新規溶菌酵素、その製造方法およびその用途
【課題】高い溶菌活性および広い溶菌スペクトルを有する新規な溶菌酵素を提供する。
【解決手段】溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た９３３個のヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子およびそのコードするアミノ酸配列からなるタンパク質；該ＤＮＡを含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞；該宿主細胞を培養してタンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法；並びに該タンパク質を有効成分として含有する組成物、特には研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質。
【解決手段】溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た９３３個のヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子およびそのコードするアミノ酸配列からなるタンパク質；該ＤＮＡを含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞；該宿主細胞を培養してタンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法；並びに該タンパク質を有効成分として含有する組成物、特には研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な溶菌酵素、その製造方法およびその用途に関する。より具体的には、溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た遺伝子によりコードされる新規な溶菌酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正細菌はグラム陽性菌とグラム陰性菌とに大別でき、構造的に異なる細胞壁をそれぞれ有している。この細胞壁の主成分は糖鎖とペプチドとの化合物：ペプチドグリカンであるが、さらに分子構造の差異によりムレインとシュードムレインに大別することができる。そして細胞壁を分解する加水分解酵素、所謂溶菌酵素は、近年著しく発展しつつある生命工学分野および医療分野において大きな重要性を有する。例えば、遺伝子の調製、遺伝子組換タンパク質の生産等では細菌の細胞壁を破壊する必要が有るため、溶菌酵素は必須な手段として用いられている。また、溶菌酵素をコードする遺伝子を使用し、発酵スターター細菌の人為的な溶菌制御等、発酵産業への応用も試みられている。
【０００３】
さらに、ペプチドグリカンは細菌の細胞壁に特異的な構造であるため、病原細菌の細胞壁を加水分解することにより、溶菌酵素を病原細菌の撲滅に使用できる。病原細菌の撲滅では、溶菌酵素は従来の抗生物質と攻撃機序が異なるため、抗生物質等に耐性を有する薬剤耐性菌にも有効であり、また攻撃対象がペプチドグリカンであるため、細菌にのみ選択的に作用して他の細胞への副作用はないという利点を有する。さらに溶菌酵素がタンパク質であることから、環境汚染に関する問題も回避できる。
【０００４】
現在市販されている溶菌酵素剤としては、例えば、ムタノリシン（シグマ社、和光純薬工業株式会社）、リゾスタフィン（シグマ社、和光純薬工業株式会社）、ラビアーゼ（生化学工業株式会社）等が挙げられる。これらのうち、ムタノリシンは２種のタンパク質Ｍ１およびＭ２の混合物であり、タンパク質Ｍ１はムラミダーゼ族に属することが知られているが、タンパク質Ｍ２については不明である。またラビアーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ムラミダーゼ等を主体とする複合酵素剤である。
【０００５】
ところで乳酸菌は、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、エンドペプチダーゼ、トランスグリコシラーゼ、カルボキシペプチダーゼを含む多数の細胞壁分解酵素を有することが報告されている（例えば非特許文献１参照）。これは細菌のペプチドグリカン（ムレイン）の分解を触媒し、そしてそれらの細胞成長および細胞分裂における機能が細胞壁合成、娘細胞分離等において確かめられている（例えば非特許文献２参照）。
【０００６】
一般に、乳酸菌が有するムラミン加水分解酵素はオートリシンとエンドリシンの２つの群に分けることができる。該オートリシンは、細菌のリボソームによりコードされたムレインの分解およびそれによる溶菌を可能とする酵素である（例えば非特許文献３参照）。しかしながら、Lactobacillus lactis MG1363によりコードされる酵素をを除き、構造および機能は分子および遺伝子レベルまで明らかにされている乳酸菌のオートリシンはない（例えば非特許文献３参照）。
【０００７】
他方、前記エンドリシンはファージが保有する溶菌酵素である。該エンドリシンは、宿主細胞自身が持つオートリシンより強い活性を有すると想定されており、そしてラクトコッカスファージφLC3（例えば非特許文献４参照）、Tuc2009（例えば非特許文献５参照）、φvML3（例えば非特許文献６参照）およびr1t（例えば非特許文献７参照）、並びにラ
クトバチルスファージφadh（例えば非特許文献８参照）、LL-H（例えば非特許文献９参照）、mv1（例えば非特許文献１０参照）、mv4（例えば非特許文献１１参照）およびφg1e（例えば非特許文献１２参照）に由来するものを含み、約３０種のエンドリシンをコードする溶菌遺伝子が報告されている。
【０００８】
しかしながら現在に至るまで、生化学的特性が分子レベルおよび遺伝子レベルまで解析されている溶菌酵素は少なく、特にブドウ球菌、肺炎球菌等の病原細菌が属するグラム陽性菌に有効な溶菌酵素に関する知見は乏しい。また溶菌酵素として商品化されているもの価格は非常に高価であり、また溶菌活性および溶菌スペクトルについても問題が残るものであった。
【非特許文献１】Delcour, J., Ferain, T., Deghorain, M., Palumbo, E., Pascal Hols, P., 1999. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 76, 159-184.
【非特許文献２】Cleveland, R.F., Holtje, J.-V., Wicken, A.J., Tomasz, A., Daneo-Moore, L., Shockman, G.D., 1975. Inhibition of bacterial wall lysins by lipoteichoic acids and related compounds. Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 1128-1135.
【非特許文献３】Buist, G., Karsens, H., Nauta, A., van Sinderen, D., Venema, G., Kok, J. 1997. Autolysis of Lactococcus lactis caused by induced overproduction of its major autolysin, AcmA. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2722-2728.
【非特許文献４】Birkeland, N.-K., 1994. Cloning, molecular characterization, and expression of the genes encoding the lytic functions of lactococcal bacteriophage φLC3: a dual lysis system of molecular design. Can. J. Microbiol. 40, 658-665.
【非特許文献５】Arendt, E. K., Daly, C., Fitzgerald, G. F., van de Guchte,M., 1994. Molecular characterization of lactococcal bacteriophage Tuc2009 and identification and analysis of genes encoding lysin, a putative holin, and two structural proteins. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1875-1883.
【非特許文献６】Shearman, C.A., Jury, K.L., Gasson, M.J., 1994. Controlled expression and structural organization of a Lactococcus lactis bacteriophage lysin encoded by two overlapping genes. Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063-73.
【非特許文献７】van Sinderen, D., Karsens, H., Kok, J., Terpstra, P., Ruiters, M. H. J., Venema, G., Nauta, A., 1996. Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage r1t. Mol. Microbiol. 19,1343-1355.
【非特許文献８】Henrich, B., Binishofer, B., Blasi, U., 1995. Primary structure and functional analysis of the lysis genes of Lactobacillus gasseri bacteriophage φadh. J. Bacteriol. 177, 723-732.
【非特許文献９】Vasala, A., Valkkila, M., Caldentey, J., Alatossava, T., 1995. Genetic and biochemical characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage LL-H lysin. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4004-4011.
【非特許文献１０】Boizet, B., Lahbib-Mansais, Y., Dupont, L., Ritzenthaler, P., Mala, M., 1990. Cloning, expression and sequence analysis of an endolysin-encoding gene of Lactobacillus bulgaricus bacteriophage mv1. Gene 94, 61-67.
【非特許文献１１】Dupont, L., Vasala, A., Mikkonen, M., Boizet-Bonhoure, B., Alatossava, T., Ritzenthaler, P., 1993. GenBank accession no. Z26590.
【非特許文献１２】Oki, M., Kakikawa, M., Yamada, K., Taketo, A., Kodaira, K. -I., 1996. Cloning, sequence analysis, and expression of the gene encoding lytic functions of bacteriophage φg1e. Gene 176, 215-223.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、高い溶菌活性および広い溶菌スペクトルを有する新規な溶菌酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから新規な溶菌酵素の遺伝子を分離した。そして該遺伝子が産生するタンパク質の大量産生系を構築し、得られたタンパク質の生化学的特性を検討したところ、既知の同種の酵素群と比較して、高い溶菌活性を示し、また広い溶菌スペクトルを有することを確認して本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の１ないし１４の観点に関する；
［１］
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
［２］
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質。
［３］
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、上記［３］に記載の遺伝子。
［４］
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、溶菌活性を有するタンパク質。
［５］
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行
われることを特徴とする、上記［４］に記載のタンパク質。
［６］
上記［１］ないし［３］のうちの何れか１つに記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。［７］
発現ベクターであることを特徴とする、上記［６］に記載の組換えプラスミド。
［８］
上記［６］または［７］に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
［９］
グラム陽性細菌であることを特徴とする、上記［８］に記載の宿主細胞。
［１０］
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、上記［９］に記載の宿主細胞。
［１１］
以下の工程１）および２）を含む、上記［４］または［５］に記載のタンパク質の製造方法；
１）上記［８］ないし［１０］のうちの何れか１つに記載の宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、溶菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
［１２］
上記［１１］に記載の製造方法により得られるタンパク質。
［１３］
上記［２］または［３］に記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
［１４］
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、上記［１３］に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高い溶菌活性および広い溶菌スペクトルを有する新規な溶菌酵素が提供される。そして該溶菌酵素は生命工学分野および医療分野の用途への適用、特に研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等の有効成分として好ましく使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の遺伝子は、ヒトの健康維持における善玉菌として知られているプロバイオティクバクテリアに属する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tより得ることができる。該Lactobacillus gasseri JCM1131Tは、対数増殖後培養液から菌体を集め緩衝液中に懸濁すると顕著な自己溶菌を示し、また、この菌の培養液上清をザイモグラム法で解析すると５４ｋＤａおよび３５ｋＤａの溶菌活性を有するタンパク質が見出された。この知見に鑑み、本発明者は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌機構おおび溶菌酵素遺伝子に関する知見を得るために分子レベルでの解析を行った。
【００１４】
始めに、Lactobacillus gasseri JCM1131Tのゲノムライブラリを大腸菌プラスミドを用いて構築し、溶菌活性を指標にスクリーニングした。その結果、それぞれ約３．２ｋｂｐおよび約３．９ｋｂｐの溶菌活性を有する２クローンを得た。これらのクローンは、３’末端の一部の配列を除いて殆ど同一の塩基配列を有し、そして双方のクローン共に、Lactobacillus jonsonii由来の溶菌酵素と相同性を示す３１０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
【００１５】
次いで、大腸菌内で前記タンパク質の誘導発現を試みると、約３３ｋＤａのタンパク質
の発現を認められ、さらにザイモグラム法により、このタンパク質がムラミダーゼ族に属し、Lactobacillus属、Staphylococcus属等のグラム陽性菌に対し幅広い溶菌スペクトルを示すことが判明した。この結果より、Lactobacillus gasseri JCM1131Tは溶原ファージを保有すると推定し、紫外線照射によりファージ誘発を行ったところ、菌の培養液の濁度減少が観察され、そして培養液上清より、正多面体のヘッドと非収縮性のテールを有するファージ：φｇａＹを検出した。該タンパク質の至適ｐＨは６．５〜７．５、至適温度は３７℃であって、２価陽イオン依存は認められなかった。
【００１６】
従って本発明の遺伝子の１つの例は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tのゲノムライブラリから得た前記２つのクローンに共通し３１０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする領域に相当する以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡからなる遺伝子も、溶菌活性を示す限り本発明に包含される。
【００１７】
また、本発明の遺伝子の他の例は、下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるもの、および下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と９５％以上のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるものが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１８】
本発明の遺伝子のさらなる例は、前記３１０個のアミノ酸に相当する以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。ここで、各アミノ酸に対応するコドンは任意に選択でき、また例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。
【００１９】
他方、本発明のタンパク質の例としては、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明に包含される。
【００２０】
また、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、溶菌活性を有する限り本発明に包含される。ここで数個とは、１０個を超えない数であり、好ましくは５個以下である。
【００２１】
ここで、あるＤＮＡが以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば以下の手順により決定できる：先ず、目的とするＤＮＡをランダムプライマー法、ニックトランスレーション法等に従いプローブを用いて標識する。次いで、ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡを公知の方法、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線照射により固相化する。その膜をその後、例えば６×ＳＳＣ、５％デンハート溶液および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、５５℃で４時間以上保温する。ここで先に作成した標識プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６０℃で一晩保温する。膜を５７℃で５分間洗浄する操作を５回繰り返し、さらに５７℃で２０分間洗浄後、オートラジオグラフィーを行うこ
とにより、ハイブリダイズしたか否かを判定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションの条件は前記条件に限定されず、ストリンジェントな条件下であればよい。本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことからなるハイブリダイゼーションを指す。さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこともできる。
【００２３】
また、本発明のタンパク質が溶菌活性を有するか否かは、通常の方法により評価できる。より詳しくは、以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた溶菌活性試験を、アミノ酸の欠失、置換および／または付加により生成した改変タンパク質に対して行うことにより、該改変タンパク質の溶菌活性の有無を決定できる。
【００２４】
ところで、本発明のタンパク質と他の溶菌酵素との相同性比較および三次元構造予測を行った結果、本発明のタンパク質の活性ドメインであるＮ末端領域は、β／α−バレル構造を有することが示唆された。そして以下の配列番号２における、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸またはアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸の何れかがプロトンまたは電子対の供与体として働いていることが推測された。他方、Ｃ末端領域は細胞壁認識ドメインを形成すると推測された。
【００２５】
この知見に従い、上記４つのアミノ酸に加えて、アミノ酸番号３３のグルタミン酸およびアミノ酸番号３６のアスパラギン酸について、各々をアラニンに置換した変異体を構築し、その溶菌活性を調査した。すると、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸またはアミノ酸番号９８のグルタミン酸を置換した変異体は略完全に溶菌活性を失い、またアミノ酸番号９６のアスパラギン酸またはアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸を置換した変異体の溶菌活性は低下した。他方、アミノ酸番号３６のアスパラギン酸を置換した変異体の溶菌活性は、未置換の野生株と略同等であった。またさらに無作為変異の導入により、アミノ酸番号１０のグリシンをセリンに置換した変異体、およびアミノ酸番号６０のヒスチジンをアルギニンに置換した変異体もまた溶菌活性を失うことを見出した。またβ／α−バレル構造のみを発現させた場合にも、溶菌活性を示さないことも見出した。
【００２６】
従って本発明の遺伝子およびタンパク質では、前記アミノ酸の欠失、置換および／または付加が、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることが好ましい。
【００２７】
また本発明のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドも本発明に包含される。該ベクターとしては、一般に知られている様々なベクターを使用でき、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクター等があるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換できる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることができ好ましい。
【００２８】
本発明の組換えプラスミドを各種細胞に導入することにより得られる宿主細胞も本発明に包含される。該宿主細胞として好ましいのは、グラム陽性細菌、特に大腸菌、乳酸菌、枯草菌、ブドウ球菌等である。
【００２９】
本発明のタンパク質は、前記組換えプラスミドにより形質転換した前記宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、該培養により得た培養物から溶菌活性を有するタンパク質を回収することにより製造できる。宿主細胞の培養方法およびタンパク質の回収方法としては従来一般に知られている方法が使用可能であり、例えば以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた方法により行うことができる。
【００３０】
本発明はまた、本発明のタンパク質を有効成分として含有してなる組成物に関する。該組成物は、細菌の細胞壁を分解することが必要となるか、または細胞壁の分解により細菌を死滅させることが必要となる様々な用途に適用できる。該用途としては、具体的には、研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等が挙げられる。
【００３１】
特に、ペプチドグリカンは細菌の細胞壁に特異的な構造であるため、本発明のタンパク質は病原細菌の撲滅に使用できる。本発明のタンパク質は従来用いられている抗生物質と異なる作用機序により病原細菌を死滅させるので、従来の抗生物質によって死滅させることが困難な病原細菌、所謂抗生物質耐性菌に対しても有効であり得る。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の抗生物質耐性菌は近年特に院内感染等において大きな問題となっており、よって本発明のタンパク質は“酵素抗生物質”として好ましく適用できる。また本発明のタンパク質は、ペプチドグリカンからなる細胞壁を有する細菌にのみ作用するので、投与対象の他の細胞には作用せず、副作用を招く惧れがない。さらに本発明のタンパク質は、化学的に安定な物質である従来の抗生物質と比較して、環境中の放出されたときの負荷も小さい。
【００３２】
以下、本発明を具体的な例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定することを意図しない。
【実施例１】
【００３３】
Lactobacillus gasseri JCM1131Tからの溶菌活性遺伝子の分離
Lactobacillus gasseri JCM1131T（寄託番号：ＡＴＣＣ３３３２３）の全ＤＮＡを以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）に従って調製した。
Lactobacillus gasseri JCM 1131Tを、ＭＲＳ培地（ディフコ社製）を用い、３７℃で一晩静置培養（１２時間）した。該培養菌を新たなＭＲＳ培地（１０ｍＬ）に植え継ぎ、菌数が５×１０8／ｍＬに達したとき、遠心分離法（冷却遠心機、日立製作所製：１００００ｒｐｍ、４℃、１０分）で菌体を回収し、滅菌水およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で遠心洗浄後、溶菌酵素反応緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２％ＰＥＧ６０００）に懸濁した。ムタノリシン（和光純薬工業社製、２μｇ／μＬ）を２μｌ添加し、６０℃で２．５時間、次いで、プロテイナーゼＫ（タカラ社製、０．４ｍｇ／μｌ）を２０μｌ添加し、３７℃で１時間処理した。ＳＤＳ（３％）を５００μｌ添加し、室温で３０分間保温し、次いで遠心分離法で菌体ＤＮＡを含む粗抽出液（上清分画）を得た。菌体ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム処理で部分精製し、組換えプラスミドの作成に用いた。
こうして抽出したＤＮＡを、ショットガンクローニングのために制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断して、３１７１ｂｐおよび３７６８ｂｐの２種のＤＮＡフラグメントを得た。
【００３４】
次いで、該２種のＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＵＣ１１８（３１６２ｂｐの大腸菌ベクター、Ａｍｐr、ｐｌａｃ、ｌａｃＺ’）のＢａｍＨＩサイト中にクローニングして、２つの組換えプラスミド：ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２を得た。
組換えプラスミドの作成は以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)）で行った。
上記の菌体ＤＮＡ（５０μｇ）を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（０．２単位）で、３７℃、１時間部分切断した。プラスミドｐＵＣ１１８のＤＮＡをＢａｍＨＩで完全分解し、線状ＤＮＡ分子を得た。該部分切断菌体ＤＮＡ（３μｇ）と線状ｐＵＣ１１８ＤＮＡ（０．５μｇ）を混合し、ＤＮＡ結合酵素（４００単位）を加えた。１６℃で１６時間の結合反応により組換えプラスミドを作成した。
また同様にして、該組換えプラスミドを使用して以下の３つの組換えプラスミドを得た（図１参照）：
・ｐ１１９ｇａＹ３
ｐ１１８ｇａＹ１のＭｆｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（１１３８ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトにクローニングして入手。
・ｐ１１９ｇａＹ４
ｐ１１９ｇａＹ３のＳｍａＩ／ＸｂａＩフラグメント（５１３ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングして入手。
・ｐ１１９ｇａＹ５
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩフラグメント（９８０ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングして入手。
【００３５】
こうして得た５つの組換えプラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ４６、ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ-、Ｆ’［ｐｒｏＡＢ+、ｌａｃＩq、ｌａｃＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（Ｔｅｔr）］）中に導入して形質転換体を得た。
詳細には、先ず大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅをＬＢ（Luria-Bertain）培地を用い、３７℃で培養した。一晩（１２時間）経過後、培養菌２ｍＬを新鮮なＬＢ培地１００ｍＬに植え継ぎ、３７℃で培養した。菌数が５×１０8／ｍｌに達したとき、上記と同様の遠心分離法で集菌した。菌体を滅菌水で３度洗浄し、１００μＬの蒸留水に懸濁した。該懸濁液に１μＬの組換えプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ）とＰＥＧ６０００（１０％）を添加した。大腸菌体内への該組換えプラスミドの導入は、ジーンパルサー（登録商標、バイオラッド社製）を用い、電圧１．７５ｋＶ／ｃｍ、静電容量２５μＦ、抵抗６００Ωの電気パルス条件を用いたエレクトロポレーション法で行った。電気パルス処理後、ＬＢ培地を４倍量加え、３７℃で３０分間保温し、形質転換体を得た。
【００３６】
該形質転換体を、１×１０9／ｍＬのオートクレーブにより失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞、０．１％のトリトンＸ−１００ｎ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ（Luria-Bertani）培地中、３７℃で２４時間培養し、その後４℃で２４時間定温放置した。より詳しい条件は以下の通りである：
Lactobacillus gasseri JCM 1131TをＬＢ培地で一晩培養した。集菌後、蒸留水で二回洗浄した後、オートクレーブ（加熱蒸気圧滅菌：三洋電気社製）を用い、１１０℃、１．５気圧で１５分間加熱処理した。１×１０9／ｍＬに相当する該加熱処理菌体と、０．１％のトリトンＸ−１００ｎ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む固形ＬＢ寒天培地（プレート）を径９ｃｍのシャーレに作成した。１ｍＭのＩＰＴＧと共に該形質転換体を該寒天プレートに塗布し、３７℃で２４時間培養した。生成した菌体コロニーを４℃で２４時間放置し、溶菌斑を生じる形質転換体を選別分離した。
【００３７】
次いで、前記培養プレートを、オートクレーブにより失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞に対する、トリトンＸ−１００誘導溶菌表現型についてスクリーニングした。
その結果、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌は、ＩＰＴＧでの誘導により約３３ｋＤａの同じ分子量を持つタンパク質を産生し、該タンパク質は失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞に対し溶菌活性を示した。その結果、これらの形質転換体のコロニーの周囲には明らかなハロ領域が形成した（図２参照）。
組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌を３７℃で時間を変えて培養し、培養により産生したタンパク質をＳＤＳゲル上での電気泳動により分析した結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）は、培養時間が最も短いもの（最も左側のレーン）から最も長いもの（最も右側のレーン）に増加するにつれて、約３３ｋＤａのタンパク質（矢印部分）の産生が増加したことを明らかに示している。
また、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌による約３３ｋＤａのタンパク質の産生を、他のプラスミドで形質転換した大腸菌と比較した結果を図３（Ｂ）に示す。レーン１はマーカーであり、レーン２ないしレーン５はｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌をそれぞれ０、１、２および３時間培養した結果であり、レーン６ないし９はｐ１１８ｇａＹ１で形質転換した大腸菌をそれぞれ０、１、２および３時間培養した結果である。これにより、プラスミドｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌は約３３ｋＤａのタンパク質（矢印部分）の産生を誘導しないのに対し、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌は、時間と共に該タンパク質を産生することが解る。
【実施例２】
【００３８】
ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２の配列決定
Lactobacillus gasseriの全遺伝子ショットガン配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＺ＿ＡＡＡ００２０００００６）に基き、ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２の挿入ＤＮＡフラグメントの配列を決定した（。決定したＤＮＡ配列の物理マップを図１に示す。
図１に示すように、ｐ１１８ｇａＹ１に挿入したＤＮＡフラグメントは、ｏｒｆ１４９、ｏｒｆ９２、ｈｏｌｇａＹ、ｌｙｓｇａＹ、ｏｒｆ３５およびｍｎａＡｇａＹ１をコードし、またｐ１１８ｇａＹ２に挿入したＤＮＡフラグメントは、ｏｒｆＸｇａＹ１、ｏｒｆ１６９、ｏｒｆ１４９、ｏｒｆ９２、ｈｏｌｇａＹ、ｌｙｓｇａＹ、ｏｒｆ３５ｉｎｔｇａＹをコードしていた。
これらのうちｈｏｌｇａＹとｏｒｆ３５との間に位置するｌｙｓｇａＹは、その分子量が３３．７ｋＤａであると推計される３１０アミノ酸からなるタンパク質であり、そして該タンパク質の分子量は、ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌がＩＰＴＧ誘導により産生し溶菌活性の要因と推測されるタンパク質の分子量と同一であった。これらの理由により、ｌｙｓｇａＹをLactobacillus gasseri JCM1131Tが産生する溶菌性タンパク質であると決定した。ｌｙｓｇａＹをコードするヌクレオチド配列を以下の配列番号１に、また該ヌクレオチド配列によりコードされるｌｙｓｇａＹのアミノ酸配列を以下の配列番号２に示す。またｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子の境界領域を図４に図示する。図４は境界領域のみを示し、Ｎ末端とＣ末端の間の中間部分は省略されている。また図４において、ｌｙｓｇａＹの下流に存在する転写終結因子として機能し得る３８塩基のステム−ループ２次構造を矢印で示す。
【００３９】
ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌が産生した３３ｋＤａのタンパク質がｌｙｓｇａＹであることを確認するために、ｌｙｓｇａＹのみを含むＭｆｅｌ／ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８に挿入して組換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３を入手し、上記と同様にしてｐ１１９ｇａＹ３により大腸菌を形質転換し、そしてｌｙｓｇａＹの誘導発現を試みた。その結果、ｐ１１９ｇａＹ３は予測通り３３ｋＤａのタンパク質（ｌｙｓｇａＹ）を産生した。
【実施例３】
【００４０】
ｌｙｓｇａＹの溶菌活性評価
ｌｙｓｇａＹの溶菌活性を、オートクレーブにより失活させた３種のグラム陽性菌：Lactobacillus gasseri JCM1134T、Staphylococcus warneri MおよびMicrococcus luteusについて評価し、その溶菌活性を市販の溶菌酵素剤であるムタノリシンおよび卵白リゾチーム（共にシグマ社製）のものと比較した。
オートクレーブ処理した３種類の菌体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁し、６６０ｎｍでの吸光度が０．５となるように調整した。次いで、ｌｙｓｇａＹ０．０６μｇ／μＬを添加し３７℃で保温した。スペクトロニック２０（ミルトン・ロイ社製）を用い、６６０ｎｍでの吸光度の経時変化を１５分ごとに測定して、活性評価試験を行った。
上記した６６０ｎｍでの吸光度の経時変化を、各タンパク質について、吸光度を縦軸（ＯＤ660）に、また時間（分）を横軸にとったグラフとして図５に示す。
また得られた各タンパク質の酵素活性（Ｕ／μｇ）を、３種の基質毎に表１に示す。
【表１】
【００４１】
試験結果から明らかなように、本発明のタンパク質であるｌｙｓｇａＹは３種全ての基質に対して溶菌活性を示した。特にLactobacillus gasseri JCM1134Tに対する溶菌活性は高く、ムタノリシンの溶菌活性に匹敵していた。
他方、卵白リゾチームはLactobacillus gasseri JCM1134Tに対する溶菌活性を殆ど示さなかった。
【実施例４】
【００４２】
ｌｙｓｇａＹの溶菌スペクトル評価
ｌｙｓｇａＹの溶菌スペクトルを、オートクレーブで失活させた様々なグラム陽性菌を基質として、以下の手順に従い評価した：
ＬｙｓｇａＹの溶菌スペクトルをザイモグラフィー法を用い以下の手順で評価した。
各グラム陽性菌をオートクレーブ処理して基質とした。該基質（湿潤、２％ｗｔ／ｖｏｌ）を含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０％）を作成し、ＬｙｓｇａＹを電気泳動した。次いで泳動終了ゲルを、０．１％のトリトンＸ−１００ｎを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、３７℃で２４時間保温した。その後、０．１％のメチレンブルーで染色し、溶菌活性を検出した。
結果を表２に示す。表２では＋＋＋が強い溶菌活性を、＋＋が中程度の溶菌活性を、＋が弱い溶菌活性を示し、そして−は溶菌活性が検出されなかったことを示す。また比較の目的で同様に評価したLactobacillus plantarum G1e phage φg1eがコードするエンドリシン：Ｌｙｓｇｌｅの溶菌スペクトルを共に示す。
【表２】
【００４３】
表２に示す結果から明らかなように、、本発明のタンパク質であるｌｙｓｇａＹは、試験した１８種のグラム陽性菌のうち、Staphylococcus haemolyticusを除く全てについて少なくとも弱い溶菌活性を示し、その殆どでは中程度以上の溶菌活性を示した。これらの結果より、ｌｙｓｇａＹが広い溶菌スペクトルを有することを確認できた。
他方、Ｌｙｓｇｌｅは僅かに２種のグラム陽性菌でのみしか溶菌活性を示さず、また示した溶菌活性もｌｙｓｇａＹのものと比較すると弱かった。
【００４４】
・配列番号１：ｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子のヌクレオチド配列
atg gtt gaa gta gct aaa aga agt tac ggt gta gat gta tca agt cat aac aac ggc aat tat tcc gga tcg aaa ttt gcc gtt gtt aaa gtg tca gag ggc tta gat tat cgt aat cct aaa gca caa tct caa gta tct act gca aga gct aat agt atg ttg cca atg gct tat cac tat gcg agg ttt agt ggc aat agt aac gta gca att caa gaa ggt aac tat gca gtt act tct gca aaa gct gtt ggt ctt gag gca ggt act tac tta gct tgt gac tat gaa caa gga agt gga aac gaa act aga gga gat cgt gaa act aat acg act gct atc tta tct ttc tta gat act att gtg ggt gct ggt tat aag cct tta cta tac tca ggc gct tat ctt atg aga gac aaa att aat act tct aga att tta gcc aag tat cct aat tgt ttg tgg gta gca gca tat cca tca ggt aat ggt act gcg gta agt gaa cca aac ttt ggc tac ttt cca tca atg aac gga gta gca att tgg caa ttt acc gat aac tgg cgt ggg tta aat gtt gac gga aac atc agc ttg att gat cta aaa aat gat agc aaa cca gta gct cag cca tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【００４５】
・配列番号２：ｌｙｓｇａＹのアミノ酸配列
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１の組換えプラスミドが含むＤＮＡフラグメントを図示する物理マップであり、（Ａ）はｐ１１８ｇａＹ１、ｐ１１８ｇａＹ３、ｐ１１８ｇａＹ４およびｐ１１９ｇａＹ５を示し、（Ｂ）はｐ１１８ｇａＹ２を示す。
【図２】図２は、実施例１における形質転換大腸菌の培養結果の写真を表す図である。
【図３】図３は、実施例１において形質転換大腸菌が産生したタンパク質の電気泳動結果の写真を表す図であり、（Ａ）は時間を変えたときの結果を表し、そして（Ｂ）はｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌によるタンパク質の産生を他のプラスミドで形質転換したもの比較した結果を表す。
【図４】図４は、ｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子の境界領域を図示する。
【図５】図５は、実施例４における溶菌活性評価の結果を図示するグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な溶菌酵素、その製造方法およびその用途に関する。より具体的には、溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た遺伝子によりコードされる新規な溶菌酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正細菌はグラム陽性菌とグラム陰性菌とに大別でき、構造的に異なる細胞壁をそれぞれ有している。この細胞壁の主成分は糖鎖とペプチドとの化合物：ペプチドグリカンであるが、さらに分子構造の差異によりムレインとシュードムレインに大別することができる。そして細胞壁を分解する加水分解酵素、所謂溶菌酵素は、近年著しく発展しつつある生命工学分野および医療分野において大きな重要性を有する。例えば、遺伝子の調製、遺伝子組換タンパク質の生産等では細菌の細胞壁を破壊する必要が有るため、溶菌酵素は必須な手段として用いられている。また、溶菌酵素をコードする遺伝子を使用し、発酵スターター細菌の人為的な溶菌制御等、発酵産業への応用も試みられている。
【０００３】
さらに、ペプチドグリカンは細菌の細胞壁に特異的な構造であるため、病原細菌の細胞壁を加水分解することにより、溶菌酵素を病原細菌の撲滅に使用できる。病原細菌の撲滅では、溶菌酵素は従来の抗生物質と攻撃機序が異なるため、抗生物質等に耐性を有する薬剤耐性菌にも有効であり、また攻撃対象がペプチドグリカンであるため、細菌にのみ選択的に作用して他の細胞への副作用はないという利点を有する。さらに溶菌酵素がタンパク質であることから、環境汚染に関する問題も回避できる。
【０００４】
現在市販されている溶菌酵素剤としては、例えば、ムタノリシン（シグマ社、和光純薬工業株式会社）、リゾスタフィン（シグマ社、和光純薬工業株式会社）、ラビアーゼ（生化学工業株式会社）等が挙げられる。これらのうち、ムタノリシンは２種のタンパク質Ｍ１およびＭ２の混合物であり、タンパク質Ｍ１はムラミダーゼ族に属することが知られているが、タンパク質Ｍ２については不明である。またラビアーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ムラミダーゼ等を主体とする複合酵素剤である。
【０００５】
ところで乳酸菌は、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、エンドペプチダーゼ、トランスグリコシラーゼ、カルボキシペプチダーゼを含む多数の細胞壁分解酵素を有することが報告されている（例えば非特許文献１参照）。これは細菌のペプチドグリカン（ムレイン）の分解を触媒し、そしてそれらの細胞成長および細胞分裂における機能が細胞壁合成、娘細胞分離等において確かめられている（例えば非特許文献２参照）。
【０００６】
一般に、乳酸菌が有するムラミン加水分解酵素はオートリシンとエンドリシンの２つの群に分けることができる。該オートリシンは、細菌のリボソームによりコードされたムレインの分解およびそれによる溶菌を可能とする酵素である（例えば非特許文献３参照）。しかしながら、Lactobacillus lactis MG1363によりコードされる酵素をを除き、構造および機能は分子および遺伝子レベルまで明らかにされている乳酸菌のオートリシンはない（例えば非特許文献３参照）。
【０００７】
他方、前記エンドリシンはファージが保有する溶菌酵素である。該エンドリシンは、宿主細胞自身が持つオートリシンより強い活性を有すると想定されており、そしてラクトコッカスファージφLC3（例えば非特許文献４参照）、Tuc2009（例えば非特許文献５参照）、φvML3（例えば非特許文献６参照）およびr1t（例えば非特許文献７参照）、並びにラ
クトバチルスファージφadh（例えば非特許文献８参照）、LL-H（例えば非特許文献９参照）、mv1（例えば非特許文献１０参照）、mv4（例えば非特許文献１１参照）およびφg1e（例えば非特許文献１２参照）に由来するものを含み、約３０種のエンドリシンをコードする溶菌遺伝子が報告されている。
【０００８】
しかしながら現在に至るまで、生化学的特性が分子レベルおよび遺伝子レベルまで解析されている溶菌酵素は少なく、特にブドウ球菌、肺炎球菌等の病原細菌が属するグラム陽性菌に有効な溶菌酵素に関する知見は乏しい。また溶菌酵素として商品化されているもの価格は非常に高価であり、また溶菌活性および溶菌スペクトルについても問題が残るものであった。
【非特許文献１】Delcour, J., Ferain, T., Deghorain, M., Palumbo, E., Pascal Hols, P., 1999. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 76, 159-184.
【非特許文献２】Cleveland, R.F., Holtje, J.-V., Wicken, A.J., Tomasz, A., Daneo-Moore, L., Shockman, G.D., 1975. Inhibition of bacterial wall lysins by lipoteichoic acids and related compounds. Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 1128-1135.
【非特許文献３】Buist, G., Karsens, H., Nauta, A., van Sinderen, D., Venema, G., Kok, J. 1997. Autolysis of Lactococcus lactis caused by induced overproduction of its major autolysin, AcmA. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2722-2728.
【非特許文献４】Birkeland, N.-K., 1994. Cloning, molecular characterization, and expression of the genes encoding the lytic functions of lactococcal bacteriophage φLC3: a dual lysis system of molecular design. Can. J. Microbiol. 40, 658-665.
【非特許文献５】Arendt, E. K., Daly, C., Fitzgerald, G. F., van de Guchte,M., 1994. Molecular characterization of lactococcal bacteriophage Tuc2009 and identification and analysis of genes encoding lysin, a putative holin, and two structural proteins. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1875-1883.
【非特許文献６】Shearman, C.A., Jury, K.L., Gasson, M.J., 1994. Controlled expression and structural organization of a Lactococcus lactis bacteriophage lysin encoded by two overlapping genes. Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063-73.
【非特許文献７】van Sinderen, D., Karsens, H., Kok, J., Terpstra, P., Ruiters, M. H. J., Venema, G., Nauta, A., 1996. Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage r1t. Mol. Microbiol. 19,1343-1355.
【非特許文献８】Henrich, B., Binishofer, B., Blasi, U., 1995. Primary structure and functional analysis of the lysis genes of Lactobacillus gasseri bacteriophage φadh. J. Bacteriol. 177, 723-732.
【非特許文献９】Vasala, A., Valkkila, M., Caldentey, J., Alatossava, T., 1995. Genetic and biochemical characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis bacteriophage LL-H lysin. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4004-4011.
【非特許文献１０】Boizet, B., Lahbib-Mansais, Y., Dupont, L., Ritzenthaler, P., Mala, M., 1990. Cloning, expression and sequence analysis of an endolysin-encoding gene of Lactobacillus bulgaricus bacteriophage mv1. Gene 94, 61-67.
【非特許文献１１】Dupont, L., Vasala, A., Mikkonen, M., Boizet-Bonhoure, B., Alatossava, T., Ritzenthaler, P., 1993. GenBank accession no. Z26590.
【非特許文献１２】Oki, M., Kakikawa, M., Yamada, K., Taketo, A., Kodaira, K. -I., 1996. Cloning, sequence analysis, and expression of the gene encoding lytic functions of bacteriophage φg1e. Gene 176, 215-223.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、高い溶菌活性および広い溶菌スペクトルを有する新規な溶菌酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから新規な溶菌酵素の遺伝子を分離した。そして該遺伝子が産生するタンパク質の大量産生系を構築し、得られたタンパク質の生化学的特性を検討したところ、既知の同種の酵素群と比較して、高い溶菌活性を示し、また広い溶菌スペクトルを有することを確認して本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の１ないし１４の観点に関する；
［１］
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
［２］
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質。
［３］
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、上記［３］に記載の遺伝子。
［４］
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、溶菌活性を有するタンパク質。
［５］
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行
われることを特徴とする、上記［４］に記載のタンパク質。
［６］
上記［１］ないし［３］のうちの何れか１つに記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。［７］
発現ベクターであることを特徴とする、上記［６］に記載の組換えプラスミド。
［８］
上記［６］または［７］に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
［９］
グラム陽性細菌であることを特徴とする、上記［８］に記載の宿主細胞。
［１０］
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、上記［９］に記載の宿主細胞。
［１１］
以下の工程１）および２）を含む、上記［４］または［５］に記載のタンパク質の製造方法；
１）上記［８］ないし［１０］のうちの何れか１つに記載の宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、溶菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
［１２］
上記［１１］に記載の製造方法により得られるタンパク質。
［１３］
上記［２］または［３］に記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
［１４］
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、上記［１３］に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高い溶菌活性および広い溶菌スペクトルを有する新規な溶菌酵素が提供される。そして該溶菌酵素は生命工学分野および医療分野の用途への適用、特に研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等の有効成分として好ましく使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の遺伝子は、ヒトの健康維持における善玉菌として知られているプロバイオティクバクテリアに属する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tより得ることができる。該Lactobacillus gasseri JCM1131Tは、対数増殖後培養液から菌体を集め緩衝液中に懸濁すると顕著な自己溶菌を示し、また、この菌の培養液上清をザイモグラム法で解析すると５４ｋＤａおよび３５ｋＤａの溶菌活性を有するタンパク質が見出された。この知見に鑑み、本発明者は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌機構おおび溶菌酵素遺伝子に関する知見を得るために分子レベルでの解析を行った。
【００１４】
始めに、Lactobacillus gasseri JCM1131Tのゲノムライブラリを大腸菌プラスミドを用いて構築し、溶菌活性を指標にスクリーニングした。その結果、それぞれ約３．２ｋｂｐおよび約３．９ｋｂｐの溶菌活性を有する２クローンを得た。これらのクローンは、３’末端の一部の配列を除いて殆ど同一の塩基配列を有し、そして双方のクローン共に、Lactobacillus jonsonii由来の溶菌酵素と相同性を示す３１０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
【００１５】
次いで、大腸菌内で前記タンパク質の誘導発現を試みると、約３３ｋＤａのタンパク質
の発現を認められ、さらにザイモグラム法により、このタンパク質がムラミダーゼ族に属し、Lactobacillus属、Staphylococcus属等のグラム陽性菌に対し幅広い溶菌スペクトルを示すことが判明した。この結果より、Lactobacillus gasseri JCM1131Tは溶原ファージを保有すると推定し、紫外線照射によりファージ誘発を行ったところ、菌の培養液の濁度減少が観察され、そして培養液上清より、正多面体のヘッドと非収縮性のテールを有するファージ：φｇａＹを検出した。該タンパク質の至適ｐＨは６．５〜７．５、至適温度は３７℃であって、２価陽イオン依存は認められなかった。
【００１６】
従って本発明の遺伝子の１つの例は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tのゲノムライブラリから得た前記２つのクローンに共通し３１０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする領域に相当する以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡからなる遺伝子も、溶菌活性を示す限り本発明に包含される。
【００１７】
また、本発明の遺伝子の他の例は、下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるもの、および下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と９５％以上のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるものが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１８】
本発明の遺伝子のさらなる例は、前記３１０個のアミノ酸に相当する以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。ここで、各アミノ酸に対応するコドンは任意に選択でき、また例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。
【００１９】
他方、本発明のタンパク質の例としては、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明に包含される。
【００２０】
また、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、溶菌活性を有する限り本発明に包含される。ここで数個とは、１０個を超えない数であり、好ましくは５個以下である。
【００２１】
ここで、あるＤＮＡが以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば以下の手順により決定できる：先ず、目的とするＤＮＡをランダムプライマー法、ニックトランスレーション法等に従いプローブを用いて標識する。次いで、ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡを公知の方法、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線照射により固相化する。その膜をその後、例えば６×ＳＳＣ、５％デンハート溶液および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、５５℃で４時間以上保温する。ここで先に作成した標識プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６０℃で一晩保温する。膜を５７℃で５分間洗浄する操作を５回繰り返し、さらに５７℃で２０分間洗浄後、オートラジオグラフィーを行うこ
とにより、ハイブリダイズしたか否かを判定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションの条件は前記条件に限定されず、ストリンジェントな条件下であればよい。本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことからなるハイブリダイゼーションを指す。さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこともできる。
【００２３】
また、本発明のタンパク質が溶菌活性を有するか否かは、通常の方法により評価できる。より詳しくは、以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた溶菌活性試験を、アミノ酸の欠失、置換および／または付加により生成した改変タンパク質に対して行うことにより、該改変タンパク質の溶菌活性の有無を決定できる。
【００２４】
ところで、本発明のタンパク質と他の溶菌酵素との相同性比較および三次元構造予測を行った結果、本発明のタンパク質の活性ドメインであるＮ末端領域は、β／α−バレル構造を有することが示唆された。そして以下の配列番号２における、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸またはアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸の何れかがプロトンまたは電子対の供与体として働いていることが推測された。他方、Ｃ末端領域は細胞壁認識ドメインを形成すると推測された。
【００２５】
この知見に従い、上記４つのアミノ酸に加えて、アミノ酸番号３３のグルタミン酸およびアミノ酸番号３６のアスパラギン酸について、各々をアラニンに置換した変異体を構築し、その溶菌活性を調査した。すると、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸またはアミノ酸番号９８のグルタミン酸を置換した変異体は略完全に溶菌活性を失い、またアミノ酸番号９６のアスパラギン酸またはアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸を置換した変異体の溶菌活性は低下した。他方、アミノ酸番号３６のアスパラギン酸を置換した変異体の溶菌活性は、未置換の野生株と略同等であった。またさらに無作為変異の導入により、アミノ酸番号１０のグリシンをセリンに置換した変異体、およびアミノ酸番号６０のヒスチジンをアルギニンに置換した変異体もまた溶菌活性を失うことを見出した。またβ／α−バレル構造のみを発現させた場合にも、溶菌活性を示さないことも見出した。
【００２６】
従って本発明の遺伝子およびタンパク質では、前記アミノ酸の欠失、置換および／または付加が、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることが好ましい。
【００２７】
また本発明のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドも本発明に包含される。該ベクターとしては、一般に知られている様々なベクターを使用でき、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクター等があるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換できる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることができ好ましい。
【００２８】
本発明の組換えプラスミドを各種細胞に導入することにより得られる宿主細胞も本発明に包含される。該宿主細胞として好ましいのは、グラム陽性細菌、特に大腸菌、乳酸菌、枯草菌、ブドウ球菌等である。
【００２９】
本発明のタンパク質は、前記組換えプラスミドにより形質転換した前記宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、該培養により得た培養物から溶菌活性を有するタンパク質を回収することにより製造できる。宿主細胞の培養方法およびタンパク質の回収方法としては従来一般に知られている方法が使用可能であり、例えば以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた方法により行うことができる。
【００３０】
本発明はまた、本発明のタンパク質を有効成分として含有してなる組成物に関する。該組成物は、細菌の細胞壁を分解することが必要となるか、または細胞壁の分解により細菌を死滅させることが必要となる様々な用途に適用できる。該用途としては、具体的には、研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等が挙げられる。
【００３１】
特に、ペプチドグリカンは細菌の細胞壁に特異的な構造であるため、本発明のタンパク質は病原細菌の撲滅に使用できる。本発明のタンパク質は従来用いられている抗生物質と異なる作用機序により病原細菌を死滅させるので、従来の抗生物質によって死滅させることが困難な病原細菌、所謂抗生物質耐性菌に対しても有効であり得る。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の抗生物質耐性菌は近年特に院内感染等において大きな問題となっており、よって本発明のタンパク質は“酵素抗生物質”として好ましく適用できる。また本発明のタンパク質は、ペプチドグリカンからなる細胞壁を有する細菌にのみ作用するので、投与対象の他の細胞には作用せず、副作用を招く惧れがない。さらに本発明のタンパク質は、化学的に安定な物質である従来の抗生物質と比較して、環境中の放出されたときの負荷も小さい。
【００３２】
以下、本発明を具体的な例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定することを意図しない。
【実施例１】
【００３３】
Lactobacillus gasseri JCM1131Tからの溶菌活性遺伝子の分離
Lactobacillus gasseri JCM1131T（寄託番号：ＡＴＣＣ３３３２３）の全ＤＮＡを以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）に従って調製した。
Lactobacillus gasseri JCM 1131Tを、ＭＲＳ培地（ディフコ社製）を用い、３７℃で一晩静置培養（１２時間）した。該培養菌を新たなＭＲＳ培地（１０ｍＬ）に植え継ぎ、菌数が５×１０8／ｍＬに達したとき、遠心分離法（冷却遠心機、日立製作所製：１００００ｒｐｍ、４℃、１０分）で菌体を回収し、滅菌水およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で遠心洗浄後、溶菌酵素反応緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２％ＰＥＧ６０００）に懸濁した。ムタノリシン（和光純薬工業社製、２μｇ／μＬ）を２μｌ添加し、６０℃で２．５時間、次いで、プロテイナーゼＫ（タカラ社製、０．４ｍｇ／μｌ）を２０μｌ添加し、３７℃で１時間処理した。ＳＤＳ（３％）を５００μｌ添加し、室温で３０分間保温し、次いで遠心分離法で菌体ＤＮＡを含む粗抽出液（上清分画）を得た。菌体ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム処理で部分精製し、組換えプラスミドの作成に用いた。
こうして抽出したＤＮＡを、ショットガンクローニングのために制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断して、３１７１ｂｐおよび３７６８ｂｐの２種のＤＮＡフラグメントを得た。
【００３４】
次いで、該２種のＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＵＣ１１８（３１６２ｂｐの大腸菌ベクター、Ａｍｐr、ｐｌａｃ、ｌａｃＺ’）のＢａｍＨＩサイト中にクローニングして、２つの組換えプラスミド：ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２を得た。
組換えプラスミドの作成は以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)）で行った。
上記の菌体ＤＮＡ（５０μｇ）を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（０．２単位）で、３７℃、１時間部分切断した。プラスミドｐＵＣ１１８のＤＮＡをＢａｍＨＩで完全分解し、線状ＤＮＡ分子を得た。該部分切断菌体ＤＮＡ（３μｇ）と線状ｐＵＣ１１８ＤＮＡ（０．５μｇ）を混合し、ＤＮＡ結合酵素（４００単位）を加えた。１６℃で１６時間の結合反応により組換えプラスミドを作成した。
また同様にして、該組換えプラスミドを使用して以下の３つの組換えプラスミドを得た（図１参照）：
・ｐ１１９ｇａＹ３
ｐ１１８ｇａＹ１のＭｆｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（１１３８ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩサイトにクローニングして入手。
・ｐ１１９ｇａＹ４
ｐ１１９ｇａＹ３のＳｍａＩ／ＸｂａＩフラグメント（５１３ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｃＩＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングして入手。
・ｐ１１９ｇａＹ５
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩフラグメント（９８０ｂｐ）をプラスミドｐＵＣ１１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングして入手。
【００３５】
こうして得た５つの組換えプラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｓｕｐＥ４４、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ４６、ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ-、Ｆ’［ｐｒｏＡＢ+、ｌａｃＩq、ｌａｃＺΔＭ１５、Ｔｎ１０（Ｔｅｔr）］）中に導入して形質転換体を得た。
詳細には、先ず大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅをＬＢ（Luria-Bertain）培地を用い、３７℃で培養した。一晩（１２時間）経過後、培養菌２ｍＬを新鮮なＬＢ培地１００ｍＬに植え継ぎ、３７℃で培養した。菌数が５×１０8／ｍｌに達したとき、上記と同様の遠心分離法で集菌した。菌体を滅菌水で３度洗浄し、１００μＬの蒸留水に懸濁した。該懸濁液に１μＬの組換えプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ）とＰＥＧ６０００（１０％）を添加した。大腸菌体内への該組換えプラスミドの導入は、ジーンパルサー（登録商標、バイオラッド社製）を用い、電圧１．７５ｋＶ／ｃｍ、静電容量２５μＦ、抵抗６００Ωの電気パルス条件を用いたエレクトロポレーション法で行った。電気パルス処理後、ＬＢ培地を４倍量加え、３７℃で３０分間保温し、形質転換体を得た。
【００３６】
該形質転換体を、１×１０9／ｍＬのオートクレーブにより失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞、０．１％のトリトンＸ−１００ｎ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ（Luria-Bertani）培地中、３７℃で２４時間培養し、その後４℃で２４時間定温放置した。より詳しい条件は以下の通りである：
Lactobacillus gasseri JCM 1131TをＬＢ培地で一晩培養した。集菌後、蒸留水で二回洗浄した後、オートクレーブ（加熱蒸気圧滅菌：三洋電気社製）を用い、１１０℃、１．５気圧で１５分間加熱処理した。１×１０9／ｍＬに相当する該加熱処理菌体と、０．１％のトリトンＸ−１００ｎ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む固形ＬＢ寒天培地（プレート）を径９ｃｍのシャーレに作成した。１ｍＭのＩＰＴＧと共に該形質転換体を該寒天プレートに塗布し、３７℃で２４時間培養した。生成した菌体コロニーを４℃で２４時間放置し、溶菌斑を生じる形質転換体を選別分離した。
【００３７】
次いで、前記培養プレートを、オートクレーブにより失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞に対する、トリトンＸ−１００誘導溶菌表現型についてスクリーニングした。
その結果、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌は、ＩＰＴＧでの誘導により約３３ｋＤａの同じ分子量を持つタンパク質を産生し、該タンパク質は失活させたLactobacillus gasseri JCM1131T細胞に対し溶菌活性を示した。その結果、これらの形質転換体のコロニーの周囲には明らかなハロ領域が形成した（図２参照）。
組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌を３７℃で時間を変えて培養し、培養により産生したタンパク質をＳＤＳゲル上での電気泳動により分析した結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）は、培養時間が最も短いもの（最も左側のレーン）から最も長いもの（最も右側のレーン）に増加するにつれて、約３３ｋＤａのタンパク質（矢印部分）の産生が増加したことを明らかに示している。
また、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌による約３３ｋＤａのタンパク質の産生を、他のプラスミドで形質転換した大腸菌と比較した結果を図３（Ｂ）に示す。レーン１はマーカーであり、レーン２ないしレーン５はｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌をそれぞれ０、１、２および３時間培養した結果であり、レーン６ないし９はｐ１１８ｇａＹ１で形質転換した大腸菌をそれぞれ０、１、２および３時間培養した結果である。これにより、プラスミドｐＵＣ１１８で形質転換した大腸菌は約３３ｋＤａのタンパク質（矢印部分）の産生を誘導しないのに対し、組換えプラスミドｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌は、時間と共に該タンパク質を産生することが解る。
【実施例２】
【００３８】
ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２の配列決定
Lactobacillus gasseriの全遺伝子ショットガン配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＺ＿ＡＡＡ００２０００００６）に基き、ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２の挿入ＤＮＡフラグメントの配列を決定した（。決定したＤＮＡ配列の物理マップを図１に示す。
図１に示すように、ｐ１１８ｇａＹ１に挿入したＤＮＡフラグメントは、ｏｒｆ１４９、ｏｒｆ９２、ｈｏｌｇａＹ、ｌｙｓｇａＹ、ｏｒｆ３５およびｍｎａＡｇａＹ１をコードし、またｐ１１８ｇａＹ２に挿入したＤＮＡフラグメントは、ｏｒｆＸｇａＹ１、ｏｒｆ１６９、ｏｒｆ１４９、ｏｒｆ９２、ｈｏｌｇａＹ、ｌｙｓｇａＹ、ｏｒｆ３５ｉｎｔｇａＹをコードしていた。
これらのうちｈｏｌｇａＹとｏｒｆ３５との間に位置するｌｙｓｇａＹは、その分子量が３３．７ｋＤａであると推計される３１０アミノ酸からなるタンパク質であり、そして該タンパク質の分子量は、ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌がＩＰＴＧ誘導により産生し溶菌活性の要因と推測されるタンパク質の分子量と同一であった。これらの理由により、ｌｙｓｇａＹをLactobacillus gasseri JCM1131Tが産生する溶菌性タンパク質であると決定した。ｌｙｓｇａＹをコードするヌクレオチド配列を以下の配列番号１に、また該ヌクレオチド配列によりコードされるｌｙｓｇａＹのアミノ酸配列を以下の配列番号２に示す。またｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子の境界領域を図４に図示する。図４は境界領域のみを示し、Ｎ末端とＣ末端の間の中間部分は省略されている。また図４において、ｌｙｓｇａＹの下流に存在する転写終結因子として機能し得る３８塩基のステム−ループ２次構造を矢印で示す。
【００３９】
ｐ１１８ｇａＹ１およびｐ１１８ｇａＹ２により形質転換した大腸菌が産生した３３ｋＤａのタンパク質がｌｙｓｇａＹであることを確認するために、ｌｙｓｇａＹのみを含むＭｆｅｌ／ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１１８に挿入して組換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３を入手し、上記と同様にしてｐ１１９ｇａＹ３により大腸菌を形質転換し、そしてｌｙｓｇａＹの誘導発現を試みた。その結果、ｐ１１９ｇａＹ３は予測通り３３ｋＤａのタンパク質（ｌｙｓｇａＹ）を産生した。
【実施例３】
【００４０】
ｌｙｓｇａＹの溶菌活性評価
ｌｙｓｇａＹの溶菌活性を、オートクレーブにより失活させた３種のグラム陽性菌：Lactobacillus gasseri JCM1134T、Staphylococcus warneri MおよびMicrococcus luteusについて評価し、その溶菌活性を市販の溶菌酵素剤であるムタノリシンおよび卵白リゾチーム（共にシグマ社製）のものと比較した。
オートクレーブ処理した３種類の菌体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁し、６６０ｎｍでの吸光度が０．５となるように調整した。次いで、ｌｙｓｇａＹ０．０６μｇ／μＬを添加し３７℃で保温した。スペクトロニック２０（ミルトン・ロイ社製）を用い、６６０ｎｍでの吸光度の経時変化を１５分ごとに測定して、活性評価試験を行った。
上記した６６０ｎｍでの吸光度の経時変化を、各タンパク質について、吸光度を縦軸（ＯＤ660）に、また時間（分）を横軸にとったグラフとして図５に示す。
また得られた各タンパク質の酵素活性（Ｕ／μｇ）を、３種の基質毎に表１に示す。
【表１】
【００４１】
試験結果から明らかなように、本発明のタンパク質であるｌｙｓｇａＹは３種全ての基質に対して溶菌活性を示した。特にLactobacillus gasseri JCM1134Tに対する溶菌活性は高く、ムタノリシンの溶菌活性に匹敵していた。
他方、卵白リゾチームはLactobacillus gasseri JCM1134Tに対する溶菌活性を殆ど示さなかった。
【実施例４】
【００４２】
ｌｙｓｇａＹの溶菌スペクトル評価
ｌｙｓｇａＹの溶菌スペクトルを、オートクレーブで失活させた様々なグラム陽性菌を基質として、以下の手順に従い評価した：
ＬｙｓｇａＹの溶菌スペクトルをザイモグラフィー法を用い以下の手順で評価した。
各グラム陽性菌をオートクレーブ処理して基質とした。該基質（湿潤、２％ｗｔ／ｖｏｌ）を含有するＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０％）を作成し、ＬｙｓｇａＹを電気泳動した。次いで泳動終了ゲルを、０．１％のトリトンＸ−１００ｎを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中、３７℃で２４時間保温した。その後、０．１％のメチレンブルーで染色し、溶菌活性を検出した。
結果を表２に示す。表２では＋＋＋が強い溶菌活性を、＋＋が中程度の溶菌活性を、＋が弱い溶菌活性を示し、そして−は溶菌活性が検出されなかったことを示す。また比較の目的で同様に評価したLactobacillus plantarum G1e phage φg1eがコードするエンドリシン：Ｌｙｓｇｌｅの溶菌スペクトルを共に示す。
【表２】
【００４３】
表２に示す結果から明らかなように、、本発明のタンパク質であるｌｙｓｇａＹは、試験した１８種のグラム陽性菌のうち、Staphylococcus haemolyticusを除く全てについて少なくとも弱い溶菌活性を示し、その殆どでは中程度以上の溶菌活性を示した。これらの結果より、ｌｙｓｇａＹが広い溶菌スペクトルを有することを確認できた。
他方、Ｌｙｓｇｌｅは僅かに２種のグラム陽性菌でのみしか溶菌活性を示さず、また示した溶菌活性もｌｙｓｇａＹのものと比較すると弱かった。
【００４４】
・配列番号１：ｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子のヌクレオチド配列
atg gtt gaa gta gct aaa aga agt tac ggt gta gat gta tca agt cat aac aac ggc aat tat tcc gga tcg aaa ttt gcc gtt gtt aaa gtg tca gag ggc tta gat tat cgt aat cct aaa gca caa tct caa gta tct act gca aga gct aat agt atg ttg cca atg gct tat cac tat gcg agg ttt agt ggc aat agt aac gta gca att caa gaa ggt aac tat gca gtt act tct gca aaa gct gtt ggt ctt gag gca ggt act tac tta gct tgt gac tat gaa caa gga agt gga aac gaa act aga gga gat cgt gaa act aat acg act gct atc tta tct ttc tta gat act att gtg ggt gct ggt tat aag cct tta cta tac tca ggc gct tat ctt atg aga gac aaa att aat act tct aga att tta gcc aag tat cct aat tgt ttg tgg gta gca gca tat cca tca ggt aat ggt act gcg gta agt gaa cca aac ttt ggc tac ttt cca tca atg aac gga gta gca att tgg caa ttt acc gat aac tgg cgt ggg tta aat gtt gac gga aac atc agc ttg att gat cta aaa aat gat agc aaa cca gta gct cag cca tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【００４５】
・配列番号２：ｌｙｓｇａＹのアミノ酸配列
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１の組換えプラスミドが含むＤＮＡフラグメントを図示する物理マップであり、（Ａ）はｐ１１８ｇａＹ１、ｐ１１８ｇａＹ３、ｐ１１８ｇａＹ４およびｐ１１９ｇａＹ５を示し、（Ｂ）はｐ１１８ｇａＹ２を示す。
【図２】図２は、実施例１における形質転換大腸菌の培養結果の写真を表す図である。
【図３】図３は、実施例１において形質転換大腸菌が産生したタンパク質の電気泳動結果の写真を表す図であり、（Ａ）は時間を変えたときの結果を表し、そして（Ｂ）はｐ１１８ｇａＹ１により形質転換した大腸菌によるタンパク質の産生を他のプラスミドで形質転換したもの比較した結果を表す。
【図４】図４は、ｌｙｓｇａＹをコードする遺伝子の境界領域を図示する。
【図５】図５は、実施例４における溶菌活性評価の結果を図示するグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg gtt gaa gta gct aaa aga agt tac ggt gta gat gta tca agt cat aac aac ggc aat tat tcc gga tcg aaa ttt gcc gtt gtt aaa gtg tca gag ggc tta gat tat cgt aat cct aaa gca caa tct caa gta tct act gca aga gct aat agt atg ttg cca atg gct tat cac tat gcg agg ttt agt ggc aat agt aac gta gca att caa gaa ggt aac tat gca gtt act tct gca aaa gct gtt ggt ctt gag gca ggt act tac tta gct tgt gac tat gaa caa gga agt gga aac gaa act aga gga gat cgt gaa act aat acg act gct atc tta tct ttc tta gat act att gtg ggt gct ggt tat aag cct tta cta tac tca ggc gct tat ctt atg aga gac aaa att aat act tct aga att tta gcc aag tat cct aat tgt ttg tgg gta gca gca tat cca tca ggt aat ggt act gcg gta agt gaa cca aac ttt ggc tac ttt cca tca atg aac gga gta gca att tgg caa ttt acc gat aac tgg cgt ggg tta aat gtt gac gga aac atc agc ttg att gat cta aaa aat gat agc aaa cca gta gct cag cca tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【請求項２】
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質。
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg
Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項３】
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、請求項２記載の遺伝子。
【請求項４】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、溶菌活性を有するタンパク質。
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項５】
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし３のうちの何れか１項に記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
【請求項７】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項６記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
グラム陽性細菌であることを特徴とする、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
以下の工程１）および２）を含む、請求項４または５に記載のタンパク質の製造方法；
１）請求項８ないし１０のうちの何れか１項に記載の宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、溶菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
【請求項１２】
請求項１１記載の製造方法により得られるタンパク質。
【請求項１３】
請求項２または３に記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
【請求項１４】
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、請求項１３記載の組成物。
【請求項１】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から９３３に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、溶菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg gtt gaa gta gct aaa aga agt tac ggt gta gat gta tca agt cat aac aac ggc aat tat tcc gga tcg aaa ttt gcc gtt gtt aaa gtg tca gag ggc tta gat tat cgt aat cct aaa gca caa tct caa gta tct act gca aga gct aat agt atg ttg cca atg gct tat cac tat gcg agg ttt agt ggc aat agt aac gta gca att caa gaa ggt aac tat gca gtt act tct gca aaa gct gtt ggt ctt gag gca ggt act tac tta gct tgt gac tat gaa caa gga agt gga aac gaa act aga gga gat cgt gaa act aat acg act gct atc tta tct ttc tta gat act att gtg ggt gct ggt tat aag cct tta cta tac tca ggc gct tat ctt atg aga gac aaa att aat act tct aga att tta gcc aag tat cct aat tgt ttg tgg gta gca gca tat cca tca ggt aat ggt act gcg gta agt gaa cca aac ttt ggc tac ttt cca tca atg aac gga gta gca att tgg caa ttt acc gat aac tgg cgt ggg tta aat gtt gac gga aac atc agc ttg att gat cta aaa aat gat agc aaa cca gta gct cag cca tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【請求項２】
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質。
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg
Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項３】
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、請求項２記載の遺伝子。
【請求項４】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、溶菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、溶菌活性を有するタンパク質。
Met Val Glu Val Ala Lys Arg Ser Tyr Gly Val Asp Val Ser Ser His Asn Asn Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Lys Phe Ala Val Val Lys Val Ser Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asn Pro Lys Ala Gln Ser Gln Val Ser Thr Ala Arg Ala Asn Ser Met Leu Pro Met Ala Tyr His Tyr Ala Arg Phe Ser Gly Asn Ser Asn Val Ala Ile Gln Glu Gly Asn Tyr Ala Val Thr Ser Ala Lys Ala Val Gly Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Leu Ala Cys Asp Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Asn Glu Thr Arg Gly Asp Arg Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ile Leu Ser Phe Leu Asp Thr Ile Val Gly Ala Gly Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ser Gly Ala Tyr Leu Met Arg Asp Lys Ile Asn Thr Ser Arg Ile Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Cys Leu Trp Val Ala Ala Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Thr Ala Val Ser Glu Pro Asn Phe Gly Tyr Phe Pro Ser Met Asn Gly Val Ala Ile Trp Gln Phe Thr Asp Asn Trp Arg Gly Leu Asn Val Asp Gly Asn Ile Ser Leu Ile Asp Leu Lys Asn Asp Ser Lys Pro Val Ala Gln Pro Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項５】
前記ｃ）記載のタンパク質において、アミノ酸の欠失、置換および／または付加は、アミノ酸番号１０のグリシン、アミノ酸番号１２のアスパラギン酸、アミノ酸番号３３のグルタミン酸、アミノ酸番号６０のヒスチジン、アミノ酸番号９６のアスパラギン酸、アミノ酸番号９８のグルタミン酸およびアミノ酸番号１９８のアスパラギン酸以外の部位で行われることを特徴とする、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし３のうちの何れか１項に記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
【請求項７】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項６記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
グラム陽性細菌であることを特徴とする、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
以下の工程１）および２）を含む、請求項４または５に記載のタンパク質の製造方法；
１）請求項８ないし１０のうちの何れか１項に記載の宿主細胞を、溶菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、溶菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
【請求項１２】
請求項１１記載の製造方法により得られるタンパク質。
【請求項１３】
請求項２または３に記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
【請求項１４】
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、請求項１３記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１２１９９３（Ｐ２００６−１２１９９３Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１５８６２（Ｐ２００４−３１５８６２）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
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