新規遺伝子
本発明は、Ａｏｖｐｓ５遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子の機能を抑制させた糸状菌、および該糸状菌を用いてタンパク加水分解率が顕著に上昇したタンパク加水分解物の作製方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５ポリペプチドと相同性を有する液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドの機能を抑制することにより液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を作製する方法、および該方法により作製される液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌に関する。さらには、該糸状菌を用いた液胞酵素の製造方法、および該酵素を用いたタンパク加水分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
液胞は酵母、植物細胞、糸状菌などに共通して観察される細胞内器官の一つであり、細胞内成分のリサイクル、浸透圧調節、解毒、栄養素の貯蔵などの生理的機能を担っている。酵母の液胞はプロテアーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、グリコシダーゼなど多くの加水分解酵素を含むことが知られている［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，２６６（１９９０）］。
醤油醸造などにおいては、熟成中に麹菌〔アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）〕が溶菌し、溶出した細胞内タンパク質により窒素可溶化率が上昇し（醤油の科学と技術、１９８８年、ｐ．１２２）、味質の向上に寄与しているが、その分解活性の大部分は液胞酵素に因っていると予想される。このように液胞酵素は産業上有用であり、特にＧＲＡＳグレードである麹菌の液胞酵素は食品製造上、利用価値が高い。しかし、液胞酵素を取得するためには、自己消化または物理的もしくは酵素的に麹菌を破砕、溶菌することが必要であり時間と手間がかかる。そのため効率的な液胞酵素の取得方法が望まれる。
北本はソーティング工学の見地から、液胞酵素を効率的に細胞外に分泌できる可能性に言及している（生物工学会誌、１９９９年、第７７巻、ｐ．１−３３）が、これまで麹菌において液胞酵素を細胞外に分泌した例はない。
液胞酵素を分泌酵素から選別し、液胞まで輸送する機構についての解析は、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）で研究が進んでいる。サッカロミセス・セレビシエの液胞酵素の選別と輸送には４０以上の遺伝子が関与しており、該遺伝子の破壊、変異によりその機能が欠失、低下した場合、液胞酵素の輸送は正常に行なわれず細胞外にミスソートされる。これらは液胞酵素選別（Ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＶＰＳ）遺伝子として知られている［Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，１（１９９５）］。サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子は、ソーティング・ネキシンＩと相同性を有するポリペプチドをコードする液胞酵素選別遺伝子であり、ＶＰＳ５遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエは、液胞酵素の細胞外へのミスソートが見られた［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１０，１０６３（１９９７）］。
糸状菌にも形態的に酵母の液胞と類似の細胞内器官が存在しており、酵母の液胞と同様、様々な加水分解酵素を有していると考えられる。また糸状菌においても酵母と類似の機構で液胞酵素が分泌酵素から選別され、液胞まで輸送されていると予想される。
糸状菌の液胞の機能解明を目的として、樽谷らは、サッカロミセス・セレビシエにおいて、トランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関与する、液胞酵素選別遺伝子ＶＰＳ１の相同遺伝子ｖｐｓＡをアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離し、該遺伝子破壊株を作製し、液胞の形態形成に関与していることを示した［Ｇｅｎｅ，２６８，２３（２００１）］。また、同じくトランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関わる液胞酵素選別に関わることが知られている、ＶＰＳ４５の相同遺伝子ｖｐｓＢをアスペルギルス・ニドランスから単離した（日本農芸化学会誌，第７３巻，臨時増刊号，１９９９年度日本農芸化学会大会講演要旨集，１９９９年，ｐ．２１２）。
松田らは、トランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関与するスモールＧＴＰａｓｅ、ＶＰＳ２１の相同遺伝子ｖｐｓＣをアスペルギルス・ニドランスから単離した（例えば、日本農芸化学会誌，第７３巻，臨時増刊号，１９９９年度日本農芸化学会大会講演要旨集，１９９９年，ｐ２１３）。
正路らはアスペルギルス・オリゼからサッカロミセス・セレビシエＶＡＭ３相同遺伝子を単離・同定し、該遺伝子がサッカロミセス・セレビシエのｖａｍ３遺伝子破壊株およびｐｅｐ１２／ｖｐｓ６遺伝子破壊株の表現型を相補したことを示した（第２回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集，２００２年，ｐ．２４）。
また、大根田はアスペルギルス・ニドランスから単離・同定されたカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子ｃｐｙＡに蛍光タンパク質を結合させた融合タンパク質を、アスペルギルス・オリゼの細胞内で発現させ、該遺伝子産物がアスペルギルス・オリゼの液胞に局在することを示し［Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７，２９（２００２）］、さらに培地中の蛍光強度が上がる変異株を単離しその表現型を解析した（日本生物工学会大会要旨集，２００１年，ｐ．２３１）。しかしこの原因遺伝子の同定には至っていない（第２回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集，２００２年，ｐ．４９）。
【発明の開示】
アスペルギルス・オリゼの、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子、および該遺伝子を利用し、効率的に糸状菌の液胞酵素を培地中に生産する方法が求められている。
本発明は、以下の（１）〜（３４）を提供する。
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（５）配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡ。
（６）配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
（８）（７）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（９）（８）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から、該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
（１０）配列番号２または３の塩基配列の連続する２０塩基以上の配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いて、（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１１）配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡを用いて、（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１２）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることを特徴とする、液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製方法。
（１３）糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子破壊することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１４）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを転写させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１５）糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１６）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１７）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドが（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドである、（１２）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に培養し、培地に赤褐色の色素を分泌する菌株を選択することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
（１９）糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に重金属を含む培地に培養し、重金属に対する耐性を有する菌株を選択することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
（２０）糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である（１２）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである（２０）に記載の方法。
（２２）（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡのコード領域内に１つ以上のＤＮＡを挿入または欠失することにより、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ。
（２３）（２２）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（２４）（１７）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌。
（２５）糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である（２４）に記載の糸状菌。
（２６）アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである（２５）に記載の糸状菌。
（２７）（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培地に培養し、培地中に液胞酵素を生成蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することを特徴とする液胞酵素の製造方法。
（２８）培地が固体培地である（２７）に記載の製造方法。
（２９）培地が液体培地である請求項（２７）に記載の製造方法。
（３０）液胞酵素がトリペプチジルペプチダーゼである（２７）〜（２９）のいずれか１項に記載の製造方法。
（３１）（２７）〜（３０）のいずれか１項に記載の方法により製造された液胞酵素、または（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培養して得られる液胞酵素を含む培養物または培養処理物を、基質となるタンパク質に作用させることを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
（３２）（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を、基質となるタンパク質を含む培地に培養することを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
（３３）（３１）または（３２）に記載の方法で製造されたタンパク加水分解物。
（３４）（３３）に記載のタンパク加水分解物を含有することを特徴とする調味料。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをあげることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子に対するアスペルギルス・オリゼの相同遺伝子（以下、Ａｏｖｐｓ５遺伝子ともいう）がコードするポリペプチドである。
１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−２００１）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入し、２．に後述する方法で変異を導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させることにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。また、アミノ酸の欠失、置換または付加は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１ヶ所に限らず、２ヶ所以上の位置で同時に生じてもよい。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端をあげることができる。
上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加があることを意味し、欠失、置換もしくは付加が同時に生じてもよく、置換もしくは付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、液胞酵素を細胞内に局在化させるためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
上記のポリペプチドが、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有することは、糸状菌において、３．に後述する方法で該ポリペプチドの機能を抑制したときに、糸状菌の液胞酵素が細胞外に分泌されることにより、確認することができる。
細胞外に液胞酵素が分泌されることは、糸状菌を培地で培養し、培養後の培地中の液胞酵素を検出することにより確認できる。液胞酵素としては、例えばトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＹがあげられる。液胞酵素を検出する方法としては、（ａ）液胞酵素の酵素活性を測定する方法、（ｂ）液胞酵素を認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング等により免疫学的に検出する方法、（ｃ）グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のマーカータンパク質またはＦＬＡＧタグ等のエピトープペプチドと液胞酵素の融合タンパク質を糸状菌で発現させ、マーカータンパク質やエピトープペプチドを特異的に認識する抗体を利用して融合タンパク質を検出する方法〔Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，３７，２９（２００２）〕等があげられる。例えば、トリペプチジルペプチダーゼは、文献〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４７，１０７９（１９９９）〕に記載されたトリペプチジルペプチダーゼＩの活性測定方法に準じて、基質となるアラニン−アラニン−フェニルアラニン−パラニトロアニリドを含む基質溶液に、糸状菌の培養液等の試料溶液を加えて、３０℃で１０分間反応させた後、分光光度計により３８４ｎｍの吸光度を測定することにより、活性を測定できる。
あるいは、３．および実施例３に後述するアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を宿主として、２．に記載の方法あるいは３．に記載の相同組換え法で該ポリペプチドを発現させたときに、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が有する、（１）液胞酵素の細胞外への分泌、（２）赤褐色の色素の分泌、（３）重金属に対する耐性、（４）分生子の形成の阻害、等の表現型がもとの表現型に回復することによっても、該ポリペプチドが液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有することを確認することができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡがあげられる。配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡがあげられる。配列番号２の塩基配列は、アスペルギルス・オリゼのゲノム上のＡｏｖｐｓ５遺伝子の配列であり、配列番号３の塩基配列は、該遺伝子のｃＤＮＡのコード領域の配列である。
また、本発明のＤＮＡとしては、配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラークのＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でプローブとハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
１．本発明のＤＮＡの調製
（１）プローブの調製
以下のようにして得られるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片をプローブとして用いることができる。
まず、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ７３５１２）のコード領域の配列（配列番号４）を問い合わせ配列として、アスペルギルス・ニドランス、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等の各種糸状菌のゲノム配列データベースを相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕を用いて検索することにより、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子と高い相同性を有するノイロスポラ・クラッサ等のＶＰＳ５相同遺伝子のゲノム配列を見出すことができる。例えば、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子の塩基配列としては配列番号５をあげることができる。
このノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列から、縮重プライマーを設計する。プライマーを設計するアミノ酸配列は、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列から任意の２カ所の配列を選ぶことができるが、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子とサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子がそれぞれコードするアミノ酸配列間で保存性の高い領域を選択することが望ましい。例えばノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の１８１〜１８９番目の配列（Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ）、２６７〜２７４番目の配列（Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ）をあげることができる。縮重プライマーは、選択した２箇所のアミノ酸配列について、よりＮ末側のアミノ酸配列に対応する全てのコドンの塩基配列、よりＣ末のアミノ酸配列に対応する全てのコドンと相補的な塩基配列を、それぞれ含むＤＮＡとして設計する。縮重の数をへらすため、コドンの３番目の塩基としてイノシンを利用したり、アスペルギルス・ニドランスのコドン使用頻度〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０，２８８（１９９１）〕を利用したりすることもできる。プライマーの長さは、１４〜３０塩基が好ましい。縮重プライマーの例としては、配列番号６および７の塩基配列をそれぞれ有するＤＮＡをあげることができる。設計した縮重プライマーは、例えば、アプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成装置等を使用して調製することができる。
上記の縮重プライマーとアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲを行うことにより、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片を増幅し単離することができる。アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡは、（２）に後述する方法で調製できる。ＰＣＲは当業者に周知の条件及び手段を用いて、行うことができる。例えば、ＰＣＲの反応条件としては、９４℃で５分間の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる反応サイクルを３０サイクル行う条件があげられる。ただし、反応サイクル中のアニーリングの温度は、プライマーの長さ、塩基組成により推定されるＴｍに基づいて、適当なものにする。なお、サーマルサイクラーとしては、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製９６００、アステック社製プログラム・テンプ・コントロール・システムＰＣ−７００など市販のサーマルサイクラーを用いることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）などの市販品を用いることができる。反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従う。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を単離し、ジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）、放射性同位元素等で標識したものをプローブとする。また、上記のＰＣＲの反応液中にＤＩＧ、放射性同位元素等で標識したヌクレオチドを添加してＰＣＲを行うことにより、プローブの標識を増幅と同時に行うこともできる。以上のようにして得られる、プローブとして用いることのできるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片としては、配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
増幅されたＤＮＡ断片は、適当なプラスミドベクターにクローニングし、ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）、ＡＢＩ ３１０ジェネエティック・アナライザー（パーキンエルマー社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定し、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子と相同性を有しているか確認することが好ましい。
（２）染色体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの調製
アスペルギルス・オリゼから抽出したゲノムＤＮＡを、適当な制限酵素を用いて切断し、同じ切断末端をもつ制限酵素で切断したベクターに挿入する。ベクターとして例えばλＤＡＳＨＩＩ（ストラタジーン社製）、λＦＩＸＩＩ（ストラタジーン社製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）等のプラスミドベクターがあげられる。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡは、五味らの方法〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５，（１９８９）〕に従って抽出できる。
例えば、ファージベクターλＤＡＳＨＩＩへの挿入は、ＢａｍＨＩで開裂したベクターとＢａｍＨＩで分解した染色体ＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。このようにして得られたゲノムＤＮＡ断片を挿入したベクターを適切なエシェリヒア・コリ宿主に導入することにより染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
ｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調製できる。まず、液体窒素で凍結したアスペルギルス・オリゼの菌体を細かく粉砕した後、グアニジンイソチオシアネートを含んだフェノール又はフェノール−クロロホルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水層と有機層に分離する。その後、水層とイソプロパノールを混合し、水層に含まれる全ＲＮＡを沈殿させて回収するか、あるいはショ糖もしくはセシウムクロライド密度勾配遠心法により回収する。もしくは市販の全ＲＮＡ抽出キット（例えばＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いることもできる。この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーにかけてｍＲＮＡ（即ち、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）を精製する。
次に、ｍＲＮＡから逆転写酵素の存在下にｃＤＮＡを合成し、ファージもしくはプラスミドベクターに連結可能なように適当な制限酵素部位を作り、これを同様の制限酵素部位をもつファージもしくはプラスミドベクターに連結し、このようにして得られたベクターで大腸菌を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを調製する。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法として、ゲートウェイ技術を用いたｃＤＮＡ合成およびクローニング用スーパースクリプト・プラスミド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ、インビトロジェン社製）などの市販キットを用いることもできる。
（３）Ａｏｖｐｓ５遺伝子クローンの選別
Ａｏｖｐｓ５遺伝子を含むクローンの選別は、具体的には、プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーション〔モレキュラー・クローニング第３版、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，８７９（１９８１）〕により行うことができる。例えば、プラークをニトロセルロースあるいはナイロンメンブレン上に転写し、真空中で８０℃、２時間あるいは紫外線照射によって、ＤＮＡをメンブレン上に固定化する。この時、必要に応じて０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含むアルカリ性溶液を用いた変性および０．５ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、３ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムの溶液を用いた中和を行う。このメンブレンを、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２％ＳＤＳ、１％ブロッキング・リージェント（ロシュ社製）からなる溶液中でプローブとメンブレンを４２℃、６時間インキュベートした後、４２℃で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで１５分間、順次洗浄する条件、あるいは４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２％フィコール４００、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなる溶液中でプローブとメンブレンを、４２℃、一昼夜インキュベートした後、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液で室温、２分間で３回洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液中で５０℃、２時間で３回洗浄する条件でプローブとハイブリダイゼーションさせる。洗浄後のメンブレンは放射性同位体で標識したプローブの場合は、風乾した後、−７０℃で２時間から一昼夜Ｘ線フィルムに露光させ、現像して、ポジティブクローンを可視化する。ジゴキシゲニンで標識したプローブの場合は、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩ（ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ＆Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ ＫｉｔＩ、ロシュ社製）を用いて発色反応を行い、ポジティブクローンを検出する。
（４）本発明のＤＮＡの単離
上記のようにして選別されたポジティブクローンのプラークまたはコロニーからファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを抽出・単離し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができる。取得したＤＮＡは、適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）、ＡＢＩ ３１０ジェネエティック・アナライザー（パーキンエルマー社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。Ａｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡの配列とｃＤＮＡの配列を決定し、両者の塩基配列を比較することにより、ゲノムＤＮＡのイントロンの領域を決定することができる。
Ａｏｖｐｓ５遺伝子の塩基配列が決定された後は、ポリペプチドのコード領域を含む領域を適当に選択し、選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより本発明のＤＮＡを増幅し単離することができる。ＰＣＲは（１）に記載した条件と同様にして行うことができる。
以上のようにして得られる本発明のＤＮＡとして、配列番号２の塩基配列からなるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡ、配列番号３の塩基配列からなるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡをあげることができる。
また、このようにして得られた本発明のＤＮＡをプローブとして、（２）および（３）に記載した方法に準じて、他の糸状菌のゲノムＤＮＡライブライリーまたはｃＤＮＡライブラリーを、上記（３）の条件下でのハイブリダイゼーションでスクリーニングすることにより、他の糸状菌のＡｏｖｐｓ５相同遺伝子のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを取得することができる。これらのＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
（５）本発明のＤＮＡの検出
本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むＤＮＡ断片またはオリゴＤＮＡを放射性同位体、ジゴキシゲニン、ビオチン等で標識したものをプローブとし、ハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な連続する２０塩基以上の配列を含むＤＮＡ断片は、上記（４）に記載した方法に準じて、本発明のＤＮＡの任意の領域を含む領域を適当に選択し、選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれプライマーとしたＰＣＲにより調製することができる。オリゴＤＮＡはＤＮＡ合成装置により調製できる。プローブの長さは、検出対象などに応じて当業者が適宜選択することができるが、通常、１５〜３０００塩基、好ましくは２０〜１０００塩基の長さである。
ハイブリダイゼーションは、電気泳動ゲルあるいはコロニーなどからゲノムＤＮＡあるいはｍＲＮＡを転写したニトロセルロースメンブレンあるいはナイロンメンブレンに対して、（３）に記載したハイブリダイゼーションの方法に準じて行うことができる。また、基板上にオリゴＤＮＡまたはＤＮＡ断片を固定化し、標識したｍＲＮＡあるいはＤＮＡとハイブリダイズさせた後、ドットとして検出するＤＮＡチップ〔Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）〕によっても本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。
また、本発明のＤＮＡの塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび本発明のＤＮＡの塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡをプライマーとして、コロニー等から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにより、本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。ＰＣＲは（１）に記載した条件と同様にして行うことができる。
２．本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、例えば以下の方法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより、調製することができる。具体的な遺伝子操作的手法は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用いることができる。
（１）で得られた本発明のＤＮＡから、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡを調製する。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。
該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中で機能するプロモーターを含有しているものが用いられる。また、形質転換体を選択するための形質転換マーカーとなる遺伝子を含むことが好ましい。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび転写終結配列が連結された構造を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
原核生物用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＴｒＳ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ（クロンテック社製）、ｐＲＳＥＴ Ｃ（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５６（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
糸状菌を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えばｐＰＴＲＩ（白鶴酒造社製）、ｐＰＴＲＩＩ（白鶴酒造社製）、ｐＡＵＲ３１６（宝酒造社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、糸状菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えばａｍｙＢプロモーター、ｅｎｏＡプロモーター、ｇｐｄプロモーター、ｍｅｌＯプロモーター、ａｌｃＡプロモーター、ｐｒＡプロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属等に属する糸状菌、例えばアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｃｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｂｅｕｓ）をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては糸状菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、プロトプラスト法〔ＧＥＮＥＴＩＣＳ ｏｆ ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＤＵＬＡＮＳ：ＥＭＢＯ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，８（１９８８）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クロンテック社製）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３ １９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１（ストラタジーン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＭＳＧ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（ともにインビトロジェン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許公報２６０６８５６号、特許公報２５１７８１３号）等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母、糸状菌等の真核微生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、小麦タンパク質および小麦タンパク加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
糸状菌の培養においては、小麦ふすま、米糠、大豆ふすま、脱脂大豆タンパク質、蒸米等を、炭素源、窒素源および無機物源とし、適当な塩類を補強したものを培地として用いることもできる。
培養は、振とう培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
糸状菌を培養する場合、通常の液体培地だけではなく固体培地を使用して培養することもできる。糸状菌の培養に用いられる固体培地としては、通常の寒天培地より水分活性が低い培地を用いることができる。該固体培地としては、小麦ふすまに水性媒体を浸潤させた小麦ふすま培地、蒸米等があげられる。
糸状菌を、固体培地で培養する場合は、糸状菌を植菌後、固体培地と糸状菌を充分に混合し、アルミまたはステンレス製のトレーに薄く広げて培養室内に静置する。その後、温度を通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、湿度を通常８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％に制御して、３〜１０日間静置培養する。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｍｉｍｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、Ｄａｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨバイオサイエンス社製）、Ｇｒａｃｅの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて本発明のポリペプチドを生産することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量の本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、本発明のポリペプチドを生産することができる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。ｐＲＳＥＴ系ベクター（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（アマシャム・バイオサイエンス社製）等、該ポリペプチドにタグをつけて発現させた場合、ニッケルレジン、グルタチオンセファロースなどの適当な担体を用いてアフィニティ精製することもできる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中のポリペプチド変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される本発明のポリペプチドとして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをあげることができる。
３．液胞酵素の培地中への生産
（１）液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製
糸状菌において、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることにより、液胞酵素、例えばトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼが、好ましくはトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼが効率的に細胞外に分泌されるため、液胞酵素を培地中に生産させることができる。
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドとは、該ポリペプチドの機能を抑制させたときに、液胞酵素のすべてまたはその一部が液胞内に正常に局在せず、細胞外に分泌されるようになるポリペプチドを意味する。細胞外に分泌される液胞酵素は前駆体または成熟体のどちらであってもよい。、このようなポリペプチドとしては、液胞酵素の選別や輸送、液胞の酸性化や形態形成・維持に関わる遺伝子がコードするポリペプチドがあげられ、例えばサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ遺伝子群、ＰＥＰ遺伝子群、ＶＡＣ遺伝子群、ＴＬＧ遺伝子群、ＶＡＭ遺伝子群、ＡＰＧ遺伝子群、ＣＶＴ遺伝子群およびＧＲＤ遺伝子群または動植物細胞におけるシンタキシンファミリーおよびソーティング・ネキシンファミリーなどの遺伝子群のいずれかと相同性を有する、糸状菌の遺伝子がコードするポリペプチドがあげられる。該ポリペプチドとしては、アスペルギルス・ニドランスのｖｐｓＡ遺伝子、ｖｐｓＢ遺伝子およびｖｐｓＣ遺伝子、アスペルギルス・オリゼのＶＡＭ３相同遺伝子、Ａｏｖｐｓ５遺伝子等がそれぞれコードするポリペプチド（Ａｏｖｐｓ５遺伝子がコードするポリペプチドを以下、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドともいう）があげられ、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドが好ましく用いられる。このようなポリペプチドをコードする糸状菌の遺伝子は、１．に記載した本発明のＤＮＡを取得する方法と同様にして、取得することができる。
糸状菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコラ属、ムコール属、モナスカス属等に属する糸状菌をあげることができるが、アスペルギルス属に属する糸状菌が好ましく、特に、醸造工業で用いられるアスペルギルス属に属する糸状菌が好ましい。醸造工業で用いられるアスペルギルス属に属する糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）等をあげることができる。
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させる方法として、（ａ）遺伝子破壊をする方法、（ｂ）アンチセンスｍＲＮＡを転写させる方法、（ｃ）プロモーター領域に変異を導入する方法、（ｄ）優性不活性（ドミナントネガティブ）変異体を発現させる方法等があげられる。
（ａ）遺伝子破壊をする方法では、まず、機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡのポリペプチドＡをコードする領域中の制限酵素サイトを利用して１つ以上、通常は数１００ｂｐ〜数ｋｂのＤＮＡの挿入あるいは欠失を行うことにより構造を破壊し、ポリペプチドＡの機能（本発明の場合は、液胞酵素を細胞内に局在させる活性）を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ（以下、遺伝子破壊用ＤＮＡとよぶ）を作製する。次いで、遺伝子破壊用ＤＮＡを含む組換えベクターで糸状菌を形質転換した後、ゲノム中のポリペプチドＡをコードする遺伝子が、遺伝子破壊用ＤＮＡにより相同組換えをおこした形質転換体を、ＰＣＲやサザンブロッティングにより選択する。
ポリペプチドＡをコードする領域に挿入するＤＮＡとして、形質転換マーカーとなる遺伝子を用いれば、選択培地を用いて形質転換体を容易に選択することができる。形質転換マーカーとなる遺伝子は、宿主とする糸状菌の栄養要求性や薬剤耐性と関係する遺伝子で、例えば、ｓＣ遺伝子、ａｒｇＢ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子、ｐｔｒＡ遺伝子、ｐａｂａＡ遺伝子、ｎｉｉＡ遺伝子、ＢｅｎＡＲ遺伝子などがあげられる。
組換えベクターの作製に用いるベクターは、大腸菌で自律複製でき、適当なクローニング用制限酵素サイトを持つ通常のプラスミドベクターであればよく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）（ストラタジーン社製）等があげられる。遺伝子破壊用ＤＮＡの作製に形質転換マーカー遺伝子を用いない場合は、上記のベクターに形質転換マーカー遺伝子を挿入したベクターを組換えベクターの作製に用いることにより、形質転換体を選択することができる。宿主とする糸状菌は形質転換マーカー遺伝子が欠損している株を用いる。
（ｂ）アンチセンスｍＲＮＡを転写させる方法では、まず機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするＤＮＡを単離する。次いで、該ＤＮＡを２．に記載の方法に準じて糸状菌用発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に連結し、通常の遺伝子ＡのｍＲＮＡとは相補的な配列を有するアンチセンスｍＲＮＡを転写する組換えベクターを作製する。該組換えベクターで糸状菌を形質転換することにより、形質転換体において、遺伝子ＡのｍＲＮＡとアンチセンスｍＲＮＡのハイブリッドを形成させて遺伝子ＡのｍＲＮＡからの翻訳を阻害させる。
（ｃ）プロモーター領域に変異を導入する方法では、まず機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするゲノム遺伝子のコード領域の上流にあるプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡのプロモーター領域中の制限酵素サイトを利用して数１００ｂｐ〜数ｋｂのＤＮＡの挿入あるいは欠失を行うことにより、プロモーター機能を破壊したＤＮＡを作製する。次いで該ＤＮＡを含む組換えベクターで糸状菌を形質転換した後、ゲノム中のポリペプチドＡをコードする遺伝子のプロモーター領域が、プロモーター機能を破壊したＤＮＡにより相同組換えをおこした形質転換体を、ＰＣＲやサザンブロッティングにより選択する。組換えベクターの作製に用いるベクターは、（ａ）の遺伝子破壊に用いるベクターと同様のベクターを用いる。
（ｄ）ドミナントネガティブ変異体は、あるポリペプチドの機能ドメインに欠失、置換、付加等の改変を加えることにより作製した、もとの該ポリペプチドが有する機能を失い、しかも細胞内の正常な該ポリペプチドの機能を阻害するような性質の変異体である。ドミナントネガティブ変異体を発現させる方法では、まず機能を抑制したいポリペプチドＡのドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡを作製する。該ＤＮＡを用いて、２．に記載の方法にしたがって糸状菌用の発現ベクターを作製する。該発現ベクターで糸状菌を形質転換して得られる該形質転換体において、ドミナントネガティブ変異体を発現させ、細胞内の正常なポリペプチドＡの機能を阻害させる。
ポリペプチドＡの機能ドメインは、例えばタンパク質ファミリーのデータベースＰｆａｍ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，２７６（２００２）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８，４０５−４２０（１９９７）〕の検索を行うことにより推察できる。Ｐｆａｍの検索は、サンガー研究所のＰｆａｍに関するウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）上で行うことができる。
例えば、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に対し、Ｐｆａｍの検索を行うと、４４番目のリジンから１５８番目のグルタミン酸までが、ホスファチジルイノシトール３−リン酸等の脂質と結合する機能を有するＰＸドメイン、および１５９番目のスレオニンからＣ末端のアラニンまでが、ポリペプチド同士の重合体の形成に関与するとされているコイルドコイル領域として予測される。これらのドメインの改変を行うことによりドミナントネガティブ変異体を作製できる。
例えば、サッカロミセス・セレビシエのＶＡＭ７ポリペプチドのＰＸドメインの解析〔Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，６１３（２００１）〕から、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドのＰＸドメイン中で、脂質との結合に関与するアミノ酸として、８７番目のアルギニン、９５番目のリジン、１２８番目のアルギニン、１２９番目のアルギニンがあげられ、特に８７番目から８９番目のアミノ酸配列（Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｙｒ）が重要と考えられるので、これらのアミノ酸のいずれか、もしくはこれらから選ばれる複数のアミノ酸に欠失や置換等の変異を導入することによりドミナントネガティブ変異体を作製できる。
また、コイルドコイル領域以外の部分を欠失させたコイルドコイル領域のみからなる変異体も、正常なポリペプチドの重合体形成を阻害するドミナントネガティブ変異体の例としてあげられる。また、ＰＸドメインのみからなる変異体、コイルドコイル領域の一部または全てを欠失させた変異体であってもよい。
糸状菌において、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能が抑制されると、分生子の形成が阻害される傾向にあるため、上記の、アンチセンスｍＲＮＡの転写やドミナントネガティブ変異体の発現を、薬物の投与等で誘導できる発現ベクターを用いて行えば、増殖および分生子の形成過程では遺伝子の機能を抑制せず、分生子が形成した後に該遺伝子の機能を抑制することで、分生子形成能を損なわず液胞酵素を細胞外に生産できる利点がある。
糸状菌の形質転換は、糸状菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、プロトプラスト法〔ＧＥＮＥＴＩＣＳ ｏｆ ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＤＵＬＡＮＳ：ＥＭＢＯ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，８（１９８８）〕等をあげる事ができる。
また、Ａｏｖｐｓ５糸状菌の分生子への紫外線照射等でゲノムＤＮＡにランダムに突然変異を誘発させた後、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株に特徴的な表現型を利用して、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が欠損した変異株（以下、Ａｏｖｐｓ５機能欠損変異株ともいう）を選択することにより、上記のような遺伝子操作を用いずに、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が抑制された糸状菌を取得することができる。
アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株は、寒天培地上で培養を行うと赤褐色の色素を培地中に分泌する。したがって、本性質を利用することによりＡｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が欠損した変異株のスクリーニングが可能である。
スクリーニングは以下に記載の方法により行う。五味らの方法〔日本醸造協会誌，８４，４６５（１９８９）〕に基づいて、アスペルギルス・オリゼの分生子に紫外線を照射することにより、分生子のゲノム中に変異を誘発する。この分生子を寒天培地（０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）上にまき、シャーレ本体と蓋を、密閉状態にならないようにパラフィルムで巻いて固定し、３０℃で、５日以上、好ましくは７日以上培養する。周辺部の培地が赤褐色になるコロニーをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株の候補株として選択することができる。選択した候補株の２次スクリーニングとして、上記の候補株を培養した培地中のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、親株に比べて活性が上がっているものをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株として選択する。
また、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子破壊株が親株に比べてコバルトやニッケルなどの重金属に対する耐性が向上していることが報告されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，９６６０（２００１）〕。したがってアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株も、重金属に対する耐性を獲得していると予想されるため、重金属に対する耐性を指標にＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株のスクリーニングが可能である。重金属の例として、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、モリブデン、銀、カドミウム、スズ、バリウム、水銀、鉛等があげられる。
これらの重金属を含まないか、通常の培地に含まれる濃度でしか含まない合成培地にこれらの重金属のいずれかを何段階かの適当な濃度で添加した培地に、親株とＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を培養し、親株は生育できないがＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が生育できるような選択培地の重金属の濃度を決定する。紫外線を照射してゲノム中に変異を誘発した分生子を、決定した濃度の重金属を含む選択培地上で培養し、生育してきたコロニーをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株の候補株として選択する。選択した候補株の２次スクリーニングとして、候補株を培養した培地中のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、親株に比べて活性が上がっているものをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株として選択する。
このようにして得られるＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株は遺伝子操作を施していないため、食品、飲料などの製造に好適である。
（２）液胞酵素の製造方法
以下に、（１）に記載した方法で得られる液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を用いた液胞酵素の製造方法について述べる。
該糸状菌を培地に培養し、液胞酵素を培地中に生産・蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することができる。
該糸状菌を培養する方法は、固体培養、液体培養、多孔性膜培養、ゲル包括固定化培養等があげられる。菌体の接種の方法は胞子を接種することもできるが、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では胞子を形成しないため、例えば菌糸を滅菌した生理食塩水などに分散させた後に接種することができる。
液体培地の場合、炭素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、フラクトース、スクロース等、窒素源として、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ポリペプトン、酵母エキス、脱脂大豆タンパク質等、ミネラル成分としてリン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄等を添加することができる。
培養は、振とう培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で、通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃で通常１〜７日間行う。
固体培地の場合、培地原料として水性媒体を湿潤させた小麦ふすま、蒸米、脱脂大豆タンパク質等があげられ、水性媒体として水、無機塩類を含有する水溶液があげられる。培養は温度を通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、湿度は８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％、通常３〜１０日間で行う。
多孔性膜培養またはゲル包括固定化培養の場合は、例えば特開平１１−２２５７４６に記載の方法に従い培養することができる。
液胞酵素を細胞外に分泌する能力を有する糸状菌を液体培地で培養する場合、以下に記載の方法に従い、液胞酵素を単離・精製することができる。
培養終了後、培養液から不溶性固形分を、遠心分離、膜ろ過等の方法により分離除去し、上清を取得する。該上清から、通常の酵素の単離・精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。ｐＲＳＥＴ系ベクター（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（アマシャム・バイオサイエンス社製）等のタグを、液胞酵素につけて発現させた場合、ニッケルレジン、グルタチオンセファロースなどの適当な担体を用いてアフィニティ精製することもできる。
固体培地で培養する場合、例えば糸状菌が増殖した固体培地を水系緩衝液に分散した後、固液分離して酵素抽出液を取得し、液体培養において上清から液胞酵素を単離・精製した方法と同様の方法により、該酵素抽出液から液胞酵素を単離・精製することができる。
多孔性膜培養またはゲル包括固定化培養の場合、菌体が生育する膜または菌体を包埋したゲルと接触させた培地から、液体培地で培養した場合と同様にして、液胞酵素を単離・精製できる。
４．タンパク加水分解物の調製
３．（２）に記載した方法等に従って、液体培地で糸状菌を培養する場合、タンパク質を含む原料を該培養物中に添加することにより、タンパク加水分解物を製造することができる。または、タンパク質を含む原料に、３．（２）に記載した方法で得られる液胞酵素を添加して混合し、通常２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて、２４〜２６４時間、好ましくは４８〜２４０時間反応させることにより、タンパク加水分解物を製造することができる。反応時のｐＨは、本発明の液胞酵素および分泌酵素が作用できるｐＨであればよいが、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ５〜８に調整する。
この製造方法で用いる液胞酵素としては、精製した液胞酵素を用いることもできるし、液胞酵素を精製せずに、上記３．に記載した液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を培地に培養して得られる、液胞酵素を含む培養物または培養処理物を用いることもできる。培養処理物としては、培養物からろ過や遠心分離等により菌体を除去して得られる溶液、該溶液の濃縮物、乾燥物等があげられる。
糸状菌は、醸造工業で用いられるものであれば、いかなるものでもよいが、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリをあげることができる。
タンパク加水分解物の製造方法に用いる原料に含まれるタンパク質は、特に限定されないが、グルタミン酸含量の高いものが好ましい。例えば、小麦グルテン、コーンミールグルテン、脱脂大豆、分離大豆タンパク質等があげられ、小麦グルテン、コーンミールグルテン等が好ましく用いられる。
また、タンパク質を含む原料は特に限定されないが、タンパク質含量が高いものが好ましい。
反応終了後、固液分離により未反応の原料タンパク質、菌体などを除去後、必要に応じて濃縮、乾燥することによりタンパク加水分解物を得ることができる。
得られたタンパク加水分解物はそのままでも調味料として用いることもできるが、アミノ酸、核酸、エキス類、酸味料、甘味料等と混合し、味、風味を調整することにより、うまみが強く風味の良好な調味料をつくることができる。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図 サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子がコードするアミノ酸配列とノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の比較である。上段、下段の配列はそれぞれサッカロミセス・セレビシエ、ノイロスポラ・クラッサのアミノ酸配列を示している。また、両配列で一致するアミノ酸を中段に示す。数字は各ポリペプチドＮ末端からのアミノ酸残基の位置を示す。下線は縮重プライマーに対応するアミノ酸配列を示す。
第２図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子の破壊に用いる形質転換用ＤＮＡの構造を示す。
第３図 ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株のゲノム中の破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子のＰＣＲによる検出を示す。レーン１〜３はそれぞれ、Ａｏｖｐｓ５変異株であるＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株のゲノムＤＮＡを、レーン４はＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊用プラスミドｐＤＶ５１を、レーン５は野生株（ＲＩＢ４０株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときのＰＣＲ産物を示す。
第４図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の窒素可溶化率（ろ液の総窒素÷原料に含まれる総窒素×１００）を示す。左から親株（ＮＳ４株）、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株（それぞれ左からＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株）の各培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の、湿菌体重量（ｇ）あたりの窒素可溶化率（％）を示す。
第５図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の遊離アミノ酸の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を示す。左から親株（ＮＳ４株）、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株（それぞれ左からＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株）の各培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の、湿菌体重量（ｇ）あたりの遊離アミノ酸の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１ アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５のゲノムＤＮＡのクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株（ＡＴＣＣ番号：４２１４４）の菌体から、五味らの方法〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５（１９８９）〕に従い、以下に示すようにゲノムＤＮＡを調製した。
１５０ｍｌのＤＰＹ培地（２％デキストリン、２％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物）にアスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株を植菌し、３０℃で２０時間振とう培養後、ブフナー漏斗で集菌し、液体窒素存在下で乳鉢で粉砕した。これを１０ｍｌのプロテアーゼ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に懸濁し、５０℃で４時間インキュベートした。この溶液を、フェノール処理２回、フェノール／クロロホルム処理２回、クロロホルム処理１回を順次行った。なお、これら有機溶媒による処理は、溶液と有機溶媒を穏やかに混合し、上清を分取することにより行った。次に溶液に１／１０容量の３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２．５倍量の９９．５％エタノールを加え、−２０℃で２０分間静置し、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿は７０％エタノールでリンスした後、５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この溶液に１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを添加し３７℃、３０分間インキュベート後、フェノール／クロロホルム処理を行った。回収した上清に１／１０容量の３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２．５倍量の９９．５％エタノールを加え、−２０℃で２０分間静置し、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿は７０％エタノールでリンスした後、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡ溶液とした。
（２）糸状菌のＶＰＳ５相同遺伝子の検索
まず、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子の塩基配列を公共データベースＧｅｎＢａｎｋから取得した（登録番号：Ｕ７３５１２）。取得したサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子のコード領域の配列（配列番号４）を問い合わせ配列（クエリー）として各種糸状菌データベースを検索した。その結果、ホワイトヘッド生物医学研究所ゲノム研究センターのウェブサイト内のノイロスポラ・クラッサのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｆｕｎｇｉ／ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ／）から、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子と高い相同性（Ｅ−ｖａｌｕｅ＝３Ｅ−５４）を有する遺伝子配列（配列番号：ＮＣＵ０４１３７．１）を見出した。該塩基配列を配列番号５に記載した。サッカロミセス・セレビシエＶＰＳ５遺伝子と該遺伝子と相同性の高いノイロスポラ・クラッサの遺伝子がコードするアミノ酸配列との比較を第１図に示した。
（３）プローブの作製
第１図から比較的保存性が高く、機能的に保存されている可能性が高いと予想される領域から、縮重プライマーＶ５Ｐ−ＦおよびＶ５Ｐ−Ｒを設計した。該プライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号６および配列番号７に示す。
配列番号６および７の塩基配列は、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の１８１〜１８９番目の配列（Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ）、２６７〜２７４番目の配列（Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ）にそれぞれ対応する。
ＰＣＲは上記オリゴヌクレオチドをプライマー、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキン・エルマー社製）により以下の条件で行った。まず９４℃で５分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、１サイクル９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を３０サイクル行った。反応液を２％アガロースゲルで電気泳動した結果、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を検出した。
（４）プローブの塩基配列決定
ジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）−ｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）存在下でＰＣＲを行う以外は、（３）に記載の条件で取得したＰＣＲ産物を切り出し、ジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ、Ｑバイオジーン社製）により精製した。精製したＰＣＲ産物はＴＡクローニングにより、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（ノバジェン社製）のＴクローニング部位に導入し、プラスミドｐＶ５ＰＲを取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により、得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を決定した。その結果を配列番号８に示す。
（５）アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）で取得したアスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ラムダファージベクターλＤＡＳＨ ＩＩ（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。これをインビトロパッケージングし、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡライブラリーとした。このライブラリーを用い、大腸菌Ｐ２３９２を宿主とし常法に従いプラークを形成させた。プラークはＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）にブロッティングし、変性溶液（１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム）上で５分間静置後、中和液（１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．５ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．０））上で静置し、２×ＳＳＣ（０．３ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、７０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム）に５分間浸し、風乾した。次にメンブレンを、緩衝液（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２％ＳＤＳ，１％ブロッキング・リージェント（ロシュ社製））中で４２℃、１時間インキュベートした後、（４）で作製したＤＩＧ標識プローブを０．１％（ｖ／ｖ）添加した上記緩衝液中で、メンブレンを４２℃、６時間インキュベートした。上記メンブレンを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間、順次洗浄した後、マレイン酸バッファー（０．１ｍｏｌ／ｌマレイン酸、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム）でリンスした。発色は、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩ（ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ＆Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ ＫｉｔＩ、ロシュ社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。その結果、約５０００個のプラークからポジティブクローンを１個取得した。
（６）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列決定
上記（５）で得られたポジティブクローンからλファージＤＮＡを常法に従い精製し、ＳａｌＩで切断後、約３．２ｋｂｐのＳａｌＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）（ストラタジーン社製）のＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＶＰＳ５Ｓを取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の塩基配列を決定した。結果を配列番号２に示す。
実施例２ アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株のｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株をＤＰＹ培地６０ｍｌに接種し３００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコで、３０℃、２日間、１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養物をろ過し得られた湿菌体１ｇを、液体窒素存在下で、乳鉢で微細な粉末とした。
該菌体破砕物から、アールエヌイージー・ミディ・キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを取得した。
取得した全ＲＮＡからオリゴテックス・ｄＴ３０スーパー・ｍＲＮＡ精製キット（ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付の説明書に従い、０．６μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ溶液を１００μｌ取得した。この溶液に１０μｌの３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）と２５０μｌの９９．５％エタノールを添加し、激しく攪拌後、−２０℃で２時間静置した。１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、沈殿を２００μｌの７０％エタノールで洗った後、６μｌのジエチルピロカーボネート処理水に溶解した。
回収したｍＲＮＡは、ゲートウェイ技術を用いたｃＤＮＡ合成およびクローニング用スーパースクリプト・プラスミド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ、インビトロジェン社製）を用いて第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡの合成を行ないＰＣＲのテンプレートに供した。
（２）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲによる取得
テンプレート配列番号２に示す塩基配列から設計したそれぞれ配列番号９および配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーＶＰＳ５ＦおよびＶＰＳ５Ｒ）を合成した。ＰＣＲは、上記のテンプレートｃＤＮＡ、プライマーを用いて、Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー社製）により行った。反応は、９４℃で５分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分の反応を３０サイクルの条件下で行った。
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分離した結果、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。これを切り出し、ジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ、Ｑバイオジーン社製）により精製した。
（３）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列決定
精製したＤＮＡ断片はＴＡクローニングにより、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（ノバジェン社製）のＴクローニング部位に導入し、プラスミドｐＶＰＳ５を取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（島津製作所社製）により、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。結果を配列番号３に示す。
実施例３ Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の作製
本発明のポリペプチドのコード領域中にマーカー遺伝子を挿入してＡｏｖｐｓ５遺伝子本来の機能を破壊したＡｏｖｐｓ５遺伝子（以下、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子ともいう）を用い、相同組換えにより、アスペルギルス・オリゼのゲノム上のＡｏｖｐｓ５遺伝子が破壊された、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を作製した。以下に方法を記す。
プラスミドｐＵＮＡ〔Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６１，１３６７（１９９７）〕のアスペルギルス・ニドランスのｓＣ遺伝子を含むＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＫｐｎＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、プラスミドｐＩＡＤを取得した。ｓＣ遺伝子を含む、ｐＩＡＤのＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＶＰＳ５ＳのＡｏｖｐｓ５ゲノム遺伝子のコード領域内に存在するＢｇｌＩＩサイトに挿入し、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子を有するプラスミドｐＤＶ５１を作製した。
形質転換用ＤＮＡは、ｐＤＶ５１をＳａｌＩで切断後、０．８％アガロースゲルで分離し、３．５ｋｂｐの断片をジーンクリーン・キットにより精製した。形質転換用ＤＮＡの構造を第２図に示す。
ｓＣ遺伝子欠損株であるアスペルギルス・オリゼＮＳ４株（独立行政法人酒類総合研究所 ＲＩＢ Ｎｏ．ＮＳ４）を１５０ｍｌのＤＰＹ培地に植菌し、３０℃で２０時間振とう培養した後、ろ過により菌体を回収し滅菌水で洗浄した。回収した菌体を１０ｍｌの酵素反応液〔０．６ｍｏｌ／ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／ｌマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１％ヤタラーゼ（宝酒造社製）〕に懸濁し３０℃で３時間ゆるやかに振とうした。反応液はミラクロス〔カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を用いてろ過し、プロトプラストを回収した。プロトプラスト溶液に等量の緩衝液Ａ〔１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、３５ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）〕を加え、沈殿を緩やかに分散した後、２０００ｒｐｍ、８分間遠心分離し沈殿を回収した。上記洗浄工程を２回行なった後、１×１０７〜１×１０８個／ｍｌになるように上記緩衝液を加え懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。
２００μｌのプロトプラスト懸濁液と５μｇの形質転換用ＤＮＡを混合し、氷上で３０分間静置した。次に、緩衝液Ｂ〔６０％ポリエチレングリコール４０００、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）〕を２５０μｌ加え穏やかに混合した後、緩衝液Ｂを２５０μｌ加え穏かに混合し、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加え穏やかに混合した。これを２０分間、室温で静置してＤＮＡを菌体内に導入した。
次に１０ｍｌの緩衝液Ａを加え穏やかに混合後、２０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、プロトプラスト懸濁液を回収した。プロトプラストに５００μｌの緩衝液Ｂを加え穏やかに混合後、あらかじめ４５℃に保温しておいた５ｍｌのトップアガー（１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、０．８％アガロース、０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、ｐＨ５．５）をプロトプラスト懸濁液に加えて、選択培地（１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）に重層した。
ｓＣ遺伝子が欠損した株は、硫酸化合物を唯一の硫黄源とする培地上では生育できないので、該選択培地を用いて、ｓＣ遺伝子が挿入された破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子を含むＤＮＡが導入された形質転換体を選択することができる。３０℃で７日間培養し、約１００株の形質転換体を取得した。取得された形質転換体は上記選択培地上で３回継代培養を行った。
得られた形質転換体から、Ａｏｖｐｓ５遺伝子の遺伝子座で破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子の相同組換えが生じた株は、実施例１の（１）記載の方法によりそれぞれの形質転換体から取得されたゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ｃＤＮＡのクローニングに使用した配列番号９および配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより検出することができる。ＰＣＲは、プログラム・テンプ・コントロール・システム（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣ−７００（アステック社製）により行った。反応は９４℃で３分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分３０秒、５６℃で１分１５秒、７２℃で４分の反応を３０サイクルの条件下で行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、野生型のＡｏｖｐｓ５遺伝子（約１．６ｋｂｐ）は、検出されず、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子（約５ｋｂｐ）が検出された形質転換体を、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株として選択した。図３に、このようにして選択された形質転換体ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして上記の条件下でＰＣＲを行ったときの、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。
なお、これらのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では、分生子の形成がみられなかった。また、寒天培地（０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）にこれらのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の菌糸を植え、シャーレ本体と蓋を、密閉状態にならないようにパラフィルムで巻いて固定し、３０℃で５日以上培養した結果、コロニー周辺の寒天培地が乳白色から赤褐色に変化した。したがって、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株は、上記培養条件下で赤褐色の色素を分泌すると予想される。
実施例４ 培地中に分泌された液胞酵素の活性測定
アスペルギルス・オリゼの親株（ＮＳ４株）、およびＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株３株（ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株）をそれぞれＤＰＹ培地６０ｍｌに接種し３００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコで、３０℃、２日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。
培養液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し菌体を除去した後、該ろ液の４３５μｌに２４１５μｌの５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸バッファーを加え、２．８５ｍｌの酵素溶液とした。これを３０℃で５分間インキュベートした後、基質溶液〔８ｍｍｏｌ／ｌアラニン−アラニン−フェニルアラニン−パラニトロアニリドを含む５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）〕を１５０μｌ混合し基質の分解を開始した。３０℃で１０分間反応させ、経時的にサンプリングを行い、分光光度計により３８４ｎｍの吸光度を測定した。パラニトロアニリンのモル吸光係数（１０３００）より、反応時間１分あたりのパラニトロアニリンの遊離量を計算し、３０℃で１分間に１μモルのパラニトロアニリンを遊離する活性を１単位とした。該培養液のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、活性値を算出した結果を第１表に示す。
この結果から示されるとおり、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では培地中に液胞酵素であるトリペプチジルペプチダーゼが効率よく分泌される。
実施例５ Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が生産する酵素によるタンパク加水分解物の調製
親株（ＮＳ４株）及びＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株３株（ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株）を、それぞれＤＰＹ培地６０ｍに植菌し３００ｍｌのバッフル付き三角フラスコで、３０℃、、２日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、吸引ろ過により菌体と上清に分離した。菌体は湿菌体の状態でその重量を測定した。
１２１℃、１５分間加圧滅菌した１５％の小麦グルテン（プロミックＧＴ、協和醗酵工業社製）分散液３０ｍｌに、孔径０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過した上清３０ｍｌを加え、４０℃、１００ｒｐｍで４８時間インキュベートし、タンパク加水分解物を調製した。タンパク質を分解した後、反応物を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、１００℃、１０分間加熱処理を行ない、窒素可溶化率と遊離アミノ酸量を測定した。窒素可溶化率は、原料に含まれる総窒素に対するろ液の総窒素の割合とする。総窒素の測定は、ＮＡ２１００（サーモフィニガン社製）により測定した。測定値（％）は湿菌体重量（ｇ）で標準化し、３回の実験結果の平均値を算出した。結果を第４図に示す。遊離アミノ酸量の測定法はオルトフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法〔Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，６２，３６３（１９９８）〕に従った。測定した遊離アミノ酸量（ｍｍｏｌ／ｌ）は湿菌体重量（ｇ）で標準化し、３回の実験結果の平均値を算出した（図５）。その結果、親株と比較しＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物では、湿菌体重量（ｇ）あたりの窒素可溶化率および遊離アミノ酸量が有意に増加していることを見出した。したがって、Ａｏｖｐｓ５遺伝子の破壊株の培養液を用いることにより、従来より加水分解率の高いタンパク加水分解物を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、Ａｏｖｐｓ５遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子の機能を抑制させた糸状菌、および該糸状菌を用いてタンパク加水分解率が顕著に上昇したタンパク加水分解物の作製方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−発明者：徳永税、斎藤知明
発明者：北本勝ひこ
配列番号６−縮重プライマーＶ５Ｐ−Ｆ
配列番号７−縮重プライマーＶ５Ｐ−Ｒ
配列番号９−ＰＣＲプライマーＶＰＳ５Ｆ
配列番号１０−ＰＣＲプライマーＶＰＳ５Ｒ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５ポリペプチドと相同性を有する液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドの機能を抑制することにより液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を作製する方法、および該方法により作製される液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌に関する。さらには、該糸状菌を用いた液胞酵素の製造方法、および該酵素を用いたタンパク加水分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
液胞は酵母、植物細胞、糸状菌などに共通して観察される細胞内器官の一つであり、細胞内成分のリサイクル、浸透圧調節、解毒、栄養素の貯蔵などの生理的機能を担っている。酵母の液胞はプロテアーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、グリコシダーゼなど多くの加水分解酵素を含むことが知られている［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，２６６（１９９０）］。
醤油醸造などにおいては、熟成中に麹菌〔アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）〕が溶菌し、溶出した細胞内タンパク質により窒素可溶化率が上昇し（醤油の科学と技術、１９８８年、ｐ．１２２）、味質の向上に寄与しているが、その分解活性の大部分は液胞酵素に因っていると予想される。このように液胞酵素は産業上有用であり、特にＧＲＡＳグレードである麹菌の液胞酵素は食品製造上、利用価値が高い。しかし、液胞酵素を取得するためには、自己消化または物理的もしくは酵素的に麹菌を破砕、溶菌することが必要であり時間と手間がかかる。そのため効率的な液胞酵素の取得方法が望まれる。
北本はソーティング工学の見地から、液胞酵素を効率的に細胞外に分泌できる可能性に言及している（生物工学会誌、１９９９年、第７７巻、ｐ．１−３３）が、これまで麹菌において液胞酵素を細胞外に分泌した例はない。
液胞酵素を分泌酵素から選別し、液胞まで輸送する機構についての解析は、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）で研究が進んでいる。サッカロミセス・セレビシエの液胞酵素の選別と輸送には４０以上の遺伝子が関与しており、該遺伝子の破壊、変異によりその機能が欠失、低下した場合、液胞酵素の輸送は正常に行なわれず細胞外にミスソートされる。これらは液胞酵素選別（Ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＶＰＳ）遺伝子として知られている［Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，１（１９９５）］。サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子は、ソーティング・ネキシンＩと相同性を有するポリペプチドをコードする液胞酵素選別遺伝子であり、ＶＰＳ５遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエは、液胞酵素の細胞外へのミスソートが見られた［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１０，１０６３（１９９７）］。
糸状菌にも形態的に酵母の液胞と類似の細胞内器官が存在しており、酵母の液胞と同様、様々な加水分解酵素を有していると考えられる。また糸状菌においても酵母と類似の機構で液胞酵素が分泌酵素から選別され、液胞まで輸送されていると予想される。
糸状菌の液胞の機能解明を目的として、樽谷らは、サッカロミセス・セレビシエにおいて、トランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関与する、液胞酵素選別遺伝子ＶＰＳ１の相同遺伝子ｖｐｓＡをアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離し、該遺伝子破壊株を作製し、液胞の形態形成に関与していることを示した［Ｇｅｎｅ，２６８，２３（２００１）］。また、同じくトランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関わる液胞酵素選別に関わることが知られている、ＶＰＳ４５の相同遺伝子ｖｐｓＢをアスペルギルス・ニドランスから単離した（日本農芸化学会誌，第７３巻，臨時増刊号，１９９９年度日本農芸化学会大会講演要旨集，１９９９年，ｐ．２１２）。
松田らは、トランスゴルジからプレ液胞コンパートメントへの小胞輸送に関与するスモールＧＴＰａｓｅ、ＶＰＳ２１の相同遺伝子ｖｐｓＣをアスペルギルス・ニドランスから単離した（例えば、日本農芸化学会誌，第７３巻，臨時増刊号，１９９９年度日本農芸化学会大会講演要旨集，１９９９年，ｐ２１３）。
正路らはアスペルギルス・オリゼからサッカロミセス・セレビシエＶＡＭ３相同遺伝子を単離・同定し、該遺伝子がサッカロミセス・セレビシエのｖａｍ３遺伝子破壊株およびｐｅｐ１２／ｖｐｓ６遺伝子破壊株の表現型を相補したことを示した（第２回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集，２００２年，ｐ．２４）。
また、大根田はアスペルギルス・ニドランスから単離・同定されたカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子ｃｐｙＡに蛍光タンパク質を結合させた融合タンパク質を、アスペルギルス・オリゼの細胞内で発現させ、該遺伝子産物がアスペルギルス・オリゼの液胞に局在することを示し［Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７，２９（２００２）］、さらに培地中の蛍光強度が上がる変異株を単離しその表現型を解析した（日本生物工学会大会要旨集，２００１年，ｐ．２３１）。しかしこの原因遺伝子の同定には至っていない（第２回糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集，２００２年，ｐ．４９）。
【発明の開示】
アスペルギルス・オリゼの、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子、および該遺伝子を利用し、効率的に糸状菌の液胞酵素を培地中に生産する方法が求められている。
本発明は、以下の（１）〜（３４）を提供する。
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２）配列番号１のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（５）配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡ。
（６）配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（７）（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
（８）（７）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（９）（８）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から、該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
（１０）配列番号２または３の塩基配列の連続する２０塩基以上の配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いて、（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１１）配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡを用いて、（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１２）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることを特徴とする、液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製方法。
（１３）糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子破壊することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１４）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを転写させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１５）糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１６）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる（１２）に記載の方法。
（１７）液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドが（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドである、（１２）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に培養し、培地に赤褐色の色素を分泌する菌株を選択することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
（１９）糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に重金属を含む培地に培養し、重金属に対する耐性を有する菌株を選択することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
（２０）糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である（１２）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである（２０）に記載の方法。
（２２）（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＤＮＡのコード領域内に１つ以上のＤＮＡを挿入または欠失することにより、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ。
（２３）（２２）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（２４）（１７）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌。
（２５）糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である（２４）に記載の糸状菌。
（２６）アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである（２５）に記載の糸状菌。
（２７）（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培地に培養し、培地中に液胞酵素を生成蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することを特徴とする液胞酵素の製造方法。
（２８）培地が固体培地である（２７）に記載の製造方法。
（２９）培地が液体培地である請求項（２７）に記載の製造方法。
（３０）液胞酵素がトリペプチジルペプチダーゼである（２７）〜（２９）のいずれか１項に記載の製造方法。
（３１）（２７）〜（３０）のいずれか１項に記載の方法により製造された液胞酵素、または（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培養して得られる液胞酵素を含む培養物または培養処理物を、基質となるタンパク質に作用させることを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
（３２）（１２）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を、基質となるタンパク質を含む培地に培養することを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
（３３）（３１）または（３２）に記載の方法で製造されたタンパク加水分解物。
（３４）（３３）に記載のタンパク加水分解物を含有することを特徴とする調味料。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをあげることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子に対するアスペルギルス・オリゼの相同遺伝子（以下、Ａｏｖｐｓ５遺伝子ともいう）がコードするポリペプチドである。
１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−２００１）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入し、２．に後述する方法で変異を導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させることにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。また、アミノ酸の欠失、置換または付加は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１ヶ所に限らず、２ヶ所以上の位置で同時に生じてもよい。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端をあげることができる。
上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加があることを意味し、欠失、置換もしくは付加が同時に生じてもよく、置換もしくは付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記の１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、液胞酵素を細胞内に局在化させるためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
上記のポリペプチドが、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有することは、糸状菌において、３．に後述する方法で該ポリペプチドの機能を抑制したときに、糸状菌の液胞酵素が細胞外に分泌されることにより、確認することができる。
細胞外に液胞酵素が分泌されることは、糸状菌を培地で培養し、培養後の培地中の液胞酵素を検出することにより確認できる。液胞酵素としては、例えばトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＹがあげられる。液胞酵素を検出する方法としては、（ａ）液胞酵素の酵素活性を測定する方法、（ｂ）液胞酵素を認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング等により免疫学的に検出する方法、（ｃ）グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のマーカータンパク質またはＦＬＡＧタグ等のエピトープペプチドと液胞酵素の融合タンパク質を糸状菌で発現させ、マーカータンパク質やエピトープペプチドを特異的に認識する抗体を利用して融合タンパク質を検出する方法〔Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，３７，２９（２００２）〕等があげられる。例えば、トリペプチジルペプチダーゼは、文献〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４７，１０７９（１９９９）〕に記載されたトリペプチジルペプチダーゼＩの活性測定方法に準じて、基質となるアラニン−アラニン−フェニルアラニン−パラニトロアニリドを含む基質溶液に、糸状菌の培養液等の試料溶液を加えて、３０℃で１０分間反応させた後、分光光度計により３８４ｎｍの吸光度を測定することにより、活性を測定できる。
あるいは、３．および実施例３に後述するアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を宿主として、２．に記載の方法あるいは３．に記載の相同組換え法で該ポリペプチドを発現させたときに、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が有する、（１）液胞酵素の細胞外への分泌、（２）赤褐色の色素の分泌、（３）重金属に対する耐性、（４）分生子の形成の阻害、等の表現型がもとの表現型に回復することによっても、該ポリペプチドが液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有することを確認することができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡがあげられる。配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡがあげられる。配列番号２の塩基配列は、アスペルギルス・オリゼのゲノム上のＡｏｖｐｓ５遺伝子の配列であり、配列番号３の塩基配列は、該遺伝子のｃＤＮＡのコード領域の配列である。
また、本発明のＤＮＡとしては、配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラークのＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でプローブとハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
１．本発明のＤＮＡの調製
（１）プローブの調製
以下のようにして得られるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片をプローブとして用いることができる。
まず、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ７３５１２）のコード領域の配列（配列番号４）を問い合わせ配列として、アスペルギルス・ニドランス、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等の各種糸状菌のゲノム配列データベースを相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）〕を用いて検索することにより、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子と高い相同性を有するノイロスポラ・クラッサ等のＶＰＳ５相同遺伝子のゲノム配列を見出すことができる。例えば、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子の塩基配列としては配列番号５をあげることができる。
このノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列から、縮重プライマーを設計する。プライマーを設計するアミノ酸配列は、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列から任意の２カ所の配列を選ぶことができるが、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子とサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子がそれぞれコードするアミノ酸配列間で保存性の高い領域を選択することが望ましい。例えばノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の１８１〜１８９番目の配列（Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ）、２６７〜２７４番目の配列（Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ）をあげることができる。縮重プライマーは、選択した２箇所のアミノ酸配列について、よりＮ末側のアミノ酸配列に対応する全てのコドンの塩基配列、よりＣ末のアミノ酸配列に対応する全てのコドンと相補的な塩基配列を、それぞれ含むＤＮＡとして設計する。縮重の数をへらすため、コドンの３番目の塩基としてイノシンを利用したり、アスペルギルス・ニドランスのコドン使用頻度〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０，２８８（１９９１）〕を利用したりすることもできる。プライマーの長さは、１４〜３０塩基が好ましい。縮重プライマーの例としては、配列番号６および７の塩基配列をそれぞれ有するＤＮＡをあげることができる。設計した縮重プライマーは、例えば、アプライド・バイオシステムズ社製のＤＮＡ合成装置等を使用して調製することができる。
上記の縮重プライマーとアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲを行うことにより、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片を増幅し単離することができる。アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡは、（２）に後述する方法で調製できる。ＰＣＲは当業者に周知の条件及び手段を用いて、行うことができる。例えば、ＰＣＲの反応条件としては、９４℃で５分間の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる反応サイクルを３０サイクル行う条件があげられる。ただし、反応サイクル中のアニーリングの温度は、プライマーの長さ、塩基組成により推定されるＴｍに基づいて、適当なものにする。なお、サーマルサイクラーとしては、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製９６００、アステック社製プログラム・テンプ・コントロール・システムＰＣ−７００など市販のサーマルサイクラーを用いることができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）などの市販品を用いることができる。反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従う。
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を単離し、ジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）、放射性同位元素等で標識したものをプローブとする。また、上記のＰＣＲの反応液中にＤＩＧ、放射性同位元素等で標識したヌクレオチドを添加してＰＣＲを行うことにより、プローブの標識を増幅と同時に行うこともできる。以上のようにして得られる、プローブとして用いることのできるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の部分断片としては、配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
増幅されたＤＮＡ断片は、適当なプラスミドベクターにクローニングし、ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）、ＡＢＩ ３１０ジェネエティック・アナライザー（パーキンエルマー社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定し、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子と相同性を有しているか確認することが好ましい。
（２）染色体ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの調製
アスペルギルス・オリゼから抽出したゲノムＤＮＡを、適当な制限酵素を用いて切断し、同じ切断末端をもつ制限酵素で切断したベクターに挿入する。ベクターとして例えばλＤＡＳＨＩＩ（ストラタジーン社製）、λＦＩＸＩＩ（ストラタジーン社製）等のラムダファージベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）等のプラスミドベクターがあげられる。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡは、五味らの方法〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５，（１９８９）〕に従って抽出できる。
例えば、ファージベクターλＤＡＳＨＩＩへの挿入は、ＢａｍＨＩで開裂したベクターとＢａｍＨＩで分解した染色体ＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することにより行うことができる。このようにして得られたゲノムＤＮＡ断片を挿入したベクターを適切なエシェリヒア・コリ宿主に導入することにより染色体ＤＮＡライブラリーが得られる。
ｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調製できる。まず、液体窒素で凍結したアスペルギルス・オリゼの菌体を細かく粉砕した後、グアニジンイソチオシアネートを含んだフェノール又はフェノール−クロロホルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水層と有機層に分離する。その後、水層とイソプロパノールを混合し、水層に含まれる全ＲＮＡを沈殿させて回収するか、あるいはショ糖もしくはセシウムクロライド密度勾配遠心法により回収する。もしくは市販の全ＲＮＡ抽出キット（例えばＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いることもできる。この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーにかけてｍＲＮＡ（即ち、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）を精製する。
次に、ｍＲＮＡから逆転写酵素の存在下にｃＤＮＡを合成し、ファージもしくはプラスミドベクターに連結可能なように適当な制限酵素部位を作り、これを同様の制限酵素部位をもつファージもしくはプラスミドベクターに連結し、このようにして得られたベクターで大腸菌を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを調製する。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法として、ゲートウェイ技術を用いたｃＤＮＡ合成およびクローニング用スーパースクリプト・プラスミド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ、インビトロジェン社製）などの市販キットを用いることもできる。
（３）Ａｏｖｐｓ５遺伝子クローンの選別
Ａｏｖｐｓ５遺伝子を含むクローンの選別は、具体的には、プラークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーション〔モレキュラー・クローニング第３版、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，８７９（１９８１）〕により行うことができる。例えば、プラークをニトロセルロースあるいはナイロンメンブレン上に転写し、真空中で８０℃、２時間あるいは紫外線照射によって、ＤＮＡをメンブレン上に固定化する。この時、必要に応じて０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含むアルカリ性溶液を用いた変性および０．５ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、３ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムの溶液を用いた中和を行う。このメンブレンを、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２％ＳＤＳ、１％ブロッキング・リージェント（ロシュ社製）からなる溶液中でプローブとメンブレンを４２℃、６時間インキュベートした後、４２℃で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで１５分間、順次洗浄する条件、あるいは４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２％フィコール４００、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなる溶液中でプローブとメンブレンを、４２℃、一昼夜インキュベートした後、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液で室温、２分間で３回洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液中で５０℃、２時間で３回洗浄する条件でプローブとハイブリダイゼーションさせる。洗浄後のメンブレンは放射性同位体で標識したプローブの場合は、風乾した後、−７０℃で２時間から一昼夜Ｘ線フィルムに露光させ、現像して、ポジティブクローンを可視化する。ジゴキシゲニンで標識したプローブの場合は、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩ（ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ＆Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ ＫｉｔＩ、ロシュ社製）を用いて発色反応を行い、ポジティブクローンを検出する。
（４）本発明のＤＮＡの単離
上記のようにして選別されたポジティブクローンのプラークまたはコロニーからファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを抽出・単離し、挿入断片を適当な制限酵素でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得することができる。取得したＤＮＡは、適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）、ＡＢＩ ３１０ジェネエティック・アナライザー（パーキンエルマー社製）等のＤＮＡシークエンサーを用いて、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。Ａｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡの配列とｃＤＮＡの配列を決定し、両者の塩基配列を比較することにより、ゲノムＤＮＡのイントロンの領域を決定することができる。
Ａｏｖｐｓ５遺伝子の塩基配列が決定された後は、ポリペプチドのコード領域を含む領域を適当に選択し、選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより本発明のＤＮＡを増幅し単離することができる。ＰＣＲは（１）に記載した条件と同様にして行うことができる。
以上のようにして得られる本発明のＤＮＡとして、配列番号２の塩基配列からなるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡ、配列番号３の塩基配列からなるアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡをあげることができる。
また、このようにして得られた本発明のＤＮＡをプローブとして、（２）および（３）に記載した方法に準じて、他の糸状菌のゲノムＤＮＡライブライリーまたはｃＤＮＡライブラリーを、上記（３）の条件下でのハイブリダイゼーションでスクリーニングすることにより、他の糸状菌のＡｏｖｐｓ５相同遺伝子のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを取得することができる。これらのＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
（５）本発明のＤＮＡの検出
本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な配列の連続する２０塩基以上の配列を含むＤＮＡ断片またはオリゴＤＮＡを放射性同位体、ジゴキシゲニン、ビオチン等で標識したものをプローブとし、ハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な連続する２０塩基以上の配列を含むＤＮＡ断片は、上記（４）に記載した方法に準じて、本発明のＤＮＡの任意の領域を含む領域を適当に選択し、選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれプライマーとしたＰＣＲにより調製することができる。オリゴＤＮＡはＤＮＡ合成装置により調製できる。プローブの長さは、検出対象などに応じて当業者が適宜選択することができるが、通常、１５〜３０００塩基、好ましくは２０〜１０００塩基の長さである。
ハイブリダイゼーションは、電気泳動ゲルあるいはコロニーなどからゲノムＤＮＡあるいはｍＲＮＡを転写したニトロセルロースメンブレンあるいはナイロンメンブレンに対して、（３）に記載したハイブリダイゼーションの方法に準じて行うことができる。また、基板上にオリゴＤＮＡまたはＤＮＡ断片を固定化し、標識したｍＲＮＡあるいはＤＮＡとハイブリダイズさせた後、ドットとして検出するＤＮＡチップ〔Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）〕によっても本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。
また、本発明のＤＮＡの塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび本発明のＤＮＡの塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡをプライマーとして、コロニー等から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにより、本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる。ＰＣＲは（１）に記載した条件と同様にして行うことができる。
２．本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、例えば以下の方法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより、調製することができる。具体的な遺伝子操作的手法は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用いることができる。
（１）で得られた本発明のＤＮＡから、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡを調製する。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。
該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中で機能するプロモーターを含有しているものが用いられる。また、形質転換体を選択するための形質転換マーカーとなる遺伝子を含むことが好ましい。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび転写終結配列が連結された構造を含むベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
原核生物用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＴｒＳ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＥＴ１４（ノバジェン社製）、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ（クロンテック社製）、ｐＲＳＥＴ Ｃ（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５６（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
糸状菌を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えばｐＰＴＲＩ（白鶴酒造社製）、ｐＰＴＲＩＩ（白鶴酒造社製）、ｐＡＵＲ３１６（宝酒造社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、糸状菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えばａｍｙＢプロモーター、ｅｎｏＡプロモーター、ｇｐｄプロモーター、ｍｅｌＯプロモーター、ａｌｃＡプロモーター、ｐｒＡプロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属等に属する糸状菌、例えばアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フィカム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｉｃｃｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、リゾープス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｂｅｕｓ）をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては糸状菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、プロトプラスト法〔ＧＥＮＥＴＩＣＳ ｏｆ ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＤＵＬＡＮＳ：ＥＭＢＯ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，８（１９８８）〕等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クロンテック社製）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３ １９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１（ストラタジーン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＭＳＧ（アマシャム・バイオサイエンス社製）、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（ともにインビトロジェン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ９（クロンテック社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許公報２６０６８５６号、特許公報２５１７８１３号）等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母、糸状菌等の真核微生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、小麦タンパク質および小麦タンパク加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
糸状菌の培養においては、小麦ふすま、米糠、大豆ふすま、脱脂大豆タンパク質、蒸米等を、炭素源、窒素源および無機物源とし、適当な塩類を補強したものを培地として用いることもできる。
培養は、振とう培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
糸状菌を培養する場合、通常の液体培地だけではなく固体培地を使用して培養することもできる。糸状菌の培養に用いられる固体培地としては、通常の寒天培地より水分活性が低い培地を用いることができる。該固体培地としては、小麦ふすまに水性媒体を浸潤させた小麦ふすま培地、蒸米等があげられる。
糸状菌を、固体培地で培養する場合は、糸状菌を植菌後、固体培地と糸状菌を充分に混合し、アルミまたはステンレス製のトレーに薄く広げて培養室内に静置する。その後、温度を通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、湿度を通常８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％に制御して、３〜１０日間静置培養する。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｍｉｍｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、Ｄａｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨバイオサイエンス社製）、Ｇｒａｃｅの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，６，１２９（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて本発明のポリペプチドを生産することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的なＲＮＡポリメラーゼを反応させることにより大量の本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばウサギ網状赤血球ライセートやコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、本発明のポリペプチドを生産することができる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。ｐＲＳＥＴ系ベクター（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（アマシャム・バイオサイエンス社製）等、該ポリペプチドにタグをつけて発現させた場合、ニッケルレジン、グルタチオンセファロースなどの適当な担体を用いてアフィニティ精製することもできる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中のポリペプチド変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される本発明のポリペプチドとして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをあげることができる。
３．液胞酵素の培地中への生産
（１）液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製
糸状菌において、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることにより、液胞酵素、例えばトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼが、好ましくはトリペプチジルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼが効率的に細胞外に分泌されるため、液胞酵素を培地中に生産させることができる。
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドとは、該ポリペプチドの機能を抑制させたときに、液胞酵素のすべてまたはその一部が液胞内に正常に局在せず、細胞外に分泌されるようになるポリペプチドを意味する。細胞外に分泌される液胞酵素は前駆体または成熟体のどちらであってもよい。、このようなポリペプチドとしては、液胞酵素の選別や輸送、液胞の酸性化や形態形成・維持に関わる遺伝子がコードするポリペプチドがあげられ、例えばサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ遺伝子群、ＰＥＰ遺伝子群、ＶＡＣ遺伝子群、ＴＬＧ遺伝子群、ＶＡＭ遺伝子群、ＡＰＧ遺伝子群、ＣＶＴ遺伝子群およびＧＲＤ遺伝子群または動植物細胞におけるシンタキシンファミリーおよびソーティング・ネキシンファミリーなどの遺伝子群のいずれかと相同性を有する、糸状菌の遺伝子がコードするポリペプチドがあげられる。該ポリペプチドとしては、アスペルギルス・ニドランスのｖｐｓＡ遺伝子、ｖｐｓＢ遺伝子およびｖｐｓＣ遺伝子、アスペルギルス・オリゼのＶＡＭ３相同遺伝子、Ａｏｖｐｓ５遺伝子等がそれぞれコードするポリペプチド（Ａｏｖｐｓ５遺伝子がコードするポリペプチドを以下、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドともいう）があげられ、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドが好ましく用いられる。このようなポリペプチドをコードする糸状菌の遺伝子は、１．に記載した本発明のＤＮＡを取得する方法と同様にして、取得することができる。
糸状菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコラ属、ムコール属、モナスカス属等に属する糸状菌をあげることができるが、アスペルギルス属に属する糸状菌が好ましく、特に、醸造工業で用いられるアスペルギルス属に属する糸状菌が好ましい。醸造工業で用いられるアスペルギルス属に属する糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）等をあげることができる。
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させる方法として、（ａ）遺伝子破壊をする方法、（ｂ）アンチセンスｍＲＮＡを転写させる方法、（ｃ）プロモーター領域に変異を導入する方法、（ｄ）優性不活性（ドミナントネガティブ）変異体を発現させる方法等があげられる。
（ａ）遺伝子破壊をする方法では、まず、機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡのポリペプチドＡをコードする領域中の制限酵素サイトを利用して１つ以上、通常は数１００ｂｐ〜数ｋｂのＤＮＡの挿入あるいは欠失を行うことにより構造を破壊し、ポリペプチドＡの機能（本発明の場合は、液胞酵素を細胞内に局在させる活性）を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ（以下、遺伝子破壊用ＤＮＡとよぶ）を作製する。次いで、遺伝子破壊用ＤＮＡを含む組換えベクターで糸状菌を形質転換した後、ゲノム中のポリペプチドＡをコードする遺伝子が、遺伝子破壊用ＤＮＡにより相同組換えをおこした形質転換体を、ＰＣＲやサザンブロッティングにより選択する。
ポリペプチドＡをコードする領域に挿入するＤＮＡとして、形質転換マーカーとなる遺伝子を用いれば、選択培地を用いて形質転換体を容易に選択することができる。形質転換マーカーとなる遺伝子は、宿主とする糸状菌の栄養要求性や薬剤耐性と関係する遺伝子で、例えば、ｓＣ遺伝子、ａｒｇＢ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子、ｐｔｒＡ遺伝子、ｐａｂａＡ遺伝子、ｎｉｉＡ遺伝子、ＢｅｎＡＲ遺伝子などがあげられる。
組換えベクターの作製に用いるベクターは、大腸菌で自律複製でき、適当なクローニング用制限酵素サイトを持つ通常のプラスミドベクターであればよく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）（ストラタジーン社製）等があげられる。遺伝子破壊用ＤＮＡの作製に形質転換マーカー遺伝子を用いない場合は、上記のベクターに形質転換マーカー遺伝子を挿入したベクターを組換えベクターの作製に用いることにより、形質転換体を選択することができる。宿主とする糸状菌は形質転換マーカー遺伝子が欠損している株を用いる。
（ｂ）アンチセンスｍＲＮＡを転写させる方法では、まず機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするＤＮＡを単離する。次いで、該ＤＮＡを２．に記載の方法に準じて糸状菌用発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に連結し、通常の遺伝子ＡのｍＲＮＡとは相補的な配列を有するアンチセンスｍＲＮＡを転写する組換えベクターを作製する。該組換えベクターで糸状菌を形質転換することにより、形質転換体において、遺伝子ＡのｍＲＮＡとアンチセンスｍＲＮＡのハイブリッドを形成させて遺伝子ＡのｍＲＮＡからの翻訳を阻害させる。
（ｃ）プロモーター領域に変異を導入する方法では、まず機能を抑制させたいポリペプチドＡをコードするゲノム遺伝子のコード領域の上流にあるプロモーター領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡのプロモーター領域中の制限酵素サイトを利用して数１００ｂｐ〜数ｋｂのＤＮＡの挿入あるいは欠失を行うことにより、プロモーター機能を破壊したＤＮＡを作製する。次いで該ＤＮＡを含む組換えベクターで糸状菌を形質転換した後、ゲノム中のポリペプチドＡをコードする遺伝子のプロモーター領域が、プロモーター機能を破壊したＤＮＡにより相同組換えをおこした形質転換体を、ＰＣＲやサザンブロッティングにより選択する。組換えベクターの作製に用いるベクターは、（ａ）の遺伝子破壊に用いるベクターと同様のベクターを用いる。
（ｄ）ドミナントネガティブ変異体は、あるポリペプチドの機能ドメインに欠失、置換、付加等の改変を加えることにより作製した、もとの該ポリペプチドが有する機能を失い、しかも細胞内の正常な該ポリペプチドの機能を阻害するような性質の変異体である。ドミナントネガティブ変異体を発現させる方法では、まず機能を抑制したいポリペプチドＡのドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡを作製する。該ＤＮＡを用いて、２．に記載の方法にしたがって糸状菌用の発現ベクターを作製する。該発現ベクターで糸状菌を形質転換して得られる該形質転換体において、ドミナントネガティブ変異体を発現させ、細胞内の正常なポリペプチドＡの機能を阻害させる。
ポリペプチドＡの機能ドメインは、例えばタンパク質ファミリーのデータベースＰｆａｍ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，２７６（２００２）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８，４０５−４２０（１９９７）〕の検索を行うことにより推察できる。Ｐｆａｍの検索は、サンガー研究所のＰｆａｍに関するウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）上で行うことができる。
例えば、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に対し、Ｐｆａｍの検索を行うと、４４番目のリジンから１５８番目のグルタミン酸までが、ホスファチジルイノシトール３−リン酸等の脂質と結合する機能を有するＰＸドメイン、および１５９番目のスレオニンからＣ末端のアラニンまでが、ポリペプチド同士の重合体の形成に関与するとされているコイルドコイル領域として予測される。これらのドメインの改変を行うことによりドミナントネガティブ変異体を作製できる。
例えば、サッカロミセス・セレビシエのＶＡＭ７ポリペプチドのＰＸドメインの解析〔Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，６１３（２００１）〕から、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドのＰＸドメイン中で、脂質との結合に関与するアミノ酸として、８７番目のアルギニン、９５番目のリジン、１２８番目のアルギニン、１２９番目のアルギニンがあげられ、特に８７番目から８９番目のアミノ酸配列（Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｙｒ）が重要と考えられるので、これらのアミノ酸のいずれか、もしくはこれらから選ばれる複数のアミノ酸に欠失や置換等の変異を導入することによりドミナントネガティブ変異体を作製できる。
また、コイルドコイル領域以外の部分を欠失させたコイルドコイル領域のみからなる変異体も、正常なポリペプチドの重合体形成を阻害するドミナントネガティブ変異体の例としてあげられる。また、ＰＸドメインのみからなる変異体、コイルドコイル領域の一部または全てを欠失させた変異体であってもよい。
糸状菌において、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能が抑制されると、分生子の形成が阻害される傾向にあるため、上記の、アンチセンスｍＲＮＡの転写やドミナントネガティブ変異体の発現を、薬物の投与等で誘導できる発現ベクターを用いて行えば、増殖および分生子の形成過程では遺伝子の機能を抑制せず、分生子が形成した後に該遺伝子の機能を抑制することで、分生子形成能を損なわず液胞酵素を細胞外に生産できる利点がある。
糸状菌の形質転換は、糸状菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、プロトプラスト法〔ＧＥＮＥＴＩＣＳ ｏｆ ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＤＵＬＡＮＳ：ＥＭＢＯ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，８（１９８８）〕等をあげる事ができる。
また、Ａｏｖｐｓ５糸状菌の分生子への紫外線照射等でゲノムＤＮＡにランダムに突然変異を誘発させた後、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株に特徴的な表現型を利用して、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が欠損した変異株（以下、Ａｏｖｐｓ５機能欠損変異株ともいう）を選択することにより、上記のような遺伝子操作を用いずに、Ａｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が抑制された糸状菌を取得することができる。
アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株は、寒天培地上で培養を行うと赤褐色の色素を培地中に分泌する。したがって、本性質を利用することによりＡｏｖｐｓ５ポリペプチドの機能が欠損した変異株のスクリーニングが可能である。
スクリーニングは以下に記載の方法により行う。五味らの方法〔日本醸造協会誌，８４，４６５（１９８９）〕に基づいて、アスペルギルス・オリゼの分生子に紫外線を照射することにより、分生子のゲノム中に変異を誘発する。この分生子を寒天培地（０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）上にまき、シャーレ本体と蓋を、密閉状態にならないようにパラフィルムで巻いて固定し、３０℃で、５日以上、好ましくは７日以上培養する。周辺部の培地が赤褐色になるコロニーをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株の候補株として選択することができる。選択した候補株の２次スクリーニングとして、上記の候補株を培養した培地中のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、親株に比べて活性が上がっているものをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株として選択する。
また、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子破壊株が親株に比べてコバルトやニッケルなどの重金属に対する耐性が向上していることが報告されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，９６６０（２００１）〕。したがってアスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株も、重金属に対する耐性を獲得していると予想されるため、重金属に対する耐性を指標にＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株のスクリーニングが可能である。重金属の例として、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、モリブデン、銀、カドミウム、スズ、バリウム、水銀、鉛等があげられる。
これらの重金属を含まないか、通常の培地に含まれる濃度でしか含まない合成培地にこれらの重金属のいずれかを何段階かの適当な濃度で添加した培地に、親株とＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を培養し、親株は生育できないがＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が生育できるような選択培地の重金属の濃度を決定する。紫外線を照射してゲノム中に変異を誘発した分生子を、決定した濃度の重金属を含む選択培地上で培養し、生育してきたコロニーをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株の候補株として選択する。選択した候補株の２次スクリーニングとして、候補株を培養した培地中のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、親株に比べて活性が上がっているものをＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株として選択する。
このようにして得られるＡｏｖｐｓ５機能欠損変異株は遺伝子操作を施していないため、食品、飲料などの製造に好適である。
（２）液胞酵素の製造方法
以下に、（１）に記載した方法で得られる液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を用いた液胞酵素の製造方法について述べる。
該糸状菌を培地に培養し、液胞酵素を培地中に生産・蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することができる。
該糸状菌を培養する方法は、固体培養、液体培養、多孔性膜培養、ゲル包括固定化培養等があげられる。菌体の接種の方法は胞子を接種することもできるが、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では胞子を形成しないため、例えば菌糸を滅菌した生理食塩水などに分散させた後に接種することができる。
液体培地の場合、炭素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、フラクトース、スクロース等、窒素源として、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、ポリペプトン、酵母エキス、脱脂大豆タンパク質等、ミネラル成分としてリン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄等を添加することができる。
培養は、振とう培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で、通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃で通常１〜７日間行う。
固体培地の場合、培地原料として水性媒体を湿潤させた小麦ふすま、蒸米、脱脂大豆タンパク質等があげられ、水性媒体として水、無機塩類を含有する水溶液があげられる。培養は温度を通常１５〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃に、湿度は８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％、通常３〜１０日間で行う。
多孔性膜培養またはゲル包括固定化培養の場合は、例えば特開平１１−２２５７４６に記載の方法に従い培養することができる。
液胞酵素を細胞外に分泌する能力を有する糸状菌を液体培地で培養する場合、以下に記載の方法に従い、液胞酵素を単離・精製することができる。
培養終了後、培養液から不溶性固形分を、遠心分離、膜ろ過等の方法により分離除去し、上清を取得する。該上清から、通常の酵素の単離・精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。ｐＲＳＥＴ系ベクター（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＸ系ベクター（アマシャム・バイオサイエンス社製）等のタグを、液胞酵素につけて発現させた場合、ニッケルレジン、グルタチオンセファロースなどの適当な担体を用いてアフィニティ精製することもできる。
固体培地で培養する場合、例えば糸状菌が増殖した固体培地を水系緩衝液に分散した後、固液分離して酵素抽出液を取得し、液体培養において上清から液胞酵素を単離・精製した方法と同様の方法により、該酵素抽出液から液胞酵素を単離・精製することができる。
多孔性膜培養またはゲル包括固定化培養の場合、菌体が生育する膜または菌体を包埋したゲルと接触させた培地から、液体培地で培養した場合と同様にして、液胞酵素を単離・精製できる。
４．タンパク加水分解物の調製
３．（２）に記載した方法等に従って、液体培地で糸状菌を培養する場合、タンパク質を含む原料を該培養物中に添加することにより、タンパク加水分解物を製造することができる。または、タンパク質を含む原料に、３．（２）に記載した方法で得られる液胞酵素を添加して混合し、通常２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて、２４〜２６４時間、好ましくは４８〜２４０時間反応させることにより、タンパク加水分解物を製造することができる。反応時のｐＨは、本発明の液胞酵素および分泌酵素が作用できるｐＨであればよいが、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ５〜８に調整する。
この製造方法で用いる液胞酵素としては、精製した液胞酵素を用いることもできるし、液胞酵素を精製せずに、上記３．に記載した液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌を培地に培養して得られる、液胞酵素を含む培養物または培養処理物を用いることもできる。培養処理物としては、培養物からろ過や遠心分離等により菌体を除去して得られる溶液、該溶液の濃縮物、乾燥物等があげられる。
糸状菌は、醸造工業で用いられるものであれば、いかなるものでもよいが、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリをあげることができる。
タンパク加水分解物の製造方法に用いる原料に含まれるタンパク質は、特に限定されないが、グルタミン酸含量の高いものが好ましい。例えば、小麦グルテン、コーンミールグルテン、脱脂大豆、分離大豆タンパク質等があげられ、小麦グルテン、コーンミールグルテン等が好ましく用いられる。
また、タンパク質を含む原料は特に限定されないが、タンパク質含量が高いものが好ましい。
反応終了後、固液分離により未反応の原料タンパク質、菌体などを除去後、必要に応じて濃縮、乾燥することによりタンパク加水分解物を得ることができる。
得られたタンパク加水分解物はそのままでも調味料として用いることもできるが、アミノ酸、核酸、エキス類、酸味料、甘味料等と混合し、味、風味を調整することにより、うまみが強く風味の良好な調味料をつくることができる。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図 サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子がコードするアミノ酸配列とノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の比較である。上段、下段の配列はそれぞれサッカロミセス・セレビシエ、ノイロスポラ・クラッサのアミノ酸配列を示している。また、両配列で一致するアミノ酸を中段に示す。数字は各ポリペプチドＮ末端からのアミノ酸残基の位置を示す。下線は縮重プライマーに対応するアミノ酸配列を示す。
第２図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子の破壊に用いる形質転換用ＤＮＡの構造を示す。
第３図 ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株のゲノム中の破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子のＰＣＲによる検出を示す。レーン１〜３はそれぞれ、Ａｏｖｐｓ５変異株であるＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株のゲノムＤＮＡを、レーン４はＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊用プラスミドｐＤＶ５１を、レーン５は野生株（ＲＩＢ４０株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときのＰＣＲ産物を示す。
第４図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の窒素可溶化率（ろ液の総窒素÷原料に含まれる総窒素×１００）を示す。左から親株（ＮＳ４株）、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株（それぞれ左からＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株）の各培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の、湿菌体重量（ｇ）あたりの窒素可溶化率（％）を示す。
第５図 Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の遊離アミノ酸の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を示す。左から親株（ＮＳ４株）、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株（それぞれ左からＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株）の各培養液を用いて製造したタンパク加水分解物の、湿菌体重量（ｇ）あたりの遊離アミノ酸の濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１ アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５のゲノムＤＮＡのクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株（ＡＴＣＣ番号：４２１４４）の菌体から、五味らの方法〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，２２５（１９８９）〕に従い、以下に示すようにゲノムＤＮＡを調製した。
１５０ｍｌのＤＰＹ培地（２％デキストリン、２％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％リン酸一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物）にアスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株を植菌し、３０℃で２０時間振とう培養後、ブフナー漏斗で集菌し、液体窒素存在下で乳鉢で粉砕した。これを１０ｍｌのプロテアーゼ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に懸濁し、５０℃で４時間インキュベートした。この溶液を、フェノール処理２回、フェノール／クロロホルム処理２回、クロロホルム処理１回を順次行った。なお、これら有機溶媒による処理は、溶液と有機溶媒を穏やかに混合し、上清を分取することにより行った。次に溶液に１／１０容量の３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２．５倍量の９９．５％エタノールを加え、−２０℃で２０分間静置し、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿は７０％エタノールでリンスした後、５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この溶液に１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを添加し３７℃、３０分間インキュベート後、フェノール／クロロホルム処理を行った。回収した上清に１／１０容量の３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２．５倍量の９９．５％エタノールを加え、−２０℃で２０分間静置し、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿は７０％エタノールでリンスした後、１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡ溶液とした。
（２）糸状菌のＶＰＳ５相同遺伝子の検索
まず、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子の塩基配列を公共データベースＧｅｎＢａｎｋから取得した（登録番号：Ｕ７３５１２）。取得したサッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子のコード領域の配列（配列番号４）を問い合わせ配列（クエリー）として各種糸状菌データベースを検索した。その結果、ホワイトヘッド生物医学研究所ゲノム研究センターのウェブサイト内のノイロスポラ・クラッサのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｆｕｎｇｉ／ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ／）から、サッカロミセス・セレビシエのＶＰＳ５遺伝子と高い相同性（Ｅ−ｖａｌｕｅ＝３Ｅ−５４）を有する遺伝子配列（配列番号：ＮＣＵ０４１３７．１）を見出した。該塩基配列を配列番号５に記載した。サッカロミセス・セレビシエＶＰＳ５遺伝子と該遺伝子と相同性の高いノイロスポラ・クラッサの遺伝子がコードするアミノ酸配列との比較を第１図に示した。
（３）プローブの作製
第１図から比較的保存性が高く、機能的に保存されている可能性が高いと予想される領域から、縮重プライマーＶ５Ｐ−ＦおよびＶ５Ｐ−Ｒを設計した。該プライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号６および配列番号７に示す。
配列番号６および７の塩基配列は、ノイロスポラ・クラッサのＶＰＳ５相同遺伝子がコードするアミノ酸配列の１８１〜１８９番目の配列（Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ）、２６７〜２７４番目の配列（Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ）にそれぞれ対応する。
ＰＣＲは上記オリゴヌクレオチドをプライマー、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキン・エルマー社製）により以下の条件で行った。まず９４℃で５分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、１サイクル９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応を３０サイクル行った。反応液を２％アガロースゲルで電気泳動した結果、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を検出した。
（４）プローブの塩基配列決定
ジゴキシゲニン（以下、ＤＩＧと略す）−ｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）存在下でＰＣＲを行う以外は、（３）に記載の条件で取得したＰＣＲ産物を切り出し、ジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ、Ｑバイオジーン社製）により精製した。精製したＰＣＲ産物はＴＡクローニングにより、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（ノバジェン社製）のＴクローニング部位に導入し、プラスミドｐＶ５ＰＲを取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により、得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を決定した。その結果を配列番号８に示す。
（５）アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
（１）で取得したアスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ラムダファージベクターλＤＡＳＨ ＩＩ（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。これをインビトロパッケージングし、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡライブラリーとした。このライブラリーを用い、大腸菌Ｐ２３９２を宿主とし常法に従いプラークを形成させた。プラークはＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）にブロッティングし、変性溶液（１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム）上で５分間静置後、中和液（１．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．５ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．０））上で静置し、２×ＳＳＣ（０．３ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、７０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム）に５分間浸し、風乾した。次にメンブレンを、緩衝液（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２％ＳＤＳ，１％ブロッキング・リージェント（ロシュ社製））中で４２℃、１時間インキュベートした後、（４）で作製したＤＩＧ標識プローブを０．１％（ｖ／ｖ）添加した上記緩衝液中で、メンブレンを４２℃、６時間インキュベートした。上記メンブレンを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間、順次洗浄した後、マレイン酸バッファー（０．１ｍｏｌ／ｌマレイン酸、０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム）でリンスした。発色は、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩ（ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ＆Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ ＫｉｔＩ、ロシュ社製）を用いて、添付の説明書に従い行った。その結果、約５０００個のプラークからポジティブクローンを１個取得した。
（６）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列決定
上記（５）で得られたポジティブクローンからλファージＤＮＡを常法に従い精製し、ＳａｌＩで切断後、約３．２ｋｂｐのＳａｌＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）（ストラタジーン社製）のＳａｌＩ部位に挿入し、プラスミドｐＶＰＳ５Ｓを取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡシークエンサー（島津製作所社製）により、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子の塩基配列を決定した。結果を配列番号２に示す。
実施例２ アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株のｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ ４０株をＤＰＹ培地６０ｍｌに接種し３００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコで、３０℃、２日間、１５０ｒｐｍで振とう培養した。培養物をろ過し得られた湿菌体１ｇを、液体窒素存在下で、乳鉢で微細な粉末とした。
該菌体破砕物から、アールエヌイージー・ミディ・キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを取得した。
取得した全ＲＮＡからオリゴテックス・ｄＴ３０スーパー・ｍＲＮＡ精製キット（ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０〈Ｓｕｐｅｒ〉ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付の説明書に従い、０．６μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ溶液を１００μｌ取得した。この溶液に１０μｌの３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）と２５０μｌの９９．５％エタノールを添加し、激しく攪拌後、−２０℃で２時間静置した。１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、沈殿を２００μｌの７０％エタノールで洗った後、６μｌのジエチルピロカーボネート処理水に溶解した。
回収したｍＲＮＡは、ゲートウェイ技術を用いたｃＤＮＡ合成およびクローニング用スーパースクリプト・プラスミド・システム（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＧＡＴＥＷＡＹＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ、インビトロジェン社製）を用いて第１鎖ｃＤＮＡおよび第２鎖ｃＤＮＡの合成を行ないＰＣＲのテンプレートに供した。
（２）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲによる取得
テンプレート配列番号２に示す塩基配列から設計したそれぞれ配列番号９および配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーＶＰＳ５ＦおよびＶＰＳ５Ｒ）を合成した。ＰＣＲは、上記のテンプレートｃＤＮＡ、プライマーを用いて、Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２４００（パーキンエルマー社製）により行った。反応は、９４℃で５分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で２分の反応を３０サイクルの条件下で行った。
ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分離した結果、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出した。これを切り出し、ジーンクリーン・キット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ、Ｑバイオジーン社製）により精製した。
（３）アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列決定
精製したＤＮＡ断片はＴＡクローニングにより、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（ノバジェン社製）のＴクローニング部位に導入し、プラスミドｐＶＰＳ５を取得した。ＤＳＱ２０００Ｌ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（島津製作所社製）により、アスペルギルス・オリゼのＡｏｖｐｓ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。結果を配列番号３に示す。
実施例３ Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の作製
本発明のポリペプチドのコード領域中にマーカー遺伝子を挿入してＡｏｖｐｓ５遺伝子本来の機能を破壊したＡｏｖｐｓ５遺伝子（以下、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子ともいう）を用い、相同組換えにより、アスペルギルス・オリゼのゲノム上のＡｏｖｐｓ５遺伝子が破壊された、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株を作製した。以下に方法を記す。
プラスミドｐＵＮＡ〔Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６１，１３６７（１９９７）〕のアスペルギルス・ニドランスのｓＣ遺伝子を含むＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＫｐｎＩ／ＰｓｔＩサイトに挿入し、プラスミドｐＩＡＤを取得した。ｓＣ遺伝子を含む、ｐＩＡＤのＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＶＰＳ５ＳのＡｏｖｐｓ５ゲノム遺伝子のコード領域内に存在するＢｇｌＩＩサイトに挿入し、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子を有するプラスミドｐＤＶ５１を作製した。
形質転換用ＤＮＡは、ｐＤＶ５１をＳａｌＩで切断後、０．８％アガロースゲルで分離し、３．５ｋｂｐの断片をジーンクリーン・キットにより精製した。形質転換用ＤＮＡの構造を第２図に示す。
ｓＣ遺伝子欠損株であるアスペルギルス・オリゼＮＳ４株（独立行政法人酒類総合研究所 ＲＩＢ Ｎｏ．ＮＳ４）を１５０ｍｌのＤＰＹ培地に植菌し、３０℃で２０時間振とう培養した後、ろ過により菌体を回収し滅菌水で洗浄した。回収した菌体を１０ｍｌの酵素反応液〔０．６ｍｏｌ／ｌ硫酸アンモニウム、５０ｍｍｏｌ／ｌマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１％ヤタラーゼ（宝酒造社製）〕に懸濁し３０℃で３時間ゆるやかに振とうした。反応液はミラクロス〔カルビオケム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）社製〕を用いてろ過し、プロトプラストを回収した。プロトプラスト溶液に等量の緩衝液Ａ〔１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、３５ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）〕を加え、沈殿を緩やかに分散した後、２０００ｒｐｍ、８分間遠心分離し沈殿を回収した。上記洗浄工程を２回行なった後、１×１０７〜１×１０８個／ｍｌになるように上記緩衝液を加え懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。
２００μｌのプロトプラスト懸濁液と５μｇの形質転換用ＤＮＡを混合し、氷上で３０分間静置した。次に、緩衝液Ｂ〔６０％ポリエチレングリコール４０００、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリス−塩酸（ｐＨ７．５）〕を２５０μｌ加え穏やかに混合した後、緩衝液Ｂを２５０μｌ加え穏かに混合し、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加え穏やかに混合した。これを２０分間、室温で静置してＤＮＡを菌体内に導入した。
次に１０ｍｌの緩衝液Ａを加え穏やかに混合後、２０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、プロトプラスト懸濁液を回収した。プロトプラストに５００μｌの緩衝液Ｂを加え穏やかに混合後、あらかじめ４５℃に保温しておいた５ｍｌのトップアガー（１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、０．８％アガロース、０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、ｐＨ５．５）をプロトプラスト懸濁液に加えて、選択培地（１．２ｍｏｌ／ｌソルビトール、０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）に重層した。
ｓＣ遺伝子が欠損した株は、硫酸化合物を唯一の硫黄源とする培地上では生育できないので、該選択培地を用いて、ｓＣ遺伝子が挿入された破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子を含むＤＮＡが導入された形質転換体を選択することができる。３０℃で７日間培養し、約１００株の形質転換体を取得した。取得された形質転換体は上記選択培地上で３回継代培養を行った。
得られた形質転換体から、Ａｏｖｐｓ５遺伝子の遺伝子座で破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子の相同組換えが生じた株は、実施例１の（１）記載の方法によりそれぞれの形質転換体から取得されたゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ｃＤＮＡのクローニングに使用した配列番号９および配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより検出することができる。ＰＣＲは、プログラム・テンプ・コントロール・システム（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ）ＰＣ−７００（アステック社製）により行った。反応は９４℃で３分間加熱しテンプレートのＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分３０秒、５６℃で１分１５秒、７２℃で４分の反応を３０サイクルの条件下で行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、野生型のＡｏｖｐｓ５遺伝子（約１．６ｋｂｐ）は、検出されず、破壊Ａｏｖｐｓ５遺伝子（約５ｋｂｐ）が検出された形質転換体を、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株として選択した。図３に、このようにして選択された形質転換体ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株、ＣＴ９６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして上記の条件下でＰＣＲを行ったときの、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。
なお、これらのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では、分生子の形成がみられなかった。また、寒天培地（０．２％塩化アンモニウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二水素一カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００２％硫酸鉄７水和物、２％グルコース、１．５％寒天、ｐＨ５．５）にこれらのＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の菌糸を植え、シャーレ本体と蓋を、密閉状態にならないようにパラフィルムで巻いて固定し、３０℃で５日以上培養した結果、コロニー周辺の寒天培地が乳白色から赤褐色に変化した。したがって、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株は、上記培養条件下で赤褐色の色素を分泌すると予想される。
実施例４ 培地中に分泌された液胞酵素の活性測定
アスペルギルス・オリゼの親株（ＮＳ４株）、およびＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株３株（ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株）をそれぞれＤＰＹ培地６０ｍｌに接種し３００ｍｌのバッフル付きの三角フラスコで、３０℃、２日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。
培養液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し菌体を除去した後、該ろ液の４３５μｌに２４１５μｌの５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸バッファーを加え、２．８５ｍｌの酵素溶液とした。これを３０℃で５分間インキュベートした後、基質溶液〔８ｍｍｏｌ／ｌアラニン−アラニン−フェニルアラニン−パラニトロアニリドを含む５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）〕を１５０μｌ混合し基質の分解を開始した。３０℃で１０分間反応させ、経時的にサンプリングを行い、分光光度計により３８４ｎｍの吸光度を測定した。パラニトロアニリンのモル吸光係数（１０３００）より、反応時間１分あたりのパラニトロアニリンの遊離量を計算し、３０℃で１分間に１μモルのパラニトロアニリンを遊離する活性を１単位とした。該培養液のトリペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、活性値を算出した結果を第１表に示す。
この結果から示されるとおり、Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株では培地中に液胞酵素であるトリペプチジルペプチダーゼが効率よく分泌される。
実施例５ Ａｏｖｐｓ５遺伝子破壊株が生産する酵素によるタンパク加水分解物の調製
親株（ＮＳ４株）及びＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株３株（ＣＴ６１１８株、ＣＴ９１０３株およびＣＴ９６株）を、それぞれＤＰＹ培地６０ｍに植菌し３００ｍｌのバッフル付き三角フラスコで、３０℃、、２日間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、吸引ろ過により菌体と上清に分離した。菌体は湿菌体の状態でその重量を測定した。
１２１℃、１５分間加圧滅菌した１５％の小麦グルテン（プロミックＧＴ、協和醗酵工業社製）分散液３０ｍｌに、孔径０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過した上清３０ｍｌを加え、４０℃、１００ｒｐｍで４８時間インキュベートし、タンパク加水分解物を調製した。タンパク質を分解した後、反応物を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過し、１００℃、１０分間加熱処理を行ない、窒素可溶化率と遊離アミノ酸量を測定した。窒素可溶化率は、原料に含まれる総窒素に対するろ液の総窒素の割合とする。総窒素の測定は、ＮＡ２１００（サーモフィニガン社製）により測定した。測定値（％）は湿菌体重量（ｇ）で標準化し、３回の実験結果の平均値を算出した。結果を第４図に示す。遊離アミノ酸量の測定法はオルトフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法〔Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，６２，３６３（１９９８）〕に従った。測定した遊離アミノ酸量（ｍｍｏｌ／ｌ）は湿菌体重量（ｇ）で標準化し、３回の実験結果の平均値を算出した（図５）。その結果、親株と比較しＡｏｖｐｓ５遺伝子破壊株の培養液を用いて製造したタンパク加水分解物では、湿菌体重量（ｇ）あたりの窒素可溶化率および遊離アミノ酸量が有意に増加していることを見出した。したがって、Ａｏｖｐｓ５遺伝子の破壊株の培養液を用いることにより、従来より加水分解率の高いタンパク加水分解物を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、Ａｏｖｐｓ５遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該遺伝子の機能を抑制させた糸状菌、および該糸状菌を用いてタンパク加水分解率が顕著に上昇したタンパク加水分解物の作製方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−発明者：徳永税、斎藤知明
発明者：北本勝ひこ
配列番号６−縮重プライマーＶ５Ｐ−Ｆ
配列番号７−縮重プライマーＶ５Ｐ−Ｒ
配列番号９−ＰＣＲプライマーＶＰＳ５Ｆ
配列番号１０−ＰＣＲプライマーＶＰＳ５Ｒ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から、該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
配列番号２または３の塩基配列の連続する２０塩基以上の配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いて、請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１１】
配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡを用いて、請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１２】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることを特徴とする、液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製方法。
【請求項１３】
糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子破壊することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを転写させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドが請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に培養し、培地に赤褐色の色素を分泌する菌株を選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
【請求項１９】
糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に重金属を含む培地に培養し、重金属に対する耐性を有する菌株を選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
【請求項２０】
糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡのコード領域内に１つ以上のＤＮＡを挿入または欠失することにより、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌。
【請求項２５】
糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である請求項２４に記載の糸状菌。
【請求項２６】
アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである請求項２５に記載の糸状菌。
【請求項２７】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培地に培養し、培地中に液胞酵素を生成蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することを特徴とする液胞酵素の製造方法。
【請求項２８】
培地が固体培地である請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
培地が液体培地である請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３０】
液胞酵素がトリペプチジルペプチダーゼである請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法により製造された液胞酵素、または請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培養して得られる液胞酵素を含む培養物または培養処理物を、基質となるタンパク質に作用させることを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
【請求項３２】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を、基質となるタンパク質を含む培地に培養することを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法で製造されたタンパク加水分解物。
【請求項３４】
請求項３３に記載のタンパク加水分解物を含有することを特徴とする調味料。
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２または３の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２または３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から、該ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
配列番号２または３の塩基配列の連続する２０塩基以上の配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを用いて、請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１１】
配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列を有するＤＮＡおよび配列番号２または３の塩基配列の連続する１５塩基以上の配列と相補的な配列を有するＤＮＡを用いて、請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１２】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドの機能を抑制させることを特徴とする、液胞酵素を細胞外に分泌する糸状菌の作製方法。
【請求項１３】
糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子破壊することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡを転写させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
糸状菌のゲノム中の、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドのドミナントネガティブ変異体を発現させることにより、該ポリペプチドの機能を抑制させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドが請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に培養し、培地に赤褐色の色素を分泌する菌株を選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
【請求項１９】
糸状菌を、ゲノムに突然変異を誘発させた後に重金属を含む培地に培養し、重金属に対する耐性を有する菌株を選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの機能が抑制された糸状菌の取得方法。
【請求項２０】
糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡのコード領域内に１つ以上のＤＮＡを挿入または欠失することにより、液胞酵素を細胞内に局在させる活性を有するポリペプチドをコードしなくなったＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌。
【請求項２５】
糸状菌がアスペルギルス属に属する糸状菌である請求項２４に記載の糸状菌。
【請求項２６】
アスペルギルス属に属する糸状菌がアスペルギルス・オリゼである請求項２５に記載の糸状菌。
【請求項２７】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培地に培養し、培地中に液胞酵素を生成蓄積させ、該培地から液胞酵素を採取することを特徴とする液胞酵素の製造方法。
【請求項２８】
培地が固体培地である請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
培地が液体培地である請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３０】
液胞酵素がトリペプチジルペプチダーゼである請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法により製造された液胞酵素、または請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を培養して得られる液胞酵素を含む培養物または培養処理物を、基質となるタンパク質に作用させることを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
【請求項３２】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法で得られる糸状菌を、基質となるタンパク質を含む培地に培養することを特徴とするタンパク加水分解物の製造方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法で製造されたタンパク加水分解物。
【請求項３４】
請求項３３に記載のタンパク加水分解物を含有することを特徴とする調味料。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１３７
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５２５１（Ｐ２００５−５０５２５１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４７８９
【国際出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５１４４５８８）協和発酵フーズ株式会社 (50)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４７８９
【国際出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５１４４５８８）協和発酵フーズ株式会社 (50)
【Ｆターム（参考）】
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