本出願は、ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的とするＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、ならびに、特に治療目的でのその使用に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１０年１１月１０日に出願されたＵＳＳＮ第６１／４１２，３０９号、２０１０年５月１４日に出願されたＵＳＳＮ第６１／３３４，８０６号、および２０１０年２月１９日に出願されたＵＳＳＮ第６１／３０６，３１１号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的化するＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、ならびに、特に治療目的でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔリンパ球は、抗原に対する適応的免疫反応において中心的役割を果たす。ナイーブＴ細胞は、その完全な活性化のために２つのシグナルを必要とする（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ １９９９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１８５−９０）。第１のシグナルは、抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原ＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用により提供される。第２のシグナルは、Ｔ細胞上の受容体とＡＰＣ上のそのリガンドとの間の相互作用により提供される共刺激シグナルである。ＴＣＲ／ＭＨＣ結合および共刺激相互作用の両方により、カルシウム−カルシニューリンおよびＲＡＳマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを含む複数の細胞内経路を介してＴ細胞活性化がもたらされ、続いてＩＬ−２等のサイトカインを含む複数のエフェクター化合物の転写因子の活性化がもたらされる。これらの事象は、Ｔ細胞増殖、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）プールの生成、および活性化ＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ細胞の拡張をもたらす。完全Ｔ細胞活性化には共刺激が重要であるだけでなく、ＴＣＲ／ＭＨＣ結合中にそれが存在しないと、アネルギーおよび／またはアポトーシスが引き起こされる。
【０００４】
Ｔ細胞調節には複数の正および負の共刺激経路が関与するが、最も重要なのは、Ｔ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）との間である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞のＴＨ１表現型細胞への分化を促進し、Ｂ細胞による抗体産生およびＴ細胞の活性化を向上させる。樹状細胞（ＤＣ）およびＢ細胞等のＡＰＣ上に発現するＢ７−１およびＢ７−２は、重複するが別個の機能を有する。Ｂ７−２は、構成的に発現され、ＴＣＲ／ＭＨＣ結合（シグナル１）と同期してＡＰＣ上で急速に上方調節される。Ｂ７−１発現は、休止細胞上では非常に低いが、典型的には長期Ｔ細胞刺激後に誘導される。これらの差は、Ｂ７−２はＴ細胞活性化の開始において重要となり得るが、Ｂ７−１は免疫応答を持続させる上でより大きな役割を果たし得ることを示唆している。
【０００５】
Ｔ細胞活性化に続いて、負の調節受容体細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２とも呼ばれる）が、Ｔ細胞上で上方調節される（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １：２２０−８）。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８と構造的に相同であるが、Ｂ７−１およびＢ７−２リガンドの両方により強固に結合する。ＣＬＴＡ４は、２つの主要な様式で免疫応答を阻害する、すなわち、Ｂ７リガンドに関してＣＤ２８と競合し、ひいては共刺激を阻止し、またＴ細胞活性化を阻害するように負の信号伝達を行う（Ｋｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，１９９５，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：４５９−４６５；Ｗａｌｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４０５−４１３）。最近の研究では、Ｂ７−２が免疫シナプスにおいてＣＴＬＡ４よりもＣＤ２８に結合し、一方Ｂ７−１は、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ４を連結することが示されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：２０１−２１０；Ｊａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：１５７５−１５８５）。
【０００６】
免疫応答の促進および維持におけるＢ７共刺激経路の重要な役割により、それに拮抗するように設計された治療薬剤は、自己免疫疾患および障害の治療のために有望である。アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））は、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに連結したＣＴＬＡ４の細胞外結合ドメインからなるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンである。アバタセプトは、Ｂ７媒介共刺激を阻害するように開発されたものであり（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：２３３−２３８）、関節リウマチ（ＲＡ）の治療に認可されており、いくつかの他の自己免疫性適応症について臨床試験中である。しかしながら、アバタセプトはＲＡの治療においてある程度の活性を示すものの、他の適応症には効果的ではない。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは、移植片拒絶反応に対する耐性においては到底有効ではない（Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：８７８９−８７９４；Ｌｅｖｉｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９：５１８７−５１９１）。
【０００７】
アバタセプトの不十分な臨床成績は、そのＢ７リガンド、特にＢ７−２に対する天然ＣＴＬＡ４の最適ではない親和性（これが免疫の開始において重要と考えられるため）に起因するとされている。本発明は、改善されたＢ７親和性および増強されたＴ細胞阻害活性を有する新規変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを提供する。そのような新規免疫アドヘシンは、様々な用途において、特に以下で詳細に議論するように免疫関連障害の治療に有益である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との間の相互作用を阻害する新規ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを提供する。本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）に高い親和性で結合するＣＴＬＡ４部分を含み、また１つ以上のＦｃ受容体またはＦｃリガンドと結合し得るＩｇ Ｆｃ部分（またはＦｃ領域）を含む。
【０００９】
本発明の一態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体ＣＴＬＡ４タンパク質を含み、前記変異体は、天然ＣＴＬＡ４タンパク質内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記修飾は、Ａ２９Ｅ、Ａ２９Ｆ、Ａ２９Ｈ、Ａ２９Ｋ、Ａ２９Ｎ、Ａ２９Ｑ、Ａ２９Ｒ、Ｔ３０Ｅ、Ｔ３０Ｈ、Ｔ３０Ｒ、Ｔ３０Ｖ、Ｅ３１Ｄ、Ｅ３１Ｉ、Ｅ３１Ｍ、Ｅ３１Ｔ、Ｅ３１Ｖ、Ｒ３３Ｅ、Ｒ３３Ｆ、Ｒ３３Ｉ、Ｒ３３Ｌ、Ｒ３３Ｍ、Ｒ３３Ｑ、Ｒ３３Ｔ、Ｒ３３Ｗ、Ｒ３３Ｙ、Ｔ３５Ｄ、Ｔ３５Ｅ、Ｔ３５Ｆ、Ｔ３５Ｍ、Ｔ３５Ｖ、Ｔ３５Ｙ、Ａ４９Ｄ、Ａ４９Ｅ、Ａ４９Ｆ、Ａ４９Ｔ、Ａ４９Ｗ、Ａ４９Ｙ、Ｔ５１Ｄ、Ｔ５１Ｅ、Ｔ５１Ｈ、Ｔ５１Ｌ、Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｑ、Ｔ５１Ｒ、Ｔ５１Ｓ、Ｔ５１Ｖ、Ｍ５３Ｅ、Ｍ５３Ｆ、Ｍ５３Ｈ、Ｍ５３Ｑ、Ｍ５３Ｗ、Ｍ５３Ｙ、Ｔ５９Ｈ、Ｔ５９Ｉ、Ｔ５９Ｌ、Ｔ５９Ｎ、Ｔ５９Ｑ、Ｔ５９Ｖ、Ｔ５９Ｙ、Ｌ６１Ａ、Ｌ６１Ｄ、Ｌ６１Ｅ、Ｌ６１Ｆ、Ｌ６１Ｇ、Ｌ６１Ｈ、Ｌ６１Ｉ、Ｌ６１Ｋ、Ｌ６１Ｍ、Ｌ６１Ｎ、Ｌ６１Ｐ、Ｌ６１Ｑ、Ｌ６１Ｒ、Ｌ６１Ｓ、Ｌ６１Ｔ、Ｌ６１Ｖ、Ｌ６１Ｗ、Ｌ６１Ｙ、Ｄ６３Ｅ、Ｓ６４Ｋ、Ｓ６４Ｒ、Ｓ６４Ｙ、Ｋ９３Ｄ、Ｋ９３Ｅ、Ｋ９３Ｆ、Ｋ９３Ｈ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｑ、Ｋ９３Ｒ、Ｋ９３Ｓ、Ｋ９３Ｔ、Ｋ９３Ｖ、Ｋ９３Ｗ、Ｋ９３Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｈ、Ｅ９５Ｌ、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｙ、Ｍ９７Ｄ、Ｍ９７Ｆ、Ｍ９７Ｉ、Ｍ９７Ｎ、Ｍ９７Ｖ、Ｙ９８Ｆ、Ｙ９８Ｗ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ｗ、Ｙ１０３Ｄ、Ｙ１０３Ｅ、Ｙ１０３Ｆ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｎ、Ｙ１０３Ｑ、Ｙ１０３Ｗ、Ｌ１０４Ｆ、Ｌ１０４Ｈ、Ｌ１０４Ｍ、Ｌ１０４Ｖ、Ｌ１０４Ｙ、Ｇ１０５Ｄ、Ｇ１０５Ｅ、Ｉ１０６Ｅ、およびＩ１０６Ｙからなる群から選択される置換であり、前記置換は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の好ましい態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ａ２９Ｈ、Ｔ５１Ｎ、Ｍ５３Ｙ、Ｌ６１Ｅ、およびＫ９３Ｑからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換を含み、前記置換は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の最も好ましい態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ａ２９Ｈ、Ｔ５１Ｎ、Ｌ６１Ｅ、およびＫ９３Ｑからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換を含み、前記置換は、Ｂ７−１および／またはＢ
７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の一態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ａ２９Ｈ、Ａ２９Ｋ、Ｔ５１Ｎ、Ｌ６１Ｅ、およびＹ１０３Ｑからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換を含み、前記置換は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の他の態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ｋ９３Ｖ、Ｌ６１Ｑ、およびＬ１０４Ｈからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換を含み、前記置換は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体ＣＴＬＡ４タンパク質を含み、前記変異体は、Ａ２９Ｈ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｎ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ、Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、およびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換の組み合わせを含み、前記変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の好ましい態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３ＱおよびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換の組み合わせを含み、前記変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の他の態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ、およびＴ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅからなる群から選択されるＣＴＬＡ４置換の組み合わせを含み、前記変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体ＣＴＬＡ４タンパク質を含み、前記変異体は、３５、４９、５１、５３、５９、６１、および９５からなる群から選択されるＣＴＬＡ４位置における置換を含み、前記変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。本発明の好ましい態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体ＣＬＴＡ４タンパク質を含み、前記変異体は、５１および６１からなる群から選択されるＣＴＬＡ４位置における置換を含み、前記変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２に対する増強された結合を提供する。
【００１２】
追加的態様において、本発明は、変異体ヒトＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記第１のドメインは、式：Ｆｘ（１〜２８）−Ｖｂ（２９）−Ｆｘ（３０〜５０）−Ｖｂ（５１）−Ｆｘ（５２）−Ｖｂ（５３）−Ｆｘ（５４〜６０）−Ｖｂ（６１）−Ｆｘ（６２〜９２）−Ｖｂ（９３）−Ｆｘ（９４〜１２４）［配列番号１］（式中、Ｆｘ（１〜２８）は、配列ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫ（配列番号１の位置１〜２８）であり；Ｖｂ（２９）は、ＡおよびＨからなる群から選択され；Ｆｘ（３０〜５０）は、配列ＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡ（配列番号１の位置３０〜５０）であり；Ｖｂ（５１）は、ＴおよびＮからなる群から選択され；Ｆｘ（５２）は、Ｙであり；Ｖｂ（５３）は、ＭおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（５４〜６０）は、配列ＭＧＮＥＬＴＦ（配列番号１の位置５４〜６０）であり；Ｖｂ（６１）は、ＬおよびＥからなる群から選択され；Ｆｘ（６２〜９２）は、配列ＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣ（配列番号１の位置６２〜９２）であり；Ｖｂ（９３）は、ＫおよびＱからなる群から選択され；Ｆｘ（９４〜１２４）は、配列ＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ（配列番号１の位置９４〜１２４）である）を有し、前記変異体は、配列番号２ ６と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増加した結合を示す。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、変異体ヒトＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記第１のドメインは、式：Ｆｘ（１〜２８）−Ｖｂ（２９）−Ｆｘ（３０〜５０）−Ｖｂ（５１）−Ｆｘ（５２）−Ｖｂ（５３）−Ｆｘ（５４〜６０）−Ｖｂ（６１）−Ｆｘ（６２〜９２）−Ｖｂ（９３）−Ｆｘ（９４〜１２４）［配列番号２］（式中、Ｆｘ（１〜２８）は、配列ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫ（配列番号２の位置１〜２８）であり；Ｖｂ（２９）は、Ｈであり；Ｆｘ（３０〜５０）は、配列ＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡ（配列番号２の位置３０〜５０）であり；Ｖｂ（５１）は、ＴおよびＮからなる群から選択され；Ｆｘ（５２）は、Ｙであり；Ｖｂ（５３）は、ＭおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（５４〜６０）は、配列ＭＧＮＥＬＴＦ（配列番号２の位置５４〜６０）であり；Ｖｂ（６１）はＬおよびＥからなる群から選択され；Ｆｘ（６２〜９２）は、配列ＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣ（配列番号２の位置６２〜９２）であり；Ｖｂ（９３）は、ＫおよびＱからなる群から選択され；Ｆｘ（９４〜１２４）は、配列ＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ（配列番号２の位置９４〜１２４）である）を有し、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増加した結合を示す。
【００１４】
追加的態様において、本発明は、変異体ヒトＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記第１のドメインは、式：Ｆｘ（１〜２８）−Ｖｂ（２９）−Ｆｘ（３０〜５０）−Ｖｂ（５１）−Ｆｘ（５２）−Ｖｂ（５３）−Ｆｘ（５４〜６０）−Ｖｂ（６１）−Ｆｘ（６２〜９２）−Ｖｂ（９３）−Ｆｘ（９４〜１２４）［配列番号３］（式中、Ｆｘ（１〜２８）は、配列ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫ（配列番号３の位置１〜２８）であり；Ｖｂ（２９）は、ＡおよびＨからなる群から選択され；Ｆｘ（３０〜５０）は、配列ＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡ（配列番号３の位置３０〜５０）であり；Ｖｂ（５１）は、Ｎであり；Ｆｘ（５２）は、Ｙであり；Ｖｂ（５３）は、ＭおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（５４〜６０）は、配列ＭＧＮＥＬＴＦ（配列番号３の位置５４〜６０）であり；Ｖｂ（６１）は、ＬおよびＥからなる群から選択され；Ｆｘ（６２〜９２）は、配列ＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣ（配列番号３の位置６２〜９２）であり；Ｖｂ（９３）は、ＫおよびＱからなる群から選択され；Ｆｘ（９４〜１２４）は、配列ＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ（配列番号３の位置９４〜１２４）である）を有し、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増加した結合を示す。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、変異体ヒトＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記第１のドメインは、式：Ｆｘ（１〜２８）−Ｖｂ（２９）−Ｖｂ（３０）−Ｖｂ（３１）−Ｆｘ（３２）−Ｖｂ（３３）−Ｆｘ（３４）−Ｖｂ（３５）−Ｆｘ（３６〜４８）−Ｖｂ（４９）−Ｆｘ（５０）−Ｖｂ（５１）−Ｆｘ（５２）−Ｖｂ（５３）−Ｆｘ（５４〜５８）−Ｖｂ（５９）−Ｆｘ（６０）−Ｖｂ（６１）−Ｆｘ（６２）−Ｖｂ（６３）−Ｖｂ（６４）−Ｆｘ（６５−９２）−Ｖｂ（９３）−Ｆｘ（９４）−Ｖｂ（９５）−Ｆｘ（９６）−Ｖｂ（９７）−Ｖｂ（９８）−Ｆｘ（９９〜１０１）−Ｖｂ（１０２）−Ｖｂ（１０３）−Ｖｂ（１０４）−Ｖｂ（１０５）−Ｖｂ（１０６）−Ｆｘ（１０７〜１２４）［配列番号４］（式中、Ｆｘ（１〜２８）は、配列ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫ（配列番号４の位置１〜２８）であり；Ｖｂ（２９）は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択され；Ｖｂ（３０）は、Ｔ、ＨおよびＶからなる群から選択され；Ｖｂ（３１）は、Ｅ、Ｄ、Ｉ、Ｍ、ＴおよびＶからなる群から選択され；Ｆｘ（３２）は、Ｖであり；Ｖｂ（３３）は、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｔ、ＷおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（３４）は、Ｖであり；Ｖｂ（３５）は、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、ＶおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（３６〜４８）は、配列ＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣ（配列番号４の位置３６〜４８）であり；Ｖｂ（４９）は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、ＷおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（５０）は、Ａであり；Ｖｂ（５１）は、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶからなる群から選択され；Ｆｘ（５２）は、Ｙであり；Ｖｂ（５３）は、Ｍ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、ＷおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（５４〜５８）は、配列ＭＧＮＥＬＴ（配列番号４の位置５４〜５８）であり；Ｖｂ（５９）は、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＶおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（６０）は、Ｆであり；Ｖｂ（６１）は、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（６２）は、Ｄであり；Ｖｂ（６３）は、ＤおよびＥからなる群から選択され；Ｖｂ（６４）は、Ｓ、
Ｋ、ＲおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（６５〜９２）は、配列ＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣ（配列番号３の位置６５〜９２）であり；Ｖｂ（９３）は、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（９４）は、Ｖであり；Ｖｂ（９５）は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、ＱおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（９６）は、Ｌであり；Ｖｂ（９７）は、Ｍ、Ｄ、Ｆ、Ｉ、ＮおよびＶからなる群から選択され；Ｖｂ（９８）は、Ｙ、ＦおよびＷからなる群から選択され；Ｆｘ（９９〜１０１）は、配列ＰＰＰであり；Ｖｂ（１０２）は、Ｙ、ＦおよびＷからなる群から選択され；Ｖｂ（１０３）は、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷからなる群から選択され；Ｖｂ（１０４）は、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、ＶおよびＹからなる群から選択され；Ｖｂ（１０５）は、Ｇ、ＤおよびＥからなる群から選択され；Ｖｂ（１０６）は、Ｉ、ＥおよびＹからなる群から選択され；Ｆｘ（１０７〜１２４）は、配列ＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ（配列番号４の位置１０７〜１２４）である）の式を有し、前記変異体は、配列番号２ ６と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増加した結合を示す。
【００１６】
追加的態様において、本発明は、配列番号３４ ８を含む免疫アドヘシンを提供し、前記免疫アドヘシンは、配列番号２ ６と比較してアミノ酸修飾を含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、配列番号２ ６と比較して変異体ＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記ＣＴＬＡ４変異体は、Ｔ５１Ｎ、Ａ２９Ｈ、Ｍ５３Ｙ、Ｌ６１Ｅ、およびＫ９３Ｑからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増強された結合を提供する。
【００１８】
追加的態様において、本発明は、免疫アドヘシン配列番号６と比較して変異体ＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンを提供し、前記ＣＴＬＡ４変異体は、配列番号２ ６の数を使用した５１、５３、６１および９３からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を含み、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増強された結合を提供する。
【００１９】
本発明の一態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、天然Ｆｃ領域を含む。本発明の好ましい天然Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むがこれらに限定されない。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体Ｆｃ領域を含む。本発明の好ましい態様において、変異体Ｆｃ領域は、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する親和性を増強する。本発明のもっとも好ましい態様において、変異体Ｆｃ領域は、生体内でのＣＴＬＡ４−Ｉｇの半減期を延長する。ＦｃＲｎ親和性の増強および／または生体内での半減期の延長に好ましい変異体は、２５９Ｉ、３０７Ｑ、３０８Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｖ、３７８Ｖ、３７８Ｔ、４２６Ｖ、４２８Ｌ、４３４Ｓ、４３６Ｉ、４３６Ｖ、２５０Ｑ、４３４Ａ、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（付番はＥＵ指標に従う）を含むが、これらに限定されない。ＦｃＲｎ親和性の増強および／または生体内での半減期の延長に最も好ましい変異体は、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（付番はＥＵ指標に従う）である。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載の新規ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする単離核酸を提供する。本発明は、随意に制御配列に操作可能に連結される核酸を含むベクターを提供する。本発明は、ベクターを含有する宿主細胞、および免疫アドヘシンを産生し、随意に回収するための方法を提供する。
【００２２】
本発明は、新規ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を提供する。前記新規ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質は、治療製品に用途を見出し得る。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質、および生理学的または薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ 免疫アドヘシンの治療および診断用途を企図する。本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、好ましくは、免疫関連障害を治療するために使用される。本発明の最も好ましい実施形態において、本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、クローン病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ループス腎炎、乾癬性関節炎、乾癬、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、および／または移植片拒絶反応を治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】全長ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、およびヒトＣＴＬＡ４のベラタセプトＡ２９Ｙ／Ｌ１０４Ｅ変異体型のアミノ酸配列である。ＣＴＬＡ４のＥＣＤは、全長ＣＴＬＡ４配列においてグレーでハイライトされている。ベラタセプト配列のグレー部分は、Ａ２９Ｙ／Ｌ１０４Ｅ置換［配列番号５〜８］を強調している。
【図２】例示的Ｆｃ領域のアミノ酸配列である。ここでのＦｃ領域は、ＥＵ付番規定に基づくＣ末端（２３０〜４４７）に対する位置２３０として定義される。グレーハイライトは、天然ＩｇＧ Ｆｃ領域［配列番号９〜１５］からの修飾を示す。
【図３】例示的リンカーのアミノ酸配列である。リンカーの付番はＥＵ指標に基づき、残基２１６〜２２９を含有し、２１６は、ＥＵ付番に基づく天然ＩｇＧイソタイプのＮ末端２１６Ｅである。Ｎ末端Ｑの付加によって番号が変わることはない（すなわち、２１６Ｅはまだ２１６Ｅである）。グレーハイライトは、天然ＩｇＧリンカー［配列番号１６〜２３］からの修飾を示す。
【図４】本研究において使用されたリンカーおよびＦｃ領域の例示的組み合わせのアミノ酸配列である。グレーハイライトは、天然ＩｇＧ定常領域配列［配列番号２４〜２７］からの修飾を示す。
【図５】本研究において試験された、選択されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのアミノ酸配列である［配列番号 ２８〜３０］。
【図６】グレーの三角形により表される、スクリーニングした一置換ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体の全てに関する、アバタセプトに対する倍数（ｋ_ｏｆｆ）のプロットである。黒の正方形は、親ＣＴＬＡ４−Ｉｇアバタセプトを表し、黒の中空の円は、ベラタセプトを表す。
【図７】アバタセプトおよびベラタセプトと比較したＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体に対するＣＤ８０およびＣＤ８６ Ｋ_Ｄのプロットである。本研究のＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体は、グレーの三角形として表されている。黒の正方形は、親ＣＴＬＡ４−Ｉｇアバタセプトを表し、黒の中空の円は、ベラタセプトを表す。
【図８】ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体ＨＮＥＱ（Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ）をアバタセプトおよびベラタセプトと比較した、ＣＤ８６（上）およびＣＤ８０（下）に対する結合のＢｉａｃｏｒｅセンサグラムである。
【図９】例示的変異体ＣＴＬＡ４および変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質［配列番号３１〜３４］のアミノ酸配列である。
【図１０】ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体のＴ細胞阻害活性である。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３および組み換えＢ７−２−Ｉｇを使用したＢ７−２の共連結により活性化された。ＣＦＳＥ標識化Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを使用して監視した。
【図１１】生体内半減期を延長するＦｃ変異体を有する例示的ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体のアミノ酸配列である［配列番号３５〜３８］。
【図１２】ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の天然型およびＦｃ変異体型による、ｐＨ ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する結合のＢｉａｃｏｒｅセンサグラムである。ＬＳは、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を指す。
【図１３】Ｂｉａｃｏｒｅにより決定される、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の天然Ｆｃおよび変異体Ｆｃ型のＦｃＲｎ結合親和性（ｐＨ６．０）のプロットである。ＬＳは、４２８Ｌ／４３４Ｓバリアントを指す。
【図１４】ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体のＴ細胞阻害活性である。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３および組み換えＢ７−２−Ｉｇを使用したＢ７−２の共連結により活性化された。ＣＦＳＥ標識化Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを使用して監視した。
【図１５】混合リンパ球反応におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体のＴ細胞阻害活性である。Ｔ細胞は、２組の実験において、同種異系ＰＢＭＣの混合により活性化された（１つはドナー２３３６および３０７０を用い（上）、１つはドナー３０７０および３９９５を用いた（下））。活性化は、ＥＬＩＳＡにより測定されるＩＬ−２の放出を測定することにより定量化した。
【図１６】生体内での変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の阻害活性である。破傷風に対するヒト免疫応答を阻害するＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の能力を、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて検討した。グラフは、ＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＴＴ）、アバタセプト、および変異体ＣＴＬＡ４（ＮＥＱ）−Ｉｇ（ａｂ）（Ｂ７−１およびＢ７−２に対する増強された親和性を有する５１Ｎ／６１Ｅ／９３Ｑ）で処置した場合の、ＰＢＬ移植後２１日目の破傷風負荷後の抗破傷風抗体（抗ＴＴ ＩｇＧ）の血清濃度を示す。陰性対照として、ＰＢＳ単独（破傷風なし）による処置を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
概要
【００２７】
本発明は、改善されたＢ７親和性および増強されたＴ細胞阻害活性を有する新規変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに関する。そのような新規免疫アドヘシンは、以下で詳細に議論するように、様々な用途において有益である。
【００２８】
ＣＴＬＡ−４とも呼ばれ、またＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られるＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）は、免疫系において重要な調節機能を果たすタンパク質である。人間においては、ＣＴＬＡ４タンパク質は、ＣＴＬＡ４遺伝子によりコードされ、その翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号１に規定される。ＣＴＬＡ４は、免疫グロブリン上科のメンバーであり、細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と構造的に相同である。ＣＴＬＡ４は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の共刺激リガンドＢ７−１およびＢ７−２に結合する。ＣＬＴＡ４は、２つの主要な様式で免疫応答を阻害する、すなわち、Ｂ７−１およびＢ７−２への結合に関してＣＤ２８と競合し、それにより共刺激を阻止し、またＴ細胞活性化を阻害するように負の信号伝達を行う。本発明において、ＣＴＬＡ４タンパク質の特に重要な領域は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２）であり、これは、ＡＰＣ上のＢ７−１およびＢ７−２リガンドへの結合を仲介する。
【００２９】
免疫応答の促進および維持におけるＢ７共刺激経路の重要な役割により、この経路に拮抗するように設計された治療薬剤を提供することが望ましい。したがって、本発明は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ免疫接着を提供する。
【００３０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン
【００３１】
本発明は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ免疫アドヘシンを提供する。「免疫アドヘシン」は、１つ以上のポリペプチドがＦｃ領域に操作可能に連結されるタンパク質を指す。本明細書において使用される免疫アドヘシンは、先行技術において使用される用語「Ｆｃ融合物」、「Ｉｇ融合物」、「受容体Ｆｃ融合物」「Ｉｇキメラ」、および「受容体グロブリン」（時折ダッシュを伴う）、ならびに「ＴＲＡＰ」の同義語である（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：５２−６０、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１９５−２００、ともに参照によりその全体が本明細書に援用される）。免疫アドヘシンは、免疫グロブリンのＦｃ領域を、一般的に標的タンパク質に対する特異性を有する任意のタンパク質または小分子であり得る融合パートナーと結合させる。したがって、免疫アドヘシンは、２つの主要な部分、すなわち標的結合部分およびＦｃ部分を有する。標的結合部分は、実質的に任意の標的または標的抗原に対する特異性を有し得る。Ｆｃ部分は、１つ以上のＦｃ受容体またはＦｃリガンドに結合し得る。融合パートナーは、ＮもしくはＣ末端、または末端間のある残基を含む、Ｆｃ領域の任意の領域に連結されてもよい。実質的に、いかなるタンパク質または小分子もＦｃに連結され、Ｆｃ融合物を生成し、したがって実質的にいかなる標的をも標的とし得るが、本発明の免疫アドヘシンは、融合パートナーとしてＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４の変異体を含む。ＣＴＬＡ４のＩｇ Ｆｃ領域との融合物は、本明細書においてＣＴＬＡ４−ＩｇまたはＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質と呼ばれる。
【００３２】
ＣＴＬＡ４変異体
【００３３】
本発明の免疫アドヘシンの標的結合部分または融合パートナーは、タンパク質ＣＴＬＡ４を含む。したがって、本発明の免疫アドヘシンは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、および、ＣＴＬＡ４により結合される、既知または未知の任意の他のリガンドまたは受容体を結合するように誘導される。本発明の標的結合部分は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質（配列番号１）の全て、いずれか、または一部で構成されるアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、免疫アドヘシン結合部分んは、ＣＴＬＡ４（配列番号２）のＥＣＤの全てまたは一部を含む。実施例に記載されるように、免疫アドヘシン結合は、好ましくは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する結合を改善するＣＴＬＡ４の変異体であり、いくつかの場合において、いずれかへの優先的結合を示す。
【００３４】
ＣＴＬＡ４変異体は、天然ＣＴＬＡ４タンパク質、一般的には配列番号１に示されるヒトＣＴＬＡ４タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、殆どの場合、全ＣＴＬＡ４タンパク質は一般的に本発明の融合タンパク質において使用されないため、変異体は、細胞外ドメイン内にある。この実施形態において、１つ以上の修飾は、以下の位置１つ以上において行われる（配列番号２における付番）：２９、３０、３１、３３、３５、４９、５１、５３、５９、６１、６３、６４、９３、９５、９７、９８、１０２、１０３、１０４、１０５または１０６。いくつかの実施形態において、修飾は、以下の置換の１つ以上である：Ａ２９Ｅ、Ａ２９Ｆ、Ａ２９Ｈ、Ａ２９Ｋ、Ａ２９Ｎ、Ａ２９Ｑ、Ａ２９Ｒ、Ｔ３０Ｅ、Ｔ３０Ｈ、Ｔ３０Ｒ、Ｔ３０Ｖ、Ｅ３１Ｄ、Ｅ３１Ｉ、Ｅ３１Ｍ、Ｅ３１Ｔ、Ｅ３１Ｖ、Ｒ３３Ｅ、Ｒ３３Ｆ、Ｒ３３Ｉ、Ｒ３３Ｌ、Ｒ３３Ｍ、Ｒ３３Ｑ、Ｒ３３Ｔ、Ｒ３３Ｗ、Ｒ３３Ｙ、Ｔ３５Ｄ、Ｔ３５Ｅ、Ｔ３５Ｆ、Ｔ３５Ｍ、Ｔ３５Ｖ、Ｔ３５Ｙ、Ａ４９Ｄ、Ａ４９Ｅ、Ａ４９Ｆ、Ａ４９Ｔ、Ａ４９Ｗ、Ａ４９Ｙ、Ｔ５１Ｄ、Ｔ５１Ｅ、Ｔ５１Ｈ、Ｔ５１Ｌ、Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｑ、Ｔ５１Ｒ、Ｔ５１Ｓ、Ｔ５１Ｖ、Ｍ５３Ｅ、Ｍ５３Ｆ、Ｍ５３Ｈ、Ｍ５３Ｑ、Ｍ５３Ｗ、Ｍ５３Ｙ、Ｔ５９Ｈ、Ｔ５９Ｉ、Ｔ５９Ｌ、Ｔ５９Ｎ、Ｔ５９Ｑ、Ｔ５９Ｖ、Ｔ５９Ｙ、Ｌ６１Ａ、Ｌ６１Ｄ、Ｌ６１Ｅ、Ｌ６１Ｆ、Ｌ６１Ｇ、Ｌ６１Ｈ、Ｌ６１Ｉ、Ｌ６１Ｋ、Ｌ６１Ｍ、Ｌ６１Ｎ、Ｌ６１Ｐ、Ｌ６１Ｑ、Ｌ６１Ｒ、Ｌ６１Ｓ、Ｌ６１Ｔ、Ｌ６１Ｖ、Ｌ６１Ｗ、Ｌ６１Ｙ、Ｄ６３Ｅ、Ｓ６４Ｋ、Ｓ６４Ｒ、Ｓ６４Ｙ、Ｋ９３Ｄ、Ｋ９３Ｅ、Ｋ９３Ｆ、Ｋ９３Ｈ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｑ、Ｋ９３Ｒ、Ｋ９３Ｓ、Ｋ９３Ｔ、Ｋ９３Ｖ、Ｋ９３Ｗ、Ｋ９３Ｙ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｈ、Ｅ９５Ｌ、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｙ、Ｍ９７Ｄ、Ｍ９７Ｆ、Ｍ９７Ｉ、Ｍ９７Ｎ、Ｍ９７Ｖ、Ｙ９８Ｆ、Ｙ９８Ｗ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ｗ、Ｙ１０３Ｄ、Ｙ１０３Ｅ、Ｙ１０３Ｆ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｎ、Ｙ１０３Ｑ、Ｙ１０３Ｗ、Ｌ１０４Ｆ、Ｌ１０４Ｈ、Ｌ１０４Ｍ、Ｌ１０４Ｖ、Ｌ１０４Ｙ、Ｇ１０５Ｄ、Ｇ１０５Ｅ、Ｉ１０６Ｅ、およびＩ１０６Ｙ。いくつかの実施形態において、特に有用であるのは、Ａ２９Ｈ、Ｔ５１Ｎ、Ｍ５３Ｙ、Ｌ６１Ｅ、およびＫ９３Ｑから選択される１つ以上の置換を有するＣＴＬＡ４変
異体であり、特に有用な組み合わせは、Ａ２９Ｈ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｎ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ、Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、およびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑを含む。
【００３５】
本明細書における位置および置換の一覧の全てに関して、個々の置換の組み合わせは、ありとあらゆる可能な組み合わせから形成することができ、またいかなる個々の位置または置換も、独立して可能性の一覧に含まれ得る、またはそこから除外され得ることが理解されるべきである。一般に、野生型または親ＣＴＬＡ４（またはＦｃ領域）と比較して、本発明の変異体は、一般的に、ＣＴＬＡ４領域において１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を有するが、いくつかの場合において、所望の機能が保存される限り、より多くの置換を使用することができる。同様に、以下に記載されるように、Ｆｃドメインもまたこのように置換を有し得る。
【００３６】
別の場所に記載されるように、ＣＴＬＡ４変異体は、Ｂ７−１および／またはＢ７−２への増強された結合等、一般にＣＴＬＡ４リガンドの１つ以上に対する結合を保存または増強する。
【００３７】
Ｆｃドメイン
【００３８】
本発明の免疫アドヘシンのＦｃ部分は、抗体のＦｃ領域またはＦｃ領域のある部分を含む。抗体は、特定の抗原に結合する免疫グロブリンである。ヒトおよびマウスを含む大半の哺乳類において、抗体は、対のポリペプチド重鎖および軽鎖から構成される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗体間で大幅な配列の多様性を示し、標的抗原の結合に関与する。各鎖は、個別の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって、一般的な用語の免疫グロブリンが、このようなタンパク質に使用される。
【００３９】
従来の天然抗体の構造単位は、典型的に、四量体を含む。各四量体は、典型的に、同一の２対のポリペプチド鎖から成り、各対は、「軽鎖」（典型的に、約２５ｋＤａの分子量を有する）１本と、「重鎖」（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）１本とを有する。ヒトの軽鎖は、κおよびλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソタイプを定義する。ＩｇＧは、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、これらに限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、これらに限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む、いくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書で使用される、「イソタイプ」とは、それらの定常領域の化学的および抗原特性により定義される、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ1、IgM2, ＩｇＤ、およびＩｇＥである。微妙な相違が、可変領域に存在する場合があるが、これらの抗体クラス間の際立った特徴は、それらの定常領域である。
【００４０】
軽鎖および重鎖のそれぞれは、可変領域および定常領域と称される、２つの個別の領域から構成される。ＩｇＧ重鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順に、ＮからＣ末端まで連結される４つの免疫グロブリンドメインから成り、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を指す（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも称され、それぞれ、重鎖可変ドメイン、定常γ１ドメイン、定常γ２ドメイン、および定常γ３ドメインを指す）。ＩｇＧ軽鎖は、ＶＬ−ＣＬの順に、ＮからＣ末端まで連結される２つの免疫グロブリンドメインから成り、それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを指す。定常領域は、配列の多様性が低く、重要な生化学事象を顕在化するいくつかの天然タンパク質の結合に関与する。可変および定常領域を含む、抗体の天然な生物学的形態を構成する構造は、本明細書において「完全長抗体」と呼ばれる。ヒトおよびマウスを含む大半の哺乳類において、ＩｇＧイソタイプの完全長抗体は、四量体であり、同一の２対の２つの免疫グロブリン鎖からなり、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、およびＣγ３を含む。
【００４１】
この可変領域は、典型的に、抗体のアミノ末端部であり、分子の抗原結合決定因子を含有し、したがって、その標的抗原に対する抗原の特異性を決定する。可変領域は、同一クラス内の他の抗体と配列が最も異なるため、そう呼ばれる。
【００４２】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖には、重鎖定常（ＣＨ）領域と呼ばれるいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。ＩｇＧ抗体と関連して、ＩｇＧイソタイプは、それぞれ、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧと関連して、「ＣＨ」ドメインとは、以下の通りである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置１１８〜２２０を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置２３７〜３４０を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従い、位置３４１〜４４７を指す。
【００４３】
重鎖の別の重要な領域は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」、もしくは「ヒンジ領域」、もしくは「抗体ヒンジ領域」、もしくは「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１と第２の定常ドメインの間にアミノ酸を含む、柔軟なポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインは、ＥＵの位置２２０で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵの位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧにおいて、抗体ヒンジは、本明細書において、位置２２１（ＩｇＧ１でＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１でＧ２３６）を含むように定義され、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ指標に従う。いくつかの実施形態において、例えば、Ｆｃ領域と関連して、一般的に、「下方ヒンジ」が、位置２２６または２３０から２３６を指す、下方ヒンジが含まれる。
【００４４】
本発明において議論される全ての定常領域位置に関して、付番は、のＥＵ指標に従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。抗体の技術分野の当業者には、これらの規則が、免疫グロブリン配列特定領域における非連続的付番からなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置の正規化された参照を可能とすることが理解される。したがって、ＥＵ指標により定義されるような所与の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続的配列に対応するわけではない。
【００４５】
本発明の免疫アドヘシンは、ＣＴＬＡ４と抗体のＦｃ領域との融合物であるタンパク質である。本明細書で使用される、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン、およびいくつかの場合において、ヒンジの一部を除外する抗体の定常領域を含む、ポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭにいて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧにおいて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間の下方ヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基２３０〜Ｃ末端までを含むように定義され、付番は、ＥＵ付番規定に基づく。Ｆｃは、単独でこの領域を指すか、またはＦｃポリペプチドと関連してこの領域を指してもよい。本明細書で使用される、「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。
【００４６】
抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される、数々の重要な機能的能力を付与する。Ｆｃ領域のＩｇＧにおいて、Ｆｃは、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ２に通じるＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞アームとの間の連通を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０、Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、イソタイプＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、イソタイプＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにイソタイプＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内のいくつかのシグナル伝達事象を媒介してもよい細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、天然キラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞を含む、種々の免疫細胞で発現しもよい。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の編成は、これらのエフェクター細胞を結合抗原の部位に動員し、典型的に、細胞内のシグナル伝達事象、ならびに炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよび細胞障害性攻撃等の、その後の重要な免疫反応をもたらす。細胞障害性および食細胞性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞
を破壊する潜在的機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を生じる細胞媒介性反応は、抗体依存性の細胞媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）と称される（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６； Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞障害性細胞が、標的細胞上で結合抗体を認識し、後に標的細胞のファゴトーシスを生じる、細胞媒介性反応は、抗体依存性の細胞媒介性ファゴトーシス（ＡＤＣＰ）と称される。
【００４７】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりこの受容体に実質的に良く結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＦｃγＲｓは、異なる親和性でＩｇＧ Ｆｃ領域に結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％が同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられる、免疫複合体により引き起こされる活性の正の調節因子であるが、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容抑制チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、前者は、活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは、抑制受容体と呼ばれる。親和性および活性化におけるこれらの相違にも関わらず、全てのＦｃγＲは、Ｃγ２ドメインのＮ末端および前述のヒンジで、Ｆｃ上の同じ領域に結合する。
【００４８】
重複しているが、別個であるＦｃ上の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑの接触面として機能する。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合が、ＡＤＣＣを媒介する同じ方式で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃγ２ドメインとＣγ３ドメインとの間のＦｃ上の部位は、エンドソームから形質膜陥入された抗体を血流に再循環させる結合である、新生受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６、ともに、参照によりその全体が本明細書に援用される）。この過程は、大型の完全長分子による腎臓濾過の防止とともに、１〜３週間にわたる好適な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、抗体輸送において主要な役割も果たす。Ｆｃ上でのＦｃＲｎの結合部位は、細菌タンパク質ＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質の密着結合は、典型的に、タンパク質の精製中に、プロテインＡまたはプロテインＧの親和性クロマトグラフィーを利用することにより、抗体を精製する手段として活用される。これらの領域の再現性、補体、およびＦｃＲｎ／プロテインＡ結合領域は、抗体の臨床特性およびそれらの発達の両方に重要である。
【００４９】
Ｆｃ領域の主な特徴は、Ｎ２９７で生じる、保存されたＮ結合グリコシル化である。場合によってオリゴ糖と称されるこの糖は、抗体にとって重要な構造的かつ機能的役割を担い、抗体が哺乳類発現系を使用して生成されなければならない、主な理由の１つである。ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的なＦｃ結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７糖の組成物における変更、またはその消失は、これらのタンパク質への結合に影響を及ぼす。
【００５０】
本明細書に開示される実施形態の免疫グロブリンは、抗体クラスのいずれかに属する、免疫グロブリン遺伝子によっても実質的にコードされてもよい。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含む。代替の実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、抗体のＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスに属する配列を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、１本以上のタンパク質鎖を含んでもよく、例えば、ホモまたはヘテロオリゴマーを含む単量体もしくはオリゴマーである、抗体またはＦｃ融合物であってもよい。
【００５１】
本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意の生物、例えば、哺乳類（これらに限定されないが、ヒト、ゲッ齒類（これらに限定されないが、マウスおよびラットを含む）、ウサギ目（これらに限定されないが、ウサギおよびノウサギを含む）、ラクダ科（これらに限定されないが、ラクダ、ラマ、およびヒトコブラクダを含む）、ならびにこれらに限定されないが、原猿、広鼻猿類（新世界ザル）、オナガザル上科（旧世界ザル）、およびテナガザル、小型および大型類人猿を含むヒト上科を含むヒト以外の霊長類からの遺伝子により実質的にコードされてもよい。最も好ましい実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンは、実質的にヒトであってもよい。
【００５２】
当該分野に周知のように、免疫グロブリン多型が、ヒト集団に存在する。Ｇｍ多型は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３分子のマーカーのＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、およびＧ３ｍアロタイプと称される、アロタイプ抗原決定基をコードする対立遺伝子を有する、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ３遺伝子により決定される（γ４鎖上で、Ｇｍアロタイプは発見されていない）。マーカーは、「アロタイプ」と「イソアロタイプ」とに分類され得る。これらは、イソタイプ間の強い配列の相同性に応じて、異なる血清学的根拠により区別される。アロタイプは、Ｉｇ遺伝子の対立遺伝子型により特定される抗原決定基である。アロタイプは、異なる個別の重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のわずかな相違を表す。たった１つのアミノ酸の相違でさえ、アロタイプ決定基を引き起こすことができるが、多くの場合、いくつかのアミノ酸置換が生じている。アロタイプは、抗血清が対立遺伝子の相違のみを認識する、サブクラスの対立遺伝子間の配列相違である。イソアロタイプは、１つ以上の他のイソタイプの非多型相同領域と共有されるエピトープを生成する一イソタイプにおける対立遺伝子であり、このため、抗血清は、関連するアロタイプと関連する相同イソタイプの両方と反応する（Ｃｌａｒｋ，１９９７，ＩｇＧ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｃｈｅｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：８８−１１０；Ｇｏｒｍａｎ ＆ Ｃｌａｒｋ，１９９０，Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（６）：４５７−６６、ともに参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００５３】
ヒト免疫グロブリンの対立遺伝子型は、明確に特徴付けされている（ＷＨＯ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｌｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ １９７６，３：３５７−３６２、ＷＨＯ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｌｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５９９−６０１、Ｌｏｇｈｅｍ Ｅ ｖａｎ，１９８６，Ａｌｌｏｔｙｐｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ，Ｍｏｎｏｇｒ Ａｌｌｅｒｇｙ １９：４０−５１、全て参照によりその全体が本明細書に援用される）。加えて、他の多型も特徴付けされている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５４：１−９、参照によりその全体が本明細書に援用される）。現在、１８のＧｍアロタイプが知られている：Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）もしくはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）もしくはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）もしくはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．４３−７８（１９９０）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５０，１９９−２１１、ともに参照によりその全体が本明細書に援用される）。固定された組み合わせで受け継がれるアロタイプは、Ｇｍハプロタイプと呼ばれる。本明細書に開示される免疫グロブリンは、任意の免疫グロブリン遺伝子の任意のアロタイプ、イソアロタイプ、またはハプロタイプにより実質的にコードされ得る。
【００５４】
ＣＴＬＡ４タンパク質は、リンカーを介してＦｃ領域に連結されてもよい。「リンカー」という用語は、ペプチド結合により結合され、１つ以上の抗原結合部分を連結するように使用される２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指すように使用される。そのようなリンカーポリペプチドは、当該分野において周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。種々のリンカーは、融合パートナーにＦｃ領域を共有結合的に連結するように、本明細書に記載されるいくつかの実施形態に用途を見出し得る。本明細書における「リンカー」はまた、「リンカー配列」、「スペーサー」、「係留配列」、またはそれらの文法上の同義語として呼ばれる。ホモまたはヘテロ二機能性リンカーが、周知である（参照によりその全体が援用される、１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，ｐａｇｅｓ １５５−２００を参照のこと）。いくつかの方法を、分子を共有結合的に一緒に連結するように使用することができる。これらは、これらに限定されないが、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮとＣ末端の間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結、および化学的架橋試薬を介した連結を含む。この実施形態の一態様において、リンカーは、組み換え技術またはペプチド合成により生成される、ペプチド結合である。リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒ。リンカーペプチドは、所望の活性を維持するように、相互に対して適切な高次構造を成すような方式で、２つの分子を連結するのに適当な長さを有するべきである。一実施形態において、リンカーは、約１〜５０のアミノ酸の長さであり、好ましくは約１〜３０のアミノ酸の長さである。一実施形態において、長さが１〜２０のアミノ酸のリンカーが使用されてもよい。有用なリンカーは、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ［配列番号３９］、（ＧＧＧＧＳ）ｎ［配列番号４０］、および（ＧＧＧＳ）ｎ［配列番号４１］（式中、ｎは、少
なくとも１の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の柔軟なリンカーを含む。代替的に、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体を含む、種々の非タンパク質性重合体が、リンカーとしての用途を見出し得、つまりリンカーとしての用途を見出し得る。
【００５５】
本発明の好ましいリンカーは、抗体ヒンジ領域からの配列を含む。例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４からのヒンジ配列を含む、任意の抗体イソタイプからのヒンジ領域配列が使用されてもよい。リンカー配列はまた、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含んでもよいがＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではなく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２のアミノ酸残基を含んでもよい。リンカーは、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のイソタイプの免疫グロブリン重鎖から得ることができる。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκまたはＣλから得ることができる。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えばＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）等の他のタンパク質、ヒンジ領域誘導配列、および他のタンパク質からの他の天然の配列から得られてもよい。
【００５６】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンにおけるアミノ酸修飾
【００５７】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、変異体ＣＴＬＡ４、変異体Ｆｃ領域、または変異体ＣＴＬＡ４および変異体Ｆｃ領域の両方を含んでもよい。変異体は、親ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸修飾を含み、該アミノ酸修飾は、１つ以上の最適化された特性を提供する。本明細書において、「修飾」とは、タンパク質、ポリペプチド、抗体、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの物理的、化学的、または配列特性の変更を意味する。本明細書で使用される、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置で存在し得る、２０の自然に生じるアミノ酸または任意の非天然類似体の１つを意味する。したがって、本明細書で使用される「アミノ酸」は、自然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的におけるアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基を含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれかであってもよい。好ましい実施形態において、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ配置である。非天然発生的側鎖が使用される場合、例えば生体内分解を防止または遅延させるために、非アミノ酸置換基が使用されてもよい。アミノ酸修飾は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、および／または欠失であり得る。本明細書における、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を意味する。本明細書で使用される、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の追加を意味する。本明細書で使用される、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
【００５８】
本明細書に開示される変異体は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、その親とアミノ酸配列が異なる。本明細書で使用される、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、変異体を生成するように後に修飾される、無修飾のポリペプチドを意味する。前記親ポリペプチドは、自然に生じるポリペプチド、すなわちＷＴもしくは天然タンパク質、または自然に生じるポリペプチドの変異体もしくは操作された変型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。本明細書において、「野生型」、「ＷＴ」、または「天然」とは、対立遺伝子変型を含む、天然界に認められるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。例えばＷＴ ＣＴＬＡ４またはＷＴ Ｆｃ領域タンパク質を含むＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、親と比較して、１つ以上のアミン酸修飾、例えば、約１〜５０のアミノ酸修飾、例えば、親と比較して、約１〜１０のアミノ酸修飾、約１〜５のアミノ酸修飾等を有してもよい。したがって、この変異体の配列、および親ポリペプチドの配列は、実質的に相同である。例えば、本明細書において、変異体配列は、親変異体配列と約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも約９９％の相同性等を有する。本明細書に開示される修飾は、グリコフォーム修飾も含む。修飾は、一般的に、分子生物学を使用して行われるか、または酵素的に、もしくは化学的に行われてもよい。
【００５９】
本明細書に開示される変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾によって定義される。したがって、例えば、ＣＴＬＡ４における置換Ｔ５１Ｎは、位置５１におけるトレオニンがアスパラギンで置き換えられたＣＴＬＡ４変異体を指す。別の例として、Ｆｃ領域における置換Ｎ４３４Ｓは、位置４３４におけるアスパラギンがセリンで置き換えられたＦｃ変異体を指す。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを伴うＦｃ変異体を定義する。野生型アミノ酸の同一性は、不特定であってもよく、この場合、前述の変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される順番は、恣意的であり、つまり、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、４３４Ｓ／４２８Ｌと同じ変異体であることに留意する。ＣＴＬＡ４における修飾に関して、本明細書における位置の付番は、配列番号６に規定されるＣＴＬＡ４の細胞外領域の連続番号に従う。本明細書において議論される抗体定常領域およびＦｃ領域の位置は、ＥＵ指標またはＥＵ付番規定に従い番号付けされる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＫａｂａｔもしくはＥＵ付番のＥＵ指標またはＥＵ指標は、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００６０】
本明細書における変異体の目標は、典型的には標的リガンドまたはＦｃ受容体との親和性を改変することにより、１つ以上の最適化された特性を提供することである。親和性は、親タンパク質に関連して増強または低減され得る。本明細書で使用される、親ポリペプチドより「大きな親和性」または「改善された親和性」または「増強された親和性」または「良好な親和性」とは、例えば結合アッセイの変異体および親ポリペプチドの量が基本的に同じである時、変異体が、同じ条件下で行われた親ポリペプチドより有意に高い会合平衡定数（ＫＡもしくはＫａ）、または低い解離平衡定数（ＫＤもしくはＫｄ）で、リガンドまたは受容体に結合することを意味する。
【００６１】
例えば、改善されたＢ７−２結合親和性を有するＣＴＬＡ４変異体は、親ＣＴＬＡ４ポリペプチドと比較して約１．２、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００倍またはそれ以上のＢ７−２結合親和性の改善を示してもよく、Ｂ７−２結合親和性は、例えば、当業者によって、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）を含むがこれに限定されない本明細書に開示される結合方法により決定される。
【００６２】
したがって、本明細書で使用される、親ポリペプチドと比較して「低減された親和性」とは、変異体が、親ポリペプチドより有意に低いＫＡまたは高いＫＤで、リガンドまたは受容体に結合することを意味する。より大きいまたは低減された親和性は、親和性の絶対レベルに対しても定義され得る。
【００６３】
本明細書における免疫アドヘシンは、好ましくは、変異体ＣＴＬＡ４を含む。ＣＴＬＡ４変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する結合を改善してもよい。ＣＴＬＡ４変異体は、Ｂ７−１に比べて選択的にＢ７−２への結合を改善してもよい。すなわち、変異体は、ＣＴＬＡ４のＢ７−２への親和性を増強してもよいが、Ｂ７−１への親和性を低減するか、またはＢ７−１への親和性に影響しないか、またはＢ７−２に対する親和性の改善よりも低くＢ７−１への親和性を改善する。代替的に、変異体は、Ｂ７−２に比べて選択的にＢ７−１に対する結合を改善してもよい。
【００６４】
本明細書における免疫アドヘシンは、好ましくは、Ｆｃ変異体を含む。本明細書におけるＦｃ変異体は、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドに対する改善または低減された結合のために最適化されてもよい。本明細書で使用される、「Ｆｃ受容体」または「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃリガンド複合体を形成する、任意の生物からの分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲｓ、ＦｃγＲｓ、ＦｃγＲｓ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲを含むが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドはまた、ＦｃγＲｓと相同であるＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）を含む。Ｆｃリガンドは、Ｆｃを結合する未発見の分子を含んでもよい。
【００６５】
好ましい実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ＦｃＲｎ結合を改善するＦｃ変異体を組み込む。そのような変異体は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ 免疫アドヘシンの生体内薬物動態特性を向上させてもよい。ＦｃＲｎへの結合を増加する、および／または薬物動態特性を改善する好適な変異体は、これらに限定されないが、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍを含む、位置２５９、３０８、４２８、および４３４での置換を含むが、これらに限定されない（「Ｆｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃＲｎ」の表題で、２００８年１２月２２日に出願されたＵＳＳＮ第１２／３４１，７６９号、参照によりその全体が援用される）。ＦｃのＦｃＲｎへの結合を増加する他の変異体は、これらに限定されないが、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６，Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４、参照によりその全体が援用される）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１６９：５１７１−５１８０，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：２３５１４−２３５２４、参照によりその全体が援用される）を含む。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の修飾は、Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ
．，２０１０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：７６６３−７６７１に記載されている。
【００６６】
本発明における使用のための他のＦｃ修飾は、ＦｃγＲｓおよび／または補体タンパク質に対する結合を低減または切断し、それによりＦｃ媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを低減または切断する変異体を含む。そのような変異体はまた、本明細書において「ノックアウト変異体」または「ＫＯ変異体」と呼ばれる。ＦｃγＲｓおよび補体に対する結合を低減する変異体は、Ｆｃ領域により媒介される望ましくない相互作用の低減、およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの選択性の調整に有用である。好ましいノックアウト変異体は、参照により本明細書に明示的に援用される、１０／２／２００８に公開された米国特許出願公開第２００８−０２４２８４５Ａ１号、名称「Ｆｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」に記載されている。好ましい修飾は、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、および３２８における置換、挿入、および欠失を含むがこれらに限定されず、付番はＥＵ指標に従う。好ましい置換は、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒを含むがこれらに限定されず、付番はＥＵ指標に従う。好ましい変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含む。変異体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、任意のＩｇＧイソタイプまたはＩｇＧイソタイプＦｃ領域に関して使用され得る。ＦｃγＲおよび補体結合の低減ならびにＦｃ仲介エフェクター機能の低減に好ましいＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。ハイブリッドのイソタイプ、例えばＵＳＳＮ第１１／２５６，０６０号に記載のハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２イソタイプもまた有用となり得る。ＦｃγＲおよび補体相互作用を低減するための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、および２３４Ｖ、ならびに、突然変異もしくは酵素による手段による、またはタンパク質をグリコシル化しないバクテリア等の生物における産生による、位置２９７におけるグリコシル化の除去を含むが、これらに限定されない。これらの他の修飾は、参照によりその全体が
援用される、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１において考察されている。
【００６７】
ＦｃγＲｓおよび／または補体に対する結合を改善するＦｃ修飾はまた、本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに用途を見出す。そのようなＦｃ変異体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣ等のＦｃ媒介エフェクター機能を増強してもよい。ＦｃγＲおよび補体結合を改善するために好ましい修飾は、参照により本明細書に明示的に援用される、２／２／２００６に公開された米国特許出願公開第２００６−００２４２９８Ａ１号、および１０／１９／２００６に公開された米国特許出願公開第２００６−０２３５２０８Ａ１号に記載されている。好ましい修飾は、２３６、２３９、２６８、３２４、および３３２からなる群から選択される位置における置換を含み、付番はＥＵ指標に従う。好ましい置換は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。好ましい変異体は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含むが、これらに限定されない。ＦｃγＲおよび補体相互作用を増強するための他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉ、および３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９（同上）において考察されている。
【００６８】
一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、阻害受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体を組み込んでもよい。そのような変異体は、本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃγＲＩＩｂ^＋細胞に関連した免疫調節活性を提供してもよい。一実施形態において、Ｆｃ変異体は、１つ以上の活性化受容体に比べ、ＦｃγＲＩＩｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を改変するための修飾は、参照により明示的に本明細書に援用される、２００８年５月３０日出願のＵＳＳＮ第１２／１５６，１８３号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＣＤ３２ｂ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ」に記載されている。特に、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を改善するＦｃ変異体は、ＥＵ指標に従う２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２からなる群から選択される位置において、１つ以上の修飾を含んでもよい。ＦｃγＲＩＩｂ親和性を増強するための好ましい置換は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅを含む。より好ましくは、置換は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙを含むが、これらに限定されない。ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を増強するための好ましいＦｃ変異体は、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、任意のＩｇＧイソタイプまたはＩｇＧイソタイプＦｃ領域に関して、Ｆｃ修飾を組み込む。ＩｇＧイソタイプは、ＦｃγＲ−および／または補体媒介エフェクター機能（複数を含む）を改変するように選択されてもよい。ハイブリッドＩｇＧイソタイプもまた有用となり得る。例えば、ＵＳＳＮ第１１／２５６，０６０号は、具体的発明における用途を見出し得るいくつかのハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２定常領域を記載している。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、イソタイプの修飾、つまり、親ＩｇＧの別のＩｇＧのアミノ酸タイプへの修飾のための手段を含んでもよい。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、２つのイソタイプが異なる位置で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ１位置をＩｇＧ３からのアミノ酸と置換するための置換手段によって構築されてもよい。したがって、１つ以上の置換手段、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含む、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築されてもよい。本発明の他の実施形態において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体は、２つのイソタイプが異なる位置で、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のＩｇＧ２を、ＩｇＧ１からのアミノ酸と置換するための置換手段によって構築されてもよい。したがって、１つ以上の置換手段、例えば、次のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６での、グリシンの挿入を指す）、および３２７Ａの１つ以上を含む、ハイブリッド変異体ｇＧ抗体が、構築されてもよい。
【００７０】
当業者に理解されるように、Ｆｃ領域における個々の変異体および変異体の組み合わせの開示は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４変異体のいずれかと独立して、および随意に組み合わせることができる。すなわち、本明細書に記載される場合、ＣＴＬＡ４変異体は、開示される変異体の組内で、任意の組み合わせで、個々に、および随意に選択および／または組み合わされる。同様に、好適なＦｃドメイン変異体の上記一覧は、Ｆｃ領域内だけでなく、任意のＣＴＬＡ４変異体と、任意の様式で個々に、および随意に組み合わせることができる。すなわち、いくつかの変異体、例えばＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑを含むＣＴＬＡ４変異体が選択されてもよく、これらの変異体は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、および／または４２８Ｌ／４３４Ｓ等のＦｃドメイン変異体と組み合わせることができる。したがって、可能な個々の変異体の「一覧」の開示は、その一覧内、および同じまたは他の目的のための変異体の他の一覧内のありとあらゆる可能な組み合わせを含むことを意図する。
【００７１】
グリコフォーム修飾
【００７２】
抗体Ｆｃ領域は、重鎖の定常領域の保存位置で糖を含有する。各抗体のイソタイプは、明確な種々のＮ結合型糖構造を有する。重鎖に結合される糖とは別に、ヒトＩｇＧの最大３０％は、グリコシル化Ｆａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で、単一結合型二触角性糖を有する。血清からか、またはハイブリドーマもしくは操作された細胞で生体外で産生されるＩｇＧにおいて、ＩｇＧは、Ａｓｎ２９７結合型糖に関して異種である。ヒトＩｇＧにおいて、コアオリゴ糖は、通常、異なる数の外側残基を有する、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃからなる。
【００７３】
本明細書に開示される免疫アドヘシンの糖鎖は、オリゴ糖の説明に通常使用される命名法を参照して説明される。この命名法を使用する糖化学の総説は、Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５−５８３に見られる。この命名法は、例えば、マンノースを表すＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースを表すＧａｌ、フコースを表すＦｕｃ、およびグルコースを表すＧｌｃを含む。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＡｃ、および５−グルコリルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＧｃの省略標記によって記載される。
【００７４】
「グリコシル化」とは、オリゴ糖（２つ以上の単糖の連結、例えば、２〜約１２の単糖の連結を含有する糖）の糖タンパク質への結合を意味する。オリゴ糖測鎖は、典型的に、ＮまたはＯ結合のいずれかを通して、糖タンパク質の骨格に連結される。本明細書に開示される免疫アドヘシンのオリゴ糖は、一般的に、Ｎ結合型オリゴ糖としてＦｃ領域のＣＨ２ドメイに結合される。「Ｎ結合型グリコシル化」とは、糖タンパク質鎖における、糖鎖のアスパラギン残基への結合を指す。当業者は、例えば、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のそれぞれ、ならびにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＤ ＣＨ２ドメインが、残基２９７で、Ｎ結合型グリコシル化のための単一部位を有することを認識するであろう。
【００７５】
本明細書の目的において、「成熟型コア糖構造」とは、一般的に、二触角性オリゴ糖に典型的な、次の糖構造：ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃｏｓｅ）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）_２からなる、Ｆｃ領域に結合される処理されたコア糖構造を指す。成熟型コア糖構造は、一般的に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合を介して、糖タンパク質のＦｃ領域に結合される。「二分ＧｌｃＮＡｃ」とは、成熟型コア糖構造のα１，４マンノースに結合されるＧｌｃＮＡｃ残基である。二分ＧｌｃＮＡｃは、α（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ酵素（ＧｎＴＩＩＩ）により、酵素的に成熟型コア糖構造に結合され得る。ＣＨＯ細胞は、通常、ＧｎＴＩＩＩを発現しないが（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３３７０−１３３７８）、そのように操作することができる（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【００７６】
本明細書において、修飾されたグリコフォームまたは操作されたグリコフォームを含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが記載される。本明細書で使用される、「修飾されたグリコフォーム」、または「操作されたグリコフォーム」とは、タンパク質、例えば、抗体に共有結合的に結合される糖組成物を意味し、該糖組成物は、親タンパク質のそれと化学的に異なる。操作されたグリコフォームは、これらに限定されないが、ＦｃγＲ媒介性エフェクター機能の増強または低減を含む、種々の目的に有用であり得る。一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ｆｃ領域に共有結合的に結合される、フコシル化および／または二分オリゴ糖のレベルを制御するように修飾される。
【００７７】
修飾されたグリコフォームを生成するための種々の方法は、当該分野において周知である（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３、ＵＳＳＮ第１２／４３４，５３３号、参照により全てが明示的に援用される）。これらの技法は、例えば、操作された、種々の生物または細胞株（例えば、Ｌｅｃ−１３ＣＨＯ細胞、またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現させることにより、さもさければ、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシル基転移酵素］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することにより、ＩｇＧが発現した後に、糖（類）を修飾することにより、または酵素阻害剤としてのフコース類似体の存在下で抗体を発現させることにより、Ｆｃ領域に共有結合的に結合される、フコシル化および／または二分オリゴ糖のレベルを制御する。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのグリコフォームを修飾するための他の方法は、糖操作された酵母株（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４（２）：２１０−２１５）、蘚類（Ｎｅｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｊｏｌ ４４（７）：１８２６−８）、および植物（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１２）：１５９１−７）の使用を含む。修飾されたグリコフォームを生成するための特定の方法の使用は、その方法に実施形態を制限するものではない。むしろ、本明細書に開示される実施形態は、それらがどのように生成されるかに関係なく、修飾されたグリコフォームを伴うＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを包含する。
【００７８】
一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、シアル化のレベルを変更するために、糖操作される。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンＧ分子における、高レベルのシアル化Ｆｃグリカンは、機能性に悪影響を与える可能性があり（Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（７）：１５２４−３４）、Ｆｃシアル化のレベルの相違は、変更された抗炎症性活性をもたらす可能性がある（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０−６７３）。抗体は、Ｆｃコア多糖のシアル化の際に抗炎症性特性を取得し得るため、Ｆｃシアル酸含有量の増加または低減のために、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを糖操作することは、有益であり得る。
【００７９】
操作されたグリコフォームは、典型的に、異なる糖またはオリゴ糖を指し、したがって、例えば、免疫グロブリンは、操作されたグリコフォームを含み得る。代替的に、操作されたグリコフォームは、異なる糖またはオリゴ糖を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを指す場合がある。一実施形態において、本明細書に開示される組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含み、グリコシル化抗体の約５１〜１００％、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％、９０〜１００％、９５〜１００％等が、フコースを欠失する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、フコースを欠失する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。代替の実施形態において、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含み、約５１〜１００％のグリコシル化抗体、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％または９０〜１００％は、シアル酸を欠失する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、シアル酸を欠失する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。また別の実施形態において、組成物は、Ｆｃ領域を有するグリコシル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含み、グリコシル化抗体の約５１〜１００％、例えば、組成物中の抗体の約８０〜１００％または９０〜１００％は、シアル酸を含有する、成熟型コア糖構造を含む。別の実施形態において、組成物中の抗体は、シアル酸を含有する成熟型コア糖構造を含み、さらに、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、両方である。別の実施形態において、操作されたグリコフォームとアミノ酸修飾の組み合わせは、抗体に最適なＦｃ受容体結合特性を提供する。
【００８０】
他の修飾
【００８１】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、最適化された特性を提供する１つ以上の修飾を含んでもよい。該修飾は、アミノ酸修飾であるか、または酵素的に、もしくは化学的に行われる修飾であってもよい。このような修飾は、例えば、その安定性、溶解性、または臨床使用の増強等の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのある程度の改善を提供する可能性が高い。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをさらなる修飾と結合することにより行わせてもよい、種々の改善を本明細書に開示する。
【００８２】
一実施形態において、修飾は、これらに限定されないが、安定性、溶解性、およびオリゴマー状態を含む、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生物物理学的特性を改善するように行われる。修飾は、例えば、より高い安定性を提供するように、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのより好適な分子内相互作用を提供する置換、または高溶解性のために、露出非極性アミノ酸の極性アミノ酸との置換を含むことができる。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに対する他の修飾は、特定の構造、またはホモ二量体もしくはホモ多量体分子を可能にするものを含む。そのような修飾は、これらの限定されないが、操作されたジスルフィド、および化学修飾または集合法を含む。
【００８３】
さらなる実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、タンパク質分解部位を除去する修飾を含む。これらは、例えば、生産収量を低減するプロテアーゼ部位、ならびに生体内で投与タンパク質を分解するプロテアーゼ部位を含み得る。一実施形態において、さらなる修飾は、脱アミド（すなわち、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド）、酸化、およびタンパク質分解部位等の、共有結合分解部位を除去するように行われる。除去に特に有用である脱アミド部位は、これらに限定されないが、グリシンが続く、アスパラギニルおよびグルタミル（ｇｌｔｕａｍｙｌ）残基、（それぞれ、ＮＧおよびＱＧモチーフ）を含む、脱アミドの傾向を増強するものである。このような場合、いずれの残基の置換も、脱アミドの傾向を有意に低減することができる。一般的な酸化部位は、メチオニンおよびシステイン残基を含む。導入または除去され得る他の共有結合性修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の”−アミノ基のメチル化、およびＮ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。さらなる修飾は、限定されないが、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化およびリン酸化等の、翻訳後修飾も含み得る。
【００８４】
修飾は、生物学の産生に通常使用される、宿主または宿主細胞から得られる発現および／または精製収量を改善するものを含んでもよい。これらは、これらに限定されないが、種々の哺乳類細胞株（例えば、ＣＨＯ）、酵母細胞株、バクテリア細胞、および植物を含む。さらなる修飾は、重鎖が、鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を除去する、または低減する修飾を含む。さらなる修飾は、重鎖が、鎖内ジスルフィド結合を形成する能力を除去する、または低減する修飾を含む。
【００８５】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、限定されないが、参照により本明細書に明示的に援用される、Ｌｉｕ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ，２０１０，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９：４１３−４４４に記載される方法を含む方法を使用して組み込まれた、非天然アミノ酸の使用を含む修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態において、これらの修飾は、上述の種々の機能的、生物物理学的、免疫学的、または製造特性の操作を可能にする。さらなる実施形態において、これらの修飾は、他の目的のために、さらなる化学修飾を可能にする。
【００８６】
他の修飾が、本明細書において企図される。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体等の、種々の非タンパク質性重合体の１つに連結されてもよい。さらなるアミノ酸修飾が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの特異的または非特異的な化学修飾もしくは翻訳後修飾を可能にするように行われてもよい。このような修飾は、これらに限定されないが、ペグ化およびグリコシル化を含む。ペグ化を可能にするように利用され得る特異的置換は、これらに限定されないが、効率的かつ特異的なカップリング化学法が、ＰＥＧか、さもなければ重合体部分を結合するために使用され得るような、新規システイン残基または非天然アミノ酸の導入を含む。特定のグリコシル化部位の導入は、新規Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列を本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに導入することにより、達成され得る。
【００８７】
免疫原性を低減するための修飾は、親配列由来の処理されたペプチドのＭＨＣタンパク質への結合を低減する修飾を含んでもよい。例えば、アミノ酸修飾は、任意の一般的なＭＨＣ対立遺伝子を高親和性で結合することが予測される免疫エピトープが存在しないか、または最小数であるように操作されるだろう。タンパク質配列におけるＭＨＣ結合型エピトープの同定のいくつかの方法は、当該分野で知られており、本明細書に開示される抗体のエピトープをスコアするために使用されてもよい。
【００８８】
共有結合修飾は、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの範囲内に含まれ、必ずではないが、概して翻訳後に行われる。例えば、共有結合的修飾のいくつかの種類は、特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖、またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることにより、分子に導入され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫グロブリンの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の追加を含む。「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。いくつかの実施形態において、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために、種々の長さのスペーサーのアームを介してＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに結合される。タンパク質を標識するための種々の方法が、当該分野において知られており、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生成に使用され得る。
【００８９】
一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、「融合タンパク質」であり、本明細書において時折「共役体」と呼ばれる。融合パートナーまたは共役パートナーは、タンパク質性または非タンパク質性であり得、後者は、一般的に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン上および共役パートナー上の官能基を使用して生成される。共役パートナーおよび融合パートナーは、小分子化学化合物およびポリペプチドを含む、任意の分子であってもよい。例えば、種々の共役体および方法が、Ｔｒａｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５８４−５８８に記載されており、参照によりその全体が援用される。可能な共役パートナーは、これらに限定されないが、サイトカイン、細胞障害性薬剤、毒素、ラジオアイソトープ、化学療法剤、反脈管形成物質、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療活性剤を含む。いくつかの実施形態において、共役パートナーは、むしろ負荷量と考えられてもよい、つまり、共役体の目的は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンによる、共役パートナーの標的細胞、例えば、癌細胞または免疫細胞への標的送達である。したがって、例えば、毒素のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの共役は、該毒素の標的抗原を発現する細胞への送達を標的とする。当業者により理解されるように、実際には、融合および複合の概念および定義は、重複する。融合または複合の意味は、本明細書に開示される任意の特定の実施形態にそれを制限するものではない。むしろ、これらの用語は、本明細書に開示される任意のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが、ある所望の特性を提供するように、遺伝的に、化学的に、または他の方法で、１つ以上のポリペプチドもしくは分子に連結されてもよいという、広範な概念を伝達するように漠然と使用される。
【００９０】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの産生
【００９１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを産生し、実験的に試験するための方法もまた、本明細書に開示される。開示される方法は、実施形態を任意の特定の操作の用途または理論に限定するものではない。むしろ、提供される方法は、１つ以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを取得するように産生され、実験的に試験され得ることを、一般的に例示して説明するものである。抗体およびタンパク質分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングのための一般的な方法は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌ編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１、およびＨａｙｈｕｒｓｔ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２００１，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：６８３−６８９、Ｍａｙｎａｒｄ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２：３３９−７６に記載されている。
【００９２】
本明細書に開示される一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードし、その後、所望する場合、宿主細胞内にクローン化、発現、および測定され得る核酸が作製される。したがって、各タンパク質配列をコードする、核酸、および特にＤＮＡが作製され得る。これらの実践は、周知の手順を使用して実施される。例えば、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生成に用途を見出し得る種々の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）、および Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に記載されており、ともに、参照によりその全体が援用される。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードするＤＮＡを効率的に生成するために使用され得る、種々の技術がある。このような方法は、これらに限定されないが、遺伝子アセンブリ法、ＰＣＲに基づく方法、およびＰＣＲの変形を使用する方法、リガーゼ連鎖反応に基づく方法、合成組み換え、エラーを起こしやすい増幅法、およびランダム変異を伴うオリゴを使用する方法等の混合オリゴ法、古典的な部位指定変異導入法、カセット変異導入法、ならびに他の増幅および遺伝子合成法を含む。当該分野において知られているように、遺伝子アセンブリ、変異導入、ベクターサブクローン化等のための種々の市販のキットおよび方法があり、このような市販製品は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸の生成に用途を見出す。
【００９３】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンタンパク質は、タンパク質の発現を誘発する、または生じるような適切な条件下で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸を含有する、核酸、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することにより生成することができる。発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により異なり、日常の実験を通して、当業者によって容易に確認されるであろう。これらに限定されないが、哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、酵母、および植物細胞を含む、多種多様の適切な宿主細胞が使用されてもよい。例えば、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生成に用途を見出し得る、種々の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、ＡＴＣＣ（登録商標）細胞株カタログに記載されている。
【００９４】
一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、発現コンストラクトが、レトロウイルスまたはアデノウイルス等のウイルスを用いて哺乳類細胞に導入される系を含む、哺乳類発現系で発現される。任意の哺乳類細胞、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、および霊長類の細胞を使用することができる。適切な細胞は、限定されないが、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ Ｃ．６、ＨｅＬａ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０細胞、およびそれらの変異体を含む、既知の研究細胞も含む。代替の実施形態において、ライブラリタンパク質が、バクテリア細胞で発現される。バクテリア発現系は、当該分野に周知であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌、ストレプトコッカスクレモリス、およびストレプトコッカスリビダンスを含む。代替の実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウラバＢｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）または酵母細胞（例えば、出芽酵母、ピキア等）で産生される。代替の実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、無細胞翻訳系を使用して、生体外で発現される。原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および真核（例えば、麦芽、ウサギ網状赤血球）細胞の両方に由来する生体外翻訳系が、利用可能であり、対象とするタンパク質の発現レベル、および機能特性に基づき選択されてもよい。例えば、当業者に理解されるように、生体外翻訳が、例えば、リボソーム提示等の、いくつかの提示技術に必要である。加えて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、化学合成法により産生されてもよい。動物（例えば、ウシ、ヒツジ、またはヤギの乳、発育鶏卵、全昆虫幼虫等）および植物（例えば、トウモロコシ、タバコ、ウキクサ等）の両方の形質転換発現系も同様。
【００９５】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸が、タンパク質を発現するために、発現ベクターに導入されてもよい。種々の発現ベクターが、タンパク質発現のために利用されてもよい。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み入れられるベクターを含んでもよい。発現ベクターは、宿主細胞型と適合可能であるように構築される。したがって、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生成に用途を見出す発現ベクターは、これらに限定されないが、哺乳類細胞、バクテリア、昆虫細胞、酵母、および生体外系で、タンパク質発現を可能にするものを含む。当該分野において知られているように、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを発現するための用途を見出し得る、種々の発現ベクターが、商業的または別様に入手可能である。
【００９６】
発現ベクターは、典型的に、制御もしくは調節配列と操作可能に連結するタンパク質、選択可能マーカー、任意の融合パートナー、および／または追加要素を含む。本明細書において、「操作可能に連結される」とは、核酸が、別の核酸配列と機能的関係に配置されることを意味する。概して、これらの発現ベクターは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸に操作可能に連結される転写および翻訳調節核酸を含み、典型的に、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適している。一般的に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびに転写促進因子または活性化因子配列を含み得る。また当該分野において知られているように、発現ベクターは、典型的に、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする、選択遺伝子またはマーカーを含有する。選択遺伝子は、当該分野に周知であり、使用される宿主細胞により異なる。
【００９７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、発現タンパク質の標的、精製、スクリーニング、提示等を可能にするように、融合パートナーに操作可能に連結されてもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン配列に連結されてもよい。リンカー配列は、一般的に、少数のアミノ酸、典型的には、１０より少ないアミノ酸を含むが、それより長いリンカーも使用されてもよい。典型的には、リンカー配列は、柔軟かつ分解に対して耐性であるように選択される。当業者に理解されるように、広範な種々の配列のいずれをも、リンカーとして使用することができる。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ ［配列番号４０］を含む。融合パートナーは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンおよび任意の関連する融合パートナーを所望の細胞部位または細胞外媒体に誘導する、標的またはシグナル配列であってもよい。当該分野において知られているように、特定のシグナル伝達配列は、成長媒体か、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔のいずれかの中に分泌されるタンパク質を標的とし得る。融合パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にする、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列でもあってよい。このような融合パートナーは、これらに限定されないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（例えば、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システムで使用するためのＨ６およびＨ１０、または他のタグ（例えば、Ｎｉ^＋２親和性カラム））、ＧＳＴ融合物、ＭＢＰ融合物、Ｓｔｒｅｐタグ、バクテリア酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体の標的とされるエピトープタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグ等）を含む。当業者に理解されるように、このようなタグは、精製、スクリーニング、または両方に有用であり得る。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、Ｎｉ^＋２親和性カラムに固定することにより、Ｈｉｓタグを使用して生成されてもよく、次いで、精製後、同じＨｉｓタグは、（以下に記載するように）ＥＬＩＳＡまたは他の結合測定法を実施するために、抗体をＮｉ^＋２被覆プレートに固定するために使用されてもよい。融合パートナーは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをスクリーニングするための選択法の使用を可能にし得る（以下を参照）。種々の選択法を
可能にする融合パートナーは、当該分野において周知である。
【００９８】
一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に知られている種々の方式で、単離または精製することができる。本発明において、精製は、本明細書に記載のように、ヘテロ二量体重鎖種をホモ二量体重鎖から分離するために特に有用である。標準的な精製方法は、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣ等のシステムを使用して大気圧力または高圧で実施される、イオン交換、粗水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、および逆相を含むクロマトグラフィー技術を含む。精製法は、電気泳動法、等電点分離法、免疫学、沈降法、透析法、および等電点電気泳動法も含む。タンパク質濃度と併用して、限外濾過法および透析濾過法も、有用である。当該分野に周知のように、種々の天然のタンパク質が、Ｆｃおよび抗体に結合し、これらのタンパク質は、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを精製するために用途を見出すことができる。例えば、細菌タンパク質ＡおよびＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌タンパク質Ｌは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合し、当然、抗体の標的抗原にも同様に結合する。精製は、多くの場合、特定の融合パートナーにより可能となり得る。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ＧＳＴ融合が採用される場合、グルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが採用される場合、Ｎｉ^＋２親和性クロマトグラフィー、またはｆｌａｇタグが使用される場合、固定抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製されてもよい。適切な精製技法の一般的な指針については、例えば、参照によりその全体が援用される、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。必要な精製の程度は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのスクリーニングまたは使用に応じて異なる。いくつかの場合においては、精製は必要ない。例えば、一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが分泌される場合、スクリーニングが、媒体から直接行われてもよい。当該分野に周知のように、いくつかの選択の方法は、タンパク質の精製を含まない。
【００９９】
生体外実験
【０１００】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、これらに限定されないが、結合検定法、細胞を用いた検定法、および選択技術を使用するものを含む、種々の生体外法を使用して実験的に試験されてもよい。自動高処理スクリーニング技術が、スクリーニング手順に利用されてもよい。スクリーニングは、融合パートナーまたは標識の使用を採用してもよい。融合パートナーの使用は、上で論じられた。本明細書において、「標識化」とは、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが、スクリーニングにおける検出を可能とする１つ以上の元素、同位体、または化学化合物を有することを意味する。一般的に、標識は、次の３つに分類される：ａ）抗体により認識される融合パートナーとして組み込まれるエピトープであってもよい、免疫標識、ｂ）放射性活性もしくは重同位体であってもよい、同位体標識、およびｃ）蛍光色素および比色色素、もしくは他の標識法を可能にするビオチン等の分子を含んでもよい、小分子標識。標識が、任意の位置で化合物に組み込まれてもよく、タンパク質発現中に、生体外または生体内に組み込まれてもよい。
【０１０１】
一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの機能的および／または生物物理学的特性は、生体外検定でスクリーニングされる。生体外検定は、対象とするスクリーニング特性の広範なダイナミックレンジを可能にし得る。本発明に特に関連して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、１つ以上の抗原に対する親和性に関して試験され得る。スクリーニングされ得る特性は、これらに限定されないが、安定性、溶解性、およびＦｃリガンド、例えば、ＦｃγＲに対する親和性を含む。複数の特性が、同時または個別にスクリーニングされてもよい。タンパク質は、検定の必要条件に応じて、精製されていても、精製されていなくてもよい。一実施形態において、スクリーンニングは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを結合することが既知の、またはそう思われる、タンパク質または非タンパク質分子へのＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの結合に対する定性もしくは定量性結合検定である。一実施形態において、スクリーニングは、標的抗原への結合を測定するための結合検定である。代替の実施形態において、スクリーニングは、これらに限定されないが、ＦｃγＲｓのファミリー、新生児型受容体ＦｃＲｎ、補体タンパク質Ｃ１ｑ、ならびに細菌プロテイン質ＡおよびＧを含む、ＦｃリガンドへのＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの結合についての検定である。前記Ｆｃリガンドは、任意の生物からであってもよい。一実施形態において、Ｆｃリガンドは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、および／またはサルからのものである。結合検定は、限定されないが、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）および ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）を用いた検定、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（増幅発光性近接均質アッセイ）、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）としても知られる）、等温滴定熱量測定法、示差走査熱量測定法、ゲル電気泳動法、およびゲル濾過を含むクロマトグラフィーを含む、当該分野において知られている種々の方法を使用して実施され得る。これら、および他の方法は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのある融合パートナーまたは標識をうまく利用し得る。検定は、限定されないが、発色性、蛍光性、発光性、または同位体標識を含む、種々の検出方法を採用し
てもよい。
【０１０２】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生物物理学的特性、例えば、安定性および溶解性は、当該分野において知られている種々の方法を使用して試験され得る。タンパク質の安定性は、折り畳み状態と非折り畳み状態との間の熱力学的平衡を測定することにより決定され得る。例えば、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、化学変性剤、熱、またはｐＨを使用してほどかれてもよく、この移行は、これらに限定されないが、円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法、およびタンパク質分解を含む方法を使用して監視されてもよい。当業者により理解されるように、フォールドおよびアンフォールドの移行の動態パラメータも、これら、および他の技法を使用して監視され得る。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの溶解性および全体的な構造の統合性は、当該分野において知られている広範な方法を使用して、定量的、または定性的に決定され得る。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生物物理学的特性を特徴付けるための用途を見出し得る方法は、ゲル電気泳動法、等電点電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、ペプチドマッピング、オリゴ糖マッピング、質量分析法、紫外吸光分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、等温滴定熱量測定法、示差走査熱量測定法、超遠心分析法、動的光散乱法、タンパク質分解および架橋結合、濁度測定、フィルタ遅延アッセイ、免疫学的検定、蛍光色素結合検定、タンパク質染色法、顕微鏡法、およびＥＬＩＳＡまたは他の結合検定を介した凝集物の検出を含む。Ｘ線結晶学的技法およびＮＭＲ分光法を採用した構造分析にも、用途を見出し得る。一実施形態において、安定性および／または溶解性は、所定の時間期間の後に、タンパク質溶液の量を決定することにより測定され得る。この検定において、タンパク質は、例えば、高温、低ｐＨ、または変性剤の存在等の、ある極端な条件に曝されても、曝されなくてもよい。機能は、典型的に、安定性、溶解性、および／またはよく折り畳まれた構造のタンパク質を必要とするため、前述の機能検定および結合検定も、このような測定を実施するための方式を提供する。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含む溶液は、
標的抗原を結合するその能力について測定され、その後、１つ以上の所定の時間期間の間、高温に曝され、その後、再び、抗原結合について測定され得る。アンフォールドおよび凝集タンパク質は、抗原に結合する能力があると予期されないため、活性残存量は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの安定性および溶解性の尺度を提供する。
【０１０３】
一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、１つ以上の細胞を用いた検定、または生体外検定を使用して試験されてもよい。このような検定において、細胞が本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに曝されるように、精製もしくは未精製のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが、典型的に、外因的に添加される。これらの検定は、必ずしもそうではないが、典型的に、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの標的抗原に結合し、例えば、細胞溶解、ファゴサイトーシス、リガンド／受容体結合阻害、成長および／または増殖の阻害、カルシウム放出および／またはシグナル伝達の阻害、アポトーシスのようなエフェクター機能等の、ある生化学事象を媒介する能力の生物学に基づく。このような検定は、多くの場合、細胞のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンへの応答、例えば、細胞生存、細胞死、細胞ファゴサイトーシス、細胞溶解、細胞形態の変化、または天然遺伝子もしくはリポーター遺伝子の細胞発現等の転写活性化を監視することを含む。例えば、このような検定は、例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣの殺細胞を誘発する、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの能力を測定し得る。抗原の共結合により媒介される殺細胞を測定する検定が、本発明に特に関連する。いくつかの検定において、例えば、血清補体、または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞等のエフェクター細胞等の、追加の細胞または構成要素が、つまり、標的細胞に加え、添加される必要がある場合がある。このような追加細胞は、任意の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルからであってもよい。架橋または単量体抗体は、抗体の標的抗原を発現する特定の細胞株のアポトーシスをもたらすか、または検定に添加された免疫細胞による、標的細胞への攻撃を媒介する場合がある。細胞の死または生存を監視するための方法は、当該分野において知られており、色素、フルオロフォア、免疫化学、細胞化学、および放射性試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼ検定またはアネキシン−フルオロ結合物は、アポトーシスの測定を可能にし得、放射性基質（例えば、クロム−５１放出検定）の取り込み、もしくは放出、またはアラマーブルー等の蛍光色素の代謝減少は、細胞成長、増殖、または活性の監視を可能にし得る。一実施形態において、ＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴ
ＤＡを用いた、細胞障害性検定（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）が使用される。代替的に、死んだ、または損傷した標的細胞は、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ等の、１つ以上の天然の細胞内タンパク質の放出を測定することにより監視され得る。転写の活性化も、細胞を用いた検定の機能を測定するための方法として機能する。この場合、上方制御または下方制御されてもよい天然遺伝子またはタンパク質について測定することにより、応答が監視されてもよく、例えば、特定のインターロイキンの放出が測定されてもよく、代替的に、ルシフェラーゼまたはＧＦＰリポーターコンストラクトを介して、読出しが行われてもよい。細胞を用いた検定は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの存在に対する応答としての、細胞の形態変化の測定も含み得る。このような検定用の細胞型は、原核または真核であってもよく、当該分野において知られている種々の細胞株が採用されてもよい。代替的に、細胞を用いたスクリーニングは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸を形質転換またはそれを形質移入した細胞を使用して実施される。
【０１０４】
生体内実験
【０１０５】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生物学的特性は、細胞、組織、および全生物実験において特徴付けされてもよい。
【０１０６】
本明細書に示されるように、一般に、本発明の免疫アドヘシンの変異体ＣＴＬＡ４ドメインの結合および関連した親和性の試験は、実施例に概説した結合検定を使用して行われる。上述のように、親和性は、親ポリペプチドに比べて変異体ポリペプチドのＫＡが有意に高い場合、または変異体ポリペプチドのＫＤが親ポリペプチドに比べて有意に低い場合、増強されていると言うことができる。比に関して、例えばＫＡ（変異体ポリペプチド）／ＫＡ（親ポリペプチド）またはＫＤ（親ポリペプチド）／ＫＤ（変異体ポリペプチド）に関して表現される場合、親和性の有意な増加は、例えば、これらの比の１つおよび／または両方が約１．２、１．５、２．０、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２５０、５００、１０００またはそれ以上である場合に確認される。
【０１０７】
当該分野において知られているように、薬物は、多くの場合、疾病または疾病モデルに対する治療における薬物の効果を測定するために、または薬物の薬物動態、毒性、および他の特性を測定するために、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物において試験される。該動物は、疾病モデルと称される場合がある。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンに関して、候補ポリペプチドのヒトでの効果の可能性を評価するために動物モデルを使用する時、特別な課題が生じる。これは、少なくとも部分的に、ヒトＦｃ受容体に対する親和性に特定の作用を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのＦｃドメインが、オルソロガスな動物の受容体と同じ親和性作用を有さない可能性があるという事実による。これらの問題は、真のオルソロガスの正確な割り当てに関連する、回避不可能な不明確さ（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４：４６３−４６８、参照によりその全体が援用される）、およびいくつかのオルソロガスが、単純に動物に存在しないという事実により、さらに深刻化し得る。治療用物質は、多くの場合、これらに限定されないが、ヌードマウス、Ｒａｇ欠損マウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、および遺伝子導入マウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むマウスにおいて試験される。本明細書における治療ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、マウス株ＮＺＢ、ＮＯＤ、ＢＸＳＢ、ＭＲＬ／ｌｐｒ、Ｋ／ＢｘＮおよび遺伝子導入（ノックインおよびノックアウトを含む）において試験され得る。このようなマウスは、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）等の、ヒト臓器に特異的な、全身性自己免疫または炎症性疾患病変に似た、種々の自己免疫状態を発症させることができる。例えば、自己免疫疾患に対して意図される本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの疾患病変の発達を低減する、または阻害する能力を決定するようにマウスを処置することにより、このようなマウスモデルにおいて試験することができる。マウスとヒトＦｃγ受容体系との間の不和合性のため、代替的なアプローチとして、ヒトＰＢＬまたはＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ、ｈｕＰＢＭＣ−ＳＣＩＤ）を免疫欠損マウ
スに植え付けることにより、ヒトエフェクター細胞およびＦｃ受容体を伴う半機能的なヒト免疫系を提供する、マウスＳＣＩＤモデルを使用する。他の生物、例えば、哺乳類も、試験に使用されてもよい。例えば、サルは、ヒトに対するその遺伝子的類似性のため、治療モデルに適している場合があり、したがって、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの効果、毒性、薬物動態、または他の特性を試験するために使用することができる。ヒトにおける本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの試験が、最終的に、薬物としての承認のために必要となり、したがって、当然のことながら、これらの実験が意図される。したがって、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、その治療効果、毒性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定するように、ヒトにおいて試験され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、種々のヒト疾患の臨床的適切な動物モデルにおける効果について評価することができる。多くの場合、適切なモデルは、特定の抗原および受容体に対する種々の遺伝子導入動物を含む。
【０１０９】
一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの試験は、標的抗原を持つ特定の標的細胞の欠乏の評価を容易にするために、霊長類（例えば、カニクイザルモデル）における効果の試験を含んでもよい。さらなる霊長類のモデルは、限定されないが、自己免疫、移植、および癌の治療試験における、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを評価するための、アカゲザルの使用を含む。
【０１１０】
毒性試験は、標準的な薬理学的プロファイルで評価できない、または薬剤の反復投与後にのみに発生する、薬物に関連する効果を決定するために実施される。大半の毒性試験は、新規治療学的実体がヒトに導入される前に、任意の予測できない有害作用が見過ごされないことを確実にするために、ゲッ齒類およびゲッ齒類以外の２つの種属において実施される。一般的に、これらのモデルは、遺伝子毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖／発生毒性、および発癌を含む、種々の毒性を測定することができる。前述のパラメータには、食消費量、体重、抗体産生、臨床化学の標準的な測定、および標準的な臓器／組織の肉眼および顕微鏡検査（例えば、心毒性）を含む。測定のさらなるパラメータは、もしあれば、注入部位損傷および中和抗体の測定である。従来、裸または複合のモノクローナル抗体治療学は、放射標識種属の正常組織、免疫原性／抗体産生、複合体またはリンカー毒性、および「傍観者」毒性を用いた、交差反応について評価される。それにもかかわらず、このような試験は、特定の問題に対処するように個別化され、ＩＣＨ Ｓ６（上記される、生物工学製品についての安全性試験）で規定されるガイダンスに従わなければならない場合がある。したがって、原則として、製品は、十分に良く特徴付けされ、不純物／汚染物が除去され、試験材料が、開発全体を通して同等であり、ＧＬＰコンプライアンスが維持されることが、原則である。
【０１１１】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの薬物動態（ＰＫ）は、種々の動物系で試験され得、最も適切なのは、カニクイザルおよびアカゲザル等のヒト以外の霊長類である。血漿濃度およびクリアランスを使用して、６０００倍（０．０５〜３００ｍｇ／ｋｇ）の用量範囲にわたる単一または反復静脈内／皮下投与が、半減期（日〜週）について評価され得る。定常状態での分布量および全身吸収レベルも測定され得る。このような測定のパラメータの例としては、一般的に、最大観測血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘ到達時間（Ｔｍａｘ）、時間０〜無限大［ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）］ の血漿濃度時間曲線下面積、および見かけ消失半減期（Ｔ１／２）が挙げられる。さらなる測定パラメータは、静脈内投与および生体利用性の後に得た、濃度−時間データの区画解析を含み得る。
【０１１２】
薬力学試験は、限定されないが、特異的細胞の標的化、またはシグナル伝達機構の遮断、抗原特異的抗体の阻害の測定等を含み得る。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、特定のエフェクター細胞集団を標的とし、それによって、有効性を改善するか、または特定の好ましい生理的区画の中への貫通を増加するように、特定の活性を誘発するように薬物を誘導することができる。このような薬力学作用は、動物モデル、またはヒトにおいて実証され得る。
【０１１３】
臨床使用
【０１１４】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、広範な製品において用途を見出し得る。一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、治療、診断、または研究試薬である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、モノクローナルまたはポリクローナルである組成物において用途を見出し得る。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、治療目的に使用されてもよい。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、障害を治療するように患者に投与されてもよい。
【０１１５】
本明細書に開示される目的における「患者」とは、ヒトおよび他の動物、例えば、他の哺乳動物の両方を含む。したがって、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、ヒト治療および獣医学的用途の両方を有する。本明細書に開示される、「治療」または「治療する」とは、疾病または疾患に対する治療的処置、ならびに予防的もしくは抑制手段を含むことを意味する。したがって、例えば、疾病の発現前のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの良好な投与は、疾病の治療をもたらす。別の実施例として、疾病の症状と戦うための、疾病の臨床病態後の最適化されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの良好な投与は、疾病の治療に含まれる。「治療」および「治療する」とは、疾病を根絶するための、疾病出現後の、最適化されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの投与も包含する。予想される臨床症状の軽減、および疾病の回復の可能性を伴った、発現後、および臨床症状が発達した後の薬剤の良好な投与は、疾病の治療に含まれる。これらの「治療の必要な」とは、既に疾病または疾患を有する哺乳類、ならびに疾病または疾患が予防されるべきものを含む、疾病または疾患を有する傾向があるものを含む。
【０１１６】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、好ましくは、免疫関連状態または障害を治療するために使用される。免疫関連状態は、自己免疫疾患、炎症性障害、およびドナー組織の拒絶に関連した免疫応答の防止を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、自己免疫疾患を治療するために使用され得る。本明細書における「自己免疫疾患」は、同種異系間膵島移植拒絶反応、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアックスプルー−皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、第ＶＩＩＩ因子欠損、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、ＩｇＭ多発性神経障害、免疫性の血小板減少、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植拒絶反応、スティフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば疱疹状皮膚炎脈管炎、白斑、およびウェーグナー肉芽腫症を含む。
【０１１８】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、炎症性障害を治療するために使用され得る。本明細書における「炎症性障害」は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性敗血症性関節炎、アジュバント関節炎、若年性特発性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌性またはウイルス性感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、冠動脈疾患、脳炎、炎症性大腸炎、炎症性骨溶解、急性および遅延型過敏反応に関連する炎症、腫瘍、末梢神経損傷または脱髄疾患に関連する炎症、火傷および虚血等の組織損傷に関連する炎症、髄膜炎、多臓器損傷症候群、肺線維症、敗血症および敗血性ショックによる炎症、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化関節化膿症、ならびに未分化脊椎関節症を含む。
【０１１９】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、移植者によるドナー組織、細胞、移植片、または移植臓器の拒絶に関連する免疫応答を防止または抑制するために使用され得る。移植片関連疾患または障害は、例えば骨髄移植に関連する移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）、および、例えば皮膚、筋肉、ニューロン、膵島、臓器、肝臓の実質細胞等を含む、臓器、組織、または細胞移植片移植（例えば、組織または細胞同種移植片または異種移植片）の拒絶による、またはそれに関連する免疫障害を含む。移植者におけるドナー組織、細胞、移植片または固形移植臓器に関して、本明細書に開示される本発明のそのような分子（例えば、変異体ＣＴＬＡ−４ ＥＣＤポリペプチドまたは変異体ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質）は、移植者におけるそのような移植片の急性拒絶反応を防止する上で、および／または移植者におけるそのような移植片の拒絶反応を防止するための長期維持治療（例えば、糖尿病に罹患した対象移植者における、ドナーからのインスリン産生膵島細胞の拒絶反応の阻害）に有効となり得ると考えられる
【０１２０】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンにより治療され得る好ましい免疫関連障害は、クローン病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ループス腎炎、乾癬性関節炎、乾癬、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ならびに、腎臓移植、肝臓移植、および膵臓移植を含むがこれらに限定されない移植片拒絶反応を含む。
【０１２１】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、癌を治療するために使用され得る。本明細書における「癌」および「癌性」は、典型的に制御されない細胞成長により特徴付けられる、哺乳類における生理学的状態を指す、または説明している。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、および白血病またはリンパ性悪性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
本明細書におけるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、感染症を治療するために使用され得る。本明細書における「感染症」は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、および寄生動物等の病原体により引き起こされる疾患を含む。
【０１２３】
さらに、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋炎および心筋の他の状態等の心臓の状態、酒さ、座瘡、および湿疹等の皮膚の状態、骨量減少、骨粗しょう症、パジェット病、ランゲルハンス細胞組織球増加症、歯周病、廃用性骨減少、骨軟化症、単発性線維性形成異常、多骨性線維性骨異形成症、骨への転移、骨痛処理、液性悪性高カルシウム血症、歯周組織再建、脊髄損傷、および骨折等の骨および歯の状態、ゴーシェ病等の代謝の状態、クッシング症候群等の内分泌状態、ならびに、アルツハイマー病等の神経および神経変性状態を含むがこれらに限定されない追加的状態を予防または治療するために使用され得る。
【０１２４】
製剤
【０１２５】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンおよび１つ以上の治療的活性剤が製剤化される医薬組成物が企図される。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの製剤は、所望の程度の純度を有する該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０、参照によりその全体が援用される）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量および濃度において、受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルオルベンジル（ｏｒｂｅｎｚｙｌ）アルコール、メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の糖類、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類、甘味料および他の風味剤、微結晶セルロース、ラクトース、コーンスターチおよび他のスターチ類等の増量剤、結合剤、添加剤、着色剤、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含む薬学的組成物は、酸および塩基付加塩の両方を含むものとする、医薬的に許容される塩として存在する等の、水溶性形態であってもよい。「医薬的
に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的効果を維持し、生物学的に、または別の点で望ましくないことがなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸で形成される塩類を指す。「医薬的に許容される塩基付加塩類」とは、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩等に由来するものを含む。いくつかの実施形態は、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩の少なくとも１つを含む。医薬的に許容される有機非毒性塩基由来の塩類は、一級、二級、および三級アミン類、自然に生じる置換アミン類を含む置換アミン類、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、およびエタノールアミン等の環式アミンならびにイオン交換樹脂の塩類を含む。生体内投与に使用される製剤は、無菌であってもよい。これは、無菌濾過膜を通した濾過、または他の方法により容易に達成される。
【０１２６】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンはまた、免疫リポソームとして製剤化されてもよい。リポソームは、治療薬を哺乳類に送達するのに有用である、様々な種類の脂質、リン脂質、および／または界面活性物質を含む小胞である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含有するリポソームは、当該分野において知られている方法により調製される。リポソームの構成要素は、通常、生体膜の脂質配置に類似する、二分子層構造に配列される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む、脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成され得る。リポソームは、所定の孔径のフィルタを通して押出され、所望の径のリポソームが得られる。
【０１２７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンおよび他の治療活性剤は、限定されないが、コロイド脱混合現象技法、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微細球、微小乳濁液、ナノ粒子およびナノカプセル）、およびマクロエマルションを含む方法により調製される、マイクロカプセルに封入されてもよい。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，１９８０に開示されており、参照によりその全体が援用される。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例としては、マトリックスが、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である、固体疎水性重合体の、半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸との共重合体、非分解性エチレン−ビニル酢酸、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸リュープロリドから成る注射可能な微小球）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸、およびポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれる、所望の生理活性分子からなる微小球に基づく送達系である、ＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）（Ａｌｋｅｒｍｅｓから市販）が挙げられる。
【０１２８】
投与
【０１２９】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを含む、例えば、無菌水溶液の形態での医薬組成物の投与は、限定されないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内、経皮、局所（例えばゲル、塗剤、ローション、クリーム等）、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸、または眼内を含む、様々な方式で行われてもよい。いくつかの場合において、例えば、創傷、炎症等の治療において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが、溶液またはスプレーとして直接適用されてもよい。当該分野において知られているように、医薬組成物は、導入様式に応じて製剤化されてもよい。
【０１３０】
皮下投与は、患者が、医薬組成物を自分で投与し得る状況において使用されてもよい。多くのタンパク質治療は、皮下投与の最大許容量で、治療有効量の製剤を可能にするのに十分に強力ではない。この問題は、アルギニン−ＨＣｌ、ヒスチジン、およびポリソルベートを含む、タンパク質製剤の使用により、ある程度対処され得る。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、例えば、効力の増加、血清半減期の改善、または溶解性の増強により、皮下投与により適し得る。当該分野において知られているように、タンパク質治療物質は、多くの場合、静脈内注入、またはボーラスにより送達され得る。本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンはまた、このような方法を使用して送達されてもよい。例えば、注入ビヒクルとして０．９％の塩化ナトリウムを含む、静脈内注入による投与であってもよい。
【０１３１】
肺送達は、吸入器具または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む製剤を使用して達成されてもよい。例えば、Ａｒａｄｉｇｍから市販されるＡＥＲｘ（登録商標）吸入可能技術、またはＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されるＩｎｈａｎｃｅ（商標）肺送達システムが使用されてもよい。さらに、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、経口投与に適し得る。
【０１３２】
加えて、いくつかの送達系のいずれも、当該分野において知られており、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを投与するために使用されてもよい。例としては、これらに限定されないが、リポソーム、微小粒子、微小球（例えば、ＰＬＡ／ＰＧＡ 微小球）等への封入が挙げられる。代替的に、膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、ゼラチン様物質の移植が使用されてもよい。徐放系は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸（ｇｕｔａｍａｔｅ）との共重合体、エチレン−ビニル酢酸、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）等の乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸等の、重合物質またはマトリックスを含んでもよい。例えば、レトロウイルス感染、直接注射、または脂質、細胞表面受容体、または他の形質導入剤でのコーティングにより、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンをコードする核酸を投与することも可能である。全ての場合において、制御放出系が、所望の動作位置で、またはその近くで、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを放出するように使用されてもよい。
【０１３３】
用量
【０１３４】
投与の用量および頻度は、一実施形態において、治療的または予防的に有効であるように選択される。当該分野において知られているように、タンパク質分解、全身に対して局所的送達、および新しいプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、一般健康状態、性別、食生活、投与の時間、薬物相互作用、および症状の重篤度に対する調整、必要不である場合があり、当業者により、日常の実験で確認可能である。
【０１３５】
製剤における治療的に活性なＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの濃度は、約０．１〜１００重量％まで変動し得る。一実施形態において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲である。患者を治療するために、本明細書に開示される、治療有効量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが投与され得る。本明細書において、「治療有効量」とは、効果を生じる、投与される用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に依存し、既知の技法を使用して、当業者により確認可能である。投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲、もしくはそれ以上、例えば、０．１、１、１０、または５０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。一実施形態において、投与量は、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、単一用量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンのみが使用される。他の実施形態において、多用量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンが投与される。投与間の経過時間は、１時間未満、約１時間、約１〜２時間、約２〜３時間、約３〜４時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約２〜４日間、約４〜６日間、約１週間、約２週間、または２週間以上であり得る。
【０１３７】
他の実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、連続注入または長期休息期間なしの頻繁な投与のいずれかにより、メトロノミック投与計画で投与される。このようなメトロノミック投与は、休息期間なしの一定の間隔での投与を含み得る。典型的に、このような計画は、長期間、例えば、１〜２日間、１〜２週間、１〜２ヶ月間、または最大６ヶ月もしくはそれ以上の、慢性的な小用量、または連続注入を含む。小用量の使用は、副作用および休息期間の必要性を最小限にし得る。
【０１３８】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、および１つ以上の他の予防薬もしくは治療薬が、患者に周期的に投与される。周期治療は、一回目で第１の薬剤、２回目で第２の薬剤、任意に、追加回で追加の薬剤を投与し、任意の休息期間、そして１回またはそれ以上、この投与順序を繰り返すことを含む。反復の数は、典型的に２〜１０回である。治療の反復は、１つ以上の薬剤への耐性の発生を低減し得るか、副作用を最小限にし得るか、または治療効果を改善し得る。
【０１３９】
併用療法
【０１４０】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、１つ以上の他の治療計画または薬剤と同時に投与されてもよい。追加の治療計画または薬剤は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの効力または安全性を改善するために使用されてもよい。また、追加の治療計画または薬剤は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの作用を改変するのではなく、同じ疾患または共存症を治療するために使用されてもよい。例えば、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、化学療法、放射線療法、または化学療法および放射線療法の両方と併せて患者に投与されてもよい。
【０１４１】
「〜と組み合わせて」および「同時投与」という用語は、正確に同時である予防薬または治療薬の投与に限定されない。代わりに、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンおよび他の薬剤（複数を含む）が、順番に、および、一緒に作用して、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンまたは他の薬剤（複数を含む）のいずれかのみでの治療に対し増加した利益を提供し得るような時間間隔内で投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、および他の薬剤（複数を含む）は、追加的に、および時折相乗的に作用する。そのような分子は、好適には、意図される目的のために効果的である量で組み合わせて存在する。熟練した医療従事者は、実験的に、または薬物の薬物動態および作用機序を考慮することにより、各治療薬の適切な用量（複数を含む）、ならびに適切な投与のタイミングおよび方法を決定することができる。
【０１４２】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、細胞障害性薬剤、化学療法剤、抗体、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、反脈管形成物質、心臓保護薬、免疫刺激剤、血液細胞の増殖を促進する薬剤、血管形成阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、他の抗体、Ｆｃ融合体、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、または他の治療薬を含むがこれらに限定されない、１つ以上の他の予防薬または治療薬と組み合わせて投与されてもよい。本発明の療法は、他の免疫療法と組み合わされてもよい。本発明の療法はまた、抗体およびＦｃ融合体を含むがこれらに限定されないケモカインまたはサイトカインの拮抗薬と組み合わされてもよい。
【０１４３】
本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、他の治療計画と組み合わされてもよい。例えば、一実施形態において、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンで治療されるべき患者はまた、放射線療法を受けてもよい。放射線療法は、当該分野において一般的に採用され、当業者に知られているプロトコルに従い施すことができる。そのような療法は、セシウム、イリジウム、ヨウ素、またはコバルト放射線を含むが、これらに限定されない。放射線療法は、全身照射法であってもよく、または、肺、膀胱もしくは前立腺等の身体内もしくは身体上の特定の部位もしくは組織に対して、局所的に向けられてもよい。随意に、放射線療法は、単一線量として、または複数の順次的線量として施されてもよい。熟練した医療従事者は、実験的に、本明細書において有用な放射線療法の適切な線量（複数を含む）を決定することができる。別の実施形態によれば、生体外で癌細胞を処置するために、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンおよび１つ以上の他の抗癌療法が採用される。そのような生体外治療は、骨髄移植、特に自家骨髄移植において有用となり得ることが企図される。例えば、移植患者内への移植前に癌細胞を枯渇させる、または実質的に枯渇させるために、癌細胞を含有する細胞または組織（複数を含む）の、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン、および上述したような１つ以上の他の抗癌療法による処置を採用することができる当然ながら、本明細書に開示されるＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、手術等のさらに他の治療技術と組み合わせて採用されてもよい。
【０１４４】
本発明の特定の実施形態が、例示の目的のため、上で説明されたが、詳細の多くの変形が、添付の特許請求の範囲で記載される、本発明から逸脱することなく行われてもよいことを、当業者は理解するであろう。本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が援用される。
【実施例】
【０１４５】
本発明を例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、本発明をいかなる特定の用途または実施の理論にも制限することを意図しない。
【０１４６】
実施例１．Ｂ７−１およびＢ７−２の結合を増強する操作されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体
【０１４７】
全長ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸配列を図１に示す。Ｂ７−１およびＢ７−２との相互作用を担う細胞外ドメイン（ＥＣＤ）もまた図１に示す。
【０１４８】
ＣＴＬＡ４の免疫アドヘシン（Ｆｃ融合体）は、ＥＣＤ（またはＥＣＤのいくつかの変異体）をＩｇＧのＦｃ領域に結合させることにより構築することができる。天然ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）のＦｃ領域を図２に示す。図２に示されるＩｇＧ１ Ｆｃは、３５６Ｄ／３５８Ｌハプロタイプを含有するが、他のハロタイプまたはアロタイプ形態が使用されてもよい（例えば、３５６Ｅ／３５８Ｍ）。本明細書におけるＦｃ領域は、ＥＵ付番規定に基づき、位置２３０からＣ末端として定義される。アバタセプトは、Ｐ２３８Ｓ置換を含有する修飾ＩｇＧ１に結合したＣＴＬＡ４の免疫アドヘシンである（図２中Ｆｃ（ＩｇＧ１−２３８Ｓ）と呼ばれる）。本発明のＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、位置２３８にセリンまたはプロリンを含んでもよい（すなわち、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンは、２３８Ｓまたは２３８Ｐを含んでもよい）。下方ヒンジ領域に４つのＩｇＧ１修飾を有するＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む、ＩｇＧ Ｆｃ領域の他の変異体型も図２に示す（Ｆｃ（ＩｇＧ２−２３３Ｅ／２３４Ｌ／２３５Ｌ／２３６Ｇ）と呼ばれる）。
【０１４９】
ＣＴＬＡ４ ＥＣＤは、種々のリンカーを介してＦｃ領域に結合され得る。本発明において使用されるリンカーは、ＣＨ１ドメインのＣ末端および上方ヒンジを含む、ヒトＩｇＧ定常鎖からの配列を含む。天然ＩｇＧイソタイプに基づく例示的リンカー配列を、図３に示す。修飾されたリンカーが使用されてもよい。本研究において使用される例示的リンカーは、修飾されたＩｇＧリンカー（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ベースリンカー）であり、システインがセリンと置き換えられている。アバタセプトは、Ｎ末端グルタミンの挿入に加え、修飾されたＩｇＧ１リンカーのシステインからセリンへの置換を使用する。そのようなリンカーの例もまた図３に示す。
【０１５０】
本研究において使用されるリンカーおよびＦｃ領域の例示的組み合わせの例を、図４に示す。これらは、Ｉｇ（ａｂ）と呼ばれるアバタセプトのＦｃ領域、ならびに、Ｉｇ（Ｇ２）およびＩｇ（Ｇ２−ＥＬＬＧ）と呼ばれるＩｇＧ２ Ｆｃ領域に基づく２つの融合体を含み、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域内に組み込まれた下方ヒンジ（２３３Ｅ／２３４Ｌ／２３５Ｌ／２３６Ｇ）において４つのＩｇＧ１修飾を含有する。例示的なＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンを、図５に示す。これらは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ）とも呼ばれるアバタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｇ２）と呼ばれるアバタセプトのＩｇＧ２ Ｆｃベースの型、ならびに、Ｂ７−１およびＢ７−２に対する親和性を増強するＣＴＬＡ４位置における２つの置換Ａ２９ＹおよびＬ１０４Ｅを有するアバタセプトの変異体型である、ベラタセプトを含む。
【０１５１】
ヒトＣＴＬＡ４のヒトＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）に対する親和性を増強するために、理論的構造に基づく手法を使用して、ＣＴＬＡ４変異体を設計した。ヒトＣＴＬＡ４とヒトＢ７−１（Ｓｔａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：６０８−６１１）およびＢ７−２（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：６０４−６０８）との間の複合体の高分解能構造が利用可能である。設計された変異体のライブラリを以下に示す：Ａ２９Ｋ、Ａ２９Ｎ、Ａ２９Ｅ、Ａ２９Ｗ、Ａ２９Ｆ、Ａ２９Ｙ、Ａ２９Ｈ、Ａ２９Ｑ、Ａ２９Ｒ、Ｔ３０Ｄ、Ｔ３０Ｖ、Ｔ３０Ａ、Ｔ３０Ｎ、Ｔ３０Ｅ、Ｔ３０Ｈ、Ｔ３０Ｒ、Ｅ３１Ｉ、Ｅ３１Ｍ、Ｅ３１Ｔ、Ｅ３１Ｖ、Ｅ３１Ｄ、Ｒ３３Ｆ、Ｒ３３Ｔ、Ｒ３３Ｍ、Ｒ３３Ｗ、Ｒ３３Ｉ、Ｒ３３Ｙ、Ｒ３３Ｌ、Ｒ３３Ｅ、Ｒ３３Ｑ、Ｔ３５Ｅ、Ｔ３５Ｖ、Ｔ３５Ｍ、Ｔ３５Ｄ、Ｔ３５Ｆ、Ｔ３５Ｙ、Ａ４９Ｔ、Ａ４９Ｆ、Ａ４９Ｙ、Ａ４９Ｗ、Ａ４９Ｄ、Ａ４９Ｅ、Ｔ５１Ｖ、Ｔ５１Ｌ、Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｈ、Ｔ５１Ｑ、Ｔ５１Ｅ、Ｔ５１Ｓ、Ｔ５１Ｒ、Ｔ５１Ｄ、Ｍ５３Ｅ、Ｍ５３Ｑ、Ｍ５３Ｙ、Ｍ５３Ｗ、Ｍ５３Ｆ、Ｍ５３Ｈ、Ｔ５９Ｖ、Ｔ５９Ｌ、Ｔ５９Ｎ、Ｔ５９Ｙ、Ｔ５９Ｈ、Ｔ５９Ｑ、Ｔ５９Ｉ、Ｌ６１Ｄ、Ｌ６１Ｅ、Ｌ６１Ｉ、Ｌ６１Ａ、Ｌ６１Ｆ、Ｌ６１Ｇ、Ｌ６１Ｈ、Ｌ６１Ｋ、Ｌ６１Ｍ、Ｌ６１Ｎ、Ｌ６１Ｐ、Ｌ６１Ｑ、Ｌ６１Ｒ、Ｌ６１Ｓ、Ｌ６１Ｔ、Ｌ６１Ｖ、Ｌ６１Ｗ、Ｌ６１Ｙ、Ｄ６３Ｅ、Ｓ６４Ｋ、Ｓ６４Ｒ、Ｓ６４Ｙ、Ｋ９３Ｄ、Ｋ９３Ｅ、Ｋ９３Ｆ、Ｋ９３Ｈ、Ｋ９３Ｑ、Ｋ９３Ｒ、Ｋ９３Ｔ、Ｋ９３Ｖ、Ｋ９３Ｗ、Ｋ９３Ｙ、Ｋ９３Ｎ、Ｋ９３Ｓ、Ｅ９５Ｄ、Ｅ９５Ｑ、Ｅ９５Ｙ、Ｅ９５Ｈ、Ｅ９５Ｌ、Ｍ９７Ｆ、Ｍ９７Ｄ、Ｍ９７Ｎ、Ｍ９７Ｉ、Ｍ９７Ｖ、Ｙ９８Ｆ、Ｙ９８Ｗ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ｗ、Ｙ１０３Ｆ、Ｙ１０３Ｗ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｄ、Ｙ１０３Ｅ、Ｙ１０３Ｎ、Ｙ１０３Ｑ、Ｌ１０４Ｄ、Ｌ１０４Ｅ、Ｌ１０４Ｖ、Ｌ１０４Ｍ、Ｌ１０４Ｙ、Ｌ１０４Ｗ、Ｌ１０４Ｆ、Ｌ１０４Ｈ、Ｇ１０５Ｄ、Ｇ１０５Ｅ、Ｉ１０６Ｅ、およびＩ１０６Ｙ。
【０１５２】
ＣＴＬＡ４タンパク質をコードする遺伝子は、商業的に合成され（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）、ヒトＩｇＧ定常領域を含有する哺乳類発現ベクターｐＴＴ５にサブクローン化された（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０［２］：Ｅ９）。アミノ酸修飾は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を使用した部位特異的突然変異誘発法を用い、アバタセプトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ）コンストラクト上に構築した。また、ベラタセプトＣＴＬＡ４（Ａ２９Ｙ／Ｌ１０４Ｅ）−Ｉｇ（ａｂ）を対照として構築した。全てのＤＮＡは、配列の忠実度を確認するために配列決定された。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を６ウェルプレート形式で小規模（３ｍｌ）で使用して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含有するプラスミドを２９３Ｅ細胞に形質移入し（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０［２］：Ｅ９；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）中で成長させた。成長５日後、直接上澄みからの変異体タンパク質を、標的結合についてスクリーニングした。成長５日後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡ親和性により、このタンパク質を培養上澄みから精製した。
【０１５３】
表面プラズモン共鳴を使用して、Ｂ７−１およびＢ７−２への結合について変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ Ｆｃ融合体タンパク質をスクリーニングした。結合測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して行った。センサチップは、抗ＨｉｓタグｍＡｂで誘導体化し、続いてＢ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇ（ともにＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）をそれぞれ１００ｎＭおよび２００ｎＭで１．５分間捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ）中の変異体および対照ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を、１分間注入し、続いて２分間解離させた。データは、適切な非特異的信号（流動緩衝液の対照チャネルおよび注入の応答）を減算することにより、受容体の注入前の時間および応答をゼロにすることにより処理された。 ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて解離センサグラムをフィッティングし、解離速度定数（オフ速度またはｋ_ｄまたはｋ_ｏｆｆ）を得た。３回の別個の結合実験からの結果を、両方の抗原への結合のオフ速度の改善または低減の倍数とともに表１に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【０１５４】
アバタセプトに対する倍数（ｋ_ｏｆｆ）のプロットを図６に示す。表１および図６から見ることができるように、複数の置換が、アバタセプト親タンパク質よりも遅い解離（高い結合）を示した。
【０１５５】
アバタセプトよりも遅いＢ７−１および／またはＢ７−２に対する解離速度を有する変異体を、より大規模で再び発現させ、上述のように精製した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度により測定した。Ｂ７−１およびＢ７−２に対する結合親和性は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の一連の濃度を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）で測定した。全ての変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質は、１ｕＭに正規化し、次いでプロテインＡ結合によりＱＣした。抗Ｈｉｓチップを上述のように生成し、Ｂ７−１およびＢ７−２を、それぞれ５０ｎＭで１分間および１００ｎＭで２分間固定した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を、５０、２５、１２．５および６．２５ｎＭで始まる一連の２倍濃度で希釈し、１分間注入し、続いて２分間解離させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して動力学的データを１：１結合モデル（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）にフィッティングし、解離速度定数（ｋ_ｄまたはｋ_ｏｆｆ）、会合速度定数（ｋ_ａまたはｋ_ｏｎ）、および平衡解離定数（ＫＤまたはＫ_Ｄ）を得た。結合親和性を表２（Ｂ７−１）および表３（Ｂ７−２）に示す。
【表４】

【表５】

【０１５６】
単一置換スクリーニングの結果に基づき、組み合わせの変異体および追加的な単一置換変異体のライブラリを設計した。新たな変異体を表４および５に列挙する。変異体は、上述のように構築、発現、および精製した。Ｂ７標的への結合は、上述のように測定し、フィッティングした動力学的速度定数および親和性を表４（Ｂ７−１）および表５（Ｂ７−２）に示す。
【表６】



【表７】

【０１５７】
アバタセプトおよびベラタセプトと比較した、変異体の全てに対するＣＤ８０およびＣＤ８６ ＫＤのプロットを、図７に示す。組み合わせの変異体のいくつかが、アバタセプト親ＣＴＬＡ４−Ｉｇに比べてＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）の両方により強固に結合し、Ｂ７−１に対する最大３．６倍の結合の改善、およびＢ７−２に対する最大１９．２倍の結合の改善を示した。Ｂ７−２結合において最良の三重置換変異体は、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ（ＮＥＱと呼ばれる）であり、Ｂ７−２親和性を４３７ｐＭから４０ｐＭに改善し、Ｂ７−１親和性を５９ｐＭから３６ｐＭに改善した。Ｂ７−２結合において最良の四重置換変異体は、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ（ＨＮＥＱと呼ばれる）であり、Ｂ７−２親和性を４３７ｐＭから２３ｐＭに改善し、Ｂ７−１親和性を５９ｐＭから１６ｐＭに改善した。アバタセプトおよびベラタセプトと比較したＨＮＥＱ変異体の最高ＣＴＬＡ４−Ｉｇ濃度からのセンサグラムのプロットを、図８に示す。これらのＣＴＬＡ４変異体およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体タンパク質のアミノ酸配列を、図９に示す。
【０１５８】
実施例２．操作されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体は、より大きな生体内でのＴ細胞阻害活性を有する。
【０１５９】
ＮＥＱおよびＨＮＥＱ変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を、Ｔ細胞増殖を阻害する能力について、細胞を用いた検定法において試験した。アバタセプト、ベラタセプト、およびＢ７−１またはＢ７−２に対する親和性を有さない抗ＲＳＶ ＩｇＧ１抗体（陰性対照）を、対照として試験した。この検定法において、Ｔ細胞活性化および増殖を、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３および組み換えＢ７−２ Ｆｃ融合体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して刺激した。Ｕ字型組織培養プレートを、ＰＢＳ中、４℃で一晩２ｕｇ／ｍｌのＣＤ８６−Ｆｃおよび０．５ｕｇ／ｍｌの抗ＯＫＴ３で被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ密度勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）を使用して、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を匿名の健常志願者の白血球分離により精製した（ＨｅｍａＣａｒｅ、ＶａｎＮｕｙｓ、ＣＡ）。ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴ細胞をＰＢＭＣから単離し、Ｔ細胞をＣＳＦＥ（１０ｕＭ）で標識化した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質変異体および対照を、最高濃度を５０ ｕｇ／ｍｌとして、８つの濃度にわたる４倍希釈で添加した。試料を繰り返し試験した。約５００，０００個のＴ細胞を被覆されたプレートに加え、３７℃で４日間インキュベートした。ＣＤ８６−Ｆｃ／ＯＫＴ３被覆ウェル上の細胞および細胞のみ（被覆無し）について対照条件を行った。４日間の培養後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）を使用してＦＩＴＣ染色（ＣＳＦＥ）について試料を分析した。図１０中のデータは、試験したＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３ＱおよびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑが、その改善されたＢ７−１およびＢ７−２親和性に一致して、親ＣＴＬＡ４−Ｉｇアバタセプトよりも優れていることを示している。さらに、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３ＱおよびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ変異体の両方が、そのより大きなＢ７−２親和性に一致して、ベラタセプトに比べてより大きい阻害活性を示した。
【０１６０】
実施例３．延長された生体内半減期のための、増強されたＦｃＲｎへの結合を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン
【０１６１】
生体内血清半減期を改善することを目的として、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質のＦｃ領域を、新生児型Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対する親和性を増強するように操作した。ＦｃＲｎ結合を改善し、増強された薬物動態特性を提供し得るＦｃ変異体は、例えば、２５９Ｉ、３０７Ｑ、３０８Ｆ、３１１Ｉ、３１１Ｖ、３７８Ｖ、３７８Ｔ、４２６Ｖ、４２８Ｌ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、４３４Ｍ、４３６Ｉ、および４３６Ｖ（参照により本明細書に明示的に援用される、１２／２２／２００８出願のＵＳＳＮ第１２／３４１，７６９）を含むがこれらに限定されない、位置２５９、３０７、３０８、３１１、３７８、４２６、４２８、４３４、および４３６における置換を含むがこれらに限定されない。ＦｃＲｎに結合するＦｃを増加させる他の変異体は、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４、参照によりその全体が援用される）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、および３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１６９：５１７１−５１８０、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８１：２３５１４−２３５２４、参照によりその全体が援用される）を含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
増強されたＦｃＲｎ親和性および延長された半減期を提供する置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを、アバタセプトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｇ２）、ベラタセプト、ならびにＣＴＬＡ４（ＨＮＥＱ）およびＣＴＬＡ４（ＮＥＱ）変異体のＩｇ（Ｇ２−ＥＬＬＧ）型のＦｃ領域内に導入した。これらのＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体タンパク質のアミノ酸配列を、図１１に示す。
【０１６３】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体タンパク質は、上述のように構築、発現、および精製した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））を使用した抗原媒介免疫アドヘシン捕捉／ヒトＦｃＲｎ検体形式で、ｐＨ６．０でのこれらの変異体のＦｃＲｎへの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（商標）を用いて測定した。Ｂ７−１およびＢ７−２は、標準アミンカップリング法を用いて、それぞれ６５００および８４００ＲＵの密度までＣＭ５チップ上に固定した。リガンドをｐＨ４．０のアセテート緩衝液中にそれぞれ２００ｎＭまで希釈した。表面を全長１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）＋Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）で４分間活性化し、続いてＢ７−１またはＢ７−２ Ｆｃ融合リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の注入を２ｕｌ／分で１５分間行った。最後に、表面をエタノールアミンでブロックした。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の捕捉は、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液中で、２０ｎＭ（ＷＴ ＩｇＧ１ Ｆｃ）または１０ｎＭ（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体Ｆｃ）で２分間行い、それぞれ１５００または７００のＲＵを達成した。次いで、５００、２５０、および１２５ｎＭの濃度のヒトＦｃＲｎ検体溶液を、示された濃度で注入し、続いて、次のサイクルの前に、Ｂ７表面をｐＨ４．０のアセテート＋５００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で再生した。Ｂ７上に存在するＦｃ融合体に起因して、表面に直接結合するhＦｃＲｎの高いバックグラウンドがあり、したがって、一連の濃度のｈＦｃＲｎを非固定（空の）表面上に注ぎ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析中に手動でこのバックグラウンドを差し引いた。バックグラウンド／ドリフトを差し引き、軸のゼロ補正を行った後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））を使用して、センサグラムを全体的に１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。
【０１６４】
アバタセプトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ）およびＦｃ操作型ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ−ＬＳ）（ＬＳ＝４２８Ｌ／４３４Ｓ）の代表的センサグラムを、図１２に示す。アバタセプトＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ）およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｇ２）、ならびにＦｃ操作型ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ａｂ−ＬＳ）およびＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｇ２−ＬＳ）によるＦｃＲｎへの結合のフィッティングされた親和性を、表６に示し、図１３にプロットする。結果は、Ｆｃ操作型のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質のＦｃＲｎに対する増強された親和性、ひいてはＦｃ変異体型の生体内でのより長い半減期の可能性を実証している。
【表８】

【０１６５】
実施例４．混合リンパ球反応における増強されたＴ細胞阻害活性を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシン
【０１６６】
ＦｃＲｎへの増強された結合を有する選択されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体を、そのＴ細胞阻害活性について試験した。Ｔ細胞増殖を、抗ＣＤ３抗体およびＢ７−２Ｆｃ融合体を使用して刺激する上述の細胞を用いた検定法において、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を試験した。図１４におけるデータは、ＦｃＲｎ親和性を増強するＦｃ変異体（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）とともに、Ｂ７親和性が増強されたＣＴＬＡ４変異体（Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３ＱおよびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ）の強力で優れた阻害活性を示している。
【０１６７】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体を混合リンパ球反応（混合白血球反応またはＭＬＲとしても知られる）において試験することにより、それらののＴ細胞阻害活性をさらに測定した。ＭＬＲは、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞増殖の分析および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の集団の生成のための生体外法である。同種異系（異なるＭＨＣハロタイプ）リンパ球が一緒に培養されると、ＴＨ細胞集団が増殖し、続いてＣＴＬ集団が増殖する。ＭＨＣ／ＴＣＲおよびＢ７／ＣＤ２８共刺激経路は、同種異系反応に重要である。Ｔ細胞活性化を監視するために、インターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を使用した。２つの別個の実験において、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ密度勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）を使用して、ヒトＰＢＭＣの２つの異なる組を２名の異なる匿名の健常志願者の白血球分離により精製した（ＨｅｍａＣａｒｅ、ＶａｎＮｕｙｓ、ＣＡ）。ＰＢＭＣを、ウェル当たり約１．２×１０Ｅ６で、それぞれ３００ｕｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳと混合した。２つの実験のうちの一方では、ドナー２３３６および３０７０からのＰＢＭＣを混合し、他方の実験では、ドナー３０７０および３９９５からのＰＢＭＣを混合した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質および抗ＲＳＶ ＩｇＧ１陰性対照を、１０点の一連の４倍希釈で調製し、示された最終濃度で混合ＰＢＭＣに添加した。ＰＢＭＣ単独（別個に）もまた、対照として試験した。プレートを６日間インキュベートした。上澄みを回収し、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ ＬｅｇｅｎｄＭａｘ（商標）Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＩＬ−２の濃度を測定した。分析結果を図１５に示す。
【０１６８】
図１５におけるデータは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体の強力な阻害活性、およびそのＯｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト）に勝る優位性を裏付けている。驚くべきことに、ＨＮＥＱ変異体はＢ７−１およびＢ７−２に対する親和性がより大きい（表４および５）にもかかわらず、ＮＥＱ変異体がＨＮＥＱ変異体よりも優れていた。ＨＮＥＱ変異体はアバタセプトに比べてＢ７−１親和性を３．６倍、およびＢ７−２親和性を１９．２倍改善し、一方ＮＥＱ変異体はアバタセプトに比べてＢ７−１親和性を１．６倍、およびＢ７−２親和性を１０．８倍改善する。ＮＥＱ変異体のより大きいＴ細胞阻害活性は、免疫応答におけるＢ７−１およびＢ７−２の異なる生物学的役割を反映している可能性がある。最近の研究では、Ｂ７−２はＣＤ２８の支配的なリガンドであり、一方Ｂ７−１はＣＴＬＡ４の支配的なリガンドであること、さらに、Ｂ７−２はＣＴＬＡ−４を免疫シナプスに動員することができないことが実証されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：２０１−２１０、Ｊａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：１５７５−１５８５）。Ｔ細胞の下方制御における内因性ＣＴＬＡ４の役割（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １：２２０−８）、および免疫応答の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介抑制におけるその役割（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２１［１０］：１１０５−１１１１）のために、内因性ＣＴＬＡ４を優先的に結合するＢ７−１に対する増加した親和性は、天然阻害剤を阻害し、ひいてはＴ細胞活性化を促進し得る。この点において、治療目的のために、Ｂ７−２は、阻害により重要なリガンドとなり得、したがって、ＣＴＬＡ４最適化のための最適な変異体は、Ｂ７−１と比べたＢ７−２への親和性における選択的増強となり得る。Ｂ７−１と比べてＢ７−２への親和性を選択的に改善する置換は、例えば、Ａ２９Ｈ、Ａ２９Ｋ、Ｔ５１Ｎ、Ｌ６１Ｅ、およびＹ１０３Ｑを含む。実験目的で、この選択性の仮説の試験は、例えばＫ９３Ｖ、Ｌ６１Ｑ、およびＬ１０４Ｈを含む、反対の選択性、すなわちＢ７−２と比べたＢ７−１への改善された結合を提供する変異体から恩恵が得られる可能性があ
る。全体的に、結果は、ＮＥＱ組み合わせ変異体Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑが選択的に関して最適な変異体であり、Ｂ７−２に対しては１０．８倍の親和性を提供するが、Ｂ７−１に対してはわずかに大きい（１．６倍）結合しか提供しないことを示している。この親和性および選択性のプロファイルは、Ｂ７−２に対しては６．５〜７倍、Ｂ７−１に対しては２．３倍の親和性しか提供しない（表２〜５）ベラタセプトよりも優れている。
【０１６９】
実施例５．新規ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの生体内活性
【０１７０】
操作したＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体の活性を試験するために、マウスにおける生体内実験を行った。破傷風に対するヒト免疫応答を阻害するＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質の能力を、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）を移植した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて検討した。ＳＣＩＤマウスは免疫障害を有し、ヒトＰＢＭＣｎｏ移植を受け付けるため、この試験の動物モデルとしてこれらのマウスを選択した。生体内試験用のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質は、ＣＨＯ細胞（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）において発現させ、上述のように精製した。
【０１７１】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、無作為ドナーから収集したロイコパックから得られた（Ｈｅｍａｃａｒｅ、Ｖａｎ Ｎｕｙｓ、ＣＡ）。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＰＢＭＣを精製し、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中に再懸濁させ、３×１０^７細胞の用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入した。ＰＢＭＣ注入の１日前、マウスに１００ｕｌの抗シアロＧＭ（Ｗａｋｏ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を腹腔内に注入し、マウスＮＫ細胞を枯渇した。翌日、マウスに、０．５ｍＬ量の３ｘ１０^７ ＰＢＭＣを腹腔内に注入した。全体で約７０匹のマウスに注入した。細胞注入の日を試験０日目と定義した。全ての動物に同じ日にＰＢＭＣを注入した。
【０１７２】
ＰＢＭＣ注入後、マウスを無作為に群に割り当て、体重を測定した。ＰＢＭＣ注入後７日目に、ヒトＩｇＧレベルを決定するために（ｈＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）、後眼窩洞／神経叢（ＯＳＰ）穿刺を介して血液を全てのマウスから採取した。血液採取後の同じ日に（７日目）、マウスに１ｍｇ／ｋｇの被験物質または陰性対照としてのＰＢＳを腹腔内に注入した。引き続き、試験を通して３日または４日毎にマウスに注入した。被験物質は、最も最近の体重測定値を使用して、ｍｇ／ｋｇベースで注入した。９日目に、マウスに１５μｇの破傷風トキソイド（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ、カタログ番号１９１Ｂ）またはＰＢＳを腹腔内に注入した。２１日目（抗原ワクチン接種後１２日目）、ヒトＩｇＧおよび抗破傷風ＩｇＧを決定するために、血液を全てのマウスから採取した。
【０１７３】
ＰＢＭＣ移植後７日目および２１日目に、後眼窩洞／神経叢（ＯＳＰ）を用いて（局所的プロパラカイン麻酔薬および吸入イソフルランを使用して）血液試料（２５〜５０ｕｌ）を採取した。血液試料を血清分離管に移し、３０分〜１時間静置して血液を凝固させ、次いで遠心分離機で遠心分離した（３５００ｒｐｍで３０分）。得られた血清を、試験番号、動物番号、日付、採取時点をラベルしたポリプロピレン管に移した。血清試料を約２０℃で保存した。抗破傷風抗体（抗ＴＴ ＩｇＧ）の血清濃度を、標準的抗破傷風ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ−Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して測定した。
【０１７４】
図１６の結果は、ＰＢＳ＋破傷風のみに対する親和性が増強されたＮＥＱ変異体ＣＴＬＡ４−Ｉｇ免疫アドヘシンの活性を実証している。さらに、データは、ＮＥＱ変異体が、親ＣＴＬＡ４−Ｉｇアバタセプトよりも強力な阻害活性を有していたことを示している。これらのデータは、免疫関連障害の治療のための本明細書に記載のＣＴＬＡ４−Ｉｇ変異体の使用を裏付けている。
【０１７５】
引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に援用される。本発明の特定の実施形態が、例示の目的のため、上で説明されたが、詳細の多くの変形が、特許請求の範囲で記載される、本発明から逸脱することなく行われてもよいことを、当業者は理解するであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２と比較して変異体ＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンであって、前記ＣＴＬＡ４変異体は、Ｔ５１Ｎ、Ａ２９Ｈ、Ｍ５３Ｙ、Ｌ６１Ｅ、およびＫ９３Ｑからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含み、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増強された結合を提供する、免疫アドヘシン。
【請求項２】
前記変異体は、Ａ２９Ｈ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｎ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ、Ａ２９Ｈ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ、Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ａ２９Ｈ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、およびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑからなる群から選択される置換の組み合わせを含む、請求項１に記載の免疫アドヘシン。
【請求項３】
前記変異体は、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３ＱおよびＡ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑからなる群から選択される置換の組み合わせを含む、請求項２に記載の免疫アドヘシン。
【請求項４】
前記変異体は、Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ／Ｌ６１Ｅ／Ｋ９３Ｑ、Ａ２９Ｈ／Ｔ５１Ｎ、Ｔ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ、およびＴ５１Ｎ／Ｍ５３Ｙ／Ｌ６１Ｅからなる群から選択される置換の組み合わせを含む、請求項２に記載の免疫アドヘシン。
【請求項５】
前記変異体ＣＴＬＡ４タンパク質は、配列番号２６または配列番号２７に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫アドヘシン。
【請求項６】
前記免疫アドヘシンは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、または配列番号３３に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫アドヘシン。
【請求項７】
免疫関連障害に罹患した患者を治療する方法であって、前記治療は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３に対応するアミノ酸配列を含む免疫アドヘシンを前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
前記免疫関連障害は、クローン病、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ループス腎炎、乾癬性関節炎、乾癬、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、および移植片拒絶反応からなる群から選択される、請求項７に記載の治療の方法。
【請求項９】
配列番号２と比較して変異体ＣＴＬＡ４を含む第１のドメインと、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む第２のドメインとを含む免疫アドヘシンであって、前記変異体は、天然ＣＴＬＡ４において少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記修飾は、５１および６１からなる群から選択されるＣＴＬＡ４位置における置換であり、前記変異体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−１およびＢ７−２の両方に対する増強された結合を提供する、免疫アドヘシン。
【請求項１０】
請求項１に記載の免疫アドヘシンをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１２】
免疫アドヘシンを調製する方法であって、前記免疫アドヘシンが産生される条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【公表番号】特表２０１３−５２０１７６（Ｐ２０１３−５２０１７６Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４０９６（Ｐ２０１２−５５４０９６）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５７４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３５８４
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５１００８９１００）ゼンコア　インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】