新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法
本発明は新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法に係り、さらに詳しくは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343）由来のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関する。本発明によれば、安価な基質であるシチジンモノホスフェートとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを用いて一回の反応により経済的にＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を量産することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法に係り、さらに詳しくは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilisNCTC 9343）由来のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、糖鎖に関する構造及び機能に関する研究が盛んになされるに伴い、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖タンパク質などの医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を浴びている。中でも、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含有するシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウィルス感染時に受容体となるなど重要な機能を有する糖鎖である。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖は、一般的に、シアル酸転移酵素の触媒作用により合成される。シアル酸転移酵素は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供給体として糖鎖などの受容体にシアル酸を転移させる酵素である。しかしながら、糖供給体として使用するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは極めて高価であり、しかも、量的にも試薬レベルの少量でしか供給されていないのが現状である。
【０００４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造方法としては、シチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）とＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼの触媒により合成する方法が知られているが、その原料となるＣＴＰ及びＮｅｕＡｃは高価であるため、直接原料として合成されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃも高価にならざるを得ない。
【０００５】
近年、オロチン酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を司るブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）菌体、ＵＴＰからＣＴＰへの変換反応を触媒するＣＴＰ合成酵素を生産する組換え大腸菌及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を生産する組換え大腸菌を組み合わせ、オロチン酸とＮｅｕＡｃを原料としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法が開発されている。上記の方法は、高価なＣＴＰを使用しない方法ではあるが、複数種の菌体を調製しなければならないなど工程が煩雑であると共に、それを行うための大型の設備を準備することを余儀なくされ、しかも、高価なＮｅｕＡｃを原料とするという点において、実用的な方法であるとはいえない。
【０００６】
一方、ＮｅｕＡｃの製造方法に関しては、シアル酸の多量体であるコロミン酸を微生物から回収し、これを化学分解して回収する方法が知られているが、最近、酵素を用いた方法が開発されている。
【０００７】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ-neuraminic acid；ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の生産方法としては、（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを用いてＮ−アセチルマンノサミン（N-acetyl-D-mannosamine；ＭａｎＮＡｃ）から製造する方法（J. Am. Chem. Soc., 110:6481, 1988; J. Am. Chem. Soc., 110:7159, 1988；特開平１０−４９６１号公報）、（２）アルカリの条件下においてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に変換し、ここにＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を製造する方法（特開平０５−２１１８８４号公報；Biotechnol. Bioeng., 66:2, 1999; Enzyme Microb. Technol., 20, 1997）、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｍＮＡｃへの変換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンテターゼを用いてＧｌｃＮＡｃからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造する方法（ＷＯ９５／２６３９９；特開平０３−１８０１９０号公報；特開２００１−１３６９８２号公報）、（４）大腸菌と酵母菌体を用いてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成する方法（ＷＯ２００４／００９８３０）などが報告されている。
【０００８】
しかしながら、（１）の方法は原料となるＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）が高価であり、（２）の方法は安価なＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）との混合物においてＭａｎＮＡｃを精製する工程が複雑であるという問題がある。さらに、（３）の方法において使用するＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼは、ＡＴＰを必要とするため、高価なＡＴＰを添加したり、微生物を用いてＡＴＰの前駆体であるアデニンからＡＴＰを生成しなければならないという欠点があり、（４）の方法は大腸菌と酵母菌体を利用する方法がその工程からみて複雑であるという問題がある。
【０００９】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼに関しては、豚やラットの腎臓、肝、脾臓、脳、腸内粘膜、甲状腺、膵臓及び唾液腺に存在することが知られており、豚由来の酵素に関してその特性が調べられており、主として動物由来の遺伝子などから抽出されて研究されている（Biochemistry, 17:3363, 1970; Biochem. J., 210:21, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 52:371, 1964）。また、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの遺伝子については豚由来の遺伝子が知られている（J. Biol. Chem., 271:16294, 1996）。微生物の中では、藍藻の一種であるシネコシスティス属ＰＣＣ６８０３（Synechocystis sp. PCC 6803）はそのゲノムの全体配列が決定されており、ゲノムからＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを確認した（DNA Research, 3:109, 1996; Nucleic Acids Research, 26:63, 1998）。
【００１０】
一方、大韓民国公開特許（第１０−２００１−０１０２０１９号）は、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記酵素をコードするＤＮＡに関するものであり、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを藍藻（Cyanobacteria）のうちシネコシスティス（Synechocystis）から発見して使用した。
【００１１】
また、大韓民国公開特許（第１０−２００６−００１０７０６号）は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法に関するものであり、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を含む共発現ベクター導入の形質転換体にシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ピルビン酸及び酵母を添加してノイラミン酸を合成した後、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素を添加したり、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む共発現ベクター導入の形質転換体にシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ピルビン酸及び酵母を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関するものであるが、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するために多段階を経なければならず、且つ、基質として用いられるシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）がシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）に転換される収率が低いという問題点がある。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を経済的で且つ簡単な方法により製造する方法を開発するために鋭意努力した結果、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343）において新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素を確認し、前記酵素の遺伝子を組換えベクターで形質転換して得られたＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、安価な基質であるシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）及び極少量のＮＴＰを用いて多数の基質と酵素を一気に混ぜてワンポット連鎖反応により高収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明の主たる目的は、新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された組換え微生物を培養することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いて多数の基質と酵素を一気に混ぜてワンポット連鎖反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供することにある。
【００１５】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物を培養すること、及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを回収することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む反応混合物を前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの存在下で反応させること、及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを回収することを含む、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ピルビン酸及び前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを含む反応混合物をＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼの存在下で反応させること、及びノイラミン酸を回収することを含む、ノイラミン酸製造方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、（ｉ）シチジン５’モノホスフェート（cytidine 5' monophosphate；ＣＭＰ）、（ｉｉ）ヌクレオチドトリ−ホスフェート（nucleotide tri-phosphate；ＮＴＰ）またはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させること、及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を回収することを含む、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成過程を示す模式図である。
【図２】Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子（ｎａｎＥ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図３】Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子（ｎａｎ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図４】シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードする遺伝子（ｃｍｋ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図５】アセテートキナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図６】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｎｅｕ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図７】各酵素の発現の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて確認した結果を示すものである（レーン１：マーカー、レーン２：シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、レーン３：アセテートキナーゼ、レーン４：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、レーン５：Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、レーン６：アシルグルコサミン−２−エピメラーゼ）。
【図８】精製された各酵素の発現の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて確認した結果を示すものである（レーン１：マーカー、レーン２：精製されたシチジン５’モノホスフェートキナーゼ、レーン３：精製されたアセテートキナーゼ、レーン４：精製されたＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、レーン５：精製されたＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、レーン６：精製されたアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ）。
【図９】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をＨ１ＮＭＲにより分析した結果を示すものである。
【図１０】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をＨＰＬＣにより分析した結果を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、一観点において、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成に関与するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物を培養することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法に関するものである。
【００２３】
本発明において、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする。
【００２４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３由来の酵素であり、シネコシスティス属とバクテロイデスセタイオタオミクロンの該当遺伝子と３５．０６〜３２．９％の相同性を示している。
【００２５】
本発明は、他の観点において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いることを特徴とするＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン及びノイラミン酸を製造する方法に関する。
【００２６】
本発明は、さらに他の観点において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いてワンポット連鎖反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関する。
【００２７】
本発明によるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、（ｉ）シチジン５’モノホスフェート、（ｉｉ）ヌクレオチドトリホスフェートまたはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させることにより製造することができる。
【００２８】
本発明によれば、安価な基質であるシチジンモノホスフェートは、ＣＭＰ−キナーゼ及びアセテートキナーゼによりシチジンダイホスフェート（cytidine diphosphate；ＣＤＰ）を経てシチジントリホスフェートに９７％以上の高収率にて合成される。前記ＣＤＰに用いられるホスフェートの供与体としては極少量のＮＴＰを使用し、ＮＤＰは過量のアセチルホスフェートとアセテートキナーゼにより再利用されて経済的である。特に、本発明においては、ＣＤＰに供されるホスフェート供与体として用いられるＡＴＰの代わりにＣＴＰを使用することにより、反応終了後に不純物として存在するＡＤＰを除去しなければならないという煩雑さを解消することができる。
【００２９】
また、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（N-acetyl-D-glucosamine；ＧｌａｃＮＡｃ）は、本発明によるＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼによりＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（N-acetyl-D-mannosamine；ＭａｎＮＡｃ）に転換され、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸はＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼによりノイラミン酸に合成される。以上において合成されたＣＴＰとノイラミン酸は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（CMP-NeuAc synthetase）によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に合成される（図１）。
【００３０】
本発明において、前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されることを特徴とし、前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）はシチジントリホスフェート（cytidinetri-phosphate；ＣＴＰ）であることを特徴とする。
【００３１】
本発明において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は担体に固定化されていることを特徴とし、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素はそれぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１４の塩基配列によりコードされることを特徴とする。
【００３２】
本発明においては、高発現された各酵素を精製した後、キトサンなどの高分子ビーズを用いて固定化することにより反復的な合成段階を経ることなく１回で合成することができ、合成コストを大幅に下げることができる。酵素の固定化方法としては、通常の酵素の固定化手段（共有付着法、多機能試薬を用いた架橋、吸着法、微細カプセル化方法など）を使用することができる。酵素の精製方法としては、通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈殿処理、透析処理、各種のクロマトグラフィ処理など）を使用することができ、前記精製方法により得られる助酵素または精製酵素を利用することができ、前記酵素を高分子ビーズに固定化する方法としては、通常の酵素固定化方法を使用することができる。上記の方法により精製された酵素は高分子ビーズに固定化して２０回以上使用することができるため、酵素を回収するコストと工数を減らすことができる。
【００３３】
本発明によれば、前記多数の基質と酵素を一回に混ぜてワンポット連鎖反応を行うことにより各酵素の反応性を極大化させ、少量の酵素及び基質を使用しても、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を９０％以上の高収率にて合成することができる。すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの場合、エピメラーゼ単独反応を行うと、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成収率は５０％にもならないが、ワンポット連鎖反応を行う場合に９０％以上の高収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成することができる。
【００３４】
本発明において用いられるＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ＣＭＰ−キナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は公知の酵素であり、通常の方法により調製することができるが、前記遺伝子のクローニング、クローニングしたＤＮＡ断片を含む組換えベクターの製作、組換えベクターの導入された形質転換体の製作、形質転換体の培養による目的酵素タンパク質の生産などの組換えＤＮＡ法を使用することが好ましい。形質転換に用いられる宿主は特に限定されないが、操作し易さの観点から、大腸菌を使用することが好ましい。
【００３５】
本発明において用いられるＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３からＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする新規遺伝子を分離したものである。バクテロイデスフラギリスのゲノムＤＮＡの全体配列は決定されたが（ＵＳ７,０９０,９７３）、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ遺伝子に対する機能は全く知られていない。
【００３６】
本発明において、「ベクター」とは、適合する宿主内においてＤＮＡを発現可能な適合する調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物のことを言う。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または簡単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムとは無関係に複製して機能できるか、あるいは、場合によってはゲノムそのものに統合可能である。現在、プラスミドがベクターの最も汎用される形態であるため、本発明の明細書における「プラスミド」及び「ベクター」は時々相互交換的に使用される。本発明の目的からみて、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）１つの宿主細胞当たりに数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率よく行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入可能な制限酵素切断部位を含む構造を有している。たとえ適切な制限酵素切断部位が存在しないとしても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲート（ligation）することができる。
【００３７】
ライゲーション後に、ベクターは適切な宿主細胞で形質転換される必要がある。形質転換はカルシウムクロリド方法を用いて容易に行うことができる。選択的に、電気穿孔法（Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982）もこれらの細胞の形質転換に使用可能である。
【００３８】
本発明による遺伝子の過発現のために用いられるベクターとしては、当業界における公知の発現ベクターが使用可能である。
【００３９】
核酸は他の核酸配列と機能的関係を持つように配置されるときに「作動可能に連結」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるときに遺伝子発現を可能にする方式により連結された遺伝子及び調節配列であってもよい。例えば、前配列または分泌リーダーに対するＤＮＡはポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結されるか、あるいは、リボソーム結合部位は配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結されるか、あるいは、リボソーム結合部位は翻訳を容易ならしめるために配置される場合にコード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかしながら、エンハンサーは接触する必要がない。これら配列の連結は便利な制限酵素部位においてライゲーションにより行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００４０】
当業界において周知されたように、宿主細胞における形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内において機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は細菌選択マーカー及び複製開始点を一緒に含んでいる一つの組換えベクター内に含まれることになる。宿主細胞が真核細胞である場合には、組換えベクターは真核発現宿主内において有用な発現マーカーをさらに含む必要がある。
【００４１】
上述した組換えベクターにより形質転換された宿主細胞は本発明の他の側面を構成する。本願明細書における使用用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成により複製可能になることを意味する。
【００４２】
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現する上で一概に同等に機能を発揮することはないということを理解する必要がある。同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して一概に同様な機能を発揮することはない。しかしながら、当業者であれば、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しないままで種々のベクター、発現調節配列及び宿主から適切な選択をすることができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部において複製される必要があるためである。ベクターの複製数、複製数を調節可能な能力及び当該ベクターによりコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮さるべきである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
《実施例１：遺伝子のクローニング及び形質転換》
実施例１−１．Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子（配列番号１）のクローニング及び形質転換
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するに当たって収率を高め、しかも、コストを下げるための最も大きな問題点として指摘されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンへの異性質化段階を解決するために、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを種々のソースから発見した。
【００４５】
嫌気性微生物であるバクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343, NC_003228）から３種のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ類似遺伝子を発見した。
【００４６】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番は９４７８５６〜９４９０３４区域にあり、１１７９ｂｐでコードされており、リゾビウムメリローティ（Rhizobium meliloti）とホモサピエンス(Homo sapiens)の当該酵素遺伝子と２３．６８％〜２４．４４％の相同性を示している。
【００４７】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番は１９９６６２５〜１９９７８０９区域にあり、１１８５ｂｐでコードされており、シネコシスティス属（Synechocystis sp.）とバクテロイデスセタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）の当該酵素遺伝子と３５．０６％〜３２．９％の相同性を示している。
【００４８】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子３番は４７６５５９２〜４７６６３５３区域にあり、７６２ｂｐでコードされており、ロドピレルーラ・バルティカ（Rhodopirellula baltica）とシネコシスティス属（Synechocystis sp.）の当該酵素遺伝子と４８．１８％〜３４．９７％の相同性を示している。
【００４９】
各遺伝子をｐＥＴ発現ベクター（Novagen）に挿入し、これをＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現菌株に導入して形質転換した。その結果、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番及び２番は可溶性タンパク質として高発現したが、候補遺伝子３番は可溶性タンパク質として発現されず、非可溶性として発現されることを確認した。
【００５０】
高発現された候補遺伝子酵素１番及び２番の活性を調べるために、基質としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びピルビン酸を使用し、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番、２番及び活性が確認されたＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを用いて２段階を１回に反応させて生成されたノイラミン酸を糖分析装置（Metrohm）を用いて確認した。
【００５１】
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番は活性がなく、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番の方が活性に優れていることを確認することができた。また、ヒトＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（organism="Homo sapiens,ene="RENBP", coded_by="NM_002910.4:203..1456"）を同じ条件下（５０ｍＭ Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン、１００〜２００ｍＭ ピルビン酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、３０℃〜４０℃）で活性を比較したとき、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番の反応速度及び収率が極めて高いことが分かり、前記候補遺伝子２番をＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼとして確認した。
【００５２】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（GlcNAc 2−epimerase；配列番号２）をコードするｎａｎＥ遺伝子をクローニングするために、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｎａｎＥ遺伝子を増幅した。
【００５３】
配列番号３：5'-ct gcc atg gtt atg aat act aca g
配列番号４：5'-aat gga tcc tta ttt ttc tga cag
【００５４】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（４０.２℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００５５】
前記増幅されたＰＣＲ産物をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit(Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを添加した。前記沈殿されたＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いてライゲートした（図２）。
【００５６】
前記組換えベクターをE. coliXL-Blueに導入して得られたカナマイシン耐性形質転換体からプラスミドｐＮＡＮＥｅを分離した。前記ｐＮＡＮＥｅプラスミドは、ｐＥＴ２８ａ（＋）のＴ７プロモーター下流のNcoI-BamHI切断部位にバクテロイデスフラギリスのｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００５７】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pNANeと命名した。
【００５８】
実施例１−２．Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子のクローニング及び形質転換
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（NeuNAc aldolase）をコードするｎａｎＡ遺伝子（配列番号５）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coliK-12 C600）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｎａｎＡ遺伝子を増幅した。
【００５９】
配列番号６：5'-ggtatccatggcaacgaatttacg
配列番号７：5'-ggtaggctcgagcgaggggaaac
【００６０】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５０.２℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００６１】
前記増幅されたＰＣＲ産物を遺伝子増幅後、反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.９ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断されたプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図３）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＮＡＮａを単離した。前記ｐＮＡＮａは、ｐＥＴ３２ａ（＋）のＴ７プロモーター下流のNcoI-XhoI切断部位にE. coli K-12 C600のｎａｎＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６２】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pNANaと命名した。
【００６３】
実施例１−３．シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードするｃｍｋ遺伝子のクローニング及び形質転換
シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードするｃｍｋ遺伝子（配列番号８）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coli K-12）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｃｍｋ遺伝子を増幅した。
【００６４】
配列番号９：5'-cat atg acggca att gcc ccg gtt att ac
配列番号１０：5'-gaa ttc ggt cgc tta tgc gag agc c
【００６５】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬｌ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５５．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００６６】
前記増幅されたＰＣＲ産物の反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図４）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＣＭＫを単離した。前記ｐＣＭＫは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にE.coli K-12C600のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６７】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E.coli BL21(DE3)pLysS（Invitrogen）に導入し、これをE. coli/pCMKと命名した。
【００６８】
実施例１−４．アセテートキナーゼをコードするａｃｋ遺伝子のクローニング及び形質転換
アセテートキナーゼをコードするａｃｋ遺伝子（配列番号１１）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coliK-12）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２及び配列番号１３のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりａｃｋ遺伝子を増幅した。
【００６９】
配列番号１２：5'-catatgtcgagtaagttagtttctg
配列番号１３：5'-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtc
【００７０】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５８．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００７１】
前記増幅されたＰＣＲ産物の反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２４ｍａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図５）。前記反応遺伝体をE.coli XL-Blueに導入して得られたカナマイシン耐性形質転換体からプラスミドｐＡＣＫａを単離した。
【００７２】
前記ｐＡＣＫａは、ｐＥＴ２４ｍａ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にE. coliK-12 C600のａｃｋＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７３】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pACKaと命名した。
【００７４】
実施例１−５．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードするｎｅｕ遺伝子のクローニング及び形質転換
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードするｎｅｕ遺伝子（配列番号１４）をクローニングするために、ナイセリア・メニンジャイティディス（Neisseria meningitidis, Koram Biotech）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりｎｅｕ遺伝子を増幅した。
【００７５】
配列番号１５：5'-aagcatatggaaaaacaaaatattgcg
配列番号１６：5'-gtggaattcttagctttccttgtg
【００７６】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５７．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００７７】
前記増幅されたＰＣＲ産物反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図６）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＳＹＮｂを単離した。前記ｐＳＹＮｂは、ｐＥＴ２４ｍａ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にナイセリア・メニンジャイティディスのｓｙｎＢ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７８】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pSYNbと命名した。
【００７９】
《実施例２：酵素発現確認》
前記形質転換体E. coli/pNANe、E. coli/pNANa、E. coli/pCMK、E. coli/pACKa及びE. coli/pSYNbをＬＢ培地において培養した種菌５００ｍＬを本培養ＬＢ培地５Ｌに接種し、細胞密度（ＯＤ６００）が約３〜５であるときに細胞を得た。各酵素の形質転換体の培養条件を表１に示す。前記得られた細胞を超音波破砕器またはフレンチプレスで破砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じてそれぞれの酵素発現の度合いを確認した（図７）。
【００８０】
その結果、それぞれの形質転換体において挿入された遺伝子によりコードされる酵素が過発現されることを確認することができた。
【００８１】
【表１】
【００８２】
《実施例３：酵素の精製》
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素を硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びイオン交換樹脂カラムにより精製した（Protein purification techniqes第２版、Oxford University Press, 2001）。
【００８３】
各酵素沈殿に用いられる硫酸アンモニウムの濃度は、３０〜８０％の範囲において適切に使用することができる。前記それぞれの酵素を硫酸アンモニウムが含まれた状態で１０℃以下、好ましくは、３〜５℃の冷蔵庫において１〜５時間かけて攪拌しながら沈殿した。
【００８４】
前記酵素沈殿物を最少量の緩衝溶液５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶かした後、透析用膜を用いて脱塩した。精製及び濃縮された酵素液は強イオン交換樹脂ＵＮＯ sphere Ｑ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）が充填されたカラムに溶出液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、溶出液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ／１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））を用いたＡ液−Ｂ液のグラディアントにより精製した。上記において精製された酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した（図８）。
【００８５】
《実施例４：酵素の固定化》
高分子ビーズ１ｋｇ（約１Ｌ）に２．５％グルタアルデヒド３Ｌを添加した後、常温において２時間かけて攪拌して高分子ビーズを活性化させた。前記活性化されたビーズをろ過した後に洗浄し、前記実施例３において精製されたそれぞれの酵素を高分子ビーズ１ｇ当たりに３ｍｇ混合した後、常温において６時間かけて攪拌して酵素を固定化した。酵素の固定化の度合い及び定量はブラッドフォード方法（Bradford method, Anal. Biochem., 72:248, 1976）を用いて確認した。
【００８６】
《実施例５：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成》
反応混合液（２０〜８０ｍＭシチジン５’モノホスフェート（CMP、Shanghai QZU Bioscience & Biotechnology）２０〜１００ｇ、２０〜８０ｍＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Shanghai Jiubang Chemical）３４．１５〜１３６．６ｇ、４０〜１２０ｍＭピルビン酸３３．９〜１０１．７ｇ、２０ｍＭＭｇＣｌ２・Ｈ２Ｏ（Duksan）３０.９ｇ、１ｍＭＣＴＰ（Sigma）３．７２ｇ、８０〜５００ｍＭアセチルホスフェート（Sigma）８４〜５２５ｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）７Ｌ、３７℃２ＭＮａＯＨを用いてｐＨ６．５〜８．０維持）を前記実施例４において製造したシチジンモノホスフェートキナーゼ（cytidine monophosphate kinase；ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（acetate kinase；ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミンアルドラーゼ（NeuAc aldolase、ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素（CMP-NeuAc synthetase、ＮＥＵ）及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（GlcNAc-2-epimerase）がそれぞれ固定された高分子ビーズと混合した後、反応器において攪拌して５〜１２時間反応させた。
【００８７】
前記反応上澄み液を分離、検出するためにThermo 42カラム（Thermo electron corporation）を使用し、溶出液はＡ液（１００ｍＭＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４）とＢ液（メタノール）を用いて、Ａ液（９０％）：Ｂ液（１０％）によりＨＰＬＣを実施した。その結果、約９０％の収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が合成されていることを確認することができた。
【００８８】
《実施例６：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の精製》
前記実施例５において合成したＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸反応液を陰イオン交換樹脂ダウエックスヤギ型（Dowex-1×2, Cl--form）カラムの上部に注入し、塩の濃度勾配を用いて分離した。前記目的物が含まれている溶出液を再濃縮してセファデックスＧ−１０ゲル透過法を用いて塩を除去することにより高純度の最終生成物を得、これを凍結乾燥して濃縮した。各精製段階を経て最終的に８１％のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得、ＮＭＲ及びＨＰＬＣを用いて最終収得物を確認した（図９及び図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上詳述したように、本発明は、新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を経済的に量産可能な方法を提供するという効果がある。本発明によれば、安価な基質であるシチジンモノホスフェートとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを用いて１回の反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を量産することができ、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されるため、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を低廉に生産することができる。
【００９０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法に係り、さらに詳しくは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilisNCTC 9343）由来のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、糖鎖に関する構造及び機能に関する研究が盛んになされるに伴い、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖タンパク質などの医薬品または機能性素材としての用途開発が注目を浴びている。中でも、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含有するシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウィルス感染時に受容体となるなど重要な機能を有する糖鎖である。
【０００３】
シアル酸含有糖鎖は、一般的に、シアル酸転移酵素の触媒作用により合成される。シアル酸転移酵素は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を糖供給体として糖鎖などの受容体にシアル酸を転移させる酵素である。しかしながら、糖供給体として使用するＣＭＰ−ＮｅｕＡｃは極めて高価であり、しかも、量的にも試薬レベルの少量でしか供給されていないのが現状である。
【０００４】
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造方法としては、シチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）とＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンテターゼの触媒により合成する方法が知られているが、その原料となるＣＴＰ及びＮｅｕＡｃは高価であるため、直接原料として合成されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃも高価にならざるを得ない。
【０００５】
近年、オロチン酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を司るブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）菌体、ＵＴＰからＣＴＰへの変換反応を触媒するＣＴＰ合成酵素を生産する組換え大腸菌及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を生産する組換え大腸菌を組み合わせ、オロチン酸とＮｅｕＡｃを原料としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法が開発されている。上記の方法は、高価なＣＴＰを使用しない方法ではあるが、複数種の菌体を調製しなければならないなど工程が煩雑であると共に、それを行うための大型の設備を準備することを余儀なくされ、しかも、高価なＮｅｕＡｃを原料とするという点において、実用的な方法であるとはいえない。
【０００６】
一方、ＮｅｕＡｃの製造方法に関しては、シアル酸の多量体であるコロミン酸を微生物から回収し、これを化学分解して回収する方法が知られているが、最近、酵素を用いた方法が開発されている。
【０００７】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ-neuraminic acid；ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の生産方法としては、（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを用いてＮ−アセチルマンノサミン（N-acetyl-D-mannosamine；ＭａｎＮＡｃ）から製造する方法（J. Am. Chem. Soc., 110:6481, 1988; J. Am. Chem. Soc., 110:7159, 1988；特開平１０−４９６１号公報）、（２）アルカリの条件下においてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に変換し、ここにＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を製造する方法（特開平０５−２１１８８４号公報；Biotechnol. Bioeng., 66:2, 1999; Enzyme Microb. Technol., 20, 1997）、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｍＮＡｃへの変換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンテターゼを用いてＧｌｃＮＡｃからＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造する方法（ＷＯ９５／２６３９９；特開平０３−１８０１９０号公報；特開２００１−１３６９８２号公報）、（４）大腸菌と酵母菌体を用いてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成する方法（ＷＯ２００４／００９８３０）などが報告されている。
【０００８】
しかしながら、（１）の方法は原料となるＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）が高価であり、（２）の方法は安価なＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）との混合物においてＭａｎＮＡｃを精製する工程が複雑であるという問題がある。さらに、（３）の方法において使用するＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼは、ＡＴＰを必要とするため、高価なＡＴＰを添加したり、微生物を用いてＡＴＰの前駆体であるアデニンからＡＴＰを生成しなければならないという欠点があり、（４）の方法は大腸菌と酵母菌体を利用する方法がその工程からみて複雑であるという問題がある。
【０００９】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼに関しては、豚やラットの腎臓、肝、脾臓、脳、腸内粘膜、甲状腺、膵臓及び唾液腺に存在することが知られており、豚由来の酵素に関してその特性が調べられており、主として動物由来の遺伝子などから抽出されて研究されている（Biochemistry, 17:3363, 1970; Biochem. J., 210:21, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 52:371, 1964）。また、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの遺伝子については豚由来の遺伝子が知られている（J. Biol. Chem., 271:16294, 1996）。微生物の中では、藍藻の一種であるシネコシスティス属ＰＣＣ６８０３（Synechocystis sp. PCC 6803）はそのゲノムの全体配列が決定されており、ゲノムからＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを確認した（DNA Research, 3:109, 1996; Nucleic Acids Research, 26:63, 1998）。
【００１０】
一方、大韓民国公開特許（第１０−２００１−０１０２０１９号）は、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記酵素をコードするＤＮＡに関するものであり、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードするＤＮＡを藍藻（Cyanobacteria）のうちシネコシスティス（Synechocystis）から発見して使用した。
【００１１】
また、大韓民国公開特許（第１０−２００６−００１０７０６号）は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法に関するものであり、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子及びＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を含む共発現ベクター導入の形質転換体にシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ピルビン酸及び酵母を添加してノイラミン酸を合成した後、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素を添加したり、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む共発現ベクター導入の形質転換体にシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミン、ピルビン酸及び酵母を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関するものであるが、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するために多段階を経なければならず、且つ、基質として用いられるシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）がシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）に転換される収率が低いという問題点がある。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を経済的で且つ簡単な方法により製造する方法を開発するために鋭意努力した結果、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343）において新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素を確認し、前記酵素の遺伝子を組換えベクターで形質転換して得られたＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、安価な基質であるシチジンモノホスフェート（ＣＭＰ）及び極少量のＮＴＰを用いて多数の基質と酵素を一気に混ぜてワンポット連鎖反応により高収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造することができるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明の主たる目的は、新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及び前記酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された組換え微生物を培養することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いて多数の基質と酵素を一気に混ぜてワンポット連鎖反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を提供することにある。
【００１５】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物を培養すること、及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを回収することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む反応混合物を前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの存在下で反応させること、及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを回収することを含む、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ピルビン酸及び前記Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを含む反応混合物をＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼの存在下で反応させること、及びノイラミン酸を回収することを含む、ノイラミン酸製造方法を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、（ｉ）シチジン５’モノホスフェート（cytidine 5' monophosphate；ＣＭＰ）、（ｉｉ）ヌクレオチドトリ−ホスフェート（nucleotide tri-phosphate；ＮＴＰ）またはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させること、及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を回収することを含む、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成過程を示す模式図である。
【図２】Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子（ｎａｎＥ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図３】Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子（ｎａｎ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図４】シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードする遺伝子（ｃｍｋ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図５】アセテートキナーゼをコードする遺伝子（ａｃｋ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図６】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｎｅｕ）を含有する組換えベクターを示すものである。
【図７】各酵素の発現の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて確認した結果を示すものである（レーン１：マーカー、レーン２：シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、レーン３：アセテートキナーゼ、レーン４：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、レーン５：Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、レーン６：アシルグルコサミン−２−エピメラーゼ）。
【図８】精製された各酵素の発現の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じて確認した結果を示すものである（レーン１：マーカー、レーン２：精製されたシチジン５’モノホスフェートキナーゼ、レーン３：精製されたアセテートキナーゼ、レーン４：精製されたＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素、レーン５：精製されたＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、レーン６：精製されたアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ）。
【図９】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をＨ１ＮＭＲにより分析した結果を示すものである。
【図１０】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸をＨＰＬＣにより分析した結果を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、一観点において、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成に関与するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された組換え微生物及び前記組換え微生物を培養することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法に関するものである。
【００２３】
本発明において、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする。
【００２４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３由来の酵素であり、シネコシスティス属とバクテロイデスセタイオタオミクロンの該当遺伝子と３５．０６〜３２．９％の相同性を示している。
【００２５】
本発明は、他の観点において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いることを特徴とするＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン及びノイラミン酸を製造する方法に関する。
【００２６】
本発明は、さらに他の観点において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを用いてワンポット連鎖反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法に関する。
【００２７】
本発明によるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、（ｉ）シチジン５’モノホスフェート、（ｉｉ）ヌクレオチドトリホスフェートまたはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させることにより製造することができる。
【００２８】
本発明によれば、安価な基質であるシチジンモノホスフェートは、ＣＭＰ−キナーゼ及びアセテートキナーゼによりシチジンダイホスフェート（cytidine diphosphate；ＣＤＰ）を経てシチジントリホスフェートに９７％以上の高収率にて合成される。前記ＣＤＰに用いられるホスフェートの供与体としては極少量のＮＴＰを使用し、ＮＤＰは過量のアセチルホスフェートとアセテートキナーゼにより再利用されて経済的である。特に、本発明においては、ＣＤＰに供されるホスフェート供与体として用いられるＡＴＰの代わりにＣＴＰを使用することにより、反応終了後に不純物として存在するＡＤＰを除去しなければならないという煩雑さを解消することができる。
【００２９】
また、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（N-acetyl-D-glucosamine；ＧｌａｃＮＡｃ）は、本発明によるＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼによりＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（N-acetyl-D-mannosamine；ＭａｎＮＡｃ）に転換され、ＭａｎＮＡｃとピルビン酸はＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼによりノイラミン酸に合成される。以上において合成されたＣＴＰとノイラミン酸は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（CMP-NeuAc synthetase）によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に合成される（図１）。
【００３０】
本発明において、前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されることを特徴とし、前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）はシチジントリホスフェート（cytidinetri-phosphate；ＣＴＰ）であることを特徴とする。
【００３１】
本発明において、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は担体に固定化されていることを特徴とし、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素はそれぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１４の塩基配列によりコードされることを特徴とする。
【００３２】
本発明においては、高発現された各酵素を精製した後、キトサンなどの高分子ビーズを用いて固定化することにより反復的な合成段階を経ることなく１回で合成することができ、合成コストを大幅に下げることができる。酵素の固定化方法としては、通常の酵素の固定化手段（共有付着法、多機能試薬を用いた架橋、吸着法、微細カプセル化方法など）を使用することができる。酵素の精製方法としては、通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈殿処理、透析処理、各種のクロマトグラフィ処理など）を使用することができ、前記精製方法により得られる助酵素または精製酵素を利用することができ、前記酵素を高分子ビーズに固定化する方法としては、通常の酵素固定化方法を使用することができる。上記の方法により精製された酵素は高分子ビーズに固定化して２０回以上使用することができるため、酵素を回収するコストと工数を減らすことができる。
【００３３】
本発明によれば、前記多数の基質と酵素を一回に混ぜてワンポット連鎖反応を行うことにより各酵素の反応性を極大化させ、少量の酵素及び基質を使用しても、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を９０％以上の高収率にて合成することができる。すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの場合、エピメラーゼ単独反応を行うと、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成収率は５０％にもならないが、ワンポット連鎖反応を行う場合に９０％以上の高収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成することができる。
【００３４】
本発明において用いられるＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ＣＭＰ−キナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は公知の酵素であり、通常の方法により調製することができるが、前記遺伝子のクローニング、クローニングしたＤＮＡ断片を含む組換えベクターの製作、組換えベクターの導入された形質転換体の製作、形質転換体の培養による目的酵素タンパク質の生産などの組換えＤＮＡ法を使用することが好ましい。形質転換に用いられる宿主は特に限定されないが、操作し易さの観点から、大腸菌を使用することが好ましい。
【００３５】
本発明において用いられるＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３からＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする新規遺伝子を分離したものである。バクテロイデスフラギリスのゲノムＤＮＡの全体配列は決定されたが（ＵＳ７,０９０,９７３）、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ遺伝子に対する機能は全く知られていない。
【００３６】
本発明において、「ベクター」とは、適合する宿主内においてＤＮＡを発現可能な適合する調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物のことを言う。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または簡単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主で形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムとは無関係に複製して機能できるか、あるいは、場合によってはゲノムそのものに統合可能である。現在、プラスミドがベクターの最も汎用される形態であるため、本発明の明細書における「プラスミド」及び「ベクター」は時々相互交換的に使用される。本発明の目的からみて、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）１つの宿主細胞当たりに数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率よく行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入可能な制限酵素切断部位を含む構造を有している。たとえ適切な制限酵素切断部位が存在しないとしても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲート（ligation）することができる。
【００３７】
ライゲーション後に、ベクターは適切な宿主細胞で形質転換される必要がある。形質転換はカルシウムクロリド方法を用いて容易に行うことができる。選択的に、電気穿孔法（Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982）もこれらの細胞の形質転換に使用可能である。
【００３８】
本発明による遺伝子の過発現のために用いられるベクターとしては、当業界における公知の発現ベクターが使用可能である。
【００３９】
核酸は他の核酸配列と機能的関係を持つように配置されるときに「作動可能に連結」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるときに遺伝子発現を可能にする方式により連結された遺伝子及び調節配列であってもよい。例えば、前配列または分泌リーダーに対するＤＮＡはポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結されるか、あるいは、リボソーム結合部位は配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結されるか、あるいは、リボソーム結合部位は翻訳を容易ならしめるために配置される場合にコード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかしながら、エンハンサーは接触する必要がない。これら配列の連結は便利な制限酵素部位においてライゲーションにより行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００４０】
当業界において周知されたように、宿主細胞における形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内において機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は細菌選択マーカー及び複製開始点を一緒に含んでいる一つの組換えベクター内に含まれることになる。宿主細胞が真核細胞である場合には、組換えベクターは真核発現宿主内において有用な発現マーカーをさらに含む必要がある。
【００４１】
上述した組換えベクターにより形質転換された宿主細胞は本発明の他の側面を構成する。本願明細書における使用用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成により複製可能になることを意味する。
【００４２】
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現する上で一概に同等に機能を発揮することはないということを理解する必要がある。同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して一概に同様な機能を発揮することはない。しかしながら、当業者であれば、過度な実験的負担なしに本発明の範囲を逸脱しないままで種々のベクター、発現調節配列及び宿主から適切な選択をすることができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部において複製される必要があるためである。ベクターの複製数、複製数を調節可能な能力及び当該ベクターによりコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮さるべきである。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４４】
《実施例１：遺伝子のクローニング及び形質転換》
実施例１−１．Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子（配列番号１）のクローニング及び形質転換
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するに当たって収率を高め、しかも、コストを下げるための最も大きな問題点として指摘されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンへの異性質化段階を解決するために、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを種々のソースから発見した。
【００４５】
嫌気性微生物であるバクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343, NC_003228）から３種のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ類似遺伝子を発見した。
【００４６】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番は９４７８５６〜９４９０３４区域にあり、１１７９ｂｐでコードされており、リゾビウムメリローティ（Rhizobium meliloti）とホモサピエンス(Homo sapiens)の当該酵素遺伝子と２３．６８％〜２４．４４％の相同性を示している。
【００４７】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番は１９９６６２５〜１９９７８０９区域にあり、１１８５ｂｐでコードされており、シネコシスティス属（Synechocystis sp.）とバクテロイデスセタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）の当該酵素遺伝子と３５．０６％〜３２．９％の相同性を示している。
【００４８】
Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子３番は４７６５５９２〜４７６６３５３区域にあり、７６２ｂｐでコードされており、ロドピレルーラ・バルティカ（Rhodopirellula baltica）とシネコシスティス属（Synechocystis sp.）の当該酵素遺伝子と４８．１８％〜３４．９７％の相同性を示している。
【００４９】
各遺伝子をｐＥＴ発現ベクター（Novagen）に挿入し、これをＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現菌株に導入して形質転換した。その結果、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番及び２番は可溶性タンパク質として高発現したが、候補遺伝子３番は可溶性タンパク質として発現されず、非可溶性として発現されることを確認した。
【００５０】
高発現された候補遺伝子酵素１番及び２番の活性を調べるために、基質としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びピルビン酸を使用し、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番、２番及び活性が確認されたＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを用いて２段階を１回に反応させて生成されたノイラミン酸を糖分析装置（Metrohm）を用いて確認した。
【００５１】
その結果、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子１番は活性がなく、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番の方が活性に優れていることを確認することができた。また、ヒトＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（organism="Homo sapiens,ene="RENBP", coded_by="NM_002910.4:203..1456"）を同じ条件下（５０ｍＭ Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン、１００〜２００ｍＭ ピルビン酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、３０℃〜４０℃）で活性を比較したとき、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ候補遺伝子２番の反応速度及び収率が極めて高いことが分かり、前記候補遺伝子２番をＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼとして確認した。
【００５２】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（GlcNAc 2−epimerase；配列番号２）をコードするｎａｎＥ遺伝子をクローニングするために、バクテロイデスフラギリスＮＣＴＣ９３４３（Bacteroides fragilis NCTC 9343）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｎａｎＥ遺伝子を増幅した。
【００５３】
配列番号３：5'-ct gcc atg gtt atg aat act aca g
配列番号４：5'-aat gga tcc tta ttt ttc tga cag
【００５４】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（４０.２℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００５５】
前記増幅されたＰＣＲ産物をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit(Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを添加した。前記沈殿されたＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いてライゲートした（図２）。
【００５６】
前記組換えベクターをE. coliXL-Blueに導入して得られたカナマイシン耐性形質転換体からプラスミドｐＮＡＮＥｅを分離した。前記ｐＮＡＮＥｅプラスミドは、ｐＥＴ２８ａ（＋）のＴ７プロモーター下流のNcoI-BamHI切断部位にバクテロイデスフラギリスのｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００５７】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pNANeと命名した。
【００５８】
実施例１−２．Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子のクローニング及び形質転換
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（NeuNAc aldolase）をコードするｎａｎＡ遺伝子（配列番号５）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coliK-12 C600）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｎａｎＡ遺伝子を増幅した。
【００５９】
配列番号６：5'-ggtatccatggcaacgaatttacg
配列番号７：5'-ggtaggctcgagcgaggggaaac
【００６０】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５０.２℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００６１】
前記増幅されたＰＣＲ産物を遺伝子増幅後、反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.９ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断されたプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図３）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＮＡＮａを単離した。前記ｐＮＡＮａは、ｐＥＴ３２ａ（＋）のＴ７プロモーター下流のNcoI-XhoI切断部位にE. coli K-12 C600のｎａｎＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６２】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pNANaと命名した。
【００６３】
実施例１−３．シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードするｃｍｋ遺伝子のクローニング及び形質転換
シチジン５’モノホスフェートキナーゼをコードするｃｍｋ遺伝子（配列番号８）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coli K-12）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｃｍｋ遺伝子を増幅した。
【００６４】
配列番号９：5'-cat atg acggca att gcc ccg gtt att ac
配列番号１０：5'-gaa ttc ggt cgc tta tgc gag agc c
【００６５】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬｌ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５５．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００６６】
前記増幅されたＰＣＲ産物の反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図４）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＣＭＫを単離した。前記ｐＣＭＫは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にE.coli K-12C600のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６７】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E.coli BL21(DE3)pLysS（Invitrogen）に導入し、これをE. coli/pCMKと命名した。
【００６８】
実施例１−４．アセテートキナーゼをコードするａｃｋ遺伝子のクローニング及び形質転換
アセテートキナーゼをコードするａｃｋ遺伝子（配列番号１１）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（E. coliK-12）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２及び配列番号１３のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりａｃｋ遺伝子を増幅した。
【００６９】
配列番号１２：5'-catatgtcgagtaagttagtttctg
配列番号１３：5'-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtc
【００７０】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５８．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００７１】
前記増幅されたＰＣＲ産物の反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２４ｍａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図５）。前記反応遺伝体をE.coli XL-Blueに導入して得られたカナマイシン耐性形質転換体からプラスミドｐＡＣＫａを単離した。
【００７２】
前記ｐＡＣＫａは、ｐＥＴ２４ｍａ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にE. coliK-12 C600のａｃｋＡ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７３】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pACKaと命名した。
【００７４】
実施例１−５．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードするｎｅｕ遺伝子のクローニング及び形質転換
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードするｎｅｕ遺伝子（配列番号１４）をクローニングするために、ナイセリア・メニンジャイティディス（Neisseria meningitidis, Koram Biotech）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりｎｅｕ遺伝子を増幅した。
【００７５】
配列番号１５：5'-aagcatatggaaaaacaaaatattgcg
配列番号１６：5'-gtggaattcttagctttccttgtg
【００７６】
ＰＣＲ条件は鋳型ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマーそれぞれ１μＬ、Primix(Genotech)４μＬ、蒸留水１４μＬをMastercycler gradient PCR(Ependorf)を用いて変性（９６℃において１分）、アニーリング（５７．７℃において１分）、伸長（７２℃において２分）段階を合計で３０回実施した。
【００７７】
前記増幅されたＰＣＲ産物反応液をプラスミドミニプレップキット（Plasmid mini-prep kit (Solgent)）で精製し、７０％エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。前記沈殿回収したＤＮＡをアガロスゲル電気泳動により確認し、０.７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。前記精製されたＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、上記と同じ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Novagen）Ｔ４ＤＮＡ（Takara）にリガーゼを用いて連結した（図６）。前記反応遺伝体をE. coliXL-Blueに導入して得られたアンピシリン耐性形質転換体からプラスミドｐＳＹＮｂを単離した。前記ｐＳＹＮｂは、ｐＥＴ２４ｍａ（＋）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位にナイセリア・メニンジャイティディスのｓｙｎＢ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７８】
前記組換え遺伝子を塩化カルシウムで処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53:159, 1970）により高発現菌株E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)に導入し、これをE. coli/pSYNbと命名した。
【００７９】
《実施例２：酵素発現確認》
前記形質転換体E. coli/pNANe、E. coli/pNANa、E. coli/pCMK、E. coli/pACKa及びE. coli/pSYNbをＬＢ培地において培養した種菌５００ｍＬを本培養ＬＢ培地５Ｌに接種し、細胞密度（ＯＤ６００）が約３〜５であるときに細胞を得た。各酵素の形質転換体の培養条件を表１に示す。前記得られた細胞を超音波破砕器またはフレンチプレスで破砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通じてそれぞれの酵素発現の度合いを確認した（図７）。
【００８０】
その結果、それぞれの形質転換体において挿入された遺伝子によりコードされる酵素が過発現されることを確認することができた。
【００８１】
【表１】
【００８２】
《実施例３：酵素の精製》
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素を硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びイオン交換樹脂カラムにより精製した（Protein purification techniqes第２版、Oxford University Press, 2001）。
【００８３】
各酵素沈殿に用いられる硫酸アンモニウムの濃度は、３０〜８０％の範囲において適切に使用することができる。前記それぞれの酵素を硫酸アンモニウムが含まれた状態で１０℃以下、好ましくは、３〜５℃の冷蔵庫において１〜５時間かけて攪拌しながら沈殿した。
【００８４】
前記酵素沈殿物を最少量の緩衝溶液５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶かした後、透析用膜を用いて脱塩した。精製及び濃縮された酵素液は強イオン交換樹脂ＵＮＯ sphere Ｑ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）が充填されたカラムに溶出液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、溶出液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ／１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））を用いたＡ液−Ｂ液のグラディアントにより精製した。上記において精製された酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した（図８）。
【００８５】
《実施例４：酵素の固定化》
高分子ビーズ１ｋｇ（約１Ｌ）に２．５％グルタアルデヒド３Ｌを添加した後、常温において２時間かけて攪拌して高分子ビーズを活性化させた。前記活性化されたビーズをろ過した後に洗浄し、前記実施例３において精製されたそれぞれの酵素を高分子ビーズ１ｇ当たりに３ｍｇ混合した後、常温において６時間かけて攪拌して酵素を固定化した。酵素の固定化の度合い及び定量はブラッドフォード方法（Bradford method, Anal. Biochem., 72:248, 1976）を用いて確認した。
【００８６】
《実施例５：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の合成》
反応混合液（２０〜８０ｍＭシチジン５’モノホスフェート（CMP、Shanghai QZU Bioscience & Biotechnology）２０〜１００ｇ、２０〜８０ｍＭＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Shanghai Jiubang Chemical）３４．１５〜１３６．６ｇ、４０〜１２０ｍＭピルビン酸３３．９〜１０１．７ｇ、２０ｍＭＭｇＣｌ２・Ｈ２Ｏ（Duksan）３０.９ｇ、１ｍＭＣＴＰ（Sigma）３．７２ｇ、８０〜５００ｍＭアセチルホスフェート（Sigma）８４〜５２５ｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）７Ｌ、３７℃２ＭＮａＯＨを用いてｐＨ６．５〜８．０維持）を前記実施例４において製造したシチジンモノホスフェートキナーゼ（cytidine monophosphate kinase；ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（acetate kinase；ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミンアルドラーゼ（NeuAc aldolase、ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン合成酵素（CMP-NeuAc synthetase、ＮＥＵ）及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（GlcNAc-2-epimerase）がそれぞれ固定された高分子ビーズと混合した後、反応器において攪拌して５〜１２時間反応させた。
【００８７】
前記反応上澄み液を分離、検出するためにThermo 42カラム（Thermo electron corporation）を使用し、溶出液はＡ液（１００ｍＭＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４）とＢ液（メタノール）を用いて、Ａ液（９０％）：Ｂ液（１０％）によりＨＰＬＣを実施した。その結果、約９０％の収率にてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が合成されていることを確認することができた。
【００８８】
《実施例６：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の精製》
前記実施例５において合成したＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸反応液を陰イオン交換樹脂ダウエックスヤギ型（Dowex-1×2, Cl--form）カラムの上部に注入し、塩の濃度勾配を用いて分離した。前記目的物が含まれている溶出液を再濃縮してセファデックスＧ−１０ゲル透過法を用いて塩を除去することにより高純度の最終生成物を得、これを凍結乾燥して濃縮した。各精製段階を経て最終的に８１％のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を得、ＮＭＲ及びＨＰＬＣを用いて最終収得物を確認した（図９及び図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上詳述したように、本発明は、新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を経済的に量産可能な方法を提供するという効果がある。本発明によれば、安価な基質であるシチジンモノホスフェートとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを用いて１回の反応によりＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を量産することができ、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されるため、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を低廉に生産することができる。
【００９０】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を有する請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え微生物を培養すること、及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを回収することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む反応混合物を請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの存在下で反応させること、及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを回収することを含む、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法。
【請求項８】
ピルビン酸及び請求項７に記載の方法により製造されたＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを含む反応混合物をＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼの存在下で反応させること、及びノイラミン酸を回収することを含む、ノイラミン酸の製造方法。
【請求項９】
（ｉ）シチジン５’モノホスフェート（ＣＭＰ）、（ｉｉ）ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させること、及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を回収することを含む、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）はシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は担体に固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素はそれぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１４の塩基配列によりコードされることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を有する請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え微生物を培養すること、及びＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼを回収することを含む、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む反応混合物を請求項１に記載のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの存在下で反応させること、及びＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを回収することを含む、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法。
【請求項８】
ピルビン酸及び請求項７に記載の方法により製造されたＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを含む反応混合物をＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼの存在下で反応させること、及びノイラミン酸を回収することを含む、ノイラミン酸の製造方法。
【請求項９】
（ｉ）シチジン５’モノホスフェート（ＣＭＰ）、（ｉｉ）ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰ、（ｉｉｉ）アセチルホスフェート、（ｉｖ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び（ｖ）ピルビン酸を含む反応混合物を（ａ）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（ｂ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、（ｃ）シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、（ｄ）アセテートキナーゼ及び（ｅ）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素の存在下で反応させること、及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を回収することを含む、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）またはＡＴＰはアセチルホスフェート及びアセテートキナーゼにより再生されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）はシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）であることを特徴とする請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素は担体に固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、シチジン５’モノホスフェートキナーゼ、アセテートキナーゼ及びＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素はそれぞれ配列番号１、配列番号５、配列番号８、配列番号１１及び配列番号１４の塩基配列によりコードされることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５１２７４１（Ｐ２０１０−５１２７４１Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１２１５（Ｐ２００９−５４１２１５）
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６３６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２８６１
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１６８９００）ジーン ケム インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６３６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２８６１
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０９１６８９００）ジーン ケム インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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