新規酵素
【課題】新規酵素を提供する。
【解決手段】ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列が対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、該ルシフェラーゼ酵素が、当該部位に対応の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素。
【解決手段】ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列が対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、該ルシフェラーゼ酵素が、当該部位に対応の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵素、特に対応の野生型酵素と比較して増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼ酵素、アッセイにおける前記酵素の使用及び前記酵素を含む試験キットに関する。
ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ2+及び分子酸素の存在下、光の生成を伴うルシフェリンの酸化を触媒する。この反応は約０．８８の量子収率を有する。前記ルシフェラーゼの発光特性は、ＡＴＰレベルを測定する種々の発光（luminometric）アッセイにおける前記酵素の使用を導く。前記のアッセイの例には、EP-B-680515及びWO96/02665の記載に基づくアッセイが含まれる。
ルシフェラーゼは、昆虫の体、特にホタル又はツチボタル等の甲虫から直接得ることができる。ルシフェラーゼが得られる特定の種には、ニホンゲンジボタル又はケイケ（KEIKE）ボタル、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）及びルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、東欧ホタルであるルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）、北米ホタルであるフォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）並びにツチボタルであるラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）が含まれる。ルシフェラーゼを得ることができるその他の種は、Ye ら., Biochimica et Biophysica Acta, 1339 （1997） 39-52に記載されている。Vivianiら, Biochemistry, 38, （1999） 8271-8279に記載される更なる種は、フィリキソシックス（Phrixothrix）（レールロードワーム（railroad-worms））である。
しかしながら、これらの酵素をコードする多くの遺伝子がクローニングされかつ配列決定されているので、組換えＤＮＡ技術を使用しても製造することができるだろう。前記酵素をコードする組換えＤＮＡ配列を使用して、大腸菌（E.coli）等の微生物を形質転換し、所望の酵素生成物を発現させる。
野生型及び組換え型ルシフェラーゼの熱安定性は、約３０℃、特に３５℃を超える温度に曝露したときにその活性が急速に消失する程度である。この不安定性は、高い周囲温度下で酵素を保存するか又は、例えば反応速度を高くするために高温反応条件下アッセイを行うときに問題を起こす。
増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼはEP-A-524448及びW095/25798より既知である。前者は、ニホンボタルのルシフェラーゼにおいてスレオニン残基をイソロイシン残基で置換することにより部位２１７に変異を有する変異ルシフェラーゼを記載している。後者は、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼと６０％をこえる類似性を有するが、フォティナス・ピラリスの部位３５４のアミノ酸残基又はルシオラ種の部位３５６に対応するアミノ酸残基がグルタメート以外になるように変異している変異ルシフェラーゼを記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本件出願人は、増加した熱安定性をもたらし、かつ当該技術分野において既知の変異体を補完する更なる変異体を見いだした。
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ（Hotaria paroula）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（Pyrophorus plagiophthalamus）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ（Pyrocoelia nayako）、フォティナス・ペンシランヴァニカ（Photinus pennsylanvanica）又はフィリキソシックス由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列において、
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基、
のなかの少なくとも１つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、前記ルシフェラーゼ酵素は、当該部位に特定種の対応野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素を提供する。
【０００３】
好ましくは、前記タンパク質はルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有している。
特に、前記タンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、野生型ルシフェラーゼの配列、例えばフォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス （グリーン−Ｌｕｃ ＧＲ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （イエローグリーン Ｌｕｃ ＹＧ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （イエロー−Ｌｕｃ ＹＥ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （オレンジ−Ｌｕｃ ＯＲ）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＬＹ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＫＷ、フォティナス・ペンシランヴァニカ Ｊ１９又はフィリキソシックス・グリーン（ＰｖGR）若しくはレッド（ＰｈRE）の配列を実質的に有する。
但し、前記タンパク質は、野生型酵素のアミノ酸とは異なるように操作された１以上、例えば１００までのアミノ酸残基、好ましくはせいぜい５０、より好ましくはせいぜい３０のアミノ酸を含んでいてもよい。
特に、基質Ｄ−ルシフェリン（４，５−ジヒドロ−２−［６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル］−４−チアゾール カルボン酸）を使用して光放射を生じることができる種に由来する生物発光酵素は、本発明の変異体酵素の基礎を形成するだろう。
実施例によると、本発明のルシフェラーゼは、フォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも１つを有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基に変化している、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外に変化している、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基がロイシン以外に変化している、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基がアラニン以外に変化している、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外に変化している、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がセリン以外に変化している、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外に変化している。
【０００４】
本発明のタンパク質がルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来酵素の配列を実質的に有する場合、以下の変化のうちの少なくとも１つを有する。
（ａ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基礎とする配列では）グリシン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基礎とする配列では）アスパラギン以外である。
（ｂ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がセリン以外である。
（ｃ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外である。
（ｄ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外である。
（ｅ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がリジン以外である。
（ｆ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｇ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｈ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外である。
（ｉ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基本とする配列では）スレオニン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基本とする配列では）バリン以外である。
【０００５】
熱安定性を増強させる全ての場合における特定の置換アミノ酸は、以下に説明されるようなルーチンの方法により決定することができる。それぞれの場合において、異なる置換が熱安定性の増強を引き起こすだろう。当業者に理解されるように、置換は、天然又は適切な変異体タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により行うことができるだろう。この場合において本発明は熱安定性と関連するタンパク質の同定と関連する。
しかしながら、一般的には、野生型のアミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸で置換することを考慮することが好ましい。したがって、ある場合においては、親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基（逆も又同様）で好ましく置換するだろう。同様に、酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換するだろう。
例えば、本発明のタンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも６０％の類似性を有し、その配列内に以下の変化のうち少なくとも１つを有し、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である。
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である。
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。
【０００６】
種々のルシフェラーゼの全ての配列は、高度に保存されて、これら酵素間で有意な程度の類似性を有していることを示す。このことは、配列を調査して最も類似している領域を検出することにより酵素配列間の対応領域が容易に決定可能であることを示している。必要ならば、種々の配列間対応領域又は特定のアミノ酸を決定するために市販のソフト（例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループの「Bestfit」、Devereuxら（1984） Nucleic Acid Research 12: 387-395を参照のこと）を使用することができる。代替又は追加として、対応の酸を、文献：L. Yeら, Biochim. Biophys Acta 1339 (1997) 39-52により決定することができる。前記文献で使用する番号方式（numbering system）は、本件出願で使用した番号方式の基礎を形成する。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基の可能な変化について、極性アミノ酸スレオニンは、非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するスレオニン残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。
より好ましい置換はシステインによるものである。しかしながら、この部位における異なる極性残基、例えばアスパラギンも、当該部位にスレオニンを有する対応の酵素の熱安定性を増強するだろう。
野生型ルシフェラーゼ酵素においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、グリシン（ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ）、アスパラギン（ピロフォラス・プラギオフタラマス、ＧＲ、ＹＣ、ＹＥ及びＯＲ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロセリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＬＹ、ＫＷ、Ｊ１９）及びセリン（フィリキソシックス・ルシフェラーゼの部位２１１）が含まれる。非極性又は異なる非極性側鎖、例えばアラニン及びシステインで置換することは有利であろう。
【０００７】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基の可能性のある変化について、非極性アミノ酸であるイソロイシンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどで適切に置換される。野生型の配列においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、セリン及びアスパラギン（それぞれ、フィトシックス・グリーン（Phritothix green）及びレッド（Phritothix red）における対応の２２９番目の部位におけるバリン又はアラニンと同じ）が含まれる。適切には、これらの極性残基は、非極性残基、例えば前記にて概略を述べたものにより置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応する残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスの残基２３４に対応する残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。このことは、野生型配列に対するアミノ酸の変化を示している。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう（これは、フィリキソシックス・ルシフェラーゼの残基２９２に対応する）。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるフェニルアラニン又はロイシンである。これらは異なる非極性アミノ酸で改変される。例えば、フォティナス・ピラリスでは、非極性アミノ酸フェニルアラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン又はシステインにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するフェニルアラニン残基についての特に好ましい置換はロイシンによるものである。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６（フィリキソシックス由来ルシフェラーゼではアミノ酸残基１３）に対応するアミノ酸残基における変異も可能である。このアミノ酸残基（通常はフェニルアラニンであるが、ロイシン、セリン、アルギニン又はある場合ではチロシンであってもよい）は、異なるアミノ酸、特に異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン、好ましくはアラニンへ適切に改変するだろう。
【０００８】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５又はルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７に対応するアミノ酸残基（その他のルシオラ種及びフィリキソシックスにおけるアミノ酸３８に対応する）における変異も有効であろう。このアミノ酸は野生型酵素間で変化し、この部位におけるロイシン（フォティナス・ピラリス）だけでなく、リジン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、グルタミン及びアスパラギン酸も含まれるだろう。適切には、この部位におけるアミノ酸残基は、非極性アミノ酸残基又は異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。この部位における好ましいアミノ酸はアラニンであり、これは野生型酵素とは異なるものである。
フォティナス・ピラリス由来配列の部位１４に対応するアミノ酸における変異及び／又はフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基における変異は、好ましくはこの酵素における唯一の変異ではない。これらの変異は、前記で定義したその他の変異、特にフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１４、３９５又は２３２に対応する部位における変異を適切に伴う。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼにおける残基１０５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基（フィリキソシックスにおける残基１０２）の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるアラニン又はグリシンであり、フィリキソシックスではセリンであろう。これらのアミノ酸は異なる非極性アミノ酸により適切に改変される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、非極性アミノ酸アラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン等により適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの残基１０５に対応するアラニン残基についての特に好ましい置換はバリンによるものである。
【０００９】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６（フィリキソシックスにおける残基２３１）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸はアスパラギン酸又はグリシンであり、ある場合においてはグルタミン又はスレオニンである。これらは、非極性アミノ酸又は異なる非極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、アミノ酸残基アスパラギン酸は、非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するフェニルアラニン残基の置換に特に好ましいのはグリシンによるものである。非極性アミノ酸残基、例えばグリシンが（例えば、ルシオラ由来ルシフェラーゼにおいて）この部位に存在する場合、グリシンは異なる非極性アミノ酸により適切に置換されるだろう。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２（フィリキソシックス・グリーンにおける残基４１７及びフィリキソシックス・レッドにおける残基４１８）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸は無電荷極性アミノ酸であるセリン又はスレオリン又はグリシンである。これらは、異なる無電荷極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、セリンは、アスパラギン、グルタミン、スレオニン又はチロシン、特にスレオニンにより適切に置換される。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。この部位におけるアミノ酸は既知のルシフェラーゼタンパク質の間で変化し、フォティナス・ピラリス、ピロセリア・ナヤコ、ラムピリス・ノクチルカ及びある形態のフォティナス・ペンシランヴァニカ由来ルシフェラーゼではヒスチジンであり、ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ及びフィリキソシックス（アミノ酸残基３０７）由来ルシフェラーゼではスレオニンであり、ルシオラ・クルシアタ及びルシオラ・ラテラリスではバリンであり、あるピロフォラス・プラギオフタラマス由来ルシフェラーゼではアスパラギンである。したがって、一般的に、この部位におけるアミノ酸は親水性アミノ酸であり、これを異なるアミノ酸残基に換えて、酵素の熱安定性を増加させてもよい。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するヒスチジン残基に対する特に好ましい置換はアルギニンによるものである。
【００１０】
酵素内にその他の変異が存在していてもよい。例えば、好ましい態様では、タンパク質は、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸３５４に対応する部位（ルシオラ由来ルシフェラーゼにおける部位３５６及びフィリキソシックス由来ルシフェラーゼの部位３５１）にグルタミンから、特にグリシン、プロリン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変化したアミノ酸を有する。適切には、この部位におけるアミノ酸はトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンであり、特に好ましくはリジン又はアルギニンである。この変異はWO 95/25798に記載されている。
代替の好ましい態様では、EP-A-052448に記載されるように、タンパク質は、ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７に対応する部位が、疎水性アミノ酸、特にイソロイシン、ロイシン又はバリンに換わったアミノ酸を有している。
タンパク質は、当該タンパク質のルシフェラーゼ活性が過度に妥協しないことを条件に配列内に更に変異を含んでいてもよい。その変異は酵素の特性を適切に増強するか、又は、ある場合においては意図する目的により適するようにする。
このことは、更なる変異が熱安定性及び／又はカラーシフト特性及び／又はＡＴＰに対する酵素のＫmの増強を引き起こすことを意味する。カラーシフトを引き起こす変異の例はWO95/18853に記載されている。Ｋm値に影響する変異は例えばWO96/22376及び国際特許出願第PCT/GB98/01026号に記載されている。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明のタンパク質は、１つより多い変異、好ましくは前記の変異の３つすべてを適切に有している。
本発明のタンパク質には野生型及び組換え型ルシフェラーゼ酵素の両方が含まれる。本発明のタンパク質は、前記のとおり野生型酵素に存在するアミノ酸の少なくとも６０％が本発明のタンパク質に存在するという意味で、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼの配列又はその他のルシフェラーゼ酵素の配列と少なくとも６０％の類似性を有する。本発明のタンパク質は前記の野生型酵素に対し、より高い程度類似性、特に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％の類似性を有することができる。このタイプの類似のタンパク質には、対立遺伝子変異体、その他の昆虫種由来のタンパク質及び組換えにより生成した酵素が含まれる。
【００１１】
本発明のタンパク質は、野生型酵素をコードする配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるという点で同定されるだろう。前記の条件は当業者に周知であり、例えばSambrookら（1989） Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに例示されている。一般的には、低ストリンジェント条件は約周囲温度〜約６５℃における３×ＳＳＣとして定義され、高ストリンジェント条件は約６５℃における０．１×ＳＳＣとして定義される。ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸三ナトリウムからなる緩衝液の名称である。３×ＳＳＣは３回の同じ強さのＳＳＣのことである。
特に、本発明の配列と特定の配列との類似性は、Lipman 及び Pearson （Lipman, D.J. & Pearson, W.R. （1985） Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol 227, ppl435-1441）に記載される多重整列化（multiple alignment）法を使用して評価されるだろう。「最適化された」百分率のスコアは、Lipman-Pearsonアルゴリズムについての以下のパラメーター：ｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティー（gap penalty）＝４及びギャップペナルティー長さ（gap penalty length）＝１２を用いて計算されるべきである。類似性を評価する配列は「試験配列」として使用されるべきである。このことは、比較のための塩基配列、例えばフォティナス・ピラリスの配列若しくはYeら、前出に記録された前記のその他の配列又はフィリキソシックスの場合はBiochemistry, 1999, 38, 8271-8279に記載される配列は、参照配列として使用されることを意味する。
本発明の特定の例は、前記の変異を有する野生型ルシフェラーゼ配列である。
このタンパク質は少なくとも１つ、好ましくは１つより多くの前記の変位を有している。
更に本発明は前記のルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。適切には、前記核酸は当業者に周知の野生型配列に基づくものである。アミノ酸配列に所望の変異を起こす適切な突然変異は、遺伝子コードの知識に基づき容易に明らかになるだろう。
【００１２】
本発明の核酸は、発現ベクター、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素の制御下にあるプラスミドへ適切に組み込まれる。これらのベクターを用いて宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は動物細胞、特に原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）を形質転換し、当該細胞に所望のルシフェラーゼ酵素を発現させることができる。当該技術分野で周知の条件を使用して、得られた形質転換細胞の培養にルシフェラーゼ酵素を産生させ、次いで培養培地からルシフェラーゼ酵素を分離することができる。細胞が動物又は植物細胞の場合、当該細胞から植物又は動物を繁殖させてもよい。その後、当該植物からタンパク質を抽出してもよい。トランスジェニック動物の場合、タンパク質を乳汁から回収してもよい。ベクター、形質転換細胞、トランスジェニック植物及び動物並びに前記細胞の培養による酵素の生産方法の全ては本発明の更なる側面を形成する。
フォティナス・ピラリスT214A変異ルシフェラーゼを、以下のランダム突然変異誘発により作成した。T214A単一点変異体は野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を有している。
２つの新規な三重変異ルシフェラーゼ：E354K/T214A/A215L 及び E354K/T214A/I232Aを作成したところ、これらも高い熱安定性を示した。
本発明の範囲内にあるフォティナス・ピラリス変異体酵素の特定の例には以下のものが含まれる。
I232A/E354K
T214A/I232A/E354K
A215L/I232A/E354K
T214A/I232A/E354K/A215L
I232A/E354K/T214A/F295L
I232A/E354K/T214A/F295L/F14A/L35A
I232A/E354K/T214A/F295L/Fl4A/L35A/A215L
A105V
T214A
T214C
T214N
T295L
I232A
F14A
L35A
D234G
S420T
H31OR
又はその他の種のルシフェラーゼに由来するときは、それらのすべての等価物。
三重変異体作成のための変異を、プラスミドｐＥＴ２３上のルシフェラーゼ遺伝子へ、部位特異的突然変異（ＰＣＲ）により導入した。関連する変異を起こすためにＰＣＲ反応へ添加したオリゴヌクレオチドは以下の実施例で与えられたものである。
部位３５４及び２１５における点変異の効果は相加的であることが既に示されている。本発明はより高い熱安定性を与えるために３又はそれより多い変異を組み合わせる可能性を提供する。
本発明の熱安定性ルシフェラーゼは、シグナル伝達手段としてルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を利用する全ての生物発光アッセイにおいて有利に使用されるだろう。文献において非常に多数のアッセイが知られている。それゆえ、本発明のタンパク質は、前記のアッセイの実行を鑑みて調製されるキット中に、適宜ルシフェリン及び特定のアッセイを行うのに必要なその他の試薬と共に含まれるだろう。
本発明は添付図面を参照した実施例により詳述されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、本発明の変異体の生産に使用するプラスミドを示している。
【図１−２】図１は、本発明の変異体の生産に使用するプラスミドを示している。
【図２】図２は、本発明のルシフェラーゼを含むルシフェラーゼについての熱不活性化研究の結果を示している。
【図３ａ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｂ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｃ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｄ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｅ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｆ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｇ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｈ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図４】図４は、その他のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図５】図５は、本発明の変異体酵素の生産に使用したオリゴヌクレオチドを示している。
【００１４】
実施例１
熱安定性変異ルシフェラーゼの同定
エラー易発性（error-prone）ＰＣＲは、Fromantら, Analytical Biochemistry, 224, 347-353 （1995）により考案されたプロトコルに基づいていた。
本反応におけるｄＮＴＰ混合物は以下の通りであった。
３５ｍＭ ｄＴＴＰ
１２．５ｍＭ ｄＧＴＰ
２２．５ｍＭ ｄＣＴＰ
１４ｍＭ ｄＡＴＰ
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＰＷ６０１ａ Ｊ５４*
５．０μｌ １０×ＫＣｌ反応緩衝液
各１μｌのＷ５６及びＷ５７+（６０ｐｍｏｌｅの各プライマー）
１μｌ Ｂｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌ ｄＮＴＰｓ（前記参照）
１．７６μｌ ＭｇＣｌ2（５０ｍＭストック）
１μｌ ｍＮＣｌ2（２５ｍＭストック）［反応における終濃度＝３．２６ｍＭ］
３６．７μｌ ｄＨ2Ｏ
*プラスミドｐＰＷ６０１ａＪ５４はｐＰＷ６０１ａ（WO95/25798）の変異体バージョンであり、ＮｄｅＩ部位をＡＴＧ開始コドン前３塩基以内に作成した。これにより、ｐＰＷ６０１ａからｐＥＴ２３ベクターへの容易なクローニングが許容された。
＋プライマー配列：
W56:
5'-AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC-3'
W57:
5'-AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG-3'）
サイクルのパラメーター配下の通りであった。
９４℃で５分、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１２、
７２℃で１０分間。
【００１５】
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュア キット（pure kit）を使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ（cleaned up）」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件：
４μｌ ｐＥＴ２３ａ（５６ｎｇ）
５μｌ ＰＣＲ産物（２００ｎｇ）
３μｌ ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌ ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
２μｌ ｄＨ2Ｏ
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテント（electrocompetent）なＨＢ１０１細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。
１１回のエレクトロポレーションを行い、ついで細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＴＹブロスの４０ｍｌに添加した。次いで細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた培養物の全５０ｍｌを使用してプラスミドＤＮＡを精製した。これをライブラリーとした。
ライブラリーのスクリーニング
プラスミドライブラリーのアリコートを使用して大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞をエレクトロポレーションに付した。これらの細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、３７℃で一晩増殖させた。
翌日、コロニーを選び、ＬＢ寒天＋ａｍｐプレート上のナイロンフィルターにパッチをつけ（patch）、３７℃で増殖を一晩続けた。翌日、フィルターをルシフェリン溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の５００μＭ）で覆った。次いでパッチを暗室で観察した。更なる分析のために２００から１コロニー／パッチを選んだ。
熱安定性変異体の特徴付け
変異体プラスミドを保持する大腸菌クローンを単離した。プラスミドＤＮＡをＡＢＩ配列決定のために調製した。ルシフェラーゼをコードする完全なオープンリーディングフレームを、４つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して配列決定した。配列決定により、ヌクレオチド６４０におけるＡからＧへの単一の点変異が明らかになった。ＡＣＴ（Ｔ）からＧＣＴ（Ａ）へのコドン変化は部位２１４におけるアミノ酸の変化を与えた。
【００１６】
実施例２
三重変異酵素の調製
突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してｐＭＯＤ１（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ）に同一の変異を作成し、三重変異体ｐＭＯＤ２（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ／Ｔ２１４Ａ）を作成した。この変異もｐＭＯＤ１に唯一のＳａｃＩ／ＳｓｔＩ部位を作成した。
実施例３
更なる三重変異酵素の調製
鋳型としてＴ２１４Ａ変異を有するｐＥＴ２３プラスミドを用いて、以下のプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応により三重変異体Ｔ２１４Ａ／Ｉ２３２Ａ／Ｅ３５４Ｋを作成した。
CTGATTACACCCAAGGGGGATG E354K-センス
CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG E354K-アンチセンス
GCAATCAAATCGCTCCGGATACTGC I232A-センス
GCAGTATCCGGAGCGATTTGATTGC I232A-アンチセンス
実施例４
熱安定性２９５変異体の同定
Ｆ２９５変異体を、Fromantら, Analytical Biochemistry, vol 224, 347-353（1995）に記載のエラー易発性ＰＣＲ法を用いて作成した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＥＴ２３
５．０μｌ １０×ＫＣｌ反応緩衝液
１μｌプライマー１ ６０ｐｍｏｌの各プライマー
１μｌプライマー２
１μｌ Ｂｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌ ｄＮＴＰｓ、混合物中３５ｍＭ ｄＴＴＰ、１２．５ｍＭ ｄＧＴＰ、２２．５ｍＭ ｄＣＴＰ、１４ｍＭ ｄＡＴＰ
１．７６μｌ ＭｇＣｌ2（５０ｍＭストック）
１μｌ ＭｎＣｌ2（２５ｍＭストック）［反応中の最終濃度＝３．２６ｍＭ］３６．７μｌ ｄＨ2Ｏ
プライマー１＝5'-AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC-3'
プライマー２＝5'-AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG-3'
【００１７】
サイクルのパラメーターは以下の通りであった。
９４℃で５分間、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１５、
７２℃で１０分間。
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュア キットを使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件は以下の通りであった。
５６ｎｇ ｐＥＴ２３ａ
２００ｎｇ ＰＣＲ産物
３μｌ ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌ ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
ｄＨ２Ｏを用いて、容量を１０μｌにした。
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。１ｍｌのＳＯＣブロスを各エレクトロポレーションに添加し、細胞を回復させ、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性遺伝子を発現させた。ライブラリーのアリコートを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、細菌を３７℃で一晩増殖させた。ナイロンフィルターディスクで寒天プレートを覆い、コロニーを新鮮なプレートに移した。オリジナルのプレートは室温下に放置し、コロニーを再増殖させた。プレートをナイロンフィルターとともに４２℃で２時間インキュベートし、その後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中の５００μＭルシフェリンをスプレーし、暗室中で観察した。
４２℃で２時間後に増殖したことことを基礎に３つの熱安定性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから単離して、配列決定したところ、それぞれの場合においてＦ２９５Ｌ変異が明らかになった。
【００１８】
実施例５
本発明のその他の変異体を、前記及び下記のオリゴヌクレオチドの適切な組み合わせを用いたＰＣＲにより生産した。
GAAAGGCCCGGCACCAGCCTATCCTCTAGAGG F14A-センス
CCTCTAGCGGATAGGCTGGTGCCGGGCCTTTC F14A-アンチセンス
GAGATACGCCGCGGTTCCTGG L35A-センス
CCAGGAACCGCGGCGTATCTC L35A-アンチセンス
実施例６
ルシフェラーゼの精製及び熱不活性化の研究
組換え変異ルシフェラーゼを発現する細胞を増殖させ、破壊し、WO95/25798に記載の通りに抽出し、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を得た。
無細胞抽出物を含むエッペンドルフチューブを特に述べない限りは通常４０℃でインキュベートした。野生型ルシフェラーゼの精製調節物（比較目的）を、１０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭジチオスレイトール及び０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含む熱安定性緩衝液中でインキュベートした。設定時間に、チューブを取り出し、氷／水浴中で冷却し、その後、初期活性又は相対生物発光の百分率として計算される残存するアッセイされる活性を測定した。
結果を図２及び図３に示す。図２から、本発明のルシフェラーゼ変異体は既知の変異体と比べて改善された熱安定性を有していることが理解される。
野生型ルシフェラーゼ（ＲＷＴ）に対して劇的に増加した安定性は図３より明らかである。
【００１９】
実施例７
２１４の変異体の活性についての研究
２１４変異体からなるライブラリーを、カセットオリゴ（cassette oligos）を用いた部位特異的突然変異により調製し（図５）、熱安定性変異体を選択し、実施例１と同様にして試験した。３つの特定の熱安定性変異体を、実施例１と同様にして配列決定し、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎとして特徴づけた。
Ｔ２１４、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎをコードするプラスミドを保持する大腸菌ＸＬ１−ブルーのＯ／Ｎ培養を、Promega溶菌緩衝液を使用して溶解した。５０μｌの液体抽出物を３７℃及び４０℃下、種々の時間で熱不活性化した。１０μｌの加熱抽出物のアリコートを、Promegaライブアッセイ（live assay）緩衝液中で試験した（１００μｌ）。
結果を以下の表に示す。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
３つの変異体について４０℃で実験を繰り返した。
【００２３】
【００２４】
これらの結果は、Ｔ２１４Ｃがｒ−ｗｔ（野生型）又はＴ２１４Ａ若しくはＮのいずれかよりも有意に熱安定性が高いことを示している。存在するシステイン残基が多くなる程、熱安定性が悪くなると予想していたので、特性におけるこの変化は予想外のものであった。
実施例８
その他の点変異体の研究
単一の点変異を有するその他のフォティナス・ピラリス変異体のシリーズを、ランダムエラー易発性PCRを使用して調製した（図５）。生成した変異体のスクリーニング及び配列決定の後、その配列決定を、部位特異的突然変異誘発、続く更なる配列決定を用いてチェックした。Ｄ２３４Ｇ、Ａ１０５Ｖ及びＦ２９５Ｌが存在した。これらの変異体の熱安定性は、試験した組換え野生型フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼと同様であった。Promega溶菌緩衝液中タンパク質サンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、その活性を２、５及び１０分後にアッセイした。図４に示す結果は、各変異体が野生型よりも増強された熱安定性を生じることを示している。
【００２５】
本発明は以下に関するものである。
１．ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、
前記酵素の配列において、
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基、
のなかの少なくとも１つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、該ルシフェラーゼ酵素が、当該部位に対応の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素。
２．野生型ルシフェラーゼの配列を有し、該配列中の１より多いアミノ酸残基が該野生型酵素のアミノ酸残基とは異なる、前記１に記載のタンパク質。
３．５０までのアミノ酸が野生型酵素のアミノ酸と異なっている、前記２に記載のタンパク質。
４．ルシフェラーゼが、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼから修飾されたものである、前記１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
５．前記１〜４のいずれかに記載のタンパク質であって、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの配列において、以下の変化のうちの少なくとも１つを有しているタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基である、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基がアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸残基である、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がセリン以外のアミノ酸残基である、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外のアミノ酸残基である。
６．前記１〜４のいずれかに記載のタンパク質であって、該タンパク質がルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来酵素の配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも１つを有しているタンパク質。
（ａ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基礎とする配列では）グリシン以外のアミノ酸残基であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基礎とする配列では）アスパラギン以外のアミノ酸残基である、
（ｂ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がセリン以外のアミノ酸残基である、
（ｃ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｄ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｅ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７又はルシオラ・クルシアタ及びルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がリジン以外のアミノ酸残基である、
（ｆ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がグリシン以外のアミノ酸残基である、
（ｇ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基がグリシン以外のアミノ酸残基である、
（ｈ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基である、
（ｉ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基本とする配列では）スレオニン以外のアミノ酸残基であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基本とする配列では）バリン以外のアミノ酸残基である。
７．前記１〜６のいずれかに記載のタンパク質であって、ルシフェラーゼ活性を有し、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも６０％の類似性を有し、該タンパク質の配列内に以下の変化のうち少なくとも１つを有し、かつ、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有するタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である、又は、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。
８．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１に記載のタンパク質。
９．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
１０．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼであり、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がロイシンである、前記１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
１１．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜１０のいずれかに記載のタンパク質。
１２．ルシフェラーゼが変異したフォティナス・ピラリス又はルシオラ種由来ルシフェラーゼであり、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７に対応するアミノ酸残基、又はルシオラ・ラテラリス若しくはルシオラ・クルシアタ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜１１のいずれかに記載のタンパク質。
１３．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がバリンである、前記１〜１２のいずれかに記載のタンパク質。
１４．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がグリシンである、前記１〜１３のいずれかに記載のタンパク質。
１５．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がスレオニンである、前記１〜１４のいずれかに記載のタンパク質。
１６．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がアルギニンである、前記１〜１５のいずれかに記載のタンパク質。
１７．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５４（ルシオラ由来ルシフェラーゼの部位３５６）に対応する部位のアミノ酸がグルタメート以外のアミノ酸である、前記１〜１６のいずれかに記載のタンパク質。
１８．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５４（ルシオラ由来ルシフェラーゼの部位３５６）に対応する部位のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、前記１７に記載のタンパク質。
１９．ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７（フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１５）に対応する部位のアミノ酸が異なる疎水性アミノ酸である、前記１〜１８のいずれかに記載のタンパク質。
２０．ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７（フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１５）に対応する部位のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン又はバリンである、前記１９に記載のタンパク質。
２１．前記１〜２０のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする核酸。
２２．前記２１に記載の核酸を含むベクター。
２３．前記２２に記載のベクターで形質転換した細胞。
２４．原核細胞である、前記２３に記載の細胞。
２５．植物細胞である、前記２３に記載の細胞。
２６．前記２５に記載の細胞を含む植物。
２７．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質を生産する方法であって、前記２３に記載の細胞を培養する工程又は前記２６に記載の植物を増殖させる工程を含むことを特徴とする方法。
２８．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質の生物発光アッセイにおける使用。
２９．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質を含むキット。
３０．更にルシフェリンを含む、前記２９に記載のキット。
【００２６】
SEQUENCE LISTING
<110> The Secretary of State for Defence in Her Britannic Majesty's
Government of the United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland
<120> Novel enzyme
<130> IPD/P1206/WOD
<140> PCT/GB99/03538
<141> 1999-10-26
<150> GB 9823468.5
<151> 1998-10-28
<160> 35
<170> PatentIn Ver. 2.1
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gagatacgcc gcggttcctg g 21
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ccaggaaccg cggcgtatct c 21
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ccctattttc attcctggcc aaaagcactc 30
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ccgcatagag ctctctgcgt cagattc 27
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gttgaccgct tgggatcctt aattaaatac 30
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gtatagattt gaaaaagagc tg 22
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cagctctttt tcaaatctat ac 22
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ggctacatac tggagacata gc 22
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gctatgtctc cagtatgtag cc 22
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Oligonucleotide
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gcagttgcgc ccgtgaacga c 21
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Oligonucleotide
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caaatcattc cgggtactgc gattttaag 29
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Oligonucleotide
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cttaaaatcg cagtacccgg aatgatttg 29
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ccgcatagaa ctctctgcgt cagattc 27
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gaatctgacg cagagagttc tatgcgc 27
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ctgattacac ccaaggggga tg 22
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<223> Description of Artificial Sequence:
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<400> 27
catccccctt gggtgtaatc ag 22
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<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a or g or c or t
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<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide
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<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n=a or g or c or t
<400> 29
actgacgcag gcnnntctat gcggaaggg 29
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<213> Artificial Sequence
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<400> 30
gcaatcaaat cgctccggat actgc 25
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide
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gcagtatccg gagcgatttg attgc 25
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<213> Artificial Sequence
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<400> 32
ccattccatc aaggttttgg 20
<210> 33
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide
<400> 33
ccaaaacctt gatggaatgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 34
aaacagggac ccatatggaa gacgc 25
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 35
aattaactcg aggaatttcg tcatcgctga atacag 36
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵素、特に対応の野生型酵素と比較して増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼ酵素、アッセイにおける前記酵素の使用及び前記酵素を含む試験キットに関する。
ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ2+及び分子酸素の存在下、光の生成を伴うルシフェリンの酸化を触媒する。この反応は約０．８８の量子収率を有する。前記ルシフェラーゼの発光特性は、ＡＴＰレベルを測定する種々の発光（luminometric）アッセイにおける前記酵素の使用を導く。前記のアッセイの例には、EP-B-680515及びWO96/02665の記載に基づくアッセイが含まれる。
ルシフェラーゼは、昆虫の体、特にホタル又はツチボタル等の甲虫から直接得ることができる。ルシフェラーゼが得られる特定の種には、ニホンゲンジボタル又はケイケ（KEIKE）ボタル、ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）及びルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、東欧ホタルであるルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）、北米ホタルであるフォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）並びにツチボタルであるラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）が含まれる。ルシフェラーゼを得ることができるその他の種は、Ye ら., Biochimica et Biophysica Acta, 1339 （1997） 39-52に記載されている。Vivianiら, Biochemistry, 38, （1999） 8271-8279に記載される更なる種は、フィリキソシックス（Phrixothrix）（レールロードワーム（railroad-worms））である。
しかしながら、これらの酵素をコードする多くの遺伝子がクローニングされかつ配列決定されているので、組換えＤＮＡ技術を使用しても製造することができるだろう。前記酵素をコードする組換えＤＮＡ配列を使用して、大腸菌（E.coli）等の微生物を形質転換し、所望の酵素生成物を発現させる。
野生型及び組換え型ルシフェラーゼの熱安定性は、約３０℃、特に３５℃を超える温度に曝露したときにその活性が急速に消失する程度である。この不安定性は、高い周囲温度下で酵素を保存するか又は、例えば反応速度を高くするために高温反応条件下アッセイを行うときに問題を起こす。
増加した熱安定性を有する変異ルシフェラーゼはEP-A-524448及びW095/25798より既知である。前者は、ニホンボタルのルシフェラーゼにおいてスレオニン残基をイソロイシン残基で置換することにより部位２１７に変異を有する変異ルシフェラーゼを記載している。後者は、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼと６０％をこえる類似性を有するが、フォティナス・ピラリスの部位３５４のアミノ酸残基又はルシオラ種の部位３５６に対応するアミノ酸残基がグルタメート以外になるように変異している変異ルシフェラーゼを記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本件出願人は、増加した熱安定性をもたらし、かつ当該技術分野において既知の変異体を補完する更なる変異体を見いだした。
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ（Hotaria paroula）、ピロフォラス・プラギオフタラマス（Pyrophorus plagiophthalamus）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ（Pyrocoelia nayako）、フォティナス・ペンシランヴァニカ（Photinus pennsylanvanica）又はフィリキソシックス由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、前記酵素の配列において、
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基、
のなかの少なくとも１つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、前記ルシフェラーゼ酵素は、当該部位に特定種の対応野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素を提供する。
【０００３】
好ましくは、前記タンパク質はルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有している。
特に、前記タンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、野生型ルシフェラーゼの配列、例えばフォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス （グリーン−Ｌｕｃ ＧＲ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （イエローグリーン Ｌｕｃ ＹＧ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （イエロー−Ｌｕｃ ＹＥ）、ピロフォラス・プラギオフタラマス （オレンジ−Ｌｕｃ ＯＲ）、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＬＹ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＫＷ、フォティナス・ペンシランヴァニカ Ｊ１９又はフィリキソシックス・グリーン（ＰｖGR）若しくはレッド（ＰｈRE）の配列を実質的に有する。
但し、前記タンパク質は、野生型酵素のアミノ酸とは異なるように操作された１以上、例えば１００までのアミノ酸残基、好ましくはせいぜい５０、より好ましくはせいぜい３０のアミノ酸を含んでいてもよい。
特に、基質Ｄ−ルシフェリン（４，５−ジヒドロ−２−［６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル］−４−チアゾール カルボン酸）を使用して光放射を生じることができる種に由来する生物発光酵素は、本発明の変異体酵素の基礎を形成するだろう。
実施例によると、本発明のルシフェラーゼは、フォティナス・ピラリスのルシフェラーゼ配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも１つを有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基に変化している、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外に変化している、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外に変化している、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基がロイシン以外に変化している、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基がアラニン以外に変化している、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外に変化している、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がセリン以外に変化している、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外に変化している。
【０００４】
本発明のタンパク質がルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来酵素の配列を実質的に有する場合、以下の変化のうちの少なくとも１つを有する。
（ａ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基礎とする配列では）グリシン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基礎とする配列では）アスパラギン以外である。
（ｂ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がセリン以外である。
（ｃ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外である。
（ｄ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外である。
（ｅ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がリジン以外である。
（ｆ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｇ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基がグリシン以外である。
（ｈ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外である。
（ｉ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基本とする配列では）スレオニン以外であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基本とする配列では）バリン以外である。
【０００５】
熱安定性を増強させる全ての場合における特定の置換アミノ酸は、以下に説明されるようなルーチンの方法により決定することができる。それぞれの場合において、異なる置換が熱安定性の増強を引き起こすだろう。当業者に理解されるように、置換は、天然又は適切な変異体タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により行うことができるだろう。この場合において本発明は熱安定性と関連するタンパク質の同定と関連する。
しかしながら、一般的には、野生型のアミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸で置換することを考慮することが好ましい。したがって、ある場合においては、親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基（逆も又同様）で好ましく置換するだろう。同様に、酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換するだろう。
例えば、本発明のタンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも６０％の類似性を有し、その配列内に以下の変化のうち少なくとも１つを有し、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有している。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である。
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である。
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。
【０００６】
種々のルシフェラーゼの全ての配列は、高度に保存されて、これら酵素間で有意な程度の類似性を有していることを示す。このことは、配列を調査して最も類似している領域を検出することにより酵素配列間の対応領域が容易に決定可能であることを示している。必要ならば、種々の配列間対応領域又は特定のアミノ酸を決定するために市販のソフト（例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループの「Bestfit」、Devereuxら（1984） Nucleic Acid Research 12: 387-395を参照のこと）を使用することができる。代替又は追加として、対応の酸を、文献：L. Yeら, Biochim. Biophys Acta 1339 (1997) 39-52により決定することができる。前記文献で使用する番号方式（numbering system）は、本件出願で使用した番号方式の基礎を形成する。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基の可能な変化について、極性アミノ酸スレオニンは、非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するスレオニン残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。
より好ましい置換はシステインによるものである。しかしながら、この部位における異なる極性残基、例えばアスパラギンも、当該部位にスレオニンを有する対応の酵素の熱安定性を増強するだろう。
野生型ルシフェラーゼ酵素においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、グリシン（ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ）、アスパラギン（ピロフォラス・プラギオフタラマス、ＧＲ、ＹＣ、ＹＥ及びＯＲ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロセリア・ナヤコ、フォティナス・ペンシランヴァニカ ＬＹ、ＫＷ、Ｊ１９）及びセリン（フィリキソシックス・ルシフェラーゼの部位２１１）が含まれる。非極性又は異なる非極性側鎖、例えばアラニン及びシステインで置換することは有利であろう。
【０００７】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基の可能性のある変化について、非極性アミノ酸であるイソロイシンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインなどで適切に置換される。野生型の配列においてこの部位に現れるその他のアミノ酸には、セリン及びアスパラギン（それぞれ、フィトシックス・グリーン（Phritothix green）及びレッド（Phritothix red）における対応の２２９番目の部位におけるバリン又はアラニンと同じ）が含まれる。適切には、これらの極性残基は、非極性残基、例えば前記にて概略を述べたものにより置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応する残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスの残基２３４に対応する残基の特に好ましい置換はアラニンによるものである。このことは、野生型配列に対するアミノ酸の変化を示している。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう（これは、フィリキソシックス・ルシフェラーゼの残基２９２に対応する）。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるフェニルアラニン又はロイシンである。これらは異なる非極性アミノ酸で改変される。例えば、フォティナス・ピラリスでは、非極性アミノ酸フェニルアラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン又はシステインにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するフェニルアラニン残基についての特に好ましい置換はロイシンによるものである。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６（フィリキソシックス由来ルシフェラーゼではアミノ酸残基１３）に対応するアミノ酸残基における変異も可能である。このアミノ酸残基（通常はフェニルアラニンであるが、ロイシン、セリン、アルギニン又はある場合ではチロシンであってもよい）は、異なるアミノ酸、特に異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン、好ましくはアラニンへ適切に改変するだろう。
【０００８】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５又はルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７に対応するアミノ酸残基（その他のルシオラ種及びフィリキソシックスにおけるアミノ酸３８に対応する）における変異も有効であろう。このアミノ酸は野生型酵素間で変化し、この部位におけるロイシン（フォティナス・ピラリス）だけでなく、リジン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、グルタミン及びアスパラギン酸も含まれるだろう。適切には、この部位におけるアミノ酸残基は、非極性アミノ酸残基又は異なる非極性アミノ酸、例えばアラニン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。この部位における好ましいアミノ酸はアラニンであり、これは野生型酵素とは異なるものである。
フォティナス・ピラリス由来配列の部位１４に対応するアミノ酸における変異及び／又はフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基における変異は、好ましくはこの酵素における唯一の変異ではない。これらの変異は、前記で定義したその他の変異、特にフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１４、３９５又は２３２に対応する部位における変異を適切に伴う。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼにおける残基１０５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基（フィリキソシックスにおける残基１０２）の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的に、この部位におけるアミノ酸は非極性アミノ酸であるアラニン又はグリシンであり、フィリキソシックスではセリンであろう。これらのアミノ酸は異なる非極性アミノ酸により適切に改変される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、非極性アミノ酸アラニンは、異なる非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファン等により適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの残基１０５に対応するアラニン残基についての特に好ましい置換はバリンによるものである。
【０００９】
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６（フィリキソシックスにおける残基２３１）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸はアスパラギン酸又はグリシンであり、ある場合においてはグルタミン又はスレオニンである。これらは、非極性アミノ酸又は異なる非極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、アミノ酸残基アスパラギン酸は、非極性アミノ酸、例えばアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、メチオニン又はトリプトファンにより適切に置換される。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するフェニルアラニン残基の置換に特に好ましいのはグリシンによるものである。非極性アミノ酸残基、例えばグリシンが（例えば、ルシオラ由来ルシフェラーゼにおいて）この部位に存在する場合、グリシンは異なる非極性アミノ酸により適切に置換されるだろう。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２（フィリキソシックス・グリーンにおける残基４１７及びフィリキソシックス・レッドにおける残基４１８）に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。一般的にこの部位におけるアミノ酸は無電荷極性アミノ酸であるセリン又はスレオリン又はグリシンである。これらは、異なる無電荷極性アミノ酸により適切に置換される。例えば、フォティナス・ピラリスにおいて、セリンは、アスパラギン、グルタミン、スレオニン又はチロシン、特にスレオニンにより適切に置換される。
フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基の変化も、タンパク質の熱安定性に影響するだろう。この部位におけるアミノ酸は既知のルシフェラーゼタンパク質の間で変化し、フォティナス・ピラリス、ピロセリア・ナヤコ、ラムピリス・ノクチルカ及びある形態のフォティナス・ペンシランヴァニカ由来ルシフェラーゼではヒスチジンであり、ルシオラ・ミングレリカ、ホタリア・パロウラ及びフィリキソシックス（アミノ酸残基３０７）由来ルシフェラーゼではスレオニンであり、ルシオラ・クルシアタ及びルシオラ・ラテラリスではバリンであり、あるピロフォラス・プラギオフタラマス由来ルシフェラーゼではアスパラギンである。したがって、一般的に、この部位におけるアミノ酸は親水性アミノ酸であり、これを異なるアミノ酸残基に換えて、酵素の熱安定性を増加させてもよい。フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するヒスチジン残基に対する特に好ましい置換はアルギニンによるものである。
【００１０】
酵素内にその他の変異が存在していてもよい。例えば、好ましい態様では、タンパク質は、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸３５４に対応する部位（ルシオラ由来ルシフェラーゼにおける部位３５６及びフィリキソシックス由来ルシフェラーゼの部位３５１）にグルタミンから、特にグリシン、プロリン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変化したアミノ酸を有する。適切には、この部位におけるアミノ酸はトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンであり、特に好ましくはリジン又はアルギニンである。この変異はWO 95/25798に記載されている。
代替の好ましい態様では、EP-A-052448に記載されるように、タンパク質は、ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７に対応する部位が、疎水性アミノ酸、特にイソロイシン、ロイシン又はバリンに換わったアミノ酸を有している。
タンパク質は、当該タンパク質のルシフェラーゼ活性が過度に妥協しないことを条件に配列内に更に変異を含んでいてもよい。その変異は酵素の特性を適切に増強するか、又は、ある場合においては意図する目的により適するようにする。
このことは、更なる変異が熱安定性及び／又はカラーシフト特性及び／又はＡＴＰに対する酵素のＫmの増強を引き起こすことを意味する。カラーシフトを引き起こす変異の例はWO95/18853に記載されている。Ｋm値に影響する変異は例えばWO96/22376及び国際特許出願第PCT/GB98/01026号に記載されている。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明のタンパク質は、１つより多い変異、好ましくは前記の変異の３つすべてを適切に有している。
本発明のタンパク質には野生型及び組換え型ルシフェラーゼ酵素の両方が含まれる。本発明のタンパク質は、前記のとおり野生型酵素に存在するアミノ酸の少なくとも６０％が本発明のタンパク質に存在するという意味で、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼの配列又はその他のルシフェラーゼ酵素の配列と少なくとも６０％の類似性を有する。本発明のタンパク質は前記の野生型酵素に対し、より高い程度類似性、特に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％の類似性を有することができる。このタイプの類似のタンパク質には、対立遺伝子変異体、その他の昆虫種由来のタンパク質及び組換えにより生成した酵素が含まれる。
【００１１】
本発明のタンパク質は、野生型酵素をコードする配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるという点で同定されるだろう。前記の条件は当業者に周知であり、例えばSambrookら（1989） Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに例示されている。一般的には、低ストリンジェント条件は約周囲温度〜約６５℃における３×ＳＳＣとして定義され、高ストリンジェント条件は約６５℃における０．１×ＳＳＣとして定義される。ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸三ナトリウムからなる緩衝液の名称である。３×ＳＳＣは３回の同じ強さのＳＳＣのことである。
特に、本発明の配列と特定の配列との類似性は、Lipman 及び Pearson （Lipman, D.J. & Pearson, W.R. （1985） Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, vol 227, ppl435-1441）に記載される多重整列化（multiple alignment）法を使用して評価されるだろう。「最適化された」百分率のスコアは、Lipman-Pearsonアルゴリズムについての以下のパラメーター：ｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティー（gap penalty）＝４及びギャップペナルティー長さ（gap penalty length）＝１２を用いて計算されるべきである。類似性を評価する配列は「試験配列」として使用されるべきである。このことは、比較のための塩基配列、例えばフォティナス・ピラリスの配列若しくはYeら、前出に記録された前記のその他の配列又はフィリキソシックスの場合はBiochemistry, 1999, 38, 8271-8279に記載される配列は、参照配列として使用されることを意味する。
本発明の特定の例は、前記の変異を有する野生型ルシフェラーゼ配列である。
このタンパク質は少なくとも１つ、好ましくは１つより多くの前記の変位を有している。
更に本発明は前記のルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。適切には、前記核酸は当業者に周知の野生型配列に基づくものである。アミノ酸配列に所望の変異を起こす適切な突然変異は、遺伝子コードの知識に基づき容易に明らかになるだろう。
【００１２】
本発明の核酸は、発現ベクター、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素の制御下にあるプラスミドへ適切に組み込まれる。これらのベクターを用いて宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は動物細胞、特に原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）を形質転換し、当該細胞に所望のルシフェラーゼ酵素を発現させることができる。当該技術分野で周知の条件を使用して、得られた形質転換細胞の培養にルシフェラーゼ酵素を産生させ、次いで培養培地からルシフェラーゼ酵素を分離することができる。細胞が動物又は植物細胞の場合、当該細胞から植物又は動物を繁殖させてもよい。その後、当該植物からタンパク質を抽出してもよい。トランスジェニック動物の場合、タンパク質を乳汁から回収してもよい。ベクター、形質転換細胞、トランスジェニック植物及び動物並びに前記細胞の培養による酵素の生産方法の全ては本発明の更なる側面を形成する。
フォティナス・ピラリスT214A変異ルシフェラーゼを、以下のランダム突然変異誘発により作成した。T214A単一点変異体は野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を有している。
２つの新規な三重変異ルシフェラーゼ：E354K/T214A/A215L 及び E354K/T214A/I232Aを作成したところ、これらも高い熱安定性を示した。
本発明の範囲内にあるフォティナス・ピラリス変異体酵素の特定の例には以下のものが含まれる。
I232A/E354K
T214A/I232A/E354K
A215L/I232A/E354K
T214A/I232A/E354K/A215L
I232A/E354K/T214A/F295L
I232A/E354K/T214A/F295L/F14A/L35A
I232A/E354K/T214A/F295L/Fl4A/L35A/A215L
A105V
T214A
T214C
T214N
T295L
I232A
F14A
L35A
D234G
S420T
H31OR
又はその他の種のルシフェラーゼに由来するときは、それらのすべての等価物。
三重変異体作成のための変異を、プラスミドｐＥＴ２３上のルシフェラーゼ遺伝子へ、部位特異的突然変異（ＰＣＲ）により導入した。関連する変異を起こすためにＰＣＲ反応へ添加したオリゴヌクレオチドは以下の実施例で与えられたものである。
部位３５４及び２１５における点変異の効果は相加的であることが既に示されている。本発明はより高い熱安定性を与えるために３又はそれより多い変異を組み合わせる可能性を提供する。
本発明の熱安定性ルシフェラーゼは、シグナル伝達手段としてルシフェラーゼ／ルシフェリン反応を利用する全ての生物発光アッセイにおいて有利に使用されるだろう。文献において非常に多数のアッセイが知られている。それゆえ、本発明のタンパク質は、前記のアッセイの実行を鑑みて調製されるキット中に、適宜ルシフェリン及び特定のアッセイを行うのに必要なその他の試薬と共に含まれるだろう。
本発明は添付図面を参照した実施例により詳述されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】図１は、本発明の変異体の生産に使用するプラスミドを示している。
【図１−２】図１は、本発明の変異体の生産に使用するプラスミドを示している。
【図２】図２は、本発明のルシフェラーゼを含むルシフェラーゼについての熱不活性化研究の結果を示している。
【図３ａ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｂ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｃ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｄ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｅ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｆ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｇ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図３ｈ】図３は、種々のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図４】図４は、その他のルシフェラーゼ変異体についての熱安定性実験の結果を示している。
【図５】図５は、本発明の変異体酵素の生産に使用したオリゴヌクレオチドを示している。
【００１４】
実施例１
熱安定性変異ルシフェラーゼの同定
エラー易発性（error-prone）ＰＣＲは、Fromantら, Analytical Biochemistry, 224, 347-353 （1995）により考案されたプロトコルに基づいていた。
本反応におけるｄＮＴＰ混合物は以下の通りであった。
３５ｍＭ ｄＴＴＰ
１２．５ｍＭ ｄＧＴＰ
２２．５ｍＭ ｄＣＴＰ
１４ｍＭ ｄＡＴＰ
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＰＷ６０１ａ Ｊ５４*
５．０μｌ １０×ＫＣｌ反応緩衝液
各１μｌのＷ５６及びＷ５７+（６０ｐｍｏｌｅの各プライマー）
１μｌ Ｂｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌ ｄＮＴＰｓ（前記参照）
１．７６μｌ ＭｇＣｌ2（５０ｍＭストック）
１μｌ ｍＮＣｌ2（２５ｍＭストック）［反応における終濃度＝３．２６ｍＭ］
３６．７μｌ ｄＨ2Ｏ
*プラスミドｐＰＷ６０１ａＪ５４はｐＰＷ６０１ａ（WO95/25798）の変異体バージョンであり、ＮｄｅＩ部位をＡＴＧ開始コドン前３塩基以内に作成した。これにより、ｐＰＷ６０１ａからｐＥＴ２３ベクターへの容易なクローニングが許容された。
＋プライマー配列：
W56:
5'-AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC-3'
W57:
5'-AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG-3'）
サイクルのパラメーター配下の通りであった。
９４℃で５分、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１２、
７２℃で１０分間。
【００１５】
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュア キット（pure kit）を使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ（cleaned up）」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件：
４μｌ ｐＥＴ２３ａ（５６ｎｇ）
５μｌ ＰＣＲ産物（２００ｎｇ）
３μｌ ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌ ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
２μｌ ｄＨ2Ｏ
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテント（electrocompetent）なＨＢ１０１細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。
１１回のエレクトロポレーションを行い、ついで細胞を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＴＹブロスの４０ｍｌに添加した。次いで細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた培養物の全５０ｍｌを使用してプラスミドＤＮＡを精製した。これをライブラリーとした。
ライブラリーのスクリーニング
プラスミドライブラリーのアリコートを使用して大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞をエレクトロポレーションに付した。これらの細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、３７℃で一晩増殖させた。
翌日、コロニーを選び、ＬＢ寒天＋ａｍｐプレート上のナイロンフィルターにパッチをつけ（patch）、３７℃で増殖を一晩続けた。翌日、フィルターをルシフェリン溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の５００μＭ）で覆った。次いでパッチを暗室で観察した。更なる分析のために２００から１コロニー／パッチを選んだ。
熱安定性変異体の特徴付け
変異体プラスミドを保持する大腸菌クローンを単離した。プラスミドＤＮＡをＡＢＩ配列決定のために調製した。ルシフェラーゼをコードする完全なオープンリーディングフレームを、４つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して配列決定した。配列決定により、ヌクレオチド６４０におけるＡからＧへの単一の点変異が明らかになった。ＡＣＴ（Ｔ）からＧＣＴ（Ａ）へのコドン変化は部位２１４におけるアミノ酸の変化を与えた。
【００１６】
実施例２
三重変異酵素の調製
突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してｐＭＯＤ１（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ）に同一の変異を作成し、三重変異体ｐＭＯＤ２（Ａ２１５Ｌ／Ｅ３５４Ｋ／Ｔ２１４Ａ）を作成した。この変異もｐＭＯＤ１に唯一のＳａｃＩ／ＳｓｔＩ部位を作成した。
実施例３
更なる三重変異酵素の調製
鋳型としてＴ２１４Ａ変異を有するｐＥＴ２３プラスミドを用いて、以下のプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応により三重変異体Ｔ２１４Ａ／Ｉ２３２Ａ／Ｅ３５４Ｋを作成した。
CTGATTACACCCAAGGGGGATG E354K-センス
CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG E354K-アンチセンス
GCAATCAAATCGCTCCGGATACTGC I232A-センス
GCAGTATCCGGAGCGATTTGATTGC I232A-アンチセンス
実施例４
熱安定性２９５変異体の同定
Ｆ２９５変異体を、Fromantら, Analytical Biochemistry, vol 224, 347-353（1995）に記載のエラー易発性ＰＣＲ法を用いて作成した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
０．５μｌ（５０ｎｇ）プラスミドｐＥＴ２３
５．０μｌ １０×ＫＣｌ反応緩衝液
１μｌプライマー１ ６０ｐｍｏｌの各プライマー
１μｌプライマー２
１μｌ Ｂｉｏｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（５Ｕ）
２μｌ ｄＮＴＰｓ、混合物中３５ｍＭ ｄＴＴＰ、１２．５ｍＭ ｄＧＴＰ、２２．５ｍＭ ｄＣＴＰ、１４ｍＭ ｄＡＴＰ
１．７６μｌ ＭｇＣｌ2（５０ｍＭストック）
１μｌ ＭｎＣｌ2（２５ｍＭストック）［反応中の最終濃度＝３．２６ｍＭ］３６．７μｌ ｄＨ2Ｏ
プライマー１＝5'-AAACAGGGACCCATATGGAAGACGC-3'
プライマー２＝5'-AATTAACTCGAGGAATTTCGTCATCGCTGAATACAG-3'
【００１７】
サイクルのパラメーターは以下の通りであった。
９４℃で５分間、
次いで９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で５分
のサイクル×１５、
７２℃で１０分間。
ＰＣＲ産物は、Clontech Advantage（登録商標）ＰＣＲ−ピュア キットを使用して反応混合物から精製した。精製産物のアリコートを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて消化した。次いで消化したＰＣＲ産物を、前記Advantageキットで「クリーンアップ」し、同一の酵素で消化したベクターｐＥＴ２３ａに連結した。
ライゲーション条件は以下の通りであった。
５６ｎｇ ｐＥＴ２３ａ
２００ｎｇ ＰＣＲ産物
３μｌ ５×ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ反応緩衝液
１μｌ ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ（１０Ｕ）
ｄＨ２Ｏを用いて、容量を１０μｌにした。
ライゲーションは１６℃で一晩行った。
連結したＤＮＡをAdvantage（登録商標）キットを用いて精製し、次いでエレクトロコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞へエレクトロポレーションした（１ｍｍキュベット、１．８Ｋｖ）。１ｍｌのＳＯＣブロスを各エレクトロポレーションに添加し、細胞を回復させ、プラスミドによりコードされる抗生物質耐性遺伝子を発現させた。ライブラリーのアリコートを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天に撒き、細菌を３７℃で一晩増殖させた。ナイロンフィルターディスクで寒天プレートを覆い、コロニーを新鮮なプレートに移した。オリジナルのプレートは室温下に放置し、コロニーを再増殖させた。プレートをナイロンフィルターとともに４２℃で２時間インキュベートし、その後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中の５００μＭルシフェリンをスプレーし、暗室中で観察した。
４２℃で２時間後に増殖したことことを基礎に３つの熱安定性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡをこれらのクローンから単離して、配列決定したところ、それぞれの場合においてＦ２９５Ｌ変異が明らかになった。
【００１８】
実施例５
本発明のその他の変異体を、前記及び下記のオリゴヌクレオチドの適切な組み合わせを用いたＰＣＲにより生産した。
GAAAGGCCCGGCACCAGCCTATCCTCTAGAGG F14A-センス
CCTCTAGCGGATAGGCTGGTGCCGGGCCTTTC F14A-アンチセンス
GAGATACGCCGCGGTTCCTGG L35A-センス
CCAGGAACCGCGGCGTATCTC L35A-アンチセンス
実施例６
ルシフェラーゼの精製及び熱不活性化の研究
組換え変異ルシフェラーゼを発現する細胞を増殖させ、破壊し、WO95/25798に記載の通りに抽出し、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を得た。
無細胞抽出物を含むエッペンドルフチューブを特に述べない限りは通常４０℃でインキュベートした。野生型ルシフェラーゼの精製調節物（比較目的）を、１０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭジチオスレイトール及び０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含む熱安定性緩衝液中でインキュベートした。設定時間に、チューブを取り出し、氷／水浴中で冷却し、その後、初期活性又は相対生物発光の百分率として計算される残存するアッセイされる活性を測定した。
結果を図２及び図３に示す。図２から、本発明のルシフェラーゼ変異体は既知の変異体と比べて改善された熱安定性を有していることが理解される。
野生型ルシフェラーゼ（ＲＷＴ）に対して劇的に増加した安定性は図３より明らかである。
【００１９】
実施例７
２１４の変異体の活性についての研究
２１４変異体からなるライブラリーを、カセットオリゴ（cassette oligos）を用いた部位特異的突然変異により調製し（図５）、熱安定性変異体を選択し、実施例１と同様にして試験した。３つの特定の熱安定性変異体を、実施例１と同様にして配列決定し、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎとして特徴づけた。
Ｔ２１４、Ｔ２１４Ａ、Ｔ２１４Ｃ及びＴ２１４Ｎをコードするプラスミドを保持する大腸菌ＸＬ１−ブルーのＯ／Ｎ培養を、Promega溶菌緩衝液を使用して溶解した。５０μｌの液体抽出物を３７℃及び４０℃下、種々の時間で熱不活性化した。１０μｌの加熱抽出物のアリコートを、Promegaライブアッセイ（live assay）緩衝液中で試験した（１００μｌ）。
結果を以下の表に示す。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
３つの変異体について４０℃で実験を繰り返した。
【００２３】
【００２４】
これらの結果は、Ｔ２１４Ｃがｒ−ｗｔ（野生型）又はＴ２１４Ａ若しくはＮのいずれかよりも有意に熱安定性が高いことを示している。存在するシステイン残基が多くなる程、熱安定性が悪くなると予想していたので、特性におけるこの変化は予想外のものであった。
実施例８
その他の点変異体の研究
単一の点変異を有するその他のフォティナス・ピラリス変異体のシリーズを、ランダムエラー易発性PCRを使用して調製した（図５）。生成した変異体のスクリーニング及び配列決定の後、その配列決定を、部位特異的突然変異誘発、続く更なる配列決定を用いてチェックした。Ｄ２３４Ｇ、Ａ１０５Ｖ及びＦ２９５Ｌが存在した。これらの変異体の熱安定性は、試験した組換え野生型フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼと同様であった。Promega溶菌緩衝液中タンパク質サンプルを３７℃で１０分間インキュベートし、その活性を２、５及び１０分後にアッセイした。図４に示す結果は、各変異体が野生型よりも増強された熱安定性を生じることを示している。
【００２５】
本発明は以下に関するものである。
１．ルシフェラーゼ活性を有し、かつ、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ、ピロコエリア・ナヤコ又はフォティナス・ペンシランヴァニカ由来のルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有するタンパク質であって、
前記酵素の配列において、
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１７に対応するアミノ酸残基、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７、又はルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０又はルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基、
のなかの少なくとも１つが対応の野生型配列において現れるアミノ酸とは異なるものであり、かつ、該ルシフェラーゼ酵素が、当該部位に対応の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸を有する酵素と比較して増加した熱安定性を有することを特徴とする酵素。
２．野生型ルシフェラーゼの配列を有し、該配列中の１より多いアミノ酸残基が該野生型酵素のアミノ酸残基とは異なる、前記１に記載のタンパク質。
３．５０までのアミノ酸が野生型酵素のアミノ酸と異なっている、前記２に記載のタンパク質。
４．ルシフェラーゼが、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼから修飾されたものである、前記１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
５．前記１〜４のいずれかに記載のタンパク質であって、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの配列において、以下の変化のうちの少なくとも１つを有しているタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基である、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基がイソロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｄ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｅ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｆ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基がアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｇ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸残基である、
（ｈ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がセリン以外のアミノ酸残基である、
（ｉ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がヒスチジン以外のアミノ酸残基である。
６．前記１〜４のいずれかに記載のタンパク質であって、該タンパク質がルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来酵素の配列を実質的に有し、かつ、以下の変化のうちの少なくとも１つを有しているタンパク質。
（ａ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基礎とする配列では）グリシン以外のアミノ酸残基であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基礎とする配列では）アスパラギン以外のアミノ酸残基である、
（ｂ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がセリン以外のアミノ酸残基である、
（ｃ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸残基である、
（ｄ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニン以外のアミノ酸残基である、
（ｅ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７又はルシオラ・クルシアタ及びルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がリジン以外のアミノ酸残基である、
（ｆ）ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又は、ルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がグリシン以外のアミノ酸残基である、
（ｇ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３６に対応するアミノ酸残基がグリシン以外のアミノ酸残基である、
（ｈ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２２に対応するアミノ酸残基がスレオニン以外のアミノ酸残基である、
（ｉ）ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１２に対応するアミノ酸残基が、（ルシオラ・ミングレリカを基本とする配列では）スレオニン以外のアミノ酸残基であり、又は、（ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリスを基本とする配列では）バリン以外のアミノ酸残基である。
７．前記１〜６のいずれかに記載のタンパク質であって、ルシフェラーゼ活性を有し、フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来のルシフェラーゼ酵素と少なくとも６０％の類似性を有し、該タンパク質の配列内に以下の変化のうち少なくとも１つを有し、かつ、野生型ルシフェラーゼ酵素と比較して増加した熱安定性を有するタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はスレオニン以外である、
（ｂ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合はイソロイシン以外である、又は、
（ｃ）フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９７に対応するアミノ酸残基が変異しており、かつ、例えば、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの場合、フェニルアラニン以外である。
８．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１４に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１６に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１に記載のタンパク質。
９．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３２に対応するアミノ酸残基及びルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ又はルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
１０．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼであり、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２９５に対応するアミノ酸残基がロイシンである、前記１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
１１．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１４に対応するアミノ酸残基又はルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１６に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜１０のいずれかに記載のタンパク質。
１２．ルシフェラーゼが変異したフォティナス・ピラリス又はルシオラ種由来ルシフェラーゼであり、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３７に対応するアミノ酸残基、又はルシオラ・ラテラリス若しくはルシオラ・クルシアタ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３８に対応するアミノ酸残基がアラニンである、前記１〜１１のいずれかに記載のタンパク質。
１３．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０５に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・ミングレリカ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０６に対応するアミノ酸残基、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０７に対応するアミノ酸残基、又はルシオラ・ラテラリス遺伝子由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基１０８に対応するアミノ酸残基がバリンである、前記１〜１２のいずれかに記載のタンパク質。
１４．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２３４に対応するアミノ酸残基がグリシンである、前記１〜１３のいずれかに記載のタンパク質。
１５．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基４２０に対応するアミノ酸残基がスレオニンである、前記１〜１４のいずれかに記載のタンパク質。
１６．変異したフォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼを含み、フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３１０に対応するアミノ酸残基がアルギニンである、前記１〜１５のいずれかに記載のタンパク質。
１７．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５４（ルシオラ由来ルシフェラーゼの部位３５６）に対応する部位のアミノ酸がグルタメート以外のアミノ酸である、前記１〜１６のいずれかに記載のタンパク質。
１８．フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基３５４（ルシオラ由来ルシフェラーゼの部位３５６）に対応する部位のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、前記１７に記載のタンパク質。
１９．ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７（フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１５）に対応する部位のアミノ酸が異なる疎水性アミノ酸である、前記１〜１８のいずれかに記載のタンパク質。
２０．ルシオラ由来ルシフェラーゼのアミノ酸残基２１７（フォティナス・ピラリス由来ルシフェラーゼの部位２１５）に対応する部位のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン又はバリンである、前記１９に記載のタンパク質。
２１．前記１〜２０のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする核酸。
２２．前記２１に記載の核酸を含むベクター。
２３．前記２２に記載のベクターで形質転換した細胞。
２４．原核細胞である、前記２３に記載の細胞。
２５．植物細胞である、前記２３に記載の細胞。
２６．前記２５に記載の細胞を含む植物。
２７．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質を生産する方法であって、前記２３に記載の細胞を培養する工程又は前記２６に記載の植物を増殖させる工程を含むことを特徴とする方法。
２８．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質の生物発光アッセイにおける使用。
２９．前記１〜２０のいずれかに記載のタンパク質を含むキット。
３０．更にルシフェリンを含む、前記２９に記載のキット。
【００２６】
SEQUENCE LISTING
<110> The Secretary of State for Defence in Her Britannic Majesty's
Government of the United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland
<120> Novel enzyme
<130> IPD/P1206/WOD
<140> PCT/GB99/03538
<141> 1999-10-26
<150> GB 9823468.5
<151> 1998-10-28
<160> 35
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 23
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gttgaccgct tgggatcctt aattaaatac 30
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<213> Artificial Sequence
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Oligonucleotide
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gcagtatccg gagcgatttg attgc 25
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<213> Artificial Sequence
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ccattccatc aaggttttgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide
<400> 33
ccaaaacctt gatggaatgg 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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aaacagggac ccatatggaa gacgc 25
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 35
aattaactcg aggaatttcg tcatcgctga atacag 36
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３２位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３２位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１０６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位、
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位又は
ルシオラ・ラテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの１０８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１０６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位、
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位又は
ルシオラ・ラテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの１０８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項９】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも７０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも８０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも９０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１４】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの３５４位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がグルタメート以外のアミノ酸に変異している、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１５】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの３５４位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジン又はアルギニンに変異している、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの２１５位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異している、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１７】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの２１５位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がイソロイシン、ロイシン又はバリンに変異している、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換した細胞。
【請求項２１】
原核細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質の生物発光アッセイにおける使用。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質を含むキット。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３２位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３２位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２９７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３７位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１０６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位、
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位又は
ルシオラ・ラテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの１０８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０５位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの１０６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位、
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの１０７位又は
ルシオラ・ラテラリス遺伝子に由来する野生型ルシフェラーゼの１０８位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３４位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２３６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの４２２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）フォティナス・ピラリス、ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ、ルシオラ・ラテラリス、ホタリア・パロウラ、ピロフォラス・プラギオフタラマス、ラムピリス・ノクチルカ又はフォティナス・ペンシランヴァニカの１つに由来する野生型ルシフェラーゼに由来するタンパク質であって、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ルシフェラーゼ活性及び各野生型ルシフェラーゼと比較して増加した熱安定性を有するタンパク質、但し、
フォティナス・ピラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１０位、
ルシオラ・ミングレリカに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位、
ルシオラ・クルシアタに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位又は
ルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３１２位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が変異している、タンパク質。
【請求項９】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも６０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも７０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも８０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載のタンパク質であって、
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼと少なくとも９０％の類似性を有する、タンパク質。
【請求項１４】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの３５４位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がグルタメート以外のアミノ酸に変異している、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１５】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの３５４位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの３５６位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジン又はアルギニンに変異している、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの２１５位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸が疎水性アミノ酸に変異している、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１７】
フォティナス・ピラリス由来の野生型ルシフェラーゼの２１５位、又は
ルシオラ・ミングレリカ、ルシオラ・クルシアタ若しくはルシオラ・ラテラリスに由来する野生型ルシフェラーゼの２１７位
のアミノ酸に対応するアミノ酸がイソロイシン、ロイシン又はバリンに変異している、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のルシフェラーゼをコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換した細胞。
【請求項２１】
原核細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質の生物発光アッセイにおける使用。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質を含むキット。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図３ｈ】
【図４】
【図５】
【図１−２】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図３ｈ】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１２０６０５（Ｐ２０１１−１２０６０５Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−３１０７１（Ｐ２０１１−３１０７１）
【出願日】平成２３年２月１６日（２０１１．２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５７８４３２（Ｐ２０００−５７８４３２）の分割
【原出願日】平成１１年１０月２６日（１９９９．１０．２６）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１６日（２０１１．２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５７８４３２（Ｐ２０００−５７８４３２）の分割
【原出願日】平成１１年１０月２６日（１９９９．１０．２６）
【出願人】（５０５００５０４９）スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー (2,080)
【Ｆターム（参考）】
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