早期膵がんの検出方法
【課題】腫瘍サイズが２ｃｍ以下の早期膵がんを短時間かつ容易に検出する方法およびそれに使用する試薬を提供する。
【解決手段】この発明の早期膵がんの検出方法は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む。
【解決手段】この発明の早期膵がんの検出方法は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がんの検出方法に関し、より詳細には、微小サイズの早期膵がんを簡便かつ短時間に非侵襲的に検出する方法及びその方法に好適な試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵がんは、特徴的な自覚症状に乏しく、７５％以上はステージＩＶ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以上、膵がんは膵臓の外へ少し出ており、第２群のリンパ節転移があるか、またはがんが膵臓周囲の血管におよんでいるがリンパ節転移はないか第１群までに限られている）で発見される。発見が遅れる結果、５年生存率が５％以下という極めて予後不良な悪性がんとなっている。さらに、ステージＩ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以下、リンパ節転移なし、膵臓の内部に限局）の切除例でも、５年生存率が３２％という難治がんである。
【０００３】
膵がんによる死亡率を顕著に下げるためには、膵臓における１ｃｍ以下の微小病変の早期発見とそれに基づいた早期治療が不可欠である。膵がん診断法の１つに、放射性造影剤を用いたＰＥＴ診断がある。特に、造影剤としてＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を用いたＰＥＴ診断（ＦＤＧ−ＰＥＴ）は、保険適用もあって普及している。しかし、ＦＤＧ−ＰＥＴを含む従来の膵がんのＰＥＴ診断では、異型過形成や１ｃｍ以下の微小膵がん、及び、ステージＩ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以下）の検出が困難である。さらに、ＦＤＧは、炎症部位（膵炎）に対して擬陽性を呈することがある。したがって、現状では、膵がんの微小病変を高い確度で検出する方法やそれに用いるイメージング剤は確立されていない。
【０００４】
インテグリンは、細胞接着（細胞−細胞間、細胞−細胞外基質間）に関与する膜貫通型の糖タンパクの一種である。インテグリンは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ２量体で構成され、サブタイプがいくつか知られている。αｖβ３インテグリンは、一部の腫瘍細胞や血管新生中の内皮細胞に高発現し、通常の正常細胞や内皮細胞にはほとんど発現しない。そこで、αｖβ３インテグリンが、腫瘍イメージングにおける標的分子として注目されている。
【０００５】
αｖβ３インテグリンは、特にアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の配列からなるペプチド（ＲＧＤ）を認識する。この特性を利用して、種々のＲＧＤ類似化合物やＲＧＤ含有ペプチドからなるαｖβ３インテグリンリガンド等が開発されている。
【０００６】
例えば、１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｙＶ）及び１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｆＹ）が、ＭｅｌａｎｏｍａＭ２１、Ｏｓｔｅｒｏｓａｒｃｏｍａ、Ｍａｍｍａｒｙ ｃａｃｒｉｎｏｍａを移植した担がんモデルマウスで評価されている（非特許文献１）。１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｙＶ）は、αｖβ３インテグリン特異的な腫瘍集積と速やかな血液クリアランスを示すが、肝臓への高い集積を示すことが問題であった。肝臓への非特異的集積を改善するために、ｃ（ＲＧＤｙＫ）やｃ（ＲＧＤｆＫ）が開発された（非特許文献２〜３）。
【０００７】
また、ペプチドに糖修飾することにより親水性を高めたＧａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）が開発されている。糖の導入は、アミノメチル基への１８Ｆ標識（［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ））を可能にし、薬物動態の改善とＰＥＴトレーサーへの応用を可能にする。Ｈａｕｂｎｅｒらは、悪性黒色腫、肉種、骨転移がん及び絨毛結節性骨膜炎の患者９名に１８５Ｍｂｑの［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与した（非特許文献５）。［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）は腎臓に最も高い集積を示し、動物実験から得られた知見とよく一致した。
【０００８】
本発明者もまた、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）及び９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）を用いたαｖβ３インテグリンイメージング及び内用放射線療法を報告している（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒ．Ｈａｕｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．：Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ αｖβ３ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４０，１０６１−１０７１（１９９９）
【非特許文献２】Ｘ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．：ＭｉｃｒｏＰＥＴ ａｎｄ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ αｖ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ １８Ｆ− ａｎｄ ６４Ｃｕ−ｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１５，４１−４９（２００４）
【非特許文献３】Ｘ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ １２５Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３１，１１−１９（２００４）
【非特許文献４】Ｍ．Ｊａｎｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｃ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，１７，６４１−６４６（２００２）
【非特許文献５】Ｒ．Ｈａｕｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．：Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ αｖβ３ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ＲＧＤ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．，２，ｅ７０（２００５）
【非特許文献６】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．：αｖβ３Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｕｇ １，１２３（３），７０９−１５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、膵がんの微小病変の発見に基づく早期膵がんの検出方法、及びその方法に好適な試薬及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、αｖβ３インテグリンを標的とした膵がんイメージングを鋭意検討した結果、以下の方法によれば早期膵がんを検出可能であることを発見した。すなわち、本発明は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む、早期膵がんの検出方法、ならびに放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを有効成分とする、哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキットを提供する。
【００１２】
ｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドは、血管内皮細胞を標的にした血管新生や腫瘍のイメージングに使用されることが示唆されており、そのため、腫瘍の浸潤・転移能といった悪性度の評価に利用されていた。しかし、膵がんの早期発見は非常に困難であるという従来の認識から、微小病変の発見を目的とした膵がんの早期検出には利用されていなかった。したがって、本発明の方法及び試薬により膵がんの微小病変をｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージング可能であることは全く予想できなかった。
【００１３】
本発明の方法及び試薬に使用する放射性核種は、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、及び放射性銅及び放射性フッ素の少なくとも一種であることが好ましい。
【００１４】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドは、特に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
ＦＧＤ（フルオロデオキシグルコース）のような従来の放射性標識剤を使用したＰＥＴでは、早期膵がんの検出が困難であった。一方、本発明の方法及び試薬によれば、これらの早期膵がんを簡便かつ短時間に検出することができる。ＦＤＧは膵炎にも取り込まれるため、膵炎を膵がんと判断することがある。それに対して、本発明の方法で使用する１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）などは炎症部位に取り込まれ難いため、本発明の検出方法は、膵がんの陽性率の数値の確度が高まる。しかも、本発明に使用するｃ（ＲＧＤｆＫ）は正常組織への集積が低く、したがって患者への被曝線量が低くできる点でも、本発明の方法及び試薬は、有利である。また、本発明の方法及び試薬は、治療、予後の観察等への利用が期待される。また、膵がんの抗ガン剤を開発する際の評価手段としても期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】化学発がん物質ＢＯＰを投与したハムスターの膵管がんの発達過程とαｖβ３インテグリンの発現：（Ａ１）正常な腺管のＨＥ染色図、（Ａ２）正常な腺管のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｂ１）腺管内の過形成部（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のＨＥ染色図、（Ｂ２）腺管内の過形成部（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｃ１）腺管内の異型過形成部（Ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のＨＥ染色図、（Ｃ２）腺管内の異型過形成部（Ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｄ１）膵管がんのＨＥ染色図、（Ｄ２）膵管がんのαｖβ３インテグリンの染色図を示す。
【図２】本発明の早期膵がんの検出方法のプロトコールを示す。条件は、以下のとおりである。投与量：１８．５〜３７ＭＢｑ、ＣＴの撮像スケジュール：ＳＰＥＣＴ撮像を行う前に臨床用ヨード造影剤（イオパミロン等）を投与し、その後、撮像を行う、ＳＰＥＣＴの撮像スケジュール：１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）投与１時間後及び４時間後、合計撮像時間：１時間（ｅｘ ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴの場合は、０．５時間）
【図３】ＢＯＰ投与後１８週目ハムスターの微小膵がんの、（Ａ）解剖図（肉眼所見無し）、（Ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴ（○内は、微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｃ）ＡＲＧ（□内は、〜１．５ｍｍの微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｄ）病理切片のＨＥ染色図、（Ｅ）Ｄの拡大図を示す。
【図４】ＢＯＰ投与後２２週目ハムスターの膵がんのＳＰＥＣＴ：（Ａ）解剖図（○内は、膵頭部に見られた膵がんを示す）、（Ｂ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は、図Ａの膵頭部にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｃ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、膵がん部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｄ）摘出したハムスターのすい臓（○内は、図Ａは膵頭部に見られた膵がん（４ｍｍ）、○内は脾葉部位にできた膵がん（３ｍｍ）を示す）、（Ｅ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は図Ｄの脾葉部位にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積を示す）、（Ｆ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、図Ｄの脾葉部位にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）を示す。
【図５】図４のハムスターの膵臓の、（Ａ）解剖図（○内は、膵頭にできた膵がん、右下○内は、脾葉にできた膵がんを示す）、（Ｂ）〜（Ｅ）ｅｘ ｖｉｖｏＳＰＥＣＴ（○内は、膵頭及び脾葉にできた膵がんを示す）を示す。
【図６】図４のハムスターの、（Ａ）膵頭部の解剖写真とＡＲＧ、（Ｂ）病理組織のＨＥ染色図、（Ｃ）図Ｂの□内の拡大図、（Ｄ）脾葉の解剖写真とＡＲＧ、（Ｅ）病理組織のＨＥ染色図、（Ｆ）図Ｅの□内の拡大図を示す。
【図７】ＢＯＰ投与後２3週目ハムスターの膵臓の、（Ａ）解剖図（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｂ）Ａの拡大図、（Ｃ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｄ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｅ）ＳＰＥＣＴ矢状断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）を示す。
【図８】図７のハムスターの膵頭部のＡＲＧとＨＥ染色図（□内は、膵頭部にできた膵がんを示す）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の早期膵がんの検出方法及び試薬をより詳細に説明する。本発明の膵がんの検出する方法は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を必須とする。
【００１８】
前記ｃ（ＲＧＤｆＫ）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄフェニルアラニン−リジンの順で環状に結合した環状ペンタペプチドである。様々なＲＧＤ様化合物が開発されている中で、ｃ（ＲＧＤｆＫ）は、脂溶性のチロシンを含むｃ（ＲＧＤｙＫ）に比べ肝臓への集積が低い、また、ｃ（ＲＧＤｆＫ）が２個結合したダイマーや４個結合したテトラマーに比べて正常組織（特に肝臓、腎臓）への集積が低く、その結果、被曝線量低減につながるという点で、その他のＲＧＤ様化合物よりも優れる。
【００１９】
前記放射性核種の例として、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅のような放射性金属核種、１８Ｆのような放射性ハロゲン核種が挙げられる。本発明には、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、６２Ｃｕ、及び６４Ｃｕの少なくも一種を用いることが、核医学用画像診断機器（ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）で体外から正確に検出できる点で好ましい。なお、核医学用画像診断機器の選択に応じて、適宜の放射性核種が選ばれる。
【００２０】
１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕなどの放射性金属核種は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミノペンタ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−ｔｒｉａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＹＮＩＣ（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）のようなキレート剤を介してｃ（ＲＧＤｆＫ）と結合することができる。また、１８Ｆのような放射性ハロゲンは、ガラクトースなどを介してｃ（ＲＧＤｆＫ）と結合することができる。
【００２１】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドの好適な例は、下記化学式：
【化１】
で示される１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６２Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６２Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６７Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、１８Ｆ−Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）などである。
【００２２】
本発明の試薬又はそのキットは、上記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を必須の有効成分とし、適宜、ｐＨ緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤等の医薬的に許容される添加剤を含む。
【００２３】
本発明では、前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を、哺乳動物に投与する。哺乳動物の例には、ヒトの他に、ハムスター、ラット、マウスのような実験動物が挙げられる。特に、ハムスターは、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｂｉｓ（２−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｅ（以下、ＢＯＰという）のような化学発がん物質で膵管がんや膵がん前がん病変を約１０週間で発症させることができる。
【００２４】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を、静脈内注射の投与経路で哺乳動物へ投与する。その投与量は、動物種、放射性核種、放射性核種検知手段などの種類にもよるが、通常、７．４〜３７０ＭＢｑになる量である。ハムスターの場合、好ましくは１８．５〜３７ＭＢｑになる量である。ヒトの場合、好ましくは１８５〜３７０ＭＢｑになる量である。
【００２５】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与した哺乳動物の膵臓を、適宜の放射性核種検知手段でｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージング又は計測する。αｖβ３インテグリンは腫瘍化した膵臓に高発現するので、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）による膵臓での描出部位は、膵がんの発症を大いに示唆する。
【００２６】
放射性核種検知手段として、ＳＰＥＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＡＲＧ（Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ、オートジオグラフィ）、が挙げられる。これらの検知手段によれば、肉眼や病理診断では観察が困難な微小膵がんのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージングが可能である。特にＳＰＥＣＴ／ＣＴやＰＥＴ／ＣＴは、ＳＰＥＣＴとＣＴやＰＥＴとＣＴの融合画像の取得により、核医学の生体情報と解剖学的情報とを関連づけられる点で有利である。
【００２７】
放射性核種検知手段による測定時期は、測定する動物種や使用する核種により適宜決められるが、通常、標識化ｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与してから、０．５〜２４時間後、好ましくは１〜４時間後である。２４時間よりも遅すぎると、放射能の減衰また標識化ｃ（ＲＧＤｆＫ）の腫瘍組織からの洗い流しにより、膵がんを見逃す恐れがある。
【００２８】
前記放射性核種を検出する工程では、膵臓内部に限局した大きさが２ｃｍ以下、好ましくは１ｃｍ以下の腫瘍を検出する。この腫瘍の大きさは、膵がんのステージＩの早期がんの症状を意味する。本発明によれば、従来検出が困難であった早期膵がんを非侵襲的に短時間かつ容易に検出することが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．分子プローブの合成
非特許文献６に記載される方法に従って、ｃ（ＲＧＤｆＫ）にキレート剤としてのＤＯＴＡを結合させた後、さらに放射性核種１１１Ｉｎで結合することにより、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。具体的には、以下の手順で合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた固相合成法によりｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンの存在下、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒと反応させ、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）を必要量の１１１ＩｎＣｌ３に添加した。該混合溶液を室温で５分間放置し、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を添加した。この混合物を１００℃で１５分間加熱した。
【００３０】
１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の精製を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ３００ ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１５０ｍｍ，Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を用いたＨＰＬＣにより行った。溶出溶媒として、９０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）と１０％のアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を用いた。１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の放射化学純度は、９９％以上であった。
【００３１】
２．発がんとαｖβ３インテグリンの発現
化学発がんモデルを用いた１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）による早期膵がんイメージングを検討するために、ヒト膵がんとほぼ同様な発がん過程及び病理組織像を示すハムスターのＢＯＰ化学発がんモデルを用いた。具体的には、６週齢の雌性シリアンゴールデンハムスター（日本エスエルシー（株）より入手）に発がん剤であるＢＯＰを１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で処置した。
【００３２】
図１のＡ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ１に示す膵がんの発達過程で、ハムスターの膵臓から切片を取得し、ＨＥ染色及びαｖβ３インテグリンの染色を行った。ＨＥ染色結果を図１のＡ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ１に示す。αｖβ３インテグリンのＨＥ染色の結果、前がん病変部（図１のＢ２やＣ２）ですでにαｖβ３インテグリンの発現が認められ、膵臓腺管がん部（図１のＤ２）に強い発現が認められた。
【００３３】
３．膵がん検出試薬の投与と検出
ＢＯＰ投与後、１６、１８、２２及び２３週目のハムスター計６匹に、それぞれ１８．５〜３７ＭＢｑの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を静脈内投与した。
【００３４】
上記ハムスターに対して、図２のプロトコールに従って生体分析を行った。具体的には、試薬投与１及び４時間後に、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置（Ｂｉｏｓｃａｎ社製）を用いてＣＴ／ＳＰＥＣＴを撮影した。そして、投与２時間後又は５時間後、ハムスターを屠殺し、膵臓組織を採取した。摘出した膵臓のＣＴとＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）を撮影した。
【００３５】
また、オートジオグラフィー（ＡＲＧ）を用いて腫瘍への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積分布及び強度の解析を行った。採取した膵臓組織から凍結切片を作成し、スライドガラスに貼り付けた。得られた切片をイメージングプレート（富士フィルム社製）に密着させた。画像解析装置（富士フィルム社製）にて画像化し、腫瘍部位と正常膵臓部位に関心領域を設定し、腫瘍／非腫瘍比（Ｔ／Ｎ比）を、下記式により求めた。
【数１】
【００３６】
さらに、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が実際の腫瘍部位と一致するか否かを調べるため、摘出した組織をＨＥ染色することにより、病理学的診断を行った。
【００３７】
〔１８週目〕
図３に、２４週齢（ＢＯＰ投与後１８週）のハムスターから摘出した膵臓部位の解剖写真、ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、ＡＲＧ及びＨＥ染色図（組織病理像）を示す。ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）では、２ｍｍ以下の微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積を確認することができた。また、この集積部位はＡＲＧ解析における高集積部位（Ｔ／Ｎ＞４．９、図３のＣ）と一致した。さらに、病理切片のＨＥ染色図（図３のＤ及びＥ）から、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が前がん病変部（異型過形成）であることを確認した。このように、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）が正常膵臓に対して微小病変に高集積を示しことがから、ヒトの臨床試験においても微小病変からなる早期膵がんの検出が可能であると考えられる。
【００３８】
〔２２週目〕
２８週齢（ＢＯＰ投与後２２週目）のハムスターについて、図４に解剖写真と膵臓腫瘍のＳＰＥＣＴ、図５にＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、そして、図６に膵頭部及び脾葉部のＡＲＧとＨＥ染色図（病理組織像）を示す。
【００３９】
図４に示すとおり、ＳＰＥＣＴ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、大きさが３ｍｍと４ｍｍの腫瘍部位に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積が認められた。また、図５に示すとおり、ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において、摘出膵臓において確認された腫瘍部位に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積が認められた。図６のＡＲＧの解析では腫瘍正常膵臓組織比（Ｔ／Ｎ）が平均４．０と高い値を示した。
【００４０】
〔２３週目〕
５ｍｍ以上の膵がんにおいても、ＳＰＥＣＴ（ｉｎ ｖｉｖｏ）イメージングで１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の明らかな高集積が見られた。
【００４１】
１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が実際の腫瘍部位と一致するか否かを調べるため、ＨＥ染色による病理学的診断を行った。結果を図８に示す。図８から、病理切片との対比によって１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積部位と実際の腫瘍部位が一致することを確認した。
【００４２】
〔実施例２〕
ＦＤＧは、がん細胞に取り込まれるため、ＰＥＴ撮影のイメージング剤として使用されている。しかし、ＦＤＧは炎症細胞にも取り込まれるため、がん診断の際に擬陽性を呈することがある。そこで、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の炎症部位への取り込みを以下の手順で測定した。対照の１８Ｆ−ＦＤＧについても、同様の測定を行った。
【００４３】
ｄｄＹマウス（♂、６週齢）に１匹あたり５０μＬのテレピン油を下肢大腿部に筋注した。処置後３日経過した動物を炎症モデルとして実験に使用した。９２５ＫＢｑの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）又は１８Ｆ−ＦＤＧを尾静脈より投与した。投与１時間後に炎症部位を取り出し、凍結切片を作成した。オートラジオグラフィーにより解析を行い、炎症部位と正常筋肉組織への集積比（炎症筋肉比；Ｉ／Ｍ比）を算出した。
【００４４】
１８Ｆ−ＦＤＧのＩ／Ｍ比は８．３７と高値を示した。一方、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）のＩ／Ｍ比は１．９８と低値であった。このことから、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）は１８Ｆ−ＦＤＧに比べて炎症部位への集積が非常に低いことから、膵がんと膵炎との鑑別も容易であることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵がんの検出方法に関し、より詳細には、微小サイズの早期膵がんを簡便かつ短時間に非侵襲的に検出する方法及びその方法に好適な試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵がんは、特徴的な自覚症状に乏しく、７５％以上はステージＩＶ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以上、膵がんは膵臓の外へ少し出ており、第２群のリンパ節転移があるか、またはがんが膵臓周囲の血管におよんでいるがリンパ節転移はないか第１群までに限られている）で発見される。発見が遅れる結果、５年生存率が５％以下という極めて予後不良な悪性がんとなっている。さらに、ステージＩ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以下、リンパ節転移なし、膵臓の内部に限局）の切除例でも、５年生存率が３２％という難治がんである。
【０００３】
膵がんによる死亡率を顕著に下げるためには、膵臓における１ｃｍ以下の微小病変の早期発見とそれに基づいた早期治療が不可欠である。膵がん診断法の１つに、放射性造影剤を用いたＰＥＴ診断がある。特に、造影剤としてＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を用いたＰＥＴ診断（ＦＤＧ−ＰＥＴ）は、保険適用もあって普及している。しかし、ＦＤＧ−ＰＥＴを含む従来の膵がんのＰＥＴ診断では、異型過形成や１ｃｍ以下の微小膵がん、及び、ステージＩ（腫瘍の大きさが２ｃｍ以下）の検出が困難である。さらに、ＦＤＧは、炎症部位（膵炎）に対して擬陽性を呈することがある。したがって、現状では、膵がんの微小病変を高い確度で検出する方法やそれに用いるイメージング剤は確立されていない。
【０００４】
インテグリンは、細胞接着（細胞−細胞間、細胞−細胞外基質間）に関与する膜貫通型の糖タンパクの一種である。インテグリンは、α鎖とβ鎖からなるヘテロ２量体で構成され、サブタイプがいくつか知られている。αｖβ３インテグリンは、一部の腫瘍細胞や血管新生中の内皮細胞に高発現し、通常の正常細胞や内皮細胞にはほとんど発現しない。そこで、αｖβ３インテグリンが、腫瘍イメージングにおける標的分子として注目されている。
【０００５】
αｖβ３インテグリンは、特にアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の配列からなるペプチド（ＲＧＤ）を認識する。この特性を利用して、種々のＲＧＤ類似化合物やＲＧＤ含有ペプチドからなるαｖβ３インテグリンリガンド等が開発されている。
【０００６】
例えば、１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｙＶ）及び１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｆＹ）が、ＭｅｌａｎｏｍａＭ２１、Ｏｓｔｅｒｏｓａｒｃｏｍａ、Ｍａｍｍａｒｙ ｃａｃｒｉｎｏｍａを移植した担がんモデルマウスで評価されている（非特許文献１）。１２５Ｉ−ｃ（ＲＧＤｙＶ）は、αｖβ３インテグリン特異的な腫瘍集積と速やかな血液クリアランスを示すが、肝臓への高い集積を示すことが問題であった。肝臓への非特異的集積を改善するために、ｃ（ＲＧＤｙＫ）やｃ（ＲＧＤｆＫ）が開発された（非特許文献２〜３）。
【０００７】
また、ペプチドに糖修飾することにより親水性を高めたＧａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）が開発されている。糖の導入は、アミノメチル基への１８Ｆ標識（［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ））を可能にし、薬物動態の改善とＰＥＴトレーサーへの応用を可能にする。Ｈａｕｂｎｅｒらは、悪性黒色腫、肉種、骨転移がん及び絨毛結節性骨膜炎の患者９名に１８５Ｍｂｑの［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与した（非特許文献５）。［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）は腎臓に最も高い集積を示し、動物実験から得られた知見とよく一致した。
【０００８】
本発明者もまた、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）及び９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）を用いたαｖβ３インテグリンイメージング及び内用放射線療法を報告している（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒ．Ｈａｕｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．：Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ αｖβ３ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４０，１０６１−１０７１（１９９９）
【非特許文献２】Ｘ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．：ＭｉｃｒｏＰＥＴ ａｎｄ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ αｖ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ １８Ｆ− ａｎｄ ６４Ｃｕ−ｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１５，４１−４９（２００４）
【非特許文献３】Ｘ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．：Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ １２５Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３１，１１−１９（２００４）
【非特許文献４】Ｍ．Ｊａｎｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｃ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ＲＧＤ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，１７，６４１−６４６（２００２）
【非特許文献５】Ｒ．Ｈａｕｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．：Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ αｖβ３ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ［１８Ｆ］Ｇａｌａｃｔｏ−ＲＧＤ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．，２，ｅ７０（２００５）
【非特許文献６】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．：αｖβ３Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＲＧＤ ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｕｇ １，１２３（３），７０９−１５（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、膵がんの微小病変の発見に基づく早期膵がんの検出方法、及びその方法に好適な試薬及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、αｖβ３インテグリンを標的とした膵がんイメージングを鋭意検討した結果、以下の方法によれば早期膵がんを検出可能であることを発見した。すなわち、本発明は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を含む、早期膵がんの検出方法、ならびに放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを有効成分とする、哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキットを提供する。
【００１２】
ｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドは、血管内皮細胞を標的にした血管新生や腫瘍のイメージングに使用されることが示唆されており、そのため、腫瘍の浸潤・転移能といった悪性度の評価に利用されていた。しかし、膵がんの早期発見は非常に困難であるという従来の認識から、微小病変の発見を目的とした膵がんの早期検出には利用されていなかった。したがって、本発明の方法及び試薬により膵がんの微小病変をｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージング可能であることは全く予想できなかった。
【００１３】
本発明の方法及び試薬に使用する放射性核種は、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、及び放射性銅及び放射性フッ素の少なくとも一種であることが好ましい。
【００１４】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドは、特に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
ＦＧＤ（フルオロデオキシグルコース）のような従来の放射性標識剤を使用したＰＥＴでは、早期膵がんの検出が困難であった。一方、本発明の方法及び試薬によれば、これらの早期膵がんを簡便かつ短時間に検出することができる。ＦＤＧは膵炎にも取り込まれるため、膵炎を膵がんと判断することがある。それに対して、本発明の方法で使用する１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）などは炎症部位に取り込まれ難いため、本発明の検出方法は、膵がんの陽性率の数値の確度が高まる。しかも、本発明に使用するｃ（ＲＧＤｆＫ）は正常組織への集積が低く、したがって患者への被曝線量が低くできる点でも、本発明の方法及び試薬は、有利である。また、本発明の方法及び試薬は、治療、予後の観察等への利用が期待される。また、膵がんの抗ガン剤を開発する際の評価手段としても期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】化学発がん物質ＢＯＰを投与したハムスターの膵管がんの発達過程とαｖβ３インテグリンの発現：（Ａ１）正常な腺管のＨＥ染色図、（Ａ２）正常な腺管のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｂ１）腺管内の過形成部（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のＨＥ染色図、（Ｂ２）腺管内の過形成部（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｃ１）腺管内の異型過形成部（Ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のＨＥ染色図、（Ｃ２）腺管内の異型過形成部（Ａｔｙｐｉｃａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）のαｖβ３インテグリンの染色図、（Ｄ１）膵管がんのＨＥ染色図、（Ｄ２）膵管がんのαｖβ３インテグリンの染色図を示す。
【図２】本発明の早期膵がんの検出方法のプロトコールを示す。条件は、以下のとおりである。投与量：１８．５〜３７ＭＢｑ、ＣＴの撮像スケジュール：ＳＰＥＣＴ撮像を行う前に臨床用ヨード造影剤（イオパミロン等）を投与し、その後、撮像を行う、ＳＰＥＣＴの撮像スケジュール：１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）投与１時間後及び４時間後、合計撮像時間：１時間（ｅｘ ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴの場合は、０．５時間）
【図３】ＢＯＰ投与後１８週目ハムスターの微小膵がんの、（Ａ）解剖図（肉眼所見無し）、（Ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴ（○内は、微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｃ）ＡＲＧ（□内は、〜１．５ｍｍの微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｄ）病理切片のＨＥ染色図、（Ｅ）Ｄの拡大図を示す。
【図４】ＢＯＰ投与後２２週目ハムスターの膵がんのＳＰＥＣＴ：（Ａ）解剖図（○内は、膵頭部に見られた膵がんを示す）、（Ｂ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は、図Ａの膵頭部にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｃ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、膵がん部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）、（Ｄ）摘出したハムスターのすい臓（○内は、図Ａは膵頭部に見られた膵がん（４ｍｍ）、○内は脾葉部位にできた膵がん（３ｍｍ）を示す）、（Ｅ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は図Ｄの脾葉部位にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積を示す）、（Ｆ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、図Ｄの脾葉部位にできた膵がんへの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の集積を示す）を示す。
【図５】図４のハムスターの膵臓の、（Ａ）解剖図（○内は、膵頭にできた膵がん、右下○内は、脾葉にできた膵がんを示す）、（Ｂ）〜（Ｅ）ｅｘ ｖｉｖｏＳＰＥＣＴ（○内は、膵頭及び脾葉にできた膵がんを示す）を示す。
【図６】図４のハムスターの、（Ａ）膵頭部の解剖写真とＡＲＧ、（Ｂ）病理組織のＨＥ染色図、（Ｃ）図Ｂの□内の拡大図、（Ｄ）脾葉の解剖写真とＡＲＧ、（Ｅ）病理組織のＨＥ染色図、（Ｆ）図Ｅの□内の拡大図を示す。
【図７】ＢＯＰ投与後２3週目ハムスターの膵臓の、（Ａ）解剖図（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｂ）Ａの拡大図、（Ｃ）ＳＰＥＣＴ冠状断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｄ）ＳＰＥＣＴ横断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）、（Ｅ）ＳＰＥＣＴ矢状断面画像（○内は、膵頭部にできた膵がんを示す）を示す。
【図８】図７のハムスターの膵頭部のＡＲＧとＨＥ染色図（□内は、膵頭部にできた膵がんを示す）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の早期膵がんの検出方法及び試薬をより詳細に説明する。本発明の膵がんの検出する方法は、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを、哺乳動物に投与する工程、及び、投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程を必須とする。
【００１８】
前記ｃ（ＲＧＤｆＫ）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄフェニルアラニン−リジンの順で環状に結合した環状ペンタペプチドである。様々なＲＧＤ様化合物が開発されている中で、ｃ（ＲＧＤｆＫ）は、脂溶性のチロシンを含むｃ（ＲＧＤｙＫ）に比べ肝臓への集積が低い、また、ｃ（ＲＧＤｆＫ）が２個結合したダイマーや４個結合したテトラマーに比べて正常組織（特に肝臓、腎臓）への集積が低く、その結果、被曝線量低減につながるという点で、その他のＲＧＤ様化合物よりも優れる。
【００１９】
前記放射性核種の例として、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅のような放射性金属核種、１８Ｆのような放射性ハロゲン核種が挙げられる。本発明には、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、６２Ｃｕ、及び６４Ｃｕの少なくも一種を用いることが、核医学用画像診断機器（ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）で体外から正確に検出できる点で好ましい。なお、核医学用画像診断機器の選択に応じて、適宜の放射性核種が選ばれる。
【００２０】
１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕなどの放射性金属核種は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミノペンタ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−ｔｒｉａｚａｃｙｃｌｏｎｏｎａｎｅ−１，４，７−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＹＮＩＣ（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）のようなキレート剤を介してｃ（ＲＧＤｆＫ）と結合することができる。また、１８Ｆのような放射性ハロゲンは、ガラクトースなどを介してｃ（ＲＧＤｆＫ）と結合することができる。
【００２１】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドの好適な例は、下記化学式：
【化１】
で示される１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６２Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６４Ｃｕ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６２Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６７Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）、１８Ｆ−Ｇａｌａｃｔｏ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）などである。
【００２２】
本発明の試薬又はそのキットは、上記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を必須の有効成分とし、適宜、ｐＨ緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤等の医薬的に許容される添加剤を含む。
【００２３】
本発明では、前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を、哺乳動物に投与する。哺乳動物の例には、ヒトの他に、ハムスター、ラット、マウスのような実験動物が挙げられる。特に、ハムスターは、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｂｉｓ（２−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｅ（以下、ＢＯＰという）のような化学発がん物質で膵管がんや膵がん前がん病変を約１０週間で発症させることができる。
【００２４】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を、静脈内注射の投与経路で哺乳動物へ投与する。その投与量は、動物種、放射性核種、放射性核種検知手段などの種類にもよるが、通常、７．４〜３７０ＭＢｑになる量である。ハムスターの場合、好ましくは１８．５〜３７ＭＢｑになる量である。ヒトの場合、好ましくは１８５〜３７０ＭＢｑになる量である。
【００２５】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与した哺乳動物の膵臓を、適宜の放射性核種検知手段でｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージング又は計測する。αｖβ３インテグリンは腫瘍化した膵臓に高発現するので、放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）による膵臓での描出部位は、膵がんの発症を大いに示唆する。
【００２６】
放射性核種検知手段として、ＳＰＥＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＰＥＴ（ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＡＲＧ（Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ、オートジオグラフィ）、が挙げられる。これらの検知手段によれば、肉眼や病理診断では観察が困難な微小膵がんのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏイメージングが可能である。特にＳＰＥＣＴ／ＣＴやＰＥＴ／ＣＴは、ＳＰＥＣＴとＣＴやＰＥＴとＣＴの融合画像の取得により、核医学の生体情報と解剖学的情報とを関連づけられる点で有利である。
【００２７】
放射性核種検知手段による測定時期は、測定する動物種や使用する核種により適宜決められるが、通常、標識化ｃ（ＲＧＤｆＫ）を投与してから、０．５〜２４時間後、好ましくは１〜４時間後である。２４時間よりも遅すぎると、放射能の減衰また標識化ｃ（ＲＧＤｆＫ）の腫瘍組織からの洗い流しにより、膵がんを見逃す恐れがある。
【００２８】
前記放射性核種を検出する工程では、膵臓内部に限局した大きさが２ｃｍ以下、好ましくは１ｃｍ以下の腫瘍を検出する。この腫瘍の大きさは、膵がんのステージＩの早期がんの症状を意味する。本発明によれば、従来検出が困難であった早期膵がんを非侵襲的に短時間かつ容易に検出することが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．分子プローブの合成
非特許文献６に記載される方法に従って、ｃ（ＲＧＤｆＫ）にキレート剤としてのＤＯＴＡを結合させた後、さらに放射性核種１１１Ｉｎで結合することにより、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。具体的には、以下の手順で合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸を用いた固相合成法によりｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンの存在下、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒと反応させ、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を合成した。３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）を必要量の１１１ＩｎＣｌ３に添加した。該混合溶液を室温で５分間放置し、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を添加した。この混合物を１００℃で１５分間加熱した。
【００３０】
１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の精製を、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ ３００ ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１５０ｍｍ，Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を用いたＨＰＬＣにより行った。溶出溶媒として、９０％水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）と１０％のアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を用いた。１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の放射化学純度は、９９％以上であった。
【００３１】
２．発がんとαｖβ３インテグリンの発現
化学発がんモデルを用いた１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）による早期膵がんイメージングを検討するために、ヒト膵がんとほぼ同様な発がん過程及び病理組織像を示すハムスターのＢＯＰ化学発がんモデルを用いた。具体的には、６週齢の雌性シリアンゴールデンハムスター（日本エスエルシー（株）より入手）に発がん剤であるＢＯＰを１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で処置した。
【００３２】
図１のＡ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ１に示す膵がんの発達過程で、ハムスターの膵臓から切片を取得し、ＨＥ染色及びαｖβ３インテグリンの染色を行った。ＨＥ染色結果を図１のＡ１、Ｂ１、Ｃ１及びＤ１に示す。αｖβ３インテグリンのＨＥ染色の結果、前がん病変部（図１のＢ２やＣ２）ですでにαｖβ３インテグリンの発現が認められ、膵臓腺管がん部（図１のＤ２）に強い発現が認められた。
【００３３】
３．膵がん検出試薬の投与と検出
ＢＯＰ投与後、１６、１８、２２及び２３週目のハムスター計６匹に、それぞれ１８．５〜３７ＭＢｑの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を静脈内投与した。
【００３４】
上記ハムスターに対して、図２のプロトコールに従って生体分析を行った。具体的には、試薬投与１及び４時間後に、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置（Ｂｉｏｓｃａｎ社製）を用いてＣＴ／ＳＰＥＣＴを撮影した。そして、投与２時間後又は５時間後、ハムスターを屠殺し、膵臓組織を採取した。摘出した膵臓のＣＴとＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）を撮影した。
【００３５】
また、オートジオグラフィー（ＡＲＧ）を用いて腫瘍への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積分布及び強度の解析を行った。採取した膵臓組織から凍結切片を作成し、スライドガラスに貼り付けた。得られた切片をイメージングプレート（富士フィルム社製）に密着させた。画像解析装置（富士フィルム社製）にて画像化し、腫瘍部位と正常膵臓部位に関心領域を設定し、腫瘍／非腫瘍比（Ｔ／Ｎ比）を、下記式により求めた。
【数１】
【００３６】
さらに、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が実際の腫瘍部位と一致するか否かを調べるため、摘出した組織をＨＥ染色することにより、病理学的診断を行った。
【００３７】
〔１８週目〕
図３に、２４週齢（ＢＯＰ投与後１８週）のハムスターから摘出した膵臓部位の解剖写真、ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、ＡＲＧ及びＨＥ染色図（組織病理像）を示す。ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）では、２ｍｍ以下の微小病変部位への１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積を確認することができた。また、この集積部位はＡＲＧ解析における高集積部位（Ｔ／Ｎ＞４．９、図３のＣ）と一致した。さらに、病理切片のＨＥ染色図（図３のＤ及びＥ）から、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が前がん病変部（異型過形成）であることを確認した。このように、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）が正常膵臓に対して微小病変に高集積を示しことがから、ヒトの臨床試験においても微小病変からなる早期膵がんの検出が可能であると考えられる。
【００３８】
〔２２週目〕
２８週齢（ＢＯＰ投与後２２週目）のハムスターについて、図４に解剖写真と膵臓腫瘍のＳＰＥＣＴ、図５にＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、そして、図６に膵頭部及び脾葉部のＡＲＧとＨＥ染色図（病理組織像）を示す。
【００３９】
図４に示すとおり、ＳＰＥＣＴ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、大きさが３ｍｍと４ｍｍの腫瘍部位に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積が認められた。また、図５に示すとおり、ＳＰＥＣＴ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において、摘出膵臓において確認された腫瘍部位に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積が認められた。図６のＡＲＧの解析では腫瘍正常膵臓組織比（Ｔ／Ｎ）が平均４．０と高い値を示した。
【００４０】
〔２３週目〕
５ｍｍ以上の膵がんにおいても、ＳＰＥＣＴ（ｉｎ ｖｉｖｏ）イメージングで１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の明らかな高集積が見られた。
【００４１】
１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の集積部位が実際の腫瘍部位と一致するか否かを調べるため、ＨＥ染色による病理学的診断を行った。結果を図８に示す。図８から、病理切片との対比によって１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の高集積部位と実際の腫瘍部位が一致することを確認した。
【００４２】
〔実施例２〕
ＦＤＧは、がん細胞に取り込まれるため、ＰＥＴ撮影のイメージング剤として使用されている。しかし、ＦＤＧは炎症細胞にも取り込まれるため、がん診断の際に擬陽性を呈することがある。そこで、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）の炎症部位への取り込みを以下の手順で測定した。対照の１８Ｆ−ＦＤＧについても、同様の測定を行った。
【００４３】
ｄｄＹマウス（♂、６週齢）に１匹あたり５０μＬのテレピン油を下肢大腿部に筋注した。処置後３日経過した動物を炎症モデルとして実験に使用した。９２５ＫＢｑの１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）又は１８Ｆ−ＦＤＧを尾静脈より投与した。投与１時間後に炎症部位を取り出し、凍結切片を作成した。オートラジオグラフィーにより解析を行い、炎症部位と正常筋肉組織への集積比（炎症筋肉比；Ｉ／Ｍ比）を算出した。
【００４４】
１８Ｆ−ＦＤＧのＩ／Ｍ比は８．３７と高値を示した。一方、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）のＩ／Ｍ比は１．９８と低値であった。このことから、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）は１８Ｆ−ＦＤＧに比べて炎症部位への集積が非常に低いことから、膵がんと膵炎との鑑別も容易であることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを哺乳動物に投与する工程、及び、
投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程、
を含む、早期膵がんの検出方法。
【請求項２】
前記前記放射性核種を検出する工程は、膵臓内部に限局した大きさ２ｃｍ以下の腫瘍を検出することを特徴とする、請求項１に記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項３】
前記放射性核種が、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅、及び放射性フッ素の少なくとも一種から選択される、請求項１又は２に記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項４】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドが、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項５】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを有効成分とする、哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【請求項６】
前記放射性核種が、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅、及び放射性フッ素の少なくとも一種であるである、請求項５に記載の哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【請求項７】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドが、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載の哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【請求項１】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを哺乳動物に投与する工程、及び、
投与後の哺乳動物の膵臓における前記放射性核種を検出する工程、
を含む、早期膵がんの検出方法。
【請求項２】
前記前記放射性核種を検出する工程は、膵臓内部に限局した大きさ２ｃｍ以下の腫瘍を検出することを特徴とする、請求項１に記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項３】
前記放射性核種が、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅、及び放射性フッ素の少なくとも一種から選択される、請求項１又は２に記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項４】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドが、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の早期膵がんの検出方法。
【請求項５】
放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドを有効成分とする、哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【請求項６】
前記放射性核種が、放射性インジウム、放射性ガリウム、放射性テクネチウム、放射性銅、及び放射性フッ素の少なくとも一種であるである、請求項５に記載の哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【請求項７】
前記放射性核種で標識されたｃ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドが、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）であることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載の哺乳動物の早期膵がん検出用試薬又はそのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−４２２１５（Ｐ２０１２−４２２１５Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８０７７８（Ｐ２０１０−１８０７７８）
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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