新規酵母およびそれを用いたΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンの製造方法
【課題】コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールなどのΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを効率よく製造する方法を提供すること。
【解決手段】アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母を用いてΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造する。
【解決手段】アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母を用いてΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の中間体等として有用なΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造する酵母およびそれを用いたΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロール類は動物、植物、真菌類に含まれている生命活動に必須の物質であり、細胞膜に遊離型ステロールの状態で含まれるほか、一部は脂肪酸とのエステル型として貯蔵される。このうち、Ｃ５，７−ジエン体ステロールはコレステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールであるが、その中でもコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オール（別名、７−デヒドロデスモステロール、以下、TEOLと称する）は医薬品であるケノデオキシコール酸やウルソデオキシコール酸の合成原料として用いられるなど、医薬品の中間体などとして非常に有用な物質である。
【０００３】
また、11β,17α,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン（ハイドロコルチゾン）は、その前駆物質であるプレグネノロン、プロゲステロン、７−デヒドロプレグネノロンとともに、医薬および医薬中間体として産業上有用な化合物である。プレグネノロンの既存の製造法として、コレステロールやジオスゲニン、スティグマステロールといった天然由来のステロール化合物を原料として、複数の有機合成反応により合成する方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
従来、Ｃ５，７−ジエン体ステロールは動物組織の抽出物から精製されたものが使用されている。一方で、酵母等の真菌類においてエルゴステロールの生合成経路が明らかにされる（非特許文献２）につれて、近年ではその生合成経路を改変して特定のステロールを蓄積させるという研究が進められている。
【０００５】
酵母、カビ等の真菌類において、エルゴステロール生合成酵素欠損株あるいはエルゴステロール生合成酵素遺伝子の過剰発現によりステロール組成を変えた研究例がいくつか報告されている。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエでステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を欠損させることにより、側鎖２４位にメチル基を持たないステロールのみが蓄積するようにした例（非特許文献３）や、酵母でステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を欠損させアラビドプシスのΔ７−ステロールリダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変し、エルゴスタ−５，２４−ジエノール、エルゴスタ−５−エネノール、エルゴスタ−５，２２−ジエノールが蓄積するようにした例が報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
また、特許文献１では、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化され、ステロールΔ７−リダクターゼ、および／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）を培養し、培養物からステロール類を採取する方法が開示されている。
【０００７】
一方、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼはステロール化合物のエステル化を触媒する酵素であり、ステリルエステル加水分解酵素はステリルエステルの加水分解を触媒する酵素である。アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であるARE1の発現を強化した酵母は非特許文献５に開示されており、ス
テリルエステル加水分解酵素活性を有するYEH1のＣ末端にプロテインＡを付加した融合タンパク質を導入した酵母が非特許文献６に開示されている。しかしながら、これらの文献ではARE1やYEH1の発現強化のＣ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール産生への効果については記載されておらず、また、ARE1とYEH1の両方の発現を強化した酵母はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004-141125号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Org. Chem. 44, 1582-1584 (1979)
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 635-646（2004）
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 509-517（1988）
【非特許文献４】J. Biol. Chem. 271（18）, 10866-10873（1996）
【非特許文献５】Science 272, 1353-1356（1996）
【非特許文献６】Biochim. Biophys. Acta 1791, 118-124（2009）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｃ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを効率よく産生する改変酵母を提供すること、およびこれを用いてＣ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。
上記のとおり、ステロール化合物はその大半がエステル体として細胞内に蓄積される。従って所望のステロール化合物を効率よく蓄積させるにはステロール化合物のエステル化を促進することが重要と一般的には考えられ、当業者であれば、Δ５，７−ステロールを効率よく産生するためにはステロールをエステル化するアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性のみを増強し、逆にそのエステル体の加水分解を促進するステリルエステル加水分解酵素を低減化する、または改変しないと考えられる。しかしながら、本発明者らは、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子だけでなく、ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現も同時に増強することを試みたところ、意外なことに、これらの両遺伝子の発現を増強することにより非常に効率よくΔ５，７−ステロールを産生させることができることを見出した。また、さらに酵母を改変することでハイドロコルチゾンも製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母。
[２]さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）及びステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低減するように改変された、[１]に記載の酵母。
[３]さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）の発現が低減するように改変された、[１]に記載の酵母。
[４]さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性から選択される少なくとも一つの活性を有
するように改変された[３]に記載の酵母。
[５]さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール３位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性を有するように改変された[３]に記載の酵母。
[６]サッカロミセス・セレビジエである、[１]〜[５]のいずれかに記載の酵母。
[７]親株がサッカロミセス・セレビジエYPH499株、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株、サッカロミセス・セレビジエKA311A株またはサッカロミセス・セレビジエX2181-1B株である、[６]に記載の酵母。
[８] [１]〜[３]のいずれかに記載の酵母を培養してΔ５，７−ステロールを生成・蓄積させ、Δ５，７−ステロールを回収する、Δ５，７−ステロールの製造方法。
[９]培養する酵母が[１]又は[２]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがＣ５，７−ジエン体ステロールである、[８]に記載の方法。
[１０]Ｃ５，７−ジエン体ステロールがコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールまたは７−デヒドロコレステロールである、[９]に記載の方法。
[１１]培養する酵母が[１]又は[３]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴスタ−5,7,24-トリエノールである、[８]に記載の方法。
[１２]培養する酵母が[１]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴステロールである、[８]に記載の方法。
[１３] [５]に記載の酵母を培養してハイドロコルチゾンを生成・蓄積させ、ハイドロコルチゾンを回収する、ハイドロコルチゾンの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の酵母を用いることにより、Δ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを産生させることができる。本発明の方法によってΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造し、これらを用いて医薬を合成すれば、医薬の製造プロセスの効率化にも寄与すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。「C7,24」はコレスタ−７,２４−ジエン−３β−オールを表し、「ZYMO」はザイモステロールを表し、「その他」はその他のステロール類を表す。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１３）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１６）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３１７）を示す。いずれもＹＰＨ４９９を親株として作製された株である。
【図２】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１２）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３２０）を示す。ＳＸ１３１９、ＳＸ１３２０については３クローンずつ評価した。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図３】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３０７）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２１）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３２２）を示す。いずれもＫＡ３１１Ａを親株として作製された株である。
【図４】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５３）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５０）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３５１）を示す。いずれもＸ２１８１−１Ｂを親株として作製された株である。
【図５】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）、他はいずれもＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株であり、ＹＥＨ１ ｌｏｃｕｓは、ＹＥＨ１をＹＥＨ１のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２０）、ＵＲＡ３ ｌｏｃｕｓはＹＥＨ１をｕｒａ３のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３３２）、ＬＥＵ２ ｌｏｃｕｓは、ＹＥＨ１をｌｅｕ２のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２５）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図６】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも導入していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３３５）、他はいずれもＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株であり、ＡＲＥ１ ｌｏｃｕｓは、ＡＲＥ１をＡＲＥ１のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２０）、ＵＲＡ３ ｌｏｃｕｓはＡＲＥ１をｕｒａ３のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３３３）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図７】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ２とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ２とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ２とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３３５）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ２は、ＡＲＥ２のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４７）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ２ＹＥＨ１は、ＡＲＥ２とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３４６）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図８】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。「ERGO」はエルゴステロールを表し、「ZYMO」はザイモステロールを表し、「その他」はその他のステロール類を表す。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していない株（ＳＸ１３４８）、ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入した株（ＳＸ１３３８）、ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入した株（ＳＸ１３３７）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
（１）本発明の酵母
本発明の酵母は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強するように改変された酵母である。
【００１７】
本発明において、Δ５，７−ステロールはステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールを意味し、好ましくはエルゴステロールおよびＣ５，７−ジエン体ステロールである。また、Ｃ５，７−ジエン体ステロールはコレステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールを意味するが、TEOL（コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オール）、7-デヒドロコレステロールが好ましく、TEOLが特に好ましい。また、ハイドロコルチゾンを目的生成物とする場合には、エルゴスタ−5,7,24−トリエノールが好ましい。Δ５，７−ステロールやＣ５，７−ジエン体ステロールには、それぞれΔ５，７−ステロールやＣ５，７−ジエン体ステロールのエステル体も含まれる。
【００１８】
また、本発明において「アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子」とは、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を意味し、「ステリルエステル加水分解酵素遺伝子」とは、ステリルエステル加水分解酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を意味する。
【００１９】
「アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強した」とは、非改変株または親株と比較してアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強したことを意味する。アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の増強は、非改変株または親株と比較して、単位菌体重量当たり5倍以上増強されていることが好ましく、10倍以上増強されていることがより好ましい。
なお、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼは、ステロールのエステル化反応を触媒する酵素であり、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は定量PCR法などによって測定することができる。
【００２０】
「ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強した」とは、非改変株または親株と比較してステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強したことを意味する。ステリルエステル加水分解酵素遺伝子発現の増強は、非改変株または親株と比較して、単位菌体重量当たり5倍以上増強されていることが好ましく、10倍以上増強されていることがより好ましい。
なお、ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現は定量PCR法などによって測定することができる。
【００２１】
本発明に用いる酵母は、以下に示すような酵母を親株として用い、該親株を改変することによって得ることができる。
親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、または、ピキア属に属する酵母であることが好ましく、例えば、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichoderma reesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）が挙げられる。
【００２２】
これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいことからサッカロミセス属が好適である。さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、以下の株が例示される。
サッカロミセス・セレビジエYPH499株（MATa ura3 lys2 ade2 trp1 his3 leu2）（ATCC204679：American Type Culture Collection又はSTRATAGENE社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株（MATα ura3 leu2 trp1 his3）（Euroscarf社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエX2181-1B株（MATalpha his2 gal1 trp1 ade1
MAL SUC）（ATCC204822：American Type Culture Collectionより入手できる）。あるいは、サッカロミセス・セレビシエKA311A株（MATa his3 leu2 trp1 ura3）（Mol. Cell Biol. 13, 307-3083（1993））も用いることができ、KA311A株は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：FERM P-19053として寄託されている。
【００２３】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、遺伝子組換え法、例えば、該酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、またはこの遺伝子のプロモーターを置換することによってこれらの遺伝子の発現量を増大させることによって行うことができる。
【００２４】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、ARE1遺伝子やARE2遺伝子が挙げられる。ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、多くの微生物で知られており、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号４３または４５の塩基配列を有するサッカロミセス・セレビジエ由来の遺伝子を挙げることができる。また、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号４３または４５の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、またはこれらの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
また、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、それぞれ配列番号４４または４６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００２６】
さらに、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、配列番号４４または４６のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、アシル
ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、１または数個とは、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。
【００２７】
また、サッカロミセス・セレビジエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のARE1遺伝子およびARE2遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはホモロジー等に基づいてアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００２８】
ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、YEH1遺伝子が挙げられる。YEH1遺伝子は、多くの微生物で知られており、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号４７の塩基配列を有するサッカロミセス・セレビジエ由来の遺伝子を挙げることができる。また、YEH1遺伝子は、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号４７の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、またはこれらの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件は、上記のとおりである。
【００２９】
また、YEH1遺伝子は、それぞれ配列番号４８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、YEH1遺伝子は、配列番号４８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、１または数個とは、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。
【００３０】
また、サッカロミセス・セレビジエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のYEH1遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のYEH1遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはホモロジー等に基づいてステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００３１】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現を増強するためには、例えば、上記のようなDNAを宿主酵母で機能しうるプラスミドに発現可能に組込み、宿主酵母に導入すればよい。
【００３２】
上記遺伝子を組込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主酵母内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）などが
挙げられる。これらのベクターは市販されており容易に入手可能である。
【００３３】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００３４】
ARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を、上記したような酵母内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組換えベクターで、サッカロミセス・セレビジエなどの酵母を形質転換することにより、これらの遺伝子の発現が増加した酵母が得られる。
【００３５】
形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができる。
また、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上でARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 9, 1382-1385（1991））が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を含む発現単位の挿入箇所は、ステロール生合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。具体的には、ARE1遺伝子を適当なプロモーターの制御下となるように連結させたDNAを、宿主ゲノム上のARE1遺伝子座上などに挿入し、宿主ゲノム中のARE1遺伝子が２コピーとなるようにして、さらにYEH1遺伝子も同様のプロモーターの制御下となるように連結させたDNAを宿主ゲノム上のYEH１遺伝子座などに挿入して宿主ゲノム中のYEH1遺伝子が２コピーとなるようにゲノムを改変する方法などが好ましく用いられる。
【００３６】
また、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、宿主ゲノム上でARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。
上記組換えプラスミドによる導入または染色体上への相同組換えにおいて、ARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を発現させるためのプロモーター、または染色体上のARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子のプロモーターを置換するために使用するプロモーターは、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、３−フォスフォグリセレートキナーゼ１遺伝子のプロモーター（以下、「ＰＧＫ１プロモーター」と称することがある）あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーター、ないしは、GAL1やGAL10（Mol. Cell Biol. 4（8）, 1440-1448（1984））などの誘導型プロモーター（例えば、STRATAGENE社製）などが挙げられる。
【００３７】
なお、本発明の酵母は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強に加えて、他の酵素遺伝子の発現が非改変株と比べて増強または低下するように改変されたものでもよい。
他の酵素の改変は目的とするΔ５，７−ステロールの種類により適宜選択される。
【００３８】
例えば、TEOLを生産する場合、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）とステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低下するように改変することが好ましい。これらの改変は特開2004-141125に記載されている。
また、Δ５，７−ステロールとしてのエルゴスタ−5,7,24−トリエノールを中間体とし
てハイドロコルチゾンを目的生成物とする場合には、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）のみの発現が低下するように改変することが好ましい。
【００３９】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼは、各種ステロール類の側鎖の２２位に二重結合を導入する能力を有する酵素であり、具体的には、例えばコレスタ−５，７，２４−トリエノールをコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに、エルゴスタ−５，７−ジエノールをエルゴスタ−５，７，２２−トリエノールに、エルゴスタ−５，２４−ジエノールをエルゴスタ−５，２２，２４−トリエノールに、エルゴスタ−５，７，２４−トリエノールをエルゴスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００４０】
また、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンから各種ステロール類の２４位にメチル基を転移させる能力、さらには転移により付加されたメチル基にさらにメチル基を転移させる能力を有する酵素であり、具体的には、例えばザイモステロールをフェコステロールに変換する能力を有する酵素を指す。
これら酵素をコードする遺伝子は、既に単離され塩基配列が決定されているものもあり、例えば、ステロールＣ−２２デサチュラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されており（Biochem. Biophys. Acta 1299, 313-324（1996））、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されている（Gene 169, 105-109（1996））。
【００４１】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性低減化方法としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学物質あるいはＵＶなどの変異源処理によって得られた両酵素遺伝子の欠損突然変異株を交配する方法、両遺伝子の転写をアンチセンス遺伝子の導入によりおさえる方法、両遺伝子の転写産物をＲＮＡｉ技術によって抑制する方法、両酵素の特異的阻害剤で酵素活性を抑える方法などを用いることができる。
【００４２】
酵母においては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをそれぞれコードしている遺伝子断片中に、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ＤＮＡないしはジェネティシンやオーレオバシジンＡなどの抗生物質や抗真菌薬に対する耐性遺伝子が挿入された遺伝子断片、あるいはその遺伝子断片がさらにベクターに挿入されたプラスミドを作製し、相同組換えにより宿主染色体中の該遺伝子を破壊する方法が好適に用いられる。
【００４３】
例えば、サッカロミセス・セレビシエにおいては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片を制限酵素切断ないしはポリメラーゼチェーンリアクション法（以下これを「ＰＣＲ」と略称することがある）によって得てベクターに組み込んで中間ベクターを作製する。この中間ベクターをＥＲＧ５遺伝子およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子内部にある任意の制限酵素部位で２つに切断し、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ｃＤＮＡのいずれか１つを２つの中間ベクター同士で重ならないように選択し挿入することにより遺伝子破壊用ベクター、ないしはそれをＰＣＲで増幅して得られる遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を作製する。次いでこの遺伝子破壊用ベクターないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を酵母に遺伝子導入することで相同組換えを誘発し、目的遺伝子を破壊することができる。
【００４４】
かくして構築される遺伝子破壊用ＤＮＡ断片若しくは遺伝子破壊用ベクターの具体例として、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＴＲＰ１遺伝子が挿
入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７６ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＨＩＳ３遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３（特開2004-141125号公報を参照）等が挙げられる。
【００４５】
酵母における遺伝子破壊の確認は、特定の栄養要求性遺伝子が挿入された遺伝子部分が相同組換えにより酵母ゲノム中に組み込まれるために、宿主株が持っていた複数の栄養要求性のうち該当する栄養要求性が消失することで知ることができる。さらにＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の５'末端と３'末端にそれぞれ設定したＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子破壊操作を受けた酵母株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片の長さが挿入した栄養要求性遺伝子の長さだけ大きくなっていることを確認することにより遺伝子破壊の確認を行うことができる。
かくして得られる遺伝子破壊株の具体例としては、遺伝子破壊用ベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１のｅｒｇ５：：ＴＲＰ１断片でＥＲＧ５遺伝子を破壊した、サッカロミセス・セレビシエＫＡΔ５−５株、さらに該Δ５−５株のＥＲＧ６遺伝子をｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３のｅｒｇ６：：ＨＩＳ３断片で破壊したＫＡΔ５Δ６−１株、ＫＡΔ５Δ６−４株、ＫＡΔ５Δ６−５株等が挙げられる。
さらに、本発明の酵母としては、以下の（３）に記載の酵母も含まれる。
【００４６】
（２）Δ５，７−ステロールの製造方法
上記で説明した本発明の酵母を炭素源、窒素源、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気条件下、温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば、酵母菌体中にΔ５，７−ステロールが蓄積するのでこれを採取する。
【００４７】
炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、フルクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜、などの炭水化物、酢酸、ピルビン酸、メバロン酸などの各種有機酸が使用できる。さらに酵母の資化性によって、炭化水素、アルコールなども用いられる。特に廃糖蜜は好適にもちいられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、または塩化アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの各種無機塩および有機アンモニウム塩類あるいはペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など種々のものが使用可能である。
無機塩としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを使用する。ビタミン、アミノ酸としては、使用する酵母の種類によってことなるが、必要に応じ添加する。また使用する菌株が、栄養要求性を示す場合は、その要求物質を添加する。
【００４８】
培養は使用する菌株に応じて適切な条件で行うが、通常は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。生産株として、サッカロミセス・セレビシエを用いる場合は、培養温度は２０〜４０℃が好適であり、培地のｐＨは弱酸性付近に維持する事が望ましい。培養期間は通常１〜１５日間で菌体中にΔ５，７−ステロールが蓄積する。また、培養期間中に上記に記載した炭素源や窒素源、無機塩、ビタミン、アミノ酸を連続的、あるいは断続的に添加する流加培養や連続培養を行うことにより、菌体の生育やΔ５，７−ステロールの蓄積をさらに伸ばすことが可能である。
【００４９】
培養終了後のΔ５，７−ステロールの抽出は一般に生物組織からステロール類を抽出する方法により行うことができる。具体的には、例えば、菌体を海砂とともにそのままアセトン中で破砕し酢酸エチルで抽出するか、又は、２ＭのＮａＯＨを含む５０％エタノール中で２時間煮沸し鹸化したのちヘプタンないしはクロロホルム／メタノール／水（体積比８６：１６：１）混液で抽出し、薄層クロマトグラフィーにかけステロール画分を掻き取
って、窒素気流下で乾燥させメタノール／クロロホルム混液に溶解することで総ステロールを菌体から抽出することができる。
【００５０】
次いでステロールの種類の同定は、薄層クロマトグラフィーで分離抽出したステロール画分を、それ自体公知の適当な溶媒およびカラムの組み合わせでガスクロマトグラフィーないしは高速液体クロマトグラフィーにかけて、現れるピークの保持時間を標準試料の保持時間と比較することで行うことができる。また、同定された各種ステロールの総ステロール中にしめる割合は各ピークの面積から算出することができる。さらに、これらの主要なステロールのピークが目的化合物であることの確認は、マススペクトロメトリーを用いて、分子量および開裂パターンを調べることで行うことができる。また、ＧＣ−ＭＳあるいはＨＰＬＣ−ＭＳを用いることによりさらに効率よく抽出されたステロール類を同定することができる。
【００５１】
得られたΔ５，７−ステロールは各種医薬等の中間体となりうる。
例えば、TEOLはケノデオキシコール酸やウルソデオキシコール酸の合成原料として有用である。特開2007-210888号公報および特開2006-056877号公報に、TEOLからのウルソデオキシコール酸の合成方法が開示されている。
具体的には、TEOLを原料として、以下の４つの工程、すなわち
（Ｉ）３位水酸基の酸化と５位２重結合の４位への異性化を行う工程
（ＩＩ）側鎖の酸化的切断により２４位をカルボキシル基またはそのエステル誘導体とする工程
（ＩＩＩ）７位に酸素官能基を導入する工程
（ＩＶ）４位２重結合の還元飽和化による５β立体構築を行う工程
を経て５β−３，７−ジオキソコラン酸を製造し、これを還元することによってウルソデオキシコール酸を製造することができる。
５β−３，７−ジオキソコラン酸のウルソデオキシコール酸への還元反応は、金属還元または接触水素化によって行うことができる。また、５β−３，７−ジオキソコラン酸からウルソデオキシコール酸への変換は、特開昭60-228500号公報及び特開平5-32692号公報の記載を参酌して行うことができる。
【００５２】
（３）ハイドロコルチゾンの製造方法
上記酵母で、以下の活性を有するものを上記（２）と同様にして培養することによりハイドロコルチゾンが生成される。活性を有する酵母とは、該酵母自体がそれぞれの活性を有していてもよいし、該活性を有する物質を培養液中に添加してもよいし、該活性を有する酵母の菌体あるいはその処理物を培養液中に添加することでもよい。
【００５３】
ハイドロコルチゾンの生成にさらに必要な活性とは、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド11β位水酸化活性である。本発明の酵母には、上記活性のうち少なくとも１つを有するものも含まれる。ハイドロコルチゾン生成を目的とする本発明の酵母としては、上記活性を有する蛋白質を生成するものが好ましく、また、発現するための遺伝子及びその活性に必要な補酵素などの遺伝子の全てを導入したものも好ましく挙げられる。上記活性を有する蛋白質を生成するためには、該蛋白質をコードするDNAを上記の発現ベクターに挿入して、上記酵母を形質転換した形質転換酵母を用いる方法が好ましく用いられる。
【００５４】
ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性を有する蛋白質を生成する活性を獲得する方法としては、 (i) 例えば、WO2010/079594公報に記載の酵素蛋白質（CYP204A1やCYPSS204A）をコードする遺伝子やその他の遺伝子がコードする同様の活性を有する酵素遺伝子と、該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、およ
び該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子の混合物、あるいは(ii)上記酵素蛋白質と該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子が発現するように該酵母に遺伝子導入する方法などが挙げられる。
【００５５】
ここで、電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質は両者の活性を有する1種の蛋白質でもよい。例えば、Bacillus megateriumのP450-BM3遺伝子のP450還元酵素ドメインを酵素蛋白質（P450 2C11）に連結し、人工的に作製した融合蛋白質を利用できる（Helvig, C. and Capdevila, J. H., Biochemistry, (2000）39, 5196-5205)。
【００５６】
フェレドキシン還元酵素は、例えば以下の中から選択される。
ホウレン草由来のフェレドキシンレダクターゼ、
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシンレダクターゼ、
動物由来のアドレノドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシンレダクターゼ、
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンレダクターゼやフェレドキシンレダクターゼ、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシンレダクターゼ、
またはその他のフェレドキシンレダクターゼ。
【００５７】
フェレドキシンは、例えば以下の中から選択される；
ホウレン草由来のフェレドキシン、
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシン、
動物由来のアドレノドキシン、
ノボスフィンゴビウム サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシン、
ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシン、
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンやフェレドキシン、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシン、
またはその他のフェレドキシン型蛋白質。
【００５８】
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質、ステロール３位酸化異性化酵素蛋白質は、例えば、Molecular and Cellular Endocrinology 1990, 73, 73-80に記載のものが用いられる。
また、ステロールΔ７−還元酵素蛋白質は、Journal of Biological Chemistry 1996, 271, 10866-10873記載のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの、あるいはApplied and Environmental Microbiology 2007, 73, 1736-1741記載のモルティエレラ（Mortierella）属カビ由来ものが用いられる。
具体的には、ステロールΔ７−還元酵素蛋白質はシロイヌナズナ由来ＮＡＤＰＨ−ステロールΔ７−還元酵素モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）由来ステロー
ルΔ７−還元酵素（MoDELTA7SR）が好ましい。
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質は、例えば、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c17が好ましい。
また、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質は、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c21が好ましい。
ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質としてはウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c11やクルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）由来P-450lun等が好ましい。
さらにステロール３位酸化異性化酵素蛋白質はウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来３β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（3βHSD）やストレプトミセス（Streptomyces）属細菌由来コレステロール酸化酵素が好ましい。
【００５９】
ここで、好ましく用いられる酵母としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、ヤロウィア（Yarrowia）属酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属、モルティエレラ（Mortierella）属があげられる。より好ましくは、サッカロミセス属酵母があげられる。具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、より具体的には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）FY1679-28c株（JP2004-528827 A1）、以下同様に、FY1679-18b株（JP2004-528827 A1）、KA311A株(FERM:P-19053)、YPH499株(ATCC#204679)、YPH500株(ATCC#204680)等が挙げられ、それぞれの酵素蛋白質をコードするDNAは、pESC-LEU（Stratagene社）等の発現ベクターや酵母菌の染色体に挿入されていることが好ましい。
【００６０】
また、これらの酵母が、以下（1）−（5）の性質のいずれかまたはすべてを持つことが好ましい。
（1）ステロール−２２デサチュラーゼ蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２２位と２３位の間が不飽和化されない、
（2）ＮＡＤＰ−シトクロムＰ４５０還元酵素蛋白質の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、
（3）ステロールエステル加水分解酵素の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、
（4）ステロイド１７α水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、ステロイド１１β位水酸化酵素に電子を伝達するフェレドキシン型蛋白質および該蛋白質へ電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子をその発現制御領域とともに宿主細胞に導入することで、該蛋白質の発現が強化されている、
（5）ステロール−２４メチル基転移酵素蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２４位にメチル基が存在しない。
【００６１】
反応混合物からハイドロコルチゾンを分画する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離又は精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
また、上記で製造したハイドロコルチゾンからは、各種の誘導体を公知の方法で製造することができる。さらに、かくして製造されたハイドロコルチゾンおよびその誘導体は、それ自体既知の方法により試験管内、あるいは生体内における薬理学的または生理学的試験により、その医薬としての活性や安全性のスクリーニングを行なうことにより疾病治療薬とすることができる。この場合、上記工程により得た化合物を有効成分とする医薬組成物を製造する方法も本発明に含まれる。
【００６３】
具体的には、ハイドロコルチゾンそれ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。かくして得られる医薬化合物はそれ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、0.01〜90重量％の間で変動され得る。
【００６４】
本発明で得られたΔ５，７−ステロールやハイドロコルチゾンを含む医薬組成物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤等の剤形として経口的に投与してもよいし、あるいは薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁剤形等の注射剤として、例えば静脈内投与、筋肉内投与、局所内投与、皮下投与してもよい。また坐薬や舌下錠、経鼻、経肺製剤等の粘膜投与、さらには軟膏や貼付剤等の外用剤としての投与も可能である。経口、非経口の組成物を調製する場合には、有機または無機の固体または液体の担体、希釈剤とともに通常用いられる単位容量形態で混和することによって行うことができる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６５】
経口投与および粘膜投与のための固形製剤を製造する際に用いられる賦形剤としては、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム等が用いられる。経口投与のための液体製剤、すなわちシロップ剤、懸濁剤、液剤等は、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水、植物油等を含む。この製剤は、不活性な希釈剤以外に補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、安定剤等を含むこともできる。注射剤、粘膜投与剤等の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、レシチン等が挙げられる。坐剤に用いられる基剤としては、例えばカカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂、ウィテップゾール等が挙げられる。外用剤の製造には、溶解剤または溶解補助剤としてアルコ−ル、脂肪酸エステル類、プロピレングリコール等が、粘着剤としてカルボキシビニルポリマ−、多糖類等が、乳化剤として界面活性剤等などが使用される。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）
サッカロミセス・セレビジエ ＹＰＨ４９９、ＦＹ１６７９−０６ｃ株、ＫＡ３１１Ａ株、Ｘ２１８１−１Ｂ株のｅｒｇ５およびｅｒｇ６遺伝子の二重破壊及びARE1およびYEH1増強株の作製
（１）酵母染色体ＤＮＡの調製
サッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣより入手 ＡＴＣＣ２０４５８）の染色体ＤＮＡは、特開2004-141125と同様の方法で調製された。
【００６８】
（２）遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の導入によるｅｒｇ５遺伝子破壊株ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６、ＳＸ１３３４の作製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子ＥＲＧ５破壊用のプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１（特開２００４−１４１１２５号公報を参照）を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（タカラバイオ社製、以下、特に記載のない限り、制限酵素はタカラバイオ社製である）とＫｐｎ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片をサッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｙｓ２ ａｄｅ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手）とＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ
社より入手）、Ｘ２１８１−１Ｂ（ＭＡＴａｌｐｈａ ｈｉｓ２ ｇａｌ１ ｔｒｐ１ ａｄｅ１ ＭＡＬ ＳＵＣ）（ＡＴＣＣより入手）に酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）、もしくはエレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）で形質転換し、ＹＰＨ４９９株は各２０ｍｇ／ｌのアデニン、Ｌ−ヒスチジン、ウラシル、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、ＦＹ１６７９−０６ｃ株は各２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジン、ウラシル、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、Ｘ２１８１−１Ｂ株は２０ｍｇ／ｌ アデニンをそれぞれ含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００６９】
寒天培地上に生育してきたトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％
酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＴＲＰ１−ｏｕｔＦ（配列番号１）とリバースプライマーＥＲＧ５−Ｄ３１（配列番号２）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ５遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて（１）９４℃、２分、（２）９４℃、１分、（３）５３℃、１分、（４）７２℃、３分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返した後、４℃で冷却の条件で反応を行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５−５株、およびＹＰＨ４９９株、ＦＹ１６７９−０６ｃ株、Ｘ２１８１−１Ｂ株の染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００７０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１１（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３０６（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３３４（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．９３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６、ＳＸ１３３４株は相同組換えによりＥＲＧ５遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００７１】
（３）ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６株への遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の導入、およびＳＸ１３３４株への遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２の導入によるｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、ＳＸ１３４０株の作製
（i）遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３導入によるｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２株の作製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＥＲＧ６破壊用のプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３（特開2004-141125を参照）を制限酵素ＳｃａＩとＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡ断片を上記（２）で作製したＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＸ１３１１株は各２０ｍｇ／ｌのアデニン、ウラシル、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、ＳＸ１３０６株は２０ｍｇ／ｌ ウラシル、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンをそれぞれ含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００７２】
寒天培地上に生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、 ２％ポリペプトン、 ２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−Ｕ５２（配列
番号３）とリバースプライマーＥＲＧ６−Ｄ３４（配列番号４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５Δ６−１株、およびＹＰＨ４９９株、ＦＹ１６７９−０６ｃの染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００７３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１３（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１２（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．７８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１３，ＳＸ１３１２株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００７４】
（ii）破壊用ＥＲＧ６、酵母発現用ＨＩＳ２遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片、ＨＩＳ２遺伝子を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
【００７５】
ＥＲＧ６遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ６−５Ｌ（配列番号５）とリバースプライマーＥＲＧ６−３Ｌ（配列番号６）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ６の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの２３８塩基前から終始コドンの２５８塩基後までを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
ＨＩＳ２遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＨＩＳ２−Ｆ（配列番号７）とリバースプライマーＨＩＳ２−Ｒ（配列番号８）を用いた。このプライマーの組み合わせでＨＩＳ２の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４３０塩基前から終始コドンの２９０塩基後までを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＳｍａＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、２分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．６５ｋｂｐのＥＲＧ６遺伝子断片を、約１．７３ｋｂｐのＨＩＳ２遺伝子断片を確認した。
【００７６】
（iii）ｅｒｇ６破壊用プラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２の作製
ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、上記（ii）でＰＣＲ合成したＥＲＧ６遺伝子断片をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＨｉｎｃIIによる切断で、約０．６４ｋｂｐと３．６６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｌと名付けた。
次に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）のクローニングサイトに上記（ii）でＰＣＲ合成したＨＩＳ２遺伝子断片をダイレクトクローニングにより連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｓｍ
ａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約３．０ｋｂｐと１．７３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＨＩＳ２と名付けた。
【００７７】
さらに、上記ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｌを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉで切断し、ｃｌｏｎｅｄ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行った後に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＨＩＳ２を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断し、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｃａＩによる切断で、約１．７１ｋｂｐと１．６７ｋｂｐ、１．８９ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２と名付けた。
【００７８】
（iv）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株ＳＸ１３４０の作製
上記（iii）で作製したＥＲＧ６破壊用のプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した。このＤＮＡ断片を上記（２）で作製したＳＸ１３３４株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ アデニンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００７９】
寒天培地上に生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、 ２％ポリペプトン、 ２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−Ｕ５２（配列番号３）とリバースプライマーＥＲＧ６−Ｄ３４（配列番号４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（i）で述べた条件で行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５Δ６−１株、およびＸ２１８１−１Ｂ株の染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４０と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．７６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４０株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００８０】
（４）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株へのＡＲＥ１遺伝子導入株の作製
（i）酵母発現用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵの作製
酵母細胞内で外来遺伝子を構成的に発現させるための３−ホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーター領域は、サッカロミセス・セレビジエＫＡ３１１Ａ株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３）の染色体ＤＮＡを鋳型にし、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−５Ａ（配列番号９）、リバースプライマーＰＰＧＫ１−３Ａ（配列番号１０）を用いたＰＣＲにて合成した。このプライマーの組み合わせで５'側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、３'側に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて（１）９４℃、２分、（２）９４℃、１分、（３）５５℃、１分、（４）７２℃、１分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、４分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約０．６ｋｂｐのＰＧＫ１プロモーターのＤＮＡ断片を確認した。
このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結した。連結物を用
いてエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出を行った。
得られたプラスミドをＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＰＧＫ１プロモーター）をGENE CLEAN II KIT（フナコシ社製）により抽出した。
【００８１】
一方、酵母発現用ベクターｐＡＤＮＳΔＥ（特開2004-141125）も同じくＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約６．５８ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出した。
上記２つのＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、エッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により約７．２ｋｂｐを確認したプラスミドを目的プラスミドとし、ｐＰＧ−ＬＥＵと名付けた。ｐＰＧ−ＬＥＵはプロモーターとしてＰＧＫ１プロモーター、ターミネーターとしてアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）由来のＡＤＨ１ターミネーターを持つ。
【００８２】
（ii）酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）の作製
上記（i）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵを制限酵素Ｈｐａ ＩとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断し、アガロースゲルから約５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出することで２μｍ
ＤＮＡを除き、得られたＤＮＡ断片を自己連結し、エッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により約５．４ｋｂｐを確認したプラスミドを目的プラスミドとし、ｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）と名付けた。
【００８３】
（iii）酵母発現用のＡＲＥ１、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡＲＥ１）を含むＤＮＡ断片、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＡＲＥ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＲＥ１−Ｓｍａ
Ｉ（Ｆ）（配列番号１１）とリバースプライマーＡＲＥ１−ＥｃｏＲ Ｉ（Ｒ）（配列番号１２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＲＥ１の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５'側には制限酵素Ｓｍａ Ｉの認識配列を、３'側にはＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。 ＵＲＡ３遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＵＲＡ３−２Ｆ（配列番号１３）とリバースプライマーＵＲＡ３−１Ｒ（配列番号１４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＵＲＡ３の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの２５４塩基前から終始コドンの１７８塩基後までを増幅することができる。また、合成された遺伝子断片中には開始コドンの２２３塩基前と終始コドンの１３６塩基後にＨｉｎｄ ＩＩＩの認識配列が含まれた形で合成される。ＡＤＥ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＤＥ１−Ｆ（配列番号１５）とリバースプライマーＡＤＥ１−Ｒ（配列番号１６）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＤＥ１の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの３４６塩基前から終始コドンの３１２塩基後までを増幅することができる。また、合成された遺伝子断片中には終始コドンの１０６塩基後にＥｃｏＲＶの認識配列が含まれた形で合成される。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．８３ｋｂｐのＡＲＥ１遺伝子断片を、約１．２３ｋｂｐのＵＲＡ３遺伝子断片を、約１．５７ｋｂｐのＡＤＥ１遺伝子断片を確認した。
【００８４】
（５）ＡＲＥ１発現用プラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）、ｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）の作製
上記（２）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、ＰＣＲ合成したＡＲＥ１遺伝子断片をＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．８３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）と名付けた。
【００８５】
次に、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＵＲＡ３遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断で、約２．６８ｋｂｐと１．２３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ＵＲＡ３と名付けた。
【００８６】
また、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のクローニングサイトに上記（iii）でＰＣＲ合成したＡＤＥ１遺伝子断片をダイレクトクローニングにより連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｐｅＩとＰｓｔＩによる切断で、約３．４７ｋｂｐと１．６２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＣＲ−Ｂ−ＡＤＥ１と名付けた。
【００８７】
続いて、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＸｂａＩとＳｍａＩで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行った後に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＣＲ−Ｂ−ＡＤＥ１をＳｐｅＩとＥｃｏＲＶで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約１．０１ｋｂｐと０．３９ｋｂｐ、２．６８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１と名付けた。
【００８８】
さらに、上記ｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）をＳｓｐＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＵＣ−ＵＲＡ３をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったもの、上記ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１をＰｓｔＩとＫｐｎＩで切断し、ｃｌｏｎｅ
ｄ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものとをそれぞれＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＰｓｔ Ｉによる切断で、約３．５６ｋｂｐと３．０７ｋｂｐの断片が確認できたもの、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉによる切断で、約３．７４ｋｂｐと１．２９ｋｂｐ、１．８５ｋｂｐの断片が確認できたものをそれぞれ目的プラスミドとして、ｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）、ｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）と名付けた。
【００８９】
（６）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、ＫＡΔ５−４、ＳＸ１３４０へのＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５、ＳＸ１３５０株の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５−４（以後、ＳＸ１３０７と記載する）のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記（３）で作製したＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２株、ＳＸ１３０７株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＳＸ１３１３株の形質転換を行ったＳＤ寒天培地にのみ２０ｍｇ／ｌ アデニン、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジンを添加した。
【００９０】
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【００９１】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１４（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１８（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３１５（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【００９２】
さらに、ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３４０のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、上記と同様に以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。また、ＡＲＥ１を導入していない対照株を作製するため、上記（５）で作製したｐＵＣ１９−ＡＤＥ１を制限酵素ＨｐａＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（３）で作製したＳＸ１３４０株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ
寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００９３】
寒天培地上に生育してきたアデニンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【００９４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５０（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５０株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
また、ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１をＨｐａＩで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＡＤＥ１−１Ｆ（配列番号１９）とリバースプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＤＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５３と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５３株は相同組換えによりＡＤＥ１遺伝子が相補されたことが確認された。
【００９５】
（７）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株へのＹＥＨ１遺伝子導入株の作製
（i）酵母発現用のＹＥＨ１、ＧＡＬ１遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子（ＹＥＨ１）を含むＤＮＡ断片、ＧＡＬ１を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＹＥＨ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＹＬＬ−ＯＦ（配列番号２１）とリバースプライマーＹＬＬ−ＯＲ（配列番号２２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＹＥＨ１の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５'側と３'側の両側に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００９６】
ＧＡＬ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＧＡＬ１−５１（配列番号２３）とリバースプライマーＧＡＬ１−３１（配列番号２４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＧＡＬ１の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４９９塩基前から終始コドンの２３０塩基後までを増幅することができる。また、５’側と３’側の両側に制限酵素ＳｍａＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００９７】
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．７２ｋｂｐのＹＥＨ１遺伝子断片を、約２．３３ｋｂｐのＧＡＬ１遺伝子断片を確認した。
【００９８】
（ii）ＹＥＨ１発現用プラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）、ｐＰＧＧＡＬ−ＹＥＨ１（−２μ）の作製
上記（４）(ii)で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＹＥＨ１遺伝子断片をＥｃｏＲ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．７２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【００９９】
次に、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＳｍａＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＧＡＬ１遺伝子断片をＳｍａＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＰｖｕIIによる切断で、約０．４８ｋｂｐと０．７２ｋｂｐ、１．４５ｋｂｐ、２．３６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ１９−ＧＡＬ１と名付けた。
続いて、上記ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＳｓｐＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＵＣ１９−ＧＡＬ１をＳｍａＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約３．３０ｋｂｐと２．６６ｋｂｐの断片が確認でき、さらに制限酵素ＳｃａＩによる切断で、約１．２８ｋｂｐと４．６８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧ−ＧＡＬ１（−２μ）と名付けた。さらに、上記ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＢａｍＨＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＰＧ−ＧＡＬ１（−２μ）をＢａｍＨＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＨｉｎｄIIIによる切断で、約０．３７ｋｂｐと０．５７ｋｂｐと０．１９ｋｂｐと３．７３ｋｂｐと２．８２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＧＡＬ１−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【０１００】
（iii）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５、ＳＸ１３５０へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３１７、ＳＸ１３２０、ＳＸ１３２２、ＳＸ１３５１株の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加
水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｎｄｅ Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、（４）(ii)で作製した酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（６）で作製したＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＳＸ１３１４株に対して形質転換を行ったＳＤ寒天培地にのみ２０ｍｇ／ｌアデニン、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジンを添加した。
【０１０１】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１７（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３２０（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３２２（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１７，ＳＸ１３２０、ＳＸ１３２２株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１０３】
また、プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）をＢｓｐ１４０７Ｉで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１６（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１９（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３２１（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１６，ＳＸ１３１９、ＳＸ１３２１株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１０５】
さらに、ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３５０のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、上記と同様に以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＧＡＬ１−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉ（ＹＥＨ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記（６）で作製したＳＸ１３５０株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＧ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ガラクトース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１０６】
ガラクトースを炭素源として寒天培地上に生育してきたアデニンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養
液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５１（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５１株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１０８】
（実施例２）
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２の発現ｌｏｃｕｓの異なるARE1およびYEH1増強株の作製
（１）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３２６の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１０９】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２６と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２６株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１１０】
（２）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３１８、ＳＸ１３２６株への発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３２５、ＳＸ１３３２の作製
（i）ＹＥＨ１発現用プラスミドｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）の作製
上記実施例１（５）で作製したプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＢａｍＨ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩによる切断で、約４．８８ｋｂｐと１．６４ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【０１１１】
（ii）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１８、１３２６への発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３２５、ＳＸ１３３２株の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１８のｌｅｕ２遺伝子座と、ＳＸ１３２６のゲノム上のｕｒａ３遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（leu2遺伝子中）で切断し、ｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＳｔｕＩ（ura3遺伝子中）で切断した。これらのＤＮＡ断片をＳＸ１３１８とＳＸ１３２６株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１１２】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）とリバースプライマーＹＬＬ−Ｓｅｑ３Ｒ（配列番号２８）、フォワードプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）とリバースプライマーＹＥＨ１−ｓｅｑＲ１（配列番号３０）の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上とｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２５（ｌｅｕ２遺伝子座）とＳＸ１３３２（ｕｒａ３遺伝子座）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．８ｋｂｐと約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ検出された。従って、ＳＸ１３２５，ＳＸ１３３２株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１１４】
（３）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２への発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３２７の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のｕｒａ３遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素ＳｔｕＩ（ｕｒａ３遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）とリバースプライマーＡＲＥ１−ＲＲ（配列番号３１）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１５】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２６と名付けた形質転
換体は目的サイズと同じ約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２７株のゲノムのｕｒａ３遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１１６】
（４）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３２７株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３３３の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３２７のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＮｄｅＩ（YEH1遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片をＳＸ１３２７株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３３（ＹＥＨ１遺伝子座）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３３株のゲノムのＹＥＨ１遺伝子座には上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１１８】
（５）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を導入していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３３５株の作製
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２９と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２９株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１２０】
次に、酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片を上記で作製したＳＸ１３２９株に上記実施例１（２）と
同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１２１】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１２２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３５と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３５株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１２３】
（実施例３）
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のARE2およびYEH1増強株の作製
（１）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ２遺伝子導入株ＳＸ１３４２の作製
（i）酵母発現用のＡＲＥ２遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡＲＥ２）を含むＤＮＡ断片は、上記実施例１（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＡＲＥ２遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＲＥ２−ＳｍａＩ（Ｆ）（配列番号３２）とリバースプライマーＡＲＥ２−ＥｃｏＲＩ（Ｒ）（配列番号３３）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＲＥ２の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＳｍａＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．９３ｋｂｐのＡＲＥ２遺伝子断片を確認した。
【０１２４】
（ii）ＡＲＥ２発現用プラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）の作製
上記実施例１（４）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、ＰＣＲ合成したＡＲＥ２遺伝子断片をＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．９３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）と名付けた。
【０１２５】
（iii）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ２遺伝子導入株ＳＸ１３４２株の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のＡＲＥ２遺伝子座へさらにＡＲＥ２遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ２発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）を制限酵素ＳａｌＩ（ＡＲＥ２遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ２−Ｒ１（配列番号３４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１２６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４２と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４２株のゲノムのＡＲＥ２遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ２遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１２７】
（２）ＡＲＥ２遺伝子を導入したＳＸ１３４２株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３４６の作製
ＡＲＥ２遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３４２のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（１）で作製したＳＸ１３４２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１２８】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４６と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４６株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１２９】
また、プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３をＳｔｕＩで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）
とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４７と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４７株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１３１】
（実施例４）
サッカロミセス・セレビジエ ＦＹ１６７９−０６ｃ株のARE1およびYEH1増強株の作製
（１）ＦＹ１６７９−０６ｃ株へのＡＲＥ１遺伝子増強株ＳＸ１３３０の作製
サッカロミセス・セレビジエ ＦＹ１６７９−０６ｃ株のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片をＦＹ１６７９−０６ｃ株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１３２】
寒天培地上に生育してきたウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３０と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３０株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１３４】
（２）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３３０株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３３７の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３３０株のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｎｄｅ Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（４）(ii)で作製した酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（１）で作製したＳＸ１３３０株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１３５】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３７と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３７株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１３７】
また、プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）をＢｓｐ１４０７Ｉで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３８と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３８株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１３９】
（３）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を導入していない対照株ＳＸ１３４８の作製
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。このＤＮＡ断片をＦＹ１６７９−０６ｃ株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１４０】
寒天培地上に生育してきたウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１４１】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４３と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４３株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
次に、酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片を上記で作製したＳＸ１３４３株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１４２】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４８と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４８株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１４３】
（実施例５）
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強した各種株のステロール類の分析
（１）各種酵母株の培養、およびステロール類の分析
実施例１〜４で作製した各種株を０．５％グルコースを炭素源とした２ｍｌのＹＰＡＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン）に１白金耳植菌し、３０℃、１８時間培養し、種菌とした。この酵母培養液から初期ＯＤ６６０＝０．２となる分量の培養液を回収し、４℃、１０，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行い、培養上清を除去した。菌体ペレットに０．１ｍｌの０．８５％生理食塩水を添加、懸濁し、２％グルコースを炭素源とした５ｍｌのＹＰＡＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン）に播種し、３０℃、７２時間培養を行った。酵母培養液０．５ｍｌを４℃、１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行い、菌体を回収した。菌体ペレットにエタノール０．４ｍｌと４０％水酸化カリウム水溶液０．０２ｍｌを添加し、８０℃、９０分間振とうを行い、菌体内に蓄積したステロールエステルのケン化処理を行った。この液を３５℃で減圧濃縮機にかけ、濃縮乾固させた。
得られた濃縮乾固物にエタノール０．１ｍｌと滅菌水０．０５ｍｌを加え懸濁し、さらにヘプタン０．８ｍｌを添加し激しく混和した後、室温で１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離することで水層と油層に分離した。上層のヘプタン層を別のチューブに取り、残った水層に再度、エタノール０．１ｍｌとヘプタン０．８ｍｌを添加し、抽出操作を繰り返した。抽出した約１．６ｍｌのヘプタン溶液に滅菌水０．０４ｍｌを添加し、激しく混和した後、再度、室温で１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離することで水層と油層に分離した。約１．６ｍｌのヘプタン層を回収し、３５℃で減圧濃縮機にかけ、濃縮乾固させた。得られた濃縮乾固物は０．２ｍｌトルエンに再溶解し、テストステロンを内部標準としてガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析を行った。結果を図１〜８に示す。
【０１４４】
（２）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図１（ａ）に示した通り、ＹＰＨ４９９を親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１６）に対して、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１７）では、ＺＹＭＯの蓄積量が減少し、ＴＥＯＬの蓄積量が増加していることがわかった。このことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
一方、図２（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２０）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＦＹ１６７０−０６ｃを親株とした場合でも明らかとなった。
【０１４５】
次に、図３（ａ）に示した通り、ＫＡ３１１Ａを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２１）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２２）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＫＡ３１１Ａを親株とした場合でも明らかとなった。
さらに、図４（ａ）に示した通り、Ｘ２１８１−１Ｂを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５０）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５１）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＸ２１８１−１Ｂを親株とした場合でも明らかとなった。
【０１４６】
（３）発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図５（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製した、発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＡＲＥ１増強株において、ＹＥＨ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２いずれのｌｏｃｕｓでＹＥＨ１を発現させた株でも同等のＴＥＯＬ蓄積を示した。このことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１をどのようなｌｏｃｕｓで発現増強させても、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
一方、図６（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製した、発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＹＥＨ１増強株において、ＡＲＥ１、ＵＲＡ３いずれのｌｏｃｕｓでＡＲＥ１を発現させた株でも同等のＴＥＯＬ蓄積を示した。このことからＹＥＨ１増強下においてＡＲＥ１をどのようなｌｏｃｕｓで発現増強させても、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
【０１４７】
（４）ＡＲＥ２、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図７（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ２のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４７）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４６）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ２増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが、ＡＲＥ２をステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼとして用いた場合でも明らかとなった。
【０１４８】
（５）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強した株のステロール類の分析
図８（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強した株（ＳＸ１３３８）に対して、さらにＹＥＨ１を増強した株（ＳＸ１３３７）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＥＲＧＯ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが、ｅｒｇ５ｅｒｇ６二重破壊をしていない株を用いた場合でも明らかとなった。
【０１４９】
（実施例６）
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強した各種株の転写量の分析
（１）酵母からの全ＲＮＡの調製
実施例５で調製した各種株について、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔおよ
びＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを以下のとおり調製した。
上記実施例５と同様に菌体を培養した後、回収した培養液を用いて、２×１０7個になるよう酵母菌体溶液を調製し（ＯＤ６６０＝１が、約１．５×１０7個として細胞数を調製）、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して得られた菌体を０．８５％生理食塩水に懸濁し、再度、４℃、１０，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離を行った。得られた菌体は、キット付属のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ０．６ｍｌと２−メルカプトエタノール ６μｌで懸濁し、この懸濁液をＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）のチューブに移し、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて室温で６，０００ｒｐｍ、１分間破砕を行った。この菌体破砕液をゲノムＤＮＡ除去ミニスピンカラムに入れ、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ付属の使用説明書に従い、全ＲＮＡの調製を行った。オプションとして全ＲＮＡのカラム吸着後にＤＮａｓｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０．０８ｍｌを添加し、室温で１５分間静置し、染色体ＤＮＡの分解を行った。また、最後に５０℃で保温したＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加え、室温で１分間静置し、遠心分離にて全ＲＮＡを溶出した。
【０１５０】
（２）逆転写反応
上記（１）で調製した全ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、付属の使用説明書に従い、逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、３００ｎｇの全ＲＮＡ、プライマーとして５０μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20を使用した。
【０１５１】
（３）定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲの反応は、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いて、付属の使用説明書に従って反応を行い、（１）９５℃、１０秒、（２）９５℃、５秒、（３）６０℃、２０秒、（２）から（３）の反応を４０回繰り返した。温度変化速度はいずれも２０℃／秒とした。また、融解曲線分析を（１）９５℃、０秒、（２）６５℃、１５秒、（３）９５℃、０秒で行い、温度変化速度はいずれも２０℃／秒とした。ＰＣＲプライマーとして、ＡＲＥ１の定量ＰＣＲにはＡＲＥ１−Ｆ（配列番号３５）とＡＲＥ１−Ｒ（配列番号３６）、ＡＲＥ２の定量ＰＣＲにはＡＲＥ２−Ｆ（配列番号３７）とＡＲＥ２−Ｒ（配列番号３８）、ＹＥＨ１の定量ＰＣＲにはＹＥＨ１−Ｆ（配列番号３９）とＹＥＨ１−Ｒ（配列番号４０）を使用した。また、発現コントロールとしてアクチンをコードしているＡＣＴ１を用い、ＡＣＴ１−Ｆ（配列番号４１）とＡＣＴ１−Ｒ（配列番号４２）をプライマーとして使用した。
定量分析には、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＬｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ、およびＬｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５を用い、Ｆｉｔ
Ｐｏｉｎｔ法を用いて分析を行った。この結果を図１および図２の（ｂ）、（ｃ）に示す。
【０１５２】
（４）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
図１（ｂ）、（ｃ）で示した通り、ＹＰＨ４９９のｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析を行った結果、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３１６ではＡＲＥ１の転写量が、ＳＸ１３１３に比べ増加しており、発現増強されていることが確認できた。また、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３１７のＡＲＥ１、ＹＥＨ１それぞれの転写量もＳＸ１３１３に比べて増加していることから、両遺伝子とも発現増強されていることが確認できた。
同様に、ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図２（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３１２に対して、ＡＲＥ１のみを増強
したＳＸ１３１９はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３２０はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５３】
続いて、ＫＡ３１１Ａのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図３（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３０７に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３２１はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３２２はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
さらに、Ｘ２１８１−１Ｂのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図４（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３５３に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３５０はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３５１はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５４】
（５）発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＡＲＥ１増強株を親株として、発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１を強化した株における転写解析の結果（図５（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３１９に対して、ＳＸ１３２０（YEH1 locus）、ＳＸ１３３２（URA3 locus）、ＳＸ１３２５（LEU2 locus）いずれの株も、ＹＥＨ１の転写量が増加していることが確認できた。
【０１５５】
さらに、ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株として、発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１をＹＥＨ１とともに強化した株における転写解析の結果（図６（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３３５に対して、ＳＸ１３２０（ARE1 locus）、ＳＸ１３３３（URA3 locus）いずれの株も、ＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５６】
（６）ＡＲＥ２、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図７（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３３５に対して、ＡＲＥ２のみを増強したＳＸ１３４７はＡＲＥ２の転写量が増加し、ＡＲＥ２とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３４６はＡＲＥ２とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５７】
（７）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強した株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃを親株とした株における転写解析の結果（図８（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３４８に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３３８はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３３７はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５８】
なお、表１に、図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１５９】
【表１】
【０１６０】
また、表２に、図２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
表３に、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重
量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６３】
【表３】
【０１６４】
表４に、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
表５に、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６７】
【表５】
【０１６８】
表６に、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６９】
【表６】
【０１７０】
表７に、図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ２とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１７１】
【表７】
【０１７２】
表８に、図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１７３】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によって製造されるΔ５，７−ステロールは、医薬分野、化粧品分野、食品分野等で有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の中間体等として有用なΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造する酵母およびそれを用いたΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロール類は動物、植物、真菌類に含まれている生命活動に必須の物質であり、細胞膜に遊離型ステロールの状態で含まれるほか、一部は脂肪酸とのエステル型として貯蔵される。このうち、Ｃ５，７−ジエン体ステロールはコレステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールであるが、その中でもコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オール（別名、７−デヒドロデスモステロール、以下、TEOLと称する）は医薬品であるケノデオキシコール酸やウルソデオキシコール酸の合成原料として用いられるなど、医薬品の中間体などとして非常に有用な物質である。
【０００３】
また、11β,17α,21-トリヒドロキシ-4-プレグネン-3,20-ジオン（ハイドロコルチゾン）は、その前駆物質であるプレグネノロン、プロゲステロン、７−デヒドロプレグネノロンとともに、医薬および医薬中間体として産業上有用な化合物である。プレグネノロンの既存の製造法として、コレステロールやジオスゲニン、スティグマステロールといった天然由来のステロール化合物を原料として、複数の有機合成反応により合成する方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
従来、Ｃ５，７−ジエン体ステロールは動物組織の抽出物から精製されたものが使用されている。一方で、酵母等の真菌類においてエルゴステロールの生合成経路が明らかにされる（非特許文献２）につれて、近年ではその生合成経路を改変して特定のステロールを蓄積させるという研究が進められている。
【０００５】
酵母、カビ等の真菌類において、エルゴステロール生合成酵素欠損株あるいはエルゴステロール生合成酵素遺伝子の過剰発現によりステロール組成を変えた研究例がいくつか報告されている。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエでステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を欠損させることにより、側鎖２４位にメチル基を持たないステロールのみが蓄積するようにした例（非特許文献３）や、酵母でステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を欠損させアラビドプシスのΔ７−ステロールリダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変し、エルゴスタ−５，２４−ジエノール、エルゴスタ−５−エネノール、エルゴスタ−５，２２−ジエノールが蓄積するようにした例が報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
また、特許文献１では、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化され、ステロールΔ７−リダクターゼ、および／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）を培養し、培養物からステロール類を採取する方法が開示されている。
【０００７】
一方、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼはステロール化合物のエステル化を触媒する酵素であり、ステリルエステル加水分解酵素はステリルエステルの加水分解を触媒する酵素である。アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であるARE1の発現を強化した酵母は非特許文献５に開示されており、ス
テリルエステル加水分解酵素活性を有するYEH1のＣ末端にプロテインＡを付加した融合タンパク質を導入した酵母が非特許文献６に開示されている。しかしながら、これらの文献ではARE1やYEH1の発現強化のＣ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール産生への効果については記載されておらず、また、ARE1とYEH1の両方の発現を強化した酵母はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004-141125号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Org. Chem. 44, 1582-1584 (1979)
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotechnol. 63, 635-646（2004）
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 509-517（1988）
【非特許文献４】J. Biol. Chem. 271（18）, 10866-10873（1996）
【非特許文献５】Science 272, 1353-1356（1996）
【非特許文献６】Biochim. Biophys. Acta 1791, 118-124（2009）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｃ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを効率よく産生する改変酵母を提供すること、およびこれを用いてＣ５，７−ジエン体ステロールやエルゴステロールなどのΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。
上記のとおり、ステロール化合物はその大半がエステル体として細胞内に蓄積される。従って所望のステロール化合物を効率よく蓄積させるにはステロール化合物のエステル化を促進することが重要と一般的には考えられ、当業者であれば、Δ５，７−ステロールを効率よく産生するためにはステロールをエステル化するアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性のみを増強し、逆にそのエステル体の加水分解を促進するステリルエステル加水分解酵素を低減化する、または改変しないと考えられる。しかしながら、本発明者らは、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子だけでなく、ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現も同時に増強することを試みたところ、意外なことに、これらの両遺伝子の発現を増強することにより非常に効率よくΔ５，７−ステロールを産生させることができることを見出した。また、さらに酵母を改変することでハイドロコルチゾンも製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母。
[２]さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）及びステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低減するように改変された、[１]に記載の酵母。
[３]さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）の発現が低減するように改変された、[１]に記載の酵母。
[４]さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性から選択される少なくとも一つの活性を有
するように改変された[３]に記載の酵母。
[５]さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール３位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性を有するように改変された[３]に記載の酵母。
[６]サッカロミセス・セレビジエである、[１]〜[５]のいずれかに記載の酵母。
[７]親株がサッカロミセス・セレビジエYPH499株、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株、サッカロミセス・セレビジエKA311A株またはサッカロミセス・セレビジエX2181-1B株である、[６]に記載の酵母。
[８] [１]〜[３]のいずれかに記載の酵母を培養してΔ５，７−ステロールを生成・蓄積させ、Δ５，７−ステロールを回収する、Δ５，７−ステロールの製造方法。
[９]培養する酵母が[１]又は[２]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがＣ５，７−ジエン体ステロールである、[８]に記載の方法。
[１０]Ｃ５，７−ジエン体ステロールがコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールまたは７−デヒドロコレステロールである、[９]に記載の方法。
[１１]培養する酵母が[１]又は[３]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴスタ−5,7,24-トリエノールである、[８]に記載の方法。
[１２]培養する酵母が[１]に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴステロールである、[８]に記載の方法。
[１３] [５]に記載の酵母を培養してハイドロコルチゾンを生成・蓄積させ、ハイドロコルチゾンを回収する、ハイドロコルチゾンの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の酵母を用いることにより、Δ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを産生させることができる。本発明の方法によってΔ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンを製造し、これらを用いて医薬を合成すれば、医薬の製造プロセスの効率化にも寄与すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。「C7,24」はコレスタ−７,２４−ジエン−３β−オールを表し、「ZYMO」はザイモステロールを表し、「その他」はその他のステロール類を表す。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１３）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１６）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３１７）を示す。いずれもＹＰＨ４９９を親株として作製された株である。
【図２】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１２）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３２０）を示す。ＳＸ１３１９、ＳＸ１３２０については３クローンずつ評価した。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図３】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３０７）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２１）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３２２）を示す。いずれもＫＡ３１１Ａを親株として作製された株である。
【図４】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５３）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５０）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３５１）を示す。いずれもＸ２１８１−１Ｂを親株として作製された株である。
【図５】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）、他はいずれもＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株であり、ＹＥＨ１ ｌｏｃｕｓは、ＹＥＨ１をＹＥＨ１のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２０）、ＵＲＡ３ ｌｏｃｕｓはＹＥＨ１をｕｒａ３のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３３２）、ＬＥＵ２ ｌｏｃｕｓは、ＹＥＨ１をｌｅｕ２のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２５）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図６】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも導入していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３３５）、他はいずれもＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株であり、ＡＲＥ１ ｌｏｃｕｓは、ＡＲＥ１をＡＲＥ１のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３２０）、ＵＲＡ３ ｌｏｃｕｓはＡＲＥ１をｕｒａ３のｌｏｃｕｓに導入した株（ＳＸ１３３３）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図７】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ２とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ２とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、Δｅ５Δｅ６は、ＡＲＥ２とＹＥＨ１をいずれも増強していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３３５）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ２は、ＡＲＥ２のみを導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４７）、Δｅ５Δｅ６ＡＲＥ２ＹＥＨ１は、ＡＲＥ２とＹＥＨ１を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６破壊株（ＳＸ１３４６）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【図８】（ａ）ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。「ERGO」はエルゴステロールを表し、「ZYMO」はザイモステロールを表し、「その他」はその他のステロール類を表す。（ｂ）、（ｃ）定量ＰＣＲによるＡＲＥ１とＹＥＨ１の転写量を分析した結果を示す図である。転写量は、ＡＣＴ１に対する比として示した。（ｂ）は、ＡＲＥ１とＡＣＴ１の発現量比を示し、（ｃ）は、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比を示す。図中、−は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をいずれも増強していない株（ＳＸ１３４８）、ＡＲＥ１は、ＡＲＥ１のみを導入した株（ＳＸ１３３８）、ＡＲＥ１ＹＥＨ１は、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を導入した株（ＳＸ１３３７）を示す。いずれもＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製された株である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
（１）本発明の酵母
本発明の酵母は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強するように改変された酵母である。
【００１７】
本発明において、Δ５，７−ステロールはステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールを意味し、好ましくはエルゴステロールおよびＣ５，７−ジエン体ステロールである。また、Ｃ５，７−ジエン体ステロールはコレステロール骨格の５位と７位に炭素−炭素二重結合を有するステロールを意味するが、TEOL（コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オール）、7-デヒドロコレステロールが好ましく、TEOLが特に好ましい。また、ハイドロコルチゾンを目的生成物とする場合には、エルゴスタ−5,7,24−トリエノールが好ましい。Δ５，７−ステロールやＣ５，７−ジエン体ステロールには、それぞれΔ５，７−ステロールやＣ５，７−ジエン体ステロールのエステル体も含まれる。
【００１８】
また、本発明において「アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子」とは、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を意味し、「ステリルエステル加水分解酵素遺伝子」とは、ステリルエステル加水分解酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を意味する。
【００１９】
「アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強した」とは、非改変株または親株と比較してアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現が増強したことを意味する。アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の増強は、非改変株または親株と比較して、単位菌体重量当たり5倍以上増強されていることが好ましく、10倍以上増強されていることがより好ましい。
なお、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼは、ステロールのエステル化反応を触媒する酵素であり、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は定量PCR法などによって測定することができる。
【００２０】
「ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強した」とは、非改変株または親株と比較してステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強したことを意味する。ステリルエステル加水分解酵素遺伝子発現の増強は、非改変株または親株と比較して、単位菌体重量当たり5倍以上増強されていることが好ましく、10倍以上増強されていることがより好ましい。
なお、ステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現は定量PCR法などによって測定することができる。
【００２１】
本発明に用いる酵母は、以下に示すような酵母を親株として用い、該親株を改変することによって得ることができる。
親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、または、ピキア属に属する酵母であることが好ましく、例えば、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichoderma reesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）が挙げられる。
【００２２】
これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいことからサッカロミセス属が好適である。さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、以下の株が例示される。
サッカロミセス・セレビジエYPH499株（MATa ura3 lys2 ade2 trp1 his3 leu2）（ATCC204679：American Type Culture Collection又はSTRATAGENE社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株（MATα ura3 leu2 trp1 his3）（Euroscarf社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエX2181-1B株（MATalpha his2 gal1 trp1 ade1
MAL SUC）（ATCC204822：American Type Culture Collectionより入手できる）。あるいは、サッカロミセス・セレビシエKA311A株（MATa his3 leu2 trp1 ura3）（Mol. Cell Biol. 13, 307-3083（1993））も用いることができ、KA311A株は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：FERM P-19053として寄託されている。
【００２３】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、遺伝子組換え法、例えば、該酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、またはこの遺伝子のプロモーターを置換することによってこれらの遺伝子の発現量を増大させることによって行うことができる。
【００２４】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、ARE1遺伝子やARE2遺伝子が挙げられる。ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、多くの微生物で知られており、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号４３または４５の塩基配列を有するサッカロミセス・セレビジエ由来の遺伝子を挙げることができる。また、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号４３または４５の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、またはこれらの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２５】
また、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、それぞれ配列番号４４または４６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００２６】
さらに、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、配列番号４４または４６のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、アシル
ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、１または数個とは、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。
【００２７】
また、サッカロミセス・セレビジエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のARE1遺伝子およびARE2遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のARE1遺伝子およびARE2遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはホモロジー等に基づいてアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００２８】
ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として、YEH1遺伝子が挙げられる。YEH1遺伝子は、多くの微生物で知られており、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号４７の塩基配列を有するサッカロミセス・セレビジエ由来の遺伝子を挙げることができる。また、YEH1遺伝子は、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号４７の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、またはこれらの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件は、上記のとおりである。
【００２９】
また、YEH1遺伝子は、それぞれ配列番号４８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、YEH1遺伝子は、配列番号４８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、ステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、１または数個とは、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。
【００３０】
また、サッカロミセス・セレビジエ以外の酵母、または他の微生物又は動植物由来のYEH1遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のYEH1遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはホモロジー等に基づいてステリルエステル加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００３１】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現を増強するためには、例えば、上記のようなDNAを宿主酵母で機能しうるプラスミドに発現可能に組込み、宿主酵母に導入すればよい。
【００３２】
上記遺伝子を組込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主酵母内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。酵母に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）などが
挙げられる。これらのベクターは市販されており容易に入手可能である。
【００３３】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００３４】
ARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を、上記したような酵母内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組換えベクターで、サッカロミセス・セレビジエなどの酵母を形質転換することにより、これらの遺伝子の発現が増加した酵母が得られる。
【００３５】
形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができる。
また、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上でARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 9, 1382-1385（1991））が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を含む発現単位の挿入箇所は、ステロール生合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。具体的には、ARE1遺伝子を適当なプロモーターの制御下となるように連結させたDNAを、宿主ゲノム上のARE1遺伝子座上などに挿入し、宿主ゲノム中のARE1遺伝子が２コピーとなるようにして、さらにYEH1遺伝子も同様のプロモーターの制御下となるように連結させたDNAを宿主ゲノム上のYEH１遺伝子座などに挿入して宿主ゲノム中のYEH1遺伝子が２コピーとなるようにゲノムを改変する方法などが好ましく用いられる。
【００３６】
また、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強は、宿主ゲノム上でARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。
上記組換えプラスミドによる導入または染色体上への相同組換えにおいて、ARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子を発現させるためのプロモーター、または染色体上のARE1（またはARE2遺伝子）およびYEH1遺伝子のプロモーターを置換するために使用するプロモーターは、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、３−フォスフォグリセレートキナーゼ１遺伝子のプロモーター（以下、「ＰＧＫ１プロモーター」と称することがある）あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーター、ないしは、GAL1やGAL10（Mol. Cell Biol. 4（8）, 1440-1448（1984））などの誘導型プロモーター（例えば、STRATAGENE社製）などが挙げられる。
【００３７】
なお、本発明の酵母は、アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現の増強に加えて、他の酵素遺伝子の発現が非改変株と比べて増強または低下するように改変されたものでもよい。
他の酵素の改変は目的とするΔ５，７−ステロールの種類により適宜選択される。
【００３８】
例えば、TEOLを生産する場合、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）とステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低下するように改変することが好ましい。これらの改変は特開2004-141125に記載されている。
また、Δ５，７−ステロールとしてのエルゴスタ−5,7,24−トリエノールを中間体とし
てハイドロコルチゾンを目的生成物とする場合には、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）のみの発現が低下するように改変することが好ましい。
【００３９】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼは、各種ステロール類の側鎖の２２位に二重結合を導入する能力を有する酵素であり、具体的には、例えばコレスタ−５，７，２４−トリエノールをコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに、エルゴスタ−５，７−ジエノールをエルゴスタ−５，７，２２−トリエノールに、エルゴスタ−５，２４−ジエノールをエルゴスタ−５，２２，２４−トリエノールに、エルゴスタ−５，７，２４−トリエノールをエルゴスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００４０】
また、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンから各種ステロール類の２４位にメチル基を転移させる能力、さらには転移により付加されたメチル基にさらにメチル基を転移させる能力を有する酵素であり、具体的には、例えばザイモステロールをフェコステロールに変換する能力を有する酵素を指す。
これら酵素をコードする遺伝子は、既に単離され塩基配列が決定されているものもあり、例えば、ステロールＣ−２２デサチュラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されており（Biochem. Biophys. Acta 1299, 313-324（1996））、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されている（Gene 169, 105-109（1996））。
【００４１】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性低減化方法としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学物質あるいはＵＶなどの変異源処理によって得られた両酵素遺伝子の欠損突然変異株を交配する方法、両遺伝子の転写をアンチセンス遺伝子の導入によりおさえる方法、両遺伝子の転写産物をＲＮＡｉ技術によって抑制する方法、両酵素の特異的阻害剤で酵素活性を抑える方法などを用いることができる。
【００４２】
酵母においては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをそれぞれコードしている遺伝子断片中に、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ＤＮＡないしはジェネティシンやオーレオバシジンＡなどの抗生物質や抗真菌薬に対する耐性遺伝子が挿入された遺伝子断片、あるいはその遺伝子断片がさらにベクターに挿入されたプラスミドを作製し、相同組換えにより宿主染色体中の該遺伝子を破壊する方法が好適に用いられる。
【００４３】
例えば、サッカロミセス・セレビシエにおいては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片を制限酵素切断ないしはポリメラーゼチェーンリアクション法（以下これを「ＰＣＲ」と略称することがある）によって得てベクターに組み込んで中間ベクターを作製する。この中間ベクターをＥＲＧ５遺伝子およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子内部にある任意の制限酵素部位で２つに切断し、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ｃＤＮＡのいずれか１つを２つの中間ベクター同士で重ならないように選択し挿入することにより遺伝子破壊用ベクター、ないしはそれをＰＣＲで増幅して得られる遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を作製する。次いでこの遺伝子破壊用ベクターないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を酵母に遺伝子導入することで相同組換えを誘発し、目的遺伝子を破壊することができる。
【００４４】
かくして構築される遺伝子破壊用ＤＮＡ断片若しくは遺伝子破壊用ベクターの具体例として、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＴＲＰ１遺伝子が挿
入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７６ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＨＩＳ３遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３（特開2004-141125号公報を参照）等が挙げられる。
【００４５】
酵母における遺伝子破壊の確認は、特定の栄養要求性遺伝子が挿入された遺伝子部分が相同組換えにより酵母ゲノム中に組み込まれるために、宿主株が持っていた複数の栄養要求性のうち該当する栄養要求性が消失することで知ることができる。さらにＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の５'末端と３'末端にそれぞれ設定したＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子破壊操作を受けた酵母株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片の長さが挿入した栄養要求性遺伝子の長さだけ大きくなっていることを確認することにより遺伝子破壊の確認を行うことができる。
かくして得られる遺伝子破壊株の具体例としては、遺伝子破壊用ベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１のｅｒｇ５：：ＴＲＰ１断片でＥＲＧ５遺伝子を破壊した、サッカロミセス・セレビシエＫＡΔ５−５株、さらに該Δ５−５株のＥＲＧ６遺伝子をｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３のｅｒｇ６：：ＨＩＳ３断片で破壊したＫＡΔ５Δ６−１株、ＫＡΔ５Δ６−４株、ＫＡΔ５Δ６−５株等が挙げられる。
さらに、本発明の酵母としては、以下の（３）に記載の酵母も含まれる。
【００４６】
（２）Δ５，７−ステロールの製造方法
上記で説明した本発明の酵母を炭素源、窒素源、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気条件下、温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば、酵母菌体中にΔ５，７−ステロールが蓄積するのでこれを採取する。
【００４７】
炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、フルクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜、などの炭水化物、酢酸、ピルビン酸、メバロン酸などの各種有機酸が使用できる。さらに酵母の資化性によって、炭化水素、アルコールなども用いられる。特に廃糖蜜は好適にもちいられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、または塩化アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの各種無機塩および有機アンモニウム塩類あるいはペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など種々のものが使用可能である。
無機塩としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを使用する。ビタミン、アミノ酸としては、使用する酵母の種類によってことなるが、必要に応じ添加する。また使用する菌株が、栄養要求性を示す場合は、その要求物質を添加する。
【００４８】
培養は使用する菌株に応じて適切な条件で行うが、通常は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。生産株として、サッカロミセス・セレビシエを用いる場合は、培養温度は２０〜４０℃が好適であり、培地のｐＨは弱酸性付近に維持する事が望ましい。培養期間は通常１〜１５日間で菌体中にΔ５，７−ステロールが蓄積する。また、培養期間中に上記に記載した炭素源や窒素源、無機塩、ビタミン、アミノ酸を連続的、あるいは断続的に添加する流加培養や連続培養を行うことにより、菌体の生育やΔ５，７−ステロールの蓄積をさらに伸ばすことが可能である。
【００４９】
培養終了後のΔ５，７−ステロールの抽出は一般に生物組織からステロール類を抽出する方法により行うことができる。具体的には、例えば、菌体を海砂とともにそのままアセトン中で破砕し酢酸エチルで抽出するか、又は、２ＭのＮａＯＨを含む５０％エタノール中で２時間煮沸し鹸化したのちヘプタンないしはクロロホルム／メタノール／水（体積比８６：１６：１）混液で抽出し、薄層クロマトグラフィーにかけステロール画分を掻き取
って、窒素気流下で乾燥させメタノール／クロロホルム混液に溶解することで総ステロールを菌体から抽出することができる。
【００５０】
次いでステロールの種類の同定は、薄層クロマトグラフィーで分離抽出したステロール画分を、それ自体公知の適当な溶媒およびカラムの組み合わせでガスクロマトグラフィーないしは高速液体クロマトグラフィーにかけて、現れるピークの保持時間を標準試料の保持時間と比較することで行うことができる。また、同定された各種ステロールの総ステロール中にしめる割合は各ピークの面積から算出することができる。さらに、これらの主要なステロールのピークが目的化合物であることの確認は、マススペクトロメトリーを用いて、分子量および開裂パターンを調べることで行うことができる。また、ＧＣ−ＭＳあるいはＨＰＬＣ−ＭＳを用いることによりさらに効率よく抽出されたステロール類を同定することができる。
【００５１】
得られたΔ５，７−ステロールは各種医薬等の中間体となりうる。
例えば、TEOLはケノデオキシコール酸やウルソデオキシコール酸の合成原料として有用である。特開2007-210888号公報および特開2006-056877号公報に、TEOLからのウルソデオキシコール酸の合成方法が開示されている。
具体的には、TEOLを原料として、以下の４つの工程、すなわち
（Ｉ）３位水酸基の酸化と５位２重結合の４位への異性化を行う工程
（ＩＩ）側鎖の酸化的切断により２４位をカルボキシル基またはそのエステル誘導体とする工程
（ＩＩＩ）７位に酸素官能基を導入する工程
（ＩＶ）４位２重結合の還元飽和化による５β立体構築を行う工程
を経て５β−３，７−ジオキソコラン酸を製造し、これを還元することによってウルソデオキシコール酸を製造することができる。
５β−３，７−ジオキソコラン酸のウルソデオキシコール酸への還元反応は、金属還元または接触水素化によって行うことができる。また、５β−３，７−ジオキソコラン酸からウルソデオキシコール酸への変換は、特開昭60-228500号公報及び特開平5-32692号公報の記載を参酌して行うことができる。
【００５２】
（３）ハイドロコルチゾンの製造方法
上記酵母で、以下の活性を有するものを上記（２）と同様にして培養することによりハイドロコルチゾンが生成される。活性を有する酵母とは、該酵母自体がそれぞれの活性を有していてもよいし、該活性を有する物質を培養液中に添加してもよいし、該活性を有する酵母の菌体あるいはその処理物を培養液中に添加することでもよい。
【００５３】
ハイドロコルチゾンの生成にさらに必要な活性とは、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド11β位水酸化活性である。本発明の酵母には、上記活性のうち少なくとも１つを有するものも含まれる。ハイドロコルチゾン生成を目的とする本発明の酵母としては、上記活性を有する蛋白質を生成するものが好ましく、また、発現するための遺伝子及びその活性に必要な補酵素などの遺伝子の全てを導入したものも好ましく挙げられる。上記活性を有する蛋白質を生成するためには、該蛋白質をコードするDNAを上記の発現ベクターに挿入して、上記酵母を形質転換した形質転換酵母を用いる方法が好ましく用いられる。
【００５４】
ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性を有する蛋白質を生成する活性を獲得する方法としては、 (i) 例えば、WO2010/079594公報に記載の酵素蛋白質（CYP204A1やCYPSS204A）をコードする遺伝子やその他の遺伝子がコードする同様の活性を有する酵素遺伝子と、該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、およ
び該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子の混合物、あるいは(ii)上記酵素蛋白質と該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質の融合蛋白質をコードする遺伝子が発現するように該酵母に遺伝子導入する方法などが挙げられる。
【００５５】
ここで、電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質は両者の活性を有する1種の蛋白質でもよい。例えば、Bacillus megateriumのP450-BM3遺伝子のP450還元酵素ドメインを酵素蛋白質（P450 2C11）に連結し、人工的に作製した融合蛋白質を利用できる（Helvig, C. and Capdevila, J. H., Biochemistry, (2000）39, 5196-5205)。
【００５６】
フェレドキシン還元酵素は、例えば以下の中から選択される。
ホウレン草由来のフェレドキシンレダクターゼ、
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシンレダクターゼ、
動物由来のアドレノドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシンレダクターゼ、
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンレダクターゼやフェレドキシンレダクターゼ、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシンレダクターゼ、
またはその他のフェレドキシンレダクターゼ。
【００５７】
フェレドキシンは、例えば以下の中から選択される；
ホウレン草由来のフェレドキシン、
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシン、
動物由来のアドレノドキシン、
ノボスフィンゴビウム サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシン、
ノボスフィンゴビウム アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由来フェレドキシン、
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンやフェレドキシン、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来フェレドキシン、
またはその他のフェレドキシン型蛋白質。
【００５８】
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質、ステロール３位酸化異性化酵素蛋白質は、例えば、Molecular and Cellular Endocrinology 1990, 73, 73-80に記載のものが用いられる。
また、ステロールΔ７−還元酵素蛋白質は、Journal of Biological Chemistry 1996, 271, 10866-10873記載のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの、あるいはApplied and Environmental Microbiology 2007, 73, 1736-1741記載のモルティエレラ（Mortierella）属カビ由来ものが用いられる。
具体的には、ステロールΔ７−還元酵素蛋白質はシロイヌナズナ由来ＮＡＤＰＨ−ステロールΔ７−還元酵素モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）由来ステロー
ルΔ７−還元酵素（MoDELTA7SR）が好ましい。
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質は、例えば、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c17が好ましい。
また、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質は、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c21が好ましい。
ステロイド１１β位水酸化酵素蛋白質としてはウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c11やクルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）由来P-450lun等が好ましい。
さらにステロール３位酸化異性化酵素蛋白質はウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来３β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（3βHSD）やストレプトミセス（Streptomyces）属細菌由来コレステロール酸化酵素が好ましい。
【００５９】
ここで、好ましく用いられる酵母としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、ヤロウィア（Yarrowia）属酵母、アスペルギルス（Aspergillus）属、モルティエレラ（Mortierella）属があげられる。より好ましくは、サッカロミセス属酵母があげられる。具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、より具体的には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）FY1679-28c株（JP2004-528827 A1）、以下同様に、FY1679-18b株（JP2004-528827 A1）、KA311A株(FERM:P-19053)、YPH499株(ATCC#204679)、YPH500株(ATCC#204680)等が挙げられ、それぞれの酵素蛋白質をコードするDNAは、pESC-LEU（Stratagene社）等の発現ベクターや酵母菌の染色体に挿入されていることが好ましい。
【００６０】
また、これらの酵母が、以下（1）−（5）の性質のいずれかまたはすべてを持つことが好ましい。
（1）ステロール−２２デサチュラーゼ蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２２位と２３位の間が不飽和化されない、
（2）ＮＡＤＰ−シトクロムＰ４５０還元酵素蛋白質の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、
（3）ステロールエステル加水分解酵素の発現が本蛋白質をコードする遺伝子をその発現制御領域とともに１コピー以上宿主細胞に導入することで、強化されている、
（4）ステロイド１７α水酸化酵素、ステロイド２１位水酸化酵素、ステロイド１１β位水酸化酵素に電子を伝達するフェレドキシン型蛋白質および該蛋白質へ電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子をその発現制御領域とともに宿主細胞に導入することで、該蛋白質の発現が強化されている、
（5）ステロール−２４メチル基転移酵素蛋白質をコードする遺伝子またはその発現を制御する領域のDNA配列を改変することで内在性のステロールの２４位にメチル基が存在しない。
【００６１】
反応混合物からハイドロコルチゾンを分画する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離又は精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
また、上記で製造したハイドロコルチゾンからは、各種の誘導体を公知の方法で製造することができる。さらに、かくして製造されたハイドロコルチゾンおよびその誘導体は、それ自体既知の方法により試験管内、あるいは生体内における薬理学的または生理学的試験により、その医薬としての活性や安全性のスクリーニングを行なうことにより疾病治療薬とすることができる。この場合、上記工程により得た化合物を有効成分とする医薬組成物を製造する方法も本発明に含まれる。
【００６３】
具体的には、ハイドロコルチゾンそれ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。かくして得られる医薬化合物はそれ自体を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、0.01〜90重量％の間で変動され得る。
【００６４】
本発明で得られたΔ５，７−ステロールやハイドロコルチゾンを含む医薬組成物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤等の剤形として経口的に投与してもよいし、あるいは薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁剤形等の注射剤として、例えば静脈内投与、筋肉内投与、局所内投与、皮下投与してもよい。また坐薬や舌下錠、経鼻、経肺製剤等の粘膜投与、さらには軟膏や貼付剤等の外用剤としての投与も可能である。経口、非経口の組成物を調製する場合には、有機または無機の固体または液体の担体、希釈剤とともに通常用いられる単位容量形態で混和することによって行うことができる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６５】
経口投与および粘膜投与のための固形製剤を製造する際に用いられる賦形剤としては、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム等が用いられる。経口投与のための液体製剤、すなわちシロップ剤、懸濁剤、液剤等は、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水、植物油等を含む。この製剤は、不活性な希釈剤以外に補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、香味剤、着色剤、保存剤、安定剤等を含むこともできる。注射剤、粘膜投与剤等の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、レシチン等が挙げられる。坐剤に用いられる基剤としては、例えばカカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂、ウィテップゾール等が挙げられる。外用剤の製造には、溶解剤または溶解補助剤としてアルコ−ル、脂肪酸エステル類、プロピレングリコール等が、粘着剤としてカルボキシビニルポリマ−、多糖類等が、乳化剤として界面活性剤等などが使用される。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）
サッカロミセス・セレビジエ ＹＰＨ４９９、ＦＹ１６７９−０６ｃ株、ＫＡ３１１Ａ株、Ｘ２１８１−１Ｂ株のｅｒｇ５およびｅｒｇ６遺伝子の二重破壊及びARE1およびYEH1増強株の作製
（１）酵母染色体ＤＮＡの調製
サッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣより入手 ＡＴＣＣ２０４５８）の染色体ＤＮＡは、特開2004-141125と同様の方法で調製された。
【００６８】
（２）遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の導入によるｅｒｇ５遺伝子破壊株ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６、ＳＸ１３３４の作製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子ＥＲＧ５破壊用のプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１（特開２００４−１４１１２５号公報を参照）を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（タカラバイオ社製、以下、特に記載のない限り、制限酵素はタカラバイオ社製である）とＫｐｎ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片をサッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ ｕｒａ３ ｌｙｓ２ ａｄｅ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手）とＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα ｕｒａ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ
社より入手）、Ｘ２１８１−１Ｂ（ＭＡＴａｌｐｈａ ｈｉｓ２ ｇａｌ１ ｔｒｐ１ ａｄｅ１ ＭＡＬ ＳＵＣ）（ＡＴＣＣより入手）に酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）、もしくはエレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）で形質転換し、ＹＰＨ４９９株は各２０ｍｇ／ｌのアデニン、Ｌ−ヒスチジン、ウラシル、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、ＦＹ１６７９−０６ｃ株は各２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジン、ウラシル、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、Ｘ２１８１−１Ｂ株は２０ｍｇ／ｌ アデニンをそれぞれ含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００６９】
寒天培地上に生育してきたトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％
酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＴＲＰ１−ｏｕｔＦ（配列番号１）とリバースプライマーＥＲＧ５−Ｄ３１（配列番号２）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ５遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて（１）９４℃、２分、（２）９４℃、１分、（３）５３℃、１分、（４）７２℃、３分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返した後、４℃で冷却の条件で反応を行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５−５株、およびＹＰＨ４９９株、ＦＹ１６７９−０６ｃ株、Ｘ２１８１−１Ｂ株の染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００７０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１１（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３０６（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３３４（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．９３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６、ＳＸ１３３４株は相同組換えによりＥＲＧ５遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００７１】
（３）ＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６株への遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の導入、およびＳＸ１３３４株への遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２の導入によるｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、ＳＸ１３４０株の作製
（i）遺伝子破壊用ＤＮＡ断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３導入によるｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２株の作製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＥＲＧ６破壊用のプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３（特開2004-141125を参照）を制限酵素ＳｃａＩとＥｃｏＲＩで切断した。このＤＮＡ断片を上記（２）で作製したＳＸ１３１１、ＳＸ１３０６株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＸ１３１１株は各２０ｍｇ／ｌのアデニン、ウラシル、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを、ＳＸ１３０６株は２０ｍｇ／ｌ ウラシル、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンをそれぞれ含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００７２】
寒天培地上に生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、 ２％ポリペプトン、 ２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−Ｕ５２（配列
番号３）とリバースプライマーＥＲＧ６−Ｄ３４（配列番号４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５Δ６−１株、およびＹＰＨ４９９株、ＦＹ１６７９−０６ｃの染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
【００７３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１３（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１２（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．７８ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１３，ＳＸ１３１２株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００７４】
（ii）破壊用ＥＲＧ６、酵母発現用ＨＩＳ２遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片、ＨＩＳ２遺伝子を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
【００７５】
ＥＲＧ６遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ６−５Ｌ（配列番号５）とリバースプライマーＥＲＧ６−３Ｌ（配列番号６）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ６の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの２３８塩基前から終始コドンの２５８塩基後までを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＰｓｔＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
ＨＩＳ２遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＨＩＳ２−Ｆ（配列番号７）とリバースプライマーＨＩＳ２−Ｒ（配列番号８）を用いた。このプライマーの組み合わせでＨＩＳ２の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４３０塩基前から終始コドンの２９０塩基後までを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＳｍａＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、２分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．６５ｋｂｐのＥＲＧ６遺伝子断片を、約１．７３ｋｂｐのＨＩＳ２遺伝子断片を確認した。
【００７６】
（iii）ｅｒｇ６破壊用プラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２の作製
ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、上記（ii）でＰＣＲ合成したＥＲＧ６遺伝子断片をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＨｉｎｃIIによる切断で、約０．６４ｋｂｐと３．６６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｌと名付けた。
次に、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ社製）のクローニングサイトに上記（ii）でＰＣＲ合成したＨＩＳ２遺伝子断片をダイレクトクローニングにより連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｓｍ
ａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約３．０ｋｂｐと１．７３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＨＩＳ２と名付けた。
【００７７】
さらに、上記ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｌを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉで切断し、ｃｌｏｎｅｄ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行った後に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＨＩＳ２を制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断し、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｃａＩによる切断で、約１．７１ｋｂｐと１．６７ｋｂｐ、１．８９ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２と名付けた。
【００７８】
（iv）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株ＳＸ１３４０の作製
上記（iii）で作製したＥＲＧ６破壊用のプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断した。このＤＮＡ断片を上記（２）で作製したＳＸ１３３４株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ アデニンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００７９】
寒天培地上に生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、 ２％ポリペプトン、 ２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−Ｕ５２（配列番号３）とリバースプライマーＥＲＧ６−Ｄ３４（配列番号４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（i）で述べた条件で行った。比較対照として、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５Δ６−１株、およびＸ２１８１−１Ｂ株の染色体ＤＮＡを鋳型として同様にＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４０と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．７６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４０株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認された。
【００８０】
（４）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株へのＡＲＥ１遺伝子導入株の作製
（i）酵母発現用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵの作製
酵母細胞内で外来遺伝子を構成的に発現させるための３−ホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子（ＰＧＫ１）のプロモーター領域は、サッカロミセス・セレビジエＫＡ３１１Ａ株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３）の染色体ＤＮＡを鋳型にし、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−５Ａ（配列番号９）、リバースプライマーＰＰＧＫ１−３Ａ（配列番号１０）を用いたＰＣＲにて合成した。このプライマーの組み合わせで５'側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、３'側に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲはＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて（１）９４℃、２分、（２）９４℃、１分、（３）５５℃、１分、（４）７２℃、１分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、４分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約０．６ｋｂｐのＰＧＫ１プロモーターのＤＮＡ断片を確認した。
このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結した。連結物を用
いてエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出を行った。
得られたプラスミドをＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＰＧＫ１プロモーター）をGENE CLEAN II KIT（フナコシ社製）により抽出した。
【００８１】
一方、酵母発現用ベクターｐＡＤＮＳΔＥ（特開2004-141125）も同じくＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約６．５８ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出した。
上記２つのＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、エッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により約７．２ｋｂｐを確認したプラスミドを目的プラスミドとし、ｐＰＧ−ＬＥＵと名付けた。ｐＰＧ−ＬＥＵはプロモーターとしてＰＧＫ１プロモーター、ターミネーターとしてアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）由来のＡＤＨ１ターミネーターを持つ。
【００８２】
（ii）酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）の作製
上記（i）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵを制限酵素Ｈｐａ ＩとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断し、アガロースゲルから約５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出することで２μｍ
ＤＮＡを除き、得られたＤＮＡ断片を自己連結し、エッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により約５．４ｋｂｐを確認したプラスミドを目的プラスミドとし、ｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）と名付けた。
【００８３】
（iii）酵母発現用のＡＲＥ１、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡＲＥ１）を含むＤＮＡ断片、ＵＲＡ３、ＡＤＥ１を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＡＲＥ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＲＥ１−Ｓｍａ
Ｉ（Ｆ）（配列番号１１）とリバースプライマーＡＲＥ１−ＥｃｏＲ Ｉ（Ｒ）（配列番号１２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＲＥ１の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５'側には制限酵素Ｓｍａ Ｉの認識配列を、３'側にはＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。 ＵＲＡ３遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＵＲＡ３−２Ｆ（配列番号１３）とリバースプライマーＵＲＡ３−１Ｒ（配列番号１４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＵＲＡ３の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの２５４塩基前から終始コドンの１７８塩基後までを増幅することができる。また、合成された遺伝子断片中には開始コドンの２２３塩基前と終始コドンの１３６塩基後にＨｉｎｄ ＩＩＩの認識配列が含まれた形で合成される。ＡＤＥ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＤＥ１−Ｆ（配列番号１５）とリバースプライマーＡＤＥ１−Ｒ（配列番号１６）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＤＥ１の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの３４６塩基前から終始コドンの３１２塩基後までを増幅することができる。また、合成された遺伝子断片中には終始コドンの１０６塩基後にＥｃｏＲＶの認識配列が含まれた形で合成される。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．８３ｋｂｐのＡＲＥ１遺伝子断片を、約１．２３ｋｂｐのＵＲＡ３遺伝子断片を、約１．５７ｋｂｐのＡＤＥ１遺伝子断片を確認した。
【００８４】
（５）ＡＲＥ１発現用プラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）、ｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）の作製
上記（２）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、ＰＣＲ合成したＡＲＥ１遺伝子断片をＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．８３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）と名付けた。
【００８５】
次に、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＵＲＡ３遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断で、約２．６８ｋｂｐと１．２３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ−ＵＲＡ３と名付けた。
【００８６】
また、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のクローニングサイトに上記（iii）でＰＣＲ合成したＡＤＥ１遺伝子断片をダイレクトクローニングにより連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｐｅＩとＰｓｔＩによる切断で、約３．４７ｋｂｐと１．６２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＣＲ−Ｂ−ＡＤＥ１と名付けた。
【００８７】
続いて、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＸｂａＩとＳｍａＩで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行った後に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＣＲ−Ｂ−ＡＤＥ１をＳｐｅＩとＥｃｏＲＶで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約１．０１ｋｂｐと０．３９ｋｂｐ、２．６８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１と名付けた。
【００８８】
さらに、上記ｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）をＳｓｐＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＵＣ−ＵＲＡ３をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったもの、上記ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１をＰｓｔＩとＫｐｎＩで切断し、ｃｌｏｎｅ
ｄ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端平滑化処理を行ったものとをそれぞれＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＰｓｔ Ｉによる切断で、約３．５６ｋｂｐと３．０７ｋｂｐの断片が確認できたもの、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉによる切断で、約３．７４ｋｂｐと１．２９ｋｂｐ、１．８５ｋｂｐの断片が確認できたものをそれぞれ目的プラスミドとして、ｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）、ｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）と名付けた。
【００８９】
（６）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、ＫＡΔ５−４、ＳＸ１３４０へのＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５、ＳＸ１３５０株の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２、特開2004-141125に記載されたＫＡΔ５−４（以後、ＳＸ１３０７と記載する）のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記（３）で作製したＳＸ１３１３、ＳＸ１３１２株、ＳＸ１３０７株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＳＸ１３１３株の形質転換を行ったＳＤ寒天培地にのみ２０ｍｇ／ｌ アデニン、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジンを添加した。
【００９０】
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【００９１】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１４（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１８（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３１５（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【００９２】
さらに、ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３４０のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、上記と同様に以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＡＤＥ１−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。また、ＡＲＥ１を導入していない対照株を作製するため、上記（５）で作製したｐＵＣ１９−ＡＤＥ１を制限酵素ＨｐａＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（３）で作製したＳＸ１３４０株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ
寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【００９３】
寒天培地上に生育してきたアデニンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【００９４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５０（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５０株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
また、ｐＵＣ１９−ＡＤＥ１をＨｐａＩで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＡＤＥ１−１Ｆ（配列番号１９）とリバースプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＤＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５３と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５３株は相同組換えによりＡＤＥ１遺伝子が相補されたことが確認された。
【００９５】
（７）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株へのＹＥＨ１遺伝子導入株の作製
（i）酵母発現用のＹＥＨ１、ＧＡＬ１遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子（ＹＥＨ１）を含むＤＮＡ断片、ＧＡＬ１を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＹＥＨ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＹＬＬ−ＯＦ（配列番号２１）とリバースプライマーＹＬＬ−ＯＲ（配列番号２２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＹＥＨ１の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５'側と３'側の両側に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００９６】
ＧＡＬ１遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＧＡＬ１−５１（配列番号２３）とリバースプライマーＧＡＬ１−３１（配列番号２４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＧＡＬ１の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４９９塩基前から終始コドンの２３０塩基後までを増幅することができる。また、５’側と３’側の両側に制限酵素ＳｍａＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００９７】
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．７２ｋｂｐのＹＥＨ１遺伝子断片を、約２．３３ｋｂｐのＧＡＬ１遺伝子断片を確認した。
【００９８】
（ii）ＹＥＨ１発現用プラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）、ｐＰＧＧＡＬ−ＹＥＨ１（−２μ）の作製
上記（４）(ii)で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＹＥＨ１遺伝子断片をＥｃｏＲ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．７２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【００９９】
次に、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＳｍａＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ＰＣＲ合成したＧＡＬ１遺伝子断片をＳｍａＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＰｖｕIIによる切断で、約０．４８ｋｂｐと０．７２ｋｂｐ、１．４５ｋｂｐ、２．３６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＵＣ１９−ＧＡＬ１と名付けた。
続いて、上記ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＳｓｐＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＵＣ１９−ＧＡＬ１をＳｍａＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断で、約３．３０ｋｂｐと２．６６ｋｂｐの断片が確認でき、さらに制限酵素ＳｃａＩによる切断で、約１．２８ｋｂｐと４．６８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧ−ＧＡＬ１（−２μ）と名付けた。さらに、上記ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＢａｍＨＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、上記ｐＰＧ−ＧＡＬ１（−２μ）をＢａｍＨＩで切断したものとをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＨｉｎｄIIIによる切断で、約０．３７ｋｂｐと０．５７ｋｂｐと０．１９ｋｂｐと３．７３ｋｂｐと２．８２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＧＡＬ１−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【０１００】
（iii）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５、ＳＸ１３５０へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３１７、ＳＸ１３２０、ＳＸ１３２２、ＳＸ１３５１株の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加
水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｎｄｅ Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、（４）(ii)で作製した酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（６）で作製したＳＸ１３１４、ＳＸ１３１８、ＳＸ１３１５株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＳＸ１３１４株に対して形質転換を行ったＳＤ寒天培地にのみ２０ｍｇ／ｌアデニン、３０ｍｇ／ｌ Ｌ−リジンを添加した。
【０１０１】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１７（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３２０（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３２２（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１７，ＳＸ１３２０、ＳＸ１３２２株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１０３】
また、プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）をＢｓｐ１４０７Ｉで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３１６（ＹＰＨ４９９株由来）、ＳＸ１３１９（ＦＹ１６７９−０６ｃ株由来）、ＳＸ１３２１（ＫＡ３１１Ａ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３１６，ＳＸ１３１９、ＳＸ１３２１株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１０５】
さらに、ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３５０のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、上記と同様に以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＧＡＬ１−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉ（ＹＥＨ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記（６）で作製したＳＸ１３５０株に上記（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＧ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ガラクトース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１０６】
ガラクトースを炭素源として寒天培地上に生育してきたアデニンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養
液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件で行った。
【０１０７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３５１（Ｘ２１８１−１Ｂ株由来）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３５１株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１０８】
（実施例２）
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２の発現ｌｏｃｕｓの異なるARE1およびYEH1増強株の作製
（１）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３２６の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１０９】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２６と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２６株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１１０】
（２）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３１８、ＳＸ１３２６株への発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３２５、ＳＸ１３３２の作製
（i）ＹＥＨ１発現用プラスミドｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）の作製
上記実施例１（５）で作製したプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行ったものと、ｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）をＢａｍＨ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩによる切断で、約４．８８ｋｂｐと１．６４ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）と名付けた。
【０１１１】
（ii）ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１８、１３２６への発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３２５、ＳＸ１３３２株の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１８のｌｅｕ２遺伝子座と、ＳＸ１３２６のゲノム上のｕｒａ３遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（leu2遺伝子中）で切断し、ｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＳｔｕＩ（ura3遺伝子中）で切断した。これらのＤＮＡ断片をＳＸ１３１８とＳＸ１３２６株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１１２】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）とリバースプライマーＹＬＬ−Ｓｅｑ３Ｒ（配列番号２８）、フォワードプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）とリバースプライマーＹＥＨ１−ｓｅｑＲ１（配列番号３０）の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上とｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２５（ｌｅｕ２遺伝子座）とＳＸ１３３２（ｕｒａ３遺伝子座）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．８ｋｂｐと約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ検出された。従って、ＳＸ１３２５，ＳＸ１３３２株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１１４】
（３）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２への発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１遺伝子導入株ＳＸ１３２７の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のｕｒａ３遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素ＳｔｕＩ（ｕｒａ３遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）とリバースプライマーＡＲＥ１−ＲＲ（配列番号３１）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１５】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２６と名付けた形質転
換体は目的サイズと同じ約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２７株のゲノムのｕｒａ３遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１１６】
（４）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３２７株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３３３の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３２７のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素ＮｄｅＩ（YEH1遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片をＳＸ１３２７株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３３（ＹＥＨ１遺伝子座）と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３３株のゲノムのＹＥＨ１遺伝子座には上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１１８】
（５）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を導入していないｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３３５株の作製
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたウラシルおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１１９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３２９と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３２９株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１２０】
次に、酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片を上記で作製したＳＸ１３２９株に上記実施例１（２）と
同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１２１】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１２２】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３５と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３５株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１２３】
（実施例３）
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のARE2およびYEH1増強株の作製
（１）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ２遺伝子導入株ＳＸ１３４２の作製
（i）酵母発現用のＡＲＥ２遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビジエ由来アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡＲＥ２）を含むＤＮＡ断片は、上記実施例１（１）で取得したサッカロミセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
ＡＲＥ２遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＡＲＥ２−ＳｍａＩ（Ｆ）（配列番号３２）とリバースプライマーＡＲＥ２−ＥｃｏＲＩ（Ｒ）（配列番号３３）を用いた。このプライマーの組み合わせでＡＲＥ２の蛋白質コード領域である開始コドンから終始コドンまでを増幅することができる。また、５’側には制限酵素ＳｍａＩの認識配列を、３’側にはＥｃｏＲＩの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、（１）９８℃、２分、（２）９８℃、１０秒、（３）５５℃、５秒、（４）７２℃、２分、（２）から（４）の反応を３０回繰り返し、（５）７２℃、７分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．９３ｋｂｐのＡＲＥ２遺伝子断片を確認した。
【０１２４】
（ii）ＡＲＥ２発現用プラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）の作製
上記実施例１（４）で作製したプラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、ＰＣＲ合成したＡＲＥ２遺伝子断片をＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、２％寒天）上に生育したコロニーからプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩによる切断で、約５．４ｋｂｐと１．９３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的プラスミドとして、ｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）と名付けた。
【０１２５】
（iii）ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２へのＡＲＥ２遺伝子導入株ＳＸ１３４２株の作製
ｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３１２のゲノム上のＡＲＥ２遺伝子座へさらにＡＲＥ２遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ２発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＡＲＥ２（−２μ）を制限酵素ＳａｌＩ（ＡＲＥ２遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片を上記実施例１（３）で作製したＳＸ１３１２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、２０ｍｇ／ｌ ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ２−Ｒ１（配列番号３４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１２６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４２と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４２株のゲノムのＡＲＥ２遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ２遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１２７】
（２）ＡＲＥ２遺伝子を導入したＳＸ１３４２株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３４６の作製
ＡＲＥ２遺伝子を導入したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株ＳＸ１３４２のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（１）で作製したＳＸ１３４２株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、ＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１２８】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル、ヒスチジン、トリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４６と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４６株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１２９】
また、プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３をＳｔｕＩで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）
とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４７と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４７株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１３１】
（実施例４）
サッカロミセス・セレビジエ ＦＹ１６７９−０６ｃ株のARE1およびYEH1増強株の作製
（１）ＦＹ１６７９−０６ｃ株へのＡＲＥ１遺伝子増強株ＳＸ１３３０の作製
サッカロミセス・セレビジエ ＦＹ１６７９−０６ｃ株のゲノム上のＡＲＥ１遺伝子座へさらにＡＲＥ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＲＥ１発現用のプラスミドｐＰＧＵ−ＡＲＥ１（−２μ）を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ（ＡＲＥ１遺伝子中）で切断した。このＤＮＡ断片をＦＹ１６７９−０６ｃ株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１３２】
寒天培地上に生育してきたウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＡＲＥ１−ｃｈｅｃｋ（配列番号１８）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＡＲＥ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３０と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３０株のゲノムのＡＲＥ１遺伝子座に上記相同組換えによりＡＲＥ１遺伝子が導入され、合計２コピー存在することが確認された。
【０１３４】
（２）ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３３０株へのＹＥＨ１遺伝子導入株ＳＸ１３３７の作製
ＡＲＥ１遺伝子を導入したＳＸ１３３０株のゲノム上のＹＥＨ１遺伝子座へさらにＹＥＨ１遺伝子を導入することを目的として、以下の工程を行った。サッカロミセス・セレビジエ由来ステリルエステル加水分解酵素をコードする遺伝子ＹＥＨ１発現用のプラスミドｐＰＧＬ−ＹＥＨ１（−２μ）を制限酵素Ｎｄｅ Ｉ（YEH1遺伝子中）で切断した。また、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（４）(ii)で作製した酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。これらのＤＮＡ断片を上記（１）で作製したＳＸ１３３０株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１３５】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｆ（配列番号１７）とリバースプライマーＹＥＨ１−ＲＲ（配列番号２５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＹＥＨ１遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３７と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３７株のゲノムには上記相同組換えによりＹＥＨ１遺伝子が導入され、２コピー存在していることが確認された。
【０１３７】
また、プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）をＢｓｐ１４０７Ｉで切断したＤＮＡ断片を用いて形質転換を行った株については、フォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１３８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３３８と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３３８株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１３９】
（３）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を導入していない対照株ＳＸ１３４８の作製
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を導入していない対照株を作製するため、上記実施例１（５）で作製した酵母組換え用プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。このＤＮＡ断片をＦＹ１６７９−０６ｃ株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファン、１００ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１４０】
寒天培地上に生育してきたウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２０）とリバースプライマーＵＲＡ３−ＲＲ（配列番号２９）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｕｒａ３遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
【０１４１】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４３と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４３株は相同組換えによりＵＲＡ３遺伝子が相補されたことが確認された。
次に、酵母組換え用プラスミドｐＰＧ−ＬＥＵ（−２μ）を制限酵素Ｂｓｐ１４０７ Ｉで切断した。このＤＮＡ断片を上記で作製したＳＸ１３４３株に上記実施例１（２）と同様に酢酸リチウム法、もしくはエレクトロポレーション法で形質転換し、各２０ｍｇ／ｌ Ｌ−ヒスチジン、トリプトファンを含むＳＤ寒天培地（０．６７％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース、２％寒天）に播き、３０℃で３〜５日間培養した。
【０１４２】
寒天培地上に生育してきたロイシンおよびウラシル非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培
地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）２ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養を行った。この培養液から上記実施例１（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＰＰＧＫ１−Ｒ１（配列番号２６）とリバースプライマーＬＥＵ２−Ｒ２（配列番号２７）の組み合わせでＰＣＲを行い、ｌｅｕ２遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記実施例１（２）で述べた条件で行った。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＳＸ１３４８と名付けた形質転換体は目的サイズと同じ約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された。従って、ＳＸ１３４８株は相同組換えによりＬＥＵ２遺伝子が相補されたことが確認された。
【０１４３】
（実施例５）
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強した各種株のステロール類の分析
（１）各種酵母株の培養、およびステロール類の分析
実施例１〜４で作製した各種株を０．５％グルコースを炭素源とした２ｍｌのＹＰＡＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン）に１白金耳植菌し、３０℃、１８時間培養し、種菌とした。この酵母培養液から初期ＯＤ６６０＝０．２となる分量の培養液を回収し、４℃、１０，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行い、培養上清を除去した。菌体ペレットに０．１ｍｌの０．８５％生理食塩水を添加、懸濁し、２％グルコースを炭素源とした５ｍｌのＹＰＡＤ液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン）に播種し、３０℃、７２時間培養を行った。酵母培養液０．５ｍｌを４℃、１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行い、菌体を回収した。菌体ペレットにエタノール０．４ｍｌと４０％水酸化カリウム水溶液０．０２ｍｌを添加し、８０℃、９０分間振とうを行い、菌体内に蓄積したステロールエステルのケン化処理を行った。この液を３５℃で減圧濃縮機にかけ、濃縮乾固させた。
得られた濃縮乾固物にエタノール０．１ｍｌと滅菌水０．０５ｍｌを加え懸濁し、さらにヘプタン０．８ｍｌを添加し激しく混和した後、室温で１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離することで水層と油層に分離した。上層のヘプタン層を別のチューブに取り、残った水層に再度、エタノール０．１ｍｌとヘプタン０．８ｍｌを添加し、抽出操作を繰り返した。抽出した約１．６ｍｌのヘプタン溶液に滅菌水０．０４ｍｌを添加し、激しく混和した後、再度、室温で１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離することで水層と油層に分離した。約１．６ｍｌのヘプタン層を回収し、３５℃で減圧濃縮機にかけ、濃縮乾固させた。得られた濃縮乾固物は０．２ｍｌトルエンに再溶解し、テストステロンを内部標準としてガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析を行った。結果を図１〜８に示す。
【０１４４】
（２）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図１（ａ）に示した通り、ＹＰＨ４９９を親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１６）に対して、ＡＲＥ１とＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１７）では、ＺＹＭＯの蓄積量が減少し、ＴＥＯＬの蓄積量が増加していることがわかった。このことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
一方、図２（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３１９）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２０）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＦＹ１６７０−０６ｃを親株とした場合でも明らかとなった。
【０１４５】
次に、図３（ａ）に示した通り、ＫＡ３１１Ａを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２１）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３２２）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＫＡ３１１Ａを親株とした場合でも明らかとなった。
さらに、図４（ａ）に示した通り、Ｘ２１８１−１Ｂを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５０）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３５１）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることがＸ２１８１−１Ｂを親株とした場合でも明らかとなった。
【０１４６】
（３）発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図５（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製した、発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＡＲＥ１増強株において、ＹＥＨ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２いずれのｌｏｃｕｓでＹＥＨ１を発現させた株でも同等のＴＥＯＬ蓄積を示した。このことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１をどのようなｌｏｃｕｓで発現増強させても、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
一方、図６（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製した、発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＹＥＨ１増強株において、ＡＲＥ１、ＵＲＡ３いずれのｌｏｃｕｓでＡＲＥ１を発現させた株でも同等のＴＥＯＬ蓄積を示した。このことからＹＥＨ１増強下においてＡＲＥ１をどのようなｌｏｃｕｓで発現増強させても、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが明らかとなった。
【０１４７】
（４）ＡＲＥ２、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株のステロール類の分析
図７（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ２のみを増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４７）に対して、さらにＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株（ＳＸ１３４６）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＴＥＯＬ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ２増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが、ＡＲＥ２をステロールアシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼとして用いた場合でも明らかとなった。
【０１４８】
（５）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強した株のステロール類の分析
図８（ａ）に示した通り、ＦＹ１６７９−０６ｃを親株として作製したＡＲＥ１のみを増強した株（ＳＸ１３３８）に対して、さらにＹＥＨ１を増強した株（ＳＸ１３３７）でも、ＺＹＭＯ蓄積量が減少し、ＥＲＧＯ蓄積量が増加した。これらのことからＡＲＥ１増強下においてＹＥＨ１を増強することにより、ＴＥＯＬの前駆体であるＺＹＭＯを減らし、ＴＥＯＬの蓄積を向上させることが、ｅｒｇ５ｅｒｇ６二重破壊をしていない株を用いた場合でも明らかとなった。
【０１４９】
（実施例６）
ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強した各種株の転写量の分析
（１）酵母からの全ＲＮＡの調製
実施例５で調製した各種株について、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔおよ
びＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを以下のとおり調製した。
上記実施例５と同様に菌体を培養した後、回収した培養液を用いて、２×１０7個になるよう酵母菌体溶液を調製し（ＯＤ６６０＝１が、約１．５×１０7個として細胞数を調製）、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して得られた菌体を０．８５％生理食塩水に懸濁し、再度、４℃、１０，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離を行った。得られた菌体は、キット付属のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ ０．６ｍｌと２−メルカプトエタノール ６μｌで懸濁し、この懸濁液をＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ社製）のチューブに移し、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて室温で６，０００ｒｐｍ、１分間破砕を行った。この菌体破砕液をゲノムＤＮＡ除去ミニスピンカラムに入れ、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ付属の使用説明書に従い、全ＲＮＡの調製を行った。オプションとして全ＲＮＡのカラム吸着後にＤＮａｓｅ ｍｉｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ０．０８ｍｌを添加し、室温で１５分間静置し、染色体ＤＮＡの分解を行った。また、最後に５０℃で保温したＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加え、室温で１分間静置し、遠心分離にて全ＲＮＡを溶出した。
【０１５０】
（２）逆転写反応
上記（１）で調製した全ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、付属の使用説明書に従い、逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、３００ｎｇの全ＲＮＡ、プライマーとして５０μＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）20を使用した。
【０１５１】
（３）定量ＰＣＲ
定量ＰＣＲの反応は、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いて、付属の使用説明書に従って反応を行い、（１）９５℃、１０秒、（２）９５℃、５秒、（３）６０℃、２０秒、（２）から（３）の反応を４０回繰り返した。温度変化速度はいずれも２０℃／秒とした。また、融解曲線分析を（１）９５℃、０秒、（２）６５℃、１５秒、（３）９５℃、０秒で行い、温度変化速度はいずれも２０℃／秒とした。ＰＣＲプライマーとして、ＡＲＥ１の定量ＰＣＲにはＡＲＥ１−Ｆ（配列番号３５）とＡＲＥ１−Ｒ（配列番号３６）、ＡＲＥ２の定量ＰＣＲにはＡＲＥ２−Ｆ（配列番号３７）とＡＲＥ２−Ｒ（配列番号３８）、ＹＥＨ１の定量ＰＣＲにはＹＥＨ１−Ｆ（配列番号３９）とＹＥＨ１−Ｒ（配列番号４０）を使用した。また、発現コントロールとしてアクチンをコードしているＡＣＴ１を用い、ＡＣＴ１−Ｆ（配列番号４１）とＡＣＴ１−Ｒ（配列番号４２）をプライマーとして使用した。
定量分析には、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のＬｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ、およびＬｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．３．５を用い、Ｆｉｔ
Ｐｏｉｎｔ法を用いて分析を行った。この結果を図１および図２の（ｂ）、（ｃ）に示す。
【０１５２】
（４）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１遺伝子を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
図１（ｂ）、（ｃ）で示した通り、ＹＰＨ４９９のｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析を行った結果、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３１６ではＡＲＥ１の転写量が、ＳＸ１３１３に比べ増加しており、発現増強されていることが確認できた。また、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３１７のＡＲＥ１、ＹＥＨ１それぞれの転写量もＳＸ１３１３に比べて増加していることから、両遺伝子とも発現増強されていることが確認できた。
同様に、ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図２（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３１２に対して、ＡＲＥ１のみを増強
したＳＸ１３１９はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３２０はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５３】
続いて、ＫＡ３１１Ａのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図３（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３０７に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３２１はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３２２はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
さらに、Ｘ２１８１−１Ｂのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図４（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３５３に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３５０はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３５１はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５４】
（５）発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊、ＡＲＥ１増強株を親株として、発現ｌｏｃｕｓの異なるＹＥＨ１を強化した株における転写解析の結果（図５（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３１９に対して、ＳＸ１３２０（YEH1 locus）、ＳＸ１３３２（URA3 locus）、ＳＸ１３２５（LEU2 locus）いずれの株も、ＹＥＨ１の転写量が増加していることが確認できた。
【０１５５】
さらに、ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株として、発現ｌｏｃｕｓの異なるＡＲＥ１をＹＥＨ１とともに強化した株における転写解析の結果（図６（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３３５に対して、ＳＸ１３２０（ARE1 locus）、ＳＸ１３３３（URA3 locus）いずれの株も、ＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５６】
（６）ＡＲＥ２、ＹＥＨ１を増強したｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃのｅｒｇ５、ｅｒｇ６二重破壊株を親株とした株における転写解析の結果（図７（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３３５に対して、ＡＲＥ２のみを増強したＳＸ１３４７はＡＲＥ２の転写量が増加し、ＡＲＥ２とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３４６はＡＲＥ２とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５７】
（７）ＡＲＥ１、ＹＥＨ１を増強した株の転写量の分析
ＦＹ１６７９−０６ｃを親株とした株における転写解析の結果（図８（ｂ）、（ｃ））、ＳＸ１３４８に対して、ＡＲＥ１のみを増強したＳＸ１３３８はＡＲＥ１の転写量が増加し、ＡＲＥ１とＹＥＨ１をともに増強したＳＸ１３３７はＡＲＥ１とＹＥＨ１それぞれの転写量が増加していることが確認できた。
【０１５８】
なお、表１に、図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１５９】
【表１】
【０１６０】
また、表２に、図２（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
表３に、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重
量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６３】
【表３】
【０１６４】
表４に、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
表５に、図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６７】
【表５】
【０１６８】
表６に、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１６９】
【表６】
【０１７０】
表７に、図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ２とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１７１】
【表７】
【０１７２】
表８に、図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の数値データを示す。数値は、（A）乾燥菌体重量１ｇあたりのステロール蓄積量ｍｇで示した。（B）ＡＣＴ１に対する転写量比として、ＡＲＥ１とＡＣＴ１、ＹＥＨ１とＡＣＴ１の発現量比をそれぞれ示した。
【０１７３】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によって製造されるΔ５，７−ステロールは、医薬分野、化粧品分野、食品分野等で有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母。
【請求項２】
さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）及びステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低減するように改変された、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）の発現が低減するように改変された、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性から選択される少なくとも一つの活性を有するように改変された請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール３位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性を有するように改変された請求項３に記載の酵母。
【請求項６】
サッカロミセス・セレビジエである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項７】
親株がサッカロミセス・セレビジエYPH499株、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株、サッカロミセス・セレビジエKA311A株またはサッカロミセス・セレビジエX2181-1B株である、請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母を培養してΔ５，７−ステロールを生成・蓄積させ、Δ５，７−ステロールを回収する、Δ５，７−ステロールの製造方法。
【請求項９】
培養する酵母が請求項１又は２に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがＣ５，７−ジエン体ステロールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ５，７−ジエン体ステロールがコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールまたは７−デヒドロコレステロールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培養する酵母が請求項１又は３に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴスタ−5,7,24-トリエノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
培養する酵母が請求項１に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴステロールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の酵母を培養してハイドロコルチゾンを生成・蓄積させ、ハイドロコルチゾンを回収する、ハイドロコルチゾンの製造方法。
【請求項１】
アシルＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とステリルエステル加水分解酵素遺伝子の発現が増強されるように改変された酵母。
【請求項２】
さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）及びステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ERG6）の発現が低減するように改変された、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
さらに、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（ERG5）の発現が低減するように改変された、請求項１に記載の酵母。
【請求項４】
さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール3位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性から選択される少なくとも一つの活性を有するように改変された請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
さらに、Δ７−還元活性、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性、ステロール３位酸化異性化活性、ステロイド１７α水酸化活性、ステロイド２１位水酸化活性、及びステロイド１１β位水酸化活性を有するように改変された請求項３に記載の酵母。
【請求項６】
サッカロミセス・セレビジエである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項７】
親株がサッカロミセス・セレビジエYPH499株、サッカロミセス・セレビジエFY1679-06ｃ株、サッカロミセス・セレビジエKA311A株またはサッカロミセス・セレビジエX2181-1B株である、請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母を培養してΔ５，７−ステロールを生成・蓄積させ、Δ５，７−ステロールを回収する、Δ５，７−ステロールの製造方法。
【請求項９】
培養する酵母が請求項１又は２に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがＣ５，７−ジエン体ステロールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ５，７−ジエン体ステロールがコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オールまたは７−デヒドロコレステロールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
培養する酵母が請求項１又は３に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴスタ−5,7,24-トリエノールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
培養する酵母が請求項１に記載の酵母であり、Δ５，７−ステロールがエルゴステロールである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の酵母を培養してハイドロコルチゾンを生成・蓄積させ、ハイドロコルチゾンを回収する、ハイドロコルチゾンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２４０８４（Ｐ２０１２−２４０８４Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４２２８２（Ｐ２０１１−１４２２８２）
【出願日】平成２３年６月２７日（２０１１．６．２７）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２７日（２０１１．６．２７）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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