血漿インスリンを増加させるための、または血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の血漿インスリンを増加させるための、または血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中グルコース濃度を降下させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中インスリン分泌を増加させるための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰが食事補助剤の形態であるＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の局所適用における、好ましくはパーソナルケア適用における使用、およびＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、飼料およびペットフードにおける使用にも関する。ＭＡＰが好ましいトリペプチドであるとともに本発明の使用において好ましい。
【０００７】
さらに本発明は、１型および２型糖尿病の処置の、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者における２型糖尿病の予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法、および高血圧症または心不全に罹患している人々の処置またはそれらの予防の方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法に関する。
【０００８】
本発明のさらなる態様に従い、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の化学合成の方法が開示される。そのうえ本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる医薬品、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食事補助剤、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食品、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を医薬品として、または健康上の利益のため含んでなる組成物、健康上の利益がストレスの作用の処置である組成物であって、好ましくは該組成物が食品または飼料である組成物、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を局所剤としての使用のため、好ましくはパーソナルケアにおける使用のため含んでなる組成物、およびローション、ゲルまたはエマルジョンである組成物に関する。
【０００９】
本発明に従えば、驚くことに、ＭＡＰおよびＩＴＰの双方がアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するとともに、ひいては血圧降下作用を呈することが所見されている。ＡＣＥの阻害は結果として、血管収縮の低減、血管拡張の亢進、ナトリウムおよび水分排泄の改善をもたらし、これが次には末梢血管抵抗性および血圧の低減および局部血流の改善につながる。このように、本組成物はＡＣＥ阻害により影響され得る疾患の予防および処置に特に効果的であり、これらとしては、限定はされないが、高血圧症、心不全、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患、アテローム性動脈硬化症、腎症、腎不全、勃起機能不全、内皮機能不全、左室肥大、糖尿病性血管障害、体液貯留、および高アルドステロン症が挙げられる。本組成物はまた、胃腸障害（下痢、過敏性腸症候群）、炎症、真性糖尿病、肥満、認知症、癲癇、老人性錯乱、およびメニエール病の予防および処置においても有用であり得る。さらには、本組成物は、認知機能および記憶（アルツハイマー病を含む）、満腹感を亢進し、虚血性傷害を制限し、およびバイパス手術または血管形成術後の動脈の再閉塞を予防し得る。
【００１０】
真性糖尿病は現在に至るまで治療法を有しない広範な慢性疾患である。真性糖尿病の発症率および有病率は指数関数的に増加しているとともに、先進国および発展途上国において最も多く見られる代謝障害である。真性糖尿病は複数の原因因子に由来する複合疾患であるとともにインスリン分泌欠乏および／またはインスリン抵抗性に関連する炭水化物、タンパク質および脂質代謝障害により特徴づけられる。これは結果として空腹時および食後血清グルコース濃度の上昇をもたらし、無処置のまま放置すれば合併症につながる。疾患には２つの主要な分類、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｔ１ＤＭ）およびインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、Ｔ２ＤＭ）がある。Ｔ１ＤＭ＝１型真性糖尿病。Ｔ２ＤＭ＝２型真性糖尿病。
【００１１】
Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ糖尿病は、高血糖症、高コレステロール血症および高脂血症に関連する。Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭにおける、それぞれの絶対的インスリン欠乏およびインスリン非感受性は、肝、筋および脂肪組織によるグルコース利用性の低下および血糖値の上昇につながる。コントロール不良の高血糖症は、腎症、神経障害、網膜症、高血圧症、脳卒中、および心疾患を含む、微小血管および大血管疾患のリスク増加による死亡率増加および若年死亡率に関連する。最近、厳格な血糖コントロールがＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方におけるこれらの合併症の予防における主要因子であるという証拠が示された。それゆえ、薬物または治療レジメンによる最適な血糖コントロールが糖尿病の処置においては重要な手法である。
【００１２】
Ｔ２ＤＭの治療は初期に食事および生活習慣の変更を含み、それらの対策で適切な血糖コントロールを維持できない時、患者は経口血糖降下薬および／または外因性インスリンで処置される。現行のＴ２ＤＭの処置用薬理学的経口薬剤としては、インスリン分泌を増強するもの（スルホニル尿素剤）、肝中のインスリンの効用を改善するもの（ビグアナイド系薬剤）、インスリン増感剤（チアゾリジンジオン）およびグルコースの取り込みを阻害するべく効用する薬剤（α−グルコシダーゼ阻害剤）が挙げられる。しかしながら、現在利用可能な薬剤は概して、膵細胞機能の進行性喪失の結果として生じる高血糖の進行性悪化のため、適切な血糖コントロールを長期間維持できない。目標血糖値を維持できる患者の割合は時間が経つにつれ著しく減少し、追加的／代替的な薬理学的薬剤の投与が必要となる。さらには、薬物は望ましくない副作用を有し得るとともに高い原発性および続発性不全率に関連する。最終的には、血糖降下薬の使用は血糖値を調節するのに有効であり得るが、糖尿病の全ての合併症を予防するとは限らないといえる。このように、全ての型の真性糖尿病向け処置の現行の方法は正常血糖の理想値および糖尿病合併症の予防を実現できない。
【００１３】
それゆえ、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの処置において選択され得る治療は基本的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、糖尿病の処置および予防のための副作用が最小の安全かつ有効な栄養補助剤の必要性はある。多くの患者が高用量の薬物に関連する副作用を最小化するとともに付加的な臨床的利益を産み出すことができるであろう代替療法に関心を有している。真性糖尿病患者は、補助処置として使用され得る、穏和な抗糖尿病作用を伴うとともに主要な副作用を伴わない「自然」と考えられる処置に特に関心を有している。Ｔ２ＤＭは進行性かつ慢性的な疾患であり、インスリン産生を担う膵細胞（ランゲルハンス島のβ細胞）に重大な傷害が起こるまで通常認識されない。それゆえ、Ｔ２ＤＭを発症するリスクがある人々、特にそのリスクが高い高齢者において、β細胞傷害、ひいては顕性Ｔ２ＤＭへの進行を予防するべく使用され得る食事補助剤の開発に関心が高まっている。膵β細胞の保護は、グルコースおよび脂質がβ細胞に対し傷害作用を及ぼすとき血糖値および／または脂質値の低下により実現され得る。血糖値の低減は種々の機序を介して、例えばインスリン感受性を亢進することにより、および／または肝グルコース産生を低減することにより実現され得る。血中脂質値の低減もまた、種々の機序を介して、例えば脂質酸化および／または脂質貯蔵を亢進することにより実現され得る。膵β細胞を保護する別の考え得る方策は酸化的ストレスを低下させることであろう。酸化的ストレスもまた、続発するインスリン分泌の損失および顕性Ｔ２ＤＭへの進行を伴うβ細胞傷害を引き起こす。
【００１４】
それゆえ、Ｔ２ＤＭは複数の臓器部位に同時に存在する欠陥、すなわち筋および脂肪組織でのインスリンの効用に対する抵抗性、欠陥のある膵インスリン分泌、無制限の肝グルコース産生の結果として生じる複雑な疾患である。これらの欠陥は脂質異常および内皮機能不全に関連することが多い。Ｔ２ＤＭにおける複数の病態生理学的病変を所与とすれば、併用療法はその管理への魅力的な手法である。
【００１５】
本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる新規栄養補助組成物に関する。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる栄養補助組成物はまた、真性糖尿病、またはシンドロームＸなどの耐糖能障害に関連する他の病態の処置または予防のための活性成分として加水分解物、非加水分解タンパク質および炭水化物も含んでなることができる。別の態様において本発明はかかる組成物の前記処置または予防向け栄養補助剤としての、例えば、正常代謝機能の維持に必須であるが体内では合成されないビタミンおよびミネラルを含んでなるマルチビタミン調製剤への添加剤としての使用に関する。なお別の態様において、本発明は１型および２型の双方の真性糖尿病の処置および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者もしくは肥満者におけるＴ２ＤＭの予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物を投与するステップを含んでなる方法に関する。
【００１６】
本発明の組成物はＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方の処置、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者におけるＴ２ＤＭの予防が特に意図される。
【００１７】
本発明はＭＡＰおよび／またはＩＴＰ、および場合によりタンパク質加水分解物を含んでなる組成物に関する。さらに本組成物はアミノ酸を含んでなり、好ましくは該アミノ酸はロイシンである。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ、および場合によりタンパク質加水分解物は血中の血漿インスリンを増加させるべく、好ましくは２型糖尿病または前糖尿病のため、有利に使用される。
【００１８】
驚くべきことに、本ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは２型糖尿病または前糖尿病向けに、好ましくは食後グルコース濃度を降下させるため、または食後の血中インスリン分泌を増加させるため使用され得ることが所見される。
【００１９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰとタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物との組み合わせを含んでなる組成物は相乗的にインスリン分泌を刺激するとともに脂肪組織、骨格筋および肝臓などのインスリン感受性標的組織へのグルコース排出を増加させ、ひいては、真性糖尿病の処置における相乗作用を提供する。
【００２０】
ストレス関連疾患、およびストレスの身体に対する負の作用が、多くの人々に重大な影響を有することが一般的に認知されている。近年ではストレスの作用、および様々な疾患および病態の発症へのその様々な関与は、医学界および科学界においてより広範な認知を得ている。消費者はいまやこれらの潜在的問題をますます意識するようになっているとともに自身の健康に対するストレスの考え得る負の影響の低減または予防にますます関心を有するようになっている。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、身体がストレスの作用に対処するのを補助する際の使用に好適である、食製品、またはそれに混入され得る成分を提供することである。
【００２２】
さらなる目的は、身体がストレスの負の作用に対処するのを補助するなどの、健康上の利益を提供する高濃度の成分を有する食製品を提供することである。
【００２３】
ある態様に従えば本発明はトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰおよび／またはそれらの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用を提供する。
【００２４】
特定のペプチドは抗ストレス作用を呈することが知られている。それゆえトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰおよび／またはそれらの塩はかかる健康上の利益の提供における使用に非常に好適であると考えられる。当業者は材料のかかる特性をいかに測定するかは十分に承知している。
【００２５】
用語の栄養補助物は本明細書中で使用されるとき栄養および医薬の双方の応用分野における有用性を意味する。このように、新規栄養補助組成物は食品および飲料に対する補助剤としての、およびカプセルまたは錠剤などの固形製剤、または溶液または懸濁液などの液体製剤であり得る経腸または非経口適用向け医薬製剤または医薬品としての使用を見出すことができる。前述から明らかであろうとおり、用語の栄養補助組成物はまたＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび場合によりタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物を含有する食品および飲料ならびに補助組成物、例えば前記活性成分を含有する食事補助剤も含んでなる。
【００２６】
用語の食事補助剤は本明細書中で使用されるとき日常食を補助することが意図される「食事成分」を含有する口から摂取される製品を意味する。これらの製品中の「食事成分」としては、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、および酵素、臓器組織、腺、および代謝産物などの物質が挙げられ得る。食事補助剤はまた、抽出物または濃縮物でもあり得るとともに、錠剤、カプセル、ソフトゲル、ジェルキャップ、液体、または粉末などの多々の形態にあってもよい。これらはまた、バーなどの、他の形態でもあり得るが、もしそうであるならば、該食事補助剤のラベル情報は一般に、製品を従来の食品または食事もしくは日常食の単一品目としては表示しないであろう。
【００２７】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは断片ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する任意の好適な基質の加水分解または発酵により製造されてもよい。有利にはタンパク質基質は断片ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの双方を含有する。好ましくはタンパク質基質はカゼインまたは乳である。トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）はまた、従来技術を使用する化学合成によっても製造され得る。
【００２８】
本発明によれば驚くことにＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物は膵インスリン分泌を刺激するとともにインスリン感受性標的組織へのグルコース排出を亢進することが所見されている。それゆえ、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物はＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの双方を予防または処置するために、および前糖尿病者、耐糖能障害（ＩＧＴ）者におけるＴ２ＤＭの予防のために使用され得る。
【００２９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰとタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物との組み合わせの使用は、それらが個別に種々の効用機序を及ぼし、糖尿病患者において目標血糖値を実現および維持するのに有効である。
【００３０】
上記に同定される活性成分の組み合わせは、それらの種々の効用により、相乗作用および多臓器作用の利点を活用すると思われる。個々の活性成分の異なる効用機序のため本組み合わせは血糖コントロールを改善するばかりでなく、結果としてある設定でより低用量の薬物投与をもたらすとともに有害作用を最小限にする。それらの効用の異なる機序および部位のため、上記で考察される食事補助剤の特異的組み合わせもまた相乗作用の利点を活用し、単剤で達成できるより大きなグルコース降下度を実現する。このように、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの治療処置は基本的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、然るべき栄養療法もまた糖尿病の処置の成功に主として重要である。
【００３１】
マルチビタミンおよびミネラル補助剤が本発明の栄養補助組成物に添加され、一部の日常食において不足する必須栄養素の適切量を調達してもよい。マルチビタミンおよびミネラル補助剤はまた、疾患予防および糖尿病において時に観察される生活習慣パターンおよび一般の不適切な食事パターンによる栄養損失および欠乏からの保護にも有用であり得る。そのうえ、酸化ストレスはインスリン抵抗性の発症に関係するとされている。活性酸素種はインスリン受容体シグナル伝達カスケードを妨害することによりインスリン刺激性グルコース取り込みを障害し得る。α−トコフェロール（ビタミンＥ）アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの抗酸化剤による酸化ストレスのコントロールは糖尿病の処置において価値があり得る。それゆえ、マルチビタミン補助剤の摂取が上述の活性物質に追加され、バランスの良い栄養を維持してもよい。
【００３２】
さらに、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）および／またはカリウム（Ｋ＋）などのミネラルとの組み合わせが、健康の改善および限定はされないながら心血管疾患および糖尿病を含む疾患の予防および／または処置に使用されてもよい。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、本発明の栄養補助組成物はＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物を含有する。ＭＡＰおよび／またはＩＴＰは好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｇから体重１ｋｇ当たり約１ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．０５ｇから１食当たり約５０ｇのＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤はＭＡＰおよび／またはＩＴＰを１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．００１ｇから約１ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．０３５ｇから１日量当たり約７０ｇまでの量で含有してもよい。タンパク質加水分解物は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約３ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．１ｇから１食当たり約１００ｇのタンパク質加水分解物を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤はタンパク質加水分解物を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０１ｇから約５ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約２１０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３４】
本発明の別の好ましい態様において組成物は上記に定めるとおりのＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質を含有する。非加水分解タンパク質は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約３ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．１ｇから１食当たり約１００ｇの非加水分解タンパク質を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤は非加水分解タンパク質を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０１ｇから約５ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約２１０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３５】
本発明のさらに別の好ましい態様において組成物は上記に定めるとおりのＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質、および炭水化物を含有する。炭水化物は好適には、本発明に従う組成物中に、それが投与される対象者の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｇから体重１ｋｇ当たり約７ｇまでの１日服用量を提供する量で存在する。食品または飲料は好適には、１食当たり約０．５ｇから１食当たり約２００ｇの炭水化物を含有する。栄養補助組成物が医薬製剤である場合、かかる製剤は炭水化物を１回服用当たり、例えば１カプセルまたは１錠剤当たり、約０．０５ｇから約１０ｇまで、または液体製剤１日量当たり約０．７ｇから１日量当たり約４９０ｇまでの量で含有してもよい。
【００３６】
本発明の好ましい栄養補助組成物はＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物、特に
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物および炭水化物、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質、
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよび非加水分解タンパク質および炭水化物、
の組み合わせを含んでなり、
最も好ましくはＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物の組み合わせである。
【００３７】
用量範囲（７０ｋｇの人１人用）
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ：０．００５〜７０ｇ／日
タンパク質加水分解物：０．０７〜２１０ｇ／日
非加水分解タンパク質：０．０７〜２１０ｇ／日
炭水化物：０．１〜４９０ｇ／日
【００３８】
トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）は、化学合成、酵素加水分解およびタンパク質含有溶液の発酵を含む様々な方法により製造され得る。
【００３９】
タンパク質加水分解物または発酵の結果生じる液体などの複合混合物中の生物学的に活性なペプチドの同定は難題である。適正なタンパク質基質を使用しているか、適正な酵素を使用しているか、適正な微生物培養物を使用しているかといった基本的な懸案は別として、数個の生物学的に活性なペプチドが数千ペプチドを含有する複合試料中に存在すると推定され得る。高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分画の反復サイクルおよび生化学的評価を用いる伝統的な同定手法は一般的に時間がかかるとともに存在する生物学的に活性なペプチドの損失が起こりやすく、関連する生物活性の検出を極めて困難にする。本研究においては非常に洗練された機器が使用され、多くの異なるタンパク質加水分解物および発酵ブロスがスクリーニングされたことで、最終的に我々はＡＣＥ阻害特性を有する２個の新規ペプチドであるＭＡＰおよびＩＴＰの同定に至った。我々の手法においては連続フロー生化学アッセイがオンラインでＨＰＬＣ分画装置と連結された。ＨＰＬＣカラム溶出液が連続フローＡＣＥバイオアッセイと化学分析技法（質量分析法）とに分割された。粗加水分解物および発酵ブロスがＨＰＣＬにより分離された後、生物学的に活性な化合物の存在がオンライン生化学アッセイによって検出された。生化学アッセイにおいてペプチドが陽性シグナルを示す時の構造情報が直ちに入手できるよう質量スペクトルが継続的に記録された。
【００４０】
上述される手法により同定されるとおりのトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは経済的に実行可能な産生経路を含む様々な方法により産生され得る。化学合成を介する産生が、例えばＮ．セウォルド（Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．Ｄ．ジャクブケ（Ｈ．Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ）編による「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ、２００２年、第４章に記載されるとおりの従来技術を使用して可能である。大規模産生に好適な化学的ペプチド合成の特に費用対効果の高い方法は、Ｃ末端保護のためのメチルエステルおよびＮ保護のためのベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用と組み合わせたカルボン酸基の活性化のためのクロロギ酸アルキルまたは塩化ピバロイルの使用に基づく。例えば、ＭＡＰの場合に、Ｌ−プロリンメチルエステルはクロロギ酸イソブチル活性化Ｚ−Ａｌａと共役され得る；結果として生じるジペプチドは水素およびＣ上のＰｄを使用する水素化分解を通じてＺが脱保護され得るとともにクロロギ酸イソブチル活性化Ｚ−Ｍｅｔとさらに共役され得る；結果として生じるトリペプチドのメチルエステルはＮａＯＨを使用して加水分解されるとともに、水素化分解によるＺ脱保護の後、トリペプチドＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏが得られる。同様に、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏが合成され得るが、カップリング反応の間、Ｔｈｒのヒドロキシ官能基はベンジル保護を必要とする；最後のステップにおいてこの基は次に、Ｚ脱保護の間に同時に除去される。
【００４１】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰはまた、酵素加水分解または発酵手法によりアミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する任意のタンパク質基質を使用して製造され得る。有利には、タンパク質基質は双方の断片ＭＡＰおよびＩＴＰを含有する。かかる酵素または発酵手法に好ましいタンパク質基質はウシ乳またはウシ乳のカゼイン画分である。発酵または加水分解条件の最適化を通じ、生物学的に活性な分子ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの産生が最大化されてもよい。産生を最大化しようとする当業者は、加水分解／発酵時間、加水分解／発酵温度、酵素／微生物のタイプおよび濃度等といった、処理パラメータをいかに調節するかは周知であろう。
【００４２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる組成物は有利には加水分解物であるとともに好ましくは次のステップ
（ａ）そのアミノ酸配列中にＭＡＰまたはＩＴＰを含んでなり、結果としてトリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含んでなる加水分解タンパク質産物をもたらす、好適なタンパク質基質の酵素加水分解、
（ｂ）加水分解タンパク質産物からのトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰリッチな画分の分離、および場合により
（ｃ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰリッチな濃縮液または固形物を得るための、ステップｂ）からの画分の濃縮および／または乾燥、を含む方法により製造される。
【００４３】
酵素加水分解ステップ（ａ）はタンパク質の加水分解に至る結果としてＭＡＰおよび／またはＩＴＰトリペプチドの遊離をもたらす好適なタンパク質基質の任意の酵素的処置であってもよい。酵素の数種の組み合わせがタンパク質基質から所望のトリペプチドを遊離するために使用され得るが、本方法において使用される好ましい酵素はプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリン特異的オリゴペプチダーゼである。好適なタンパク質基質はアミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを包含する任意の基質であってもよい。ＭＡＰを包含することで知られるタンパク質基質は、例えば、カゼイン、コムギグルテン、ヒマワリタンパク質分離物、米タンパク質、卵タンパク質である。好適なタンパク質基質は好ましくは、ウシβ−カゼイン、コムギグルテンのα−グリアジン画分中およびヒマワリタンパク質分離物の２Ｓ画分中に存在するとおりのアミノ酸配列ＡＭＡＰまたはＰＭＡＰを包含する。
【００４４】
カゼイン基質は相当量のβ−カゼインおよびα−ｓ２−カゼインを含有する任意の材料であってもよい。好適な基質の例は乳ならびにカゼイン、カゼイン粉末、カゼイン粉末濃縮物、カゼイン粉末分離物またはβ−カゼイン、またはα−ｓ２−カゼインである。好ましくは、カゼインタンパク質分離物（ＣＰＩ）などの、高含量のカゼインを有する基質である。
【００４５】
酵素は、結果として１個または複数のトリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰの遊離をもたらす、β−カゼインおよび／またはα−ｓ２−カゼインなどのタンパク質を加水分解できる任意の酵素または酵素の組み合わせであってもよい。
【００４６】
分離ステップ（ｂ）は当業者に周知の任意の方法で、例えば、沈殿、ろ過、遠心分離、抽出またはクロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせにより実行されてもよい。好ましくは分離ステップ（ｂ）は精密ろ過または限外ろ過の技法を使用して実行される。ろ過ステップにおいて使用される膜の孔径、ならびに膜の電荷がトリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰの分離を制御するべく使用されてもよい。ＵＦ／ＮＦ荷電膜を使用するカゼインタンパク質加水分解物の分画がＹ．ポワロ（Ｙ．Ｐｏｉｌｏｔ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５８（１９９９年）１０５−１１４頁に記載される。
【００４７】
濃縮ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）により生成される画分のナノろ過または蒸発を含み、高濃縮液を産出してもよい。例えば低水分活性（Ａｗ）、低ｐＨおよび好ましくは安息香酸またはソルビン酸などの防腐剤を伴い、好適に調合される場合、かかる濃縮液組成物は本発明に従うトリペプチドの魅力的な貯蔵方法となる。場合により蒸発ステップの後に乾燥ステップ、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥が続き、高濃度のＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含有する固形物を産出する。
【００４８】
酵素処理は好ましくは単一の酵素インキュベーションステップを含んでなる。本発明に従う酵素処理はさらに、好ましくは夾雑酵素活性のないプロリン特異的プロテアーゼの使用に関する。プロリン特異的プロテアーゼはプロリンのカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼとして定義される。好ましいプロリン特異的プロテアーゼはプロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼである。プロリン特異的プロテアーゼは好ましくはポリペプチドまたはタンパク質それ自体のような巨大タンパク質分子の加水分解能を有する。本発明に従う方法は一般に、２４時間未満のインキュベーション時間、好ましくは１０時間未満のインキュベーション時間およびより好ましくは４時間未満のインキュベーション時間を有する。インキュベーション温度は一般に、３０℃より高く、好ましくは４０℃より高く、およびより好ましくは５０℃より高い。
【００４９】
本発明の別の態様はトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの加水分解タンパク質からの精製および／または分離である。本発明に従う加水分解タンパク質の大部分は好ましくは選択されたｐＨ条件下で沈殿能を有する。この精製処理はｐＨを加水分解および非加水分解タンパク質の大部分を沈殿させるｐＨに変性するステップおよび沈殿したタンパク質を溶液中に残留する（生物活性）トリペプチドから分離するステップを含んでなる。
【００５０】
カルボキシ末端側終端にプロリン残基を伴う本トリペプチドを得るためには、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断できるプロテアーゼの使用が好ましい選択肢を提示する。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）はペプチドをプロリン残基のカルボキシ側で選好的に切断する固有の可能性を有する。プロリルオリゴペプチダーゼはまた、ペプチドをアラニン残基のカルボキシ側で切断する可能性も有するが、この反応はプロリン残基を含むペプチド結合の切断より効率が悪い。哺乳動物ならびに微生物源から単離される適切にキャラクタライズされた全てのプロリン特異的プロテアーゼにおいては、酵素の活性部位から高分子ペプチドを排除する固有のペプチダーゼドメインが同定されている。事実、これらの酵素は約３０アミノ酸残基超を含有するペプチドを分解できないため、これらの酵素は今日「プロリルオリゴペプチダーゼ」と称される（フロップ（Ｆｕｌｏｐ）ら：Ｃｅｌｌ、第９４巻、１６１−１７０頁、１９９８年７月２４日）。結果としてこれらのプロリルオリゴペプチダーゼは加水分解の効用を及ぼし得る前に他のエンドプロテアーゼを伴う前加水分解を必要とする。しかしながら、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットに記載されるとおり、プロリルオリゴペプチダーゼのかかる別のエンドプロテアーゼとの組み合わせでさえ結果としてカルボキシ末端プロリン残基を伴うペプチドの割合の有意な亢進により特徴づけられる加水分解物をもたらす。このため、かかる加水分解物はインビトロでのＡＣＥ阻害作用ならびに胃腸管内タンパク質分解に対する改善された抵抗性を伴うトリペプチドの単離のための優れた出発点となる。
【００５１】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は本明細書においてペプチド結合を通じ連結される少なくとも２個のアミノ酸の鎖として定義される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は（一般に認識されるとおり）同義と考えられるとともに各用語は文脈上の必要に応じ可換的に使用され得る。「ポリペプチド」は本明細書において３０個を超えるアミノ酸残基を含有する鎖として定義される。本明細書中の全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、慣行に従い、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向として表記される。本明細書中で使用されるアミノ酸の１文字コードは当該技術分野において一般に周知であるとともにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）に見出され得る。
【００５２】
エンドプロテアーゼは本明細書においてポリペプチド中のペプチド結合をエンド様式で加水分解するとともにＥＣ３．４群に属する酵素として定義される。エンドプロテアーゼは触媒機序に基づきサブ−サブクラスに分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブ−サブクラスがある。エキソプロテアーゼは本明細書において末端α−アミノ基に隣接するペプチド結合を加水分解する酵素（「アミノペプチダーゼ」）、または末端カルボキシル基と末端から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合を加水分解する酵素（「カルボキシペプチダーゼ」）として定義される。
【００５３】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から得られる特異的プロテアーゼを記載する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素はプロリンのカルボキシ末端で選好的に切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端でも、およびより効率は低いが、アラニンのカルボキシ末端でも選好的に切断できる。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはまた、このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素と他の微生物または哺乳動物源由来の既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に明確な相同性が存在しないことも教示する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは対照的に、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は酸性の最適ｐＨ値を有する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼもＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素もいわゆるセリンプロテアーゼであるが、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は全く異なるサブファミリーに属する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）分泌酵素は、大部分の細胞質プロリルオリゴペプチダーゼが群化されているＳ９ファミリーよりむしろ、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであると見られる（ローリング，Ｎ．Ｄ．（Ｒａｗｌｉｎｇ，Ｎ．Ｄ．）およびバレット，Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２９８（１９９６年）１−３頁）。本発明の方法において使用されるとおりのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物は好ましくは本質的に純粋である、つまり純プロリン特異的エンドプロテアーゼに固有の内部タンパク質分解活性以外の有意な内部タンパク質分解活性が存在しない。我々はまた、好ましくは本発明に従い使用される我々のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物が外部タンパク質分解性の、より具体的にはアミノペプチド分解性の副次的な活性を一切含有しないことも実証する。好ましくは外部タンパク質分解活性は本発明の方法において使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物中に不在である。プロリン特異的内部タンパク質分解活性が非組換えアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株中に本質的に不在であるという概念についての実験的証明は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに見出され得る。本発明の方法はカゼイン基質をプロリン特異的エンドプロテアーゼのみを伴いインキュベートすることにより可能であることから、温度、ｐＨ等といった最適なインキュベーション条件は容易に選択され得るとともに、２個以上の酵素が利用される場合に想定されるような準最適条件で固定化される必要はない。さらに不要な副産物、例えば付加的な非生物活性ペプチドまたは肉汁臭い味につながる遊離アミノ酸などの形成を防止する。反応条件を選択する際により高い自由度を有すれば、より容易に他の基準を選択することが可能となる。例えば、微生物感染に対しより感受性が低い条件を今日選択すること、および続くタンパク質沈殿ステップに関するｐＨ条件を最適化することはさらに容易である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）酵素はオリゴペプチダーゼではないが、未処理タンパク質、高分子ペプチドならびにより低分子量のペプチド分子をアクセサリーエンドプロテアーゼの必要なしに加水分解できる真のエンドペプチダーゼである。この新しい、かつ驚くべき発見は、アクセサリーエンドプロテアーゼが必要とされないため、かつてない高含量のカルボキシ末端プロリン残基を備えるペプチドを伴う加水分解物の調製に向けたＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素の使用の可能性を切り開く。かかる新加水分解物は植物由来または動物由来であるにしろ種々のタンパク質性出発材料から調製され得る。かかる出発材料の例は、カゼイン、ゼラチン、魚または卵タンパク質、コムギグルテン、大豆およびエンドウ豆タンパク質ならびに米タンパク質およびヒマワリタンパク質がある。ナトリウムは高血圧症において重要な役割を果たすことが知られているため、ＡＣＥ阻害ペプチドの産生に好ましい基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩よりむしろ、カルシウムおよびカリウムである。
【００５４】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨ値は４．３前後である。この低い最適ｐＨ値のためウシ乳カゼイン塩をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼを伴いインキュベートするステップは自明ではない。ウシ乳カゼイン塩はｐＨが６．０未満に降下すれば沈殿するであろうが、ｐＨ６．０ではＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は限定的な活性のみを有する。このむしろ好ましからざる条件下でさえ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼを伴うインキュベーションはＩＰＰおよびＬＰＰなどの数個の既知のＡＣＥ阻害ペプチドを産出する。非常に驚くべきことにＶＰＰはこれらの条件下では一切産生されない。ウシ乳カゼインはβ−カゼインおよびκ−カゼインを含む多くの異なるタンパク質を混入する。既知のアミノ配列に従えば、β−カゼインはＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。κ−カゼインはＩＰＰのみを包含する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素が計測可能なアミノペプチダーゼ活性を一切含有しないという事実は、形成されるＩＰＰがκ−カゼイン中に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることを強く示唆する。おそらくＩＰＰのペプチド結合カルボキシ末端はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの主活性により切断されるが、一方先行するＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断はそのＡｌａ特異的副次活性により達成される。同様にＶＰＰの不在はアミノペプチダーゼ副次活性の不在に基づき説明され得る。ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−内のβ−カゼイン中に含有される。したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ＶＶＶＰＰ配列を切除するが、ＶＰＰを放出することはできない。
【００５５】
これらの結果は単純な１ステップ酵素処理においてカゼイン塩をＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼとともにインキュベートすると得られる。タンパク質を含有する水溶液は、特に５．０を上回るｐＨ値および摂氏５０度以下の温度で何時間も保たれる場合に、高度に微生物感染しやすい。特にかかる長時間インキュベーションステップの間に産生され得る微生物毒素は、続く加熱ステップにも生残するとともに食品級の処理に対する潜在的な脅威となる恐れがある。本発明は好ましくは摂氏５０度を上回るインキュベーション温度を使用する。酵素インキュベーションの実行時間が２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは４時間未満である１ステップ酵素処理との組み合わせにおいて、本発明に従う方法は改善された微生物的安定性の利点を提供する。高温条件と組み合わせて本酵素基質比を使用すると、ＩＰＰおよびＬＰＰの切除は３時間のインキュベーション時間内に完了される。
【００５６】
ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰはカゼインから単一の、本質的に純粋なエンドプロテアーゼを使用して切除され得るため、本発明は結果として先行技術の方法より少数の水溶性ペプチドをもたらす。これらの水溶性ペプチドのなかでもＩＰＰおよびＬＰＰは多量に存在する。これは、他の多くの、しばしば低活性である化合物を伴わない高濃度のＡＣＥ阻害トリペプチドが必要とされる場合に特に重要である。
【００５７】
本方法に従えば、タンパク質中に存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＩＰＰまたはＬＰＰに変換される。
【００５８】
実施例において我々は新しい、かつ驚くべき精製ステップによる５倍の生物活性ペプチド精製作用を説明する。この精製処理の基本はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの固有の特性からなる。この酵素を伴うインキュベーションは基質分子のほとんどの生物活性部分を水溶性トリペプチドの形態で放出する。基質分子の非または低生物活性部分は大部分が基質分子の非切断かつそれゆえはるかに高分子量のペプチドまたはポリペプチド部分中に残留する。選択されたｐＨ条件下でのこれらの高分子ペプチドまたはポリペプチド部分の限定的な水溶性により、基質分子のこれらの非または低生物活性部分はさらにより高い可溶性の生物活性トリペプチドから容易に分離される。この方法において最初の加水分解物は摂氏５５度、ｐＨ６．０での短い酵素インキュベーション時間の間に形成されるとともに、次に場合により摂氏８０度を上回る温度まで加熱され、全ての汚染微生物を死滅させるとともにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化させる。続いて加水分解物が酸性化され、４．５または少なくとも５．０未満までのｐＨ降下を実現する。このｐＨ値では、酵素にとっての最適条件に相当するためＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化するためには使用され得ないが、カゼイン塩由来の全ての高分子ペプチドは沈殿するため溶液中にはより低分子量のペプチドのみが残留する。沈殿させたカゼイン塩はデカンテーションもしくはろ過ステップまたは低速（すなわち、５０００ｒｐｍ未満）遠心分離により容易に除去され得るため、水相はタンパク質の存在量に比べ高い割合の生物活性ペプチドを含有する。ケルダールデータによればカゼインタンパク質の８０〜７０％が低速遠心分離ステップにより除去され、これは４〜５倍のＡＣＥ阻害ペプチド精製を意味する。我々はこの精製原理がカゼイン以外のタンパク質性材料から得られる生物学的に活性なペプチドを得るためにも同様に有利に適用され得ることを発見している。また、酵素的に産生される加水分解物だけでなく、好適な微生物により発酵されるタンパク質も本方法に従い分離されるとともに精製され得る。基質が沈殿するであろうとともに酵素がなお活性である場合に近いｐＨ値で酵素および基質をインキュベートすることによりこの精製ステップは可能となるであろう。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの低い最適ｐＨ値から、ｐＨ１．５〜６．５の間の範囲での基質沈殿が考えられ得る。その特異的な沈殿挙動の点から見て、グルテン沈殿ｐＨ３．５超、ヒマワリタンパク質沈殿ｐＨ４．０超およびｐＨ６．０未満、卵白沈殿ｐＨ３．５超およびｐＨ５．０未満が、加水分解されたタンパク質が沈殿するとともに沈殿したタンパク質が加水分解されたタンパク質またはペプチドから分離され得る条件の例となる。
【００５９】
デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後、生物学的に活性なペプチドを含有する上清が精製された状態で回収され得る。続く蒸発および噴霧乾燥ステップは高生物活性の食品級ペーストまたは粉末を得るための経済的経路を産み出すであろう。記載されるとおりの方法に従いカゼイン塩を消化すると、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを伴う白色かつ無臭の粉末が得られる。あるいは蒸発またはナノろ過が使用され、生物活性ペプチドをさらに濃縮し得る。水分活性（Ａｗ）をｐＨ調整および安息香酸またはソルビン酸のような食品級防腐剤の添加と組み合わせて増加させることによるかかる濃縮物の適当な製剤は、血圧降下ペプチドの、微生物学的に安定な食品級の濃縮液を産出するであろう。正しいトリペプチド濃度まで然るべく希釈されたならば、ＡＣＥ阻害特性を備えるあらゆる種類の食品および飲料を供与するのに好適な多用途の出発材料が得られる。必要であれば、デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清がさらに処理され、最終産物の食味を改善し得る。例えば、上清は粉末状活性炭と接触させた後、続くろ過ステップで炭を除去し得る。最終産物の苦味を最小化するため、デカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清はまた、サブチリシン、トリプシン、中性プロテアーゼまたはグルタミン酸特異的エンドプロテアーゼなどの別のプロテアーゼを伴うインキュベーションにも供され得る。必要であれば、生物活性成分ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの濃度は、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの特異的親水性／疎水性の特質の使用がなされる続く精製ステップによってさらにより高く上昇させ得る。好ましい精製方法としては、ナノろ過（サイズによる分離）、例えばヘキサンまたはブタノールを伴う抽出に続く蒸発／沈殿または得られるとおりの酸性化された加水分解物の、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤレンジ（ｒａｎｇｅ）（ローム（Ｒｏｅｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂との接触が挙げられる。ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により供給されるとおりのブチル−セファロース樹脂もまた使用され得る。
【００６０】
別の実施例において我々は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを新ペプチド精製方法と組み合わせて使用して調製されるカゼイン加水分解物中の新ＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定について記載する。この単一かつ（本質的に純粋な）エンドプロテアーゼを、非生物活性ペプチドの大部分の除去および高度に洗練された分離および同定機器と組み合わせて使用するだけで、我々はこれらの新ＡＣＥ阻害トリペプチドを探知するとともに同定することが可能となった。実施例に従い（沈殿後に）調製されるカゼイン由来生物活性ペプチド（ＣＤＢＡＰ）において、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは２．９ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ１グラム（４．８ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラム）および０．９ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ１グラム（１．４ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラム）に相当する分量で同定された。ＣＤＢＡＰについてのさらなる特質はモルベースで２４％のその異常に高いプロリン含量である。本実施例７に記載される試験は、修正マツイ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍａｔｓｕｉ）試験における２個の新トリペプチドについて非常に低いＩＣ５０値、すなわちＭＡＰについて０．５マイクロモル／ｌおよびＩＴＰについて１０マイクロモル／ｌを示す。この知見は、既知の最も有効な天然ＡＣＥ阻害ペプチドの１つであるＩＰＰがこの修正マツイ試験において２．０マイクロモル／ｌのＩＣ５０値を有することを我々が理解するならば、さらにより驚くべきものである。
【００６１】
本方法に従えば、タンパク質中に存在する−Ｍ−Ａ−Ｐ−または−Ｉ−Ｔ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％がそれぞれ、トリペプチドＭＡＰまたはＩＴＰに変換される。
【００６２】
新規に同定されたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの有用性が実施例のなかでさらに説明される。当該実施例において我々は双方のペプチドが、胃腸管中に典型的に所見される消化条件をシミュレートするインキュベーション条件で生残することを示す。これらのデータに基づき我々は、新規トリペプチドが哺乳動物（例えばヒト）胃腸管中で生残する可能性があると結論づけ、これは高血圧症を処置するため使用されるならば相当な経済的可能性を意味する。
【００６３】
実施例において我々は優れたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰが酵素加水分解実験において産生され得るのみならず、然るべき食品級微生物を伴い発酵される乳調製物においても検出されることを実証する。しかしながら、我々はかかる発酵産物中のペプチドＩＴＰの存在については実証できていない。
【００６４】
追加的なステップ（例えばクロマトグラフィー精製）の前または後のいずれかに得られるとおりのペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰが日常的に広く消費される食製品中に混入するべく使用されてもよい。かかる製品の例は、マーガリン、スプレッド、バターまたはヨーグルトまたはミルクまたは乳清含有飲料などの様々な乳製品である。かかる組成物は典型的には人間に投与されるが、それらはまた、動物、好ましくは哺乳動物に投与され高血圧症を軽減してもよい。さらには得られるとおりの製品中の高濃度のＡＣＥ阻害剤によりこれらの製品は丸薬、錠剤または高濃縮溶液またはペーストまたは粉末の形態で食事補助剤中に混入するのに非常に有用となる。ＡＣＥ阻害ペプチドの継続的放出を確実にするであろう徐放性食事補助剤は特に興味深い。本発明に従うＭＡＰおよび／またはＩＴＰペプチドは乾燥粉末として、例えば、丸薬、錠剤、顆粒、小袋またはカプセル中に調合されてもよい。あるいは本発明に従う酵素は液体として、例えば、シロップまたはカプセル中に調合されてもよい。様々な製剤において使用されるとともに本発明に従う酵素を含有する組成物はまた、生理学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、安定剤、緩衝剤および希釈剤からなる群より選択される少なくとも１個の化合物を混入してもよく、ここで用語はそれらの通常の意味において使用されることで、包装、送達、吸収、安定化、またはアジュバントの場合には、酵素の生理学的作用の亢進を補助する物質を指示する。本発明に従う酵素と組み合わせて粉末形状で使用され得る様々な化合物に関連する背景は「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２ マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に見出され得る。乾燥粉末として調合される本発明に従うＡＣＥ阻害ペプチドはかなり長期間保存され得るが、湿潤または湿気は、例えばアルミニウムブリスターなどの好適な包装を選定することにより避けなければならない。比較的新しい経口適用形態は、様々なタイプのゼラチンカプセルまたはゼラチンベース錠剤の使用である。
【００６５】
高血圧症に対抗するための天然ＡＣＥ阻害ペプチドの関連性の点から見て、この新しく、かつ費用対効果の高い経路は穏和な降圧性栄養補給用またはさらには動物用の製品に向けた魅力的な出発点を提供する。本経路もまた、驚くべきことに単純な精製ステップを含むため、血圧降下性濃縮食事補給剤の可能性もまた広がる。
【００６６】
本発明に従う、または本発明に従い使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼとは、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３に記載されるとおりのポリペプチドを意味する。それゆえこのプロリン特異的エンドプロテアーゼはプロリン特異的内部タンパク質分解活性を有するポリペプチドであり、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）６０ヌクレオチド超、好ましくは１００ヌクレオチド超が少なくとも８０％または９０％同一である配列番号１の核酸配列またはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、からなる群より選択される。配列番号１および配列番号２は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示されるとおり。好ましくはポリペプチドは単離形態である。
【００６７】
本発明に従い使用される好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、およびさらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するか、または配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列を有する。
【００６８】
好ましくはポリペプチドは、低ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、および最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１の核酸配列またはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００６９】
用語「ハイブリダイズ能を有する」は、本発明の標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に上回るレベルでプローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、またはその断片、または配列番号１の相補体）とハイブリダイズできることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的であるヌクレオチド配列も含む。ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ、および最も好ましくは、ゲノムＤＮＡ配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択条件下で配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチドの連続配列を含んでなる。かかるヌクレオチドは当該技術分野において周知の方法に従い合成され得る。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体とバックグラウンドを有意に上回るレベルでハイブリダイズできる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリ中に存在する他のｃＤＮＡのため、起こり得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用により生成されるシグナルレベルは典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射標識することにより計測されてもよい。選択的ハイブリダイゼーションは典型的には、低ストリンジェンシー（約４０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃で０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）の条件を使用して実現されてもよい。
【００７１】
ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供するが、これを使用して同一性を計算してもよい（例えばそのデフォルト設定で使用される）。
【００７２】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ Ｎアルゴリズムもまた、配列同一性を計算するため、または配列を整列させる（例えば、これらのデフォルト設定で、同等な、または一致する配列を同定するなどの）ため使用され得る。
【００７３】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じ公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされる時、ある正値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定するステップを含む。Ｔは近縁ワードスコア閾値と称される。これらの初期近縁ワードヒットはそれらを含むＨＳＰを求めるための検索を開始するにあたっての元種として働く。ワードヒットは累積アラインメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットの伸長は次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から分量Ｘだけ下落する場合；１つまたは複数の負値スコアの残基アラインメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の終端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）は１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスアラインメント（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００７４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２本の配列間の類似性の統計的解析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であるならば、配列は他方の配列と類似していると考えられる。
【００７５】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の株は食品級の等級を有するとともにこれらの微生物に由来する酵素は疑いのない食品級源由来として知られる。別の好ましい実施形態に従えば、酵素は、非分泌性の、いわゆる細胞質ゾル細胞よりむしろ、その産生細胞によって分泌される。このように酵素は高価な精製ステップを伴わず本質的に純粋な状態で細胞ブロスから回収され得る。好ましくは酵素は一般的なｐＨおよび温度条件下でその基質に対し高親和性を有する。
【００７６】
本発明に従う栄養補助製品は任意の食品タイプであってもよい。それらは、然るべき量で、香味料、砂糖、果実、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等の、一般的な食品成分を食製品に加え含んでなってもよい。
【００７７】
好ましくは、栄養補助製品は５０〜２００ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または１５〜６０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または６〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋、より好ましくは、１００〜１５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３０〜５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１０〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋および最も好ましくは１１０〜１３５ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３５〜４５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１３〜２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋を含んでなる。これらの陽イオンは本発明に従う栄養補助製品中に混入されると血圧をさらに降下させる有益な作用を有する。
【００７８】
有利には、本栄養補助製品は１種または複数のビタミンＢ群を含んでなる。
【００７９】
ビタミンＢ群の葉酸は、ヒトの食事中のアミノ酸であるホモシステインの代謝に関与することが知られている。長年にわたり、高レベルなホモシステインは心血管疾患の高い発症率と相関してきた。ホモシステインの降下は心血管疾患のリスクを低減し得ると思われる。
【００８０】
ビタミンＢ６およびＢ１２はプリンおよびチアミンの生合成に干渉し、メチオニン産生のためのホモシステインメチル化の過程およびいくつかの成長過程におけるメチル基の合成に関与することで知られる。ビタミンＢ６（塩酸ピリドキシン）は既知のビタミン補助剤である。ビタミンＢ１２（シアノバラミン）は神経系の健康に寄与するとともに赤血球の産生に関わる。これはまた、食品補助剤中のビタミンとしても知られる。
【００８１】
心血管疾患リスクの低減に対するこれらの組み合わされた正の作用から、本発明に従う製品はビタミンＢ６およびビタミンＢ１２および葉酸を含んでなることが好ましい。
【００８２】
本栄養補助製品中のビタミンＢ群の量は以下に与えられるこれらのビタミンＢ群の１日量を基本として当業者により計算されてもよい：葉酸：２００〜８００μｇ／日、好ましくは２００〜４００μｇ／日；ビタミンＢ６：０．２〜２ｍｇ／日、好ましくは０５〜１ｍｇ／日およびビタミンＢ１２：０．５〜４μｇ／日、好ましくは１〜２μｇ／日。
【００８３】
好ましくは、本栄養補助製品は３〜２５ｗｔ％のステロール、より好ましくは７〜１５ｗｔ％のステロールを含んでなる。ステロールの混入の利点は、それがヒト血中のＬＤＬコレステロールレベルの低減を引き起こすであろう点であり、これは結果として心血管上のリスクの低減をもたらすであろう。
【００８４】
参照がステロールに対しなされる場合、これは飽和スタノールおよびステロール／スタノールのエステル化誘導体またはこれらのうち任意のものの混合物を含む。
【００８５】
本出願において参照がステロールエステルになされる場合、これもまた、それらの飽和誘導体、スタノールエステル、およびステロールエステルおよびスタノールエステルの組み合わせを含む。
【００８６】
ステロールまたはフィトステロールは、植物ステロール（ｐｌａｎｔ ｓｔｅｒｏｌまたはｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｓｔｅｒｏｌ）としても知られ、４−デスメチルステロール、４−モノメチルステロールおよび４，４’−ジメチルステロールの３群に分類され得る。油中でこれらは主に、遊離ステロールおよび脂肪酸のステロールエステルとして存在するが、ステロールグルコシドおよびアシル化ステロールグルコシドもまた存在する。３つの主要なフィトステロール、すなわちβ−シトステロール、スチグマステロールおよびカンペステロールがある。意図される構成成分の概略図は「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｎ Ｓｔｅｒｏｌｓ ｏｆ Ｅｄｉｂｌｅ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｏｉｌｓ」、Ｓ．Ｐ．コチャール（Ｓ．Ｐ．Ｋｏｃｈｈａｒ）；Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２２：１６１−１８８頁に与えられるとおりである。
【００８７】
シトスタノール、カンペスタノールおよびエルゴスタノールおよびそれらの誘導体などのそれぞれの５α−飽和誘導体は本明細書中ではスタノールと称される。好ましくは（場合によりエステル化された）ステロールまたはスタノールはβ−シトステロールの脂肪酸エステル、β−シトスタノール、カンペステロール、カンペスタノール、スチグマステロール、ブラシカステロール、ブラシカスタノールまたはそれらの混合物を含んでなる群より選択される。
【００８８】
ステロールまたはスタノールは場合により少なくとも部分的に脂肪酸でエステル化される。好ましくはステロールまたはスタノールは１個または複数のＣ２−２２脂肪酸でエステル化される。本発明の目的上、用語Ｃ２−２２脂肪酸はＣ２−２２主鎖および少なくとも１個の酸性基を含んでなる任意の分子を参照する。本文意内では好ましくないが、Ｃ２−２２主鎖は部分的に置換されてもよく、または側鎖が存在してもよい。しかしながら、好ましくはＣ２−２２脂肪酸は末端基として１または２個の酸性基を含んでなる直鎖分子である。最も好ましくあるのは天然油中に存在するものと同様の直鎖Ｃ８−２２脂肪酸である。
【００８９】
任意のかかる脂肪酸の好適な例は酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸である。他の好適な酸は、例えばクエン酸、乳酸、シュウ酸およびマレイン酸である。最も好ましくあるのは、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、オレイン酸、セトレイン酸、エルカ酸、エライジン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【００９０】
所望であれば脂肪酸の混合物がステロールまたはスタノールのエステル化のために使用されてもよい。例えば、天然起源の脂肪または油を脂肪酸の原料として使用すること、およびエステル交換反応を介してエステル化を実行することが可能である。
【００９１】
上述された栄養補助成分は、心血管の健康を増加させることに寄与し、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、ビタミンＢ群（葉酸、Ｂ６、Ｂ１２）およびステロールは本明細書中ではまとめて心臓の健康成分と称される。
【００９２】
以下の実施例が本発明をさらに説明する。
【００９３】
Ａ．医薬組成物は従来の製剤手順により以下に指定される成分を使用して調製されてもよい：
実施例１
ソフトゼラチンカプセル
ソフトゼラチンカプセルは従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．１ｇ、タンパク質加水分解物０．３ｇ
他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物油
実施例２
ハードゼラチンカプセル
ハードゼラチンカプセルは従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．３ｇ、タンパク質加水分解物０．７ｇ
他の成分：
賦形剤：ラクトースまたはセルロース誘導体適量
潤滑剤：必要に応じてステアリン酸マグネシウム（０．５％）
実施例３
錠剤
錠剤は従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製される：
活性成分：ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ０．４ｇ、タンパク質非加水分解物０．４ｇ
他の成分：微結晶性セルロース、二酸化シリコン（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム。
【００９４】
Ｂ．食品項目は従来の手順により以下に指定される成分を使用して調製されてもよい：
実施例４
果汁３０％の清涼飲料
標準的な１食量：２４０ｍｌ
活性成分：
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物および炭水化物源としてのマルトデキストリンが本食品項目に混入される：
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰ：０．５〜５ｇ／１食
タンパク質加水分解物：１．５〜１５ｇ／１食
マルトデキストリン：３〜３０ｇ／１食
【００９５】
Ｉ．「清涼飲料化合物」は以下の成分から調製される：
果汁濃縮物および水溶性香味料
［ｇ］
１．１ オレンジ濃縮物
６０．３°ブリックス、５．１５％酸性度 ６５７．９９
レモン濃縮物
４３．５°ブリックス、３２．７％酸性度 ９５．９６
オレンジ香味料、水溶性 １３．４３
アプリコット香味料、水溶性 ６．７１
水 ２６．４６
１．２ 着色料
β−カロチン１０％ＣＷＳ ０．８９
水 ６７．６５
１．３ 酸および抗酸化剤
アスコルビン酸 ４．１１
無水クエン酸 ０．６９
水 ４３．１８
１．４ 安定剤
ペクチン ０．２０
安息香酸ナトリウム ２．７４
水 ６５．６０
１．５ 油溶性香味料
オレンジ香味料、油溶性 ０．３４
蒸留オレンジ油 ０．３４
１．６ 活性成分
活性成分（これは上述される活性成分、すなわち上述される濃度におけるＭＡＰおよび／またはＩＴＰおよびタンパク質加水分解物およびマルトデキストリンを意味する）。
【００９６】
果汁濃縮物および水溶性香味料は空気の混入なしに混合される。着色料は脱イオン水中に溶解される。アスコルビン酸およびクエン酸は水中に溶解される。安息香酸ナトリウムは水中に溶解される。ペクチンは撹拌下で添加されるとともに煮沸しながら溶解される。溶液は冷却される。オレンジ油および油溶性香味料は予混合される。１．６に記述されるとおりの活性成分は乾燥混合されるとともに、次に好ましくは果汁濃縮混合物（１．１）中に撹拌される。
【００９７】
清涼飲料化合物を調製するため、３．１．１から３．１．６の全ての部分が共に混合された後トゥラックス（Ｔｕｒｒａｘ）および次に高圧ホモジナイザー（ｐ１＝２００バール、ｐ２＝５０バール）を使用してホモジナイズされる。
【００９８】
ＩＩ．「瓶詰めシロップ」は以下の成分から調製される：
［ｇ］
清涼飲料化合物 ７４．５０
水 ５０．００
液糖 ６０°ブリックス １５０．００
【００９９】
瓶詰めシロップの成分は共に混合される。瓶詰めシロップは１ｌのすぐに飲める飲料となるまで水で希釈される。
【０１００】
変形例：
安息香酸ナトリウムを使用する代わりに、飲料は低温殺菌されてもよい。飲料はまた、炭化されてもよい。
【０１０１】
実施例５
カゼインカリウムをＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼを伴いインキュベートすることによりＩＰＰおよびＬＰＰは急速に産出されるがＶＰＰは産出されない。
本実験においては、過剰産生され、かつ本質的に純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼがカゼインカリウムを伴いインキュベートされ、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰの遊離について試験された。使用されたエンドプロテアーゼは本質的に純粋であった、つまりプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有の内部タンパク質分解活性（すなわち、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端切断）以外の有意な内部タンパク質分解活性は存在しなかった。
【０１０２】
ＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウム取り込みを可能な限り制限するため、カゼインカリウムがこのインキュベーションにおける基質として使用された。
【０１０３】
カゼイン塩が１０％（ｗ／ｗ）タンパク質濃度で摂氏６５度の水中に懸濁された後、ｐＨがリン酸を使用して６．０に調整された。次に懸濁液が摂氏５５度まで冷却され、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが４ユニット／タンパク質１グラムの濃度で添加された（ユニットの定義については「材料および方法」の節を参照）。連続撹拌下でこの混合物は２４時間インキュベートされた。この間にさらなるｐＨ調整は実行されなかった。試料がインキュベーションの１、２、３、４、８、および２４時間後に採取された。各試料の酵素活性は、摂氏９０度まで５分間、該試料を即時加熱することにより終了させた。冷却後、各試料のｐＨをリン酸を使用して４．５まで速やかに降下させた後、懸濁液がヘレウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）卓上遠心分離機において３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離された。完全に清澄な上清がＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に使用され、上清中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦが定量化された（「材料および方法」の節を参照）。
【０１０４】
ウシ乳カゼインはβ−カゼインおよびκ−カゼインを含む多数の異なるタンパク質を混入する。既知のアミノ配列に従えば、β−カゼインはＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。β−カゼインにおいてＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−内に含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−内に含有され、およびＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−内に含有される。κ−カゼインは、β−カゼイン濃度のほぼ５０％のモル濃度における酸沈殿カゼイン塩調製物中に存在し、ＩＰＰのみを包含する。κ−カゼインにおいてＩＰＰは配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−内に含有される。カゼインの他のタンパク質構成物はＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含有しない。
【０１０５】
表２および３は、酸性化され、かつ遠心分離された上清中に存在するペプチドの、インキュベーション混合物に添加されるカゼインカリウム１グラム当たりで計算されるときの、濃度を示す。表２に示されるとおり、ＩＰＰはインキュベーションの１時間後にその最高濃度に到達する。そのうえＩＰＰ濃度はそれ以上は上昇しない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成はＩＰＰの生成と同じ動態を示す。理論的に予想されるとおり、ＶＶＶＰＰのモル収量はＬＰＰペプチドのモル収量と同様である。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの双方の収量は理論的に可能であろう収量のほぼ６０％に達する。ＬＰＰの最高濃度がインキュベーションのわずか３時間後に到達されるという事実は、β−カゼイン分子の特定部分の切断がことによると若干さらに困難であることを示唆する。ＶＶＶＰＰとは対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦは全く形成されない。この観測はプロリン特異的エンドプロテアーゼが効率的に−Ｐ−Ｆ−結合を切断し、それによりＶＶＶＰＰを生成することを示唆する。トリペプチドＩＰＰは即時形成されるが、そのモル収量はＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれかの最大モル収量の約３分の１を上回ることはない。ＩＰＰトリペプチドはβ−カゼインおよびκ−カゼインの双方の中に含有されるため、この結果は予想外である。この観測について可能な説明は、プロリン特異的プロテアーゼはＩＰＰを生成できるがカゼイン塩のκ−カゼイン部分からのみできるというものである。関連するκ−カゼインのアミノ酸配列の点から見て、これは−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合が酵素のアラニン特異的活性により切断されることを示唆する。これが真実ならば、遊離されるＩＰＰの量はκ−カゼイン中に存在する分量のおよそ４０％に達するが、理論的にβ＋κ−カゼイン中に存在するＩＰＰの約１０％は上回らない。ＩＰＰの放出についてのこの切断機序はまた、なぜＶＰＰがその前躯体分子ＶＶＶＰＰから形成され得ないのかについても説明する：所要の内部タンパク質分解活性が使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物中に単に存在しないのである。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
実施例６
酸カゼイン沈殿ステップの組込みは結果としてＡＣＥ阻害ペプチドの５倍の濃度をもたらす
実施例５に記載されるとおり、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質濃度のカゼインカリウムがｐＨ６．０でのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを伴うインキュベーションに供された。様々なインキュベーション時間の後、試料は加熱されさらなる酵素活性が中断された後、ｐＨが４．５まで降下されカゼイン溶解度は最小化された。不溶カゼイン分子が低速遠心分離により除去された。表２および３において我々は１０％タンパク質の出発濃度に基づき計算されるＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供している。しかしながら、酸性化および続く遠心分離ステップの結果として、添加されたタンパク質の大部分が除去された。酸性化された上清のこれらの低減したタンパク質含量を考慮に入れるため、窒素（ケルダール）分析が実行された。このデータによれば様々な上清が表４に示されるタンパク質レベルを含有することが所見された。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
これらのデータを考慮に入れ、我々は各上清中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算しているが、今回はそれらの実際のタンパク質含量を使用した。これらの再計算データは表５に示される。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
表３および５に提示されるデータの比較は、単純な酸性化ステップに続く工業的に実施可能なデカンテーション、ろ過または低速遠心分離ステップが結果として特異的ＡＣＥ阻害ペプチドの濃度に５倍の増加をもたらすことを明確に示す。
【０１１３】
実施例７
濃縮カゼイン加水分解物中の新規かつ強力なＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定
存在する生物活性ペプチドのより徹底した分析を円滑にするため、純粋なＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼでの消化により得られるとともに酸沈殿により精製されるカゼイン加水分解物が調製用規模で調製された。この目的のため３０００グラムのカゼインカリウムが２５リットルの摂氏７５度の水中に懸濁された。徹底した均質化の後、ｐＨが希釈リン酸を使用して徐々に６．０まで調整された。摂氏５５度まで冷却後、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが４酵素ユニット／カゼイン塩１グラムの濃度で添加された（ユニットの定義については「材料および方法」の節を参照）。３時間、摂氏５５度でのインキュベーション（撹拌を伴う）後、ｐＨは濃縮リン酸を徐々に添加することにより４．５まで降下させた。この大規模な調製においては、方法のこの部分においてプロリン特異的エンドプロテアーゼを不活化する加熱処置ステップが省略された。次に懸濁液が速やかに摂氏４度まで冷却され、かつこの温度で一晩保管された（撹拌なし）。翌朝清澄な表層はデカントされ、４０％乾燥物質のレベルに達するまで蒸発させた。この濃縮液は摂氏１４０度、４秒間のＵＨＴ処置に供され、次に摂氏５０度で限外ろ過された。細菌ろ過後、液体は噴霧乾燥された。以下、この材料は「カゼイン由来生物活性ペプチド」（ＣＤＢＡＰ）と称される。「材料および方法」の節に概説されるＬＣ／ＭＳ手順を使用して、粉末産物中のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含量が測定された。その窒素含量に従えば、粉末産物は約６０％のタンパク質含量（６．３８の換算係数を使用して）を有する。粉末のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含量は表６に提供される。ＣＤＢＡＰ産物のアミノ酸組成は表７に提供される。極めて顕著であるのは、酸沈殿後に得られる噴霧乾燥材料のプロリンモル含量の、当初の１２％からおよそ２４％までという増加である。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
ＣＤＢＡＰ中の新規ＡＣＥ阻害ペプチドの存在が二次元クロマトグラフィー分離法をアットラインＡＣＥ阻害アッセイおよび同定用質量分析と組み合わせて使用することにより調査された。第１の分析においてペプチド混合物はＯＤＳ３液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラム上で分離され、および得られた様々な画分からＡＣＥ阻害プロファイルが生成された。第２の分析において高いＡＣＥ阻害を示す第１のカラムからの画分がバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）ＬＣカラム上で異なる勾配プロファイルを使用してさらに分離された。この第２のカラムから収集された画分が２つの部分に分割された：一方の部分はアットラインＡＣＥ阻害計測に使用され、他方の部分はＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析に供され存在するペプチドが同定された。
【０１１７】
全ての分析はデュアルトレースＵＶ検出器を装備するアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９５ＨＰＬＣ装置（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）を使用して実施された。ペプチドの同定のため、ＨＰＬＣ装置は同じ供給者製のＱ−ＴＯＦ質量分光計に連結された。試験において２０μｌのミリＱ水中の１０％（ｗ／ｖ）ＣＤＢＡＰ溶液が粒径５μｍを備える１５０×２．１イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）５のＯＤＳ３カラム（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、オランダ）上に注入された。移動相ＡはミリＱ水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ溶液からなった。当初の溶離液組成は１００％Ａであった。溶離液は１００％Ａで５分間保たれた。次に直線勾配が５％Ｂまで１０分内に開始された後、１０分内に３０％Ｂまで直線勾配が続いた。カラムはＢの濃度を７０％まで５分内に上昇させることにより洗い流され、７０％Ｂでさらに５分間保たれた。この後、溶離液が１分内に１００％Ａに交換され、９分間平衡化された。総実行時間は５０分間であった。溶離液流速は０．２ｍｌ・分−１であり、カラム温度は６０℃に設定された。ＵＶクロマトグラムが２１５ｎｍで記録された。溶離液画分が１分の時間間隔を使用して９６ウェルプレートに収集された結果、２００μｌの画分量がもたらされた。ウェル中の溶離液が８０μｌの含水水酸化アンモニウム（２５％）の０．０５％溶液の添加により中和された。溶媒は窒素下５０℃で乾燥するまで蒸発させた。この後、残留物は４０μｌのミリＱ水中で再構成され、１分間混合された。
【０１１８】
アットラインＡＣＥ阻害アッセイのため、ｐＨ７．４、塩素濃度２６０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３３．４ｍＵ・ｍｌ−１ＡＣＥ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した酵素）２７μｌが添加され、混合物は７００ＲＰＭの９６ウェルプレート撹拌機上での５分間のインキュベートが可能となった。インキュベーション時間の後、ＰＢＳ緩衝液中の０．３５ｍＭ馬尿酸−ヒスチジン−ロイシン（ＨＨＬ）溶液１３μｌが添加され、１分間、７００ＲＰＭで混合された。混合物はＧＣオーブン中での６０分間、５０℃での反応が可能となった。反応後、プレートは融氷中で冷却された。
【０１１９】
９６ウェルプレートは次に、フラッシュＨＰＬＣカラム上で分析された。各ウェル３０μｌの反応混合物が、同じ供給者製の１０×４．６ｍｍＲＰ１８ｅガードカラムを装備するクロムリス・フラッシュ（Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ）ＲＰ１８ｅの２５×４．６ｍｍＨＰＬＣカラム（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）上に注入された。アイソクラティックな移動相は水／アセトニトリル７９／２１の０．１％ＴＦＡ溶液からなった。溶離液流速は２ｍｌ・分−１であったとともに、カラム温度は２５℃であった。注入は１分の時間間隔で実施された。馬尿酸（Ｈ）およびＨＨＬが２８０ｎｍでモニタされた。ＨおよびＨＨＬのピーク高さが計測され、および各画分のＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）が次式に従い計算された：
【数１】
ＡＣＥＩα 分析物の阻害率
ＤＣｗ 水中でのＨおよびＨＬに対するＨＨＬのＡＣＥによる「切断度」
ＤＣａ 分析物についてのＨおよびＨＬに対するＨＨＬの「切断度」
「切断度」は、ＨおよびＨＨＬのピーク高さの合計の比としてのＨのピーク高さを求めることにより計算された。
【０１２０】
最高ＡＣＥ阻害は１８〜２６分間に溶離した画分中で計測された。この領域が収集され、粒径３μｍの１５０×２．１ｍｍバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）カラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）上に再注入された。移動相ＡはここではミリＱ水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂはメタノール中の０．１％ＦＡ溶液からなった。当初の溶離液組成は１００％Ａであった。溶離液は１００％Ａで５分間保たれた。この後、直線勾配が５％Ｂまで１５分内に開始された後、３０分内に６０％Ｂまで直線勾配が続いた。溶離液が６０％Ｂでさらに５分間保たれた。最終的に溶離液は１分内に１００％の移動相Ａまで低減され、１０分間平衡化された。総実行時間は６５分間であった。溶離液流速は０．２ｍｌ・分−１であり、カラム温度は６０℃に設定された。ＵＶトレースが２１５ｎｍで記録された。画分がバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）カラムから１０秒の時間間隔で収集された。画分は再び２つの部分に分割され、一方の部分は上記に記載されるアットラインＡＣＥ阻害方法を使用して活性を計測するために使用され、他方の部分はＭＳおよびＭＳ−ＭＳを使用して活性ペプチドを同定するために使用された。
【０１２１】
３２６．２０８０Ｄａの分子イオンでの２つのクロマトグラフピークおよび３３０．２０２９Ｄａおよび３１８．１４８８Ｄａの分子イオンでの２つの他のピークが１８〜２６分間の領域内で計測されたＡＣＥ阻害増加に相当した。ＭＳ−ＭＳを使用してこれらのペプチドが構造異性体ＩＰＰおよびＬＰＰ（−０．６ｐｐｍ）、ＩＴＰ（−４．８ｐｐｍ）およびＭＡＰ（＋２．８ｐｐｍ）としてそれぞれ同定された。ペプチドのタンパク質源はκ−カゼインｆ１０８−１１０（ＩＰＰ）、β−カゼインｆ１５１−１５３（ＬＰＰ）、α−ｓ２−カゼインｆ１１９−１２１（ＩＴＰ）およびβ−カゼインｆ１０２−１０４（ＭＡＰ）である。ＩＰＰおよびＬＰＰはＩＣ５０値がそれぞれ５および９．６μＭであるＡＣＥ阻害ペプチドとして以前に報告された（Ｙ．ナカムラ（Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ）、Ｍ．ヤマモト（Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ）、Ｋ．サカイ（Ｋ．Ｓａｋａｉ）、Ａ．オオクボ（Ａ．Ｏｋｕｂｏ）、Ｓ．ヤマザキ（Ｓ．Ｙａｍａｚａｋｉ）、Ｔ．タカノ（Ｔ．Ｔａｋａｎｏ）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８（１９９５年）７７７−７８３頁；Ｙ．アリョシ（Ｙ．Ａｒｙｏｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（１９９３年）１３９−１４４頁）。しかしながら、トリペプチドＩＴＰおよびＭＡＰは、我々の知る限りでは、これまで強力なＡＣＥ阻害ペプチドとして報告されたことは一度もない。
【０１２２】
ＭＡＰ、ＩＴＰおよびＩＰＰは化学的に合成されたうえ、各ペプチドの活性が以下に記載される修正マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）アッセイを使用して計測された。
【０１２３】
様々な試料中のＭＡＰおよびＩＴＰの定量化がポジティブ・エレクトロスプレーの多重反応モニタリングモードにおいて操作されるマイクロマス・クアトロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ）ＩＩ ＭＳ計器において実施された。使用されるＨＰＬＣ法は上記に記載されるものと同様であった。ＭＳ設定（ＥＳＩ＋）は次のとおりであった：コーン電圧３７Ｖ、キャピラリー電圧４ｋＶ、乾燥ガスは窒素で３００ｌ／ｈ。原料および噴霧器の温度：それぞれ、１００℃および２５０℃。合成ペプチドが、前駆イオン３１８．１および積算生成イオン２２７．２および３４７．２をＭＡＰ用に使用して、前駆イオン３２０．２および積算生成イオン２８２．２および５０１．２をＩＴＰ用に使用して検量線を準備するため使用された。これらの分析に従えば、新規ＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰはＣＤＢＡＰ産物中に２．９ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ１グラムまたは４．８ｍｇＭＡＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラムおよび０．９ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ１グラムまたは（ｅｎ）１．４ｍｇＩＴＰ／ＣＤＢＡＰ中のタンパク質１グラムに相当する分量で存在する。
【０１２４】
ＭＡＰおよびＩＴＰのＡＣＥ阻害活性を測定するため、化学的に合成されたトリペプチドが、いくらかの細かな修正を伴うマツイ（Ｍａｔｓｕｉ）ら（マツイ，Ｔ（Ｍａｔｓｕｉ，Ｔ）ら（１９９２年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：５１７−５１８頁）の方法に従いアッセイされた。様々なインキュベーションが表８に示される。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
４つの試料の各々は、２００ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．３の２５０ｍＭのホウ酸塩溶液中に溶解される７５μｌの３ｍＭヒプリルヒスチジンロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有した。ＡＣＥはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手された。混合物は３７℃でインキュベートされ、３０分後に１２５μｌの０．５ＭのＨＣｌを添加することにより中断された。続いて、２２５μｌのビシン／ＮａＯＨ溶液（１ＭのＮａＯＨ：０．２５Ｍのビシン（４：６））が添加された後、２５μｌの０．１ＭのＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、スイス；０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４中）が続いた。３７℃、２０分間のインキュベーション後、０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４中の４ｍｌの４ｍＭのＮａ２ＳＯ３が添加され、４１６ｎｍでの光吸収度がＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＣＰＳコントローラを備えるシマヅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＶ−１６０１、オランダ）で計測された。
【０１２７】
ＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）の量が阻害剤の不在下でのＡＣＥの換算率と比較した阻害割合として次式に従い計算された：
ＡＣＥＩ（％）＝（（対照１−対照２）−（試料１−試料２））／（対照１−対照２））＊１００、式中、
対照１＝ＡＣＥ阻害構成成分を伴わない吸光度（＝最大ＡＣＥ活性）［ＡＵ］。
対照２＝ＡＣＥ阻害構成成分を伴わない、かつＡＣＥ（バックグラウンド）を伴わない吸光度［ＡＵ］。
試料１＝ＡＣＥおよびＡＣＥ阻害構成成分の存在下での吸光度［ＡＵ］。
試料２＝ＡＣＥ阻害構成成分の存在下だが、ＡＣＥを伴わない吸光度［ＡＵ］。
【０１２８】
得られたとおりの化学的に合成されたＭＡＰおよびＩＴＰトリペプチドのＩＣ５０が実験のスクリーニング相で使用されるアットライン計測において得られたＩＣ５０値とともに表９に示される。化学的に合成されたＩＰＰの計測値が様々な計測値の内部基準として含められた。
【０１２９】
【表８】
【０１３０】
実施例８
新規ＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰはヒト胃腸管内で生残する可能性がある
摂取後、食事性タンパク質およびペプチドは胃腸管内の様々な消化酵素処理にさらされる。新規に同定された生物活性ペプチドのヒト胃腸管内における安定性を評価するため、ＣＤＢＡＰ調製物（実施例７に記載されるとおり調製される）がヒト体内で典型的に所見される消化状態をシミュレートする胃腸処置（ＧＩＴ）に供された。ＧＩＴモデル系における様々なインキュベーション時間後に得られた試料がオンラインＨＰＬＣ−バイオアッセイ（Ｂｉｏａｓｓａｙ）−ＭＳまたはＨＲＳ−ＭＳ装置を使用して分析され、任意の残留ＭＡＰおよびＩＴＰペプチドが定量化された。ＧＩＴ手順は、１００ｍｌフラスコ（米国バンケル（Ｖａｎｋｅｌ）により供給されるとおり）を組み込む規格混合機において実施された。水浴の温度は３７．５℃に設定され、撹拌速度は試料が懸濁液中に保たれるように選定された（１００ｒｐｍ）。
【０１３１】
約３．４グラムのＣＤＢＡＰ（タンパク質レベルはおよそ６０％）が１００ｍｌのミリＱ水中に溶解／懸濁された。胃のシミュレーション中、５ＭのＨＣｌが使用されｐＨを低下させた。胃のシミュレーションの最後および十二指腸の相中、５ＭのＮａＯＨが使用されｐＨを上昇させた。
【０１３２】
ＣＤＢＡＰ懸濁液が３７．５℃まで予熱されたうえ、５ｍｌの懸濁液が取り出され０．３１ｇのペプシン（フルカ（Ｆｌｕｋａ）注文番号７７１６１）を溶解させた。ｔ＝０分で既に溶解済みのペプシンを伴う５ｍｌが懸濁液に入れ戻された。次にＣＤＢＡＰ懸濁液のｐＨが次の計画案に従い別個のｐＨ計を使用して手動で徐々に調整された：
ｔ＝２０分 ｐＨを３．５に低下させる
ｔ＝４０分 ｐＨを３．０に
ｔ＝５０分 ｐＨを２．３に
ｔ＝６０分 ｐＨを１．８に
ｔ＝６５分 ｐＨを２．７に上昇させる
ｔ＝７５分 ｐＨを３．７に
ｔ＝８０分 ｐＨを５．３に
ｔ＝９０分、０．１３９ｇの８倍ＵＳＰパンクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）注文番号Ｐ７５４５）が別の５ｍｌのＣＤＢＡＰ懸濁液中に慎重に混合されたうえ、直ちに入れ戻された。インキュベーションが次の計画案に従い続行された：
ｔ＝９３分 ｐＨを５．５に
ｔ＝９５分 ｐＨを６．３に
ｔ＝１００分 ｐＨを７．１に
【０１３３】
実験はｔ＝１２５分で中断され、ｐＨが確認された（まだｐＨ７であった）。
【０１３４】
次に試料がビーカーに移され、煮沸するまでマイクロ波オーブン中に置かれた。続いて、試料はガラス管に移されたうえ、９５℃で６０分間インキュベートされ全てのプロテアーゼ活性が不活化された。冷却後、試料はファルコン管に入れられ、１０分間３０００×ｇで遠心分離された。上清が凍結乾燥された。得られたとおりの粉末のＮ総濃度が測定され、カゼインのケルダール係数（６．３８）を使用してタンパク質レベルに換算された。これらのデータに従えば、ＧＩＴ手順後のＣＤＢＡＰ調製物のタンパク質レベルは４８．４％であった。ＧＩＴ手順に従うタンパク質分解処置を生残するＭＡＰおよびＩＴＰのレベルが実施例７に記載されるとおり測定され、得られたデータは表１０に示される。
【０１３５】
実験の結果に従えば、ＭＡＰおよびＩＴＰの双方がＧＩＴ消化に対し高い抵抗性を呈する。これらのトリペプチドにおける低いＩＣ５０値（同様に実施例７において測定されるとおり）と組み合わせれば、データからは２個の新規ＡＣＥ阻害ペプチドの血圧降下ペプチドとしての相当な可能性が示唆される。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
実施例９
合成ＭＡＰおよびＩＴＰのインビトロ模擬胃腸消化
胃腸管（ＧＩ）内でのペプチドの安定性を計測するため、ミクロ溶解が使用された。この以下の試験が使用されＭＡＰおよびＩＴＰのＧＩ安定性が試験された。
【０１３８】
成分：
溶解のため次の溶液が使用された：
０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ
１ｍｏｌ／ｌのＮａＨＣＯ３
人工胃液；
５００ｍｌの水中１．０ｇの塩化ナトリウムおよび３．５ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ
（超音波浴中で１０分間、脱気される）
胃条件における酵素（総量１ｍｌ中に必要とされる量）：
５０μｌの人工胃液中に２．９ｍｇのペプシンおよび０．４５ｍｇのアマノリパーゼ（Ａｍａｎｏ Ｌｉｐａｓｅ）−ＦＡＰ１５
腸条件における酵素（総量１ｍｌ中に必要とされる量）：
５０μｌの１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＨＣＯ３中に９ｍｇのパンクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ８０９６）および０．１２５ｍｇの胆汁抽出物
【０１３９】
手順：
胃条件：
−各バイアルに次が充填された：
−０．８２ｍｌの模擬胃液＋７０μｌのミリＱ＋１０μｇの（１０倍希釈）混合物１、
−Ｔ＝３７．５℃（ｔ＝０）の時に試料を採取し、５０μｌのペプシン／リパーゼ混合物を添加（振盪）する。
−ｐＨが計測されるとともに３．５まで０．１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌで調整される。
−６０分間のインキュベーション、６０分後試料が採取される。
腸条件：
−５０μｌのパンクレアチン混合物が添加され、かつｐＨが計測されるとともに６．８までＨＣｌで調整される。
−試料はパンクレアチンの添加（振盪）後５分、３０分および６０分で採取される。
−全ての試料は９５℃で６０分間保たれ、酵素の活性が中断される。
−冷却後、試料は分析まで−２０℃で貯蔵される。
−試料は遠心分離されるとともにＨＰＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳで分析される。
【０１４０】
表１１および１２について、計測されたペプチド濃度がｎｇ／ｍｌで与えられ、ＭＡＰの相対濃度として計算される。
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
【表１１】
【０１４３】
【表１２】
【０１４４】
【表１３】
【０１４５】
上記の結果は、トリペプチドＭＡＰが胃腸条件下で、特に胃条件下１時間後に、良好な安定性を適度に呈することを実証する。ＭＡＰは腸の終端に達する前にさらなる分解を受けるにもかかわらず、ほとんどのペプチドは胃のすぐ後、すなわち十二指腸および空腸の近位で吸収される。しかしながら、ＭＡＰはカゼイン加水分解物内の他のペプチドの存在下でこの分解に対し保護されると考えられる。
【０１４６】
結果はまた、ＩＴＰの胃腸条件下での優れた安定性も実証する。この優れた安定性はＩＴＰのＡＣＥ阻害剤としてのいくらか低い効力を補い得る。
【０１４７】
これらの結果はトリペプチドＭＡＰが胃腸条件下で、特に胃条件下１時間後に、良好な安定性を適度に呈することを実証する。しかしながら、これは腸の終端に達する前に実にさらなる分解を受ける。しかしながら、ＭＡＰはカゼイン加水分解物内の他のペプチドの存在下でこの分解に対し保護されると考えられる。これは実施例８および９に示されるＭＡＰについての安定性における明らかな差異を説明する。
【０１４８】
実施例１０
ＭＡＰ含有発酵乳の調製
実施例７に記載されるとおり高度に強力なＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰが実施例７に記載される酵素的手順に従い調製されるカゼイン加水分解物中に同定された。しかしながら、我々はＭＡＰトリペプチドが一般的な手法である脱脂乳の発酵を使用しても得られ得るのではないかとの疑問を抱いた。これを試験するため、ＡＰＩ５０ＣＨＬ条片（ビオメリュー社（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ）、６９２８０ Ｍａｒｃｙ−ｌ‘Ｅｔｏｉｌｅ、フランスから入手可能）により特徴づけられるラクトバチルス株の使用がなされた。使用された株はＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マルトース、ラクトース、スクロースおよびトレハロースを発酵することができた。ＡＰＩＬＡＢプラス（Ｐｌｕｓ）データバンク（バージョン５．０；同様にビオメリュー（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）から入手可能）に従い、株はラクトバチルス・デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ラクティス（Ｌａｃｔｉｓ）０５−１４として特徴づけられた。株はＣｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ、Ｂａａｒｎ、オランダに寄託された（ＣＢＳ１０９２７０）。
【０１４９】
実際の発酵実験用の前培養物を調製するため、無菌脱脂乳（ヨッパー・エクス・カンピナ（Ｙｏｐｐｅｒ ｅｘ Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）がラクトバチルス・デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ）株の培養物の２〜４％を接種され、２４時間摂氏３７度で成長させた。
【０１５０】
実際の発酵実験において、４．２％ＭＰＣ−８０の還元乳（カンピナ（Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）、０．５％ラクトースおよび０．３％ラクプロダン（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ）８０（カンピナ（Ｃａｍｐｉｎａ）、オランダ）が２分間８０度で低温殺菌された。冷却後、乳は２ｗｔ％の前培養物を接種され、発酵が静止条件下で１５０ｍｌのジャー中で実施され、および４０℃でｐＨコントロールを伴わず実施された。
【０１５１】
２４時間後、試料が採取され、１０分間１４．０００ｇで遠心分離された。得られた試料のｐＨは５．３、およびＭＡＰ濃度は１８．３ｍｇ／Ｌであった。しかしながら、ＩＴＰは発酵乳中に検出できなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養補助物、好ましくは医薬品としてのＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはそれらのＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩。
【請求項２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品としての使用。
【請求項３】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用。
【請求項４】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、健康の改善または疾患の予防および／または処置のための使用。
【請求項５】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、高血圧症および心不全などの心血管疾患の処置用の栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用。
【請求項６】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、前糖尿病または糖尿病の処置のための、または肥満の処置のための使用。
【請求項７】
１型および２型糖尿病の処置の、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者における２型糖尿病の予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項８】
高血圧症または心不全に罹患している人々の処置またはそれらの予防の方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、血漿インスリンまたは血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用。
【請求項１０】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の血漿インスリンに対する感受性の血漿インスリンを増加させるための使用。
【請求項１１】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中グルコース濃度を降下させるための使用。
【請求項１２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中インスリン分泌を増加させるための使用。
【請求項１３】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰが食事補助剤の形態である請求項２〜１２のいずれか一項に記載のＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の使用。
【請求項１４】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用。
【請求項１５】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の局所適用における、好ましくはパーソナルケア適用における使用。
【請求項１６】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、飼料およびペットフードにおける使用。
【請求項１７】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる医薬品。
【請求項１８】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食事補助剤。
【請求項１９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食品。
【請求項２０】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を医薬品または健康上の利益として含んでなる組成物。
【請求項２１】
前記健康上の利益がストレスの作用の処置である組成物であって、好ましくは前記組成物が食品または飼料である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を局所剤としての使用のため、好ましくはパーソナルケアにおける使用のため含んでなる組成物。
【請求項２３】
ローション、ゲルまたはエマルジョンである請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
イソロイシン、スレオニンおよびプロリンを共役してＩＴＰを形成すること、および場合によりＴＴＰをその塩に変換することによる化学合成を含んでなるＩＴＰまたはＩＴＰの塩の生産。
【請求項２５】
メチオニン、アラニンおよびプロリンを共役してＭＡＰを形成すること、および場合によりＭＡＰをその塩に変換することによる化学合成を含んでなるＭＡＰまたはＭＡＰの塩の生産。
【請求項２６】
タンパク質からのＭＡＰおよび／またはＩＴＰの産生能を有する好適な微生物による好適な前記タンパク質の発酵を含んでなるＭＡＰおよび／またはＩＴＰの製造。
【請求項２７】
前記タンパク質がカゼインであるとともに好ましくは前記微生物が乳酸を産生しているＭＡＰおよび／またはＩＴＰの生産。
【請求項１】
栄養補助物、好ましくは医薬品としてのＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはそれらのＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩。
【請求項２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品としての使用。
【請求項３】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用。
【請求項４】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、健康の改善または疾患の予防および／または処置のための使用。
【請求項５】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、高血圧症および心不全などの心血管疾患の処置用の栄養補助物、好ましくは医薬品の製造のための使用。
【請求項６】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、前糖尿病または糖尿病の処置のための、または肥満の処置のための使用。
【請求項７】
１型および２型糖尿病の処置の、および前糖尿病者、または耐糖能障害（ＩＧＴ）者における２型糖尿病の予防のための方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項８】
高血圧症または心不全に罹患している人々の処置またはそれらの予防の方法であって、かかる処置を必要とする対象者にＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を投与するステップを含んでなる方法。
【請求項９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、血漿インスリンまたは血漿インスリンに対する感受性を増加させるための使用。
【請求項１０】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の血漿インスリンに対する感受性の血漿インスリンを増加させるための使用。
【請求項１１】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中グルコース濃度を降下させるための使用。
【請求項１２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、２型糖尿病または前糖尿病の食後血中インスリン分泌を増加させるための使用。
【請求項１３】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰが食事補助剤の形態である請求項２〜１２のいずれか一項に記載のＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の使用。
【請求項１４】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、ストレスの作用の治療処置用機能性食製品の製造のための使用。
【請求項１５】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の局所適用における、好ましくはパーソナルケア適用における使用。
【請求項１６】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩の、飼料およびペットフードにおける使用。
【請求項１７】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる医薬品。
【請求項１８】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食事補助剤。
【請求項１９】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を活性成分として含んでなる食品。
【請求項２０】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を医薬品または健康上の利益として含んでなる組成物。
【請求項２１】
前記健康上の利益がストレスの作用の処置である組成物であって、好ましくは前記組成物が食品または飼料である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／またはＩＴＰの塩を局所剤としての使用のため、好ましくはパーソナルケアにおける使用のため含んでなる組成物。
【請求項２３】
ローション、ゲルまたはエマルジョンである請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
イソロイシン、スレオニンおよびプロリンを共役してＩＴＰを形成すること、および場合によりＴＴＰをその塩に変換することによる化学合成を含んでなるＩＴＰまたはＩＴＰの塩の生産。
【請求項２５】
メチオニン、アラニンおよびプロリンを共役してＭＡＰを形成すること、および場合によりＭＡＰをその塩に変換することによる化学合成を含んでなるＭＡＰまたはＭＡＰの塩の生産。
【請求項２６】
タンパク質からのＭＡＰおよび／またはＩＴＰの産生能を有する好適な微生物による好適な前記タンパク質の発酵を含んでなるＭＡＰおよび／またはＩＴＰの製造。
【請求項２７】
前記タンパク質がカゼインであるとともに好ましくは前記微生物が乳酸を産生しているＭＡＰおよび／またはＩＴＰの生産。
【公表番号】特表２００８−５３９２０３（Ｐ２００８−５３９２０３Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０８２２４（Ｐ２００８−５０８２２４）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１８７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４４３９
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１８７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４４３９
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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