新規ＰＰＡＲγプロモーター配列、及びその応用
【課題】ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能な因子を含有する優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、並びに、前記因子を阻害することにより脂肪細胞の分化、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、及び炎症作用の調節が可能な、優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及び前記ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】特定な配列からなる塩基配列を有する新規ＰＰＡＲγプロモーター配列、ＰＰＡＲγを直接調節可能な優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４などの阻害を介した優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の効率的なスクリーニング方法である。
【解決手段】特定な配列からなる塩基配列を有する新規ＰＰＡＲγプロモーター配列、ＰＰＡＲγを直接調節可能な優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４などの阻害を介した優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の効率的なスクリーニング方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ＰＰＡＲγプロモーター配列、並びに、ＰＰＡＲγ発現調節剤、脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフスタイルの欧米化に伴い、糖尿病、高血圧、動脈硬化、脂質異常症などいわゆる生活習慣病が増加しており、その主要因としてメタボリックシンドロームがある。このメタボリックシンドロームは、内臓組織の脂肪細胞の増殖や脂肪の取り込みの増加などにより発症し、過剰な食事量による脂肪細胞への脂肪酸の取り込みや、それによる脂肪細胞の増殖や分化とも密接に関連している。したがって、これらを制御する因子を解明することが、生活習慣病の予防や治療に直接結びつくものと考えられる。
しかしながら、脂肪の摂取と、脂質代謝とを直接結びつける因子や、脂肪細胞の分化に関わる因子などは十分に解明されておらず、これらの分子機構の解明が強く求められている。
【０００３】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ステロイドホルモン受容体ファミリーの１種であり、哺乳動物においてＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγの３種類のサブタイプが存在することが知られている。
ＰＰＡＲは、別の転写調節因子であるＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子の上流に存在する応答配列ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、標的遺伝子の転写を制御している。前記標的遺伝子としては、内分泌代謝、糖代謝、脂質代謝、マクロファージを介する炎症反応、骨代謝の制御、発ガン機構などの遺伝子が知られている。そのため、ＰＰＡＲは、これらの疾患の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０００４】
これらの中でも、ＰＰＡＲγは、そのプロモーターに、数種のスプライスバリアントが存在することが知られており（非特許文献１参照）、数種のアイソフォームが存在する（非特許文献２〜３参照）。例えば、ＰＰＡＲγ１は、脂肪組織や免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、ＰＰＡＲγ２は、脂肪細胞で特異的な発現が認められ、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている（非特許文献４参照）。また、ＰＰＡＲγは、マウスの破骨細胞を制御するという報告（非特許文献５参照）や、炎症疾患の調節に有用であるという報告（非特許文献６参照）もある。
【０００５】
従来、ＰＰＡＲγの作用機序に大きく関わる因子としては、ＰＰＡＲγのリガンドが報告されている（非特許文献７参照）。
しかしながら、ＰＰＡＲγの発現調節は多面的に制御されているため非常に複雑であり、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することにより、脂肪細胞の増殖や分化を促進、停止、後退させる因子、破骨細胞機能を調節する因子、炎症を調節する因子などは未だ提供されておらず、ＰＰＡＲγを直接調節することが可能なＰＰＡＲγ発現調節剤、ＰＰＡＲγの調節を介した、脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆａｊａｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９７， ２７２， ｐ．１８７７９−１８７８９
【非特許文献２】Ｆａｊａｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９９８， ４３８， ｐ．５５−６０
【非特許文献３】Ｓｕｎｄｖｏｌｄ Ｈ， Ｌｉｅｎ Ｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００１， ２８， ｐ．３８３−９０
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎ ＥＤ， Ｗａｌｋｅｙ ＣＪ， Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ Ｐ， Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ＢＭ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２０００， １４， ｐ．１２９３−３０７
【非特許文献５】Ｗａｎ Ｙ， Ｃｈｏｎｇ ＬＷ， Ｅｖａｎｓ ＲＭ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００７， １３， ｐ．１４９６ − １５０３
【非特許文献６】Ｒｉｃｏｔｅ Ｍ， Ｌｉ ＡＣ， Ｗｉｌｌｓｏｎ ＴＭ， Ｋｅｌｌｙ ＣＪ， Ｇｌａｓｓ ＣＫ， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１， ｐ．７９−８２
【非特許文献７】Ｒｏｓｅｎ ＥＤ， Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ＢＭ， Ｎａｔｕｒｅ， ２００６， ４４４， ｐ．８４７−８５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能な因子を含有する優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、並びに、前記因子を阻害することにより脂肪細胞の分化、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、及び炎症作用の調節が可能な、優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及び前記ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、脂肪分化、脂質代謝、破骨細胞調節、炎症疾患などに関与するＰＰＡＲγの発現調節に着目し、ＰＰＡＲγの発現調節に関与する因子について鋭意検討した結果、ＰＰＡＲγの発現制御に係る５’非翻訳領域（プロモーター領域）に新規スプライスバリアントが存在することを知見するとともに、その新規プロモーター配列を見出し、該プロモーター領域のプロモーターレポーターシステムを樹立した。また、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能なＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を確立し、該スクリーニング方法により、ＤＢＰ、及びＴＥＦがＰＰＡＲγの遺伝子発現を促進すること、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγの発現を抑制すること、更に、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγのプロモーター領域に存在するＤ−ボックスに結合すること、ＤＢＰ、及びＴＥＦを阻害すると脂肪細胞への分化が阻害され、更にＤＢＰの遺伝子発現は脂肪細胞の分化に伴い増加すること、Ｅ４ＢＰ４を阻害すると脂肪細胞への分化が促進し、更にＥ４ＰＢ４の遺伝子発現は脂肪細胞の分化に伴い減少することを知見し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、前記５’非翻訳領域（プロモーター領域）に新規スプライスバリアントを有するＰＰＡＲγを、「ＰＰＡＲγ６」と命名した。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 配列番号：１で表される塩基配列を有することを特徴とするＰＰＡＲγプロモーター配列である。
＜２＞ 配列番号：１で表される塩基配列のうち、塩基番号１５９〜１６６、塩基番号２０２〜２０９、及び塩基番号２１８〜２２５を少なくとも有する前記＜１＞に記載のＰＰＡＲγプロモーター配列である。
＜３＞ ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜４＞ ＰＰＡＲγの発現促進作用を有する前記＜３＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜５＞ ＰＰＡＲγの発現促進作用を有する因子が、ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかである前記＜４＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜６＞ ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有する前記＜３＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜７＞ ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有する因子が、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかである前記＜６＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜８＞ ＰＰＡＲγの発現調節作用が、ＰＰＡＲγプロモーター配列に結合することによる前記＜３＞から＜７＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜９＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列を有する前記＜８＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜１０＞ ＰＰＡＲγの発現調節作用が、配列番号：１で表される塩基配列中のＤ−ボックスに結合することによる前記＜３＞から＜９＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜１１＞ ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することを特徴とする脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１２＞ 阻害が、ｍｉＲＮＡによる前記＜１１＞に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１３＞ ｍｉＲＮＡの配列が、配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記＜１２＞に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１４＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
＜１５＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列を有する前記＜１４＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
＜１６＞ プロモーターレポーター遺伝子のＰＰＡＲγプロモーター配列が、該ＰＰＡＲγプロモーター配列が有する３箇所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失した欠失変異体である前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、
ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能な因子を含有する優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、並びに、前記因子を阻害することにより脂肪細胞の分化、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、及び炎症作用の調節が可能な、優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及び前記ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＰＰＡＲγ遺伝子のエクソン・イントロン構造を模式的に表した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＰＰＡＲγ遺伝子の６種のスプライスバリアントを模式的に表した図である。
【図２】図２は、ＰＰＡＲγ６のプロモーター構造、及びＤ−ボックスを模式的に表した図である。
【図３】図３は、ＤＢＰ発現ベクターを一過性に発現させたＣａｃｏ−２細胞における、ＤＢＰ、及びＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡ量を表した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＴＥＦのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＬＦのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｅ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６のプロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＰＡＲγ６プロモーターの欠失変異体のコンストラクトを模式的に表した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６のプロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターの欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６のプロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６のプロモーター欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のコンストラクトを模式的に表した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｅ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＢＰに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＴＥＦに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＨＬＦに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、Ｅ４ＢＰ４に対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＤＢＰの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＴＥＦの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ＨＬＦの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｈ】図７Ｈは、Ｅ４ＢＰ４の、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図８】図８は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の脂肪細胞分化への影響を、ＲＮＡｉで解析した図である。
【図９Ａ】図９Ａは、脂肪細胞分化におけるＤＢＰのｍＲＮＡの発現量の変化を表した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、脂肪細胞分化におけるＥ４ＢＰ４のｍＲＮＡの発現量の変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（新規ＰＰＡＲγプロモーター配列）
本発明の新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列を有する。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、５’非翻訳領域が、既知のＰＰＡＲγの配列と異なる、本発明者らが見出したＰＰＡＲγの新規スプライスバリアント（図１Ｂ参照）の発現を制御するプロモーター配列である。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列のみからなる塩基配列であることが好ましいが、そのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列であってもよく、配列番号：１で表される塩基配列に、更にその他の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる場合、その一部の塩基配列としては、ＰＰＡＲγのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１で表される塩基配列の、塩基番号１５９〜１６６、塩基番号２０２〜２０９、及び塩基番号２１８〜２２５を有することが好ましい。
前記その他の塩基配列としても、ＰＰＡＲγのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列に、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００１３】
＜新規スプライスバリアント＞
ヒトＰＰＡＲγの遺伝子配列は、図１Ａに示すように、１０個のエクソン（Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、Ｂ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、及びＥ６）を有する。このうち、Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、及びＢは、非翻訳領域であり、前記Ｅ１〜Ｅ６が翻訳されることによりＰＰＡＲγのタンパク質を形成する。
前記ヒトＰＰＡＲγの発現調節は、そのプロモーターにより制御されているが、前記ヒトＰＰＡＲγの５’非翻訳領域に存在するプロモーターには、従来、５種のスプライスバリアント（ＰＰＡＲγ１〜５）が存在することが知られていた（図１Ｂ参照）。前記５’非翻訳領域には、４つのエクソン（Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、及びＢ）が存在し、これらの４つのエクソンが選択的スプライシングを受けることにより、スプライスバリアントが形成される（図１Ａ、及び図１Ｂ参照）。
既知のスプライスバリアントとしては、図１Ｂに示すように、５’非翻訳領域がＡ１、及びＡ２からなるＰＰＡＲγ１、５’非翻訳領域がＢからなるＰＰＡＲγ２、５’非翻訳領域がＡ２からなるＰＰＡＲγ３、５’非翻訳領域にいずれのエクソンも有さないＰＰＡＲγ４、及び５’非翻訳領域がＣ１Ｃ２からなるＰＰＡＲγ５が存在する。
本発明者らは、これらの既知のスプライスバリアントとは全く異なる、５’非翻訳領域がＣ１Ｃ２、及びＡ２からなるヒトＰＰＡＲγが存在することを見出し（図１Ｂ参照）、「ＰＰＡＲγ６」と命名した（以下、「ＰＰＡＲγ６」と称することがある）。
【００１４】
前記ＰＰＡＲγ６が、新規スプライスバリアントを有するか否かを解析する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エクソンＣ１Ｃ２からエクソンＥ１にかけてのＰＣＲ産物のサイズ、及び配列決定などにより解析する方法などが挙げられる。
【００１５】
前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列が、ＤＮＡ結合配列を有するか否かを解析する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）により解析する方法などが挙げられる。
【００１６】
前記ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）による解析の結果、前記Ｃ１Ｃ２は、後述するＤＢＰ（Ａｌｂｕｍｉｎ ｇｅｎｅ Ｄ−ｓｉｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｄ部位結合タンパク質）の結合配列であるＤ−ボックスが３箇所（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）存在していた（図２参照）。
マウス及びヒトの、プロモーター領域及びエクソン１領域の配列についてＤＮＡ解析ソフトＧｅｎｅＷｏｒｋｓでアライメントを行い、前記領域の塩基配列に相同性が高いことを確認した。これらの解析結果より、前記Ｄ−ボックスは、種間で極めてよく保存されていることが明らかとなった。
【００１７】
（ＰＰＡＲγ発現調節剤）
本発明のＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１８】
＜ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４＞
−ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＨＬＦ−
前記ＤＢＰ、前記ＴＥＦ（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：甲状腺刺激ホルモン分泌細胞胎児性因子）、及び前記ＨＬＦ（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｆａｃｔｏｒ：肝白血病要因遺伝子）は、ＰＡＲ−ｂＺＩＰ（ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ ｂａｓｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）転写因子ファミリーに属するタンパク質である（Ｗｕａｒｉｎ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ Ｓｕｐｐｌ， １９９２， ６， ｐ．１２３−１２７）。前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーは、ホモあるいはヘテロダイマーを形成して、プロモーター領域にあるＤ−ボックス（ＲＴＴＡＹＧＴＡＡＹ）に結合し、転写活性化に働くことが知られている（Ｋｈａｔｉｂ ＺＡ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９４， １２３， ｐ．３４４−５１）。前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーは、哺乳類の概日リズムを制御する因子として知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）が、脂肪細胞の分化などを含め、他の機能に関しては全く報告がない。
【００１９】
−Ｅ４ＢＰ４−
前記Ｅ４ＢＰ４（アデノウイルスＥ４プロモーター結合蛋白４）は、ｂＺＩＰ転写因子ファミリーに属するタンパク質である。前記ｂＺＩＰファミリーは、前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーと同様に、プロモーター領域にあるＤ−ボックスに結合し、転写抑制化に働くことが知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｏ Ｔ， Ｉｓｈｉｄａ Ｙ， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）。前記Ｅ４ＢＰ４も、前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーと同様に、哺乳類の概日リズムを制御する因子として知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｏ Ｔ， Ｉｓｈｉｄａ Ｙ， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）が、脂肪分化における作用などを含め、他の機能に関しては全く報告がない。
【００２０】
−入手方法−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中に含まれる、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がタンパク質の状態である場合、例えば、市販品を用いる方法、培養細胞より精製する方法、遺伝子組換え技術により組換体タンパク質を得る方法、無細胞系を用いた真核生物由来タンパク質合成の方法などが挙げられるが、これらの中でも無細胞系を用いた真核生物由来タンパク質合成の方法により得ることが、可溶性、及び機能タンパク質を迅速に合成できる点で好ましい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がｃＤＮＡの状態である場合、例えば、市販品を用いる方法、ｃＤＮＡを合成する方法、ｃＤＮＡライブラリーからクローニングする方法などが挙げられるが、これらの中でもｃＤＮＡを合成する方法により得ることが、迅速に取得できる点で好ましい。
【００２１】
−含有量−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかそのものであってもよい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＰＡＲγの発現を促進する目的で用いられる場合と、ＰＰＡＲγの発現を抑制する目的で用いられる場合とで、前記含有比率を変えることが好ましい。
【００２２】
−−ＰＰＡＲγの発現促進作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤−−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を促進する目的で用いられる場合、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としては、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかが、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡより多く含有されていることが好ましく、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかのみ含有されていることがより好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかであると、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤によるＰＰＡＲγの発現促進作用が強い点で有利である。
なお、ＰＰＡＲγの発現促進作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤を、ＰＰＡＲγ発現促進剤として使用することができる。
【００２３】
−−ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤−−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を抑制する目的で用いられる場合、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としては、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかが、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡより多く含有されていることが好ましく、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかのみ含有されていることがより好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかであると、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤によるＰＰＡＲγの発現抑制作用が強い点で有利である。
なお、ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤を、ＰＰＡＲγ発現抑制剤として使用することができる。
【００２４】
＜ＰＰＡＲγの発現調節作用＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を調節する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγのプロモーター配列に結合することによりＰＰＡＲγの発現を調節することが好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が結合するプロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列であることが好ましく、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の少なくともいずれかに結合することがより好ましく、前記Ｄ２に結合することが更に好ましく、前記３箇所のＤ−ボックス全てに結合することが特に好ましい。
前記３箇所のＤ−ボックス全てに結合すると、ＰＰＡＲγの発現を顕著に促進又は抑制できる点で好ましい。
前記結合を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲルシフトアッセイ、チップアッセイ（ＣｈＩＰ ａｓｓａｙ）などが挙げられる。
【００２５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
＜使用＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用してもよい。また、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００２７】
＜剤型＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００２８】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかに、賦形剤、及び必要に応じて前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２９】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれか、及び必要に応じて前記その他の成分に、添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３０】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれか、及び必要に応じて前記その他の成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３１】
＜投与＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００３２】
＜用途＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有することから、脂肪細胞への分化の調節、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、炎症の調節などに好適に利用可能である。
【００３３】
（脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤）
本発明の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害する因子を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することにより、ＰＰＡＲγの発現を促進又は抑制し、脂肪分化調節作用、脂質代謝調節作用、破骨細胞機能調節作用、及び炎症調節作用を発揮することが好ましい。
【００３４】
＜阻害する因子＞
前記阻害する因子としては、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍｏｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）などが挙げられるが、これらの中でも、ｍｉＲＮＡが、完全に相補的でない場合でも翻訳阻害を引き起こすことができる点、及びＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）として利用できる配列の範囲が広い点で好ましい。
本発明において、前記ｍｉＲＮＡは、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＤＮＡに置換されているものであってもよく、ＲＮＡとＤＮＡとのキメラであってもよく、前記ｍｉＲＮＡを発現し得る分子であってもよい。
前記ｍｉＲＮＡを発現し得る分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡをＤＮＡに置換した塩基配列を有するベクターなどが挙げられる。
【００３５】
−ｍｉＲＮＡ−
前記ｍｉＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列を有することが好ましい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記配列番号：２〜３３で表される塩基配列などが挙げられる。
前記阻害する因子中のｍｉＲＮＡは、配列番号：２〜３３で表される塩基配列全てを有していてもよいが、発現を阻害する遺伝子の種類によって、下記塩基配列を選択することが好ましい。
また、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列の由来する生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ヒトなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトの配列であることが、前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤をヒトに用いる場合、抗原性を有さない点で好ましい。
【００３６】
前記ＤＢＰの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２〜５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＵＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＣＧＧＣＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＵＣＵＵ （配列番号：２）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＵＣＵＵＧＣＡＧＣＵＣＣＵＣＵＵ （配列番号：３）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：４）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：５）
【００３７】
前記ＤＢＰの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：６〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＧＵＵＣＧＣＧＧＣＵＣＧＧＣＵＵ （配列番号：６）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＧＧＧＵＵＣＧＵＧＣＧＧＣＵＣＧＧＣＵＵ （配列番号：７）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴ （配列番号：８）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴ （配列番号：９）
【００３８】
前記ＴＥＦの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１０〜１３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＣＡＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１０）
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＵＧＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１１）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１２）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１３）
【００３９】
前記ＴＥＦの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１４〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＣＧＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＵＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１４）
ＵＵＵＡＧＣＵＧＡＣＧＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１５）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１６）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１７）
【００４０】
前記ＨＬＦの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１８〜２１で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＣＡＵＣＣＵＧＡＡＧＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＵＣＡＧＧＡＵＧ （配列番号：１８）
ＣＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＡＧＧＡＵＧ （配列番号：１９）
ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧ （配列番号：２０）
ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧ （配列番号：２１）
【００４１】
前記ＨＬＦの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２２〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＧＵＧＧＵＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵ （配列番号：２２）
ＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＵＣＧＵＧＧＵＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵ （配列番号：２３）
ＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴ （配列番号：２４）
ＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴ （配列番号：２５）
【００４２】
前記Ｅ４ＢＰ４の遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２６〜２９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＵＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＵＵＧＵＵＣＵＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＧＡＡＣＡＵＵＣＣＣＵＧＵＧＡＵ （配列番号：２６）
ＡＵＣＡＣＡＧＧＧＡＡＵＧＵＵＣＵＣＡＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＵＧＡＧＡＡＣＡＡＧＵＵＣＣＣＵＧＵＧＡＵ （配列番号：２７）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２８）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２９）
【００４３】
前記Ｅ４ＢＰ４の遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：３０〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＵＡＡＵＣＵＧＧＡＡＣＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＣＡＧＡＵＵＡＵ （配列番号：３０）
ＡＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＵＣＣＡＧＡＵＵＡＵ （配列番号：３１）
ＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴ （配列番号：３２）
ＡＴＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴ （配列番号：３３）
【００４４】
前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡは、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の全体からなる塩基配列であることが、発現阻害効率が高い点で好ましいが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の一部からなる配列であってもよい。
前記ｍｉＲＮＡが、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の一部からなる配列である場合、その一部の塩基配列としては、前記ｍｉＲＮＡが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ｍｉＲＮＡは、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかの１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００４５】
−−入手方法−−
前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、合成による方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００４６】
−−含有量−−
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤中の、前記ｍｉＲＮＡの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ｍｉＲＮＡが、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかである場合、その含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合で、前記含有比率を変えることが好ましい。
【００４７】
−−−ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡが、配列番号：１０〜３３で表される塩基配列を有する前記ｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：６〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡである場合、配列番号：２〜９で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
−−−ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜９で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡ、及び配列番号：１８〜３３で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：１４〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
−−−ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜１７で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡ、及び配列番号：２６〜３３で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：２２〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
−−−Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜２５で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡそのものがより好ましく、配列番号：３０〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
＜阻害活性＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：２〜３３を用いたＲＮＡｉにより確認する方法などが挙げられる。
前記ＲＮＡｉに用いる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脂肪細胞前駆細胞株である３Ｔ３−Ｌ１細胞、マクロファージ由来の細胞株であるＲＡＷ２６４細胞、骨髄由来マスト細胞ｍＢＭＭＣｓなどが挙げられる。
前記３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた場合、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかによりＲＮＡｉを行った前記３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪滴の数と、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列を導入していない前記３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪滴の数とを比較することで、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害活性を確認することができる。
【００５２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤中の、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
＜使用＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、１種単独で使用されてもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５４】
＜剤型＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００５５】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡに、賦形剤、及び必要に応じて前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５６】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡ、及び必要に応じて前記その他の成分に、添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５７】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡ、及び必要に応じて前記その他の成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５８】
＜投与＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００５９】
＜用途＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害作用を有することから、医薬、健康食品、機能性食品などに好適に利用可能である。
【００６０】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００６１】
＜レポーター遺伝子構築工程＞
前記レポーター遺伝子構築工程は、ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するプロモーターレポーター遺伝子を構築する工程である。
【００６２】
−ＰＰＡＲγプロモーター配列−
前記ＰＰＡＲγプロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前述した配列番号：１で表される塩基配列を有するＰＰＡＲγ６プロモーター配列を用いることが好ましい。
なお、本発明のスクリーニング方法に用いる前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、前述した配列番号：１で表される塩基配列の全体からなる塩基配列を用いてもよいし、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列を用いてもよく、配列番号：１で表される塩基配列中に存在する３ヵ所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失させた欠失変異体を用いてもよい。
前記Ｄ−ボックスの欠失変異体を、前記スクリーニング方法に用いると、前記被験物質とＤ−ボックスとの関係が明らかにできる点で有利である。
【００６３】
前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトゲノミックＤＮＡを鋳型に用い、下記配列番号：３４〜３５で表される塩基配列をプライマーとしてＰＣＲにより増幅する方法などが挙げられる。
プライマー配列
ＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ （配列番号：３４）
ＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡ （配列番号：３５）
【００６４】
−レポーター遺伝子−
前記レポーター遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
前記ルシフェラーゼの遺伝子配列の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から入手する方法、ＮＣＢＩなどのデータベースから入手する方法などが挙げられる。
【００６５】
−−構築方法−−
前記プロモーターレポーター遺伝子を構築する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ルシフェラーゼ遺伝子を有する前記ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、及び前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＰＣＲ産物を制限酵素処理し、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＰＣＲ産物をクローニングすることにより構築する方法などが挙げられる。
なお、前記ルシフェラーゼは安定性の高いタンパク質であるため、プロモーター活性の変動（増減）をモニターし難いことがある。そのため、前記ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃは、ルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端にＰＥＳＴ配列（プロリン、グルタミン酸、セリン、及びスレオニンに富む配列）を導入させた配列であることが、細胞内におけるルシフェラーゼの分解を促進できる点で好ましい。
【００６６】
＜導入工程＞
前記導入工程は、前記プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する工程である。
【００６７】
−被験試料−
前記被験試料とは、少なくとも被験物質を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００６８】
−−被験物質−−
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、発現ベクターにクローニングされた遺伝子であることが好ましい。
前記発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
【００６９】
−−その他の成分−−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、ＰＢＳ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）などが挙げられる。
【００７０】
−細胞−
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃａｃｏ２細胞などが挙げられる。
なお、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、マウス胎児皮膚由来細胞株であり、前記ＨｅｐＧ２細胞は、ヒト肝ガン由来細胞株であり、前記Ｃａｃｏ２細胞は、ヒト結腸由来細胞株である。
前記細胞の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭなどが挙げられる。
前記細胞の培養条件としては、特に制限はなく、細胞の種類に応じて適宜選択することができるが、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び前記ＨｅｐＧ２細胞の場合は、１０質量％ＦＢＳ（ウシ胎児結成）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ２が好ましく、前記Ｃａｃｏ２細胞の場合は、２０質量％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、３７℃、５％ＣＯ２が好ましい。
【００７１】
−導入方法−
前記プロモーターレポーター遺伝子と、前記被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられるが、これらの中でもリポフェクション法が、簡単で導入効率が高い点で好ましい。
前記プロモーターレポーター遺伝子の導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｎｇ〜２０ｎｇが好ましく、１０ｎｇ〜１５ｎｇがより好ましい。
前記被験物質が、遺伝子である場合、その導入量としては、特に制限はなく、遺伝子の種類、発現ベクターの種類などに応じて適宜選択することができるが、６２．５ｎｇ〜１，０００ｎｇが好ましく、１００ｎｇ〜２００ｎｇがより好ましい。
前記細胞に、前記プロモーターレポーター遺伝子、及び被験物質を導入する時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記遺伝子の導入量を一定にするため、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることが好ましい。
【００７２】
＜検出工程＞
前記検出工程は、前記プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する工程である。
【００７３】
前記レポーター活性を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、前記ルシフェラーゼを反応させ、ルミノメーター（例えば、Ｍｏｄｅｌ ＴＤ−２０／２０（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社製））により検出する方法などが挙げられる。
前記ルシフェラーゼは、前記ＰＰＡＲγプロモーターの制御下で発現するため、前記ルシフェラーゼのレポーター活性を検出することで、前記ＰＰＡＲγのプロモーター活性を検出することができる。
【００７４】
＜スクリーニング工程＞
前記スクリーニング工程は、前記被験物質を含む被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする工程である。
【００７５】
前記ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記レポーター活性の強度を比較する方法などが挙げられる。
前記レポーター活性の強度を比較する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験試料を導入せず、プロモーターレポーター遺伝子のみを導入した細胞をコントロールとし、該コントロールと、被験試料、及びプロモーターレポーター遺伝子を導入した細胞とを比較して、前記被験試料、及びプロモーターレポーター遺伝子を導入した細胞のレポーター活性が、前記コントロールのレポーター活性より強い場合、前記被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする方法、前記コントロールと比較せず、前記被験物質を含む被験試料間のレポーター活性の強度の違いにより、レポーター活性が強い前記被験試料中の被験物質を、より強いＰＰＡＲγ発現調節作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする方法などが挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１：新規ＰＰＡＲγプロモーター配列の解析）
新規ＰＰＡＲγであるＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、新規スプライスバリアントｃＤＮＡの５’配列を元に転写開始点を決定し、第１エクソン（Ｃ１Ｃ２）（図１Ｂ）を有する上流領域を、下記方法により解析した。
【００７８】
＜ＰＰＡＲγ６プロモーター配列の増幅＞
ヒトゲノミックＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型に用いて、下記配列番号：３４〜３５で表される塩基配列をプライマーとして用い、９６℃・３０秒間、６２℃・３０秒間、７２℃・９０秒間を３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列を増幅した。前記ＰＰＡＲγ６プロモーター領域の長さは、約１ｋｂであった。
前記ＰＰＡＲγ６プロモーター配列のＰＣＲ産物は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＴＡ法でクローニングした（以下、「ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１」と称することがある。）。
【００７９】
プライマー配列
ＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ （配列番号：３４）
ＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡ （配列番号：３５）
【００８０】
＜ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列の解析＞
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ シーケンサー（アプライドバイオシステム社製）によりシーケンスをいった。シーケンスの結果から明らかになった配列について、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｃＤＮＡ、及びＥＴＳデータベースにて検索を行い、スプライシングパターンを決定した。その結果、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列は、ＰＰＡＲγの新規スプライスバリアントである、配列番号：１で表される塩基配列を有することが明らかとなった。
【００８１】
＜ＰＰＡＲγ６プロモーター領域のＤＮＡ結合配列予測解析＞
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１を用い、ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＤＮＡ結合配列予測解析を、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）により行った。
その結果、ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、Ｃ１Ｃ２領域に、３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）を有することが確認された（図２）。前記Ｄ−ボックスは、配列番号：１で表される塩基配列のうち、塩基番号１５９〜１６６（Ｄ１）、塩基番号２０２〜２０９（Ｄ２）、及び塩基番号２１８〜２２５（Ｄ３）に存在する。なお、図２中、ＴＳＳは、転写開始領域（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｓｔａｒｔ Ｓｉｔｅ）を示す。
【００８２】
（実施例２：ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の発現調節）
ＤＢＰがＰＰＡＲγ６の発現を調節しているか否かを、以下の方法を用いて調べた。
【００８３】
＜方法＞
−Ｃａｃｏ−２細胞の培養−
Ｃａｃｏ−２細胞（細胞株バンクＡＴＣＣ）を、２４ウエルプレートに５×１０５細胞／プレート播種し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。
【００８４】
−ＤＢＰ発現ベクターの構築−
ＤＢＰ遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＤＢＰ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ」と称することがある）。
【００８５】
−トランスフェクション−
前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ １２５ｎｇ、及びコントロールとしてＤＢＰをクローニングしていないｐｃＤＮＡ３．１ベクターのいずれかを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて前記Ｃａｃｏ−２細胞へトランスフェクションし、前記ＤＢＰを、前記Ｃａｃｏ−２細胞に一過性に過剰発現させた。前記Ｃａｃｏ−２細胞は、後述するｍＲＮＡの定量までの間、ＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１日間培養した。
【００８６】
−ｍＲＮＡの定量−
前記ＤＢＰを過剰発現させたＣａｃｏ−２細胞、及びコントロールのＣａｃｏ−２細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（（株）日本ジーン製）を用いてＲＮＡ抽出、及び精製を行い、ＤＢＰのｍＲＮＡ量、及びＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
【００８７】
＜結果＞
図３に前記ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
図３より、ＤＢＰのｍＲＮＡの発現量は、コントロールと比較して有意に高く、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰをトランスフェクションしたＣａｃｏ−２細胞では、ＤＢＰが過剰発現されていることが確認された。
ＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡの発現量は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰをトランスフェクションし、ＤＢＰを過剰発現したＣａｃｏ−２細胞では、コントロールのＣａｃｏ−２細胞と比較して有意に増加していた。
これらの結果より、ＰＰＡＲγ６の発現は、ＤＢＰにより促進されたことが示唆される。
【００８８】
（実施例３：ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６の転写制御）
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、ＰＰＡＲγ６の転写を制御しているか否かについて、以下のレポーターシステムにより調べた。
【００８９】
＜方法＞
−ＤＢＰ発現ベクターの構築−
ＤＢＰ遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＤＢＰ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ」と称することがある）。
【００９０】
−ＴＥＦ発現ベクターの構築−
ＴＥＦ遺伝子を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＴＥＦ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ」と称することがある）。
【００９１】
−ＨＬＦ発現ベクターの構築−
ＨＬＦ遺伝子を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＴＡクローニング法によって、前記ｐＣＲ３．１ベクターに、前記ＨＬＦ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ」と称することがある）。
【００９２】
−Ｅ４ＢＰ４発現ベクターの構築−
Ｅ４ＢＰ４遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＢａｍＨＩ、及びＫｐｎＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３ベクターに、前記Ｅ４ＢＰ４遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４」と称することがある）。
【００９３】
−プロモーターレポーター遺伝子の構築−
−−ｐＧＬ３−ｄｌｕｃの構築−−
ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、ルシフェラーゼをコードする遺伝子のＣ末端に相当する領域をＥｃｏＲＶ、及びＸｂａＩで制限酵素処理することにより、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ中のルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端に、ＰＥＳＴ配列を導入した（以下、「ｐＧＬ３−ｄｌｕｃ」と称することがある。）。
【００９４】
−−ｐＧＬ３−ｄｌｕｃへのＰＰＡＲγ６プロモーター配列のサブクローニング−−
実施例１のｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１と、前記ｐＧＬ３−ｄｌｕｃとを、ＫｐｎＩ、及びＢｇｌＩＩ（共に（株）日本ジーン製）で制限酵素処理し、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列をｐＧＬ３−ｄｌｕｃにサブクローニングすることにより、プロモーターレポーター遺伝子（以下、「ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ」と称することがある）を構築した。
【００９５】
−細胞の培養−
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（理化学研究所提供）を、３５ｍｍプレートに１×１０５細胞／プレート播種し、１０質量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【００９６】
−導入−
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃと、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ、前記ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ、及び前記ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４のいずれかとを、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｔｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造元の方法に従い、トランスフェクションした。
なお、前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃは、１０ｎｇトランスフェクションに用いた。前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰは０ｎｇ〜１，０００ｎｇの濃度で、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦは０ｎｇ〜５００ｎｇの濃度で、前記ｐＣＲ３．１−ＨＬＦは０ｎｇ〜５００ｎｇの濃度で、前記ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４は０ｎｇ〜１，０００ｎｇの濃度でそれぞれトランスフェクションを行った。
トランスフェクション２４時間後に、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｍｅｇａ社製）を導入した。導入遺伝子量を一定にする為、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
なお、トランスフェクション効率は、前記ｐＲＬ−ＴＫにより確認した。
導入後、１０質量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【００９７】
−検出−
前記ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造元の方法に従い、前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃより発現したルシフェラーゼを反応させた。
前記ルシフェラーゼ活性（レポーター活性）の測定は、ルミノメーターＭｏｄｅｌ ＴＤ−２０／２０（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社製）を用いて行った。
【００９８】
＜結果＞
ルシフェラーゼ活性の測定結果を、図４Ａ〜Ｄに示す。
図４Ａより、ＤＢＰは、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の増加が認められ、その活性は、ＤＢＰを５００ｎｇ導入したときに最も高かった。また、図４Ｂより、ＴＥＦもＤＢＰと同様に、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の増加が認められた。これらの結果より、ＤＢＰ、及びＴＥＦは、ＰＰＡＲγ６プロモーター活性を促進することが認められた。
図４Ｃ〜Ｄより、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４は、ＤＢＰ、及びＴＥＦとは反対に、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の低下が認められた。これらの結果より、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４は、ＰＰＡＲγ６プロモーター活性を抑制することが認められた。
ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＨＬＦは、同じＰＡＲ−ｂＺＩＰファミリーに属する転写因子であるが、ＰＰＡＲγ６に対する活性は異なるものであることが示唆された。
【００９９】
（実施例４：ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの結合部位）
ＤＢＰが、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域のどの部位を介してＰＰＡＲγ６の転写活性化を行っているか、ＰＰＡＲγ６プロモーター領域を欠失させた数種の欠失変異体を用いて、下記方法により検討を行った。
【０１００】
−欠失変異体の作製−
前記欠失変異体は、実施例２で作製したｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、製造元の方法に従い、下記表１に示すコンストラクト１〜１０を作製した（図５Ａ）。
下記表１は、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＣ１Ｃ２の５’末端を、転写開始点、即ち「０」とし、Ｃ１Ｃ２の転写開始点より上流の塩基数を「−」で示し、Ｃ１Ｃ２の転写開始点より下流の塩基数を「＋」で示した。なお、Ｃ１Ｃ２は、全長２９７ｂである。
コンストラクト１は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列全長を有する野生型である。コンストラクト２〜５は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列の上流、即ち５’末端を欠失させた欠失変異体である。コンストラクト６は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを欠失させた欠失変異体である。コンストラクト７〜９は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックス、及び５’末端を欠失させた欠失変異体である。コンストラクト１０（ネガティブコントロール）は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列を導入していない、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのみのコンストラクトである。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
−ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養−
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（理化学研究所提供）を、３５ｍｍディッシュに、１×１０６細胞／ディッシュ播種し、ＤＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【０１０３】
−導入−
前記コンストラクト１〜１０のいずれかをそれぞれ１０ｎｇと、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ １２５ｎｇとを、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、２４時間後に、１００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に２時間後に、０．１ｍＭルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含むＤＭＥＭに交換し、Ｋｒｏｎｏｓ（Ａｔｔｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼ活性を１０分間ごとに測定した。
なお、コントロールとしては、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰを導入せず、コンストラクト１〜１０のいずれかのみを導入したサンプルを用いた。前記コントロールのルシフェラーゼ活性が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性を示すものとする。
【０１０４】
−結果−
結果を、図５Ｂ〜Ｃに示す。
図５Ｂ〜Ｃより、コンストラクト１のルシフェラーゼ活性は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰにより基礎転写活性の約２倍になっており、ＰＰＡＲγ６のプロモーター活性がＤＢＰにより顕著に活性化されたことが認められた。このＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化は、Ｃ１Ｃ２より上流を欠失したコンストラクト２〜５においても認められた（図５Ｂ）。Ｃ１Ｃ２が一部欠失したコンストラクト４〜５では、コンストラクト１〜３と比較して、わずかにＰＰＡＲγ６のプロモーター活性が低かったが、いずれも各コントロール（ＤＢＰ（−））と比較して、ＰＰＡＲγ６の転写は活性化されていることが認められた。
一方、Ｃ１Ｃ２より上流は欠失せず、Ｃ１Ｃ２に存在するＤ−ボックス部位のみを欠失したコンストラクト６では、ＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性が完全に消失し、そのレベルは、コンストラクト１０（ネガティブコントロール）と同程度であった。更に、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化も認められなかった（図５Ｃ）。また、コンストラクト７〜９において、Ｃ１Ｃ２のＤ−ボックス部位を欠失させ、更にＣ１Ｃ２より上流を欠失させた場合も、ＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性は完全に消失し、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化も認められなかった（図５Ｃ）。
【０１０５】
これらの結果より、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化には、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列のＣ１Ｃ２に存在するＤ−ボックスが重要であり、ＤＢＰは、Ｄ−ボックスを介してＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化、即ちＰＰＡＲγ６の発現を促進していることが示唆された。
【０１０６】
（実施例５：ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４による、Ｄ−ボックスを介したＰＰＡＲγ６の転写制御）
実施例４の結果、ＤＢＰはＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在するＤ−ボックスに作用していることが認められた。実施例１のＰＰＡＲγ６プロモーター配列解析の結果、ＰＰＡＲγ６プロモーターには３箇所Ｄ−ボックスが存在することが明らかとなっていることから、これらの３箇所のＤ−ボックスと、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４との関係について、下記方法により検討を行った。
【０１０７】
＜方法＞
実施例４のコンストラクト５（５’末端：＋１２６、３’末端：＋２９７）を用い、実施例４と同様の方法により、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ＰＰＡＲγ６プロモーターの３箇所のＤ−ボックスの全部又は一部を欠失させた下記表２、及び図６Ａに示すコンストラクト１１〜１５を作製した。
下記表２の「○」は、Ｄ−ボックスを有する箇所を示し、「×」は、Ｄ−ボックスを欠失した箇所を示す。
前記コンストラクト１１〜１５のいずれかをそれぞれ１０ｎｇと、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ ２５０ｎｇ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４ ４００ｎｇのいずれかとを、実施例４と同様の方法で、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
なお、コントロールとしては、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４を導入せず、コンストラクト１１〜１５のいずれかのみを導入したサンプルを用いた。前記コントロールのルシフェラーゼ活性が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性を示すものとする。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
＜結果＞
図６ＢにＤＢＰの結果を、図６ＣにＥ４ＢＰ４の結果を示す。なお、図６Ｂ、及び図６Ｃ中、「＊＊」は、ｔ−検定によるｐ値が、ｐ＜０．０１を示し、「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。
【０１１０】
−ＤＢＰ−
ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを有するコンストラクト１１は、ＤＢＰによりＰＰＡＲγ６プロモーターを活性化し、その活性は、コントロール（基礎転写活性）の約２倍であった（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ２、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１２では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性に変化はなかったが、ＤＢＰ存在下では、コンストラクト１１と比較して、ＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化の強度が弱かった。また、コントロール（基礎転写活性）と比較して、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化は認められたものの、その活性化強度は弱かった（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１３では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下のコンストラクト１１と比較しても、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化の強度は弱かった。しかし、コンストラクト１３のコントロールと比較して、ルシフェラーゼの発現量は約２倍以上であり、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの強い活性化が認められた（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ２の両方を欠失させたコンストラクト１４も、コンストラクト１３の結果と同様であり、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下のコンストラクト１１と比較しても、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の活性化の強度は弱かった。しかし、コンストラクト１４のコントロールと比較して、ルシフェラーゼの発現量は約２倍以上であり、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６のプロモーターの活性化が認められた（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１〜Ｄ３の全てを欠失させたコンストラクト１５では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下でもルシフェラーゼの発現レベルは、コンストラクト１５のコントロールと同レベルであったことから、ＤＢＰによるＰＰＡＲγプロモーターの活性化が完全に消失していることが認められた（図６Ｂ）。
【０１１１】
−Ｅ４ＢＰ４−
ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを有するコンストラクト１１は、Ｅ４ＢＰ４によりＰＰＡＲγ６プロモーター活性を抑制し、その活性は、コントロール（基礎転写活性）の約１／２であった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ２、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１２では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性に変化はなく、Ｅ４ＢＰ４存在下でも、コンストラクト１１と比較して変化は認められなかった。即ち、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が認められ、その活性は、コンストラクト１２のコントロールの約１／２であった。（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１３では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、コンストラクト１３のコントロールと比較して、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が弱かった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ２の両方を欠失させたコンストラクト１４も、コンストラクト１３の結果と同様であり、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、コンストラクト１４のコントロールと比較して、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が弱かった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１〜Ｄ３の全てを欠失させたコンストラクト１５では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、Ｅ４ＢＰ４存在下でもルシフェラーゼの発現レベルは、コンストラクト１５のコントロールと同レベルであったことから、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγプロモーター活性の抑制が完全に消失していることが認められた（図６Ｃ）。
【０１１２】
実施例５の結果から、ＰＰＡＲγ６の転写調節は、主に、基礎転写活性に係る転写開始点上流配列約７００ｂと、ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーによって転写調節を受ける転写開始点より下流の３箇所のＤ−ボックスを有する配列とによって行われていることが明らかになった。
更に、ＤＢＰによって正に、Ｅ４ＢＰ４によって負に制御を受ける、Ｄ−ボックスを介した転写調節システムを有することが示された。
また、３箇所のＤ−ボックスによって、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４による転写調節が行われていることが明らかになったことから、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在するＤ−ボックスの有無によって、ＰＰＡＲγ６の転写調節作用がＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４を介するものであるかどうかを判定出来る可能性が示唆された。
【０１１３】
（実施例６：ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６のＤ−ボックスへの結合能）
実施例２〜３より、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγ６の転写活性に関与することが示唆され、更に実施例４〜５より、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６の転写制御は、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域に存在するＤ−ボックスが重要であることが示唆された。
そこで、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域に存在するＤ−ボックスに直接結合するか否かについて、ゲルシフトアッセイにより検討を行った。
【０１１４】
＜方法＞
−プローブの作製−
ゲルシフトアッセイは、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在する３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の配列をもとに、Ｄ１に対するプローブとしては、下記配列番号：３６で表される２本鎖プローブを、Ｄ２に対するプローブとしては、下記配列番号：３７で表される２本鎖プローブを、Ｄ３に対するプローブとしては、下記配列番号：３８で表される２本鎖プローブを作製した。配列番号：３６〜３８で表されるプローブの下線は、Ｄ−ボックスを示す。前記プローブに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−３２Ｐ ＡＴＰを５’末端に導入して標識した。
ＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＡ （配列番号：３６）
ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡ （配列番号：３７）
ＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴ （配列番号：３８）
【０１１５】
−タンパク質の合成−
ゲルシフトアッセイに用いるタンパク質は、実施例３で構築したｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ、ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４を鋳型として、ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、製造元の方法に従って合成した。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の合成タンパク質は、Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）に懸濁した。
【０１１６】
−ゲルシフトアッセイ−
−−プローブ特異性の確認−−
前記ＤＢＰ合成タンパク質、ＴＥＦ合成タンパク質、ＨＬＦ合成タンパク質、及びＥ４ＢＰ４合成タンパク質をそれぞれ４μｇ、前記標識した各プローブ（配列番号：３６〜３８）０．０１７５ｐｍｏｌ、特異的コンペティターとして、前記各プローブ（配列番号：３６〜３８）の非標識のプローブ１．７５ｐｍｏｌ、及び、非特異的コンペティター（合成委託）として、１．７５ｐｍｏｌを用い、下記表３〜６に従い、サンプル１〜３２を調製し、４質量％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、１５０Ｖ、２時間の条件で電気泳動を行った。ゲルはゲルドライヤー（バイオラド社製）で乾燥した後、ゲルイメージを、ＢＡＳ５０００ゲルイメージ解析装置（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取得した。
なお、表１中、「＋」は添加、「−」は非添加を示す。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
図７ＡにＤＢＰ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＢにＴＥＦ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＣにＨＬＦ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＤにＥ４ＢＰ４合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を示す。
図７Ａ〜Ｄ中、「ＷＴ」は特異的コンペティターを添加したサンプル、「ＭＴ」は非特異的コンペティターを添加したサンプルを示す。ポジティブコントロールとしては、それぞれの合成タンパク質のプローブのみを添加したもの（サンプルＮｏ．１、５、９、１３、１７、２１、２５、及び２９）を用い、ネガティブコントロールとしては、プローブのみを添加したもの（サンプルＮｏ．４、８、１２、１６、２０、２４、２８、及び３２）を用いた。
これらの結果より、ポジティブコントロールとしてコンペティターを添加しなかったサンプルは、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のどのタンパク質においても、それぞれバンドのシフトが認められた（図７Ａ〜Ｄ：サンプル１、５、９、１３、１７、２１、２５、及び２９）。また、ネガティブコントロールとしてプローブのみを添加したサンプルは、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のどのタンパク質においても、バンドのシフトが認められなかった（図７Ａ〜Ｄ：サンプル４、８、１２、１６、２０、２４、２８、及び３２）。
特異的コンペティターを添加した場合、シフトしたバンドが消失したことから、前記バンドは、配列番号：３６〜３８に特異的な配列を認識していることが確認された（図７Ａ〜Ｄ：サンプル２、６、１０、１４、１８、２２、２６、及び３０）。非特異的コンペティターを用いた場合、コンペティターを添加しなかった場合と同程度のバンドが検出されることを確認した（図７Ａ〜Ｄ：サンプル３、７、１１、１５、１９、２３、２７、及び３１）。
【０１２２】
−−ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のＤ−ボックスへの結合の確認−−
前記ＤＢＰ合成タンパク質、ＴＥＦ合成タンパク質、ＨＬＦ合成タンパク質、及びＥ４ＢＰ４合成タンパク質をそれぞれ４μｇ、及び前記標識した各プローブ（配列番号：３６〜３８）０．０１７５ｐｍｏｌを使用して、下記表７に従い、サンプル３３〜４８を調製し、４質量％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、１５０Ｖ、２時間の条件で電気泳動を行った。ゲルはゲルドライヤー（バイオラド社製）で乾燥した後、ゲルイメージを、ＢＡＳ５０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取得した。
なお、ポジティブコントロールとしては、下記配列番号：３９で表される塩基配列を有する、ＰＡＲ（ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ）、及びＥ４ＢＰ４のコンセンサス配列を用いた（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５（８）， ｐ．９９５−１００６）。
ＧＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＡＣＧＴＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＣＧＣ （配列番号：３９）
【０１２３】
【表７】
【０１２４】
＜結果＞
図７ＥにＤＢＰのゲルシフトアッセイの結果を、図７ＧにＴＥＦのゲルシフトアッセイの結果を図７ＦにＨＬＦのゲルシフトアッセイの結果を、図７ＨにＥ４ＢＰ４のゲルシフトアッセイの結果を示す。
図７Ｅ〜Ｈより、ＰＰＡＲγ６プロモーター領域に存在する３箇所のＤ−ボックスへの、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４の結合は、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３の全てにおいて結合が認められた（図７Ｅ：サンプルＮｏ．３３〜３６、及び図７Ｈ：サンプルＮｏ．４５〜４８）。特に、Ｄ２に関して強い特異的バンドが検出された（図７Ｅ：サンプルＮｏ．３４、及び図７Ｈ：サンプルＮｏ．４７）。また、ＴＥＦ、及びＨＬＦは、Ｄ２への結合が認められた（図７Ｆ：サンプルＮｏ．３９、図７Ｇ：サンプルＮｏ．４３）。
これらの結果より、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーターの転写調節は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、直接ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスに結合して行われている可能性が示唆された。
【０１２５】
（実施例７：脂肪細胞分化過程におけるＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の役割）
脂肪細胞分化過程におけるＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の役割について、下記方法により検討を行った。
【０１２６】
＜ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色による検討＞
−方法−
−−ｍｉＲＮＡ配列の合成−−
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より提供されたＲＮＡｉ配列情報を元に、下記配列番号：４、５、１６、１７、２８、及び２９で表される２本鎖ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）配列を合成した。
ＤＢＰに対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：４で表される塩基配列、及び下記配列番号：５で表される塩基配列である。
ＴＥＦに対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：１６で表される塩基配列、及び下記配列番号：１７で表される塩基配列である。
Ｅ４ＢＰ４に対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：２８で表される塩基配列、及び下記配列番号：２９で表される塩基配列である。
前記ｍｉＲＮＡ（配列番号：４、５、１６、１７、２８、及び２９）をアニーリングした後、Ｂｌｏｃｋ−ｉｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：４）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：５）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１６）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１７）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２８）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２９）
【０１２７】
−−細胞の培養−−
３Ｔ３−Ｌ１細胞（細胞株バンクＡＴＣＣ）を、２４ウエルプレートに５×１０４細胞／プレート播種し、脂肪前駆細胞培養用培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＣＳ）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％コンフルエントになるまで培養した。
【０１２８】
−−トランスフェクション−−
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４のｍｉＲＮＡの配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．８μｇを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションした。前記ｐｃＤＮＡ ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲは、ブラストシジン遺伝子配列を有することから、ブラストシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｇ／ｍＬによって導入細胞のセレクションを行なった。この細胞が、８５％コンフルエントになった段階で、インスリン（ナカライテスク（株）製）１０μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン（ナカライテスク（株）製）０．２５μＭ、及びＩＢＭＸ（ナカライテスク（株）製）０．５ｍＭにより分化誘導をかけ、分化誘導後７日目にｏｉｌ ｒｅｄ Ｏを用いた染色を行った。
【０１２９】
−結果−
結果を図８に示す。図８中、スケールバーは５０μｍである。
脂肪細胞への分化の評価は、脂肪滴数を指標に行った。ＤＢＰ、及びＴＥＦのｍｉＲＮＡを、単独あるいは両者を導入した細胞では脂肪滴数の減少が認められ、脂肪細胞への分化が阻害された。一方、Ｅ４ＢＰ４ ｍｉＲＮＡを導入した細胞では脂肪滴が増加する傾向が認められた。
【０１３０】
＜定量ＰＣＲによる検討＞
−方法−
−−細胞−−
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ社製）を、２４ウエルプレートに５×１０４細胞／プレート播種し、脂肪前駆細胞培養用培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％コンフルエントになるまで培養した。
【０１３１】
−−トランスフェクション−−
前記ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４ 発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、ブラストシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｇ／ｍＬによってセレクションを行なった。この細胞が、８５％コンフルエントになった段階で、インスリン（ナカライテスク（株）製）１０μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン（ナカライテスク（株）製）０．２５μＭ、及びＩＢＭＸ（ナカライテスク（株）製）０．５ｍＭにより分化誘導をかけ、分化誘導後７日目にＲＮＡ抽出を行った。
【０１３２】
−−ｍＲＮＡの抽出、及び精製−−
前記脂肪細胞の分化の検討を行った３Ｔ３−Ｌ１細胞より、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡ抽出、及び精製を行い、ＤＢＰのｍＲＮＡ量、及びＥ４ＢＰ４のｍＲＮＡ量をｑＰＣＲ（５０℃２分間を１サイクル、９５℃１０分間を１サイクル、及び９５℃１５秒間、及び６０℃１分間を４０サイクル）により測定した。
【０１３３】
結果を図９Ａ〜Ｂに示す。
ＤＢＰを発現させ、脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、分化に伴い、ＤＢＰの発現量が増加した（図９Ａ）。
一方、Ｅ４ＢＰ４を発現させ、脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、分化に伴い、ＤＢＰの発現量が減少した（図９Ｂ）。
【０１３４】
実施例７の結果、ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の発現は、脂肪分化と関連のあることが示唆された。その作用としては、ＤＢＰ、及びＴＥＦが、脂肪分化を促進し、Ｅ４ＢＰ４は、脂肪分化を抑制するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明のＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有することから、脂肪細胞への分化の調節、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、炎症の調節などに好適に利用可能である。
また、本発明の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害作用を有することから、医薬、健康食品、機能性食品などに好適に利用可能である。
更に、本発明のスクリーニング方法は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有する因子を効率よくスクリーニングできることから、ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニングに好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ＰＰＡＲγプロモーター配列、並びに、ＰＰＡＲγ発現調節剤、脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフスタイルの欧米化に伴い、糖尿病、高血圧、動脈硬化、脂質異常症などいわゆる生活習慣病が増加しており、その主要因としてメタボリックシンドロームがある。このメタボリックシンドロームは、内臓組織の脂肪細胞の増殖や脂肪の取り込みの増加などにより発症し、過剰な食事量による脂肪細胞への脂肪酸の取り込みや、それによる脂肪細胞の増殖や分化とも密接に関連している。したがって、これらを制御する因子を解明することが、生活習慣病の予防や治療に直接結びつくものと考えられる。
しかしながら、脂肪の摂取と、脂質代謝とを直接結びつける因子や、脂肪細胞の分化に関わる因子などは十分に解明されておらず、これらの分子機構の解明が強く求められている。
【０００３】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ステロイドホルモン受容体ファミリーの１種であり、哺乳動物においてＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγの３種類のサブタイプが存在することが知られている。
ＰＰＡＲは、別の転写調節因子であるＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子の上流に存在する応答配列ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、標的遺伝子の転写を制御している。前記標的遺伝子としては、内分泌代謝、糖代謝、脂質代謝、マクロファージを介する炎症反応、骨代謝の制御、発ガン機構などの遺伝子が知られている。そのため、ＰＰＡＲは、これらの疾患の治療薬のターゲット分子として注目されている。
【０００４】
これらの中でも、ＰＰＡＲγは、そのプロモーターに、数種のスプライスバリアントが存在することが知られており（非特許文献１参照）、数種のアイソフォームが存在する（非特許文献２〜３参照）。例えば、ＰＰＡＲγ１は、脂肪組織や免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、ＰＰＡＲγ２は、脂肪細胞で特異的な発現が認められ、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている（非特許文献４参照）。また、ＰＰＡＲγは、マウスの破骨細胞を制御するという報告（非特許文献５参照）や、炎症疾患の調節に有用であるという報告（非特許文献６参照）もある。
【０００５】
従来、ＰＰＡＲγの作用機序に大きく関わる因子としては、ＰＰＡＲγのリガンドが報告されている（非特許文献７参照）。
しかしながら、ＰＰＡＲγの発現調節は多面的に制御されているため非常に複雑であり、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することにより、脂肪細胞の増殖や分化を促進、停止、後退させる因子、破骨細胞機能を調節する因子、炎症を調節する因子などは未だ提供されておらず、ＰＰＡＲγを直接調節することが可能なＰＰＡＲγ発現調節剤、ＰＰＡＲγの調節を介した、脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆａｊａｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９７， ２７２， ｐ．１８７７９−１８７８９
【非特許文献２】Ｆａｊａｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， １９９８， ４３８， ｐ．５５−６０
【非特許文献３】Ｓｕｎｄｖｏｌｄ Ｈ， Ｌｉｅｎ Ｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００１， ２８， ｐ．３８３−９０
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎ ＥＤ， Ｗａｌｋｅｙ ＣＪ， Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ Ｐ， Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ＢＭ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２０００， １４， ｐ．１２９３−３０７
【非特許文献５】Ｗａｎ Ｙ， Ｃｈｏｎｇ ＬＷ， Ｅｖａｎｓ ＲＭ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００７， １３， ｐ．１４９６ − １５０３
【非特許文献６】Ｒｉｃｏｔｅ Ｍ， Ｌｉ ＡＣ， Ｗｉｌｌｓｏｎ ＴＭ， Ｋｅｌｌｙ ＣＪ， Ｇｌａｓｓ ＣＫ， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１， ｐ．７９−８２
【非特許文献７】Ｒｏｓｅｎ ＥＤ， Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ ＢＭ， Ｎａｔｕｒｅ， ２００６， ４４４， ｐ．８４７−８５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能な因子を含有する優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、並びに、前記因子を阻害することにより脂肪細胞の分化、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、及び炎症作用の調節が可能な、優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及び前記ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは、脂肪分化、脂質代謝、破骨細胞調節、炎症疾患などに関与するＰＰＡＲγの発現調節に着目し、ＰＰＡＲγの発現調節に関与する因子について鋭意検討した結果、ＰＰＡＲγの発現制御に係る５’非翻訳領域（プロモーター領域）に新規スプライスバリアントが存在することを知見するとともに、その新規プロモーター配列を見出し、該プロモーター領域のプロモーターレポーターシステムを樹立した。また、ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能なＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を確立し、該スクリーニング方法により、ＤＢＰ、及びＴＥＦがＰＰＡＲγの遺伝子発現を促進すること、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγの発現を抑制すること、更に、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγのプロモーター領域に存在するＤ−ボックスに結合すること、ＤＢＰ、及びＴＥＦを阻害すると脂肪細胞への分化が阻害され、更にＤＢＰの遺伝子発現は脂肪細胞の分化に伴い増加すること、Ｅ４ＢＰ４を阻害すると脂肪細胞への分化が促進し、更にＥ４ＰＢ４の遺伝子発現は脂肪細胞の分化に伴い減少することを知見し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、前記５’非翻訳領域（プロモーター領域）に新規スプライスバリアントを有するＰＰＡＲγを、「ＰＰＡＲγ６」と命名した。
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 配列番号：１で表される塩基配列を有することを特徴とするＰＰＡＲγプロモーター配列である。
＜２＞ 配列番号：１で表される塩基配列のうち、塩基番号１５９〜１６６、塩基番号２０２〜２０９、及び塩基番号２１８〜２２５を少なくとも有する前記＜１＞に記載のＰＰＡＲγプロモーター配列である。
＜３＞ ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜４＞ ＰＰＡＲγの発現促進作用を有する前記＜３＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜５＞ ＰＰＡＲγの発現促進作用を有する因子が、ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかである前記＜４＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜６＞ ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有する前記＜３＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜７＞ ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有する因子が、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかである前記＜６＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜８＞ ＰＰＡＲγの発現調節作用が、ＰＰＡＲγプロモーター配列に結合することによる前記＜３＞から＜７＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜９＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列を有する前記＜８＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜１０＞ ＰＰＡＲγの発現調節作用が、配列番号：１で表される塩基配列中のＤ−ボックスに結合することによる前記＜３＞から＜９＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤である。
＜１１＞ ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することを特徴とする脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１２＞ 阻害が、ｍｉＲＮＡによる前記＜１１＞に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１３＞ ｍｉＲＮＡの配列が、配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記＜１２＞に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤である。
＜１４＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
＜１５＞ ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列を有する前記＜１４＞に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
＜１６＞ プロモーターレポーター遺伝子のＰＰＡＲγプロモーター配列が、該ＰＰＡＲγプロモーター配列が有する３箇所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失した欠失変異体である前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、
ＰＰＡＲγの発現を直接調節することが可能な因子を含有する優れたＰＰＡＲγ発現調節剤、並びに、前記因子を阻害することにより脂肪細胞の分化、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、及び炎症作用の調節が可能な、優れた脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤、及び前記ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＰＰＡＲγ遺伝子のエクソン・イントロン構造を模式的に表した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＰＰＡＲγ遺伝子の６種のスプライスバリアントを模式的に表した図である。
【図２】図２は、ＰＰＡＲγ６のプロモーター構造、及びＤ−ボックスを模式的に表した図である。
【図３】図３は、ＤＢＰ発現ベクターを一過性に発現させたＣａｃｏ−２細胞における、ＤＢＰ、及びＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡ量を表した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＴＥＦのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＬＦのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｅ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６のプロモーターレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＰＡＲγ６プロモーターの欠失変異体のコンストラクトを模式的に表した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６のプロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターの欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６のプロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６のプロモーター欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のコンストラクトを模式的に表した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｅ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６プロモーターへの作用を、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＤ−ボックス欠失変異体のレポーター遺伝子を用いて、ルシフェラーゼアッセイで解析した図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＢＰに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＴＥＦに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＨＬＦに対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、Ｅ４ＢＰ４に対するプローブ特異性をゲルシフトアッセイにより調べた図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＤＢＰの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＴＥＦの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ＨＬＦの、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図７Ｈ】図７Ｈは、Ｅ４ＢＰ４の、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスへの結合能をゲルシフトアッセイで解析した図である。
【図８】図８は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の脂肪細胞分化への影響を、ＲＮＡｉで解析した図である。
【図９Ａ】図９Ａは、脂肪細胞分化におけるＤＢＰのｍＲＮＡの発現量の変化を表した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、脂肪細胞分化におけるＥ４ＢＰ４のｍＲＮＡの発現量の変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（新規ＰＰＡＲγプロモーター配列）
本発明の新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列を有する。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、５’非翻訳領域が、既知のＰＰＡＲγの配列と異なる、本発明者らが見出したＰＰＡＲγの新規スプライスバリアント（図１Ｂ参照）の発現を制御するプロモーター配列である。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列のみからなる塩基配列であることが好ましいが、そのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列であってもよく、配列番号：１で表される塩基配列に、更にその他の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。
前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列が、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる場合、その一部の塩基配列としては、ＰＰＡＲγのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１で表される塩基配列の、塩基番号１５９〜１６６、塩基番号２０２〜２０９、及び塩基番号２１８〜２２５を有することが好ましい。
前記その他の塩基配列としても、ＰＰＡＲγのプロモーター活性を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記新規ＰＰＡＲγプロモーター配列は、配列番号：１で表される塩基配列に、１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００１３】
＜新規スプライスバリアント＞
ヒトＰＰＡＲγの遺伝子配列は、図１Ａに示すように、１０個のエクソン（Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、Ｂ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、及びＥ６）を有する。このうち、Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、及びＢは、非翻訳領域であり、前記Ｅ１〜Ｅ６が翻訳されることによりＰＰＡＲγのタンパク質を形成する。
前記ヒトＰＰＡＲγの発現調節は、そのプロモーターにより制御されているが、前記ヒトＰＰＡＲγの５’非翻訳領域に存在するプロモーターには、従来、５種のスプライスバリアント（ＰＰＡＲγ１〜５）が存在することが知られていた（図１Ｂ参照）。前記５’非翻訳領域には、４つのエクソン（Ａ１、Ｃ１Ｃ２、Ａ２、及びＢ）が存在し、これらの４つのエクソンが選択的スプライシングを受けることにより、スプライスバリアントが形成される（図１Ａ、及び図１Ｂ参照）。
既知のスプライスバリアントとしては、図１Ｂに示すように、５’非翻訳領域がＡ１、及びＡ２からなるＰＰＡＲγ１、５’非翻訳領域がＢからなるＰＰＡＲγ２、５’非翻訳領域がＡ２からなるＰＰＡＲγ３、５’非翻訳領域にいずれのエクソンも有さないＰＰＡＲγ４、及び５’非翻訳領域がＣ１Ｃ２からなるＰＰＡＲγ５が存在する。
本発明者らは、これらの既知のスプライスバリアントとは全く異なる、５’非翻訳領域がＣ１Ｃ２、及びＡ２からなるヒトＰＰＡＲγが存在することを見出し（図１Ｂ参照）、「ＰＰＡＲγ６」と命名した（以下、「ＰＰＡＲγ６」と称することがある）。
【００１４】
前記ＰＰＡＲγ６が、新規スプライスバリアントを有するか否かを解析する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エクソンＣ１Ｃ２からエクソンＥ１にかけてのＰＣＲ産物のサイズ、及び配列決定などにより解析する方法などが挙げられる。
【００１５】
前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列が、ＤＮＡ結合配列を有するか否かを解析する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）により解析する方法などが挙げられる。
【００１６】
前記ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）による解析の結果、前記Ｃ１Ｃ２は、後述するＤＢＰ（Ａｌｂｕｍｉｎ ｇｅｎｅ Ｄ−ｓｉｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｄ部位結合タンパク質）の結合配列であるＤ−ボックスが３箇所（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）存在していた（図２参照）。
マウス及びヒトの、プロモーター領域及びエクソン１領域の配列についてＤＮＡ解析ソフトＧｅｎｅＷｏｒｋｓでアライメントを行い、前記領域の塩基配列に相同性が高いことを確認した。これらの解析結果より、前記Ｄ−ボックスは、種間で極めてよく保存されていることが明らかとなった。
【００１７】
（ＰＰＡＲγ発現調節剤）
本発明のＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１８】
＜ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４＞
−ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＨＬＦ−
前記ＤＢＰ、前記ＴＥＦ（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆａｃｔｏｒ：甲状腺刺激ホルモン分泌細胞胎児性因子）、及び前記ＨＬＦ（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｆａｃｔｏｒ：肝白血病要因遺伝子）は、ＰＡＲ−ｂＺＩＰ（ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ ｂａｓｉｃ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）転写因子ファミリーに属するタンパク質である（Ｗｕａｒｉｎ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ Ｓｕｐｐｌ， １９９２， ６， ｐ．１２３−１２７）。前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーは、ホモあるいはヘテロダイマーを形成して、プロモーター領域にあるＤ−ボックス（ＲＴＴＡＹＧＴＡＡＹ）に結合し、転写活性化に働くことが知られている（Ｋｈａｔｉｂ ＺＡ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９４， １２３， ｐ．３４４−５１）。前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーは、哺乳類の概日リズムを制御する因子として知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）が、脂肪細胞の分化などを含め、他の機能に関しては全く報告がない。
【００１９】
−Ｅ４ＢＰ４−
前記Ｅ４ＢＰ４（アデノウイルスＥ４プロモーター結合蛋白４）は、ｂＺＩＰ転写因子ファミリーに属するタンパク質である。前記ｂＺＩＰファミリーは、前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーと同様に、プロモーター領域にあるＤ−ボックスに結合し、転写抑制化に働くことが知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｏ Ｔ， Ｉｓｈｉｄａ Ｙ， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）。前記Ｅ４ＢＰ４も、前記ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーと同様に、哺乳類の概日リズムを制御する因子として知られている（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｍａｔｓｕｏ Ｔ， Ｉｓｈｉｄａ Ｙ， Ｏｋａｍｕｒａ Ｈ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５， ｐ．９９５−１００６）が、脂肪分化における作用などを含め、他の機能に関しては全く報告がない。
【００２０】
−入手方法−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中に含まれる、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がタンパク質の状態である場合、例えば、市販品を用いる方法、培養細胞より精製する方法、遺伝子組換え技術により組換体タンパク質を得る方法、無細胞系を用いた真核生物由来タンパク質合成の方法などが挙げられるが、これらの中でも無細胞系を用いた真核生物由来タンパク質合成の方法により得ることが、可溶性、及び機能タンパク質を迅速に合成できる点で好ましい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がｃＤＮＡの状態である場合、例えば、市販品を用いる方法、ｃＤＮＡを合成する方法、ｃＤＮＡライブラリーからクローニングする方法などが挙げられるが、これらの中でもｃＤＮＡを合成する方法により得ることが、迅速に取得できる点で好ましい。
【００２１】
−含有量−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかそのものであってもよい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＰＡＲγの発現を促進する目的で用いられる場合と、ＰＰＡＲγの発現を抑制する目的で用いられる場合とで、前記含有比率を変えることが好ましい。
【００２２】
−−ＰＰＡＲγの発現促進作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤−−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を促進する目的で用いられる場合、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としては、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかが、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡより多く含有されていることが好ましく、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかのみ含有されていることがより好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかであると、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤によるＰＰＡＲγの発現促進作用が強い点で有利である。
なお、ＰＰＡＲγの発現促進作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤を、ＰＰＡＲγ発現促進剤として使用することができる。
【００２３】
−−ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤−−
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を抑制する目的で用いられる場合、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの含有比率としては、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかが、前記ＤＢＰ、及びＴＥＦ、並びに、該ＤＢＰ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡより多く含有されていることが好ましく、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかのみ含有されていることがより好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、前記ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかであると、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤によるＰＰＡＲγの発現抑制作用が強い点で有利である。
なお、ＰＰＡＲγの発現抑制作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤を、ＰＰＡＲγ発現抑制剤として使用することができる。
【００２４】
＜ＰＰＡＲγの発現調節作用＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγの発現を調節する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が、ＰＰＡＲγのプロモーター配列に結合することによりＰＰＡＲγの発現を調節することが好ましい。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤が結合するプロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列であることが好ましく、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の少なくともいずれかに結合することがより好ましく、前記Ｄ２に結合することが更に好ましく、前記３箇所のＤ−ボックス全てに結合することが特に好ましい。
前記３箇所のＤ−ボックス全てに結合すると、ＰＰＡＲγの発現を顕著に促進又は抑制できる点で好ましい。
前記結合を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲルシフトアッセイ、チップアッセイ（ＣｈＩＰ ａｓｓａｙ）などが挙げられる。
【００２５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤中の、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
＜使用＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用してもよい。また、前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００２７】
＜剤型＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００２８】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかに、賦形剤、及び必要に応じて前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２９】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれか、及び必要に応じて前記その他の成分に、添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３０】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれか、及び必要に応じて前記その他の成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３１】
＜投与＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００３２】
＜用途＞
前記ＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有することから、脂肪細胞への分化の調節、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、炎症の調節などに好適に利用可能である。
【００３３】
（脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤）
本発明の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害する因子を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することにより、ＰＰＡＲγの発現を促進又は抑制し、脂肪分化調節作用、脂質代謝調節作用、破骨細胞機能調節作用、及び炎症調節作用を発揮することが好ましい。
【００３４】
＜阻害する因子＞
前記阻害する因子としては、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍｏｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）などが挙げられるが、これらの中でも、ｍｉＲＮＡが、完全に相補的でない場合でも翻訳阻害を引き起こすことができる点、及びＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）として利用できる配列の範囲が広い点で好ましい。
本発明において、前記ｍｉＲＮＡは、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＤＮＡに置換されているものであってもよく、ＲＮＡとＤＮＡとのキメラであってもよく、前記ｍｉＲＮＡを発現し得る分子であってもよい。
前記ｍｉＲＮＡを発現し得る分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡをＤＮＡに置換した塩基配列を有するベクターなどが挙げられる。
【００３５】
−ｍｉＲＮＡ−
前記ｍｉＲＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列を有することが好ましい。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記配列番号：２〜３３で表される塩基配列などが挙げられる。
前記阻害する因子中のｍｉＲＮＡは、配列番号：２〜３３で表される塩基配列全てを有していてもよいが、発現を阻害する遺伝子の種類によって、下記塩基配列を選択することが好ましい。
また、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の少なくともいずれかの遺伝子発現を抑制する塩基配列の由来する生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ヒトなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトの配列であることが、前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤をヒトに用いる場合、抗原性を有さない点で好ましい。
【００３６】
前記ＤＢＰの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２〜５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＵＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＣＧＧＣＵＣＵＣＡＧＣＵＣＣＵＣＵＵ （配列番号：２）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＵＣＵＵＧＣＡＧＣＵＣＣＵＣＵＵ （配列番号：３）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：４）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：５）
【００３７】
前記ＤＢＰの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：６〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＧＵＵＣＧＣＧＧＣＵＣＧＧＣＵＵ （配列番号：６）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＧＧＧＵＵＣＧＵＧＣＧＧＣＵＣＧＧＣＵＵ （配列番号：７）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴ （配列番号：８）
ＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴ （配列番号：９）
【００３８】
前記ＴＥＦの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１０〜１３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＣＡＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１０）
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＵＧＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１１）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１２）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１３）
【００３９】
前記ＴＥＦの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１４〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＵＵＵＡＧＣＵＧＣＣＡＣＧＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＵＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１４）
ＵＵＵＡＧＣＵＧＡＣＧＵＵＧＵＵＣＵＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＵＧＧＣＡＧＣＵＡＡＡ （配列番号：１５）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１６）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１７）
【００４０】
前記ＨＬＦの遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：１８〜２１で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＣＡＵＣＣＵＧＡＡＧＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＵＣＡＧＧＡＵＧ （配列番号：１８）
ＣＡＵＣＣＵＧＡＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＡＧＧＡＵＧ （配列番号：１９）
ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧ （配列番号：２０）
ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧ （配列番号：２１）
【００４１】
前記ＨＬＦの遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２２〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＣＵＵＣＧＵＧＧＵＧＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵ （配列番号：２２）
ＡＣＵＡＡＡＵＧＣＧＵＵＣＧＵＧＧＵＧＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＵＵＵＡＧＵ （配列番号：２３）
ＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴ （配列番号：２４）
ＡＣＴＡＡＡＴＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＧＣＡＴＴＴＡＧＴ （配列番号：２５）
【００４２】
前記Ｅ４ＢＰ４の遺伝子発現を抑制するマウス由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：２６〜２９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＵＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＵＵＧＵＵＣＵＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＧＡＡＣＡＵＵＣＣＣＵＧＵＧＡＵ （配列番号：２６）
ＡＵＣＡＣＡＧＧＧＡＡＵＧＵＵＣＵＣＡＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＵＧＡＧＡＡＣＡＡＧＵＵＣＣＣＵＧＵＧＡＵ （配列番号：２７）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２８）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２９）
【００４３】
前記Ｅ４ＢＰ４の遺伝子発現を抑制するヒト由来のｍｉＲＮＡ配列としては、例えば、下記配列番号：３０〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有することが好ましい。
ＡＵＡＡＵＣＵＧＧＡＡＣＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＣＡＧＡＵＵＡＵ （配列番号：３０）
ＡＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＵＧＵＵＵＵＣＡＧＵＣＡＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＡＡＡＡＣＵＧＡＡＡＡＣＡＡＧＵＵＣＣＡＧＡＵＵＡＵ （配列番号：３１）
ＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴ （配列番号：３２）
ＡＴＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴ （配列番号：３３）
【００４４】
前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡは、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の全体からなる塩基配列であることが、発現阻害効率が高い点で好ましいが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の一部からなる配列であってもよい。
前記ｍｉＲＮＡが、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の一部からなる配列である場合、その一部の塩基配列としては、前記ｍｉＲＮＡが、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ｍｉＲＮＡは、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかの１若しくは数個の塩基が、欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
【００４５】
−−入手方法−−
前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、合成による方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００４６】
−−含有量−−
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤中の、前記ｍｉＲＮＡの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ｍｉＲＮＡが、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかである場合、その含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合で、前記含有比率を変えることが好ましい。
【００４７】
−−−ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＤＢＰ、及び該ＤＢＰをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記ｍｉＲＮＡが、配列番号：１０〜３３で表される塩基配列を有する前記ｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：６〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：２〜９で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有する前記ｍｉＲＮＡである場合、配列番号：２〜９で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４８】
−−−ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＴＥＦ、及び該ＴＥＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜９で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡ、及び配列番号：１８〜３３で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：１４〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：１０〜１７で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
−−−ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記ＨＬＦ、及び該ＨＬＦをコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜１７で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡ、及び配列番号：２６〜３３で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡがより好ましく、配列番号：２２〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：１８〜２５で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
−−−Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの抑制−−−
前記Ｅ４ＢＰ４、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡを抑制する目的で用いられる場合、前記ｍｉＲＮＡの含有比率としては、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡが、配列番号：２〜２５で表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡより多いことが好ましく、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有するｍｉＲＮＡそのものがより好ましく、配列番号：３０〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡが特に好ましい。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかのみを有するｍｉＲＮＡである場合、配列番号：２６〜３３で表される塩基配列それぞれの含有比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
＜阻害活性＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤が、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：２〜３３を用いたＲＮＡｉにより確認する方法などが挙げられる。
前記ＲＮＡｉに用いる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脂肪細胞前駆細胞株である３Ｔ３−Ｌ１細胞、マクロファージ由来の細胞株であるＲＡＷ２６４細胞、骨髄由来マスト細胞ｍＢＭＭＣｓなどが挙げられる。
前記３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた場合、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列のいずれかによりＲＮＡｉを行った前記３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪滴の数と、前記配列番号：２〜３３で表される塩基配列を導入していない前記３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪滴の数とを比較することで、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害活性を確認することができる。
【００５２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学的に許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤中の、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
＜使用＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、１種単独で使用されてもよいし、２種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５４】
＜剤型＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００５５】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡに、賦形剤、及び必要に応じて前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５６】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡ、及び必要に応じて前記その他の成分に、添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５７】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記ｍｉＲＮＡ、及び必要に応じて前記その他の成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５８】
＜投与＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００５９】
＜用途＞
前記脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害作用を有することから、医薬、健康食品、機能性食品などに好適に利用可能である。
【００６０】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、を含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００６１】
＜レポーター遺伝子構築工程＞
前記レポーター遺伝子構築工程は、ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するプロモーターレポーター遺伝子を構築する工程である。
【００６２】
−ＰＰＡＲγプロモーター配列−
前記ＰＰＡＲγプロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前述した配列番号：１で表される塩基配列を有するＰＰＡＲγ６プロモーター配列を用いることが好ましい。
なお、本発明のスクリーニング方法に用いる前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、前述した配列番号：１で表される塩基配列の全体からなる塩基配列を用いてもよいし、配列番号：１で表される塩基配列の一部からなる塩基配列を用いてもよく、配列番号：１で表される塩基配列中に存在する３ヵ所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失させた欠失変異体を用いてもよい。
前記Ｄ−ボックスの欠失変異体を、前記スクリーニング方法に用いると、前記被験物質とＤ−ボックスとの関係が明らかにできる点で有利である。
【００６３】
前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトゲノミックＤＮＡを鋳型に用い、下記配列番号：３４〜３５で表される塩基配列をプライマーとしてＰＣＲにより増幅する方法などが挙げられる。
プライマー配列
ＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ （配列番号：３４）
ＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡ （配列番号：３５）
【００６４】
−レポーター遺伝子−
前記レポーター遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
前記ルシフェラーゼの遺伝子配列の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のベクター（例えば、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）から入手する方法、ＮＣＢＩなどのデータベースから入手する方法などが挙げられる。
【００６５】
−−構築方法−−
前記プロモーターレポーター遺伝子を構築する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ルシフェラーゼ遺伝子を有する前記ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、及び前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＰＣＲ産物を制限酵素処理し、前記ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＰＣＲ産物をクローニングすることにより構築する方法などが挙げられる。
なお、前記ルシフェラーゼは安定性の高いタンパク質であるため、プロモーター活性の変動（増減）をモニターし難いことがある。そのため、前記ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃは、ルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端にＰＥＳＴ配列（プロリン、グルタミン酸、セリン、及びスレオニンに富む配列）を導入させた配列であることが、細胞内におけるルシフェラーゼの分解を促進できる点で好ましい。
【００６６】
＜導入工程＞
前記導入工程は、前記プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する工程である。
【００６７】
−被験試料−
前記被験試料とは、少なくとも被験物質を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００６８】
−−被験物質−−
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、発現ベクターにクローニングされた遺伝子であることが好ましい。
前記発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
【００６９】
−−その他の成分−−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、ＰＢＳ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）などが挙げられる。
【００７０】
−細胞−
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｃａｃｏ２細胞などが挙げられる。
なお、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、マウス胎児皮膚由来細胞株であり、前記ＨｅｐＧ２細胞は、ヒト肝ガン由来細胞株であり、前記Ｃａｃｏ２細胞は、ヒト結腸由来細胞株である。
前記細胞の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭなどが挙げられる。
前記細胞の培養条件としては、特に制限はなく、細胞の種類に応じて適宜選択することができるが、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び前記ＨｅｐＧ２細胞の場合は、１０質量％ＦＢＳ（ウシ胎児結成）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ２が好ましく、前記Ｃａｃｏ２細胞の場合は、２０質量％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、３７℃、５％ＣＯ２が好ましい。
【００７１】
−導入方法−
前記プロモーターレポーター遺伝子と、前記被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられるが、これらの中でもリポフェクション法が、簡単で導入効率が高い点で好ましい。
前記プロモーターレポーター遺伝子の導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｎｇ〜２０ｎｇが好ましく、１０ｎｇ〜１５ｎｇがより好ましい。
前記被験物質が、遺伝子である場合、その導入量としては、特に制限はなく、遺伝子の種類、発現ベクターの種類などに応じて適宜選択することができるが、６２．５ｎｇ〜１，０００ｎｇが好ましく、１００ｎｇ〜２００ｎｇがより好ましい。
前記細胞に、前記プロモーターレポーター遺伝子、及び被験物質を導入する時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記遺伝子の導入量を一定にするため、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることが好ましい。
【００７２】
＜検出工程＞
前記検出工程は、前記プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する工程である。
【００７３】
前記レポーター活性を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、前記ルシフェラーゼを反応させ、ルミノメーター（例えば、Ｍｏｄｅｌ ＴＤ−２０／２０（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社製））により検出する方法などが挙げられる。
前記ルシフェラーゼは、前記ＰＰＡＲγプロモーターの制御下で発現するため、前記ルシフェラーゼのレポーター活性を検出することで、前記ＰＰＡＲγのプロモーター活性を検出することができる。
【００７４】
＜スクリーニング工程＞
前記スクリーニング工程は、前記被験物質を含む被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする工程である。
【００７５】
前記ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記レポーター活性の強度を比較する方法などが挙げられる。
前記レポーター活性の強度を比較する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被験試料を導入せず、プロモーターレポーター遺伝子のみを導入した細胞をコントロールとし、該コントロールと、被験試料、及びプロモーターレポーター遺伝子を導入した細胞とを比較して、前記被験試料、及びプロモーターレポーター遺伝子を導入した細胞のレポーター活性が、前記コントロールのレポーター活性より強い場合、前記被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする方法、前記コントロールと比較せず、前記被験物質を含む被験試料間のレポーター活性の強度の違いにより、レポーター活性が強い前記被験試料中の被験物質を、より強いＰＰＡＲγ発現調節作用を有するＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングする方法などが挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１：新規ＰＰＡＲγプロモーター配列の解析）
新規ＰＰＡＲγであるＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、新規スプライスバリアントｃＤＮＡの５’配列を元に転写開始点を決定し、第１エクソン（Ｃ１Ｃ２）（図１Ｂ）を有する上流領域を、下記方法により解析した。
【００７８】
＜ＰＰＡＲγ６プロモーター配列の増幅＞
ヒトゲノミックＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を鋳型に用いて、下記配列番号：３４〜３５で表される塩基配列をプライマーとして用い、９６℃・３０秒間、６２℃・３０秒間、７２℃・９０秒間を３０サイクルの条件でＰＣＲを行い、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列を増幅した。前記ＰＰＡＲγ６プロモーター領域の長さは、約１ｋｂであった。
前記ＰＰＡＲγ６プロモーター配列のＰＣＲ産物は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＴＡ法でクローニングした（以下、「ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１」と称することがある。）。
【００７９】
プライマー配列
ＧＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧ （配列番号：３４）
ＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡ （配列番号：３５）
【００８０】
＜ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列の解析＞
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１を用い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７ シーケンサー（アプライドバイオシステム社製）によりシーケンスをいった。シーケンスの結果から明らかになった配列について、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｃＤＮＡ、及びＥＴＳデータベースにて検索を行い、スプライシングパターンを決定した。その結果、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列は、ＰＰＡＲγの新規スプライスバリアントである、配列番号：１で表される塩基配列を有することが明らかとなった。
【００８１】
＜ＰＰＡＲγ６プロモーター領域のＤＮＡ結合配列予測解析＞
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１を用い、ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列のＤＮＡ結合配列予測解析を、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ社製）により行った。
その結果、ＰＰＡＲγ６のプロモーター配列は、Ｃ１Ｃ２領域に、３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）を有することが確認された（図２）。前記Ｄ−ボックスは、配列番号：１で表される塩基配列のうち、塩基番号１５９〜１６６（Ｄ１）、塩基番号２０２〜２０９（Ｄ２）、及び塩基番号２１８〜２２５（Ｄ３）に存在する。なお、図２中、ＴＳＳは、転写開始領域（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｓｔａｒｔ Ｓｉｔｅ）を示す。
【００８２】
（実施例２：ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の発現調節）
ＤＢＰがＰＰＡＲγ６の発現を調節しているか否かを、以下の方法を用いて調べた。
【００８３】
＜方法＞
−Ｃａｃｏ−２細胞の培養−
Ｃａｃｏ−２細胞（細胞株バンクＡＴＣＣ）を、２４ウエルプレートに５×１０５細胞／プレート播種し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。
【００８４】
−ＤＢＰ発現ベクターの構築−
ＤＢＰ遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＤＢＰ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ」と称することがある）。
【００８５】
−トランスフェクション−
前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ １２５ｎｇ、及びコントロールとしてＤＢＰをクローニングしていないｐｃＤＮＡ３．１ベクターのいずれかを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて前記Ｃａｃｏ−２細胞へトランスフェクションし、前記ＤＢＰを、前記Ｃａｃｏ−２細胞に一過性に過剰発現させた。前記Ｃａｃｏ−２細胞は、後述するｍＲＮＡの定量までの間、ＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１日間培養した。
【００８６】
−ｍＲＮＡの定量−
前記ＤＢＰを過剰発現させたＣａｃｏ−２細胞、及びコントロールのＣａｃｏ−２細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（（株）日本ジーン製）を用いてＲＮＡ抽出、及び精製を行い、ＤＢＰのｍＲＮＡ量、及びＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
【００８７】
＜結果＞
図３に前記ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
図３より、ＤＢＰのｍＲＮＡの発現量は、コントロールと比較して有意に高く、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰをトランスフェクションしたＣａｃｏ−２細胞では、ＤＢＰが過剰発現されていることが確認された。
ＰＰＡＲγ６のｍＲＮＡの発現量は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰをトランスフェクションし、ＤＢＰを過剰発現したＣａｃｏ−２細胞では、コントロールのＣａｃｏ−２細胞と比較して有意に増加していた。
これらの結果より、ＰＰＡＲγ６の発現は、ＤＢＰにより促進されたことが示唆される。
【００８８】
（実施例３：ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６の転写制御）
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、ＰＰＡＲγ６の転写を制御しているか否かについて、以下のレポーターシステムにより調べた。
【００８９】
＜方法＞
−ＤＢＰ発現ベクターの構築−
ＤＢＰ遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＤＢＰ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ」と称することがある）。
【００９０】
−ＴＥＦ発現ベクターの構築−
ＴＥＦ遺伝子を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに、前記ＴＥＦ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ」と称することがある）。
【００９１】
−ＨＬＦ発現ベクターの構築−
ＨＬＦ遺伝子を、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＴＡクローニング法によって、前記ｐＣＲ３．１ベクターに、前記ＨＬＦ遺伝子をクローニングした（以下、「ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ」と称することがある）。
【００９２】
−Ｅ４ＢＰ４発現ベクターの構築−
Ｅ４ＢＰ４遺伝子を、マウス肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。前記ＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＢａｍＨＩ、及びＫｐｎＩで制限酵素処理し、前記ｐｃＤＮＡ３ベクターに、前記Ｅ４ＢＰ４遺伝子をクローニングした（以下、「ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４」と称することがある）。
【００９３】
−プロモーターレポーター遺伝子の構築−
−−ｐＧＬ３−ｄｌｕｃの構築−−
ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、ルシフェラーゼをコードする遺伝子のＣ末端に相当する領域をＥｃｏＲＶ、及びＸｂａＩで制限酵素処理することにより、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ中のルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端に、ＰＥＳＴ配列を導入した（以下、「ｐＧＬ３−ｄｌｕｃ」と称することがある。）。
【００９４】
−−ｐＧＬ３−ｄｌｕｃへのＰＰＡＲγ６プロモーター配列のサブクローニング−−
実施例１のｈＰＰＡＲγ６−ｐＣＲ２．１と、前記ｐＧＬ３−ｄｌｕｃとを、ＫｐｎＩ、及びＢｇｌＩＩ（共に（株）日本ジーン製）で制限酵素処理し、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列をｐＧＬ３−ｄｌｕｃにサブクローニングすることにより、プロモーターレポーター遺伝子（以下、「ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ」と称することがある）を構築した。
【００９５】
−細胞の培養−
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（理化学研究所提供）を、３５ｍｍプレートに１×１０５細胞／プレート播種し、１０質量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【００９６】
−導入−
前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃと、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ、前記ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ、及び前記ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４のいずれかとを、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｔｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造元の方法に従い、トランスフェクションした。
なお、前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃは、１０ｎｇトランスフェクションに用いた。前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰは０ｎｇ〜１，０００ｎｇの濃度で、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦは０ｎｇ〜５００ｎｇの濃度で、前記ｐＣＲ３．１−ＨＬＦは０ｎｇ〜５００ｎｇの濃度で、前記ｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４は０ｎｇ〜１，０００ｎｇの濃度でそれぞれトランスフェクションを行った。
トランスフェクション２４時間後に、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｍｅｇａ社製）を導入した。導入遺伝子量を一定にする為、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
なお、トランスフェクション効率は、前記ｐＲＬ−ＴＫにより確認した。
導入後、１０質量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【００９７】
−検出−
前記ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、製造元の方法に従い、前記ｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃより発現したルシフェラーゼを反応させた。
前記ルシフェラーゼ活性（レポーター活性）の測定は、ルミノメーターＭｏｄｅｌ ＴＤ−２０／２０（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ社製）を用いて行った。
【００９８】
＜結果＞
ルシフェラーゼ活性の測定結果を、図４Ａ〜Ｄに示す。
図４Ａより、ＤＢＰは、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の増加が認められ、その活性は、ＤＢＰを５００ｎｇ導入したときに最も高かった。また、図４Ｂより、ＴＥＦもＤＢＰと同様に、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の増加が認められた。これらの結果より、ＤＢＰ、及びＴＥＦは、ＰＰＡＲγ６プロモーター活性を促進することが認められた。
図４Ｃ〜Ｄより、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４は、ＤＢＰ、及びＴＥＦとは反対に、導入量依存的にルシフェラーゼ活性の低下が認められた。これらの結果より、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４は、ＰＰＡＲγ６プロモーター活性を抑制することが認められた。
ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＨＬＦは、同じＰＡＲ−ｂＺＩＰファミリーに属する転写因子であるが、ＰＰＡＲγ６に対する活性は異なるものであることが示唆された。
【００９９】
（実施例４：ＤＢＰのＰＰＡＲγ６プロモーターへの結合部位）
ＤＢＰが、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域のどの部位を介してＰＰＡＲγ６の転写活性化を行っているか、ＰＰＡＲγ６プロモーター領域を欠失させた数種の欠失変異体を用いて、下記方法により検討を行った。
【０１００】
−欠失変異体の作製−
前記欠失変異体は、実施例２で作製したｈＰＰＡＲγ６−ｐｒｏｍ−１．０ｋ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃに、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、製造元の方法に従い、下記表１に示すコンストラクト１〜１０を作製した（図５Ａ）。
下記表１は、ＰＰＡＲγ６プロモーターのＣ１Ｃ２の５’末端を、転写開始点、即ち「０」とし、Ｃ１Ｃ２の転写開始点より上流の塩基数を「−」で示し、Ｃ１Ｃ２の転写開始点より下流の塩基数を「＋」で示した。なお、Ｃ１Ｃ２は、全長２９７ｂである。
コンストラクト１は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列全長を有する野生型である。コンストラクト２〜５は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列の上流、即ち５’末端を欠失させた欠失変異体である。コンストラクト６は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを欠失させた欠失変異体である。コンストラクト７〜９は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックス、及び５’末端を欠失させた欠失変異体である。コンストラクト１０（ネガティブコントロール）は、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列を導入していない、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのみのコンストラクトである。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
−ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養−
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（理化学研究所提供）を、３５ｍｍディッシュに、１×１０６細胞／ディッシュ播種し、ＤＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。
【０１０３】
−導入−
前記コンストラクト１〜１０のいずれかをそれぞれ１０ｎｇと、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ １２５ｎｇとを、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、２４時間後に、１００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に２時間後に、０．１ｍＭルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含むＤＭＥＭに交換し、Ｋｒｏｎｏｓ（Ａｔｔｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼ活性を１０分間ごとに測定した。
なお、コントロールとしては、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰを導入せず、コンストラクト１〜１０のいずれかのみを導入したサンプルを用いた。前記コントロールのルシフェラーゼ活性が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性を示すものとする。
【０１０４】
−結果−
結果を、図５Ｂ〜Ｃに示す。
図５Ｂ〜Ｃより、コンストラクト１のルシフェラーゼ活性は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰにより基礎転写活性の約２倍になっており、ＰＰＡＲγ６のプロモーター活性がＤＢＰにより顕著に活性化されたことが認められた。このＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化は、Ｃ１Ｃ２より上流を欠失したコンストラクト２〜５においても認められた（図５Ｂ）。Ｃ１Ｃ２が一部欠失したコンストラクト４〜５では、コンストラクト１〜３と比較して、わずかにＰＰＡＲγ６のプロモーター活性が低かったが、いずれも各コントロール（ＤＢＰ（−））と比較して、ＰＰＡＲγ６の転写は活性化されていることが認められた。
一方、Ｃ１Ｃ２より上流は欠失せず、Ｃ１Ｃ２に存在するＤ−ボックス部位のみを欠失したコンストラクト６では、ＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性が完全に消失し、そのレベルは、コンストラクト１０（ネガティブコントロール）と同程度であった。更に、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化も認められなかった（図５Ｃ）。また、コンストラクト７〜９において、Ｃ１Ｃ２のＤ−ボックス部位を欠失させ、更にＣ１Ｃ２より上流を欠失させた場合も、ＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性は完全に消失し、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の転写活性化も認められなかった（図５Ｃ）。
【０１０５】
これらの結果より、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化には、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列のＣ１Ｃ２に存在するＤ−ボックスが重要であり、ＤＢＰは、Ｄ−ボックスを介してＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化、即ちＰＰＡＲγ６の発現を促進していることが示唆された。
【０１０６】
（実施例５：ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４による、Ｄ−ボックスを介したＰＰＡＲγ６の転写制御）
実施例４の結果、ＤＢＰはＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在するＤ−ボックスに作用していることが認められた。実施例１のＰＰＡＲγ６プロモーター配列解析の結果、ＰＰＡＲγ６プロモーターには３箇所Ｄ−ボックスが存在することが明らかとなっていることから、これらの３箇所のＤ−ボックスと、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４との関係について、下記方法により検討を行った。
【０１０７】
＜方法＞
実施例４のコンストラクト５（５’末端：＋１２６、３’末端：＋２９７）を用い、実施例４と同様の方法により、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ＰＰＡＲγ６プロモーターの３箇所のＤ−ボックスの全部又は一部を欠失させた下記表２、及び図６Ａに示すコンストラクト１１〜１５を作製した。
下記表２の「○」は、Ｄ−ボックスを有する箇所を示し、「×」は、Ｄ−ボックスを欠失した箇所を示す。
前記コンストラクト１１〜１５のいずれかをそれぞれ１０ｎｇと、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ ２５０ｎｇ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４ ４００ｎｇのいずれかとを、実施例４と同様の方法で、前記ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
なお、コントロールとしては、ｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４を導入せず、コンストラクト１１〜１５のいずれかのみを導入したサンプルを用いた。前記コントロールのルシフェラーゼ活性が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＰＡＲγ６プロモーターの基礎転写活性を示すものとする。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
＜結果＞
図６ＢにＤＢＰの結果を、図６ＣにＥ４ＢＰ４の結果を示す。なお、図６Ｂ、及び図６Ｃ中、「＊＊」は、ｔ−検定によるｐ値が、ｐ＜０．０１を示し、「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を示す。
【０１１０】
−ＤＢＰ−
ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを有するコンストラクト１１は、ＤＢＰによりＰＰＡＲγ６プロモーターを活性化し、その活性は、コントロール（基礎転写活性）の約２倍であった（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ２、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１２では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性に変化はなかったが、ＤＢＰ存在下では、コンストラクト１１と比較して、ＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化の強度が弱かった。また、コントロール（基礎転写活性）と比較して、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化は認められたものの、その活性化強度は弱かった（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１３では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下のコンストラクト１１と比較しても、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの活性化の強度は弱かった。しかし、コンストラクト１３のコントロールと比較して、ルシフェラーゼの発現量は約２倍以上であり、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６プロモーターの強い活性化が認められた（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ２の両方を欠失させたコンストラクト１４も、コンストラクト１３の結果と同様であり、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下のコンストラクト１１と比較しても、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６の活性化の強度は弱かった。しかし、コンストラクト１４のコントロールと比較して、ルシフェラーゼの発現量は約２倍以上であり、ＤＢＰによるＰＰＡＲγ６のプロモーターの活性化が認められた（図６Ｂ）。
Ｄ−ボックスのＤ１〜Ｄ３の全てを欠失させたコンストラクト１５では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、ＤＢＰ存在下でもルシフェラーゼの発現レベルは、コンストラクト１５のコントロールと同レベルであったことから、ＤＢＰによるＰＰＡＲγプロモーターの活性化が完全に消失していることが認められた（図６Ｂ）。
【０１１１】
−Ｅ４ＢＰ４−
ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在する３箇所のＤ−ボックスを有するコンストラクト１１は、Ｅ４ＢＰ４によりＰＰＡＲγ６プロモーター活性を抑制し、その活性は、コントロール（基礎転写活性）の約１／２であった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ２、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１２では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性に変化はなく、Ｅ４ＢＰ４存在下でも、コンストラクト１１と比較して変化は認められなかった。即ち、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が認められ、その活性は、コンストラクト１２のコントロールの約１／２であった。（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ３の両方を欠失させたコンストラクト１３では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、コンストラクト１３のコントロールと比較して、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が弱かった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１、及びＤ２の両方を欠失させたコンストラクト１４も、コンストラクト１３の結果と同様であり、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、コンストラクト１４のコントロールと比較して、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーター活性の抑制が弱かった（図６Ｃ）。
Ｄ−ボックスのＤ１〜Ｄ３の全てを欠失させたコンストラクト１５では、コンストラクト１１と比較して、基礎転写活性が低下し、Ｅ４ＢＰ４存在下でもルシフェラーゼの発現レベルは、コンストラクト１５のコントロールと同レベルであったことから、Ｅ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγプロモーター活性の抑制が完全に消失していることが認められた（図６Ｃ）。
【０１１２】
実施例５の結果から、ＰＰＡＲγ６の転写調節は、主に、基礎転写活性に係る転写開始点上流配列約７００ｂと、ＰＡＲ−ｂＺＩＰ転写因子ファミリーによって転写調節を受ける転写開始点より下流の３箇所のＤ−ボックスを有する配列とによって行われていることが明らかになった。
更に、ＤＢＰによって正に、Ｅ４ＢＰ４によって負に制御を受ける、Ｄ−ボックスを介した転写調節システムを有することが示された。
また、３箇所のＤ−ボックスによって、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４による転写調節が行われていることが明らかになったことから、ＰＰＡＲγ６プロモーター配列に存在するＤ−ボックスの有無によって、ＰＰＡＲγ６の転写調節作用がＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４を介するものであるかどうかを判定出来る可能性が示唆された。
【０１１３】
（実施例６：ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のＰＰＡＲγ６のＤ−ボックスへの結合能）
実施例２〜３より、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４がＰＰＡＲγ６の転写活性に関与することが示唆され、更に実施例４〜５より、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６の転写制御は、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域に存在するＤ−ボックスが重要であることが示唆された。
そこで、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、ＰＰＡＲγ６のプロモーター領域に存在するＤ−ボックスに直接結合するか否かについて、ゲルシフトアッセイにより検討を行った。
【０１１４】
＜方法＞
−プローブの作製−
ゲルシフトアッセイは、ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在する３箇所のＤ−ボックス（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の配列をもとに、Ｄ１に対するプローブとしては、下記配列番号：３６で表される２本鎖プローブを、Ｄ２に対するプローブとしては、下記配列番号：３７で表される２本鎖プローブを、Ｄ３に対するプローブとしては、下記配列番号：３８で表される２本鎖プローブを作製した。配列番号：３６〜３８で表されるプローブの下線は、Ｄ−ボックスを示す。前記プローブに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−３２Ｐ ＡＴＰを５’末端に導入して標識した。
ＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＡ （配列番号：３６）
ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡ （配列番号：３７）
ＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴ （配列番号：３８）
【０１１５】
−タンパク質の合成−
ゲルシフトアッセイに用いるタンパク質は、実施例３で構築したｐｃＤＮＡ３．１−ＤＢＰ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＥＦ、ｐＣＲ３．１−ＨＬＦ、及びｐｃＤＮＡ３−Ｅ４ＢＰ４を鋳型として、ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、製造元の方法に従って合成した。
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４の合成タンパク質は、Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）に懸濁した。
【０１１６】
−ゲルシフトアッセイ−
−−プローブ特異性の確認−−
前記ＤＢＰ合成タンパク質、ＴＥＦ合成タンパク質、ＨＬＦ合成タンパク質、及びＥ４ＢＰ４合成タンパク質をそれぞれ４μｇ、前記標識した各プローブ（配列番号：３６〜３８）０．０１７５ｐｍｏｌ、特異的コンペティターとして、前記各プローブ（配列番号：３６〜３８）の非標識のプローブ１．７５ｐｍｏｌ、及び、非特異的コンペティター（合成委託）として、１．７５ｐｍｏｌを用い、下記表３〜６に従い、サンプル１〜３２を調製し、４質量％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、１５０Ｖ、２時間の条件で電気泳動を行った。ゲルはゲルドライヤー（バイオラド社製）で乾燥した後、ゲルイメージを、ＢＡＳ５０００ゲルイメージ解析装置（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取得した。
なお、表１中、「＋」は添加、「−」は非添加を示す。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
図７ＡにＤＢＰ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＢにＴＥＦ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＣにＨＬＦ合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を、図７ＤにＥ４ＢＰ４合成タンパク質に対するプローブ特異性の確認の結果を示す。
図７Ａ〜Ｄ中、「ＷＴ」は特異的コンペティターを添加したサンプル、「ＭＴ」は非特異的コンペティターを添加したサンプルを示す。ポジティブコントロールとしては、それぞれの合成タンパク質のプローブのみを添加したもの（サンプルＮｏ．１、５、９、１３、１７、２１、２５、及び２９）を用い、ネガティブコントロールとしては、プローブのみを添加したもの（サンプルＮｏ．４、８、１２、１６、２０、２４、２８、及び３２）を用いた。
これらの結果より、ポジティブコントロールとしてコンペティターを添加しなかったサンプルは、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のどのタンパク質においても、それぞれバンドのシフトが認められた（図７Ａ〜Ｄ：サンプル１、５、９、１３、１７、２１、２５、及び２９）。また、ネガティブコントロールとしてプローブのみを添加したサンプルは、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のどのタンパク質においても、バンドのシフトが認められなかった（図７Ａ〜Ｄ：サンプル４、８、１２、１６、２０、２４、２８、及び３２）。
特異的コンペティターを添加した場合、シフトしたバンドが消失したことから、前記バンドは、配列番号：３６〜３８に特異的な配列を認識していることが確認された（図７Ａ〜Ｄ：サンプル２、６、１０、１４、１８、２２、２６、及び３０）。非特異的コンペティターを用いた場合、コンペティターを添加しなかった場合と同程度のバンドが検出されることを確認した（図７Ａ〜Ｄ：サンプル３、７、１１、１５、１９、２３、２７、及び３１）。
【０１２２】
−−ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４のＤ−ボックスへの結合の確認−−
前記ＤＢＰ合成タンパク質、ＴＥＦ合成タンパク質、ＨＬＦ合成タンパク質、及びＥ４ＢＰ４合成タンパク質をそれぞれ４μｇ、及び前記標識した各プローブ（配列番号：３６〜３８）０．０１７５ｐｍｏｌを使用して、下記表７に従い、サンプル３３〜４８を調製し、４質量％ポリアクリルアミドゲルにアプライし、１５０Ｖ、２時間の条件で電気泳動を行った。ゲルはゲルドライヤー（バイオラド社製）で乾燥した後、ゲルイメージを、ＢＡＳ５０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて取得した。
なお、ポジティブコントロールとしては、下記配列番号：３９で表される塩基配列を有する、ＰＡＲ（ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｒｉｃｈ）、及びＥ４ＢＰ４のコンセンサス配列を用いた（Ｍｉｔｓｕｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ， ２００１， １５（８）， ｐ．９９５−１００６）。
ＧＣＣＣＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＡＣＧＴＡＡＣＡＡＧＣＧＴＴＣＧＣ （配列番号：３９）
【０１２３】
【表７】
【０１２４】
＜結果＞
図７ＥにＤＢＰのゲルシフトアッセイの結果を、図７ＧにＴＥＦのゲルシフトアッセイの結果を図７ＦにＨＬＦのゲルシフトアッセイの結果を、図７ＨにＥ４ＢＰ４のゲルシフトアッセイの結果を示す。
図７Ｅ〜Ｈより、ＰＰＡＲγ６プロモーター領域に存在する３箇所のＤ−ボックスへの、ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４の結合は、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３の全てにおいて結合が認められた（図７Ｅ：サンプルＮｏ．３３〜３６、及び図７Ｈ：サンプルＮｏ．４５〜４８）。特に、Ｄ２に関して強い特異的バンドが検出された（図７Ｅ：サンプルＮｏ．３４、及び図７Ｈ：サンプルＮｏ．４７）。また、ＴＥＦ、及びＨＬＦは、Ｄ２への結合が認められた（図７Ｆ：サンプルＮｏ．３９、図７Ｇ：サンプルＮｏ．４３）。
これらの結果より、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４によるＰＰＡＲγ６プロモーターの転写調節は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４が、直接ＰＰＡＲγ６プロモーターに存在するＤ−ボックスに結合して行われている可能性が示唆された。
【０１２５】
（実施例７：脂肪細胞分化過程におけるＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の役割）
脂肪細胞分化過程におけるＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の役割について、下記方法により検討を行った。
【０１２６】
＜ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色による検討＞
−方法−
−−ｍｉＲＮＡ配列の合成−−
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より提供されたＲＮＡｉ配列情報を元に、下記配列番号：４、５、１６、１７、２８、及び２９で表される２本鎖ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）配列を合成した。
ＤＢＰに対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：４で表される塩基配列、及び下記配列番号：５で表される塩基配列である。
ＴＥＦに対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：１６で表される塩基配列、及び下記配列番号：１７で表される塩基配列である。
Ｅ４ＢＰ４に対するｍｉＲＮＡは、下記配列番号：２８で表される塩基配列、及び下記配列番号：２９で表される塩基配列である。
前記ｍｉＲＮＡ（配列番号：４、５、１６、１７、２８、及び２９）をアニーリングした後、Ｂｌｏｃｋ−ｉｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：４）
ＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴ （配列番号：５）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１６）
ＴＴＴＡＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＡ （配列番号：１７）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２８）
ＡＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴ （配列番号：２９）
【０１２７】
−−細胞の培養−−
３Ｔ３−Ｌ１細胞（細胞株バンクＡＴＣＣ）を、２４ウエルプレートに５×１０４細胞／プレート播種し、脂肪前駆細胞培養用培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＣＳ）で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％コンフルエントになるまで培養した。
【０１２８】
−−トランスフェクション−−
前記ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４のｍｉＲＮＡの配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．８μｇを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションした。前記ｐｃＤＮＡ ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲは、ブラストシジン遺伝子配列を有することから、ブラストシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｇ／ｍＬによって導入細胞のセレクションを行なった。この細胞が、８５％コンフルエントになった段階で、インスリン（ナカライテスク（株）製）１０μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン（ナカライテスク（株）製）０．２５μＭ、及びＩＢＭＸ（ナカライテスク（株）製）０．５ｍＭにより分化誘導をかけ、分化誘導後７日目にｏｉｌ ｒｅｄ Ｏを用いた染色を行った。
【０１２９】
−結果−
結果を図８に示す。図８中、スケールバーは５０μｍである。
脂肪細胞への分化の評価は、脂肪滴数を指標に行った。ＤＢＰ、及びＴＥＦのｍｉＲＮＡを、単独あるいは両者を導入した細胞では脂肪滴数の減少が認められ、脂肪細胞への分化が阻害された。一方、Ｅ４ＢＰ４ ｍｉＲＮＡを導入した細胞では脂肪滴が増加する傾向が認められた。
【０１３０】
＜定量ＰＣＲによる検討＞
−方法−
−−細胞−−
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ社製）を、２４ウエルプレートに５×１０４細胞／プレート播種し、脂肪前駆細胞培養用培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７０％コンフルエントになるまで培養した。
【０１３１】
−−トランスフェクション−−
前記ＤＢＰ、及びＥ４ＢＰ４ 発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、ブラストシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）５μｇ／ｍＬによってセレクションを行なった。この細胞が、８５％コンフルエントになった段階で、インスリン（ナカライテスク（株）製）１０μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン（ナカライテスク（株）製）０．２５μＭ、及びＩＢＭＸ（ナカライテスク（株）製）０．５ｍＭにより分化誘導をかけ、分化誘導後７日目にＲＮＡ抽出を行った。
【０１３２】
−−ｍＲＮＡの抽出、及び精製−−
前記脂肪細胞の分化の検討を行った３Ｔ３−Ｌ１細胞より、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡ抽出、及び精製を行い、ＤＢＰのｍＲＮＡ量、及びＥ４ＢＰ４のｍＲＮＡ量をｑＰＣＲ（５０℃２分間を１サイクル、９５℃１０分間を１サイクル、及び９５℃１５秒間、及び６０℃１分間を４０サイクル）により測定した。
【０１３３】
結果を図９Ａ〜Ｂに示す。
ＤＢＰを発現させ、脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、分化に伴い、ＤＢＰの発現量が増加した（図９Ａ）。
一方、Ｅ４ＢＰ４を発現させ、脂肪細胞へ分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、分化に伴い、ＤＢＰの発現量が減少した（図９Ｂ）。
【０１３４】
実施例７の結果、ＤＢＰ、ＴＥＦ、及びＥ４ＢＰ４の発現は、脂肪分化と関連のあることが示唆された。その作用としては、ＤＢＰ、及びＴＥＦが、脂肪分化を促進し、Ｅ４ＢＰ４は、脂肪分化を抑制するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明のＰＰＡＲγ発現調節剤は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有することから、脂肪細胞への分化の調節、脂質代謝の調節、破骨細胞機能の調節、炎症の調節などに好適に利用可能である。
また、本発明の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤は、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかの阻害作用を有することから、医薬、健康食品、機能性食品などに好適に利用可能である。
更に、本発明のスクリーニング方法は、ＰＰＡＲγの発現調節作用を有する因子を効率よくスクリーニングできることから、ＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニングに好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表される塩基配列を有することを特徴とするＰＰＡＲγプロモーター配列。
【請求項２】
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤。
【請求項３】
ＰＰＡＲγの発現調節作用が、ＰＰＡＲγプロモーター配列に結合することによる請求項２に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤。
【請求項４】
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することを特徴とする脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項５】
阻害が、ｍｉＲＮＡによる請求項４に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡの配列が、配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する請求項５に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項７】
ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、
該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、
該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、
該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
プロモーターレポーター遺伝子のＰＰＡＲγプロモーター配列が、該ＰＰＡＲγプロモーター配列が有する３箇所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失した欠失変異体である請求項７に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
配列番号：１で表される塩基配列を有することを特徴とするＰＰＡＲγプロモーター配列。
【請求項２】
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰをコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤。
【請求項３】
ＰＰＡＲγの発現調節作用が、ＰＰＡＲγプロモーター配列に結合することによる請求項２に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤。
【請求項４】
ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦ、及びＥ４ＢＰ４、並びに、該ＤＢＰ、該ＴＥＦ、該ＨＬＦ、及び該Ｅ４ＢＰ４をコードするｃＤＮＡの少なくともいずれかを阻害することを特徴とする脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項５】
阻害が、ｍｉＲＮＡによる請求項４に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項６】
ｍｉＲＮＡの配列が、配列番号：２〜３３で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する請求項５に記載の脂肪分化調節剤、脂質代謝調節剤、破骨細胞機能調節剤、及び炎症調節剤。
【請求項７】
ＰＰＡＲγプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を構築するプロモーターレポーター遺伝子構築工程と、
該プロモーターレポーター遺伝子と、被験物質を含む被験試料とを細胞に導入する導入工程と、
該プロモーターレポーター遺伝子のレポーター活性を指標にして、ＰＰＡＲγプロモーター活性を検出する検出工程と、
該被験試料が、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有しているか否かを判断し、ＰＰＡＲγプロモーター活性の促進作用、及び抑制作用のいずれかの作用を有する該被験試料中の被験物質をＰＰＡＲγ発現調節剤としてスクリーニングするスクリーニング工程と、
を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
プロモーターレポーター遺伝子のＰＰＡＲγプロモーター配列が、該ＰＰＡＲγプロモーター配列が有する３箇所のＤ−ボックスの少なくともいずれかを欠失した欠失変異体である請求項７に記載のＰＰＡＲγ発現調節剤のスクリーニング方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【公開番号】特開２０１０−２６３８１８（Ｐ２０１０−２６３８１８Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１６８４５（Ｐ２００９−１１６８４５）
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]