新規ＧＰＲ１０１トランスジェニックマウスおよびそれを使用する方法
ゲノムがＧＰＲ１０１遺伝子ノックアウトを含むトランスジェニック非ヒト動物またはそれから単離される細胞と、ゲノムが構成的に活性があるＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物またはそれから単離される細胞、ならびに、肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、２型糖尿病、拒食症および悪液質を含むエネルギー代謝に関連する疾患の処置、予防または診断を改善するためのモデルとして、トランスジェニック非ヒト動物を使用する方法が記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２８，１１０号明細書の便益性を主張する。上記出願の教示全体は、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質受容体１０１（ＧＰＲ１０１）は、公知のリガンドを全く有しないオーファンＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲ１０１は、特に中枢神経系内に存在し、視床下部および扁桃体、具体的には、前脳領域の弓状核（ＡＲＣ）、視床下部腹内側部（ＶＭＨ）、視床下部背内側部（ＤＭＨ）、視床下部後部（ＰＨ）、視床下部傍室核（ＰＶＮ）、内側視索前野（ＭＰＯＡ）、視交叉上核（ＳＣＮ）および視床下部前野（ＡＨＡ）、ならびに、代謝恒常性機能に関与すると考えられる領域である後脳領域内の孤束核（ＮＴＳ）および外側結合腕傍核（ＬＰＢ）において豊富に発現される（Ｎｉｌａｗｅｅｒａ Ｋ．Ｎ．ら、「Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １０１ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ：Ａｌｔｅｒｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ａｎｄ Ａｍｙｇｄａｌａ Ｂｙ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９：３４−４５頁（２００６年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。ＧＰＲ１０１はまた、前脳における側坐核および中脳におけるセロトニン作動性の核などの動機付けられた挙動の調節に関与する脳の領域内で発現される（Ｂａｔｅｓら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＰＲ１０１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０８７：１−１４頁（２００６年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。視床下部、扁桃体、ＬＰＢおよびＮＴＳがエネルギーバランス調節において重要な役割を発揮することから、これらの領域内でのＧＰＲ１０１ ｍＲＮＡの高度の発現は、代謝恒常性におけるＧＰＲ１０１の重要な役割を示唆しうる。したがって、ＧＰＲ１０１が代謝恒常性における重要な役割を有しうることから、それは代謝性疾患および障害の処置および予防において重要な役割を有しうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の観点から、受容体調節の考えられる生理的結果を同定し、かつ代謝性疾患の処置または予防における使用にとって潜在的な作用剤または組成物を同定するための信頼性の高いツールが大いに必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＧＰＲ１０１受容体を調節する作用剤をスクリーニングすることを目的とした、新規トランスジェニックマウスモデルまたはそれから単離される細胞を特徴とする。かかるモデルを使用し、エネルギー代謝に関連する疾患の診断を改善するとともに、エネルギー代謝に関連する疾患のより優れた処置および予防用の薬学的組成物を同定し、試験することが可能である。
【０００５】
一実施形態では、本発明は、ＧＰＲ１０１ノックアウトトランスジェニック非ヒト動物、またはそれから単離される細胞、ならびに肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、２型糖尿病、拒食症および悪液質などのエネルギー代謝に関連する疾患におけるモデルとしてのその使用を提供する。
【０００６】
別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、またはそれから単離される細胞、ならびに肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質などのエネルギー代謝に関連する疾患におけるモデルとしてのその使用を提供し、ここでＧＰＲ１０１遺伝子は構成的に活性がある。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に関する。
【０００８】
別の実施形態では、前記破壊は、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによってゲノムに導入されている。
【０００９】
一実施形態では、ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない。
【００１０】
別の実施形態では、哺乳動物はマウスである。
【００１１】
さらに、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記ノックアウト非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物の体重および食物摂取を、野生型対照の体重および食物摂取と比較するステップと、ここで効果における差異は、ＧＰＲ１０１の活性の改変によって体重および食物摂取を調節する作用剤を示唆する、
を含む、方法に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法に関する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００１６】
一実施形態では、構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によってゲノムに導入されている。
【００１７】
別の実施形態では、アミノ酸置換は、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによってゲノムに導入されている。
【００１８】
さらなる実施形態では、哺乳動物はマウスである。
【００１９】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞に関する。
【００２０】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】遺伝子型マウスに対する３つのプライマーによる多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を示す。
【図２】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図３Ａ】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における、２４時間の期間中のグラム（ｇ）での食物摂取の棒グラフである。
【図３Ｂ】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における累積食物摂取を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図４】野生型対照（ＷＴ）における食物消費の変化を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図５】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）における食物消費の変化を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図６】食餌（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）に対するＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）の体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図７】高脂肪食に対するＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）の体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図８】食餌に対するマウス（野生型（ＷＴ）およびＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ））における身体組成物（グラムでの脂肪量および除脂肪量）の棒グラフである。
【００２３】
前述は、同様の参照符合が異なる図面全体を通じて同じ部分を示す添付の図面中に図示されるように、本発明の例示的な実施形態に関する以下のより詳細な説明から自明であろう。図面は、必ずしも縮尺通りに描かれることはなく、本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、トランスジェニック非ヒトＧＰＲ１０１ノックアウト動物、ならびに、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質の処置または予防を目的とした薬剤の開発のために動物を使用する方法に関する。本発明はまた、ＧＰＲ１０１遺伝子が構成的に活性があるトランスジェニック非ヒト動物、ならびに、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質の処置または予防を目的とした薬剤の開発のために動物を使用する方法に関する。特定の機序によって縛られることなく、ＧＰＲ１０１遺伝子の量または活性の調節は、かかるエネルギー代謝疾患の処置において有益でありうる。
【００２５】
代謝性疾患
代謝性疾患は、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば限定はされないが、肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質を含む。
【００２６】
定義
本明細書で使用される「トランスジェニック非ヒト動物」は、初代トランスジェニック非ヒト動物および初代動物の子孫、ならびに、動物の１つ以上の細胞が１つ以上のトランス遺伝子を含むかかる動物由来の細胞、細胞系および組織を含む。トランスジェニック非ヒト動物は、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびウサギなどの家畜動物、ラット、モルモット、およびマウスなどの齧歯動物、ならびにヒヒ、サル、およびチンパンジーなどの非ヒト霊長類であってもよい。トランスジェニックマウスは特に有用である。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、トランスジェニック動物がそこから発生する細胞のゲノムに融合され、かつ成熟動物のゲノム内に残る外因性ＤＮＡであり、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞種または組織においてコード化遺伝子産物の発現が誘導される。
【００２７】
本明細書で使用される遺伝子の「ノックアウト」は、好ましくは標的遺伝子の発現が検出できないかまたは有意でない程度に標的遺伝子の機能の低下をもたらす、遺伝子の配列内での改変または破壊を意味する。内因性遺伝子のノックアウトは、遺伝子の機能が、発現が検出できないかまたは有意でないレベルでしか認められない程度に実質的に低下していることを意味する。本明細書で使用される用語「破壊」および「改変」は、ＧＰＲ１０１遺伝子の発現および／または機能における部分的または完全な低下を示唆する。ＧＰＲ１０１遺伝子の改変または破壊は、当業者に公知の種々の方法によって行ってもよい。例えば、相同組換え、突然変異誘発（例えば点突然変異）およびアンチセンス技術を用いる遺伝子標的化を用いて、ＧＰＲ１０１遺伝子を破壊してもよい。
【００２８】
本明細書で使用される用語「遺伝子標的化」は、哺乳類細胞（例えばＥＳ細胞）への標的化コンストラクト（例えばベクター）の導入の結果として生じる相同組換えのタイプを示し、それは改変（例えば破壊）の標的とされる遺伝子座の核酸配列の対応部分を探索し、それとの組換えを行い、それによって計画された改変を付与可能な外因性組換え核酸配列を内因性遺伝子に導入するように設計される。したがって、相同組換えは、特定のＤＮＡ配列が外因性の遺伝子操作された配列によって置換されることが可能なプロセス（例えば方法）である。より詳細には、破壊の標的とされる遺伝子の内因性ヌクレオチド配列に対して相同（例えば相補的）であるように遺伝子操作されている標的化ベクターの領域が、内因性遺伝子の対応位置に、標的化ベクターのヌクレオチド配列が組み込まれる（例えばそれと融合される）ように互いに整列されるかまたは組換えられる。
【００２９】
本明細書で使用される「コンストラクト」は、組換え核酸、一般に組換えＤＮＡを意味し、それは特定のヌクレオチド配列の発現を目的として作成されているか、または他の組換えヌクレオチド配列の作成において使用されることになっているものである。
【００３０】
本明細書で使用される用語「遺伝子型」は、ＧＰＲ１０１染色体座に関連した動物の遺伝子組成を示す。より詳細には、遺伝子型という用語は、動物のＧＰＲ１０１対立遺伝子の状態を示す。ＧＰＲ１０１は、Ｘ染色体上に位置する。雌マウスが２つのＸ染色体を有することから、マウスは、次の３つの遺伝子型、すなわち野生型マウス（ＸＧＰＲ１０１＋、ＸＧＰＲ１０１＋）、ヘテロ接合体マウス（ＸＧＰＲ１０１＋、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）、またはホモ接合体ヌルマウス（ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）でありうる。雌マウスにおいては、１つのＸ染色体のみが任意の所与の細胞内で活性がある。このＸ染色体の不活性化は、細胞間でランダムであり、「ライオニゼーション（ｌｙｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」と称されることが多い。したがって、ヘテロ接合体である雌マウスにおいては、生体における細胞の約半分が、ＧＰＲ１０１を全く発現しないことになる（野生型対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１＋）が不活性化されているため）一方、その生体における細胞の残り半分は、正常なレベルのＧＰＲ１０１を発現することになる（「ヌル」対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）が不活性化され、ひいては野生型対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１＋）が活性を保持するため）。したがって、雌ＧＰＲ１０１ヘテロ接合体は複雑であり、その細胞の半分が通常量のＧＰＲ１０１を有する一方、その細胞の残り半分はＧＰＲ１０１を全く有しないことになる。野生型雌がすべての細胞内に通常量のＧＰＲ１０１を常に有する一方、ホモ接合体ヌル雌マウスは、どの細胞内にも常にＧＰＲ１０１を全く有しないことになる。雄マウスは、（ＧＰＲ１０１遺伝子が欠損する）１つのＹ染色体および（ＧＰＲ１０１遺伝子を有する）１つのＸ染色体を有する。したがって、雄マウスは、単にどちらか１つの遺伝子型を有し、すなわちすべての細胞内に通常量のＧＰＲ１０１を有する野生型（Ｙ、ＸＧＰＲ１０１＋）マウス、およびどの細胞内にもＧＰＲ１０１が全く欠損したノックアウト（Ｙ、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）マウスでありうる。
【００３１】
ＧＰＲ１０１遺伝子の改変または破壊の結果として、本発明のＧＰＲ１０１ノックアウト哺乳動物は特定の表現型を呈しうる。本明細書で使用される用語「表現型」は、特定の遺伝子型に起因する、生じた生化学または生理的結果を示す。一実施形態では、ＧＰＲ１０１ノックアウト哺乳動物は、代謝恒常性を改変している。
【００３２】
「ノックアウト」トランスジェニックは、遺伝子のヘテロ接合体ノックアウトまたは遺伝子のホモ接合体ノックアウトを有するトランスジェニック動物であってもよい。「ノックアウト」はまた、標的遺伝子の改変が、例えば、標的遺伝子の改変を促進する物質への動物の暴露、標的遺伝子部位で組換えを促進する酵素の導入（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）、または生後に標的遺伝子の改変を誘導するための他の方法によって生じうる場合での条件的ノックアウトを含む。
【００３３】
リコンビニアリング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）（組換えを介する遺伝子工学）は、ベクター、例えばＢＡＣの一部である標的配列への突然変異の導入に使用可能な相同組換えに基づく高効率の遺伝子工学システムである。リコンビニアリングの方法は当業者に公知である（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１３１４−７頁、２０００年；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：１２３−８頁（１９９８年）；ならびにＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０−５頁（２０００年）を参照）。リコンビニアリングのレビューは、Ｃｏｕｒｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３６：３６１−８８頁（２００２年）およびＣｏｐｅｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２：７６９−７７９頁、２００１年において見出すことが可能である（いずれもそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【００３４】
本明細書で使用される「構成的に活性な受容体」は、受容体のそのリガンドまたはその化学的等価物への結合を介する場合以外の手段によって活性状態で安定化された受容体を意味するものとする。構成的に活性な受容体は、内因性または非内因性のいずれであってもよい。
【００３５】
「構成的に活性化された受容体」は、構成的に活性があるように修飾されているか、またはより構成的に活性があるように修飾されている内因性受容体を意味するものとする。
【００３６】
「構成的受容体の活性化」は、受容体の、そのリガンドまたはその化学的等価物への結合の不在下での活性化を意味するものとする。
【００３７】
本明細書で使用される用語「ＥＳ細胞」は、多能性胚幹細胞と、限定はされないが、胚細胞の発生段階における細胞を含む、胚発生の非常に早い段階でのかかる多能性細胞を示す。
【００３８】
「部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」または「部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、ＤＮＡ配列内で特異的な所定の変化をもたらすことである。部位特異的突然変異誘発のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９年、１５．３−１５．１０８頁；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ、１２６：３５−４１頁（１９９３年）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：５９２−６頁（１９９２年）；ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２：５２８−３０頁（１９９２年）；Ｂａｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１８：７３４９−５５頁（１９９０年）；ＭａｒｏｔｔｉおよびＴｏｍｉｃｈ、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ、６：６７−７０頁（１９８９年）；ならびにＺｈｕ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７７：１２０４頁（１９８９年）（すべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）において見出すことが可能である。
【００３９】
トランスジェニックマウスを作製する方法
一般的態様では、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子の発現を可能にする方法での、所与のトランス遺伝子のゲノムへの組込みによって作製される。トランスジェニック動物を作製するための方法は、一般に、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４４４２頁（１９８５年）；ならびに「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 第２版（Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４年）によって説明されている（すべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。典型的には、ゲノム配列によって隣接される遺伝子は、マイクロインジェクションによって受精卵に移される。マイクロインジェクトした卵は宿主雌に移植され、子孫はトランス遺伝子の発現についてスクリーニングされる。トランスジェニック動物は、限定はされないが、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、および魚類を含む多数の動物に由来する受精卵から作製することが可能である。
【００４０】
あるいは、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子を作製するために胚幹（ＥＳ）細胞を使用することによって得てもよい。トランス遺伝子は胚幹細胞に導入され、形質移入された幹細胞は胚を形成するために利用される。ＥＳ細胞は、適切な条件下で、インビトロで着床前胚を培養することによって得られる（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６頁（１９８１年）；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５６頁（１９８４年）；Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９頁（１９８６年）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：４４５−４４８頁（１９８６年）（それら全体が参照により本明細書中に援用される））。子孫は、尾の組織からゲノムＤＮＡを単離することにより、トランス遺伝子の融合について分析し、遺伝子をコードする断片は、従来のＤＮＡ−ハイブリダイゼーション技術によって同定することが可能である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７頁（１９７５年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。
【００４１】
本発明の一態様は、本発明の非ヒトトランスジェニック動物から細胞または細胞系を単離することと、細胞を培地中で成長させることに関する。本発明の別の態様は、宿主細胞のゲノムの特定の部位への相同組換えが可能になる配列あるいは宿主細胞のゲノムへのランダムまたは準ランダム組換えが可能になる配列を有する本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。かかる細胞が特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫を示すことは理解されている。突然変異または環境の影響のいずれかが原因で後世において特定の修飾が生じうることから、かかる子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４２】
本発明の別の態様は、ベクターに関する。本明細書で使用される用語「ベクター」は、核酸分子であって、それが連結されている別の核酸を輸送可能なものを示す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは追加的なＤＮＡセグメントのライゲートが可能な環状二本鎖ＤＮＡループを示す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここでは追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲート可能である。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞内で自律複製可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時、宿主細胞のゲノムに融合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導可能である。かかるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書における「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから同義的に使用してもよい。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、かかる他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を含むように意図されている。
【００４３】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で含み、それは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結される、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むことを意味する。かかる調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（１９９０年）において記載されている（その全体が参照により本明細書中に援用される）。調節配列は、多種の宿主細胞内でのヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものと、特定の宿主細胞内に限ってヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む。発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入されることで、本明細書中に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生成することが可能である。
【００４４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞内での標的遺伝子の発現のために設計してもよい。例えば、標的遺伝子または断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞などの細菌細胞内で発現させてもよい。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（１９９０年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）においてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロで転写または翻訳してもよい。
【００４５】
標的遺伝子はまた、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞内で発現させてもよい。哺乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０頁（１９８７年））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：１８７頁（１９８７年））が挙げられる。発現ベクターの制御機能は、哺乳類細胞内で使用される場合、ウイルス調節因子によって提供されることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。原核および真核細胞の双方における他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００４６】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってもよい。例えば、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母、アフリカツメガエル細胞、または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、またはヒト胎児細胞（２９３Ｔ））であってもよい。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。本発明の一態様では、宿主細胞は、本明細書中に記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する。
【００４７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して、原核または真核細胞に導入してもよい。本明細書で使用される用語「形質転換」および「形質移入」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当該技術分野で公知の技術を示すように意図されている。宿主細胞を形質転換または形質移入するための好適な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年）および他の実験マニュアルにおいて見出すことが可能である。
【００４８】
トランスジェニック非ヒト動物を使用する方法
本発明は、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、２型糖尿病、拒食症および悪液質に対して作用する（すなわち調節する、阻害する、低下させる、予防するまたは改善する）調節因子、すなわち候補もしくは試験化合物または作用物質（例えばペプチド、環状ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、小有機分子、または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本明細書で使用される「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」または「調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」または「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、ＧＰＲ１０１受容体に対して作動または拮抗させることを示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を使用し、エネルギー代謝に関連する疾患の処置または予防にとって有効な化合物または組成物を同定することが可能である。化合物または組成物は、試験化合物または組成物を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与するか、あるいは試験化合物または組成物を、トランスジェニック非ヒト動物に由来する器官、組織（例えば骨格筋）または細胞（例えば神経細胞または筋肉細胞）と接触させることにより、同定することが可能である。トランスジェニック非ヒト動物、器官、組織または細胞におけるエネルギー代謝に対する試験化合物または組成物の効果が評価される。例えば、候補作用剤は、トランスジェニック非ヒト動物において評価してもよい。エネルギー代謝を改変する試験化合物または組成物は、エネルギー代謝に関連する疾患の処置または予防にとって有効でありうる。
【００４９】
さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規作用剤に関する。したがって、本明細書中に記載の適切な動物モデルにおいて、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物をさらに使用することは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物は、動物モデル（例えばトランスジェニックＧＰＲ１０１ノックアウト非ヒト動物）において使用し、かかる試験化合物または組成物での処置の有効性、毒性、または副作用を判定することが可能である。あるいは、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物は、動物モデルにおいて使用し、かかる試験化合物または組成物の作用機序を判定することが可能である。
【００５０】
試験化合物は、医薬的に許容できる非毒性賦形剤またはキャリアとの混合によって薬学的組成物に調合し、任意の投与経路によって本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与してもよい。例えば、皮下、筋肉内、血管内、皮内、鼻腔内、吸入、髄腔内、または腹腔内投与などの非経口経路、および舌下、経口、または直腸投与などの経腸経路を使用してもよい。
【００５１】
試験化合物または組成物は、例えば試験化合物または組成物を野生型マウスおよびＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに投与することにより、ＧＰＲ１０１受容体に対する生理作用について試験してもよい。試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて効果をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その試験化合物または組成物は、ＧＰＲ１０１の活性を変化させることによって効果をもたらすものである。試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて体重の減少、体脂肪の減少、および／または食物摂取の低下をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１の活性化因子である可能性が高い。それに対し、試験化合物または組成物が体重の増加、体脂肪の増加、および／または食物摂取の増加をもたらす場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１の阻害剤である可能性が高い。試験化合物または組成物が野生型マウスとＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの双方において効果をもたらす場合、その試験化合物または組成物は、ＧＲＰ１０１の活性を変化させることによってその効果を発揮するものではない。
【００５２】
試験化合物または組成物の特異性は、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいて試験してもよい。例えば、野生型マウスにおいて見られる効果がＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいても見られる場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１に対して特異的でない。
【００５３】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスを使用し、試験化合物または組成物によってもたらされる毒性が、ＧＰＲ１０１の活性の改変によるもの（的確な毒性）か、または他の何らかの機序の改変によるもの（的外れの毒性）かを判定してもよい。例えば、試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて毒性または望ましくない効果をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その毒性効果は、ＧＰＲ１０１の活性の改変による副産物（的確な効果）である。試験化合物または組成物が野生型マウスとＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの双方において毒性または望ましくない効果をもたらす場合、その試験化合物または組成物の毒性効果は、ＧＰＲ１０１の活性の変化に何も関連性がない（的外れの効果）。
【００５４】
ＧＰＲ１０１の構成的に活性なマウスは、例えばＧＰＲ１０１の活性を低下させかねない試験化合物または組成物を試験するのに特に有用でありうる。かかる試験化合物または組成物であれば、拒食症または悪液質を有する患者における食物摂取を刺激するのに有用でありうる。これらのマウスにおいて受容体が活性化されることから、それらはＧＰＲ１０１の活性の潜在的な阻害剤に対して感受性を示すはずである。
【００５５】
本発明の例示的な実施形態の説明は以下の通りである。
【実施例】
【００５６】
実験手順
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの作製
胚幹（ＥＳ）細胞における遺伝子標的化を用いて、ＧＰＲ１０１欠損マウスを作製した。置換標的化コンストラクトを、約１００ｋｂ上流への、および約４０ｋｂ下流へのＧＰＲ１０１配列を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）ゲノムクローンを使用して調製した。ＢＡＣクローンを、開始コドンを含むコードエクソンに及ぶＧＰＲ１０１配列の２２１６ｂｐ部分（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００００８６）が除去され、Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ−Ｆｒｔ−カナマイシン−Ｆｒｔ（Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ ＦＫＦ）カセットと置換されるように設計した。ＧＰＲ１０１におけるゲノムＤＮＡ配列は、ＮＣ＿００００８６内にあり、アセンブリ上の５４７５６８９４から５４７４９８４５の位置に由来する。欠失の設計に使用されるプライマーは、（配列番号１）ＨＤ７３フォワード５’−ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＣＡＣ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＣＣＣ Ｔ−３’および（配列番号２）ＨＤ７４リバース５’−ＣＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＡＣ Ａ−３であった。欠失を有するＢＡＣの１１．４ｋｂ部分を、Ｚｅｏｃｉｎを有するｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔに挿入した。次いで、この標的化プラスミドを線状化し、胚幹細胞にエレクトロポレートした。標的化クローンを、標的化遺伝子座の３’および５’末端に及ぶプライマーを使用するＰＣＲ分析によって同定した（図１）。標的化ＥＳクローンから拡張された細胞をＣ５７ＢＬ６胚盤胞に注入し、生殖細胞系を伝達するキメラ動物を得て、次いでＦＬＰｅ−リコンビナーゼマウスと交配させた。ＧＰＲ１０１がＸ染色体上に位置することから、得られたヘテロ接合性の子らを交配させ、野生型（＋／＋）およびホモ接合性（−／−）試験対象を作製した。すべての試験を雄マウスにおいて実施した。３つのプライマーによる多重ＰＣＲ法を、図１に示される遺伝子型マウスに対して用いた。以下は、図１からのプライマー配列である。
（配列番号３）ＨＤ５５ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＴＴＣ ＴＣＡ
（配列番号４）ＨＤ８１ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＡＴ ＣＧ
（配列番号５）ＨＤ８２ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＴＴＴ ＡＣＧ
（配列番号６）ＨＤ８４ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＧＡ
（配列番号７）ＨＤ１４２ ＴＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡ
（配列番号８）ＨＤ１４３ ＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣ
（配列番号９）ＨＤ１４４ ＧＧＧＧＣＣＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴ
【００５７】
ＧＰＲ１０１が構成的に活性なマウスの作製
ＧＰＣＲの特定の残基の突然変異の結果、オープン構造ひいては構成的活性（リガンドの不在下での活性）を有する受容体が得られる。受容体の潜在的な構成的活性に関与することになるＧＰＲ１０１内の残基を同定するため、インビトロ試験を実施した。マウスＧＰＲ１０１をコードする完全長ｃＤＮＡを、マウス脳ＲＮＡから増幅し、それを発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１に挿入した。部位特異的突然変異誘発を用いて、活性の増大につながるＧＰＲ１０１の膜貫通ループにおける突然変異を同定したが、ここでは標的としてＧＰＲ１０１タンパク質のアラニン３９７を同定し、リジンに突然変異される場合、ＧＰＲ１０１の活性における２倍の増大をもたらす（データは示さず）。単一のアミノ酸置換、すなわちＡ３９７→Ｋ３９７を伴う新規マウスモデルを作製した。
【００５８】
Ａ３９７→Ｋ３９７を伴う構成的に活性化型のＧＰＲ１０１を生成するための標的化コンストラクトを、リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む標準技術を用いて作成した。ｇａｌＫ陽性および対抗選択のスキームを用いて、ＧＰＲ１０１のＢＡＣにおいて点突然変異を生じさせた（Ｗａｒｍｉｎｇ Ｓ．ら、「Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３：１−１２頁（２００５年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。次いで、点突然変異を有するマウスを作製するため、修飾ＢＡＣをプラスミドに挿入し、胚盤胞に注入した。
【００５９】
結果
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける体重
体重調節におけるＧＰＲ１０１の機能的重要性を判定するため、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスを作製した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに標準の齧歯類用食餌を与え、３週齢以降の雄ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ｎ＝８）の体重を、野生型同腹子（ｎ＝１２）のそれと比較した。
【００６０】
図２に見られるように、雄ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、野生型同腹子対照と比較して体重増加傾向で推移した。１７週齢のＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、体重において、野生型マウスに見られる場合よりも約１０％の増加を有した。これらの結果は、中枢神経系におけるＧＰＲ１０１が正常な体重恒常性にとって必要とされることを示す。
【００６１】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける食物摂取
全食物摂取を、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいて評価した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに標準の齧歯類用食餌を与えた。６週齢目、食物摂取を２４時間記録した（図３Ａ）。結果は、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける２４時間内での食物摂取が、その野生型同腹子に対して増加したことを示す（５．１±０．５８、ＧＰＲ１０１ノックアウト対３．５２±０．５８野生型、ｎ＝６〜７／群）。８週齢目、全食物摂取を包括的な実験動物モニタリングシステムにおいて記録し、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスによって消費される全食物の、その野生型対照に対する有意な増加が見られた（図３Ｂ）。結果は、ＧＰＲ１０１が食餌サイズの調節における役割を果たすことを示唆する。
【００６２】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける食餌パターン
上で考察した２４時間の食物摂取における増加に加え、８週齢のＧＰＲ１０１ノックアウトマウスはまた、図５に示されるように、食物消費の全体パターンにおける変化を示す。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、図４および５に示されるように、野生型対照に対して食餌サイズにおける変化を示した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、暗期中により大量の食餌を消費した。
【００６３】
データは、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスが体重および食物摂取の増加を有し、それによりＧＰＲ１０１ノックアウトマウスが代謝性疾患の処置に使用可能なＧＰＲ１０１のアゴニストおよびアンタゴニストの同定において有用でありうることを示す。
【００６４】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける高脂肪食誘発性肥満
野生型およびＧＰＲ１０１遺伝子ノックアウト雄マウスを、離乳（３週齢）時に、食餌（Ｆｏｒｕｍｕｌａｂ、食餌＃５００８）（ＷＴにおいてｎ＝１０およびＧＰＲ１０１−ＫＯにおいてｎ＝８）または高脂肪食（カロリーの４５％が脂肪由来、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、Ｄ１２４５１）（ＷＴにおいてｎ＝７およびＧＰＲ１０１−ＫＯにおいてｎ＝７）を与え、体重を毎週モニタリングした。先に認められたように、食餌を与えたＧＰＲ１０１ＫＯマウスの体重は、野生型対照の場合より重かった（図６）。注目すべきことに、野生型とＧＰＲ１０１ＫＯマウスの間での体重における差異は、マウスに高脂肪食を与える場合に大きくなる（図７）。食餌を与えたマウスの身体組成物は、１２週齢時でのＥｃｈｏ−ＭＲＩによる評価によると、体重の増加が脂肪量の増加に起因することを示す（図８）。これらの実験結果は、ＧＰＲ１０１の遺伝子ノックアウトが肥満を誘発することを示す。さらに、ＧＰＲ１０１の遺伝子ノックアウトは、高脂肪食誘発性肥満に対する感受性の増大の原因になる。まとめると、これらの実験結果は、ＧＰＲ１０１アゴニストが、抗肥満効果を有する可能性が高く、故に肥満の処置にとって有用でありうることを示す。
【００６５】
本明細書中に引用されるすべての特許、公開された出願および参考文献の教示内容は、それら全体が参照により援用される。
【００６６】
本発明は、特にその例示的な実施形態を参照して示され、説明されている一方、形態におけるさまざまな変化および詳細化が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中でなされうることは当業者によって理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１２８，１１０号明細書の便益性を主張する。上記出願の教示全体は、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質受容体１０１（ＧＰＲ１０１）は、公知のリガンドを全く有しないオーファンＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲ１０１は、特に中枢神経系内に存在し、視床下部および扁桃体、具体的には、前脳領域の弓状核（ＡＲＣ）、視床下部腹内側部（ＶＭＨ）、視床下部背内側部（ＤＭＨ）、視床下部後部（ＰＨ）、視床下部傍室核（ＰＶＮ）、内側視索前野（ＭＰＯＡ）、視交叉上核（ＳＣＮ）および視床下部前野（ＡＨＡ）、ならびに、代謝恒常性機能に関与すると考えられる領域である後脳領域内の孤束核（ＮＴＳ）および外側結合腕傍核（ＬＰＢ）において豊富に発現される（Ｎｉｌａｗｅｅｒａ Ｋ．Ｎ．ら、「Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １０１ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ：Ａｌｔｅｒｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ａｎｄ Ａｍｙｇｄａｌａ Ｂｙ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９：３４−４５頁（２００６年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。ＧＰＲ１０１はまた、前脳における側坐核および中脳におけるセロトニン作動性の核などの動機付けられた挙動の調節に関与する脳の領域内で発現される（Ｂａｔｅｓら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＰＲ１０１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０８７：１−１４頁（２００６年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。視床下部、扁桃体、ＬＰＢおよびＮＴＳがエネルギーバランス調節において重要な役割を発揮することから、これらの領域内でのＧＰＲ１０１ ｍＲＮＡの高度の発現は、代謝恒常性におけるＧＰＲ１０１の重要な役割を示唆しうる。したがって、ＧＰＲ１０１が代謝恒常性における重要な役割を有しうることから、それは代謝性疾患および障害の処置および予防において重要な役割を有しうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の観点から、受容体調節の考えられる生理的結果を同定し、かつ代謝性疾患の処置または予防における使用にとって潜在的な作用剤または組成物を同定するための信頼性の高いツールが大いに必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＧＰＲ１０１受容体を調節する作用剤をスクリーニングすることを目的とした、新規トランスジェニックマウスモデルまたはそれから単離される細胞を特徴とする。かかるモデルを使用し、エネルギー代謝に関連する疾患の診断を改善するとともに、エネルギー代謝に関連する疾患のより優れた処置および予防用の薬学的組成物を同定し、試験することが可能である。
【０００５】
一実施形態では、本発明は、ＧＰＲ１０１ノックアウトトランスジェニック非ヒト動物、またはそれから単離される細胞、ならびに肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、２型糖尿病、拒食症および悪液質などのエネルギー代謝に関連する疾患におけるモデルとしてのその使用を提供する。
【０００６】
別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物、またはそれから単離される細胞、ならびに肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質などのエネルギー代謝に関連する疾患におけるモデルとしてのその使用を提供し、ここでＧＰＲ１０１遺伝子は構成的に活性がある。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に関する。
【０００８】
別の実施形態では、前記破壊は、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによってゲノムに導入されている。
【０００９】
一実施形態では、ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない。
【００１０】
別の実施形態では、哺乳動物はマウスである。
【００１１】
さらに、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記ノックアウト非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物の体重および食物摂取を、野生型対照の体重および食物摂取と比較するステップと、ここで効果における差異は、ＧＰＲ１０１の活性の改変によって体重および食物摂取を調節する作用剤を示唆する、
を含む、方法に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法に関する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【００１６】
一実施形態では、構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によってゲノムに導入されている。
【００１７】
別の実施形態では、アミノ酸置換は、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによってゲノムに導入されている。
【００１８】
さらなる実施形態では、哺乳動物はマウスである。
【００１９】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞に関する。
【００２０】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】遺伝子型マウスに対する３つのプライマーによる多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を示す。
【図２】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図３Ａ】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における、２４時間の期間中のグラム（ｇ）での食物摂取の棒グラフである。
【図３Ｂ】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１−ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）における累積食物摂取を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図４】野生型対照（ＷＴ）における食物消費の変化を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図５】ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）における食物消費の変化を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での食物摂取を表し、Ｘ軸は分単位での時間を表す。
【図６】食餌（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）に対するＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）の体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図７】高脂肪食に対するＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ）および野生型同腹子対照（ＷＴ）の体重を示すグラフである。Ｙ軸はグラム（ｇ）での体重を表し、Ｘ軸は週齢（ｗｋｓ）を表す。
【図８】食餌に対するマウス（野生型（ＷＴ）およびＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ＧＰＲ１０１ＫＯ））における身体組成物（グラムでの脂肪量および除脂肪量）の棒グラフである。
【００２３】
前述は、同様の参照符合が異なる図面全体を通じて同じ部分を示す添付の図面中に図示されるように、本発明の例示的な実施形態に関する以下のより詳細な説明から自明であろう。図面は、必ずしも縮尺通りに描かれることはなく、本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、トランスジェニック非ヒトＧＰＲ１０１ノックアウト動物、ならびに、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質の処置または予防を目的とした薬剤の開発のために動物を使用する方法に関する。本発明はまた、ＧＰＲ１０１遺伝子が構成的に活性があるトランスジェニック非ヒト動物、ならびに、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質の処置または予防を目的とした薬剤の開発のために動物を使用する方法に関する。特定の機序によって縛られることなく、ＧＰＲ１０１遺伝子の量または活性の調節は、かかるエネルギー代謝疾患の処置において有益でありうる。
【００２５】
代謝性疾患
代謝性疾患は、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば限定はされないが、肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、糖尿病、特に２型糖尿病、拒食症および悪液質を含む。
【００２６】
定義
本明細書で使用される「トランスジェニック非ヒト動物」は、初代トランスジェニック非ヒト動物および初代動物の子孫、ならびに、動物の１つ以上の細胞が１つ以上のトランス遺伝子を含むかかる動物由来の細胞、細胞系および組織を含む。トランスジェニック非ヒト動物は、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびウサギなどの家畜動物、ラット、モルモット、およびマウスなどの齧歯動物、ならびにヒヒ、サル、およびチンパンジーなどの非ヒト霊長類であってもよい。トランスジェニックマウスは特に有用である。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、トランスジェニック動物がそこから発生する細胞のゲノムに融合され、かつ成熟動物のゲノム内に残る外因性ＤＮＡであり、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞種または組織においてコード化遺伝子産物の発現が誘導される。
【００２７】
本明細書で使用される遺伝子の「ノックアウト」は、好ましくは標的遺伝子の発現が検出できないかまたは有意でない程度に標的遺伝子の機能の低下をもたらす、遺伝子の配列内での改変または破壊を意味する。内因性遺伝子のノックアウトは、遺伝子の機能が、発現が検出できないかまたは有意でないレベルでしか認められない程度に実質的に低下していることを意味する。本明細書で使用される用語「破壊」および「改変」は、ＧＰＲ１０１遺伝子の発現および／または機能における部分的または完全な低下を示唆する。ＧＰＲ１０１遺伝子の改変または破壊は、当業者に公知の種々の方法によって行ってもよい。例えば、相同組換え、突然変異誘発（例えば点突然変異）およびアンチセンス技術を用いる遺伝子標的化を用いて、ＧＰＲ１０１遺伝子を破壊してもよい。
【００２８】
本明細書で使用される用語「遺伝子標的化」は、哺乳類細胞（例えばＥＳ細胞）への標的化コンストラクト（例えばベクター）の導入の結果として生じる相同組換えのタイプを示し、それは改変（例えば破壊）の標的とされる遺伝子座の核酸配列の対応部分を探索し、それとの組換えを行い、それによって計画された改変を付与可能な外因性組換え核酸配列を内因性遺伝子に導入するように設計される。したがって、相同組換えは、特定のＤＮＡ配列が外因性の遺伝子操作された配列によって置換されることが可能なプロセス（例えば方法）である。より詳細には、破壊の標的とされる遺伝子の内因性ヌクレオチド配列に対して相同（例えば相補的）であるように遺伝子操作されている標的化ベクターの領域が、内因性遺伝子の対応位置に、標的化ベクターのヌクレオチド配列が組み込まれる（例えばそれと融合される）ように互いに整列されるかまたは組換えられる。
【００２９】
本明細書で使用される「コンストラクト」は、組換え核酸、一般に組換えＤＮＡを意味し、それは特定のヌクレオチド配列の発現を目的として作成されているか、または他の組換えヌクレオチド配列の作成において使用されることになっているものである。
【００３０】
本明細書で使用される用語「遺伝子型」は、ＧＰＲ１０１染色体座に関連した動物の遺伝子組成を示す。より詳細には、遺伝子型という用語は、動物のＧＰＲ１０１対立遺伝子の状態を示す。ＧＰＲ１０１は、Ｘ染色体上に位置する。雌マウスが２つのＸ染色体を有することから、マウスは、次の３つの遺伝子型、すなわち野生型マウス（ＸＧＰＲ１０１＋、ＸＧＰＲ１０１＋）、ヘテロ接合体マウス（ＸＧＰＲ１０１＋、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）、またはホモ接合体ヌルマウス（ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）でありうる。雌マウスにおいては、１つのＸ染色体のみが任意の所与の細胞内で活性がある。このＸ染色体の不活性化は、細胞間でランダムであり、「ライオニゼーション（ｌｙｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」と称されることが多い。したがって、ヘテロ接合体である雌マウスにおいては、生体における細胞の約半分が、ＧＰＲ１０１を全く発現しないことになる（野生型対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１＋）が不活性化されているため）一方、その生体における細胞の残り半分は、正常なレベルのＧＰＲ１０１を発現することになる（「ヌル」対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）が不活性化され、ひいては野生型対立遺伝子を担持するＸ染色体（ＸＧＰＲ１０１＋）が活性を保持するため）。したがって、雌ＧＰＲ１０１ヘテロ接合体は複雑であり、その細胞の半分が通常量のＧＰＲ１０１を有する一方、その細胞の残り半分はＧＰＲ１０１を全く有しないことになる。野生型雌がすべての細胞内に通常量のＧＰＲ１０１を常に有する一方、ホモ接合体ヌル雌マウスは、どの細胞内にも常にＧＰＲ１０１を全く有しないことになる。雄マウスは、（ＧＰＲ１０１遺伝子が欠損する）１つのＹ染色体および（ＧＰＲ１０１遺伝子を有する）１つのＸ染色体を有する。したがって、雄マウスは、単にどちらか１つの遺伝子型を有し、すなわちすべての細胞内に通常量のＧＰＲ１０１を有する野生型（Ｙ、ＸＧＰＲ１０１＋）マウス、およびどの細胞内にもＧＰＲ１０１が全く欠損したノックアウト（Ｙ、ＸＧＰＲ１０１−ｎｕｌｌ）マウスでありうる。
【００３１】
ＧＰＲ１０１遺伝子の改変または破壊の結果として、本発明のＧＰＲ１０１ノックアウト哺乳動物は特定の表現型を呈しうる。本明細書で使用される用語「表現型」は、特定の遺伝子型に起因する、生じた生化学または生理的結果を示す。一実施形態では、ＧＰＲ１０１ノックアウト哺乳動物は、代謝恒常性を改変している。
【００３２】
「ノックアウト」トランスジェニックは、遺伝子のヘテロ接合体ノックアウトまたは遺伝子のホモ接合体ノックアウトを有するトランスジェニック動物であってもよい。「ノックアウト」はまた、標的遺伝子の改変が、例えば、標的遺伝子の改変を促進する物質への動物の暴露、標的遺伝子部位で組換えを促進する酵素の導入（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）、または生後に標的遺伝子の改変を誘導するための他の方法によって生じうる場合での条件的ノックアウトを含む。
【００３３】
リコンビニアリング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）（組換えを介する遺伝子工学）は、ベクター、例えばＢＡＣの一部である標的配列への突然変異の導入に使用可能な相同組換えに基づく高効率の遺伝子工学システムである。リコンビニアリングの方法は当業者に公知である（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１３１４−７頁、２０００年；Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：１２３−８頁（１９９８年）；ならびにＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：６６４０−５頁（２０００年）を参照）。リコンビニアリングのレビューは、Ｃｏｕｒｔら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３６：３６１−８８頁（２００２年）およびＣｏｐｅｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２：７６９−７７９頁、２００１年において見出すことが可能である（いずれもそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【００３４】
本明細書で使用される「構成的に活性な受容体」は、受容体のそのリガンドまたはその化学的等価物への結合を介する場合以外の手段によって活性状態で安定化された受容体を意味するものとする。構成的に活性な受容体は、内因性または非内因性のいずれであってもよい。
【００３５】
「構成的に活性化された受容体」は、構成的に活性があるように修飾されているか、またはより構成的に活性があるように修飾されている内因性受容体を意味するものとする。
【００３６】
「構成的受容体の活性化」は、受容体の、そのリガンドまたはその化学的等価物への結合の不在下での活性化を意味するものとする。
【００３７】
本明細書で使用される用語「ＥＳ細胞」は、多能性胚幹細胞と、限定はされないが、胚細胞の発生段階における細胞を含む、胚発生の非常に早い段階でのかかる多能性細胞を示す。
【００３８】
「部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」または「部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、ＤＮＡ配列内で特異的な所定の変化をもたらすことである。部位特異的突然変異誘発のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８９年、１５．３−１５．１０８頁；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ、１２６：３５−４１頁（１９９３年）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：５９２−６頁（１９９２年）；ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２：５２８−３０頁（１９９２年）；Ｂａｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１８：７３４９−５５頁（１９９０年）；ＭａｒｏｔｔｉおよびＴｏｍｉｃｈ、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ、６：６７−７０頁（１９８９年）；ならびにＺｈｕ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７７：１２０４頁（１９８９年）（すべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）において見出すことが可能である。
【００３９】
トランスジェニックマウスを作製する方法
一般的態様では、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子の発現を可能にする方法での、所与のトランス遺伝子のゲノムへの組込みによって作製される。トランスジェニック動物を作製するための方法は、一般に、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４４４２頁（１９８５年）；ならびに「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 第２版（Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４年）によって説明されている（すべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。典型的には、ゲノム配列によって隣接される遺伝子は、マイクロインジェクションによって受精卵に移される。マイクロインジェクトした卵は宿主雌に移植され、子孫はトランス遺伝子の発現についてスクリーニングされる。トランスジェニック動物は、限定はされないが、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類、および魚類を含む多数の動物に由来する受精卵から作製することが可能である。
【００４０】
あるいは、トランスジェニック動物は、トランス遺伝子を作製するために胚幹（ＥＳ）細胞を使用することによって得てもよい。トランス遺伝子は胚幹細胞に導入され、形質移入された幹細胞は胚を形成するために利用される。ＥＳ細胞は、適切な条件下で、インビトロで着床前胚を培養することによって得られる（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６頁（１９８１年）；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５６頁（１９８４年）；Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９頁（１９８６年）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：４４５−４４８頁（１９８６年）（それら全体が参照により本明細書中に援用される））。子孫は、尾の組織からゲノムＤＮＡを単離することにより、トランス遺伝子の融合について分析し、遺伝子をコードする断片は、従来のＤＮＡ−ハイブリダイゼーション技術によって同定することが可能である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７頁（１９７５年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。
【００４１】
本発明の一態様は、本発明の非ヒトトランスジェニック動物から細胞または細胞系を単離することと、細胞を培地中で成長させることに関する。本発明の別の態様は、宿主細胞のゲノムの特定の部位への相同組換えが可能になる配列あるいは宿主細胞のゲノムへのランダムまたは準ランダム組換えが可能になる配列を有する本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。かかる細胞が特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫を示すことは理解されている。突然変異または環境の影響のいずれかが原因で後世において特定の修飾が生じうることから、かかる子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４２】
本発明の別の態様は、ベクターに関する。本明細書で使用される用語「ベクター」は、核酸分子であって、それが連結されている別の核酸を輸送可能なものを示す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは追加的なＤＮＡセグメントのライゲートが可能な環状二本鎖ＤＮＡループを示す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここでは追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲート可能である。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞内で自律複製可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時、宿主細胞のゲノムに融合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導可能である。かかるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書における「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから同義的に使用してもよい。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、かかる他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を含むように意図されている。
【００４３】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で含み、それは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結される、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むことを意味する。かかる調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（１９９０年）において記載されている（その全体が参照により本明細書中に援用される）。調節配列は、多種の宿主細胞内でのヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものと、特定の宿主細胞内に限ってヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む。発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入されることで、本明細書中に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを生成することが可能である。
【００４４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞内での標的遺伝子の発現のために設計してもよい。例えば、標的遺伝子または断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞などの細菌細胞内で発現させてもよい。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（１９９０年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）においてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロで転写または翻訳してもよい。
【００４５】
標的遺伝子はまた、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞内で発現させてもよい。哺乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０頁（１９８７年））およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：１８７頁（１９８７年））が挙げられる。発現ベクターの制御機能は、哺乳類細胞内で使用される場合、ウイルス調節因子によって提供されることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。原核および真核細胞の双方における他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００４６】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってもよい。例えば、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母、アフリカツメガエル細胞、または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、またはヒト胎児細胞（２９３Ｔ））であってもよい。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。本発明の一態様では、宿主細胞は、本明細書中に記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する。
【００４７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を介して、原核または真核細胞に導入してもよい。本明細書で使用される用語「形質転換」および「形質移入」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当該技術分野で公知の技術を示すように意図されている。宿主細胞を形質転換または形質移入するための好適な方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年）および他の実験マニュアルにおいて見出すことが可能である。
【００４８】
トランスジェニック非ヒト動物を使用する方法
本発明は、エネルギー代謝に関連する疾患、例えば肥満、代謝症候群、脂質異常症、インスリン耐性症候群、２型糖尿病、拒食症および悪液質に対して作用する（すなわち調節する、阻害する、低下させる、予防するまたは改善する）調節因子、すなわち候補もしくは試験化合物または作用物質（例えばペプチド、環状ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、小有機分子、または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本明細書で使用される「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」または「調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」または「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、ＧＰＲ１０１受容体に対して作動または拮抗させることを示す。特に、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を使用し、エネルギー代謝に関連する疾患の処置または予防にとって有効な化合物または組成物を同定することが可能である。化合物または組成物は、試験化合物または組成物を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与するか、あるいは試験化合物または組成物を、トランスジェニック非ヒト動物に由来する器官、組織（例えば骨格筋）または細胞（例えば神経細胞または筋肉細胞）と接触させることにより、同定することが可能である。トランスジェニック非ヒト動物、器官、組織または細胞におけるエネルギー代謝に対する試験化合物または組成物の効果が評価される。例えば、候補作用剤は、トランスジェニック非ヒト動物において評価してもよい。エネルギー代謝を改変する試験化合物または組成物は、エネルギー代謝に関連する疾患の処置または予防にとって有効でありうる。
【００４９】
さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規作用剤に関する。したがって、本明細書中に記載の適切な動物モデルにおいて、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物をさらに使用することは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物は、動物モデル（例えばトランスジェニックＧＰＲ１０１ノックアウト非ヒト動物）において使用し、かかる試験化合物または組成物での処置の有効性、毒性、または副作用を判定することが可能である。あるいは、本明細書中に記載のように同定される試験化合物または組成物は、動物モデルにおいて使用し、かかる試験化合物または組成物の作用機序を判定することが可能である。
【００５０】
試験化合物は、医薬的に許容できる非毒性賦形剤またはキャリアとの混合によって薬学的組成物に調合し、任意の投与経路によって本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与してもよい。例えば、皮下、筋肉内、血管内、皮内、鼻腔内、吸入、髄腔内、または腹腔内投与などの非経口経路、および舌下、経口、または直腸投与などの経腸経路を使用してもよい。
【００５１】
試験化合物または組成物は、例えば試験化合物または組成物を野生型マウスおよびＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに投与することにより、ＧＰＲ１０１受容体に対する生理作用について試験してもよい。試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて効果をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その試験化合物または組成物は、ＧＰＲ１０１の活性を変化させることによって効果をもたらすものである。試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて体重の減少、体脂肪の減少、および／または食物摂取の低下をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１の活性化因子である可能性が高い。それに対し、試験化合物または組成物が体重の増加、体脂肪の増加、および／または食物摂取の増加をもたらす場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１の阻害剤である可能性が高い。試験化合物または組成物が野生型マウスとＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの双方において効果をもたらす場合、その試験化合物または組成物は、ＧＲＰ１０１の活性を変化させることによってその効果を発揮するものではない。
【００５２】
試験化合物または組成物の特異性は、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいて試験してもよい。例えば、野生型マウスにおいて見られる効果がＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいても見られる場合、その試験化合物または組成物はＧＰＲ１０１に対して特異的でない。
【００５３】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスを使用し、試験化合物または組成物によってもたらされる毒性が、ＧＰＲ１０１の活性の改変によるもの（的確な毒性）か、または他の何らかの機序の改変によるもの（的外れの毒性）かを判定してもよい。例えば、試験化合物または組成物が野生型マウスにおいて毒性または望ましくない効果をもたらすが、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいてもたらさない場合、その毒性効果は、ＧＰＲ１０１の活性の改変による副産物（的確な効果）である。試験化合物または組成物が野生型マウスとＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの双方において毒性または望ましくない効果をもたらす場合、その試験化合物または組成物の毒性効果は、ＧＰＲ１０１の活性の変化に何も関連性がない（的外れの効果）。
【００５４】
ＧＰＲ１０１の構成的に活性なマウスは、例えばＧＰＲ１０１の活性を低下させかねない試験化合物または組成物を試験するのに特に有用でありうる。かかる試験化合物または組成物であれば、拒食症または悪液質を有する患者における食物摂取を刺激するのに有用でありうる。これらのマウスにおいて受容体が活性化されることから、それらはＧＰＲ１０１の活性の潜在的な阻害剤に対して感受性を示すはずである。
【００５５】
本発明の例示的な実施形態の説明は以下の通りである。
【実施例】
【００５６】
実験手順
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスの作製
胚幹（ＥＳ）細胞における遺伝子標的化を用いて、ＧＰＲ１０１欠損マウスを作製した。置換標的化コンストラクトを、約１００ｋｂ上流への、および約４０ｋｂ下流へのＧＰＲ１０１配列を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）ゲノムクローンを使用して調製した。ＢＡＣクローンを、開始コドンを含むコードエクソンに及ぶＧＰＲ１０１配列の２２１６ｂｐ部分（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００００８６）が除去され、Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ−Ｆｒｔ−カナマイシン−Ｆｒｔ（Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ ＦＫＦ）カセットと置換されるように設計した。ＧＰＲ１０１におけるゲノムＤＮＡ配列は、ＮＣ＿００００８６内にあり、アセンブリ上の５４７５６８９４から５４７４９８４５の位置に由来する。欠失の設計に使用されるプライマーは、（配列番号１）ＨＤ７３フォワード５’−ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＣＡＣ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＡＡ ＴＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＣＣＣ Ｔ−３’および（配列番号２）ＨＤ７４リバース５’−ＣＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＧＡ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＡＣ Ａ−３であった。欠失を有するＢＡＣの１１．４ｋｂ部分を、Ｚｅｏｃｉｎを有するｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔに挿入した。次いで、この標的化プラスミドを線状化し、胚幹細胞にエレクトロポレートした。標的化クローンを、標的化遺伝子座の３’および５’末端に及ぶプライマーを使用するＰＣＲ分析によって同定した（図１）。標的化ＥＳクローンから拡張された細胞をＣ５７ＢＬ６胚盤胞に注入し、生殖細胞系を伝達するキメラ動物を得て、次いでＦＬＰｅ−リコンビナーゼマウスと交配させた。ＧＰＲ１０１がＸ染色体上に位置することから、得られたヘテロ接合性の子らを交配させ、野生型（＋／＋）およびホモ接合性（−／−）試験対象を作製した。すべての試験を雄マウスにおいて実施した。３つのプライマーによる多重ＰＣＲ法を、図１に示される遺伝子型マウスに対して用いた。以下は、図１からのプライマー配列である。
（配列番号３）ＨＤ５５ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＴＴＣ ＴＣＡ
（配列番号４）ＨＤ８１ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＡＴ ＣＧ
（配列番号５）ＨＤ８２ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＴＴ ＡＴＴＴ ＡＣＧ
（配列番号６）ＨＤ８４ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＡＴ ＡＧＡ
（配列番号７）ＨＤ１４２ ＴＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡ
（配列番号８）ＨＤ１４３ ＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣ
（配列番号９）ＨＤ１４４ ＧＧＧＧＣＣＡＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴ
【００５７】
ＧＰＲ１０１が構成的に活性なマウスの作製
ＧＰＣＲの特定の残基の突然変異の結果、オープン構造ひいては構成的活性（リガンドの不在下での活性）を有する受容体が得られる。受容体の潜在的な構成的活性に関与することになるＧＰＲ１０１内の残基を同定するため、インビトロ試験を実施した。マウスＧＰＲ１０１をコードする完全長ｃＤＮＡを、マウス脳ＲＮＡから増幅し、それを発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１に挿入した。部位特異的突然変異誘発を用いて、活性の増大につながるＧＰＲ１０１の膜貫通ループにおける突然変異を同定したが、ここでは標的としてＧＰＲ１０１タンパク質のアラニン３９７を同定し、リジンに突然変異される場合、ＧＰＲ１０１の活性における２倍の増大をもたらす（データは示さず）。単一のアミノ酸置換、すなわちＡ３９７→Ｋ３９７を伴う新規マウスモデルを作製した。
【００５８】
Ａ３９７→Ｋ３９７を伴う構成的に活性化型のＧＰＲ１０１を生成するための標的化コンストラクトを、リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む標準技術を用いて作成した。ｇａｌＫ陽性および対抗選択のスキームを用いて、ＧＰＲ１０１のＢＡＣにおいて点突然変異を生じさせた（Ｗａｒｍｉｎｇ Ｓ．ら、「Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３：１−１２頁（２００５年）（その全体が参照により本明細書中に援用される））。次いで、点突然変異を有するマウスを作製するため、修飾ＢＡＣをプラスミドに挿入し、胚盤胞に注入した。
【００５９】
結果
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける体重
体重調節におけるＧＰＲ１０１の機能的重要性を判定するため、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスを作製した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに標準の齧歯類用食餌を与え、３週齢以降の雄ＧＰＲ１０１ノックアウトマウス（ｎ＝８）の体重を、野生型同腹子（ｎ＝１２）のそれと比較した。
【００６０】
図２に見られるように、雄ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、野生型同腹子対照と比較して体重増加傾向で推移した。１７週齢のＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、体重において、野生型マウスに見られる場合よりも約１０％の増加を有した。これらの結果は、中枢神経系におけるＧＰＲ１０１が正常な体重恒常性にとって必要とされることを示す。
【００６１】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける食物摂取
全食物摂取を、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおいて評価した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスに標準の齧歯類用食餌を与えた。６週齢目、食物摂取を２４時間記録した（図３Ａ）。結果は、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける２４時間内での食物摂取が、その野生型同腹子に対して増加したことを示す（５．１±０．５８、ＧＰＲ１０１ノックアウト対３．５２±０．５８野生型、ｎ＝６〜７／群）。８週齢目、全食物摂取を包括的な実験動物モニタリングシステムにおいて記録し、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスによって消費される全食物の、その野生型対照に対する有意な増加が見られた（図３Ｂ）。結果は、ＧＰＲ１０１が食餌サイズの調節における役割を果たすことを示唆する。
【００６２】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける食餌パターン
上で考察した２４時間の食物摂取における増加に加え、８週齢のＧＰＲ１０１ノックアウトマウスはまた、図５に示されるように、食物消費の全体パターンにおける変化を示す。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、図４および５に示されるように、野生型対照に対して食餌サイズにおける変化を示した。ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスは、暗期中により大量の食餌を消費した。
【００６３】
データは、ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスが体重および食物摂取の増加を有し、それによりＧＰＲ１０１ノックアウトマウスが代謝性疾患の処置に使用可能なＧＰＲ１０１のアゴニストおよびアンタゴニストの同定において有用でありうることを示す。
【００６４】
ＧＰＲ１０１ノックアウトマウスにおける高脂肪食誘発性肥満
野生型およびＧＰＲ１０１遺伝子ノックアウト雄マウスを、離乳（３週齢）時に、食餌（Ｆｏｒｕｍｕｌａｂ、食餌＃５００８）（ＷＴにおいてｎ＝１０およびＧＰＲ１０１−ＫＯにおいてｎ＝８）または高脂肪食（カロリーの４５％が脂肪由来、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、Ｄ１２４５１）（ＷＴにおいてｎ＝７およびＧＰＲ１０１−ＫＯにおいてｎ＝７）を与え、体重を毎週モニタリングした。先に認められたように、食餌を与えたＧＰＲ１０１ＫＯマウスの体重は、野生型対照の場合より重かった（図６）。注目すべきことに、野生型とＧＰＲ１０１ＫＯマウスの間での体重における差異は、マウスに高脂肪食を与える場合に大きくなる（図７）。食餌を与えたマウスの身体組成物は、１２週齢時でのＥｃｈｏ−ＭＲＩによる評価によると、体重の増加が脂肪量の増加に起因することを示す（図８）。これらの実験結果は、ＧＰＲ１０１の遺伝子ノックアウトが肥満を誘発することを示す。さらに、ＧＰＲ１０１の遺伝子ノックアウトは、高脂肪食誘発性肥満に対する感受性の増大の原因になる。まとめると、これらの実験結果は、ＧＰＲ１０１アゴニストが、抗肥満効果を有する可能性が高く、故に肥満の処置にとって有用でありうることを示す。
【００６５】
本明細書中に引用されるすべての特許、公開された出願および参考文献の教示内容は、それら全体が参照により援用される。
【００６６】
本発明は、特にその例示的な実施形態を参照して示され、説明されている一方、形態におけるさまざまな変化および詳細化が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中でなされうることは当業者によって理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
ゲノムが、前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含む、トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞。
【請求項６】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項７】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物はマウスである、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項９】
ゲノムが、前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含む、ノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１０】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物はマウスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内で破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記ノックアウト非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物の体重および食物摂取を野生型対照の体重および食物摂取と比較するステップであって、ここで効果における差異は、ＧＰＲ１０１の活性の改変によって体重および食物摂取を調節する作用剤を示唆するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記破壊は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の前記破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
候補作用剤を、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記破壊が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の前記破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子が、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項２２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２５】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞。
【請求項２６】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子が、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２５に記載の単離細胞。
【請求項２７】
前記アミノ酸置換は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項２６に記載の単離細胞。
【請求項２８】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２５に記載の単離細胞。
【請求項２９】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するための方法。
【請求項３０】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸置換が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
候補作用剤を、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸置換は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物はマウスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
ゲノムが、前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含む、トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞。
【請求項６】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項７】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物はマウスである、請求項５に記載の単離細胞。
【請求項９】
ゲノムが、前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内に破壊を含む、ノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項１０】
前記破壊が、胚幹細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物はマウスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能について候補作用剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが前記内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内で破壊を含むトランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記ノックアウト非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）トランスジェニックノックアウト非ヒト哺乳動物の体重および食物摂取を野生型対照の体重および食物摂取と比較するステップであって、ここで効果における差異は、ＧＰＲ１０１の活性の改変によって体重および食物摂取を調節する作用剤を示唆するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記破壊は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の前記破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
候補作用剤を、ノックアウト非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが内因性ＧＰＲ１０１遺伝子内での破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記破壊が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＰＲ１０１遺伝子の前記破壊の結果、前記マウスは、検出可能なレベルのＧＰＲ１０１を生成することができない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子が、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項２２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２５】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する単離細胞。
【請求項２６】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子が、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２５に記載の単離細胞。
【請求項２７】
前記アミノ酸置換は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項２６に記載の単離細胞。
【請求項２８】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２５に記載の単離細胞。
【請求項２９】
ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するための方法。
【請求項３０】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸置換が、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物はマウスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
候補作用剤を、ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物における体重および食物摂取に対する調節能についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ゲノムが構成的に活性な内因性ＧＰＲ１０１遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に候補作用剤を投与するステップと、
（ｃ）前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に対する前記候補作用剤の効果を評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記構成的に活性なＧＰＲ１０１遺伝子は、単一のアミノ酸置換によって前記ゲノムに導入されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸置換は、ＥＳ細胞内で、ＤＮＡ標的化コンストラクトとの相同組換えによって前記ゲノムに導入されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物はマウスである、請求項３３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２０４６５（Ｐ２０１１−５２０４６５Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１０５０５（Ｐ２０１１−５１０５０５）
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３０９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４２７２４
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（３０１０３３２５９）ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センター，インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３０９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４２７２４
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（３０１０３３２５９）ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センター，インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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