本発明は、特異性決定領域と組み合わせたタンパク質足場から生成された人工酵素、その製造、および該人工酵素の、研究、栄養学的ケア、パーソナルケア、および工業目的のための使用を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患に関連する標的基質内の特異的なペプチド結合を加水分解することができる規定された特異性を有するプロテアーゼを含む医薬を適用することによって、疾患を処置するための方法を提供する。そのような特異性を有するプロテアーゼは、さらに関連する治療または診断の目的で使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
学術的および産業上の研究は、治療剤、研究用の薬剤、診断剤、栄養剤、個人医療用の薬剤、または産業上の薬剤として使用される機能的なタンパク質を継続的に探求する。今日、このような機能的タンパク質は、主に２つのカテゴリー、すなわち、天然タンパク質および人工（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）タンパク質に分類され得る。一方で、天然タンパク質は、自然界から、例えば、天然の単離物をスクリーニングすることによって、または多様な種からのゲノムを配列決定することによって発見される。他方、人工タンパク質は、典型的には公知のタンパク質に基づいており、そして改変された機能を獲得するために変異されている。本発明は、出発成分と比較して新規機能を有する人工タンパク質を開示する。そのようなタンパク質は、ＮＢＥ（新規生物学的実体（Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ））と呼ばれる。本願において開示されるＮＢＥは、新たな基質特異性を有する人工酵素またはそのような人工酵素と他の機能性成分との融合タンパク質である。
【０００３】
特異性は、酵素機能の必須の要素である。細胞は、多数の異なる高度に反応性の触媒からなる。それでもなお、細胞は、調和された代謝および高度に秩序立った３次元構造を維持し得る。これは部分的に、酵素の特異性、すなわち、それらに対応する基質の選択的な変換に起因する。特異性は定性的かつ定量的な特性である。特定の酵素の特異性は、標的分子の１つの特定の型から特定の化学構造を有する全ての分子型に至るまで広範に変化し得る。本来、生物の酵素の特異性は、その生物の特定の必要性に対して進化してきている。治療、研究、診断、栄養学、または産業上の適用に高価値を有する任意の特異性は、可能な特異性のスペースが大きいために任意の生物の酵素のレパートリーで見出される可能性は低い。このような特異性を得る唯一の現実的な方法は、新たにそれらを作製することである。
【０００４】
酵素を結合剤と比較する場合、特異性の枠組みは、大きな分子内において小さな異なる構造として個々のエピトープを認識する抗体によって与えられる。天然に存在する非常に広範な抗体の特異性は、天然の選択と組み合わされた免疫系によって生成される多様性に起因する。いくつかの機構が、抗体特異性の広範なレパートリーに貢献し、免疫応答生成および抗体成熟の異なる段階で生じる（Ｊａｎｅｗａｙ、Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。具体的には、抗体は、非常に特異的に抗原と相互作用し、非常に類似したエピトープとの間でさえも区別を可能にする相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体の軽鎖および重鎖は、各々３つの結合ドメインに対するＣＤＲに寄与する。自然界は、ＣＤＲを生成するのに、種々の遺伝子セグメントの組換えを、さらに変異誘発と組み合わせて使用する。結果として、６つのＣＤＲループの配列は、組成および長さにおいて高度に多様であり、これにより抗体の結合特異性の多様性の基礎を形成する。多様な触媒特異性の生成のための同様の原則は、自然界からは知られていない。
【０００５】
触媒作用、すなわち、特定の化学反応の速度の増大は、結合すること以外に、最も重要なタンパク質機能である。触媒タンパク質、すなわち、酵素は、それらが触媒する化学反応に従って分類される。
【０００６】
トランスフェラーゼは、基、例えば、メチル基またはグリコシル基を、１つの化合物（一般的にはドナーと見なされる）から別の化合物（一般的にはアクセプターと見なされる）へ移動させる酵素である。例えば、グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４）は、ドナー分子からアクセプター分子へグリコシル残基を移動させる。グリコシルトランスフェラーゼのなかにはまた、加水分解を触媒するものもあり、これらはグリコシル基をドナーから水へ移動させると見なされ得る。サブクラスは、さらにヘキソシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１）、ペントシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．２）、および他のグリコシル基（ＥＣ ２．４．９９、国際生化学および分子生物学連合命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）））へとさらに分割される。
【０００７】
酸化還元酵素は、酸化還元反応を触媒する。酸化される基質は、水素または電子ドナーと見なされる。酸化還元酵素は、脱水素酵素、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、およびジオキシゲナーゼとして分類される。脱水素酵素は、水素を水素ドナーから水素アクセプター分子へ移動させる。オキシダーゼは、水素アクセプターとしての分子酸素と反応し、酸化生成物ならびに過酸化水素または水のいずれかを生成する。モノオキシゲナーゼは、分子酸素から酸素原子１個を基質へ移動させ、そして１つは水へと還元される。対照的に、ジオキシゲナーゼは、分子酸素から両方の酸素原子を基質へと挿入させることを触媒する。
【０００８】
リアーゼは、排除反応を触媒し、それにより二重結合を生成するか、または逆方向において二重結合での付加を触媒する。イソメラーゼは、分子内再配置を触媒する。リガーゼは、ＡＴＰ消費の代償として化学結合の形成を触媒する。
【０００９】
最終的に、加水分解酵素は、Ｃ−ＯまたはＣ−Ｎのような化学結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの酵素のＥ．Ｃの分類は、一般的に、それらを、加水分解される結合の性質によって、および基質の性質によって分類する。リパーゼおよびプロテアーゼのような加水分解酵素は、生来、および生体触媒の技術的な応用において重要な役割を果たす。プロテアーゼは、オリゴペプチドまたはポリペプチドの状況において、ペプチド結合を加水分解する。触媒機構に依存して、プロテアーゼは、アスパラギン酸、セリン、システイン、メタロ、およびスレオニンプロテアーゼに分類される（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ． （１９９８） Ｅｄｓ： Ｂａｒｒｅｔ、Ａ； Ｒａｗｌｉｎｇ、Ｎ． ； Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、Ｊ． ； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）この分類は、触媒作用を担うアミノ酸側鎖に基づいており、これは典型的には、互いに非常に類似して配向した活性部位に示されている。基質の切れやすい結合は、基質のアミノ酸側鎖とプロテアーゼの相補的な領域との間の特異的な相互作用に起因して触媒性残基と一致するようにされる（Ｐｅｒｏｎａ、Ｊ． ＆ Ｃｒａｉｋ、Ｃ （１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、３３７−３６０）。切れやすい結合のＮ末端側およびＣ末端側の残基は、通常、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３など、およびＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’と呼ばれ、基質に相補的な結合ポケットは、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’と、それぞれ呼ばれる（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ ＆ Ｂｅｒｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７ （１９６７） １５７−１６２に基づく命名法）。プロテアーゼの選択性は、実質的に非選択的（例えば、サブチリシンのＰ位置での厳格な優先傾向；例えば、トリプシンはアルギニンまたはリジン残基のＣ末端側を選択的に切断する）から、非常に特異的なプロテアーゼまで（例えば、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、配列ＣＰＧＲＶＶＧにおけるアルギニンのＣ末端側を切断する（Ｄｉｎｇ、Ｌ ｅｔａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２、７６２７−７６３１； Ｃｏｏｍｂｓ、Ｇｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ７１、４４６１−４４６７）非常に様々である。
【００１０】
プロテアーゼの特異性、すなわち、特定の基質を優先的に認識し加水分解する能力は、定性的におよび定量的に表現することができる。定性的な特異性は、ペプチド基質の特定の位置でプロテアーゼにより受け入れられるアミノ酸残基の種類のことをいう。例えば、トリプシンおよびｔ−ＰＡは、定性的な特異性に関して関連している。なぜなら、これらのいずれも、Ｐ位置にアルギニンまたは類似の残基を必要とするからである。他方、定量的な特異性は、プロテアーゼにより基質として受け入れられるペプチド基質の相対数、またはより正確には、プロテアーゼによって受け入れられる異なるペプチドに対するそのプロテアーゼの相対的ｋ_cat／ｋ_Mの比のことをいう。全ての可能なペプチドの中のわずかな少量の部分のみを受け入れるプロテアーゼは、高い特異性を有する。ここで、極端な場合として、任意のペプチド基質を切断するプロテアーゼの特異性は、理論的にゼロである。
【００１１】
プロテアーゼの一次構造、二次構造、ならびに三次構造の比較により（Ｆｅｒｓｈｔ、Ａ． 、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５）、高度の保存を示すクラスを同定することが可能である（Ｒａｗｌｉｎｇｓ、Ｎ． Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ．Ｊ． （１９９７） Ｉｎ ： Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｅｄｓ． Ｈｏｐｓｕ−Ｈａｖｕ、Ｖ． Ｋ．；Ｊａｒｖｉｎｅｎ、Ｍ． ；Ｋｉｒｓｃｈｋｅ、Ｈ、ｐｐ． １３−２１、ＯＳ Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。プロテアーゼの分類として広く受け入れられているスキームは、Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＆ Ｂａｒｒｅｔｔによって提唱されている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ． （１９９８） Ｅｄｓ： Ｂａｒｒｅｔ、Ａ； Ｒａｗｌｉｎｇ、Ｎ．； Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、Ｊ．； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）。例えば、セリンプロテアーゼファミリーは、キモトリプシン（クラスＳ１）、サブチリシン（クラスＳ８）、およびカルボキシペプチダーゼ（クラスＳＣ）の集団を有する構造クラスにさらに分割され得、これらの各々は、非特異的プロテアーゼおよび特異的プロテアーゼを含む（Ｒａｗｌｉｎｇｓ、Ｎ． Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ． Ｊ． （１９９４） ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ． ２４４、１９−６１）。これは、他のプロテアーゼファミリーにも同様に適用される。基質中の切断される結合の相対的な位置によって、さらなる区別がなされ得る。カルボキシペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼは、Ｃ末端およびＮ末端から、それぞれアミノ酸を切断する。これに対して、エンドペプチダーゼは、オリゴペプチドに沿ってどこでも切断する。
【００１２】
基本的に無限の種類の特異性を有する酵素が入手可能であるならば、多くの適用が考えられる。しかし、このような高い、低い、または任意の規定された特異性を有する酵素の使用は、現在のところ、天然源から単離され得るものに限定されている。このような酵素の適用分野は、治療、研究、診断、栄養学から、パーソナルケアおよび工業的用途まで様々である。
【００１３】
洗剤中の酵素添加物は、工業的な酵素市場全体のほぼ３分の１を構成するまでになっている。洗剤酵素には、有機物によるシミを除去するためのプロテアーゼ、油汚れを除去するためのリパーゼ、でんぷんを含む食品の残渣を除去するためのアミラーゼ、および繊維のなめらかな表面を回復させるためのセルラーゼが含まれる。最も良く知られている洗剤酵素は、おそらく、種々のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から単離される非特異的プロテアーゼであるサブチリシンである。
【００１４】
アミラーゼのような酵素は、食品加工において使用される酵素の大部分を占めている。でんぷん酵素は、布地デザイン、アルコール発酵、紙およびパルプの加工、ならびに洗濯用洗剤添加物のために重要な製品を含むが、最大の適用は、高フルクトースコーンシロップの製造である。工業用酵素を用いたでんぷんからのコーンシロップの製造は、酸加水分解の代わりとして成功していた。
【００１５】
でんぷん加工とは別に、酵素は、食品における増大する範囲の適用に使用されている。食品中の酵素は、きめ、外見、および栄養価値を改善することができ、または所望の風味およびアロマを生成することができる。パン屋さんで現在使用されている食品酵素は、アミラーゼ、アミログリコシダーゼ、ペントサンの分解および還元型グルテン産生のためのペントサンアーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）、またはパン生地の安定性を増大させるためのグルコースオキシダーゼである。乳製品用において一般的な酵素は、チーズ製造における凝固剤としてのレンネット（プロテアーゼ）、ラクトースの加水分解のためのラクターゼ、乳清タンパク質の加水分解のためのプロテアーゼまたは過酸化水素除去のためのカタラーゼである。醸造工程において使用される酵素は、上記のアミラーゼであるが、セルラーゼまたはタンパク質懸濁物からビールを清澄化するためのプロテアーゼもまた使用される。ワインおよびフルーツジュース中では、濁りは、より一般的にでんぷんおよびペクチンによって生じるため、アミラーゼおよびペクチナーゼは、収量および透明度を増大させる。パパインおよびその他のプロテイナーゼは、肉を柔らかくするために使用される。
【００１６】
酵素はまた、飼料を消化することにおいて動物を助けるために開発されてきた。西半球において、コーンは、ウシ、ブタ、および家禽の主要な食料源である。コーンからのリン酸のバイオアベイラビリティーを改善させるために、フィターゼが一般的に添加される（Ｗｙｓｓ、Ｍ． ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔａｓｅｓ （ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ） ； Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６５、３６７−３７３ （１９９９））。さらに、フィターゼ加水分解は、タンパク質の消化およびカルシウムのようなミネラルの吸収を改善することが示されている（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍ． Ｒ． ＆ Ｓｃｈｕｌｚｅ、Ｈ．、Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｉｇｓ ａｎｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ ［Ｒｅｖｉｅｗ］． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１、９１−１１４（１９９８））。別の主要な飼料用酵素は、キシラナーゼである。この酵素は、その相対的に高い溶解性線維含有量のために、約１０％を超える小麦、大麦、もしくはライ麦を含む飼料の補助剤として特に有用である。キシラーゼは、２つの重要な作用：飼料中のゲル様高分子量アラビノキシランを加水分解することによって腸内容物の粘度を低減させる（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｔ．Ｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｒ．＆ＭｃＣｒａｃｋｅｎ、Ｋ．Ｊ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｎｅｗｘｙｌａｎａｓｅｓ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｎｄ ｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｂｒｏｉｌｅｒ ｄｉｅｔｓ． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４４、Ｓ１６−Ｓ１８ （２００３））；およびタンパク質およびでんぷんのバイオアベイラビリティーを改善する細胞壁中のポリマーの分解。
【００１７】
バイオテクの研究開発の研究室は、日常的に、多くの他の試薬とともに少量の特別な酵素を使用する。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼのような酵素は、そのうちのいくつかの例に過ぎない。Ｔａｑポリメラーゼまたは制限エンドヌクレアーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、研究室での作業に革命を起こした。治療用酵素は、薬物の特定のクラスであり、ＦＤＡによって、他の、特に非生物学的製剤と比較して多くの利点を有する生物学的製剤として分類されている。成功している治療酵素の例は、ヒトの治療に用いる第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のようなヒト凝固因子である。さらに、ヒトの消化プロセスにおける種々の欠陥のために消化酵素が使用される。他の例は、心血管疾患の処置のためのｔ−ＰＡおよびストレプトキナーゼ、Ｉ型ゴーシェ病の処置のためのベータグルコセレブロシダーゼ、急性リンパ芽球性白血病の処置のためのＬ−アスパラギナーゼ、および嚢胞性線維症の処置のためのＤＮＡｓｅである。治療剤としてのタンパク質の適用における重要な事項は、それらが免疫原性を有し得ることである。このリスクを軽減するために、ヒト由来の酵素が好まれ、これによって利用可能な酵素のセットが狭められる。新規のテイラーメードの特異性を有する設計された酵素（好ましくは、ヒト由来の）を提供することにより、意図的に標的基質を特異的に改変することが可能となり、他方免疫原性のリスクを最小限にすることができる。治療剤としての高度に特異的な酵素のさらなる利点は、副作用の危険性が低いことである。低分子とタンパク質との間の特異的な相互作用の可能性を限定することにより、標的ではないタンパク質への結合およびそれゆえ副作用が非常に一般的であり、しばしばそれがなければ有用であるリード化合物の使用を中止することになる。他方、特異的酵素は、基質を区別するためのより多くの接触部位および機構を提供し、それゆえより高い特異性が可能であり、それによって副作用の活動が低減される。
【００１８】
プロテアーゼは、治療剤の重要なクラスを表す（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｏｄａｙ、３３、６４１−６４８ （１９９７））。しかしながら、現在、治療用のプロテアーゼは、通常、身体自体のプロテアーゼの活動が不十分な場合の代替物である。例えば、第ＶＩＩ因子は、血友病者の凝固障害または外科手術の際の特定の症例において投与され得る（Ｈｅｕｅｒ Ｌ． ；Ｂｌｕｍｅｎｂｅｒｇ Ｄ、（２００２） Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ ５１： ３８８）。組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、急性心筋梗塞において適用され、特異的な切断およびプラスミノーゲンの活性化を介してフィブリン凝血塊の溶解を開始する（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｄｒｕｇｓ、５０、２９−４１）。これまでのところ、テイラーメードの特異性を有するプロテアーゼが、疾患に関連する標的タンパク質を特異的に活性化または不活性化する治療剤を提供するために提供されている。
【００１９】
モノクローナル抗体は、治療能を有する物質の別の重要な生物学的クラスである。主要な抗体標的の１つは、サイトカインのファミリーに属する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。ＴＮＦは、炎症反応において主要な役割を果たす。ホモ３量体として、それらはほとんど全ての細胞の受容体と結合することができる。それらは、多数の細胞遺伝子、多数のシグナル伝達機構、キナーゼ、および転写因子を活性化する。最も重要なＴＮＦは、ＴＮＦアルファおよびＴＮＦベータである。ＴＮＦアルファは、マクロファージ、単球、およびその他の細胞によって産生される。ＴＮＦアルファは、炎症媒介因子である。それゆえ、過去１０年間の研究は、異なる治療的症状（例えば、関節リウマチ、クローン病、または乾癬）の可能性のある治療剤として、モノクローナル抗体のようなＴＮＦアルファ阻害剤に集中してきた（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１ （５）： １０４１−１０５２）。モノクローナル抗体の主要な欠点の１つは、それらが高価であることであり、それ故、新たな生物学的代替品が非常に重要である。
【００２０】
文献には多数の人工酵素の例が存在する。Ｆｕｌａｎｉら（Ｆｕｌａｎｉ Ｆ． ｅｔａｌ． （２００３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６、５１５−５１９）は、Ｃｄｃ２５ホスファターゼ酵素の触媒サブユニットに構造的に関連する触媒ドメインを有するＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ由来のローダナーゼ（ｒｈｏｄａｎａｓｅ）（チオスルファト：シアニドスルフルトランスフェラーゼ）を記載する。触媒機構の差違は、活性化部位の大きさの違いによる。ローダナーゼおよびホスファターゼのいずれも、異なる基質に対して高度に特異的である（硫酸対リン酸）。ローダナーゼの触媒機構は、１残基の挿入によってセリン／スレオニンホスファターゼに向かってシフトし得る。それゆえ、Ｆｕｌａｎｉらは、異なる酵素クラスからの天然に知られている酵素の構造比較および配列アラインメントによって触媒機構の変化の１つの例を示したが、同じ触媒機構を保ちながらユーザーが任意に定義可能な基質特異性をどのように生成するかについては示していない。
【００２１】
Ｂｒｉｇｇｓら（ＷＯ０２／０９０３００ Ａ２）によって記載されたチオレドキシンレダクターゼは、ＮＡＤＨに比べて優先的にＮＡＤＰＨに結合するようにコファクターの特異性を変化させた。このように、開始時の酵素および生成する人工酵素の両方の酵素が、異なる基質に対して高度に特異的である。このような変化した基質特異性を達成する方法は、コンピュータ処理による方法か、または可変残基および保存残基を決定するための関連するタンパク質の配列アラインメントのいずれかである。それらは全て、それらが公知の特異性を有するタンパク質の構造および配列の比較と、続いて同じ骨格から別の骨格への移動に基づいている点で共通している。
【００２２】
特異性操作酵素、特に、文献に公開されたプロテアーゼの他の例が存在する。しかしながら、これらの例はいずれも、記載された方法において使用する出発物質の特異性と比べて新規な特異性を生成する手段を提供しない。その方法は、構造指向型単一点変異（Ｋｕｒｔｈ、Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、１１４３４−１１４４０ ； Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、Ｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６）、２つの特異的プロテアーゼ間での表面ループの交換（Ｈｏｒｒｅｖｏｅｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８、７７９−７８２）から、インビトロもしくはインビボ選択と組み合わせた位置選択的または全遺伝子にわたったランダム変異誘発（Ｓｉｃｅｓ、Ｈ． ＆ Ｋｒｉｓｔｉｅ、Ｔ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５、２８２８−２８３３）までにわたる。
【００２３】
プロテアーゼ特異性の合理的な設計は、非常に少ない例に限られている。このアプローチは、タンパク質におけるフォールディングおよびダイナミクスならびに構造−機能関係を統御する複雑性の理解が不十分なことによって非常に限定されている（Ｃｏｒｅｙ、Ｍ．Ｊ． ＆ Ｃｏｒｅｙ、Ｅ． （１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３： １１４２８−１１４３４）。したがって、予測しながらプロテアーゼの活性または特異性を変化させるためにその一次アミノ酸配列を変化させることは困難である。１つの成功した例では、Ｋｒｕｔｈらは、トリプシンが二塩基性の誘因（ｍｏｔｉｖｅｓ）に対して優先性を示すように操作した（Ｋｕｒｔｈ、Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：１１４３４−１１４４０）。別の例では、Ｈｅｄｓｔｒｏｍらが、トリプシンのＳ１基の特異性をキモトリプシンの特異性に変換した（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ、Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５： １２４９− １２５３）。これは、１つの既知の特性が１つの骨格から別の骨格へと移動した例である。
【００２４】
Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら（ＷＯ ９６／２７６７１）は、組み合わせ変異（Ｎ６２Ｄ／Ｇ１６６Ｄ、および必要に応じて Ｙ１０４Ｄ）を有するサブチリシン変異体を記載し、この変異体は、塩基性アミノ酸を基質のＰ１、Ｐ２、およびＰ４位に有する塩基性アミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチド基質に向かっての基質特異性のシフトを有する。変異体サブチリシンの適切な基質は、５つの連続するランダム化残基を含有するファージ粒子（基質ファージ）のライブラリーをソーティングすることによって明らかになった。これらのサブチリシン変異体は、塩基性基質リンカーを有する融合タンパク質を切断するため、および塩基性切断部位を含有するホルモンまたは他のタンパク質（インビトロまたはインビボ）を加工するために有用である。合理的な酵素の設計に関連する問題は、定方向進化によって部分的に克服され得る（ＰＣＴ／ＥＰ０３／０４８６４に開示される）。これらの研究は、それらの発現系および選択系によって分類され得る。遺伝子選択は、生物の内部に、結果として生成される生物の増殖挙動を変化させる前駆体タンパク質を切断することができる酵素（例えば、プロテアーゼ）を産生することを意味する。異なるプロテアーゼを有する生物の集団から、変化した増殖挙動を有するものが選択され得る。この原理は、例えば、Ｄａｖｉｓら（ＵＳ５２５８２８９、ＷＯ９６／２１００９）によって報告された。ファージ系の産生は、ファージタンパク質を切断することができるタンパク質分解酵素の存在下でのみ活性化され得るファージタンパク質の切断に依存する。他のアプローチは、遺伝子選択ではなくスクリーニングによる選択を可能とするレポーター系を使用するが、これもまた、酵素の細胞内特徴付けの本来的な不十分さを克服できない。
【００２５】
自己分泌酵素を用いた変更された配列特異性を有する酵素を生成する系もまた、報告されている。Ｄｕｆｆら（ＷＯ ９８／１１２３７）は、自己分泌プロテアーゼのための発現系を記載する。実験のデザインの必須の要素は、触媒反応が、膜結合前駆体分子の自己タンパク質分解プロセッシングによってプロテアーゼ自体に作用し、変異したプロテアーゼを細胞膜から細胞外環境に放出することである。それゆえ、標的ペプチド配列が天然の切断部位を自己タンパク質分解のために置換した融合タンパク質が構築されなければならない。このような系の制限は、肯定的に同定されたプロテアーゼが特定のアミノ酸配列を切断する能力を有するが、それらはまた多くの他のペプチド配列も切断し得ることである。それゆえ、高い基質特異性は、達成され得ない。さらに、このような系は、規定されたアミノ酸配列における特定の位置での選択されたプロテアーゼ切断を制御できず、選択されたプロテアーゼの速度定数の正確な特徴付けができない（ｋ_cat、Ｋ_M）。
【００２６】
α／β−バレルタンパク質内で新たな触媒活性および特異性の生成を目的とする方法が記載されている（ＷＯ ０１／４２４３２ ； Ｆｅｒｓｈｔ ｅｔ ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｎｏｖｅｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ； Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３、６１７−６２２）。α／β−バレルタンパク質は、全ての既知の酵素の大きな部分を占めるタンパク質の大きなスーパーファミリーを含む。このタンパク質の構造は、α−ヘリクスによって囲まれたα／β−バレルからなっている。β−鎖およびヘリクスをつないでいるループは、活性部位残基を含む、いわゆる、リッド（ｌｉｄ（ふた））構造を含む。この方法は、触媒リッド構造に基づく２つのクラスへのα／β−バレルタンパク質の分類に基づく。α／β−バレルタンパク質構造の集中的な比較により、執筆者らは、基質結合および特異性は、基本的にバレル構造により規定されるのに対して、化学反応の特異性は、ループ内に存在するという結論に至った。異なる酵素からのバレルおよびリッド構造は、標的化またはランダム化された変異誘発および選択によって、新たな酵素活性を生成し、そして特性を最適化するための出発点を提供するために組み合わせられ得ることが示唆される。
【００２７】
まとめると、治療、研究、および診断、工業酵素、食品および食品加工、化粧品、ならびに新規な基質特異性を有する酵素が入手可能になることによって可能になるその他の領域の分野において、多くの適用の可能性が存在することが明らかである。しかし、これまで、わずかに限られた数の特異的酵素が天然源から同定されているにすぎない。配列特異性を修飾し、変更し、または移動させるための合理的な設計方法ならびに上記のランダムアプローチは、利用された出発物質に存在しなかった新規かつユーザーが任意に決定することができる特異性の作成を可能にしなかった。
【００２８】
それゆえ、現在利用可能な方法はいずれも、新規かつユーザーにより定義された配列特異性を有する酵素を提供することができない。対照的に、本発明は、このような酵素ならびにそれらを生成する方法を提供する。
【発明の開示】
【００２９】
（発明の要旨）
本発明の目的は、人工タンパク質であって、このようなタンパク質を操作するために使用された成分中に存在しない新規な機能を有する人工タンパク質を提供することである。特に、本発明は、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有する酵素を提供する。ユーザーが任意に定義することができる特異性とは、酵素が、そのような酵素の操作に使用した成分中に存在しない特異性を有して提供されることを意味する。特異性は、１つ以上の意図された標的基質が優先的に認識され、その酵素によって変換されるように、ユーザーによって選択され得る。さらに、本発明は、ヒトタンパク質と本質的に同一の配列を有するが、異なる特異性を有する酵素を提供する。１つの特定の実施形態では、本発明は、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有するプロテアーゼを提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、１つ以上のさらなる成分と融合された人工酵素に関する。これらのさらなる成分は、好ましくは結合特性を有し、基質結合ドメイン、抗体、受容体、またはこれらのフラグメントからなる群のタンパク質様の成分であり得る。さらに、これらのさらなる成分は、さらなる機能的成分、好ましくは、ポリエチレングリコール、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、金属、金属キレート剤、およびこれらのフラグメントまたは誘導体からなる群から選択され得る。生じる融合タンパク質は、本発明の範囲内のユーザーが任意に定義することができる特異性を有する酵素として理解される。
【００３１】
加えて、本発明は、新規な、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有するこのような酵素を、治療、研究、診断、栄養学、パーソナルケア、または工業目的に適用することに関する。さらに、本発明は、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有する人工酵素を生成するための方法に関する。特に、本発明は、ヒト酵素と本質的に同一の配列を有するが、異なる特異性を有する酵素を生成することに関する。
【００３２】
この課題は、下記の説明および請求の範囲において特定される本発明の実施形態によって解決されている。したがって、本発明は、
（１）下記の成分：（ａ）スクリーニング１つの基質におけるスクリーニング１つの化学反応を触媒するタンパク質足場、および（ｂ）生じる人工タンパク質が少なくとも１つの標的基質と１つ以上の異なる基質とを区別できるようにする上記タンパク質足場中の部位に存在する１つ以上の特異性決定領域（ＳＤＲ）であって、本質的に合成ペプチド配列である上記ＳＤＲ、（ｃ）の組み合わせによって特徴付けられる規定された特異性を有する人工酵素、
（２）治療、研究、診断、栄養学、パーソナルケア、または工業目的のための上記（１）に記載の人工酵素の使用、
（３）標的基質に対する特異性（その特異性は、個々の出発成分には存在しない）を有する上記（２）に記載の人工酵素を作製するための方法であって、少なくとも以下の工程：（ａ）少なくとも１つの基質上での少なくとも１つの化学反応を触媒するタンパク質足場を提供する工程、（ｂ）工程（ａ）からの上記タンパク質足場を、完全にまたは部分的に、ランダムペプチド配列と、得られる人工酵素が少なくとも１つの標的基質と１つ以上の異なる基質とを区別できるようなタンパク質足場における部位で組み合わせることによって、人工酵素のライブラリーを作製する工程、ならびに（ｃ）工程（ｂ）で作製された人工酵素の上記ライブラリーから、少なくとも１つの標的基質に対する特異性を有する１つ以上の酵素を選択する工程、を含む方法、
（４）上記（１）に記載の少なくとも１つの人工酵素、ならびに少なくとも１つのさらなる成分、好ましくは、結合特性を有し、より好ましくは、抗体、結合ドメイン、受容体、およびこれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる成分から構成される融合タンパク質、
（５）上記（１）に記載の１つ以上の人工酵素または上記（４）に記載の融合タンパク質を含む組成物または薬学的組成物であって、上記薬学的組成物は、必要に応じて、許容できる担体、賦形剤、および／もしくは助剤を含み得る、組成物または薬学的組成物、
（６）上記（１）に記載の人工酵素をコードするＤＮＡ、
（７）上記（６）に記載のＤＮＡを含有するベクター、
（８）上記（７）に記載のベクターおよび／または上記（６）に記載のＤＮＡを含有するベクターで形質転換／トランスフェクトされた宿主細胞ならびにトランスジェニック生物、ならびに
（９）上記（８）に記載の細胞または生物を培養する工程およびその培養液から酵素を単離する工程を含む人工酵素を製造する方法。
【００３３】
（定義）
本発明の枠組みにおいては、以下の用語および定義が使用される。
【００３４】
用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解し得る任意のタンパク質分子を意味する。これは、天然に存在するタンパク質分解酵素または人工のタンパク質分解酵素、ならびに部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発または任意の他のタンパク質操作法によって得られるこれらの変異体、タンパク質分解酵素の活性部位フラグメント、または上述のタンパク質の１つを含む任意の分子複合体もしくは融合タンパク質を含む。「プロテアーゼのキメラ」は、異なる親プロテアーゼに由来する２つ以上のフラグメントの融合タンパク質を意味する。
【００３５】
用語「基質」は、酵素による触媒作用によって変換し得る任意の分子を意味する。用語「ペプチド基質」は、任意のペプチド、オリゴペプチド、またはプロテアーゼによって触媒作用により加水分解され得るペプチド結合を含む任意のアミノ酸組成物、配列もしくは長さのタンパク質分子を意味する。加水分解されるペプチド結合は、「切断部位」と呼ばれる。基質中の位置の番号付けは、Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ ＆ Ｂｅｒｇｅｒによって導入されたシステムにしたがって行った（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２７ （１９６７） １５７−１６２）。切断部位のＮ末端に隣接するアミノ酸残基は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３などと番号付けされ、切断部位のＣ末端に隣接する残基は、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’などと番号付けされる。
【００３６】
用語「標的基質」は、本発明の酵素によって特異的に認識され、変換されるユーザーによって定義される基質を記載する。用語「標的ペプチド基質」は、ユーザーによって定義されるペプチド基質を記載する。用語「標的特異性」は、標的基質を認識し、変換することができる酵素の定性的および定量的な特異性を記載する。酵素の触媒特性は、ミカエリスおよびメンテンの定義に従う速度論パラメータ「Ｋ_M」または「ミカエリスメンテン定数」、「ｋ_cat」または「触媒速度定数」、「ｋ_cat／Ｋ_M」または「触媒効率」を使用して表される（Ｆｅｒｓｈｔ、Ａ． 、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５）。用語「触媒活性」は、規定された反応条件下での所定の基質の変換を定量的に記載する。
【００３７】
用語「特異性」は、特定の基質を優先的に認識し、変換する酵素の能力を意味する。特異性は、定性的にも定量的にも表現することができる。「定量的特異性」とは、酵素によって認識される基質残基の化学的性質を意味する。「定量的特異性」とは、基質として受け入れられる基質の数のことをいう。定量的特異性は、全ての受け入れられる基質の数を全ての可能な基質の数で除算したものの負の対数として定義される語句「ｓ」によって表され得る。例えば、全ての可能なペプチド基質の小部分を優先的に受け入れるプロテアーゼは、「高い特異性」を有する。ほとんど全てのペプチド基質を受け入れるプロテアーゼは、「低い特異性」を有する。定義は、ＷＯ ０３／０９５６７０（これは本明細書中に参考として組み込まれる）に従ってなされる。非常に低い特異性を有するプロテアーゼはまた「非特異的プロテアーゼ」と呼ばれる。用語「規定された特異性」とは、特定の種類の特異性、すなわち、その他の基質に対して優先的に変換される特定の標的基質または特定の標的基質のセットのことをいう。
【００３８】
用語「人工（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、用語「酵素」と組み合わされて、異なる成分を含み、個々の成分のみによっては与えられない特徴を有する酵素を記載する。
【００３９】
用語「タンパク質足場」または「足場タンパク質」とは、種々の一次、二次、および三次ポリペプチド構造のことをいう。
【００４０】
用語「ペプチド配列」とは、タンパク質足場との挿入もしくは置換のため、または組み合わせのために使用される任意のペプチド配列を示す。ペプチド配列は、通常、周知の技術に従って合成され得るか、または天然源から得られ得るＤＮＡ配列から発現により得られる。タンパク質足場との挿入、置換、組み合わせは、オリゴヌクレオチドを、タンパク質足場をコードするポリヌクレオチドへ挿入、置換、または組み合わせることによって生成される。用語「合成」は、用語「ペプチド配列」と組み合わせて、そのペプチド配列が挿入もしくは置換されたか、またはそれが組み合わされたタンパク質足場に存在しないペプチド配列のことをいう。
【００４１】
用語「成分」は、用語「人工酵素」と組み合わせて、このような酵素の操作において組み合わされるペプチド配列またはポリペプチド配列を意味する。このような成分は、とりわけ、１つ以上のタンパク質足場および１つ以上の合成ペプチド配列を含み得る。用語「人工酵素のライブラリー」は、人工酵素の混合物を記載し、そこではいかなる単一の人工酵素も異なるポリヌクレオチド配列によってコードされる。用語「遺伝子ライブラリー」は、人工酵素のライブラリーをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを示す。用語「ＳＤＲ」または「特異性決定領域」は、得られる酵素が標的基質と１つ以上の例えば、の基質とを区別できるような部位でタンパク質足場と組み合わされたときに規定された特異性を提供する合成ペプチド配列を意味する。このような部位は、「ＳＤＲ部位」と呼ばれる。
【００４２】
用語「の構造と類似した３次構造」および「類似した３次構造」は、用語「酵素」または「タンパク質」と組み合わされて、種類、配列、結合性、およびタンパク質の典型的２次構造要素の相対配位（例えば、アルファへリックス、ベータシート、ベータターン、およびループ）が類似しており、それゆえそのタンパク質が同じ構造的または位相幾何学的なクラスまたは集団にグループ分けされるタンパク質のことをいう。これは、任意の種類の変更された、追加の、または欠失された構造要素を有するが、それ以外は変化していない位相幾何学を有するタンパク質を含む。このような構造クラスの例は、ＴＮＦスーパーファミリー、セリンプロテアーゼ内のＳ１集団もしくはＳ８集団、ＧＰＣＲ、またはα／βバレル集団である。
【００４３】
用語「構造的に対応する位置」は、互いに構造的に対応する類似の３次構造中のアミノ酸を示す。すなわち、それらは通常同じ構造またはその構造の位相幾何学的要素内に位置する。構造要素内で、それらはその構造要素の始めおよび終わりに対して同じ相対的位置を有する。例えば、２つのタンパク質を位相幾何学的に比較することにより、異なる長さの２つの構造的に対応する配列、次いで、例えば、それぞれの領域の長さの２０％および４０％内のアミノ酸が構造的に違いに対応することが明らかになる。
【００４４】
用語「（本発明の）人工酵素のライブラリー」は、混合物または単離形態で存在し得る多数の酵素または酵素変異体のことをいう。
【００４５】
アミノ酸残基は、以下の表１に従って、１文字または３文字表記で略称される。
【表１】

【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、新規の機能を有する人工タンパク質を提供する。特に、本発明は、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有する酵素を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有するプロテアーゼを提供する。加えて、本発明は、このような新規の、ユーザーが任意に定義することができる特異性を有する酵素の、治療、研究、診断、栄養学、パーソナルケア、または工業用途への適用を提供する。さらに、本発明は、このような酵素を操作するために使用された成分中に存在しない特異性を有する酵素を生成するための方法を提供する。特に、本発明は、哺乳動物、特にヒトの酵素と本質的に同一である配列を有するが、異なる特異性を有する酵素の生成に関する。さらに、本発明は、遺伝子によりコードされた対応する特異性を有する特異的な人工酵素のライブラリー、遺伝子によりコードされた対応する特異性を有する特異的な人工酵素のライブラリーを生成する方法、ならびにこのようなライブラリーの技術、診断、栄養学、パーソナルケア、または研究目的への適用を提供する。
【００４７】
本発明の第一の局面は、規定された特異性を有する人工酵素を開示する。これらの人工酵素は、以下の成分によって特徴付けられる：
（ａ）基質上で少なくとも１つの化学反応を触媒し得るタンパク質足場、および
（ｂ）得られる人工タンパク質が少なくとも１つの標的基質と１つ以上の異なる基質とを区別できるようなタンパク質足場の部位に存在する１つ以上の特異性決定領域（ＳＤＲ）であって、本質的に合成ペプチド配列である、ＳＤＲ。
【００４８】
好ましくは、人工酵素のこのように規定された特異性は、タンパク質足場によって与えられない。
【００４９】
原則として、種々の一次、二次、および三次構造を有し得る。一次構造、すなわち、アミノ酸配列は、人工配列であるか、または任意のウイルス、原核生物、もしくは真核生物起源のものでありえる。しかしながら、ヒトの治療用途には、タンパク質足場は、好ましくは、哺乳動物由来のものであり、より好ましくは、ヒト由来のものである。さらに、タンパク質足場は、１つ以上の反応を触媒し得、そして好ましくは、低い特異性のみを有する。
【００５０】
好ましくは、タンパク質足場としての適用可能性のために改善された特性を付与する修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質足場の誘導体が使用される。このような改善された特性は、安定性、発現量もしくは分泌量、折り畳み（特に、タンパク質足場とＳＤＲとの組み合わせ後に）、活性化剤もしくは阻害剤のような調節剤に対する増大もしくは減少した感受性、免疫原性、触媒速度、ｋＭまたは基質親和性が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
人工酵素は、タンパク質足場と組み合わされた合成ペプチド配列から定量的特異性を明らかにする。それゆえ、人工ペプチド配列は、特異性決定領域またはＳＤＲとして作用する。このようなＳＤＲの数、長さ、および位置は、広範に変化し得る。足場内のＳＤＲの数は、少なくとも１個であり、好ましくは、１個以上、より好ましくは、２〜１１個、最も好ましくは、２〜６個である。ＳＤＲは、１〜５０アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは、１〜１５アミノ酸残基、より好ましくは、１〜６アミノ酸残基の長さを有する。あるいは、ＳＤＲは、２〜２０アミノ酸残基の長さ、好ましくは、２〜１０アミノ酸残基の長さ、より好ましくは、３〜８アミノ酸残基の長さを有する。
【００５２】
本発明の人工酵素は、定常領域および可変領域を含むが、非免疫グロブリン骨格を有し、かつ定常領域に活性部位（触媒活性）を有し、そのため活性部位の基質特異性が可変領域によって調節される抗体様分子としてもさらに記載され得る。好ましくは、免疫グロブリン構造においけると同様、可変領域は、標的分子と相互作用する可変の長さおよび組成のループ構造である。
【００５３】
本発明の特定の変異体において、人工酵素は、加水分解活性を有する。好ましい変異体において、人工酵素は、タンパク質分解活性を有する。この変異体のための特に好ましいタンパク質足場は、非特異的プロテアーゼもしくは非特異的プロテアーゼ由来の部分であるか、またはそうでなければ非特異的プロテアーゼに由来する。この観点および以下の変異体および実施形態において、「に由来する」または「その誘導体」という表現は、１つ以上のアミノ酸位置で変異し、および／または元々のタンパク質に対して少なくとも７０％、好ましくは、９０％、より好ましくは、９５％、および最も好ましくは、９９％の相同性を有し、および／またはタンパク質分解によりプロセスされ、および／または変化したグリコシル化パターンを有し、および／または非タンパク質物質に共有結合しているか、および／またはさらなるタンパク質ドメインに融合し、および／またはＣ末端および／もしくはＮ末端切断を有し、および／または特定の挿入、置換、および／もしくは欠失を有するタンパク質の誘導体のことをいう。あるいは、「に由来する」は、２つ以上のタンパク質からの２つ以上のフラグメントの組み合わせまたはキメラである誘導体のことをいうこともある。ここで、各々のフラグメントは、上述のいずれかまたは全ての修飾を必要に応じて含む。タンパク質足場の三次構造は、任意の種類のものであり得る。しかしながら、好ましくは、三次構造は、以下の構造クラスの１つに属する：クラスＳ１（セリンプロテアーゼファミリーのキモトリプシン集団）、クラスＳ８（セリンプロテアーゼファミリーのサブチリシン集団）、クラスＳＣ（セリンプロテアーゼファミリーのカルボキシペプチダーゼ集団）、クラスＡ１（アスパラギン酸プロテアーゼのペプシンＡ集団）、またはクラスＣ１４（システインプロテアーゼのカスパーゼ−１集団）。ヒト治療薬として使用するための人工タンパク質分解酵素のタンパク質足場として働くプロテアーゼの例は、ヒトトリプシン、ヒトトロンビン、ヒトキモトリプシン、ヒトペプシン、ヒトエンドチアペプシン（ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｉａｐｅｐｓｉｎ）、ヒトカスパーゼ１〜１４、および／またはヒトフリンであるか、またはこれらに由来する。
【００５４】
人工タンパク質分解酵素の規定された特異性は、少なくとも１つの標的ペプチドまたはタンパク質基質と、１つ以上のさらなるペプチドまたはタンパク質基質とを区別する能力の指標である。好ましくは、規定された特異性は、Ｐ１部位とは異なる他の位置で異なるペプチドまたはタンパク質基質を区別する能力をいい、より好ましくは、規定された特異性は、Ｐ１部位およびＰ１’部位とは異なる他の位置で異なるペプチドまたはタンパク質基質を区別する能力のことをいう。より好ましくは、人工タンパク質分解酵素は、標的ペプチドまたはタンパク質基質を、必要な限りできるだけ多くの部位で区別して、他のタンパク質に対して優先的に標的基質を加水分解する。例として、ヒトの身体において静脈内に適用される治療的に有用な人工タンパク質分解酵素は、標的基質とヒト血清中の任意の他のタンパク質とを区別するのに十分に特異的であるべきである。好ましくは、このような人工タンパク質分解酵素は、３個以上のアミノ酸位置、より好ましくは、４個以上の位置、そしてさらにより好ましくは、５個以上のアミノ酸位置でペプチド基質を認識し、区別する。これらの位置は、隣接していてもしていなくてもよい。
【００５５】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ１構造サブクラス（すなわち、キモトリプシン集団）の三次構造もしくは折り畳みと等しいかもしくは類似した三次構造または折り畳みを有し、および／またはセリンプロテアーゼのＳ１構造サブクラスのタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。ＳＤＲは、ヒトトリプシン１中の領域１８−２５、３８−４８、５４−６３、７３−８６、１２２−１３０、１４８−１５６、１６５−１７１、および１９４−２０４に対して構造的に、またはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域２０−２３、４１−４５、５７−６０、７６−８３、１２５−１２８、１５０−１５３、１６７−１６９、および１９７−２０１（配列番号１に従うアミノ酸配列の番号付け）に構造的に、またはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質足場に挿入されることが好ましい。この種のタンパク質足場と組み合わせられるべきＳＤＲの数は、好ましくは、１〜１０、より好ましくは、２〜４である。好ましくは、タンパク質足場は、以下のタンパク質の１つ以上の誘導体またはホモログである：キモトリプシン、グランザイム、カリクレイン、トリプシン、メソトリプシン、好中球エラスターゼ、膵エラスターゼ、エンテロペプチダーゼ、カテプシン、トロンビン、アンクロド、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、活性化プロテインＣ、ウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、Ｄｅｓｍｏｄｕｓ型プラスミノーゲン活性化因子。より好ましくは、タンパク質足場は、トリプシンもしくはトロンビンであり、またはトリプシンもしくはトロンビン由来の誘導体もしくはホモログである。ヒトの治療のための用途には、トリプシンまたはトロンビン足場は、免疫反応またはアレルギー反応の危険性を最小限にするために、最も好ましくは、ヒト由来である。好ましくは、ヒトトリプシンＩに由来する、または類似した三次構造を有するタンパク質に由来する改善された特徴を有する誘導体が使用される。このような誘導体の好ましい例は、ヒトトリプシンＩ（配列番号１）に由来し、そして１つ以上の以下のアミノ酸置換：Ｅ５６Ｇ；Ｒ７８Ｗ；Ｙ１３１Ｆ；Ａ１４６Ｔ；Ｃ１８３Ｒを有する。
【００５６】
２つのＳＤＲのうちの少なくとも１つが、ヒトトリプシンＩまたはその誘導体に、残基４２と４３との間（ＳＤＲ１）、および残基１２３と１２４との間（ＳＤＲ２）にそれぞれ挿入されていることが好ましい（配列番号１に従う番号付け）。さらに、ＳＤＲ１は、６という好ましい長さを、ＳＤＲ２は、５という好ましい長さを、それぞれ有する。この実施形態の好ましい変異体において、ＳＤＲ１およびＳＤＲ２の配列は、表２に列挙するアミノ酸配列の１つを含む。このような人工タンパク質分解酵素は、実施例ＩＶに例示されるように標的基質Ｂに対する特異性を有する。
【００５７】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ８構造サブクラスに属するか、および／または枯草菌由来のサブチリシンＥに類似する三次構造を有するか、および／またはセリンプロテアーゼのＳ８構造サブクラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場は、サブチリシンファミリーまたはヒトプロタンパク質コンバターゼに属する。ＳＤＲは、枯草菌由来のサブチリシンＥ中の領域６−１７、２５−２９、４７−５５、５９−６９、１０１−１１１、１１７−１２５、１２９−１３７、１３９−１５４、１５８−１６９、１８５−１９５、および２０４−２２５に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５９−６９、１０１−１１１、１２９−１３７、１５８−１６９、および２０４−２２５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号７に従う番号付け）。タンパク質足場は、１つ以上の以下のタンパク質に等しいかまたはそれらの誘導体またはホモログであることが好ましい：サブチリシンカールスバーグ、枯草菌サブチリシンＥ、サブチリシンＢＰＮ’、リケニホルミス菌、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓアルカリホスファターゼ、プロテインキナーゼＫ、ケクシン（ｋｅｘｉｎ）、ヒトプロタンパク質コンバターゼ、ヒトフリン。好ましい変異体において、サブチリシンＢＰＮ’またはタンパク質ＳＰＣ１〜７の１つが、タンパク質足場として使用される。
【００５８】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、アスパラギン酸プロテアーゼのファミリーに属するか、および／またはヒトペプチドに類似する三次構造を有する。好ましくは、足場は、プロテアーゼのＡ１クラスに属するか、および／またはプロテアーゼのＡ１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。ＳＤＲは、枯草菌由来のサブチリシンＥ中の領域６−１８、４９−５５、７４−８３、９１−９７、１１２−１２０、１２６−１３７、１５９−１６４、１８４−１９４、２４２−２４７、２６２−２６７、および２７７−３００に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１０−１５、７５−８０、１１４−１１８、１３０−１３４、１８６−１９１、および２８０−２９６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１１に従う番号付け）。タンパク質足場は、１つ以上の以下のタンパク質に等しいかまたはそれらの誘導体またはホモログであることが好ましい：ペプシン、キモシン、レニン、カテプシン、ヤプシン。好ましくは、ペプチドもしくはエンドチオペプシンまたはこれらの誘導体もしくはホモログがタンパク質足場として使用される。
【００５９】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのファミリーに属するか、および／またはヒトカスパーゼ７に類似する三次構造を有する。好ましくは、足場は、システインプロテアーゼのＣ１４クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ１４クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。ＳＤＲは、ヒトカスパーゼ７中の領域７８−９１、１４４−１６０、１８６−１９８、２２６−２４３、および２７１−２９１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域８０−８６、１４９−１５７、１９０−１９４、および２３３−２３８に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１４に従う番号付け）。タンパク質足場は、タンパク質足場は、カスパーゼ１〜９の１つに等しいか、またはその誘導体もしくはホモログであることが好ましい。
【００６０】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ１１クラスに属するか、またはセリンプロテアーゼのＳ１１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種Ｋ１５由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニントランスペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種Ｋ１５由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニントランスペプチダーゼ中の領域６７−７９、１３７−１５０、１９１−２０６、２１２−２２２、および２４１−２５１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域７０−７５、１４１−１４７、１９５−２０２、および２１６−２２０に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１５に従う番号付け）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種Ｋ１５由来のＤ−アラニン−Ｄ−アラニントランスペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６１】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ２１クラスに属するか、またはセリンプロテアーゼのＳ２１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒトサイトメガロウイルス由来のアセンブリン（ａｓｓｅｍｂｌｉｎ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒトサイトメガロウイルス由来のアセンブリン中の領域２５−３３、６４−６９、１３４−１５５、１６２−１６９、および２１７−２４４に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域２７−３１、１６４−１６８、および２２２−２３９に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１６に従う番号付け）。ヒトサイトメガロウイルス由来のアセンブリンまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６２】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ２６クラスに属するか、またはセリンプロテアーゼのＳ２６クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または大腸菌由来のシグナルペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、大腸菌由来のシグナルペプチダーゼ中の領域８−１４、５７−６８、１２５−１３４、２３９−２５４、２００−２１１、および２２８−２３９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域９−１３、６０−６７、１２７−１３２、および２０３−２０９に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１７に従う番号付け）。大腸菌由来のシグナルペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６３】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ３３クラスに属するか、またはセリンプロテアーゼのＳ３３クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または大腸菌由来のシグナルペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、セラチア・マルセッセンス由来のプロピルアミノペプチダーゼ中の領域４７−５４、１５２−１６０、２０３−２１２、および２９７−３０２に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５０−５３、１５４−１５８、および２０６−２１０に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１８に従う番号付け）。セラチア・マルセッセンス由来のプロピルアミノペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６４】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、セリンプロテアーゼのＳ５１クラスに属するか、またはセリンプロテアーゼのＳ５１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または大腸菌由来のアスパルチルジペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、大腸菌由来のアスパルチルジペプチダーゼ中の領域８−１６、３８−４６、８５−９２、１３２−１４０、１５９−１７０、および２０５−２１１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１０−１４、８７−９０、１３４−１３８、および１６０−１６５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号１９に従う番号付け）。大腸菌由来のアスパルチルジペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６５】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、アスパラギン酸プロテアーゼのＡ２クラスに属するか、またはアスパラギン酸プロテアーゼのＡ２クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒト免疫不全ウイルス由来のプロテアーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒト免疫不全ウイルス由来のプロテアーゼ中の領域５−１２、１７−２３、２７−３０、３３−３８、および７７−８３に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域７−１０、１８−２１、３４−３７、および７９−８２に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２０に従う番号付け）。ヒト免疫不全ウイルス、好ましくは、ＨＩＶ−１プロテアーゼ由来のプロテアーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６６】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、アスパラギン酸プロテアーゼのＡ２６クラスに属するか、またはアスパラギン酸プロテアーゼのＡ２６クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または大腸菌由来のオンプチン（ｏｍｐｔｉｎ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、大腸菌由来のオンプチン中の領域２８−４０、８６−９８、１５０−１６８、２１３−２１９、および２６７−２７８に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域３３−３８、１６１−１６８、および２７３−２７７に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２１に従う番号付け）。大腸菌由来のオンプチン由来のプロテアーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６７】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ１クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはカリーカ・パパイヤ由来のパパインに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、カリーカ・パパイヤ由来のパパイン中の領域１７−２４、６１−６８、８８−９５、１３５−１４２、１５３−１５８、および１７６−１８４に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域６３−６６、１３６−１３９、および１７７−１８１に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２２に従う番号付け）。カリーカ・パパイヤ由来のパパイン由来のプロテアーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６８】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ２クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ２クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒトカルパイン−２に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒトカルパイン−２中の領域９０−１０３、１６０−１７２、１９３−１９９、２４３−２６０、２８６−２９４、および３１６−３２２に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域９２−１０１、２４５−２５０、および２８７−２９１に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２３に従う番号付け）。ヒトカルパイン−２由来のプロテアーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００６９】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ４クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ４クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはタバコエッチウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）由来のＮＩａプロテアーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、タバコエッチウイルス由来のＮＩａプロテアーゼ中の領域２３−３１、１１２−１２０、１４４−１５０、１６８−１７６、および２０５−２１８に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１４５−１４９、１６９−１７４、および２１２−２１８に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２４に従う番号付け）。タバコエッチウイルス由来のＮＩａプロテアーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７０】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ１０クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ１０クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または化膿性連鎖球菌由来のストレプトパイン（ｓｔｒｅｐｔｏｐａｉｎ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、化膿性連鎖球菌由来のストレプトパイン中の領域８１−９０、１３３−１４０、１５０−１６４、１９１−１９９、２１９−２２９、２４６−２５６、３０６−３１２、および３３０−３３７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域８２−８７、１３４−１３８、２５０−２５４、および３３１−３３５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２５に従う番号付け）。化膿性連鎖球菌由来のストレプトパインまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７１】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ１９クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ１９クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒトユビキチン特異的プロテアーゼ７に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒトユビキチン特異的プロテアーゼ７中の領域３−１５、６３−７０、８０−８６、２４８−２５６、２７２−２８３、および２９２−３０４に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１０−１５、２５１−２５５、２７７−２８１、および２９８−３０４に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２６に従う番号付け）。ヒトユビキチン特異的プロテアーゼ７またはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい
【００７２】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ４７クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ４７クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または黄色ブドウ球菌由来のスタフォパイン（ｓｔａｐｈｏｐａｉｎ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、黄色ブドウ球菌由来のスタフォパイン中の領域１５−２３、５７−６６、１０８−１１９、１４２−１４９、および１５７−１６４に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１７−２２、１１１−１１７、１４３−１４７、および１５９−１６３に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２７に従う番号付け）。黄色ブドウ球菌由来のスタフォパインまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７３】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ４８クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ４８クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＵｌｐ１エンドペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、出芽酵母由来のＵｌｐ１エンドペプチダーゼ中の領域４０−５１、１０８−１１５、１３２−１４１、１７３−１７９、および５９７−６０５に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域４３−４９、１１０−１１３、１３３−１３７、および１７５−１７８に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２８に従う番号付け）。出芽酵母由来のＵｌｐ１エンドペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７４】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、システインプロテアーゼのＣ５６クラスに属するか、またはシステインプロテアーゼのＣ５６クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＰｆｐｌエンドペプチダーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＰｆｐｌエンドペプチダーゼ中の領域８−１６、４０−４７、６６−７３、１１８−１２５、および１４７−１５３に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域９−１４、６８−７１、１２０−１２３、および１４８−１５１に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号２９に従う番号付け）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のＰｆｐｌエンドペプチダーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７５】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、メタロプロテアーゼのＭ４クラスに属するか、またはメタロプロテアーゼのＭ４クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のサーモリシンに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のサーモリシン中の領域１０６−１１８、１２５−１３０、１５２−１６０、１９７−２０４、２１０−２１３、および２２１−２２９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１０８−１１５、１２６−１２９、１９９−２０３、および２２３−２２７に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３０に従う番号付け）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のサーモリシンまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７６】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、メタロプロテアーゼのＭ１０クラスに属するか、またはメタロプロテアーゼのＭ１０クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒトコラゲナーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒトコラゲナーゼ中の領域２−７、６８−７９、８５−９０、１０７−１１１、および１３５−１４１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域３−６、７１−７８、および１３６−１４０に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３１に従う番号付け）。ヒトコラゲナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７７】
人工酵素は、グリコシダーゼ活性を有することがさらに好ましい。この変異体について特に適したタンパク質足場は、グリコシダーゼであるか、またはグリコシダーゼに由来するものである。好ましくは、三次構造は、以下の構造クラスの１つに属する：クラスＧＨ１３、ＧＨ７、ＧＨ１２、ＧＨ１１、ＧＨ１０、ＧＨ２８、ＧＨ２６、およびＧＨ１８（ベータ／アルファ）８バレル。
【００７８】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ１３クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ１３クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはヒト膵アルファアミラーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、ヒト膵アルファアミラーゼ中の領域５０−６０、１００−１１０、１４８−１６７、２３５−２４４、３０２−３１０、および３４６−３５９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５１−５８、１４８−１５５、および３０３−３０９に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３２に従う番号付け）。ヒト膵アルファアミラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００７９】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ７クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ７クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ中の領域４７−５６、９３−１０４、１７３−１８２、２１５−２２３、２２９−２３６、および３２２−３３４に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１７５−１８０、２１８−２２２、および３２４−３３２に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３３に従う番号付け）。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８０】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ１２クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ１２クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のセルラーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のセルラーゼ中の領域１８−２８、５５−６０、１０６−１１３、１２６−１３２、および１４９−１５９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域２０−２６、５６−５９、１０８−１１２、および１５１−１５６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３４に従う番号付け）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のセルラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８１】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ１１クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ１１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のトキシラナーゼ（ｔｏｘｙｌａｎａｓｅ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のトキシラナーゼ中の領域７−１４、３３−３９、８８−９７、１１４−１２６、および１５８−１６７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域２０−２６、５６−５９、１０８−１１２、および１５１−１５６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３５に従う番号付け）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のトキシラナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８２】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ１０クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ１０クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のトキシラナーゼ（ｔｏｘｙｌａｎａｓｅ）に類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のトキシラナーゼ中の領域２１−２９、４２−５０、８４−９２、１３０−１３６、２０６−２１７、および２６９−２７８に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域４３−４９、８６−９０、２０８−２１３、および２７１−２７６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３６に従う番号付け）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のトキシラナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８３】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ２８クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ２８クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のペクチナーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のペクチナーゼ中の領域８２−８８、１１８−１２６、１７１−１７８、２２８−２３６、２５６−２６４、および２８９−２９９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１１６−１２４、１７４−１７８、および２９１−２９６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３７に従う番号付け）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のペクチナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８４】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ２６クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ２６クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ由来のマンナナーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ由来のマンナナーゼ中の領域７５−８３、１１３−１２５、１７４−１８２、２１７−２２４、２４７−２５４、３２４−３３２、および３２５−３４０に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１１５−１２３、１７６−１８０、２８６−２９１、および３２８−３３７に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３８に従う番号付け）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ由来のマンナナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８５】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、グリコシラーゼのＧＨ１８（ベータ／アルファ）８クラスに属するか、またはグリコシラーゼのＧＨ１８（ベータ／アルファ）８クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のキチナーゼに類似した三次構造を有する。ＳＤＲは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のキチナーゼ中の領域２１−２９、５７−６５、１３０−１３６、１７６−１８３、２２１−２２９、２４９−２５７、および３２７−３３７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５９−６３、１７８−１８１、２５０−２５４、および３３０−３３６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号３９に従う番号付け）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のキチナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８６】
人工酵素がエステル加水分解酵素活性を有することがさらに好ましい。好ましくは、この変異体についてのタンパク質足場は、リパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、またはホスホジエステラーゼ活性を有する。
【００８７】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、エステラーゼのＧＸクラスに属するか、またはエステラーゼのＧＸクラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢに類似した三次構造を有する。好ましくは、足場はリパーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢ中の領域１３９−１４８、１８８−１９５、２１６−２２４、２５６−２６６、２７２−２８７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１４１−１４６、２１８−２２２、２５９−２６３、および２７５−２８３に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４０に従う番号付け）。Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８８】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、エステラーゼのＧＸクラスに属するか、またはエステラーゼのＧＸクラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはモルモット由来の膵リパーゼに類似した三次構造を有する。好ましくは、足場はリパーゼ活性を有する。ＳＤＲは、モルモット由来の膵リパーゼ中の領域７８−９０、９１−１００、１１２−１２０、１７９−１８６、２０７−２１８、２３８−２４７、および２４８−２６０に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域８０−８７、１１４−１１８、２０９−２１５、および２３９−２４６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４１に従う番号付け）。モルモット由来の膵リパーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００８９】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、大腸菌由来のアルカリホスファターゼの構造に類似した三次構造を有するか、または大腸菌由来のアルカリホスファターゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はホスファターゼ活性を有する。ＳＤＲは、大腸菌由来のアルカリホスファターゼ中の領域１１０−１２２、１８７−１４２、１７０−１７５、１８６−１９３、２８０−２８７、および４２５−４３５に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１７１−１７４、１８７−１９１、２８２−２８６、および４２６−４３３に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４２に従う番号付け）。大腸菌由来のアルカリホスファターゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９０】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、ウシ膵臓デスオキシリボヌレアーゼＩの構造に類似した三次構造を有するか、またはウシ膵臓デスオキシリボヌレアーゼＩの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はホスホジエステラーゼ活性を有する。より好ましくは、ヌクレアーゼ、そして最も好ましくは、非特異的エンドヌクレアーゼまたはその誘導体が、足場として使用される。ＳＤＲは、ウシ膵臓デスオキシリボヌレアーゼＩ中の領域１４−２１、４１−４７、７２−７７、９７−１１１、１３５−１４３、１７１−１７８、２０２−２０９、および２４２−２５１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１６−１９、４２−４６、１３６−１４１、および１７２−１７６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４３に従う番号付け）。ウシ膵臓デスオキシリボヌレアーゼＩもしくはヒトデスオキシリボヌレアーゼ１またはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。人工酵素がトランスフェラーゼ活性を有することがさらに好ましい。この変異体について特に適したタンパク質足場は、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼまたはメチルトランスフェラーゼであり、またはその誘導体である。この変異体について特に好ましいタンパク質足場は、グリコシルトランスフェラーゼであり、またはグリコシルトランスフェラーゼに由来する。タンパク質足場の三次構造は、任意の種類のものであり得る。しかしながら、好ましくは、三次構造は、以下の構造クラスの１つに属する：ＧＨ１３、およびＧＴ１。
【００９１】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、トランスフェラーゼのＧＨ１３クラスに属するか、またはトランスフェラーゼのＧＨ１３クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼの構造に類似した三次構造を有する。好ましくは、足場はトランスフェラーゼ活性を有し、より好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼが足場として使用される。ＳＤＲは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ中の領域３８−４８、８５−９４、１４２−１５４、１７８−１８６、２５９−２６６、３３１−３４０、および３６７−３７７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域８７−９２、１８０−１８５、２６１−２６４、および２６９−２７５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４４に従う番号付け）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９２】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、トランスフェラーゼのＧＴ１クラスに属するか、またはトランスフェラーゼのＧＴ１クラスのタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有するか、および／またはＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ａ８２８４６由来のグリコシルトランスフェラーゼの構造に類似した三次構造を有する。好ましくは、足場はトランスフェラーゼ活性を有し、より好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ａ８２８４６由来のグリコシルトランスフェラーゼ中の領域５８−７４、１３０−１３８、１８５−１９３、２２８−２３６、および３１４−３２３に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域６１−７１、２３０−２３４、および３１６−３２１に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４５に従う番号付け）。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ａ８２８４６由来のグリコシルトランスフェラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９３】
人工酵素は、酸化還元酵素活性を有することがさらに好ましい。この変異体に特に適したタンパク質足場は、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ、またはこれらの誘導体である。タンパク質足場の三次構造は、任意の種類のものであり得る。
【００９４】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来の２、３−ジヒドロキシビフェニル ジオキシゲナーゼ（２、３−ｄｉｐｈｙｄｒｏｘｙｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の構造に類似した三次構造を有するか、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来の２、３−ジヒドロキシビフェニル ジオキシゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はジヒドロゲナーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来の２、３−ジヒドロキシビフェニル ジオキシゲナーゼ中の領域１７２−１８５、１９８−２０６、２３１−２３７、２５０−２５９、および２８２−２８７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１７５−１８２、２００−２０４、２５２−２５７、および２８４−２８７に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４６に従う番号付け）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来の２、３−ジヒドロキシビフェニル ジオキシゲナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９５】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種由来のカテコールジオキシゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種由来のカテコールジオキシゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はジオキシゲナーゼ活性を有し、より好ましくは、カテコールジオキシゲナーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種由来のカテコールジオキシゲナーゼ中の領域６６−７２、１０５−１１２、１５６−１７１、および１９８−２０７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域１０７−１１０、１６１−１７１、および２０１−２０５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４７に従う番号付け）。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種由来のカテコールジオキシゲナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９６】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカンファー−５−モノオキシゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカンファー−５−モノオキシゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はモノオキシゲナーゼ活性を有し、より好ましくは、カンファーモノオキシゲナーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカンファー−５−モノオキシゲナーゼ中の領域２６−３１、５７−６３、８４−９８、１８２−１９１、２４２−２５６、２９２−２９９、および３９２−３９９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域８５−９６、１８３−１８８、２４４−２５３、２９３−２９８、および３９３−３９８に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４８に従う番号付け）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカンファー−５−モノオキシゲナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９７】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、Ｅｑｕｕｓ ｃａｌｌａｂｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＥｑｕｕｓ ｃａｌｌａｂｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｅｑｕｕｓ ｃａｌｌａｂｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ中の領域４９−６３、１１１−１１２、２９４−３０１、および３６１−３６９に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５１−６１、および２９５−２９９に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号４８に従う番号付け）。Ｅｑｕｕｓ ｃａｌｌａｂｕｓ由来のアルコールデヒドロゲナーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【００９８】
人工酵素は、リアーゼ活性を有することがさらに好ましい。この変異体に特に適したタンパク質足場は、オキソ酸リアーゼ、またはその誘導体である。この変異体について特に好ましいタンパク質足場は、アルドラーゼもしくはシンターゼ、またはこれらの誘導体である。タンパク質足場の三次構造は、任意の種類のものであり得るが、（ベータ／アルファ）８バレル構造が好ましい。
【００９９】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチル−ｄ−ニューラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｃ ａｃｉｄ ａｌｄｏｌａｓｅ）の構造に類似した三次構造を有するか、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチル−ｄ−ニューラミン酸アルドラーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はアルドラーゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチル−ｄ−ニューラミン酸アルドラーゼ中の領域４５−５５、７８−８７、１０５−１１３、１３７−１４６、１６４−１７１、１８７−１９３、２０５−２１０、２４４−２５５、および２６９−２７６に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域４５−５２、１３８−１４４、１８９−１９２、２４７−２５３、および２７１−２７５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号５０に従う番号付け）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＮ−アセチル−ｄ−ニューラミン酸アルドラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【０１００】
さらなる実施形態において、タンパク質足場は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のトリプトファンシンターゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のトリプトファンシンターゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。好ましくは、足場はシンターゼ活性を有する。ＳＤＲは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のトリプトファンシンターゼ中の領域５６−６３、１２７−１３４、１５４−１６１、１７５−１９３、２０９−２１６、および２３０−２４０に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域５７−６２、１５５−１６０、１７８−１９０、および２１０−２１５に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号５１に従う番号付け）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のトリプトファンシンターゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【０１０１】
人工酵素は、イソメラーゼ活性を有することがさらに好ましい。この変異体に特に適したタンパク質足場は、変換アルドラーゼ（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ａｌｄｏｓｅ）もしくは変換ケトース（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｋｅｔｏｓｅ）、またはこれらの誘導体である。
【０１０２】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のキシロースイソメラーゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のキシロースイソメラーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。ＳＤＲは、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のキシロースイソメラーゼ中の領域１８−３１、９２−１０３、１３６−１４７、１７８−１８８、および２５０−２５７に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域２０−２７、９２−９９、および１８０−１８６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号５２に従う番号付け）。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のキシロースイソメラーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【０１０３】
人工酵素は、リガーゼ活性を有することがさらに好ましい。この変異体に特に適したタンパク質足場は、ＤＮＡリガーゼまたはその誘導体である。
【０１０４】
第一の実施形態において、タンパク質足場は、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７由来のＤＮＡリガーゼの構造に類似した三次構造を有するか、またはＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７由来のＤＮＡリガーゼの構造に類似した三次構造を有するタンパク質に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を有する。ＳＤＲは、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７由来のＤＮＡリガーゼ中の領域５２−６０、９４−１０８、１１９−１３１、２４１−２４８、２５５−２６３、および３０２−３１８に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、より好ましくは、領域９６−１０６、１２１−１２９、２５６−２６２、および３０４−３１６に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの１つ以上の位置で、タンパク質に挿入される（配列番号５３に従う番号付け）。Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７由来のＤＮＡリガーゼまたはその誘導体もしくはホモログが足場として使用されることが、好ましい。
【０１０５】
本発明の第二の局面は、治療、研究、診断、栄養学、パーソナルケア、工業用途のための特異性を有する人工酵素の適用に関する。この適用は、少なくとも以下の工程を含む：
（ａ）その加水分解が意図された目的、例えば、疾患の治癒、疾患の診断、ヒトもしくは動物栄養学のための成分の加工、またはその他の技術的プロセスに関して正の効果を有する標的ペプチド基質の同定；
（ｂ）工程（ａ）において同定された標的ペプチドに特異的な酵素である、人工酵素の提供；ならびに
（ｃ）意図された目的のための、工程（ｂ）において提供された酵素の使用。
【０１０６】
本発明の第一の局面の第一の変異体において、人工酵素は、疾患関連標的基質を不活性化させるための治療手段として使用される。この適用は、少なくとも以下の工程を包含する：
（ａ）疾患に関連し、その不活性化が疾患に関して正の効果を有する標的基質の同定、および標的基質内の標的部位の決定であって、その標的部位での修飾がその標的基質の不活性化を導くという事実によって特徴付けられる標的部位の決定、
（ｂ）人工酵素の提供であって、その酵素が工程（ａ）で同定した標的部位に対して特異的である、酵素の提供、ならびに
（ｃ）ヒトの体内または体外での上記標的基質の不活性化のための上記酵素の使用。
【０１０７】
好ましい実施形態において、工程（ｃ）に提供される人工酵素の足場は、ヒトの身体への上記酵素の適用に伴う免疫原性またはアレルギー性の効果を避けるかまたは低減するために、ヒト由来のものである。この変異体のより好ましい実施形態において、足場は、ヒトプロテアーゼであり、加水分解はそのペプチドまたはタンパク質標的の活性化または不活性化を導く。潜在的なペプチドまたはタンパク質標的には、サイトカイン、成長因子、ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、凝固カスケード由来の酵素、セルピン、免疫グロブリン、可溶性もしくは膜結合レセプター、細胞もしくはウイルス表面タンパク質、ペプチドドラッグ、タンパク質ドラッグが含まれる。
【０１０８】
特に好ましい実施形態は、人工酵素がヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を切断し得るという知見に基づいている。したがって、人工酵素または融合タンパク質は、炎症性疾患（ならびにＴＮＦ−αに関連する他の疾患）の処置のための医薬の調製のために使用され得る。好ましくは、上記人工酵素または上記融合タンパク質は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｈＴＮＦ−α）を特異的に不活性化し得、より好ましくは、上記人工酵素または上記融合タンパク質は、ｈＴＮＦ−α（配列番号９６）中の３１／３２、３２／３３、４４／４５、８７／８８、１２８／１２９、および／または１４１／１４２位間（最も好ましくは、３１／３２および３２／３３位間）のペプチド結合を加水分解し得る。
【０１０９】
さらなる実施形態において、標的基質は、人工酵素によって活性化されるプロドラッグである。この変異体の特定の実施形態において、人工酵素は、タンパク質分解活性を有し、標的基質は、タンパク質分解的に活性化されているタンパク質標的である。このようなプロドラッグの例は、凝固因子の不活化形態のようなプロタンパク質である。別の特定の変異体において、人工酵素は、酸化還元酵素であり、標的基質は、酸化により活性化され得る化学物質である。
【０１１０】
本発明のこの局面の第二の変異体において、人工酵素は、工業的にまたは栄養学的に重要な反応を規定された特異性でもって触媒するための技術的手段として使用される。この変異体の特定の実施形態において、人工酵素はタンパク質分解活性を有し、触媒される反応は、タンパク質分解プロセスであり、人工酵素は、１つ以上の工業的または栄養学的に重要なタンパク質を特異的に加水分解する。この変異体の好ましい実施形態において、人工酵素は、１つ以上の工業的または栄養学的に重要なタンパク質基質を、特定の部位で加水分解し、それによって工業的または栄養学的に所望の製品特性（例えば、きめ、風味、または沈殿特性）を導く。この変異体のさらなる特定の実施形態において、人工酵素は、グリコシド結合の加水分解を触媒する（グリコシダーゼまたはグリコシラーゼ活性）。次いで、好ましくは、触媒された反応は、ポリサッカライドプロセスであり、人工酵素は、工業的に、技術的に、または栄養学的に重要なポリサッカライド基質の１つ以上を特異的に加水分解する。この変異体のさらに特定の実施形態において、人工酵素は、トリグリセリドエステルまたは脂質の加水分解を触媒する（リパーゼ活性）。
【０１１１】
次いで、好ましくは、触媒された反応は、脂質プロセス工程であり、人工酵素は、１つ以上の工業的、技術的、または栄養学的に重要な脂質基質を特異的に加水分解する。この実施形態のさらに特定の変異体において、人工酵素は、基質の酸化または還元を触媒する（酸化還元活性）。次いで、好ましくは、人工酵素は、１つ以上の工業的、技術的、または栄養学的に重要な化学物質基質を特異的に酸化または還元する。
【０１１２】
本発明の第三の局面は、定性的におよび／または定量的に新規な特異性を有する人工酵素を、タンパク質足場と組み合わせて作製する方法に関する。本発明の方法は、少なくとも以下の工程を包含する：
（ａ）少なくとも１つの標的基質における少なくとも１つの化学反応を触媒することができるタンパク質足場を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの前記タンパク質足場と、１つ以上の完全または部分的にランダムなペプチド配列の変異体とを、生じる酵素が少なくとも１つの標的基質と１つ以上の異なる基質とを区別できるようにする前記タンパク質足場の部位において組み合わせることによって、酵素または単離された酵素のライブラリーを生成する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で生成した前記酵素のライブラリーから、少なくとも１つの標的基質に対する規定された特異性を有する１つ以上の酵素を選択する工程。
【０１１３】
本発明のこの局面の第一の変異体において、本発明の方法は、少なくとも以下の工程を包含する：
（ａ）少なくとも１つの標的基質における少なくとも１つの化学反応を触媒することができるタンパク質足場を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの前記タンパク質足場に、１つ以上の完全または部分的にランダムなペプチド配列を、生じる酵素が少なくとも１つの標的基質と１つ以上の異なる基質とを区別できるようにする前記タンパク質足場の部位に挿入することによって、酵素または単離された酵素のライブラリーを生成する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で生成した前記酵素のライブラリーから、少なくとも１つの標的基質に対する規定された特異性を有する１つ以上の酵素を選択する工程。
【０１１４】
好ましくは、１つ以上の完全にまたは部分的にランダム化されたペプチド配列がタンパク質足場と組み合わされるかまたはそれに挿入される位置は、その組み合わせまたは挿入の前に同定されている。
【０１１５】
完全にまたは部分的にランダムなペプチド配列の挿入の数または他の組み合わせ、ならびにそれらの長さは、広範に変化し得る。その数は、少なくとも１個、好ましくは、１個以上、より好ましくは、２〜１１個、最も好ましくは、２〜６個である。このような完全または部分的にランダム化されたペプチド配列の長さは、通常、５０アミノ酸残基よりも短い。好ましくは、その長さは、１〜１５アミノ酸残基、より好ましくは、１〜６アミノ酸残基である。あるいは、その長さは、２〜２０アミノ酸残基、好ましくは、２〜１０アミノ酸残基、より好ましくは、３〜８アミノ酸残基である。
【０１１６】
好ましくは、このような挿入または他の組み合わせは、このようなタンパク質足場をコードするポリヌクレオチド、およびこのような完全にまたは部分的にランダム化したペプチド配列をコードするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを使用してＤＮＡレベルで行われる。
【０１１７】
必要に応じて、工程（ａ）〜（ｃ）は、循環的に繰り返され、それにより工程（ｃ）で選択された酵素が、将来のサイクルの工程（ａ）におけるタンパク質足場として働き、そしてランダム化したペプチド配列が挿入されるか、あるいは以前のサイクルで挿入されたペプチド配列で置換される。それにより、挿入されたペプチド配列の数は、サイクルにわたって一定であるか、または増大する。意図される特異性を有する１つ以上の酵素が生成されるまで、サイクルが繰り返される
【０１１８】
さらに、工程（ａ）〜（ｃ）の１ラウンド以上の間またはその後に、足場は１つ以上の位置で変異されて、ＳＤＲ配列との組み合わせのためにより受け入れ可能な足場が作製され得るか、および／または特定のｐＨおよび温度での触媒活性を増大し得るか、および／またはグリコシル化のパターンを変化させ得るか、および／または酵素阻害剤に対する感受性を減少させ得るか、および／または酵素の安定性を変化させ得る。
【０１１９】
本発明のこの局面の第二の変異体において、本発明の方法は、少なくとも以下の工程を包含する：
（ａ）第一のタンパク質足場フラグメントを提供する工程、
（ｂ）上記タンパク質足場フラグメントをペプチド結合を介して第一のＳＤＲと連結する工程、および、必要に応じて
（ｃ）上記工程（ｂ）の生成物をペプチド結合を介してさらなるＳＤＲペプチドまたはさらなるタンパク質足場フラグメントと連結する工程、および、必要に応じて、
（ｄ）十分に特異的な酵素が生成されるために必要なサイクル工程（ｃ）を繰り返す工程、ならびに
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）において生成された集団から、１つ以上の標的基質に対する所望の特異性を有する１つ以上の酵素を選択する工程。
【０１２０】
タンパク質足場フラグメントは、タンパク質足場の配列の一部を意味する。タンパク質足場は、少なくとも２つのタンパク質足場フラグメントから構成される。
【０１２１】
本発明のこの局面の第三の変異体において、タンパク質足場、ＳＤＲ、および人工酵素は、ＤＮＡ配列によってコードされ、発現系がタンパク質を生成するために使用される。代替的な変異体において、タンパク質足場、ＳＤＲ、および／または人工酵素は、ペプチドビルディングブロックから化学合成される。
【０１２２】
本発明のこの局面の第四の変異体において、本発明の方法は、少なくとも以下の工程を包含する：
（ａ）１つ以上の標的基質における１つ以上の化学反応を触媒し得るタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）１つ以上の完全にまたは部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチド配列を、タンパク質足場をコードするポリヌクレオチドと組み合わせる工程であって、上記完全にまたは部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチド配列が、コードされる人工酵素が１つ以上の標的基質と１つ以上の他の基質とを区別できるようなポリヌクレオチド内の部位に位置する、工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において生成された集団から、１つ以上の基質に対する規定された特異性を有する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを選択する工程。
【０１２３】
任意の酵素が工程（ａ）におけるタンパク質足場として働き得る。それは、天然に存在する酵素、その変異体もしくは短縮型誘導体、または人工酵素であり得る。ヒトの治療用途には、タンパク質足場は、好ましくは、哺乳動物の酵素であり、より好ましくは、ヒトの酵素である。その局面において、本発明は、哺乳動物ゲノムまたはヒトゲノムにおいてそれぞれコードされるいかなる酵素の特異性とも異なる特異性を有する本質的に哺乳動物の、特に本質的にヒトの酵素の作製方法に関する。
【０１２４】
本発明に従って、この局面の工程（ａ）において提供されるタンパク質足場は、標的基質上で１つ以上の化学反応を触媒し得ることが要求される。それゆえ、タンパク質足場は、標的基質に対するその活性によって可能性のあるタンパク質足場の群から選択される。
【０１２５】
本発明のこの局面の好ましい変異体において、加水分解活性を有するタンパク質足場が使用される。好ましくは、タンパク質分解活性を有するタンパク質足場が使用され、より好ましくは、標的基質上で塩基性の活性を有する非常に低い特異性を有するプロテアーゼが、タンパク質足場として使用される。基質特異性の低い異なる構造クラス由来のプロテアーゼの例は、パパイン、トリプシン、サブチリシン、ＳＥＴ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ由来のトリプシン様セリンプロテアーゼ）、エラスターゼ、カテプシンＧ、またはキマーゼである。タンパク質足場として使用される前に、プロテアーゼのアミノ酸配列は、特異性以外のタンパク質特性、例えば、触媒活性、安定性、阻害剤感受性、または発現量を、本質的にＷＯ ９２／１８６４５に記載されるように、または特異性を、本質的にＥＰ ０２０２０５７６．３およびＰＣＴ／ＥＰ０３／０４８６４に記載されるように変化させるために、修飾され得る。
【０１２６】
ふさわしいタンパク質足場についての別の選択肢は、リパーゼである。肝性リパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、および膵リパーゼが、「リポタンパク質リパーゼスーパーファミリー」に属し、これは言い換えるとリパーゼのＧＸクラスの例である（Ｍ． Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｊ． Ｐｌｅｉｓｓ （２００３）、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． 、３１、３１９−３２１）。リパーゼの基質特異性は、荷電したヘッド基を有する脂肪酸およびリン脂質のトリグリセロールエステルに対するそれらの相対活性によって特徴付けられる。あるいは、エステラーゼ、グリコシラーゼ、アミダーゼ、またはニトリラーゼのような他の加水分解酵素が、足場として使用され得る。トラスフェラーゼはまた、ふさわしいタンパク質足場である。グリコシルトランスフェラーゼは、種々のドナーおよびアクセプターを含む多くの生物学的合成に関わっている。あるいは、タンパク質足場は、リガーゼ、リアーゼ、酸化還元酵素、またはイソメラーゼ活性を有し得る。
【０１２７】
第一の実施形態において、１つ以上の完全または部分的にランダム化されたペプチド配列が、タンパク質足場の特定の部位に挿入される。これらの挿入部位は、挿入されたペプチド配列が、異なる基質間の識別子、すなわち、特異性決定領域（ＳＤＲ）として作用し得るという事実によって特徴付けられる。このような挿入部位は、いくつかのアプローチによって同定され得る。好ましくは、挿入部位は、タンパク質足場の３次元構造の分析によって、タンパク質足場の一次構造の、異なる定量的特異性を有する他の酵素との比較分析により、またはアラニンスキャニング、ランダム変異誘発、もしくはランダム欠失、または任意のその組み合わせのような技術によって実験的に、同定される。
【０１２８】
ＳＤＲのための挿入部位を同定するための第一のアプローチは、Ｘ線結晶学、または核磁気共鳴研究によって得ることができるタンパク質足場の３次元構造に基づいている。同じ構造クラスであるが異なる定量的特異性を有する他の酵素との比較におけるタンパク質足場の構造アラインメントは、高い構造類似性の領域および低い構造類似性の領域を明らかにする。例えば、このような分析は、ＰＢＤビューアのような公のソフトウェア（Ｇｕｅｘ、Ｎ． ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ、Ｍ． Ｃ． （１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８、２７１４−２７２３））を使用してなされ得る。低い構造類似性の領域は、好ましいＳＤＲ挿入部位である。ＳＤＲのための挿入部位を同定する第二のアプローチにおいて、競合阻害剤または基質アナログと複合体を形成した足場タンパク質の３次元構造が分析される。競合阻害剤の結合部位は、基質の結合部位と有意に重なり合うことが仮定される。その場合、阻害剤の特定の原子間距離内にあるタンパク質の原子は、基質に対しても類似する距離にある傾向がある。例えば、５Å未満の短い距離を選択することによって、基質との密接に施蝕しているタンパク質原子の組み合わせを生じる。これらの残基は、第一のシェルコンタクト（ｓｈｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔｓ）を構成し、それゆえＳＤＲにとって好ましい挿入部位である。一旦第一のシェルコンタクトが同定されると、第二のシェルコンタクトが、第一のシェル原子から開始する距離分析を繰り返すことによって見出され得る。本発明のなお別の代替において、上記の距離分析は、活性部位残基から開始して行われる。
【０１２９】
ＳＤＲに対する挿入部位を同定する第三のアプローチにおいて、足場タンパク質の一次配列は、アラインメントアルゴリズムを使用することによって、同じ構造クラスであるが異なる定量的特異性を有する他の酵素とアラインメントされる。このようなアラインメントアルゴリズムの例は公開されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． Ｆ． 、Ｇｉｓｈ、Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｗ． 、Ｍｙｅｒｓ、Ｅ． Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ． Ｊ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０； 「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」 ｂｙ Ｅｗｅｎｓ、Ｗ． ＆ Ｇｒａｎｔ、Ｇ．Ｒ． ２００１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。このようなアラインメントは、種々の配列相同性、特に足場タンパク質と比較して１つ以上の酵素におけるさらなる配列エレメントを有する、保存された領域または保存されていない領域を明らかにし得る。保存された領域は、異なるタンパク質の間で共有されている表現型に寄与する（例えば、三次元構造の折り畳みを安定化する）可能性が高い。保存されていない領域、および特に、定量的に高い特異性を有する酵素におけるさらなる配列（Ｔｕｒｎｅｒ、Ｒ． ｅｔａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、３３０６８−３３０７４）は、ＳＤＲのための好ましい挿入部位である。
【０１３０】
プロテアーゼとして、現在５つのファミリー、すなわち、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびスレオニンプロテアーゼが知られている。各々のファミリーには、類似の集団を共有するプロテアーゼのグループが含まれる。これらのグループのメンバーの結晶構造は解析されており、公のデータベース（例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データベース）を通じてアクセス可能である（Ｈ． Ｍ． Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８ ｐｐ． ２３５−２４２（２０００））。このようなデータベースはまた、他の酵素クラスおよび各クラスの非酵素的に活性なタンパク質における構造ホモログを含んでいる。いくつかのツールが、構造ホモログについて公のデータベースを検索するために利用可能である：ＳＣＯＰ−配列および構造の調査のためのタンパク質データベースの構造分類（Ｍｕｒｚｉｎ Ａ． Ｇ． ｅｔａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４７、５３６−５４０）；ＣＡＴＨ−クラス、アーキテクチャ、トポロジー、および相同スーパーファミリー：タンパク質ドメイン構造の階層型分類（Ｏｒｅｎｇｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ （８） １０９３−１１０８）；ＦＳＳＰ−タンパク質の構造間アラインメントに基づく折り畳み分類（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ （１９９８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６ ３１６−３１９）；またはＶＡＳＴ−ベクターアラインメントサーチツール（Ｇｉｂｒａｔ、Ｍａｄｅｊ ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ （１９９６） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６、３７７−３８５）。
【０１３１】
上記のアプローチにおいて、構造クラスのメンバーは、ＳＤＲの挿入部位を同定するために比較される。
【０１３２】
これらのアプローチの好ましい変形において、構造クラスＳ１のセリンプロテアーゼが、互いに比較される。トリプシンは、低い基質特異性を有するメンバーである。なぜならそれは、Ｒ位置にアルギニンまたはリジン残基のみを必要とする。他方、トロンビン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、またはエンテロキナーゼは、全て、それらの基質配列（すなわち、それぞれ、（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）ＸＰＲ＾ＮＡ、ＣＰＧＲ＾ＶＶＧＧ、およびＤＤＤＫ＾）に対して高い特異性を有する（Ｐｅｒｏｎａ、Ｊ． ＆ Ｃｒａｉｋ、Ｃ． （１９９７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、２９９８７−２９９９０ ； Ｐｅｒｏｎａ、Ｊ． ＆ Ｃｒａｉｋ、Ｃ （１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、３３７−３６０）。これらのプロテアーゼのアミノ酸配列のアラインメントは、実施例１（図２）に同定したＳＤＲとともに記載されている。
【０１３３】
セリンプロテアーゼのファミリー内のさらなる例は、構造クラスＳ８（サブチリシン折り畳み）のメンバーによって与えられる。サブチリシンは、このクラスの型プロテアーゼであり、非特異的プロテアーゼである（Ｏｔｔｅｓｅｎ、Ｍ． ＆ Ｓｖｅｎｄｓｅｎ、Ａ． （１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９、１９９−２１５）。フリン、ＰＣ１、およびＰＣ５は、プロペプチドのプロセッシングに関与する同じ構造クラスのプロテアーゼであり、高い基質特異性を有する（Ｓｅｉｄａｈ、Ｎ． ＆ Ｃｈｒｅｔｉｅｎ、Ｍ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． 、８： ６０２−６０７； Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｆ． ｅｔａｌ． （２０００） Ｊ． Ｍｏｌ．ＥＲ７ｄｏｃｒｉｎ．、２４： １−２２）。アプローチの好ましい変形において、一次アミノ酸配列のアラインメント（図４）が、サブチリシンと比較して特異的なプロがさらに有し、それゆえ潜在的な特異性決定領域である３アミノ酸より長い１１個の配列ストレッチを同定するために使用される。アプローチのさらなる変形において、サブチリシンの３次元構造からの情報が、選択をさらに狭めるために使用され得る（図３）。１１の挿入配列ストレッチのうち、３つ、すなわち、ストレッチ番号７、８、および１１が、特に活性部位残基に近く、これらはそれぞれ、ＰＣ５、ＰＣ１、および全ての３つの特異的プロテアーゼにおける挿入である（図３）。好ましい変形において、可変長および可変組成の１または数個のアミノ酸ストレッチが、１１個の部位のうちの１または数個の位置でサブチリシン配列に挿入され得る。アプローチのより好ましい変形において、挿入が領域７、８、もしくは１１、またはこれらの任意の組み合わせで行われる。アプローチの別の好ましい変形において、構造クラスＳ８由来のサブチリシン以外のタンパク質足場が使用される。
【０１３４】
このアプローチのさらに好ましい変形において、構造クラスＡ１のアスパラギン酸プロテアーゼが分析される（Ｒａｗｌｉｎｇｓ、Ｎ． Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ． Ｊ． （１９９５）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４８、１０５−１２０ ； Ｃｈｉｔｐｉｎｉｔｙｏｌ、Ｓ． ＆ Ｃｒａｂｂｅ、ＭＪ． （１９９８）、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１、３９５−４１８）。アスパラギン酸プロテアーゼのＡ１構造クラスの例は、低い基質特異性を有するペプチド、ならびに比較的高い基質特異性を有するベータセクレターゼ（Ｇｒｎｉｎｇｅｒ−Ｌｅｉｔｃｈ、Ｆ． 、ｅｔ ａｌ． （２００２） ＪＢｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７、４６８７−４６９３）、およびレニンである。レトロウイルスプロテアーゼもまたこのクラスに属するが、活性酵素は、２つの同一のサブユニットのダイマーである。ウイルスプロテアーゼは、ポリタンパク質前駆体の正確なプロセッシングと、各場合において高い基質特異性を必要とする機能的タンパク質の生成にとって必須である（Ｗｕ、Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７、４５１８−４５２６ ； Ｐｅｔｔｉｔ、Ｓ． ｅｔａｌ． （１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． 、２６６、１４５３９−１４５４７）。ペプシンはこのクラスの型プロテアーゼであり、非特異的プロテアーゼを代表する（Ｋａｇｅｙａｍａ、Ｔ． （２００２） Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５９、２８８−３０６）。Ｂ−セクレターゼおよびカテプシンＤ（Ａｇｕｉｌａｒ、Ｃ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．Ｂｉｏ／． ３６２、１５５−１６６）は、同じクラスのプロテアーゼであり、高い基質特異性を有する。アプローチの好ましい変形において、一次アミノ酸配列のアラインメント（図６）が、ペプチドと比較して特異的プロテアーゼに挿入され、それゆえ潜在的な特異性決定領域である、３つのアミノ酸よりも長い６つの配列ストレッチを同定するために使用される。アプローチのさらなる変形において、ｂ−セクレターゼの３次元構造からの情報が、選択をさらに狭めるために使用され得る。６個の挿入配列のなかから、３つ、すなわち、それぞれストレッチ番号１、３、および４（これらはカテプシンＤおよびベータセクレターゼにおける挿入出る）が活性部位残基に特に近い（図５）。アプローチの好ましい変形において、可変数および可変組成の１または数個のアミノ酸ストレッチが、６個の位置のうち１または数個でペプシン配列に挿入され得る。本発明のより好ましい実施形態において、挿入が、位置１、３．もしくは４、またはこれらの任意の組み合わせで行われる。本発明の別の好ましい実施形態において、ペプシン以外のタンパク質足場が使用される。
【０１３５】
特定の構造クラスが、低い特異性および高い特異性の公知のメンバーを含まない場合がある。これは、システインプロテアーゼファミリーに属し（Ｒａｗｌｉｎｇｓ、Ｎ． Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ． Ｊ． （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４４、４６１−４８６）、Ｐ４〜Ｐ１位置に対して全て高い特異性を示す、カスパーゼのＣ１４クラスによって例示される。例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ３、およびカスパーゼ９は、配列ＹＶＤＡ＾、ＤＥＶＤ＾、またはＬＥＨＤ＾をそれぞれ認識する。カスパーゼ間で異なる領域の同定は、基質特異性においける差違を担う領域が含まれる（図７および８）。
【０１３６】
最後に、酵素足場と同じ折り畳みの非酵素タンパク質もまた、ＳＤＲの挿入部位の同定に起用する。例えば、ハプトグロブリン（Ａｒｃｏｌｅｏ、Ｊ． ＆ Ｇｒｅｅｒ、Ｊ．； （１９８２）ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７、１００６３−１００６８）およびアズロシジン（ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ）（Ａｌｍｅｉｄａ、Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７７、６８８−６９５）は、全てのＳ１プロテアーゼと同じキモトリプシン様の折り畳みを共有する。活性部位残基での置換により、これらのタンパク質は、如何なるタンパク質分解機能も有しないが、活性プロテアーゼとの高い相同性を示す。これらのタンパク質と特定のプロテアーゼとの間の差違は、ＳＤＲのための挿入部位として働き得る領域を含む。
【０１３７】
第四のアプローチにおいて、ＳＤＲの挿入部位は、アラニンスキャニング、ランダム変異誘発、ランダム挿入、またはランダム欠失のような技術によって実験的に同定される。上記のアプローチとは対照的に、このアプローチは、足場タンパク質の三次元構造についての詳細な知識を必要としない。このアプローチの１つの好ましい変形において、タンパク質足場と同じ構造クラス由来の比較的高い特異性を有する酵素のランダム変異誘発および特異性の消失または変化についてのスクリーニングを使用して、タンパク質足場におけるＳＤＲの挿入部位を同定し得る。ランダム変異誘発、アラニンスキャニング、ランダム挿入、またはランダム欠失は全て、酵素をコードするポリヌクレオチドのレベルに対して行われる。文献において公知の種々のプロトコルが存在する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． Ｆ； Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ． Ｆ．； Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．；Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。例えば、ランダム変異誘発は、特許ＷＯ ９２１８６４５に記載されるポリメラーゼを使用することによって達成され得る。この特許によれば、１つ以上のプロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子が、高いエラー率または誤取り込みの率を増大する条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用することによって増幅される。例えば、ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅの方法が使用され得る（Ｃａｄｗｅｌｌ、Ｒ． Ｃ． ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ、Ｇ． Ｆ． 、ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｐｌ． ２ （１９９２）２８−３３）。突然変異誘発株、化学突然変異誘発物質、またはＵＶ放射線の使用のような、しかしこれらに限定されないランダム変異誘発の他の方法もまた使用され得る。
【０１３８】
あるいは、オリゴヌクレオチドが、ランダムに分布したアミノ酸残基をアラニンと置換する変異誘発のために使用され得る。この方法は、一般的に、アラニンスキャニング範囲誘発と呼ばれる（Ｆｅｒｓｈｔ、Ａ． Ｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８９） ８０３１−８０３６）。さらなる代替方法として、２項変異誘発のようなアラニンスキャニングの改変（Ｇｒｅｇｏｒｅｔ、Ｌ． Ｍ． ａｎｄ Ｓａｕｅｒ、Ｒ． Ｔ． ＰＮＡＳ （１９９３） ４２４６−４２５０）またはコンビナトリアルアラニンスキャニング（Ｗｅｉｓｓ ｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ （２０００） ８９５０−８９５４）が使用され得る。
【０１３９】
人工酵素を発現するために、このような人工タンパク質をコードするＤＮＡが、表群的な分子クローニング技術によって適切な発現ベクターに連結される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． Ｆ； Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ． Ｆ．； Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ベクターは、適切な発現宿主細胞に導入され、これは、対応する人工酵素変異体を発現する。特に適切な発言宿主は、大腸菌もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような細菌性発現宿主、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅもしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母発現宿主、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株もしくはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株のような哺乳動物発現宿主、またはバクテリオファージ（例：Ｍ１３もしくはラムダ）もしくはバキュロウイルス発現系のようなウイルスのようなウイルス発現宿主である。さらなる代替として、インビトロタンパク質発現のためのシステムが使用され得る。代表的には、ＤＮＡが、発現ベクター中、適切なシグナル配列の後ろに挿入される。シグナル配列は、酵素変異体が細胞外空間に分泌されることを導き、それによって細胞上清中でのプロテアーゼ活性の直接的な検出を可能にする。それぞれ、大腸菌にとって特に適切なシグナル配列は、ＨｌｙＡであり、枯草菌にとっては、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢであり、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとっては、Ｂａｒｌ、Ｓｕｃ２、Ｍａｔａ、Ｉｎｕ１Ａ、Ｇｇｐｉｐである。あるいは、酵素変異体は細胞内で発現され、そして基質もまた細胞内で発現される。好ましくは、これは本質的に特許出願ＷＯ ０２１２５４３に記載されるように、基質アミノ酸配列と連結された２つの自己蛍光タンパク質を含む融合ペプチド基質を使用して行われる。さらなる代替として、酵素変異体の細胞内発現またはペリプラズム空間への分泌の後に、大腸菌についてのＤｓｂＡ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、またはｇＩＩＩのようなシグナル配列を使用して、透過化または溶解工程により、酵素変異体を上清中へ放出する。膜バリアの破壊は、超音波、フレンチプレスのような機械的手段、またはリゾチームのような膜消化酵素の使用により強制され得る。別のさらなる代替として、酵素変異体をコードする遺伝子が、細胞を含まずに、適切な細胞を含まない発現系を使用して発現される。例えば、大腸菌細胞由来のＳ３０抽出物を、Ｌｅｓｌｙらに記載のように、この目的のために使用し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３７ （１９９５） ２６５−２７８）。任意の上記の方法によって生成され発現される遺伝子変異体の集団は、例えば、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０４８６４に詳細に記載されるように、適切なアッセイおよびスクリーニング方法によってそれらの親和性、基質特異性、または活性が分析される。元々の酵素と比較して減少した特異性を有する触媒活性変異体由来の遺伝子は、配列決定によって分析される。変異および／または挿入および／または欠失が生じる部位は、ＳＤＲが部位特異的に挿入され得る好ましい挿入部位である。
【０１４０】
第二の実施形態において、１つ以上の完全または部分的にランダムなペプチド配列が、タンパク質足場中のランダム部位に挿入される。この修飾は、通常、ポリヌクレオチドレベルで、すなわち、タンパク質足場をコードする遺伝子にヌクレオチド配列を挿入することによって行われる。ヌクレオチド配列のランダム挿入を可能にするいくつかの方法が利用可能である。ランダム挿入に使用され得るシステムは、例えば、ライゲーションに基づくシステム（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０ （２００２） ７６−８１）、ＤＮＡ重合反応に基づくシステムおよびトランスポゾンに基づくシステム（ｅ．ｇ、ＧＰＳ−ＭＴＭ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、ＮＥＢＢｉｏｌａｂｓ ； ＭＧＴＭ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）である。トランスポゾンに基づく方法は、トランスポーゼースの認識配列をその末端に、ならびにまれな切断制限エンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を含有する選択可マーカー遺伝子のトランスポーゼース仲介挿入を利用する。後者のエンドヌクレアーゼを使用して、通常選択マーカーを放出し、ライゲーションの後、挿入断片を得る。再ライゲーションを行う代わりに、代替的に、１つまたは２つの外側切断制限エンドヌクレアーゼについての末端認識配列を有するフラグメントならびに選択マーカーを挿入し得る。ライゲーションの後、このフラグメントを１つまたは２つの外側切断エンドヌクレアーゼを使用して放出する。標準的な方法によって平滑末端を作製した後、平滑末端ランダムフラグメントを遺伝子にランダムな位置に挿入する。
【０１４１】
さらに好ましい実施形態において、インビトロ相同組換えのための方法が、上記方法によって導入される変異を組み合わせて、酵素集団を生成するために使用される。適用され得る方法の例は、特許出願ＷＯ０１３４８３５による組換え連鎖反応（ＲＣＲ）、特許出願ＷＯ ９５２２６２５によるＤＮＡシャッフリング方法、特許出願ＷＯ９８４２７２８によるねじれ伸長法（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、または特許出願ＷＯ９８４２７２８によるランダムプライミング組換えである。さらに、イッチー法（Ｉｔｃｈｙ ｍｅｔｈｏｄ）のような非相同組換えのための方法もまた、適用され得る（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ、Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７ （１９９９） １２０５−１２０９）。
【０１４２】
ヌクレオチド配列のタンパク質足場へのランダム挿入に際して、酵素変異体をコードする異なる遺伝子のライブラリーを得る。ポリヌクレオチドライブラリーは、引き続き、適切な発現ベクターに移される。適切な宿主における発現の際、またはインビトロ発現系の使用により、ランダムに挿入されたアミノ酸のストレッチを含有する酵素のライブラリーが得られる。
【０１４３】
本発明のこの局面の工程（ｂ）にしたがって、１つ以上の完全または部分的ランダムペプチド配列が、タンパク質足場に挿入される。このような挿入されたＳＤＲの実際の数が、意図された特異性が高いほど、ＳＤＲがより多く挿入されるという関係に従って、意図された定量的特異性によって決定される。単一のＳＤＲが中程度に特異的な酵素の生成を可能にするのに対して、２つのＳＤＲは、有意に特異的な酵素の生成をすでに可能にする。しかしながら、６個までまたはそれ以上のＳＤＲがタンパク質足場に挿入され得る。類似の関係がＳＤＲの長さについて有効である：意図される特異性が高いほど、挿入されるＳＤＲが長い。ＳＤＲは、４アミノ酸残基程度の短さであり得る。しかしながら、それらはまた、５０アミノ酸残基程度まで長くてもよい。有意な特性がすでに、４〜６アミノ酸残基の長さのＳＤＲの使用によって生成され得る。
【０１４４】
挿入されるペプチド配列は、完全にまたは部分的にランダムであり得る。この状況において、完全にランダムとは、各位置または全ての位置において互いに異なる配列を含む一組の配列が並行して挿入されることを意味する。部分的にランダムとは、少なくとも１つの位置で違いに異なる配列を含む一組の配列が並行して挿入されることを意味する。この違いは、ペアごとまたは単一の配列に関してであり得る。例えば、アミノ酸の長さの挿入に関しての場合、部分的ランダムは、（ｉ）ＡＧＧＧ、ＧＶＧＧ、ＧＧＬＧ、ＧＧＧＩを含む、または（ｉｉ）ＡＧＧＧ、ＶＧＧＧ、ＬＧＧＧ、およびＩＧＧＧを含むセットであり得る。あるいは、ランダム配列はまた、長さが互いに異なる配列を含む。ペプチド配列のランダム化は、それぞれの部位で遺伝子に挿入されたヌクレオチド配列のランダム化によって達成される。それにより、ランダム化は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に核酸塩基の混合物をモノマーとして利用することによって達成され得る。ストップコドンの可能性をさらに最小化する完全にランダムなコドンのためのモノマーの特に好ましい混合物は、ＮＮ（ＧＴＣ）である。あるいは、ランダムオリゴヌクレオチドが、それぞれの部位で遺伝子に挿入される短いフラグメントへのＤＮＡのフラグメント化によって得られ得る。フラグメント化されるＤＮＡの供給源は、合成オリゴヌクレオチドであり得るが、あるいは、クローン化された遺伝子、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡに由来するものでもよい。好ましくは、ＤＮＡは酵素をコードする遺伝子である。フラグメント化は、例えば、ＤＮＡのランダムエンドヌクレアーゼ消化によって達成され得る。好ましくは、ＤＮＡｓｅＩ（例えば、ウシ膵臓由来の）のような非特異的エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ消化のために利用される。
【０１４５】
本発明の方法の工程（ａ）〜（ｃ）が循環的に繰り返される場合、連続するラウンドにおいて挿入されるランダムペプチド配列を得るための異なる代替が存在する。好ましくは、酵素の増大した特異性を導くものとして１つのラウンドにおいて同定されたＳＤＲは、次のラウンドにおいて挿入されるランダムペプチド配列のための鋳型として使用される。
【０１４６】
好ましい代替において、１つのラウンドで選択された配列が分析され、そしてランダム化されたオリゴヌクレオチドがこれらの配列に基づいて生成される。これは、例えば、元々のヌクレオチドに加えて、他の３つのヌクレオチドモノマーの特定の割合（％）の混合物をオリゴヌクレオチド合成において各位置で使用することによって達成され得る。例えば、第一ラウンドにおいて、アミノ酸配列ＡＲＬＴ（例えば、ヌクレオチド配列ＧＣＧ ＣＧＣ ＣＴＴ ＡＣＣによってコードされる）を有するＳＤＲが同定された場合、このＳＤＲ部位に挿入されるランダムペプチド配列は、７０％Ｇ、１０％Ａ、１０％Ｔ、および１０％Ｃを第一の位置に、７０％Ｃ、１０％Ｇ、１０％Ｔ、および１０％Ａを第二の位置に、など、有するオリゴヌクレオチドによってコードされる。これは、各位置に、およそ３回に１回の割合で、鋳型アミノ酸を、３回に２回の割合で別のアミノ酸を導く。
【０１４７】
別の好ましい代替において、１つのラウンドにおいて選択される配列が分析され、そしてコンセンサスライブラリーがこれらの配列に基づいて生成される。これは、例えば、オリゴヌクレオチド合成における各位置においてヌクレオチドの規定された混合物を、前回のラウンドで選択されたＳＤＲの各位置で同定されたアミノ酸残基の混合物を導くように、使用することによって達成され得る。例えば、第一のラウンドにおいて、アミノ酸配列ＡＲＬＴおよびＶＰＧＳを有する２つのＳＤＲが同定された場合、次のラウンドでこのＳＤＲに挿入されるコンセンサスライブラリーは、配列Ｇ（Ｃ／Ｔ）ＧＣ（Ｇ／Ｃ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ｔ）Ｇ（Ａ／Ｔ）ＣＣを有するオリゴヌクレオチドによってコードされ得るこれは、ランダムペプチド配列（Ａ／Ｖ）（Ｒ／Ｐ）（Ｌ／Ｇ／Ｖ／Ｗ）（Ｔ／Ｓ）に対応し、それにより、第一のラウンドで同定された全てのアミノ酸残基の組み合わせを可能にし、そして遺伝コードの縮重により、いくつかの位置でより低い程度に代替のアミノ酸を許容する。
【０１４８】
別の好ましい代替において、１つのラウンドで選択された配列は、以前の分析なしで、ポリヌクレオチドのインビトロ組換えのための方法（例えば、ＷＯ０１／３４８３５に記載される方法）を使用して組換えされる。（以下は、また、本発明の第８および第９の局面の詳細を提供する。）
部分的にまたは完全にランダムな配列を足場タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、最終的に標準的な分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． Ｆ； Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ． ； Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して、得られた遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションした後、そのベクターは、対応する酵素変異体を発現する適切な発現宿主細胞へ導入される。特に適切な発現宿主は、大腸菌もしくは枯草菌のような細菌発現宿主、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ もしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母宿主、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株のような哺乳動物宿主、またはバクテリオファージ（例：Ｍ１３、Ｔ７ファージ、ラムダ）のようなウイルス発現系、またはバキュウロウイルス発現系のようなウイルスである。さらなる代替として、インビトロタンパク質発現のためのシステムが使用され得る。代表的には、ＤＮＡが、細胞外空間に酵素変異体を分泌させる適切なシグナル配列の後に、発現ベクターにライゲーションされ、それにより細胞上清中の酵素活性の直接検出を可能にする。大腸菌について特に適切なシグナル配列は、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＨｌｙＡであり、枯草菌についてはＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢであり、Ｓ．ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅについてはＢａｒ１、Ｓｕｃ２、Ｍａｔａ、Ｉ ｎｕ１Ａ、Ｇｇｐｌｐである。あるいは、酵素変異体が細胞内で発現され、基質もまた細胞内で発現される。プロテアーゼ変異体に従って、これは、本質的に特許出願ＷＯ ０２１２５４３に記載されるように、基質アミノ酸配列によって連結された２つの自己蛍光タンパク質を含む融合ペプチド基質を使用して、行われる。さらなる代替として、酵素変異体の細胞内発現、または大腸菌のＤｓｂＡ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ ｏｒｇｉ １１のようなシグナル配列を使用したペリプラズム空間への分泌の後、透過化または溶解工程によいｒ、酵素辺が上清へ放出される。膜バリアの破壊は、超音波、フレンチプレスのような機械的手段を使用して、またはリボチームのような膜消化酵素を使用して、強制され得る。別のさらなる代替として、酵素変異体をコードする遺伝子が、細胞を含まないで、適切な細胞を含まない発現系を使用して発現される。例えば、大腸菌細胞由来のＳ３０抽出物が、Ｌｅｓｌｙらによって記載されるようにこの目的のために使用される（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３７ （１９９５） ２６５−２７８）。
【０１４９】
ベクターの宿主細胞への導入の後、これらの細胞を、意図された標的基質に対する特異性を有する酵素の発現についてスクリーニングする。このようなスクリーニングは、典型的には、遺伝子型と表現型とを相関付けるために細胞を互いに分離し、そして増殖および発現期間の後に各細胞クローンの活性をアッセイすることによって行われる。このような分離は、例えば、細胞を、例えば、ＷＯ０１／２４９３３に記載されるようにサンプルキャリアの区画へ分布させることによって行われ得る。あるいは、細胞を、アガロースプレート上でストリーキングすることにより、アガロースのようなポリマー中で包むことにより、キャピラリー中に充填することにより、または同様の方法により分離される。
【０１５０】
意図される特異性を有する変異体の分離は、異なるアプローチによってなされ得る。プロテアーゼの場合、好ましくは、本質的にＰＣＴ／ＥＰ０３／０４８６４に記載されるペプチド基質を用いるアッセイが使用される。
【０１５１】
発現のフォーマットにかかわらず、酵素変異体を選択することにより、好ましくは、標的配列を認識し、変換する酵素の同定が可能になる。第一の代替として、標的配列を認識し、変換する酵素は、好ましくは、標的基質配列に対する高い親和性を有する酵素をスクリーニングことによって同定される。高い親和性は、実質的に第一の酵素のＫ_Mより低い標的基質濃度でスクリーニングすることによって選択される低いＫ_Mに対応する。好ましくは、使用される基質は、１０μＭ未満、好ましくは、１μＭ未満、より好ましくは、１００ｎＭ未満、そして最も好ましくは、１０ｎＭ未満の濃度で基質の修飾を検出することを可能にする１つ以上のフルオロフォアに連結される。
【０１５２】
第二の代替として、好ましく標的基質を認識し変換する酵素が、２つ以上の基質をアッセイにおいて使用し、そしてこれらの２つ以上の基質の活性を比較してスクリーニングすることによって同定される。好ましくは、使用される２つ以上の基質は、異なるマーカー分子に連結され、それにより、２つ以上の基質の修飾を連続的にまたは並行して検出することが可能になる。プロテアーゼの場合、特に好ましくは、２つのペプチド基質が使用される。一方のペプチド基質は、任意に選択されたかまたは部分的もしくは完全にランダムなアミノ酸配列を有し、それにより、任意の基質上での活性がモニターでき、そして他方のペプチド基質は、意図された標的基質配列に同一かまたは類似するアミノ酸配列を有し、それにより標的基質上での活性をモニターできる。特に好ましくは、これらの２つのペプチド基質が蛍光マーカー分子に連結され、そして連続的にまたは並行して測定された場合に両方の活性を区別するために、２つのペプチド基質の蛍光特性は十分に異なる。例えば、特許出願ＷＯ ０２１２５４３による第一の蛍光タンパク質、ペプチド、および第二の蛍光タンパク質を含む融合タンパク質が、この目的に使用され得る。あるいは、ローダミンのような蛍光色素がペプチド基質に化学的に連結される。
【０１５３】
第三の代替として、標的酵素を好ましく認識し変換する酵素が、標的基質に類似する１つ以上の基質を、高過剰の競合基質とともに使用することによって同定される。次いで、標的基質に類似する基質上の活性に関してのスクリーニングが、競合基質の存在下で行われる。標的特異性に定性的に対応する特異性を有するが、低い定量的特異性のみを有する酵素は、このようなスクリーニングにおいて負のサンプルとして同定される。これに対して、定量的におよび定性的に標的特異性に対応する特異性を有する酵素は、正に同定される。好ましくは、標的基質に類似する１つ以上の基質はマーカー分子に連結され、それによりそれらの修飾の検出が可能となり、一方、競合基質はマーカー分子を有しない。競合基質は、任意に選択されたかまたはランダムアミノ酸配列を有し、それによりマーカー保有基質の加水分解に対する競合阻害剤として作用する。例えば、タンパク質加水分解酵素（例：トリプトン）は、本発明の人工タンパク質分解酵素に対する競合基質として作用し得る。
【０１５４】
第四の代替として、標的基質を認識し変換する酵素が同定され、増幅結合または増殖結合選択工程によって同定および選択される。さらに、活性が細胞内で測定され得、そして選択がセルソーター（例えば、蛍光活性化セルソーター）によってなされ得る。
【０１５５】
さらなる代替として、標的基質を認識し変換する酵素は、第一に、標的基質に優先的に結合する酵素を選択し、第二に、酵素変異体のこのサブグループから標的基質を変換する酵素を選択することによって同定される。標的基質に優先的に結合する酵素の選択は、標的基質に対するバインダーの選択か、または他の基質へ結合する酵素の対抗選択のいずれかによって行われる。バインダーの選択または非バインダーの対抗選択のための方法は当該分野で公知である。このような方法は、典型的には、表面ディスプレイ発現法を使用することによって解決され得る表現型−遺伝子型共役を必要とする。このような方法には、例えば、ファージもしくはウイルスディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、およびインビトロディスプレイが含まれる。ファージもしくはウイルスディスプレイは、典型的には、目的のタンパク質のウイルス／ファージタンパク質への融合を含む。細胞表面ディスプレイ（すなわち、細菌もしくは真核生物細胞ディスプレイのいずれか）は、典型的には、目的のタンパク質の細胞表面に存在するペプチドもしくはタンパク質への融合を含む。インビトロディスプレイにおいて、タンパク質は、典型的には、インビトロで作製され、それらに直接または間接的に、そのタンパク質をコードするＲＮＡを結合させる（ＤＥ １９６４６３７２）。
【０１５６】
本発明はまた、本明細書中上記で規定した本発明の第一の局面に従う１つ以上の人口酵素を含有する組成物または薬学的組成物を提供する。その組成物は、必要に応じて、受容可能な担体、賦形剤、および／または助剤を含んでいても良い。本明細書中で規定される非薬学的組成物は、研究用組成物、栄養学組成物、洗浄組成物、消毒組成物、化粧用組成物、またはパーソナルケア用組成物である。さらに、本明細書中に規定する人工酵素をコードするＤＮＡ配列およびこのＤＮＡを含有するベクターもまた、提供される。最後に、このようなＤＮＡ配列および／もしくはベクターを含有する形質転換された宿主細胞（原核生物もしくは真核生物）またはトランスジェニック生物、ならびにこのような宿主細胞もしくはトランスジェニック動物を本発明の第一の局面の人工酵素を作製するために使用する方法もまた、意図される。
【０１５７】
（図面の詳細な説明）
図１：「球棒」表示で示された活性部位残基を有するヒトトリプシンＩの３次元構造。印を付けた領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【０１５８】
図２：ヒトプロテアーゼトリプシン１、アルファトロンビンおよびエンテロペプチダーゼ（これらの全てがセリンプロテアーゼファミリーの構造クラスＳ１に属する）の一次アミノ酸配列のアラインメント。トリプシンは、この構造クラスの非特異的プロテアーゼであるのに対して、アルファトロンビンおよびエンテロペプチダーゼは、高い基質特異性を有するプロテアーゼである。トリプシンと比較して、トロンビンおよびエンテロキナーゼの一次配列中に３以上のアミノ酸の挿入の領域がいくつか見られる。（−１−）と記された領域および（−３−）と記された領域は、ＳＤＲ挿入部位である。
【０１５９】
アルファトロンビンの三次構造において、両方の領域が基質結合部位の近傍にある。これらの領域は、それゆえ、ＳＤＲの候補として選択されるための２つの基準：第一に、それらが非特異的プロテアーゼと比較して特異的プロテアーゼ中にある挿入であること、および第二に、それらが基質結合部位の近くにあること、を満たす。三次元構造の表示が図３に与えられる。
【０１６０】
図３：「球棒」表示で示された活性部位残基を有するサブチリシンの三次元構造。番号を付された領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【０１６１】
図４：サブチリシンＥ、フリン、ＰＣ１、およびＰＣ５（これらの全てが、セリンプロテアーゼファミリーの構造クラスＳ８に属する）の一次アミノ酸配列のアラインメント。サブチリシンＥは、この構造クラスの非特異的プロテアーゼである。一方、フリン、ＰＣ１、およびＰＣ５は、高い基質特異性を有するプロテアーゼである。サブチリシンと比較して、フリン、ＰＣ１、およびＰＣ５の一次配列への３つ以上のアミノ酸の挿入のいくつかの領域が見られる。（−４−）、（−５−）、（−７−）、（−９−）、および（−１１−）と記された領域は、好ましいＳＤＲ挿入部位である。これらの領域ストレッチは、ＳＤＲの候補として選択されるための２つの基準を満たす。第一に、これらは、非特異的なプロテアーゼと比較して特異的なプロテアーゼにおける挿入である。第二に、それらは活性部位残基に近い。
【０１６２】
図５：「球棒」表示で示された活性部位残基を有するベータセクレターゼの３次元構造。番号を付された領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【０１６３】
図６：ペプシン、ｂ−セクレターゼ、およびカテプシンＤ（これらの全てが、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーの構造クラスＡ１に属する）の一次アミノ酸配列のアラインメント。ペプシンは、この構造クラスの非特異的プロテアーゼである。一方、ｂ−セクレターゼおよびカテプシンＤは、高い特異性を有するプロテアーゼである。ペプチドに比べて、ｂ−セクレターゼおよびカテプシンＤの一次配列中への３以上のアミノ酸の挿入のいくつかの領域が見られる。−１−〜−１１−で記された領域は、可能性のあるＳＤＲ組み合わせ部位に対応し、そして図５にも記されている。
【０１６４】
図７：「球棒」表示で示された活性部位残基を有するカスパーゼ７の３次元構造を示す。番号を付した領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【０１６５】
図８：システインプロテアーゼクラスＣ１４ファミリーのメンバーとしてのカスパーゼ７の一次アミノ酸配列を示す（配列番号１４もまた参照）。
【０１６６】
図９：本発明の第三の局面による方法の模式図である。
【０１６７】
図１０：トリプシン発現のウエスタンブロット分析である。トリプシンの変異体を発現する細胞培養の上清が、ネガティブコントロールと比較されている。レーン１：分子量標準：レーン２：ネガティブコントロール；レーン３：変異体ａの上清；レーン４：ネガティブコントロール；レーン５：変異体ｂの上清；発現された担に対して特異的な一次抗体およびシグナルの生成のための二次抗体を使用した。
【０１６８】
図１１：標的基質のタンパク質分解切断の時間経過。ヒトトリプシンの遺伝子を有するベクターを含有する細胞の上清、および遺伝子を含まないベクターを含有する細胞の上清を、本文中に記載したペプチド基質とインキュベートした。ペプチドの切断により、読み出し値が低下した。タンパク質分解活性は、陽性クローンについて確認される。
【０１６９】
図１２：異なるペプチド基質に対するヒトトリプシンＩと比較した３つの人工タンパク質分解酵素の相対活性。２つの基質のタンパク質分解消化の時間経過を行い、評価した。基質Ｂをスクリーニングに使用し、基質Ａは密接に関連した配列である。相対活性；３つの変異体の相対活性を、ヒトトリプシンＩに対して活性に対して正規化した。変異体１および変異体２は、標的基質に対して明らかに増大した特異性を示す。一方、変異体３は、ヒトトリプシンＩと類似した活性を有するネガティブコントロールとして働く。
【０１７０】
図１３：それぞれ、トリプシン、および１つまたは２つのＳＤＲを有する人工タンパク質分解酵素の変異体の相対活性。プロテアーゼの活性を、競合基質の存在下（すなわち、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のペプトン）および非存在下で決定した。タンパク質分解切断の時間経過を記録紙、時間定数ｋを決定した。競合剤ありとなしとの間の時間定数の比が形成され、プロテアーゼの特異性の定量的尺度を表す。比をトリプシンに対して正規化した。２つのＳＤＲを含有する変異体の特異性は、ＳＤＲ２のみを有する変異体の特異性よりも２．５倍高かった。
【０１７１】
図１４：競合基質の非存在下および存在下でのプロテアーゼ変異体の相対的特異性を示す。異なる配列を有する２つのインサートを含有するプロテアーゼ変異体はおよび非修飾足場ヒトトリプシンＩを適切な宿主のおいて発現した。プロテアーゼ変異体の活性を、競合基質の非存在下および存在下でのＴＮＦアルファの所望の標的配列を有するペプチドの切断速度として決定した。特異性を、競合剤の存在下および非存在下での切断速度の比として表した。
【０１７２】
図１５：図は、ヒトＴＮＦアルファに対して特異的な本発明の人工タンパク質分解酵素を発現する培養物由来の濃縮された上清とともにヒトＴＮＦあるいはフラグメントをインキュベートした時のヒトＴＮＦアルファによって誘導される細胞傷害性の減少を示す。これは、本発明の人工タンパク質分解酵素の効率を示す。
【０１７３】
図１６：図は、ヒトＴＮＦアルファに対して特異的な異なる濃度の精製した本発明の人工タンパク質分解酵素とともにヒトＴＮＦアルファをインキュベートした時のヒトＴＮＦアルファによって誘導される細胞傷害性の減少を示す。変異体ｇは、ＳＤＲ１として配列番号７２およびＳＤＲ２として配列番号７３を含む。これは、本発明の人工タンパク質分解酵素の効率を示す。
【０１７４】
図１７：図は、２つのタンパク質基質（ａ）ヒトＴＮＦアルファ、（ｂ）ヒト血清タンパク質の混合物において、ヒトＴＮＦアルファに対して特異的な本発明の人工タンパク質分解酵素の活性を、ヒトトリプシンＩの活性と比較する。これは、本発明の人工タンパク質分解酵素の安全性を示す。変異体ｘは、配列番号８９（ＳＤＲ１）および配列番号９５（ＳＤＲ２）に従うＳＤＲを含有する配列番号７５に対応する。変異体ｘｉおよびｘｉｉは、同じＳＤＲ配列を含有するその誘導体に対応する。
【０１７５】
図１８：ヒトトリプシン由来の人工タンパク質分解酵素によるヒトＶＥＧＦの特異的加水分解。
【実施例】
【０１７６】
以下の実施例では、本発明の方法により得られた酵素の触媒特性の決定を含む本発明の材料および方法が提供される。これらの実施例は、例示の目的のためのみであり、いかなる様式においても本発明を限定すると解釈されるものではないことは理解されるべきである。ここに引用される全ての文献、特許、および特許出願は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０１７７】
以下に記載される実験例では、種々の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｏｒ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９８８、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載された組換えＤＮＡ技術の標準技術を使用した。特に示されない限り、製造業者の指示書に従って、制限酵素、ポリメラーゼ、および他の酵素、ならびにＤＮＡ精製キットを使用した。
【０１７８】
（実施例Ｉ：ヒトトリプシンにおけるＳＤＲ部位の同定）
ＳＤＲの挿入部位は、セリンプロテアーゼヒトトリプシンＩ（構造クラスＳ１）において、より高い配列特異性を有する同じ構造クラスのメンバーとの比較によって、同定されている。トリプシンは、Ｐ₁位置にアルギニンまたはリジン残基のみを必要とするので、低い基質特異性を有するメンバーである。他方、トロンビン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、またはエンテロキナーゼは全て、それらの基質配列、すなわち、（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ）ＸＰＲ＾ＮＡ、ＣＰＧＲ＾ＶＶＧＧ、およびＤＤＤＫ＾それぞれに対して高い特異性を有する。これらおよびさらいＳ１セリンプロテアーゼの一次配列および三次構造は、配列および構造の低いおよび高い相同性の領域、特により特異的なプロテアーゼの配列の挿入に対応する領域を決定するためにアラインメントされている（図２）。潜在的ＳＤＲ部位を表す３アミノ酸と同じかまたはそれよりも長い挿入のいくつかの領域は、図１に示されるように同定されている。これらの領域を、以下の実施例においてＳＤＲの挿入のための標的部位として選択した。例えば、それぞれ、６の長さを有するＳＤＲ１（図２における領域１、配列番号１のアミノ酸４２の後）および５アミノ酸の長さを有するＳＤＲ２（図２の領域３、配列番号１のアミノ酸２３の後）。
【０１７９】
（実施例ＩＩ：足場タンパク質として使用されるヒトトリプシンＩ遺伝子の分子クローニングおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける成熟プロテアーゼの発現）
非特異的プロテアーゼヒトトリプシノーゲンＩをコードする遺伝子を、ベクターｐＵＣ１８にクローニングした。クローニングを以下のとおり行った。タンパク質のコード配列を、ＫｐｎＩ部位を５’末端に、そしてＢａｍＨＩ部位を３’末端に導入したプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＵＣ１８の適切な部位にクローニングした。同一性を配列決定により確認した。配列決定した後、成熟タンパク質のコード配列を、異なるＢｇｌＩ部位を５’末端および３’末端に導入したＰＣＲによって増幅した。
【０１８０】
このフラグメントを、大腸菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトルベクターの適切な部位にクローニングした。このベクターは、大腸菌中のｐＭＢ１増幅起点、大腸菌中での選択のためのネオマイシン耐性マーカー、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける構成的発現のためのＰ４３プロモーターを含有する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｉｌｓのｓａｃＢ遺伝子由来のシグナルペプチドをコードするリーダー配列を含有する８７ｂｐのフラグメントを、Ｐ４３プロモーターの後ろに導入した。異なるＢｇｌＩ制限部位は、異種遺伝子が発現するための挿入部位として作用する。
【０１８１】
ヒトトリプシンＩの発現を、遺伝子を有するベクターを含有する細胞の上清中でタンパク質分解活性を、ネガティブコントロールと比較して測定することにより確認した。アルギニン切断部位を含むペプチドを基質として選択した。ペプチドは、Ｎ末端ビオチン化および蛍光色素によりＣ末端を標識された。そのペプチドを培養上清とともにインキュベートした後、ストレプトアビジンを添加した。切断されていないペプチドはストレプトアビジンと結合し、高い読み出し値を示すが、切断されたものは低い読み出し値を生じる。図１１は、トリプシンＩ遺伝子を含まないベクターを含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ネガティブコントロール）と比較して、トリプシンＩ遺伝子を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞のタンパク質分解消化の時間経過を示す。プロテアーゼの発現のさらなる確認として、遺伝子を有するベクターを含有する細胞およびコントロール細胞の上清を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびその後の標的プロテアーゼに対する抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した。手順は、標準的な方法にしたがって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． Ｆ； Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ． Ｆ．； Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。図８は、トリプシンの遺伝子を有するベクターを有する細胞中のみのタンパク質の発現を確認する。
【０１８２】
（実施例ＩＩＩ：足場タンパク質の提供）
この実施例では、ヒトトリプシンＩを足場タンパク質として使用した。遺伝子を、その天然の形態で使用したか、または触媒活性が増大し、もしくはさらに改善した特性を有する足場タンパク質を生じるように修飾した。
【０１８３】
修飾は、遺伝子のランダム修飾、次いでその酵素の発現、および続いて活性の増大したものの選択によって行った。第一に、遺伝子を、本質的にＣａｄｗｅｌｌ、Ｒ．Ｃ．およびＪｏｙｃｅ、Ｇ．Ｆ．（ＰＣＲ ＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ． ２ （１９９２） ２８−３３）によって記載されるように変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）条件下でＰＣＲ増幅した。変異性ＰＣＲを、３０ｐｍｏｌの各プライマー、２０ｍｍｏｌのＧＴＰおよびｄＡＴＰ、１００ｎｍｏｌのＣＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｆｍｏｌのテンプレート、および５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ ゼラチン中で、９４℃で１分、６５℃で１分、および７２℃で１分の２０サイクルで行った。得られるＤＮＡライブラリーを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを供給業者の指示書に従って使用して精製した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩを用いて消化し、精製した。その後、ＰＣＲ産物を、上記のように大腸菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトルベクター中へライゲーションし、これをＢｇｌＩで消化して、脱リン酸化した。ライゲーション産物を大腸菌へ形質転換し、ＬＢ中で増幅し、そしてプラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを供給業者の指示書にしたがって使用して精製した。得られるプラスミドをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞に形質転換した。
【０１８４】
あるいは、またはランダム変異誘発に加えて、遺伝子の変異体を、本質的にＷＯ ０１３４８３５に記載されるように、組換え連鎖反応を使用して相同位置で統計学的に組み換えた。プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を、ＱｌＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを供給業者の指示書にしたがって使用して精製し、アガロースゲル電気泳動によって正確なサイズを供給業者の指示書にしたがってチェックし、そして等モル量で混合した。１５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ₂中のこのＰＣＲ混合物の８０μｇを、９４℃で５分間加熱し、続いて１秒ごとに０．０５℃で３７℃まで冷却し、鎖を再アニーリングし、それによりヘテロ二重鎖を確率論的な様式で生成した。次いで、１ΜＧのＤＮＡ当たり２．５Ｕ エンドヌクレアーゼＩＩＩを添加し、２０、４０、または６０分間、３７℃でインキュベートして、ヘテロ二重鎖の両方の３’末端から異なる長さを消化した。部分的に消化したＰＣＲ産物を、供給業者の指示書にしたがって０．１７ｍＭ ｄＮＴＰおよびＰｆｕポリメラーゼ緩衝液中で７２℃で１５分間インキュベートすることによって、１μｇ ＤＮＡ当たり０．６Ｕ Ｐｆｕのポリメラーゼで再充填した。一回のＰＣＲサイクルを行った後、得られたＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを供給業者の指示書にしたがって使用して精製し、ＢｇｌＩで消化し、直線化したベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌中へ形質転換し、アンピシリンをマーカーとして含有するＬＢ中で増幅し、そのプラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを供給業者の指示書に従って使用して精製した。得られたプラスミドを、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞中へ形質転換した。
【０１８５】
（実施例ＩＶ：ヒトトリプシンＩのタンパク質足場へのＳＤＲの挿入および配列ＫＫＷＬＧＲＶＰＧＧＰＶを有するペプチド基質に対する特異性を有する人工タンパク質分解酵素の生成）
ヒトトリプシンＩ中にＳＤＲのための挿入部位を作製するために、異なる制限部位の２つのペアを、アミノ酸配列を変更せずに潜在的ＳＤＲ部位として同定された部位（上記実施例Ｉを参照）に遺伝子を導入した。制限部位の挿入は、オーバーラップＰＣＲによって行われた。プライマーｒｅｓｔｒＩおよびｒｅｓｔｒ２をＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の導入のために使用し、ｒｅｓｔｒ３およびｒｅｓｔｒ４を、ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩ制限部位の導入のために使用した。プライマーの配列は以下の通りである：
【０１８６】
ｒｅｓｔｒ１およびｒｅｓｔｒ２についての結合部位および対応するアミノ酸配列（配列番号５４）：
【化１】

フォワードプライマーｒｅｓｔｒ１（配列番号５６）：
【化２】

リバースプライマーｒｅｓｔｒ２（配列番号５７）：
【化３】

ｒｅｓｔｒ３およびｒｅｓｔｒ４についての結合部位および対応するアミノ酸配列（配列番号５８）：
【化４】

フォワードプライマーｒｅｓｔｒ３（配列番号６０）：
【化５】

リバースプライマーｒｅｓｔｒ４（配列番号６１）：
【化６】

【０１８７】
第一のオーバーラップ伸長ＰＣＲにおいて、ＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を導入し、ＳＤＲ１を挿入できるようにし、第二のオーバーラップ伸長ＰＣＲにおいて、ＫｐｎＩ／ＮｈｅＩ部位を導入し、ＳＤＲ２を挿入できるようにした。オーバーラップ伸長ＰＣＲの産物を、プライマーｐＵＣフォワードおよびｐＵＣリバースを用いて増幅した。ｐＵＣフォワードおよびｐＵＣリバースの配列は、以下の通りである：
ｐＵＣフォワード（配列番号６２）：
【０１８８】
５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴ−３’
ｐＵＣリバース（配列番号６３）：
【０１８９】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣ−３’
【０１９０】
続いて、それにより生成された制限酵素部位を使用して、規定されたまたはランダムオリゴヌクレオチドをＳＤＲ１およびＳＤＲ２挿入部位に、標準的な制限およびライゲーション法によって挿入した。典型的には、２つの相補性合成５’リン酸化オリゴヌクレオチドをアニーリングし、それぞれの制限酵素で切断した修飾ヒトトリプシンＩ遺伝子を有するベクターにライゲーションした。ＳＤＲ１をコードするオリゴヌクレオチドを、ＳａｃＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を介して挿入し、一方、ＳＤＲ２をコードするオリゴヌクレオチドを、ＫｐｎＩ／ＮｈｅＩ部位を介して挿入した。各挿入について、以下の一般的な配列に従うオリゴヌクレオチドペアを使用した（［Ｐ］は、５’リン酸化を示す。ＮおよびＸは、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸残基をそれぞれ示す。）：
ｏｌｉｇｏｘ−ＳＤＲ１ｆ（配列番号６４）：
【化７】

ｏｌｉｇｏｘ−ＳＤＲ１ｒ（配列番号６６）：
【化８】

ｏｌｉｇｏｘ−ＳＤＲ２ｆ（配列番号６７）：
【化９】

ｏｌｉｇｏｘ−ＳＤＲ２ｒ（配列番号６９）：
【化１０】

【０１９１】
上記方法の代替方法として、修飾されたヒトトリプシンＩ中のＳＤＲ１およびＳＤＲ２挿入部位へのランダム配列の組み込みのためにＰＣＲに基づく方法が使用される。各ＳＤＲについて、１つのプライマーが使用され、ここでＳＤＲ領域は、完全にランダム化されている。プライマーの配列は以下の通りである（Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ）：
プライマーＳＤＲ１−ｍｕｔｎｎｂフォワード（配列番号７０）：
【化１１】

プライマーＳＤＲ２−ｍｕｔｎｎｂリバース（配列番号７１）：
【化１２】

【０１９２】
さらなる代替方法として、特異性を増大させるＳＤＲを同定した後、これらのＳＤＲをさらなるランダム化のための鋳型として使用した。それにより、各位置で部分的にランダム化したランダム化したランダムペプチド配列、および元々の配列に対して各位置で同一部分的に同一であるランダムペプチド配列を挿入した。
【０１９３】
例として、３つの場合のなかの約１において鋳型アミノ酸残基を有し、３つの場合のうちの約２において任意の他のアミノ酸残基を各位置で有するランダムペプチド配列を、修飾ヒトトリプシンＬの２つのＳＤＲ挿入部位に挿入した。この目的のために、ＳＤＲの各ヌクレオチド位置で鋳型塩基の約７０％および３つの他の塩基の混合物を３０％を含有するプライマーを使用した。各プライマーペアを用いて、標準的な条件下でヒトトリプシンＩ遺伝子を鋳型として用いてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを、供給業者の指示書に従って使用して精製し、ＳａｃＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化後、ＤＮＡを精製し、ＳａｃＩＩおよびＮｈｅＩ消化され脱リン酸化されたベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を、大腸菌に形質転換し、それぞれのマーカーを含有するＬＢ中で増幅し、そのプラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを供給業者の指示書にしたがって用いて精製した。得られたプラスミドをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞中へ形質転換した。次いで、これらの細胞を、単一の細胞へ分離し、クローンへと増殖させ、プロテアーゼ遺伝子の発現後、タンパク質分解活性についてスクリーニングした。
【０１９４】
以下の基質を、タンパク質分解活性のスクリーニングのために使用した（配列番号７６および７７）
【数１】

【０１９５】
プロテアーゼ変異体を、基質Ｂについて、共焦点蛍光顕微鏡によって１０⁶変異体の複雑性（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ）でスクリーニングした。基質は、Ｎ末端でビオチン化され、Ｃ末端で蛍光標識されていた。ペプチドをプロテアーゼの異なる変異体を発現する細胞の上清とともにインキュベーションした後、ストレプトアビジンを添加し、そのサンプルを共焦点蛍光定量法によって分析した。ペプチドの低い濃度（２０ｎＭ）は、高いｋ_cat／Ｋ_M値を有するプロテアーゼ（すなわち、標的配列に対する高い特異性を有するプロテアーゼ）による優先的な切断を導いた。
【０１９６】
スクリーニング手順において選択された変異体を、さらにそれらの基質Ｂおよび密接に関連する基質Ａに対する特異性について、タンパク質分解酵素消化の時間経過を測定することにより、およびｋ_cat／Ｋ_M値に比例する速度定数を決定することにより、評価した。明らかに、足場タンパク質として使用されたヒトトリプシンと比較して、変異体１および２の特異的活性は、基質Ｂのほうへシフトしている（それぞれ、配列番号２および３）。他方、変異体３（配列番号４）は、ヒトトリプシン１と同様の活性を有するネガティブコントロールとして作用する。３つの変異体の遺伝子の配列決定により、ＳＤＲ中の以下のアミノ酸配列が明らかになった。
表２：基質Ｂの特異的加水分解について選択された３つの異なる変異体中の２つのＳＤＲの配列（配列番号７８〜８３）
【表２】

【０１９７】
さらなる実験において、１遺伝子当たり異なる数のＳＤＲを含有する変異体のプールを、規定された基質および競合基質としてのペプトンの混合物を使用して、増大した特異性に関してスクリーニングした。１遺伝子当たりのＳＤＲをさらに分析した。特異性の指標として、ペプチド切断アッセイにおける活性を、競合基質の存在下および非存在下で比較した。競合基質の濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。これらの条件下で、非特異的プロテアーゼは、特異的プロテアーゼと比較して、競合剤濃度の増加につれて（０〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲）より強い活性の減少を示す。基質ありとなしのタンパク質分解活性の比は、プロテアーゼの特異性の定量的指標である。図９は、競合基質ありとなしとの相対的活性を示す。足場タンパク質として使用されたヒトトリプシンＩおよび２つの変異体（１つはＳＤＲ２のみを含み、１つは両方のＳＤＲを含む）を比較した。両方のＳＤＲを有する変異体の特異性は、ＳＤＲ２のみを有する変異体の特異性よりも２．５倍高い。これは、ＳＤＲの数と得られる人工タンパク質分解酵素の定量的特異性との間に直接的関連性があることを確証する。
【０１９８】
（実施例Ｖ：ヒトＴＮＦアルファを特異的に不活性化する人工タンパク質分解酵素の生成）
ヒトトリプシンアルファＩ、または１つ以上の下記のアミノ酸置換Ｅ５６Ｇ；Ｒ７８Ｗ；Ｙ１３１Ｆ；Ａ１４６Ｔ；Ｃ１８３Ｒを含む誘導体を、ヒトＴＮＦアルファに対する高い特異性を有する人工タンパク質分解酵素の生成のためのタンパク質足場として使用した。ヒトトリプシンＩまたはその誘導体におけるＳＤＲ部位の同定を、上記のように行った。足場内の２つの挿入部位を、ＳＤＲについて選択した。異なる配列を有する２つの挿入断片を含有するプロテアーゼ変異体および挿入物を有さないヒトトリプシンＩ自体は、枯草菌細胞内で発現された。変異体プロテアーゼ細胞を、単一細胞クローンに分離し、プロテアーゼ発現変異体を、ＴＮＦアルファの所望の標的配列を有するペプチドにおけるタンパク質分解活性についてスクリーニングした。プロテアーゼ変異体の活性を、競合基質の存在下または非存在下でのＴＮＦアルファの所望の標的配列を有するペプチドの切断速度として決定した。特異性を、競合剤の存在下および非存在下における切断速度の比として表した（図１４）。
【０１９９】
表３：競合基質の存在下または非存在下での異なるＳＤＲ配列を有する人工タンパク質分解酵素の変異体の相対活性（配列番号８４−９５）。
【表３】

【０２００】
３つの本発明のプロテアーゼ変異体のヒトＴＮＦアルファに対する拮抗性効果を、図１５に示す。変異体の使用により、アポトーシスの誘導は、ほとんど完全に排除された。これはＴＮＦアルファの分解を開始する本発明のプロテアーゼの抗炎症性効果を示す。ＴＮＦアルファを、変異体ｉ〜ｉｉｉを発現する培養由来の濃縮した上清とともに２時間インキュベートした。得られたＴＮＦアルファを、非修飾細胞とともに４時間インキュベートした。残りのＴＮＦアルファ活性の効果を、アポトーシス細胞のマーカーとしての活性化カスパーゼ３を検出することによって、アポトーシスの誘導の程度として決定した。コントロールとして、それぞれ、ヒトＴＮＦアルファ（死細胞）にプロテアーゼを加えないか、またはヒトＴＮＦアルファ（生細胞）の代わりに緩衝液を使用した。精製した変異体ｘｉｉｉを使用した類似の実験を図１６に示した。ＴＮＦアルファを、異なる濃度の精製した本発明のプロテアーゼ変異体とともにインキュベートした。
【０２０１】
本発明のプロテアーゼ変異体の特異性を実証するために、ヒト血清由来のタンパク質または精製したヒトＴＮＦアルファを、ヒトトリプシンＩまたは本発明の人工タンパク質分解酵素変異体とともにそれぞれインキュベートした。ここで、変異体ｘは、配列番号７５に対応し、変異体ｆと同じＳＤＲ、すなわち、配列番号８９（ＳＤＲ１）および配列番号９５（ＳＤＲ２）のＳＤＲを含む。変異体ｘｉおよびｘｉｉは、同じＳＤＲ配列を含むその誘導体に対応する。残りのインタクトなタンパク質を時間の関数として決定した。変異体ならびにヒトトリプシンＩがヒトＴＮＦアルファを消化するのに対して、トリプシンのみが血清タンパク質に対して活性を示す（図１７ａおよびｂ）。これは、本発明のタンパク質分解酵素の高いＴＮＦアルファ特異性を示し、それらの安全性、したがって、それらの治療用途のための副作用の低さを示す。
【０２０２】
（実施例ＶＩ：ヒトＶＥＧＦを特異的に加水分解する人工タンパク質分解酵素の生成）
ヒトトリプシンＩを、ヒトＶＥＧＦに対して高い特異性を有する人工タンパク質分解酵素の生成のためにタンパク質足場として使用した。ヒトトリプシンＩ内のＳＤＲ部位の同定は、上記のように行った。足場内の２つの挿入部位をＳＤＲのために選択した。異なる配列を有する２つの挿入断片を含有するプロテアーゼ変異体を、枯草菌細胞中で発現させた。変異体プロテアーゼ細胞を、単一細胞クローンへと分離し、そのプロテアーゼ発現変異体を上記のようにスクリーニングした。プロテアーゼ変異体の活性をＶＥＧＦ切断の速度として決定した。４μｇの組換えヒトＶＥＧＦ１６５を、室温でＰＢＳ／ｐＨ７．４中にて０．１８μｇの精製プロテアーゼとともにインキュベートした。示された時間にアリコートをとり、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。切断の程度を、バンドの濃度測定分析によって定量した。活性をインキュベーション時間に対して図１８にプロットした。特異的切断を、さらなるＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析によって制御した。
【０２０３】
以下の図面は、詳細な説明を補充し、本発明をさらに説明するために提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】「球棒」表示で示される活性化部位残基を有するヒトトリプシンＩの３次元構造を示す。印をつけた領域は潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【図２】セリンプロテアーゼクラスＳ１ファミリーである３つのメンバー：ヒトトリプシン１、ヒトアルファトロンビン、およびヒトエンテロペプチダーゼの一次アミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号１、５、および６もまた参照）。
【図３】「球棒」表示で示された活性部位残基を有するサブチリシンの３次元構造を示す。番号を付された領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【図４】セリンプロテアーゼＳ８ファミリーの４つのメンバー：サブチリシンＥ、フリン、ＰＣ１、およびＰＣ５の一次アミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号７〜１０もまた参照）。
【図５】「球棒」表示で示された活性部位残基を有するペプシンの３次元構造を示す。番号を付された領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【図６】Ａ１アスパラギン酸プロテアーゼファミリーの３つのメンバー：ペプシン、β−セクレターゼ、およびカテプシンＤの一次アミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号１１〜１３もまた参照）。
【図７】「球棒」表示で示された活性部位残基を有するカスパーゼ７の３次元構造を示す。番号を付した領域は、潜在的ＳＤＲ挿入部位を示す。
【図８】システインプロテアーゼクラスＣ１４ファミリーのメンバーとしてのカスパーゼ７の一次アミノ酸配列を示す（配列番号１４もまた参照）。
【図９】本発明の第３の局面を模式的に示す。
【図１０】ネガティブコントロールと比較して、ＳＤＲ１およびＳＤＲ２を有するヒトトリプシンＩの変異体を発現する細胞の培養上清のウエスタンブロットを示す。
【図１１】ヒトトリプシンＩによる標的基質のタンパク質分解による切断の時間経過を示す。
【図１２】本発明の人工タンパク質分解酵素の３つの変異体の、２つの異なるペプチド基質上でのヒトトリプシンＩとの比較における相対的活性を示す。
【図１３】ヒトトリプシンＩおよび１つ以上のＳＤＲを有する本発明の人工タンパク質分解酵素の相対的特異性をそれぞれ示す。
【図１４】ヒトトリプシンＩおよび、ヒトＴＮＦ−アルファの標的基質を有するペプチド上の足場を有数するヒトＴＮＦ−アルファに対して特異的な本発明の人工タンパク質分解酵素の相対的特異性を示す。
【図１５】ＴＮＦアルファを、ヒトＴＮＦ−アルファに対して特異的な本発明の人工タンパク質分解酵素を発現する培養物からの濃縮された上清と組み合わせたときにＴＮＦアルファによって誘導される細胞傷害性の減少を示す。
【図１６】ＴＮＦ−アルファを、ヒトＴＮＦ−アルファに対して特異的である精製された本発明の人工タンパク質分解酵素とインキュベートしたときの、ＴＮＦ−アルファによって誘導される細胞傷害性の減少を示す。
【図１７】ヒトＴＮＦ−アルファに対して特異的である本発明の人工タンパク質分解酵素の活性を、ヒトトリプシンＩＩの活性と、２つのタンパク質基質：（ａ）ヒトＴＮＦ−アルファ；（ｂ）ヒトセリンタンパク質の混合物において比較する。
【図１８】ヒトＶＥＧＦに対する特異性を有する本発明の人工タンパク質分解酵素の特異的活性を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分：
（ａ）少なくとも１つの標的基質における少なくとも１つの化学反応を触媒し得るタンパク質足場、および
（ｂ）得られる人工タンパク質が、少なくとも１つの標的基質と、１つ以上の異なる基とを区別することを可能にするタンパク質足場中の部位に位置する一つ以上の特異性決定領域（ＳＤＲ）、
の組み合わせによって特徴付けられる、規定された特異性の触媒活性を有する人工酵素。
【請求項２】
（Ｉ）前記ＳＤＲ（ｂ）が、５０アミノ酸残基未満の長さを有し、好ましくは、２〜２０アミノ酸残基の長さを有し、より好ましくは、２〜１０アミノ酸残基の長さを有し、さらにより好ましくは、３〜８アミノ酸残基の長さを有し、ここで、ＳＤＲの数は、少なくとも１個、好ましくは、１個より多く、より好ましくは、２〜１１個、最も好ましくは、２〜６個であり、および／または
（ＩＩ）前記タンパク質足場（ａ）は、同じかまたは異なる（ｉ）ウイルス、原核生物もしくは真核生物起源の遺伝子によってコードされるタンパク質、および／または（ｉｉ）天然の酵素、もしくはその変異誘導体もしくは切断型誘導体、および／または（ｉｉｉ）哺乳動物酵素、好ましくは、ヒト酵素に由来する１以上のポリペプチドから構成される、
請求項１に記載の人工酵素。
【請求項３】
前記タンパク質足場（ａ）が、加水分解酵素（好ましくは、プロテアーゼ）；リパーゼ；グリコシラーゼ；トランスフェラーゼ（好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼ）；酸化還元酵素（好ましくは、モノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼ）；リアーゼ；イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択される酵素に由来し、
より好ましくは、前記タンパク質足場（ａ）が、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびスレオニンプロテアーゼから選択されるプロテアーゼに由来し、
さらにより好ましくは、前記タンパク質足場（ａ）は、構造クラスＳ１、Ｓ８、Ｓ１１、Ｓ２１、Ｓ２６、Ｓ３３、またはＳ５１（最も好ましくは、クラスＳ１もしくはＳ８）のセリンプロテアーゼ、構造クラスＣ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ１０、Ｃ１４、Ｃ１９、Ｃ４７、Ｃ４８、もしくはＣ５６（最も好ましくは、クラスＣ１４）のシステインプロテアーゼ、または構造クラスＡ１、Ａ２、もしくはＡ２６（最も好ましくは、クラスＡ１）のアスパラギン酸プロテアーゼ、または構造クラスＭ４もしくはＭ１０のメタロプロテアーゼに由来する、請求項１または２に記載の人工酵素。
【請求項４】
（ｉ）前記タンパク質足場（ａ）が、構造クラスＳ１のセリンプロテアーゼに由来し、および／または
（ｉｉ）前記ＳＤＲが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトトリプシンＩ中の領域１８−２５、３８−４８、５４−６３、７３−８６、１２２−１３０、１４８−１５６、１６５−１７１、および１９４−２０４に、構造的にもしくはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置に存在し、より好ましくは、ヒトトリプシンＩ中の領域２０−２３、４１−４５、５７−６０、７６−８３、１２５−１２８、１５０−１５３、１６７−１６９、および１９７−２０１に構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群から選択される一つ以上の位置に存在する、請求項３に記載の人工酵素。
【請求項５】
（ｉ）タンパク質足場（ａ）が、セリンプロテアーゼであるトリプシン、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトトリプシンＩもしくはその誘導体であるか、または配列番号１のアミノ酸配列に以下のアミノ酸置換：Ｅ５６Ｇ、Ｒ７８Ｗ、Ｙ１３１Ｆ、Ａ１４６Ｔ、およびＣ１８３Ｒを有するものであり、
（ｉｉ）２つのＳＤＲのうちの少なくとも１つが、足場中に位置し、第一のＳＤＲが６アミノ酸までの長さを有し、残基４２と４３との間に挿入されており、第二のＳＤＲが５アミノ酸までの長さを有し、残基１２３と１２４との間に挿入されている（配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒトトリプシンＩに対しての番号付け）、請求項４に記載の人工酵素。
【請求項６】
残基４２と４３との間に第一のＳＤＲとして挿入された以下の群：配列番号７２、７８、７９、８０、８４、８５、８６、８７、８８、および８９のペプチド配列の１つ、および／または
残基１２３と１２４との間に第二のＳＤＲとして挿入された以下の群：配列番号７３、８１、８２、８３、９０、９１、９２、９３、９４、および９５のペプチド配列の１つ、を含み、
前記人工酵素が、配列番号７４または配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の人工酵素。
【請求項７】
（ｉ）前記タンパク質足場（ａ）が、構造クラスＳ８のセリンプロテアーゼに由来し、および／または
（ｉｉ）前記ＳＤＲが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する枯草菌由来のサブチリシン中の領域６−１７、２５−２９、４７−５５、５９−６９、１０１−１１１、１１７−１２５、１２９−１３７、１３９−１５４、１５８−１６９、１８５−１９５、および２０４−２２５に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置、好ましくは、枯草菌由来のサブチリシン中の領域５９−６９、１０１−１１１、１２９−１３７、１５８−１６９、および２０４−２２５に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置に存在する、請求項３に記載の人工酵素。
【請求項８】
（ｉ）前記タンパク質足場（ａ）が、構造クラスＡ１のアスパラギン酸プロテアーゼに由来し、および／または
（ｉｉ）前記ＳＤＲが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するヒトペプシン中の領域６−１８、４９−５５、７４−８３、９１−９７、１１２−１２０、１２６−１３７、１５９−１６４、１８４−１９４、２４２−２４７、２６２−２６７、および２７７−３００に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置、より好ましくは、ヒトペプシン中の領域１０−１５、７５−８０、１１４−１１８、１３０−１３４、１８６−１９１、および２８０−２９６に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置に存在する、請求項３に記載の人工酵素。
【請求項９】
（ｉ）前記タンパク質足場（ａ）が、構造クラスＣ１４のシステインプロテアーゼに由来し、および／または
（ｉｉ）前記ＳＤＲが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するヒトカスパーゼ７中の領域７８−９１、１４４−１６０、１８６−１９８、２２６−２４３、および２７１−２９１に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置、より好ましくは、ヒトカスパーゼ７中の領域８０−８６、１４９−１５７、１９０−１９４、および２３３−２３８に対して構造的にまたはアミノ酸配列相同性により対応する位置の群からの一つ以上の位置に存在する、請求項３に記載の人工酵素。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも１つの人工酵素、ならびに
（ｉ）少なくとも１つのさらなるタンパク質様成分であって、好ましくは、結合ドメイン、受容体、抗体、調節ドメイン、プロ配列、およびこれらのフラグメントからなる群から選択されるタンパク質様成分、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つのさらなる機能的成分であって、好ましくは、ポリエチレングリコール、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、金属、金属キレート剤、およびこれらのフラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される機能的成分、
から構成される融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の酵素または請求項１０に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターまたは請求項１１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１４】
大腸菌、枯草菌、出芽酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｎｉｓ、ＣＨＯ、およびＢＨＫからなる群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の酵素または請求項１０に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、請求項１３または１４に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの標的基質に対する規定された特異性を有する請求項１〜９のいずれかに記載の人工酵素を作製する方法であって、
少なくとも１つの以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの基質における少なくとも１つの化学反応を触媒するタンパク質足場を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの前記タンパク質足場をコードするポリヌクレオチドと、合成ペプチド配列をコードする一つ以上の完全または部分的ランダム合成オリゴヌクレオチド配列とを、得られるコードされた人工酵素が少なくとも１つの標的基質と一つ以上の異なる基質とを区別できるような部位で、組み合わせ、該酵素を発現させることにより、人工酵素または単離された人工酵素のライブラリーを生成する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において生成された人工酵素のライブラリーから、少なくとも１つの標的基質に対する規定された特異性を有する一つ以上の酵素を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
（Ｉ）工程（ｂ）の組み合わせが行われる部位が、タンパク質足場の特定の部位であり、組み合わせ部位として適した部位が、活性部位に近い領域を同定することにより、好ましくは、該タンパク質足場と競合阻害剤もしくは基質アナログとの複合体の構造分析により、および／または異なる定量的もしくは定性的特異性を有する同じ構造クラスの異なる酵素の構造アラインメントおよび異種領域の同定により、および／または異なる定性的もしくは定量的特異性を有する同じ構造クラスの酵素からのアミノ酸配列の競合アッセイおよび異種領域の同定により、および／またはアラニンスキャニング、ランダム変異誘発、ランダム挿入、もしくはランダム欠失のような変異誘発技術を含む実験分析およびその後の特異性に必須または感受性のタンパク質足場中の領域を同定することにより、同定され、ならびに／または
（ｉｉ）工程（ｂ）の組み合わせ部位が、前記タンパク質足場にわたってランダムに分布している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において組み合わされる前記ペプチド配列が、完全または部分的にランダムであり、および／もしくは長さのバリエーションを有し；ならびに／または
工程（ｃ）における選択が、
（ｉ）低い標的基質濃度で、もしくは
（ｉｉ）標的基質および少なくとも１つのさらなる基質を比較して使用することによって、もしくは
（ｉｉｉ）前記標的基質よりも他の基質を過剰に添加し、該添加された基質を競合剤として使用することによって、もしくは
（ｉｖ）酵素阻害剤を添加することにより、もしくは
（ｖ）標的基質に優先的に結合する酵素を選択し、このサブグループから基質を変換する酵素を選択することにより、もしくは
（ｖｉ）これらの任意の組み合わせにより、
酵素活性および／もしくは酵素親和性に関してスクリーニングすることによって達成される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）工程（ａ）〜（ｃ）が、少なくとももう１サイクル繰り返され、および１つのサイクルの工程（ｃ）で選択される前記ＳＤＲが、将来のサイクルの工程（ｂ）において挿入されるタンパク質配列のランダム化のための鋳型として働き、および／または
（ｉｉ）工程（ａ）〜（ｃ）の一つ以上のラウンドの間またはその後に、前記足場が、ＳＤＲ配列との組み合わせにより受け入れ可能な足場を作製するために、および／もしくは特定のｐＨおよび温度で触媒活性を増大させるために、および／もしくはグリコシル化パターンを変化させるために、および／もしくは酵素阻害剤に対する感受性を減少させるために、および／もしくは酵素安定性を変化させるために、一つ以上の位置で変異される、
請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
（Ｉ）少なくとも以下の工程：
（ａ）第一のタンパク質足場フラグメントを提供する工程、
（ｂ）前記タンパク質足場フラグメントを、第一のＳＤＲと、ペプチド結合を介して結合する工程、および必要に応じて、
（ｃ）前記工程（ｂ）の生成物を、さらなるＳＤＲペプチドまたはさらなる融合タンパク質足場フラグメントと、ペプチド結合を介して結合する工程、および必要に応じて、
（ｄ）十分に特異的な酵素を生成するために必要なサイクル、工程（ｃ）を繰り返す工程、
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）において生成された集団から、一つ以上の標的基質に対する所望の特異性を有する一つ以上の酵素を選択する工程、を包含するか、または
（ｉｉ）少なくとも以下の工程：
（ａ）１つ以上の標的基質における１つ以上の化学反応を触媒し得るタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）１つ以上の完全または部分的ランダム合成オリゴヌクレオチド配列を、タンパク質足場をコードするポリヌクレオチドと組み合わせる工程であって、該完全または部分的ランダム合成オリゴヌクレオチド配列が、コードされる人工酵素が１つ以上の標的基質と１つ以上の他の基質とを区別し得るような前記ポリヌクレオチド中の部位に位置している、工程、
（ｃ）工程（ｂ）において生成された集団から、１つ以上の標的基質に対する所望の特異性を有する酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを選択する工程、
を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれかに記載の１つ以上の人工酵素または請求項１０に記載の融合タンパク質を含む組成物であって、
該組成物が、好ましくは、研究用組成物、栄養学組成物、食物添加物組成物、洗浄用組成物、脱感染（ｄｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）組成物、化粧用組成物、もしくはパーソナルケア用組成物であり、および／または
前記組成物が、必要に応じて、許容できる担体および／もしくは助剤を含有する、
組成物。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれかに記載の人工酵素、または請求項１０に記載の融合タンパク質の、研究、栄養学、パーソナルケア、または工業目的のための、使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２００６−５２７５９０（Ｐ２００６−５２７５９０Ａ）
【公表日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６１７０（Ｐ２００６−５１６１７０）
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５１１７２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３５２１
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５００５８７４０３）ディレボ・ビオテク・アーゲー (2)
【氏名又は名称原語表記】ＤＩＲＥＶＯ　ＢｉｏＴｅｃｈ　ＡＧ
【Ｆターム（参考）】