早産リスク評価用バイオマーカーの同定及び定量
本明細書には、妊娠中の対象における早産リスクの評価方法が記載される。この方法は、対象からの生体試料中において早産に関連する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを検出及び定量することを含む。本明細書にはまた、単離されたバイオマーカー及び早産リスクの予測に有用なキットも記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２５３，５０３号明細書に対する優先権を主張する。この出願は、その全ての教示が本明細書によって全体として参照により援用される。
【０００２】
謝辞
本発明に至った研究は、一部についてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、交付金番号第Ｒ２１ＨＤ０４７３１９号及び同第Ｕ０１ＨＤ０５００８０号による資金提供を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の相互参照
本明細書に記載されるペプチドは、配列識別子番号（配列番号）によって参照される。配列番号は数値的には配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２等に対応する。コンピュータ可読フォーマット（ＣＦＲ）で書かれた配列表は、全体として参照により援用される。
【背景技術】
【０００４】
早期分娩は、全体の１０％を超える妊娠中の母親に影響を及ぼす。早期分娩はまた、新生児に関連する主要な罹病及び死亡原因の一つである。満期で産まれた乳児と比較して、未熟で産まれた乳幼児では新生児死亡の４０倍の増加が認められ、脳性麻痺、慢性呼吸器疾患、失明及び難聴などの主要な医学的合併症のリスクが著しく高くなり得る。さらに、出生体重が１．５ポンド未満の場合、そのうち７０％もの子供に長期にわたる神経学的な及び発育上の問題が確認されている。これらの合併症に関連して、米国だけでも毎年数十億ドルの直接的なコスト、さらに未実現の潜在的コストが推定されている。
【０００５】
問題の重大さにもかかわらず、体内で何が起こって早期陣痛及び早期分娩に至るのかに関しては、不確かなままである。早産（ＰＴＢ）の原因に関してこのような不確かさがあるため、これらの問題には限定的にしか有効に対処できていないが、適切な事前の警告があれば、医療専門家は医学的な対策をとることができる。妊娠中のどの母親が早産を起こし易いかを予測することができたならば、未熟分娩を遅延させ、又はさらには防止し得る薬物を投与することができる。加えて、早産リスクが割合早く検出される場合に母親を介して胎児に投与されたならば、胎児肺成熟度を高め、従って早産に関連する主要な合併症の一つを低減できるホルモン誘導体が知られている。しかしながら、現在のところどの妊娠中の母親にこの妊娠合併症を発症するリスクがあるかを知る方法はないように思われる。従って、早産のリスクがある母親を早期に発見するための検査手順を策定することが必要とされており、これは重要でありながらいまだ対処されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、妊娠中の対象における早産のリスク評価方法が記載される。これらの方法は、対象からの生体試料中における早産に関連する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを検出し、及び定量するステップを含む。早産の予測において有用なバイオマーカーについてもまた詳細に記載される。本発明の利点は、一部については以下の説明に示され、一部については説明から明らかとなり得るか、又は以下に記載される態様を実施することにより分かり得る。以下に記載される利点は、特に添付の特許請求の範囲に指摘される要素及び組み合わせを用いて実現及び達成され得る。前述の概要及び以下の詳細な説明の双方とも、あくまでも例示的且つ説明的なものに過ぎず、限定するものではないことが理解されるべきである。
【０００７】
本明細書に援用され、且つその一部をなす添付の図面は、以下に記載されるいくつかの態様を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１のバイオマーカーについてスクリーニングした受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。
【図２】第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーについてスクリーニングした生体試料の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本化合物、組成物、及び／又は方法を開示及び説明する前に、以下に記載される態様は特定の化合物、合成方法、又は使用に限定されるものではなく、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語法は特定の態様の説明を目的としているに過ぎず、限定を意図するものではないことも理解されなければならない。
【００１０】
本明細書及び続く特許請求の範囲では多数の用語を参照し、それらは以下の意味を持つと定義するものとする。
【００１１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含むことは留意しなければならない。従って、例えば「バイオマーカー」に対する参照は２つ以上のかかるバイオマーカーの混合物を含み、他も同様である。
【００１２】
「任意選択の」又は「場合により」は、続いて記載される事象又は状況が起こることも、又は起こらないこともあり、及びその記載が、事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【００１３】
本明細書で使用されるとき「対象」は、早産のリスクがあり、且つ本明細書に記載される方法により利益を受ける妊婦を指す。
【００１４】
本明細書で使用されるとき「早産」は、妊娠期間の満期より前の児娩出を含む。例えば、妊娠３７週未満の児娩出が早産と見なされる。早産という用語は、早期分娩及び未熟分娩と同義語である。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「バイオマーカー」は、早産リスクの予測に有用な、様々な濃度で妊婦に存在する天然に認められる生体分子を指して使用され得る。例えばバイオマーカーは、早産を起こさなかった対象における同じバイオマーカーの量と比べて早産のリスクがある対象体内ではより多量に又はより少量で存在するペプチドであってもよい。バイオマーカーには、限定はされないが生体アミン及びステロイドなどの小分子を含めた、ペプチド以外の他の分子が含まれ得る。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸であって、一方のアミノ酸のカルボキシル基により他方のα−アミノ基に連結されたアミノ酸を含む天然又は合成分子を指して使用され得る。ペプチドの長さは限定されず、従って「ペプチド」にはポリペプチド及びタンパク質が含まれ得る。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、ペプチドとの関連における用語「単離された」は、材料が天然に認められるものである場合に、その当初の環境から取り出された材料を指す。例えば、生体動物中に存在する天然に認められるペプチドは単離されたものではなく、しかし同じペプチドであって、天然系内で共存する材料の一部又は全てから分離されたペプチドは、単離されている。かかる単離されたペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおその組成物がその天然の環境の一部ではないという点で単離されているといえる。「単離された」ペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術によって合成又は産生される材料も含む。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的免疫反応性」は、ペプチドと抗体との間での結合などの、生体試料中又はペプチドと他の生物学的物質との異種集団中でのペプチドの存在の決定因子となる測定可能且つ再現可能な特異的免疫反応を指す。用語「特異的免疫反応性」は、構造形状及び表面特徴の特異的認識を含み得る。従って、指定された条件下で、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性を有する抗体は、試料中に存在する他のペプチドに多量に結合することはない。特定のペプチドに対して特異的免疫反応性を有する抗体の決定には、様々なイムノアッセイフォーマットを用いることができる。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、ペプチドとの特異的免疫反応性を有するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。例えば、特異的免疫反応性の決定に用いられ得るイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、参照により本明細書に援用されるＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００１９】
本明細書で使用されるとき用語「抗体」は、所与の抗原に対して特異的免疫反応性を有する免疫グロブリンを指す。用語「抗体」は、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の全抗体、及びその断片を含むことが意図される。「抗体」はまた、本明細書で使用されるとき、抗体製剤も含む。抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて検出可能標識で標識されてもよい。標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、又は酵素補因子、又は当該技術分野において公知の任意の他の標識であってよい。いくつかの態様において、目的のペプチドに結合する抗体は標識されなくてもよく、代わりに、一次抗体に特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出されてもよい。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「検出する」は、検出不能な、低い、正常な、又は高い血清濃度の１つ又は複数のバイオマーカー、例えばペプチド及び他の生体分子の定量的計測を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「定量する」及び「定量」は同義的に用いることができ、相対的か絶対的かにかかわらず、試料中の物質（例えば、バイオマーカー）の数量又は存在量を決定するプロセスを指す。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、所与の値が所望の結果に影響を及ぼすことなく端点を「少し上回る」又は「少し下回る」ものであってよいことを付け加えることにより数値範囲の端点に柔軟性をもたせるために使用される。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、便宜上、ある共通のリストに複数の項目、構造要素、組成要素、及び／又は材料が提示され得る。しかしながらこれらのリストは、リストの各構成物が個別的な且つ固有の構成物として個々に特定されたものとして解釈されなければならない。従ってかかるリストの個々の構成物のいずれも、反する旨の指示がなければ、共通の分類中にそれらが現れるからといって、そのことのみに基づいて同じリストの任意の他の構成物の事実上の均等物であると解釈されてはならない。
【００２４】
濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では範囲の形式で表現又は提示され得る。かかる範囲の形式は単に便宜的に、且つ簡潔にするために用いられるに過ぎないことが理解されるべきであり、従って、範囲の上下限として明示的に記載される数値を含むのみならず、当該の範囲内に含まれる個々の数値又は部分的な範囲もまた全て、各数値及び部分的な範囲が明示的に記載されたものとして含むように、柔軟に解釈されなければならない。例示として、数値範囲「約１から約５」は、約１から約５の明示的に記載される値を含むのみならず、指示される範囲内にある個々の値及び部分的な範囲もまた含むものと解釈されなければならない。従ってこの数値範囲には、２、３、及び４などの個々の値及び１〜３、２〜４、及び３〜５等の部分的な範囲、並びに個々に１、２、３、４、及び５が含まれる。この同じ原則は、ただ１つの数値を最小値又は最大値として記載する範囲に適用される。さらに、かかる解釈は、範囲の広さ又は説明される特性にかかわらず適用されなければならない。
【００２５】
本明細書には、早産のリスクがある妊娠中の対象を特定する方法が記載される。早産のリスクがあり得る妊娠初中期にある妊娠中の対象の特定に利用され得る第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーが同定されている。かかるマーカーにより、早産と、同様の症状を呈する他の状態との間の分別診断が可能となり得る。早産のリスクがより高い対象を早期に特定するならば、かかる対象をより綿密にモニタすることができるため、多大な価値がもたらされ得る。
【００２６】
本明細書に記載される方法を用いた妊娠中の対象の試験は、早産の指標となる第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを対象において定量可能な、妊娠中の任意の時点で行うことができる。例えば、一態様において第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーは妊娠約２０週〜約３４週に試験され得る。別の態様において、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーは妊娠約２４週〜約３２週に試験され得る。これらの範囲は限定として理解されてはならないことに留意すべきであり、従って試験は妊娠中のいかなる時点で実施されてもよい。むしろこれらの範囲は、かかる試験が対象の大多数で行われる可能性が最も高い妊娠周期の期間を示すために提供される。
【００２７】
早産のリスクがある対象の特定に有用なバイオマーカーとしては、様々なペプチド及び他の生体分子が含まれる。本明細書に記載される技術及び方法を用いて、早産の発生率と相関する特定のペプチド及び他の生体分子が同定されている。これらのペプチド及び他の生体分子の１つ又は複数を定量することにより、対象についての早産リスクの何らかの指標が提供され、従って予防的処置の機会が提供され得る。早産合併症を予測する任意のバイオマーカーが本発明の特許請求の範囲の範囲内にあると見なされるべきであることに留意しなければならない。しかしながら一態様では、早産合併症に関連する第１のバイオマーカー又は第２のバイオマーカーの非限定的な例として、対照の対象（すなわち、早産合併症を起こさなかった妊婦）と統計的に有意差が認められ（ｐ≦０．０１）、ｐ（確率）値＜０．０２をカットオフとする生体分子及びペプチドが含まれてもよい。
【００２８】
一態様において、バイオマーカーは第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを含む。この態様では、第１のバイオマーカーは、ＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号１）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号２）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭ（Ｏ）ＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号３）、又はそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を有するペプチドなどの、早産に関連するペプチドを含み得る。別の態様では、第２のバイオマーカーは、早産に関連する完全長タンパク質又はタンパク質のペプチド断片を含み得る。この第２のバイオマーカーとしては、限定はされないが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。さらに別の態様では、第２のバイオマーカーとして、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。これらの完全長タンパク質の配列は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能である。
【００２９】
本願の中であらゆる目的から本明細書によって全体として参照により援用される国際公開第２００８／０７９４０７号パンフレットに開示されるとおりの、バイオマーカーの同定に用いられるプロテオミクス技法を用いて、妊娠中の対象における早産リスク評価用バイオマーカーを同定及び定量することができる。一態様において、早産の可能性について妊娠中の対象を試験する方法は、生体試料中に存在する早産に関連する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせの濃度又は量の、対照（すなわち、早産を起こさない妊婦における１つ又は複数のバイオマーカーの相対的な濃度又は量）と比較した差を検出するステップを含み得る。一態様において、プロテオミクスのシステム及び方法を用いて第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを同定及び定量することができる。例えば、異なる生体試料からの複数の質量スペクトルを比較し、非生物学的な変動を補償する手法を用いた後に定量的に異なる質量イオンを特定し、目的のバイオマーカーを分離し、及び特性決定するステップを用いることができる。かかる方法は、複数の生体試料の各々を分画して複数の溶出液を形成し、複数の溶出時間における複数の溶出液の各々から複数の質量スペクトルを得て、生体試料間で定量的に異なるように見える目的の分子イオンピークを求めるステップを含み得る。この方法はさらに、生体試料間で実質的にばらつきのない内因性の基準分子であって、目的のピークと実質的に同様の溶出時間及び質量対電荷比を有する基準分子に対応する質量スペクトル基準ピークを同定するステップと、目的のピークを内因性基準分子の質量スペクトルピークに対して正規化することで複数の溶出液にわたり各生体試料についての非生物学的変動を補償するステップとを含み得る。この方法は、複数の衝突エネルギーの各々を一ランずつ使用する衝突誘導フラグメンテーション試験を行うステップと、得られた複数のフラグメントイオン質量スペクトルを平均化することなく合計して、単一の累積娘フラグメント質量スペクトルを形成するステップと、娘フラグメント質量スペクトルを使用してアミノ酸配列データを確立するステップであって、次にそれが単一のアライメントされた質量スペクトル中の目的のピークに対応するペプチドの同定において使用されるステップとをさらに含み得る。
【００３０】
別の態様において、第１及び第２のバイオマーカーを含む生体試料を分画して複数の溶出液を形成することができ、複数の溶出時間における複数の溶出液の各々から複数の質量スペクトルが得られ、複数の溶出液の各々の中に溶出する内因性アライメント分子に対応する質量スペクトルアライメントピークが特定される。この方法は、複数の溶出液の各々からの質量スペクトルアライメントピークをアライメントすることにより、各溶出液からの複数の質量スペクトルをアライメントするステップと、複数のアライメントされた質量スペクトルを合計して単一のアライメントされた質量スペクトルを形成するステップと、単一のアライメントされた質量スペクトル中の目的のピークに対応するペプチドを同定するステップとをさらに含み得る。様々な技法が企図されるが、一態様において複数の質量スペクトルをアライメントするステップは、複数の質量スペクトルを視覚的にアライメントするステップをさらに含み得る。加えて、複数の生体試料中に存在する複数の生体分子の各々を分画するステップは数多くの方法により達成することができ、例えばキャピラリー液体クロマトグラフィー（ｃＬＣ）により達成されてもよい。本明細書に記載される第１及び第２のバイオマーカーを検出及び定量するための具体的な方法及びパラメータは、実施例に提供する。
【００３１】
本明細書に記載される第１及び第２のバイオマーカーの検出及び定量に用いられるプロテオミクス技法は、全ての血清にとって天然の分子であって、標本負荷量、イオン化効率及び質量分析器感度の差を補正するために使用することのできる内部標準となる分子を利用する。上記の考察に加え、あるピークが比較群の間で定量的に同様であると示すことができ、候補バイオマーカーと同じ溶出ウィンドウでカラムから溶出し、その質量対電荷比が候補バイオマーカーと同様であり、且つ十分に豊富にあって、いずれの標本においてもノイズのレベルの３倍より多い量である場合、そのピークが基準として選択される。本明細書に記載される基準ピークは、標本処理、クロマトグラフ負荷量、イオン化効率又は機器感度のばらつきに関連する、しかしピーク量が生物学的に異なることに起因するのではないピーク高さ又はピーク面積を定量的に補正するためのものである。この基準は内部定量標準と称される。他の態様では、外部標準を使用してバイオマーカーの定量を促進することができる。この態様では、既知量の化合物を生体試料に添加することができ、それによりバイオマーカーの標準に対する比を計算することができる。次にこの比を対照試料からの比と比較することにより、早産リスクを評価することができる。
【００３２】
上記に説明したとおり、配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせを含む第１のバイオマーカーが、早産の予測因子として同定されている。内部定量標準を使用して配列番号１〜３を定量した。配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）に使用される基準（すなわち、内部標準）のｍ／ｚは、モノアイソトピックピークのその＋３の荷電状態について６７３．３６であった。中性親質量は２０１７．０７質量単位であり、クロマトグラフィー溶出時間は１５．５分であった。しかしながら溶出時間が日によって、又はカラム交換でいくらか変わることを考慮し、溶出時間はその溶出時間の内部時間標準に対する割合として（０．９９６８、すなわちそれは内部時間標準と比べてそれ自体の滞留時間の０．００３２倍早く溶出する）、及びその溶出時間の配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）と比較した割合として（１．０５５８、すなわちそれは、バイオマーカーと比べてそれ自体の溶出時間の０．０５２８６早く溶出する）、提供される。
【００３３】
第２の内部定量標準は配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）及び配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の基準とした。基準分子のｍ／ｚはその＋５の荷電状態で８４２．３９であり、中性親質量は４２０６．０７質量単位であった。クロマトグラフィー溶出時間は約１５．８分であった。しかしながら溶出時間のばらつきを考慮し、その溶出時間は内部時間標準及び配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の溶出時間との関連で記述することがより適切である。内部時間標準との関連では、内部定量標準は内部時間標準の溶出後に溶出時間それ自体の溶出時間の０．０１５９倍という率（又は時間標準マーカーの１．０１６１の比）で溶出した。配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）との関連では、内部定量マーカーはそれ自体の溶出時間の０．０５３９倍という率でバイオマーカーの後に（又はバイオマーカーの溶出時間の１．０７００の率で）溶離した。
【００３４】
個々の質量は溶出時間（滞留時間）により定義され得るが、溶出時間（滞留時間）はまた、内部時間標準の関数として表現することもできる。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカー（ｔｉｍｅ ｍａｋｅｒ）と目的のピークに後続する時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置により決定される。この決定がＲｆ値と見なされる。Ｒｆ値は以下のとおり計算される：
Ｒｆ＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）。
【００３５】
上記に説明される技法を用いることで、配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせを含む第１のバイオマーカーが早産の指標として同定されている。第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）の同定及び定量に関する具体的な詳細は実施例に提供する。配列番号１〜３のさらなる構造特性は以下に提供する。ペプチドである配列番号１は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が６７７、平均質量が２０２６．９８ダルトン、平均溶出時間が１４．３０±０．４７分、及びＲｆ値が０．５３５±０．０５２である。
【００３６】
ペプチドである配列番号２は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が８５７、平均質量が４２７９．２５ダルトン、平均溶出時間が１７．２０±２．０４分、及びＲｆ値が０．７８１±０．０８６である。
【００３７】
ペプチドである配列番号３は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が８６０、平均質量が４２９５．２５ダルトン、平均溶出時間が１６．１３±１．９７分、及びＲｆ値が０．６９５±０．１３４である。
【００３８】
上記に説明される、この例の範囲内にある技法を用いて、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーが、第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせるとき早産の指標として同定されている。
【００３９】
従って、早産の可能性について妊娠中の対象を評価する方法が提供される。一態様において、この方法は、対象の生体試料中において早産に関連する本明細書に記載される第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを検出するステップを含み、第１のバイオマーカーは、配列であって、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３により表される配列と同一の、又は相同なアミノ酸配列を有し、及び第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む。次に、生体試料中の第１及び第２のバイオマーカーの存在量が定量される。第１及び第２のバイオマーカーの存在量は、処理及び分離の後に、同様に生体試料中に存在する内部標準となる基準分子の関数として計測される。用語「存在量」は、本明細書で使用されるとき、所与の質量スペクトルにおける質量分析器により計測される特定の質量のイオンの数、又は全溶出間隔に相当するいくつかの質量スペクトル中に観測される特定の質量のイオンの合計数を表す。この内部標準に対してバイオマーカー存在量を正規化すると、非生物学的変動が低下し、リスク予測におけるバイオマーカーの利用能が向上する。別の言い方をすれば、対象間において比較的一定した存在量で生体試料中に存在する分子を基準に選択することにより、特に長期間にわたり分散し得る別々の日に実施されるランを比較するとき、生体試料の処理のばらつきを補正することができる。このため、バイオマーカーの相対的存在量は、含まれる特定のバイオマーカーによって異なり得る。従って各バイオマーカー／基準比について特定のカットオフ値を設定してもよく、それによりバイオマーカーピーク存在量の基準ピーク存在量に対する比が特定の値を上回る、又は下回ることから早産リスクの実質的な増加を予測し得る。
【００４０】
早産の可能性についての試験はまた、対象からの生体試料中の第１及び第２のバイオマーカーの存在量を、同じバイオマーカーの正常出産の指標となる既知の存在量と比較することにより達成されてもよい。一態様において、第１のバイオマーカーが、単独での、又は配列番号２及び３との任意の組み合わせでの配列番号１である場合に、対象において計測される配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５０％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される単独での、又は配列番号２及び３との組み合わせでの配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３０％未満であるならば、早産が生じ得る。さらに別の態様において、対象において計測される単独での、又は配列番号２及び３との組み合わせでの配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１０％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４１】
別の態様において、第１のバイオマーカーが配列番号２である場合に、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５０％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３０％未満であるならば、早産が生じ得る。さらに別の態様において、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１０％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４２】
さらなる態様において、第１のバイオマーカーが配列番号３である場合に、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５５％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３５％未満であるならば、早産が示唆され得る。さらに別の態様において、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１５％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４３】
第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを含み得る任意の種類の生体試料をスクリーニングすることができ、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、組織、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）及び第２のバイオマーカーは、ほとんどの妊婦に存在するが、早産を起こすことになる多くの妊婦は、正常出産を経た女性と比較して妊娠中の第１のバイオマーカーの血清中濃度が低かった。しかしながら、第２のバイオマーカー（すなわちコルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）については、スクリーニングした特定のタンパク質又はペプチドに応じて、後に早産を起こすことになった女性で正常出産を経た女性と比較して低いことも、又は高いこともあった。第２のバイオマーカーの血清中濃度に関するさらなる詳細は、実施例の節の表１６を参照されたい。第２のバイオマーカーは過去に早産の予測可能性が評価されたことは注目に値する。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＲＬ，Ｉａｍｓ ＪＤ，Ｍｅｒｃｅｒ ＢＭ，Ｍｅｉｓ ＰＪ，Ｍｏａｗａｄ Ａ，Ｄａｓ Ａ，Ｍｉｏｄｏｖｎｉｋ Ｍ，Ｖａｎｄｏｒｓｔｅｎ ＰＪ，Ｃａｒｉｔｉｓ ＳＮ，Ｔｈｕｒｎａｕ Ｇ，Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ ＭＰ；「Ｍａｔｅｒｎａｌ−Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｔｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｔｈｅ Ｐｒｅｔｅｒｍ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ：ｔｏｗａｒｄ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｍａｒｋｅｒ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ」 Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００１；１８５（３）：６４３−５１頁を参照のこと。しかしながら、上述の参考文献が指摘するとおり、第２のバイオマーカー（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）は、第１のバイオマーカーが存在しない状態で検出及び定量されるときには、ＰＴＢの臨床予測に使用するのに十分な特異度又は感度が得られなかった。
【００４５】
一態様において、ＰＴＢ症例群は第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）が対照群ほど多量ではなかった。従って、対象からの生体試料中の第１のバイオマーカーの１つ又は複数の存在量を、早産を起こさなかった対象からの既知の対照濃度と、又は試験対象からの既知のバイオマーカー濃度と比較することで、早産を予測し得る。第１のバイオマーカーの存在量がより高い又は低い対象は早産リスクが高いことがあり得るため、ひいては適切な処置が可能な十分に早い時期に特定され得る。早産の予測における特定のバイオマーカーの存在量について、以下に詳細に記載する。
【００４６】
一態様では、早産の対象及び対照の対象のバイオマーカー存在量を計算するため、妊娠２８週の第１のバイオマーカーについてｌｏｇ比をとった。例えば、ｌｏｇ ６７６．７／６７３．３６（配列番号１／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．５７９±０．１０１の対照平均及び−０．０１５±０．０９０のＰＴＢ平均が得られた。ｌｏｇ ８５６．８／８４２．８（配列番号２／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．２３１±０．１０２の対照平均（早産を起こさなかった対象）及び−０．１４９±０．０９５のＰＴＢ平均（早産のリスクがある対象）が得られた（実施例の表１２）。実施例の１２に関しては、他のバイオマーカーのｌｏｇ比を計算した。ｌｏｇ ８６０．０／８４２．８（配列番号３／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．２０１±０．０９６の対照平均及び−０．２０４±０．０８８のＰＴＢ平均が得られた。別の言い方をすれば、早産のリスクがある対象は、配列番号１の減少、配列番号２の減少、及び配列番号３の減少を、個々に、或いは同時に示す可能性が最も高いものと思われる。
【００４７】
この説明を念頭に置けば、一態様では、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約１．０未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．８未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００４８】
さらに、一態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．５未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．４４未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００４９】
加えて、一態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．４未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．２未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００５０】
特定の態様において、上記で計算されるｌｏｇ比を使用して、早産を起こすリスクがある妊婦のリスクを統計的に予測し得る。第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの予測力の一般的な一尺度は、その感度及び特異度である。「感度」は、本明細書で使用されるとき、真陽性率（例えば、バイオマーカーによって正しく特定される、後に早産を起こす妊婦の百分率）として定義される統計学用語である。用語「特異度」は、本明細書で使用されるとき、真陰性率（例えば、正しく特定される、合併症を伴わない妊娠の妊婦の百分率）として定義される。早産の予測に本明細書に記載されるとおりの第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを使用するため、数値的閾値が設定される。数値的閾値を設定するため、特定のバイオマーカーに対する値の範囲が最低値から最高値まで、及び各時点における陽性として正しく特定される対象の割合、及び同じ時点における陽性として誤って特定される対照の割合について考慮される。特定のバイオマーカーについての値の範囲は、特定のデータセットについて最低値から最高値まで実際の定量値をとることにより計算され得る。これは受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）と称される。一態様において、偽陽性率は２０％に限られてもよく、一般にはこれが臨床試験の最大耐容値と考えられる。偽陽性率（すなわち、バイオマーカーによって早産を起こすリスクがあると特定される、合併症を伴わない妊娠の女性の百分率）は、１００％から真陰性率を減じて計算される。２０％以下の偽陽性率（８０％以上の特異度に等しい）の閾値が、ある人にリスクがあるか、それともリスクがないかについての判断に使用される閾値を決定する。
【００５１】
実施例の表１３及び表１４に関連して、早産のリスクがある対象を特定するための、４つのｌｏｇ比の各々（すなわち第１のバイオマーカー）に対する閾値を決定した。各々に対する閾値は、２０％以下の偽陽性率と同じである８０％以上の特異度（真陰性率）となるように計算した。数学的に決定された閾値を用いて、４つの比から独立して感度（真陽性）の比及び特異度（真陰性）の比が提供された（表１３及び表１４）。表１４を参照すると、配列番号１の比（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）が、早産の予測に関して最も高い感度（６５％）及び特異度（８５％）をもたらした。従ってこの態様では、妊婦に存在する配列番号１（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）の同定及び定量が、早産を起こす可能性の正確な予測因子となる。配列番号１の比（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）が有用であるが、また、ｌｏｇ比の組み合わせを使用して早産リスクを予測し得ることも企図される。従って、本明細書に特定される第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）は、早産リスクの有力な予測ツールである。
【００５２】
本明細書に記載される第１のバイオマーカーは早産を予測することができる。しかしながら、ある場合には第２のバイオマーカーをスクリーニング及び定量することにより、早産試験の予測値を改良してもよい。一態様において、対象からの生体試料が第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーについてスクリーニングされてもよく、ここで第１のバイオマーカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせにより表される配列と同一の又は相同なアミノ酸配列であり、第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせである。この態様において、第２のバイオマーカーを単独でスクリーニングする場合、それはＰＴＢの指標とはならない。しかしながら、第２のバイオマーカーを第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせてスクリーニングすると、第１のバイオマーカー単独でのスクリーニングと比較してＰＴＢの予測感度が増加する。一態様では、ＰＴＢについて第１及び第２のバイオマーカーが共にスクリーニングされるとき、感度は８０％超又は８０〜９０％である。特定の態様において、感度は９０％以上である。別の態様では、ＰＴＢについて第１及び第２のバイオマーカーが共にスクリーニングされるとき、特異度は少なくとも８０％である。比較として、第１のバイオマーカーのみが検出及び定量されるとき、感度は約６５％である。
【００５３】
一態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも２つのタンパク質である。
【００５４】
別の態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも３つのタンパク質である。
【００５５】
さらなる態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも４つのタンパク質である。
【００５６】
さらに別の態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む５つのタンパク質である。
【００５７】
表１〜６は、限定はされないが、ＰＴＢの予測のためにスクリーニングされ得る第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの可能な組み合わせを含む。これらの表中、第１のバイオマーカーは、配列番号１（単独、或いは配列番号２及び３との組み合わせ）、配列番号２（単独、或いは配列番号１及び３との組み合わせ）、及び配列番号３（単独、或いは配列番号１及び２との組み合わせ）を含み、第２のバイオマーカーは、タンパク質（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）の様々な組み合わせを含む。例えば表１では、第１のバイオマーカーは配列番号１であり、及び第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むリストから選択される。従って、一態様において第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子を含むことができる。別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子及びトロンビン−抗トロンビン複合体を含むことができる。さらに別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、トロンビン−抗トロンビン複合体、及びフェリチンを含むことができる。さらに別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１、２、及び３を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含むことができる。表１〜６は、各々がこの方法論によって解釈され得る。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
【表６】
【００６４】
予測値はまた、利用される試験又はアッセイのタイプ（本明細書ではその一部をさらに詳細に考察する）によっても異なり得る。複数のバイオマーカー（すなわち、第１及び第２のバイオマーカー）の存在及び量を評価することにより、早産の予測に有用なフィンガープリントを生成することが可能である。例えば、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを決定し、定量すると、本明細書に記載される方法の予測値は増加し得る（実施例の節を参照のこと）。しかしながらＰＴＢを発症する女性がより少数しか含まれないこともあり、これは早産を起こすリスクが指示され易くなる。目的のペプチドを含み得る任意のタイプの生体試料をスクリーニングすることができ、かかる非限定的な例としては、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、組織、及びそれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら一態様では、対象から採取された血清試料中のペプチドについてスクリーニングすることが好都合であり得る。別の態様では、対象から採取された血液試料中のペプチドについてスクリーニングすることが好都合であり得る。
【００６５】
本明細書にはまた、妊娠中の対象が早産を起こす確率を予測するために利用され得る単離されたペプチド（すなわち、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカー）及び単離されたペプチドの混合物についても記載される。かかるタンパク質及びペプチドは多くの試験アッセイで陽性対照として、並びに抗体の産生用に、有用であり得る。一態様において、例えば単離タンパク質又はペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３により表される配列と同一の、又は相同なアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーである。別の態様において、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの組み合わせを含む単離タンパク質又はペプチドである。ペプチド合成は当該技術分野において公知であり、当業者であれば、ペプチド配列を入手した後には、様々な技法を用いて本明細書に開示されるペプチドを合成可能であろうことが理解される。かかる技法としては、限定なしに、液相合成法及び固相合成法、並びに様々な化学的ライゲーション方法、いくつか例を挙げれば、事前のチオール捕捉（ｐｒｉｏｒ ｔｈｉｏｌ ｃａｐｔｕｒｅ）、ネイティブ化学ライゲーション、発現タンパク質ライゲーション、アシル開始捕捉（ａｃｙｌ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ）、及びシュタウディンガーライゲーション法などを挙げることができる。加えて、ペプチドはまた組換えＤＮＡ技術を用いて合成されてもよい。
【００６６】
特定の態様では、上記に説明されるプロテオミクス技法を用いてバイオマーカーを同定及び定量することができる；しかしながら本明細書では、一致する生体試料中のバイオマーカーの検出及び／又は定量が可能な他の方法を用いることができる。可能なペプチドアッセイの一種として、イムノアッセイが挙げられる。同種法、及び異種法、並びに競合法及び非競合法を含め、特定のペプチドについて抗体を利用して生体試料をスクリーニングする数多くのイムノアッセイプロトコルが公知である。例えば、かかる技法は固体支持体の使用、免疫沈降等を含み得る。しかしながら、概してペプチドを検出するためのイムノアッセイは、標識された抗体の使用を伴うことが多い。かかる標識はいかなる種類の公知の材料を含んでもよく、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識等が挙げられる。そのため、かかるイムノアッセイ試験は当該技術分野において公知であり、生体試料中のペプチドの検出に利用される特定の方法が、本発明の特許請求の範囲の範囲に限定されるものとして解釈されるべきではないことは理解されなければならない。イムノアッセイについては以下でさらに詳しく考察する。
【００６７】
他の態様では、本明細書に記載されるとおりの第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとに対して特異的免疫反応性を有する抗体を使用することができる。一態様において、例えば、配列番号１からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。別の態様において、配列番号２からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。さらに別の態様において、配列番号３からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。
【００６８】
一態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがコルチコトロピン放出因子である、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがデフェンシンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがフェリチンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがラクトフェリンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがトロンビン−抗トロンビン複合体である、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーが腫瘍壊死α受容体１型である、抗体が提供される。
【００６９】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、又は組換えであってよく、及び当該技術分野において公知の任意の方法により産生され得る。抗体断片もまた本発明の範囲内にあると考えられる。本発明の態様に係る抗体は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物由来であってよい。一態様において、例えば抗体は、ヒト、ネズミ科動物（例えば、マウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリ等に由来することができる。
【００７０】
一態様では、ポリクローナル抗体を利用して生体試料中の本明細書に記載される第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを独立して検出及び定量することにより、早産リスクを評価し得る。ポリクローナル抗体は、当業者に公知の様々な手順により産生することができる。例えばポリクローナル抗体は、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギ等のインビボ宿主動物で産生されてもよい。宿主動物は、遊離ペプチドか、或いは担体にカップリングされたペプチドで、例えば腹腔内注射及び／又は皮内注射によって免疫される。注射材料は、典型的には約１００μｇのペプチド又は担体タンパク質を含む乳剤である。免疫応答を増加させるため、宿主種に応じて様々なアジュバントが用いられ得る。アジュバントの例としては、限定なしに、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができる。これらの及び他のアジュバントは、当該技術分野において公知である。検出することのできる有効な抗体力価をもたらすため、数回のブースター注射が、ある場合には約２週間おきに必要となり得る。免疫化された動物の血清中の抗体力価は、抗体の選択により、例えば当該技術分野において公知の方法に従うペプチドの固体支持体上への吸着及び選択された抗体の溶出により増加させることができる。
【００７１】
別の態様において、モノクローナル抗体を利用して生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを独立して検出及び定量することにより、早産リスクを評価し得る。モノクローナル抗体とは、ただ１種の抗原のみを認識する抗体を指す。このような抗体は、単一の抗体産生ハイブリドーマの娘細胞により生成される。モノクローナル抗体は、典型的にはそれが免疫反応を生じる任意のエピトープについて単一の結合親和性を呈する。モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位であって、各々が異なるエピトープに対して免疫特異性を有する抗体分子、例えば二重特異性モノクローナル抗体を含み得る。モノクローナル抗体は、当業者に公知の様々な方法により得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７頁（１９７５年）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８７年、１９９２年）；及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２年、１９９３年）（各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００７２】
また、本明細書において有用な抗体は単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、又はより高い多重度の特異性）であってよいことにも留意すべきである。多重特異性抗体はペプチドの種々のエピトープに対して特異的であってもよく、又は目的のペプチドと、異種ペプチド又は固体支持体材料などの異種エピトープとの双方に対して特異的であってもよい。さらに抗体はまた、本明細書に記載されるバイオマーカーの任意の領域から調製されてもよい。
【００７３】
例として、モノクローナル抗体は十分に確立された方法を用いて調製することができる。一態様において、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技法を用いて調製される。かかる方法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が免疫剤（例えば、本発明の態様に係るペプチド）で免疫され、その免疫剤に特異的に結合し得る抗体を産生する、又はその産生能を有するリンパ球が誘導される。或いは、リンパ球はインビトロで免疫されてもよい。次にリンパ球はポリエチレングリコールなどの好適な融剤を用いて不死化細胞系と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞系は、多くの場合に、げっ歯類、ウサギ、ウシ及びヒト起源の形質転換された哺乳動物細胞、特に骨髄腫細胞である。ラット又はマウス骨髄腫細胞系が用いられることが多い。ハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含む好適な培養培地中で培養され得る。例えば親細胞に酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。
【００７４】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地が、モノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。かかる技法及びアッセイは当該技術分野において公知である。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、細胞を限界希釈手順によりサブクローニングし、公知の方法により成長させ得る。モノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー等により培養培地から単離又は精製され得る。モノクローナル抗体はまた、本明細書によって参照により援用される米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの、組換えＤＮＡ方法により作製することもできる。当業者に公知の他の抗体生成方法が、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７５】
従って一態様では、早産の可能性について妊娠中の対象を試験する方法が提供される。かかる方法は、対象から生体試料を採取するステップと、生体試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させるステップであって、試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させると、第１の抗体が第１のバイオマーカーを結合して第１の抗体−抗原複合体を形成し、第２の抗体が第２のバイオマーカーを結合して第２の抗体−抗原複合体を形成し；第１のバイオマーカーはアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、第１の抗体−抗原複合体及び第２の抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を定量するステップとを含み得る。次に、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を、早産を起こさなかった生体試料からの同じバイオマーカーの量と比較する。生体試料中の目的のバイオマーカーの存在及び量が、早産リスクの指標を提供する。
【００７６】
説明したとおり、生体試料中のペプチドを検出及び／又は定量可能な様々なイムノアッセイが公知である。一態様において、イムノアッセイは競合アッセイであってもよい。例えば、試験ペプチドの配列を有する標識したペプチドをペプチド配列の少なくとも一部分に特異的な抗体に接触させ、抗体−抗原（又はペプチド）複合体を形成させる。そのペプチド／抗体混合物に生体試料を加え、生体試料中に存在する目的の任意のペプチドを標識ペプチドと競合させると、標識の強度が減少する。競合アッセイは一段階又は二段階プロトコルを含んでもよく、それらは当該技術分野において公知である。
【００７７】
別の態様において、イムノアッセイは非競合的アッセイ、すなわちサンドイッチアッセイであってもよい。かかるアッセイでは、概してより高いレベルのアッセイ感度及び特異度がもたらされる。非競合アッセイフォーマットもまた、一段階又は二段階プロトコルを利用し得る。概してかかるアッセイは物理的な支持体上に固定化された抗体を含み、ここで固定化された抗体は目的のバイオマーカー（すなわち第１又は第２のバイオマーカー）に対して免疫学的特異性を有する。同様に目的のペプチドに対して免疫学的特異性を有する標識抗体と共に、生体試料が支持体に加えられる。生体試料中に存在するペプチドが、支持体に沿って固定化された抗体に結合し得る。標識抗体もまた目的のペプチドに結合し、従って同様に物理的な基板にペプチド及び固定化抗体を介して固定化される。次に標識抗体の標識を検出することにより生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を定量し、対照（すなわち、早産を起こさない妊娠中の対象）と比較することができる。プロトコルによっては、標識を検出する前に、固定化されなかった標識抗体を洗浄により除くことができる。この場合、標識の強度は、生体試料中に存在する第１のバイオマーカー及び／又は第２のバイオマーカーの量量に比例する。
【００７８】
当該技術分野において公知の数多くの固体支持基板構成が企図される。かかる基板としては、抗体又は抗体アンカーなどの検出材料を固定化するための任意の好適な基板が含まれ得る。例えば、好適な基板としては、任意の固体有機、生体高分子、又は無機支持体材料などの、抗体の機能に著しい影響を及ぼすことなく検出材料との結合を形成可能な任意の固体支持体を挙げることができる。有機固体支持体材料の例としては、限定なしに、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリアクリルアミドなどのアクリル共重合体等のポリマーを挙げることができる。生体高分子支持体材料の例としては、限定なしに、セルロース、ポリデキストラン、アガロース、コラーゲン、キチン等を挙げることができる。無機支持体材料の例としては、限定なしに、ガラスビーズ（多孔質及び非多孔質）、ステンレス鋼、ＺｒＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、及びＮｉＯなどの多孔質セラミックスを含む金属酸化物、砂等を挙げることができる。
【００７９】
本明細書では、当該技術分野において公知の数多くの特異的アッセイ方法を用いることができる。かかる特異的アッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、ネフェロメトリック阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、化学発光磁気イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）等のプロトコルを挙げることができる。
【００８０】
様々な検出可能標識（すなわち指標）が、本発明の態様に従い抗体にカップリングされ得る。適切な標識としては、限定なしに、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ等）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）等）、蛍光部分又はタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰ等）、又は発光部分（例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ ＣＯＲＰ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から供給されるＱｄｏｔ（登録商標）ナノ粒子）を挙げることができる。上述の様々なイムノアッセイの実施において使用される一般的な方法は、当業者に公知である。
【００８１】
一態様において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡを含んでもよく、ここでは抗原（すなわち、第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、又はそれらの組み合わせ）が、限定はされないが９６ウェルプレートを含めた固体表面に結合され、次に抗原特異的モノクローナル抗体が加えられる。インキュベーション期間後、一次抗体が洗浄により除かれ、結合したモノクローナル抗体を認識する二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼＨＲＰで修飾されている）が加えられる。二回目のインキュベーション後、過剰な二次抗体が洗浄により除かれ、化学発光生成物又は蛍光生成物を生成する添加されたＨＲＰ用基質が添加され、「色」すなわち光が計測される。
【００８２】
イムノアッセイに加え、生体試料中のペプチドを検出するためのさらなる方法が企図され、そのいずれも本発明の範囲内にあると見なされ得る。一態様では、例えば質量分析（ＭＳ）技法が利用されてもよい。一つの具体例としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化などのハイスループットＭＳ分析技法を挙げることができる。かかる技法では、試料が毎時数百個の生体試料を高速処理することのできる特殊な設備に送られ得る。
【００８３】
本明細書にはまた、妊娠中の対象からの生体試料を試験して早産リスクを評価するためのキットも記載される。かかるキットは、病院、診療所、参照試験所、医院等により用いられ、医学的な判断を下すこと、及び必要であれば利用可能な治療又は介入を提供することを支援し得る。加えて、かかるキットはまた、早産に関連する他の医学的状態の診断、予後判定、又はリスク評価も可能にし得る。
【００８４】
従って一態様では、早産の可能性について妊娠中の対象を試験するためのキットが提供される。かかるキットは、第１の抗体と第２の抗体であって、第１の抗体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する第１のバイオマーカーに選択的に結合して第１の抗体−抗原複合体を形成する能力を有し、及び第２の抗体は、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーに選択的に結合して第２の抗体−抗原複合体を形成する能力を有する、第１の抗体と第２の抗体と；第１の抗体−抗原複合体及び第２の抗体−抗原複合体の形成をアッセイするため第１の抗体及び第２の抗体に機能上関連付けられる指標と、を含み得る。キットはさらに、利用される特定の試験アッセイに必要又は有益な任意の試薬を含み得る。
【００８５】
このキットは生体試料中のバイオマーカーを検出及び定量する任意の手段を含むことができ、キットの内容物は必然的に用いられる検出アッセイの種類に応じて異なり得る。必要な試薬に加え、キットは、第１及び第２のバイオマーカーとの結合用の抗体、固体基板、抗体−抗原複合体の検出用のさらなる抗体等を含み得る。示唆されているとおり、抗体又は抗体断片は、遊離形態で、又はプラスチック皿、試験管、試験ロッド、ビーズ等の基板に固定化されて存在し得る。キットはまた、陽性又は陰性対照の検出及び／又は標識に好適な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液など、並びに説明書も含むことができる。
【実施例】
【００８６】
以下の例は、本明細書に記載され、且つ特許請求される化合物、組成物、及び方法がどのように作製及び評価されるかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるとともに、単に例示であることが意図され、発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定するよう意図するものではない。数（例えば、量、温度等）に関しては正確を期すよう努めているが、いくらかの誤差及び偏差は考慮されなければならない。特に指示がない限り、部分数は重量部であり、温度は℃単位であるか、又は周囲温度であり、及び圧力は大気圧又はその近傍である。反応条件、例えば、構成成分の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力及びその他の、記載されるプロセスから得られる生成物の純度及び収率を向上させるために使用することのできる反応範囲及び条件には、数多くの変形例及び組み合わせがある。かかるプロセス条件を最適化するには、妥当なルーチンの実験のみで十分である。
【００８７】
血清採取
試験には１６０人の妊婦が関与し、妊娠２４週又は２８週で血液を採取し、妊娠の最後まで追跡調査した。これらの女性のうち８０人は早産（ＰＴＢ）のエビデンスなく合併症を伴わない妊娠を経た。これを対照群とした。女性のうち８０人はＰＴＢ（妊娠３７週未満）であった。これらの女性をＰＴＢ症例群とした。これらの１６０人の女性の血清を、本明細書に記載されるプロテオミクス技法を用いて試験した。この試験に関わった各群の統計データを表７に掲載する。
【００８８】
【表７】
【００８９】
アセトニトリル沈殿
２容量のＨＰＬＣ等級アセトニトリル（４００μＬ）を２００μＬの血清に添加し、５秒間ボルテックスにかけ、室温で３０分間静置した。次に（血清コレクション）からの試料を室温でＩＥＣ Ｍｉｃｒｏｍａｘ ＲＦ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に上清のアリコートを、３００μＬのＨＰＬＣ等級の水が入った微量遠心管に移した。試料を短時間ボルテックスにかけて溶液を混合し、次にそれをＬａｂｃｏｎｃｏ ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）において約２００μＬまで凍結乾燥した。凍結乾燥前に添加するこの容量の水は、溶液からのアセトニトリルの完全な取り出しを促進する。アセトニトリルはタンパク質濃度の決定に用いられるアッセイと適合しないため、これは必須である。製造者の指示に従い実施されるＢｉｏ−Ｒａｄマイクロタイタープレートタンパク質アッセイを用いて上清タンパク質濃度を決定した。４μｇのタンパク質を含むアリコートを新しい微量遠心管に移し、ほぼ乾固するまで凍結乾燥した。ＨＰＬＣ水で試料を２０μＬとし、次に２０μＬの８８％ギ酸を使用して酸性化した。
【００９０】
セプタムを有するポリプロピレン製スナップキャップで封閉された２５０μＬ円錐ポリプロピレンバイアル（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に、アセトニトリル処理した（沈殿後の）血清試料（４０μＬ）を充填し、４℃に保たれたＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー４８ウェルプレートに入れた。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーにより、０．１％のギ酸で酸性化したＨＰＬＣ水を使用して５μＬの各血清試料を液体クロマトグラフィー保護カラムに４０μＬ／分の流量で注入した。酸性化水で保護カラムから塩及び他の不純物を洗浄により除いた。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーはカラムに負荷する容量の３倍を引き込むため、試料が限られた容量になったとき、手作業で試料を注入する必要があった。これは、１０μＬ容量の試料を保護カラム上流の空のループに注入し、試料の代わりに１０μＬのＨＰＬＣ水試料を注入するようにＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーをプログラムして達成した。円錐バイアルから負荷されたかのようにして保護カラムに血清試料を負荷し、脱塩した。
【００９１】
質量スペクトル分析のための液体クロマトグラフィー分離法
キャピラリー液体クロマトグラフィー（ｃＣＬ）を実施して試料を分画した。キャピラリーＬＣは、インハウスで組み立てられた１ｍｍ（１６．２μＬ）のマイクロボア保護カラム（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）と、１５ｃｍ×２５０μｍ内径のキャピラリーカラムとを使用する。保護カラムはドライパックし、キャピラリーカラムはＰＯＲＯＳ Ｒ１逆相媒体（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用してスラリーパックした。水相（９８％ＨＰＬＣ等級Ｈ２Ｏ、２％アセトニトリル、０１．％ギ酸）と有機相（２％ＨＰＬＣ Ｈ２Ｏ、９８％アセトニトリル、０．１％ギ酸）とを使用して、カラム平衡化及びクロマトグラフ分離を実施した。分離は、９５％水溶液での３分間のカラム平衡から開始し、次に２．７５％／分の勾配で６０％有機相まで増加させ、次に７％／分で９５％有機相の濃度まで増加させて達成した。勾配は９５％有機相で７分間保持して試料のうちより疎水性が高い成分を溶出させ、次に勾配を５分間で９５％水相に戻し、その濃度に２分間保持してカラムを再度平衡化した。分離は全て、５μＬ／分の流量で実施した。クロマトグラフィーでは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により制御して、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）と共にＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＨＰＬＣポンプシステムを使用した。
【００９２】
ＭＳ分析
毎日試料ラン前に外部標準を使用してＭＳ校正を実施した。必要に応じて、信号対雑音比が最適化され、且つ感度が最大化されるように設定を調整した。
【００９３】
ｃＬＣシステムは質量分析器に直接連結した。キャピラリーカラムからの溶出物は、ＩｏｎＳｐｒａｙ源（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を介してＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ Ｉ 四重極直交飛行時間型質量分析器に送り込まれた。ｍ／ｚ ５００〜２５００についてのデータを収集し、これは５分で開始し、５５分で終了した。５μＬ／分の流量では、試料が保護カラムから質量分析器に至るまで５分かかり、従って５分より前には有用なデータを得ることができないため、開始時間の遅延をプログラムした。データの収集、処理及び予備的なフォーマット作成は、ＢｉｏＡｎａｌｙｓｔアドオン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して達成される。
【００９４】
５分から５５分まで各標本について全ｃＬＣ溶出期間にわたり１秒ごとの質量スペクトルを得た。全イオンクロマトグラムとして報告される、各対象についてのｃＬＣにより分画されたタンパク質除去血清の溶出プロファイルを調べ、前回実行したヒト血清と一致することを確認した。全体の存在量が正常の５０％未満若しくは正常の２００％超である標本、又は３つの幅の広いイオン強度領域の特徴系列を欠く標本は、再実行するか、又は標本が分析の再実行に不十分な場合には除外した。
【００９５】
ピークアライメント
試料は別々の日に実行にかけられ、及びカラムは溶出時間が異なり得るため、有効なクロマトグラム（有効なクロマトグラム約１５分〜３５分）の全体を通じて約２分おきに溶出する平均存在量の１０個の内因性分子種を決定した。目的の溶出領域に対して２分間のウィンドウを設定することにより、ファイルサイズを管理し易いまま維持した。各溶出時間マーカーについての所望のｍ／ｚ領域の溶出は、ＭＳコンピュータのＥｘｔｒａｃｔ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ＸＩＣ）機能を使用して可視化される。次に各標本ランについてアライメントピークの溶出時間の各々を決定し、次にＳｅｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ機能を用いることにより２分間ウィンドウの中心として使用した。これにより当該のウィンドウについて全てのランの位置が同じ中点にアライメントされる。次にＳｈｏｗ Ｓｐｅｃｔｒａ機能を使用して、全ての質量スペクトルから単一の平均質量スペクトルを作成することができる。
【００９６】
データ分析
Ｑ−Ｓｔａｒ（ｑ−ＴＯＦ）質量分析器をサポートするソフトウェアプログラムＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）により、１６件の個別の液体クロマトグラフィーランを編集し、同様の溶出時間におけるそれらのラン内の質量スペクトルを比較することが可能である。上記に説明したとおり、２０分間の期間の有効な溶出に対して１０個の２分間ウィンドウを設定し、データファイルサイズを管理し易いまま維持した。同様に上記に説明したとおり、２分間ウィンドウをアライメントした。１０個の２分間溶出間隔のうち、最初に分析すべき間隔を二番目の２分間ウィンドウとし、これは典型的にはより多くのペプチド種が存在したため選択した。ペプチドをその多価状態の特徴的な外観により同定した。この多価状態は、単一のピーク又は１質量／電荷単位だけ離れた複数のピークではなく、個々のピークが１質量／電荷単位未満しか離れていない、ガウス形状を有する十分に定義された一群のピークとして見える。ＰＴＢを起こした８人の対象群、及び対照（ＰＴＢなし）からの８人の対象群を色分けして重ね合わせた。次にデータを視覚的に調べ、１色が優位を占めるように見える分子種を記録した。使用したソフトウェアは１６個の試料のみの視覚化に制限されていた。１６より大きいサンプリングサイズについては、データセットの多重比較を行った。さらに考慮すべき化合物については、データセットの少なくとも３分の２で２つの群間に同じ外観上の違いを観測する必要があった。
【００９７】
次に、２つの試験群の間で異なるように見えた分子を個々に調べた。これらの候補種は全てペプチドであった。定量データを抽出する前に質量スペクトルを調べ、ペプチドピークが同じｍ／ｚを有し、且つ同じ荷電状態も表すことを確認し、それにより同じペプチドについて検討していることをさらに確認した。加えて、２つの群間で存在量の違いが示されなかった第２の近傍ピークを基準として選択した。このピークを使用して目的の候補ピークを正規化し、標本の処理、標本の負荷量及びイオン化効率におけるばらつきを補正した。
【００９８】
次にＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアにより分子種を「抽出」し、各個別のランにおける個々の分子種のピーク最大値を決定する。この機能は特定のｍ／ｚを２分間溶出ウィンドウに限って調べるものではなかったため、従ってｃＬＣ溶出時間のアライメントに用いられるピークをさらに用いることにより、溶出プロファイルにおける位置が同じであったことを確認し、ひいては毎回同じ分子種が選択されたことを確認してもよい。
【００９９】
各分子種についてのピーク高さを、その存在量の妥当な推定であると考えた。各候補化合物の存在量を表にし、各候補種の計算値の、近傍の基準種との比をとった。単一の種を考慮していたため、２つの群間のこのペプチドの存在量のあり得る差の評価においては一変量統計解析を用いた。
【０１００】
内因性時間アライメント分子
時間アライメントに使用される基準ピークの質量及び典型的な溶出時間を表８に要約する。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
全ての妊婦血清中に存在するこれらの内因性分子種の位置情報により、それらをキャピラリー液体クロマトグラフィー溶出プロファイル中のＰＴＢバイオマーカーのアライメント及び位置特定用の時間マーカーに使用することもまた可能となる。
【０１０３】
バイオマーカー特性
時間アライメント後、ＰＴＢ症例群及び対照群を各々色付けして複数の質量スペクトルを重ね合わせる最初のプロセスで、バイオマーカー候補を視覚的に同定した。主に１色のように見えるこれらのピークをさらに試験した。次に個々のスペクトルを、ＱｑＴＯＦ質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のオペレーティングシステムであるＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたコンピュータによるピーク高さの決定に供した。次にバイオマーカーの量を表にした。加えて、症例群と対照群との間で定量的に違いがなかった、同じ時間ウィンドウ内に生じた第２のピークもまた選択した。これは非生物学的ばらつきの低減を可能にする内因性標準に相当した。これは、候補ピークの量を内因性標準の量で除算することにより達成した。各標本についての比の大きさを記録し、ＰＴＢ症例群と対照群とを比較するスチューデントｔ検定を用いて統計的有意差を求めた。
【０１０４】
第１のバイオマーカーについて、３つの種には十分な差があり（ｐ≦０．０００１）、２つの群の優れた分離を可能にし得ることが示唆される。３つのＰＴＢバイオマーカーを含む第１のバイオマーカーについての個々の質量及び溶出時間を表９に要約する。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
溶出時間（滞留時間）は内部時間標準の関数として表した。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカーと目的のピークに後続する時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置により決定した。これは以下の式により計算した：
Ｒｆ＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）
【０１０７】
Ｒｆ値は、実際の溶出時間と比べて信頼性がより高かった。溶出時間は新しいカラムによって、又は既存のカラムの汚れによる性能の変化によって変わり得るが、Ｒｆがそれらの変化で変わることはなかった。第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）のＲｆ値を表１０に提供する。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
内因性共溶出標準を参照することによるばらつきの低減
現在の血清プロテオミクス手法の特徴の一つは、あらゆる種に存在した、且つ症例群と対照群との間で差がなかった内因性分子の使用である。この内部標準に対してバイオマーカー存在量を正規化することにより、非生物学的変動が低下し、リスク予測におけるバイオマーカーの利用能力が向上した。正規化は、目的のピーク存在量の基準ピークによる数学的除算を含んだ。存在量は機械導出値であった。所与の分子の存在量は、所与の質量スペクトル中における質量分析器により計測される特定の質量のイオンの数、又は全溶出間隔に相当するいくつかの質量スペクトルで観測される特定の質量のイオンの合計数を表す。分子は、典型的にはクロマトグラフィーカラムから出るまでに１．０〜１．５分を要し、一方で質量スペクトルは当該の溶出間隔の間、１秒ごとに取得される。
【０１１０】
第１のバイオマーカーについて、３つの内部基準を使用した。ピークｍ／ｚ ６７６．７（配列番号１）については、ｍ／ｚ ６７３．３の共溶出基準ピークを使用した。ピークｍ／ｚ ８５６．８（配列番号２）及びピーク８６０．０（配列番号３）については、ｍ／ｚ ８４３．８の共溶出基準ピークを選択した。これらの比を用いてｌｏｇ比の平均を計算した（表１１及び表１２）。
【０１１１】
第１のバイオマーカーのうちの３つ（すなわち配列番号１（ｍ／ｚ ６７６．７）、配列番号２（ｍ／ｚ ８５６．８）、及び配列番号３（ｍ／ｚ ８６０．０）が、症例群と対照群との間で定量的に有意差があることが分かった。表１１及び表１２は、それぞれ妊娠２４週及び２８週における症例群及び対照群のバイオマーカー存在量を掲載する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
第１のバイオマーカーを用いた早産を起こすリスクがある女性の予測
上記に説明したとおり、バイオマーカーの予測力の一般的な一尺度は、その感度及び特異度であった。表１３及び表１４に示されるとおり第１のバイオマーカーの閾値を決定し、ＰＴＢを発症するリスクがある対象を特定した。各々についての閾値は、特異度（真陰性率）が８０％以上となるように計算した。前述のとおり、これは２０％以下の偽陽性率と同じである。これらの数学的に決定された閾値を用いると、表１３及び表１４に要約するとおり、４つの比から独立して以下の感度（真陽性）及び特異度（真陰性）の比率がもたらされた。
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
【表１４】
【０１１７】
感度は、真陽性率、又は具体的にこの場合は、バイオマーカーにより正しく特定される、後にＰＴＢを発症する妊婦の百分率として定義される統計学用語である。特異度は、真陰性率、又はこの場合は、正しく特定される、合併症を伴わない妊娠の妊婦の百分率として定義される。バイオマーカーをこのように予測に使用するには数値的閾値を設定しなければならない。そのような数値を設定するため、典型的にはバイオマーカーについての値の範囲が、最低値から最高値まで、及び各時点における陽性として正しく特定される対象の割合、及び同じ時点における陽性として誤って特定される対照の割合について考慮される。これは受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）と称される。偽陽性率は２０％に限られる。一般にはこれが臨床試験の最大耐容値と考えられる。偽陽性率（バイオマーカーにより後のＰＴＢのリスクがあるとして特定される、合併症を伴わない妊娠の女性、対照群の百分率）は、真陰性率を１００％から減じて計算される。２０％以下の偽陽性率（８０％以上の特異度に等しい）である閾値であればいずれも、ある人にリスクがあるか、それともリスクがないかについての判断に使用される閾値を決定する。４つの比の各々について、後のＰＴＢリスクがある対象を特定することが可能な閾値を決定した。各々についての閾値を、特異度（真陰性率）が８０％以上となるように計算した。前述のとおり、これは２０％以下の偽陽性率と同じである。これらの数学的に決定された閾値を用いて、表１３及び表１４に要約するとおり、４つの比から独立して以下の感度（真陽性）及び特異度（真陰性）の比率がもたらされた。後のＰＴＢを予測する６７７（配列番号１）のピークの能力がピークの組み合わせによって大幅に向上することはなかった。
【０１１８】
図１は、２４週及び２８週での試料採取後の、後に起こるＰＴＢを予測する第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）の予測能力を実証するＲＯＣ曲線を示す。来院ごとの各マーカーについての曲線下面積及び９５％信頼区間もまた含まれる。
【０１１９】
第１のバイオマーカーのアイデンティティ
２つの質量分析器間に衝突セルを含むタンデムＭＳを用いて親ペプチドのフラグメンテーションを生じさせ、第２のＭＳステップで観測されるフラグメンテーションパターンから検索可能なデータベース（ＭＡＳＣＯＴ）と比較してアミノ配列を決定した。ペプチドのうちの３つは同じ親タンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）に由来し、一方、最終的なペプチドは第２のタンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）から得られた。表１５は第１のバイオマーカーのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１〜３）を提供する。
【０１２０】
【表１５】
【０１２１】
これらのペプチドは、インターαトリプシンインヒビターと称されるタンパク質スーパーファミリーから生じるように思われる。より具体的には、ペプチドは、現在インターαトリプシンインヒビター重鎖４のアイソフォームと考えられている２つの異なるタンパク質、すなわちアイソフォーム１（ＩＴＩＨ４−１）及びアイソフォーム２（ＩＴＩＨ４−２）に由来するように思われる。２つのアイソフォームはいくらかの配列相同性を有するが、他方には認められないアミノ酸部分も有する。２つのアイソフォームは、単に他方を切断したものではない。
【０１２２】
「第２のバイオマーカー」の分析
コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む６つのさらなるバイオマーカー（「第２のバイオマーカー」と定義される）、又はそれらの組み合わせを、第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）の組み合わせと共に分析した。
【０１２３】
配列番号１〜３を含む第１のバイオマーカーについて、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む第２のバイオマーカーと組み合わせてロジスティック回帰分析を実施した。受信者動作特性曲線を用いた分類性能には第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）を用いた。全ての統計的検定について、名目両側ｐ値は、ｐ値＜０．０５として定義される統計的有意性で報告した。これらの分析にはＳＡＳ バージョン８．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用した。
【０１２４】
第２のバイオマーカーの相対存在量
症例群と対照群との間で存在量に有意差がある第２のバイオマーカー（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型）を表１６に掲載する。上記に説明される方法により第２のバイオマーカーの存在量を決定した。
【０１２５】
【表１６】
【０１２６】
第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせを使用した、早産を起こすリスクがある女性の予測
直前に考察したとおり、第１のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、腫瘍壊死因子α受容体１型（ＴＮＦａｒ）、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、フェリチン（ＦＥＲ）及びラクトフェリチン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ）（ＬＡＣＴＯ）を含む５つのさらなるタンパク質（すなわち、第２のバイオマーカー）と組み合わせることで、８９．８％の感度及び８１．０％の特異度を有するバイオマーカーのパネルを提供することができる。ロジスティック回帰モデルを用いて、種々のマーカーのこれらの様々な組み合わせを検討した。モデルから、患者についての予測確率が示された。従って、マーカーの組み合わせのカットオフ値は予測確率に基づく。各分析では、≧８０％の特異度をもたらす確率を使用した。
【０１２７】
どの種が２つの臨床群間のより良い判別をもたらしたかを決定するため、第１のバイオマーカー（すなわち、ｍ／ｚ ６７７（配列番号１）、８５７（配列番号２）、８６０（配列番号３））＋第２のバイオマーカー（すなわち、５つのタンパク質バイオマーカーのうちの４つ）を組み合わせて試験して、５つのさらなるタンパク質バイオマーカーの各々を除いた効果、従って、完全なパネル（８つのバイオマーカー）から以下を除いたものの効果を確認し、以下の感度及び特異度が得られた。
【０１２８】
【表１７】
【０１２９】
これらのデータは、群間の最良のさらなる判別をもたらす２つのタンパク質がＴＮＦａｒ及びＣＲＦであることを示唆している。
【０１３０】
完全パネル及び１つのタンパク質を除いた他の組み合わせは、妥当な感度及び特異度（８０％／８０％）のバイオマーカーの組み合わせを提供するが、商業的にはより少ないバイオマーカーの使用が望ましいこともある。この目的から、以下のより少数の組み合わせを評価し、結果は以下のとおりであった。
【０１３１】
【表１８】
【０１３２】
図２は、２８週の試料採取後の、後に起こるＰＴＢを予測する以下のとおりの９つの予測因子：配列番号１、配列番号２、配列番号３、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型の組み合わせを含んだ第１及び第２のバイオマーカーの予測能力を実証するＲＯＣを作成したことを示す。曲線下面積及び９５％信頼区間もまた報告する。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡアッセイＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。目的のペプチド（抗原）に対して免疫学的特異性を有する第１の抗体を９６ウェルマイクロタイタープレートの表面上に吸着させる。既知の段階的濃度の目的とするペプチドの２５マイクロリットルの血清又は標準を個々にウェルに添加する。血清を第１の抗体と３０分間インキュベートする。ウェル表面にコーティングされた第１の抗体が抗原を結合して固定化する。同様にその抗原に対して免疫学的特異性を有する第２の抗体を含む２００マイクロリットルの第２の溶液を各ウェルに添加する。第２の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は化学発光前駆体などのマーカーで標識されている。ウェルを３０分間インキュベートして第２の抗体を抗原−第１の抗体複合体と結合させることで、それ自体がウェル表面に結合している抗体−抗原−抗体「サンドイッチ」が形成される。次にウェルを慎重且つ完全に洗浄し、結合していない第２の抗体を全て取り除く。次に、第２の抗体標識に特異的な基質を含む溶液を添加する。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、結合した第２の抗体の量に対応してウェル内で色の変化が起こる。化学発光マーカーの場合、基質は非化学発光分子種から光を放つ化学発光生成物に変換される。この生成物から放たれる光はウェル内に存在する抗原の量に比例し、特定の波長で放たれる光を計測してその強度を記録する特殊な分光計「プレートリーダー」により計測される。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡアッセイＩＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。このアッセイはＥＬＩＳＡアッセイＩと同様であり、但し第２の抗体はビオチン分子で標識される。抗体−抗原−抗体の形成後にウェルを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するストレプトアビジンを含む溶液をウェルに添加してビオチン分子と反応させる。この特定のアッセイでは、未着色の基質が着色された生成物に変換される。その特定の波長の吸光度として計測される色の強度が、ウェル内に存在する抗原の量に比例する。その吸光度を、既知の段階的濃度の抗原の一連の校正用標準の吸光度対濃度のプロットと比較することにより、未知試料の濃度を推定することができる。
【０１３５】
上述の組成物及び適用形態は、本発明の好ましい実施形態の例示に過ぎないことが理解されるべきである。当業者は本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく数多くの変形例及び代替的な構成を考案することができ、添付の特許請求の範囲がかかる変形例及び構成を網羅することが意図される。従って、本発明は上記において、現時点で本発明の最も実用的で好ましい実施形態であると見なされるものに関連して特殊性及び詳細を伴い説明されたが、当業者には、限定はされないがサイズ、材料、形状、形態、機能及び動作方法、組立て及び使用が異なるものを含め、数多くの変形例を、本明細書に示される原理及び概念から逸脱することなく実施し得ることは明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／２５３，５０３号明細書に対する優先権を主張する。この出願は、その全ての教示が本明細書によって全体として参照により援用される。
【０００２】
謝辞
本発明に至った研究は、一部についてＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、交付金番号第Ｒ２１ＨＤ０４７３１９号及び同第Ｕ０１ＨＤ０５００８０号による資金提供を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の相互参照
本明細書に記載されるペプチドは、配列識別子番号（配列番号）によって参照される。配列番号は数値的には配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２等に対応する。コンピュータ可読フォーマット（ＣＦＲ）で書かれた配列表は、全体として参照により援用される。
【背景技術】
【０００４】
早期分娩は、全体の１０％を超える妊娠中の母親に影響を及ぼす。早期分娩はまた、新生児に関連する主要な罹病及び死亡原因の一つである。満期で産まれた乳児と比較して、未熟で産まれた乳幼児では新生児死亡の４０倍の増加が認められ、脳性麻痺、慢性呼吸器疾患、失明及び難聴などの主要な医学的合併症のリスクが著しく高くなり得る。さらに、出生体重が１．５ポンド未満の場合、そのうち７０％もの子供に長期にわたる神経学的な及び発育上の問題が確認されている。これらの合併症に関連して、米国だけでも毎年数十億ドルの直接的なコスト、さらに未実現の潜在的コストが推定されている。
【０００５】
問題の重大さにもかかわらず、体内で何が起こって早期陣痛及び早期分娩に至るのかに関しては、不確かなままである。早産（ＰＴＢ）の原因に関してこのような不確かさがあるため、これらの問題には限定的にしか有効に対処できていないが、適切な事前の警告があれば、医療専門家は医学的な対策をとることができる。妊娠中のどの母親が早産を起こし易いかを予測することができたならば、未熟分娩を遅延させ、又はさらには防止し得る薬物を投与することができる。加えて、早産リスクが割合早く検出される場合に母親を介して胎児に投与されたならば、胎児肺成熟度を高め、従って早産に関連する主要な合併症の一つを低減できるホルモン誘導体が知られている。しかしながら、現在のところどの妊娠中の母親にこの妊娠合併症を発症するリスクがあるかを知る方法はないように思われる。従って、早産のリスクがある母親を早期に発見するための検査手順を策定することが必要とされており、これは重要でありながらいまだ対処されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、妊娠中の対象における早産のリスク評価方法が記載される。これらの方法は、対象からの生体試料中における早産に関連する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを検出し、及び定量するステップを含む。早産の予測において有用なバイオマーカーについてもまた詳細に記載される。本発明の利点は、一部については以下の説明に示され、一部については説明から明らかとなり得るか、又は以下に記載される態様を実施することにより分かり得る。以下に記載される利点は、特に添付の特許請求の範囲に指摘される要素及び組み合わせを用いて実現及び達成され得る。前述の概要及び以下の詳細な説明の双方とも、あくまでも例示的且つ説明的なものに過ぎず、限定するものではないことが理解されるべきである。
【０００７】
本明細書に援用され、且つその一部をなす添付の図面は、以下に記載されるいくつかの態様を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１のバイオマーカーについてスクリーニングした受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。
【図２】第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーについてスクリーニングした生体試料の受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本化合物、組成物、及び／又は方法を開示及び説明する前に、以下に記載される態様は特定の化合物、合成方法、又は使用に限定されるものではなく、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語法は特定の態様の説明を目的としているに過ぎず、限定を意図するものではないことも理解されなければならない。
【００１０】
本明細書及び続く特許請求の範囲では多数の用語を参照し、それらは以下の意味を持つと定義するものとする。
【００１１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含むことは留意しなければならない。従って、例えば「バイオマーカー」に対する参照は２つ以上のかかるバイオマーカーの混合物を含み、他も同様である。
【００１２】
「任意選択の」又は「場合により」は、続いて記載される事象又は状況が起こることも、又は起こらないこともあり、及びその記載が、事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【００１３】
本明細書で使用されるとき「対象」は、早産のリスクがあり、且つ本明細書に記載される方法により利益を受ける妊婦を指す。
【００１４】
本明細書で使用されるとき「早産」は、妊娠期間の満期より前の児娩出を含む。例えば、妊娠３７週未満の児娩出が早産と見なされる。早産という用語は、早期分娩及び未熟分娩と同義語である。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、用語「バイオマーカー」は、早産リスクの予測に有用な、様々な濃度で妊婦に存在する天然に認められる生体分子を指して使用され得る。例えばバイオマーカーは、早産を起こさなかった対象における同じバイオマーカーの量と比べて早産のリスクがある対象体内ではより多量に又はより少量で存在するペプチドであってもよい。バイオマーカーには、限定はされないが生体アミン及びステロイドなどの小分子を含めた、ペプチド以外の他の分子が含まれ得る。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸であって、一方のアミノ酸のカルボキシル基により他方のα−アミノ基に連結されたアミノ酸を含む天然又は合成分子を指して使用され得る。ペプチドの長さは限定されず、従って「ペプチド」にはポリペプチド及びタンパク質が含まれ得る。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、ペプチドとの関連における用語「単離された」は、材料が天然に認められるものである場合に、その当初の環境から取り出された材料を指す。例えば、生体動物中に存在する天然に認められるペプチドは単離されたものではなく、しかし同じペプチドであって、天然系内で共存する材料の一部又は全てから分離されたペプチドは、単離されている。かかる単離されたペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおその組成物がその天然の環境の一部ではないという点で単離されているといえる。「単離された」ペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術によって合成又は産生される材料も含む。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的免疫反応性」は、ペプチドと抗体との間での結合などの、生体試料中又はペプチドと他の生物学的物質との異種集団中でのペプチドの存在の決定因子となる測定可能且つ再現可能な特異的免疫反応を指す。用語「特異的免疫反応性」は、構造形状及び表面特徴の特異的認識を含み得る。従って、指定された条件下で、特定のペプチドに対して特異的免疫反応性を有する抗体は、試料中に存在する他のペプチドに多量に結合することはない。特定のペプチドに対して特異的免疫反応性を有する抗体の決定には、様々なイムノアッセイフォーマットを用いることができる。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、ペプチドとの特異的免疫反応性を有するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。例えば、特異的免疫反応性の決定に用いられ得るイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、参照により本明細書に援用されるＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００１９】
本明細書で使用されるとき用語「抗体」は、所与の抗原に対して特異的免疫反応性を有する免疫グロブリンを指す。用語「抗体」は、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の全抗体、及びその断片を含むことが意図される。「抗体」はまた、本明細書で使用されるとき、抗体製剤も含む。抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて検出可能標識で標識されてもよい。標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、又は酵素補因子、又は当該技術分野において公知の任意の他の標識であってよい。いくつかの態様において、目的のペプチドに結合する抗体は標識されなくてもよく、代わりに、一次抗体に特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出されてもよい。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「検出する」は、検出不能な、低い、正常な、又は高い血清濃度の１つ又は複数のバイオマーカー、例えばペプチド及び他の生体分子の定量的計測を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「定量する」及び「定量」は同義的に用いることができ、相対的か絶対的かにかかわらず、試料中の物質（例えば、バイオマーカー）の数量又は存在量を決定するプロセスを指す。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、所与の値が所望の結果に影響を及ぼすことなく端点を「少し上回る」又は「少し下回る」ものであってよいことを付け加えることにより数値範囲の端点に柔軟性をもたせるために使用される。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、便宜上、ある共通のリストに複数の項目、構造要素、組成要素、及び／又は材料が提示され得る。しかしながらこれらのリストは、リストの各構成物が個別的な且つ固有の構成物として個々に特定されたものとして解釈されなければならない。従ってかかるリストの個々の構成物のいずれも、反する旨の指示がなければ、共通の分類中にそれらが現れるからといって、そのことのみに基づいて同じリストの任意の他の構成物の事実上の均等物であると解釈されてはならない。
【００２４】
濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では範囲の形式で表現又は提示され得る。かかる範囲の形式は単に便宜的に、且つ簡潔にするために用いられるに過ぎないことが理解されるべきであり、従って、範囲の上下限として明示的に記載される数値を含むのみならず、当該の範囲内に含まれる個々の数値又は部分的な範囲もまた全て、各数値及び部分的な範囲が明示的に記載されたものとして含むように、柔軟に解釈されなければならない。例示として、数値範囲「約１から約５」は、約１から約５の明示的に記載される値を含むのみならず、指示される範囲内にある個々の値及び部分的な範囲もまた含むものと解釈されなければならない。従ってこの数値範囲には、２、３、及び４などの個々の値及び１〜３、２〜４、及び３〜５等の部分的な範囲、並びに個々に１、２、３、４、及び５が含まれる。この同じ原則は、ただ１つの数値を最小値又は最大値として記載する範囲に適用される。さらに、かかる解釈は、範囲の広さ又は説明される特性にかかわらず適用されなければならない。
【００２５】
本明細書には、早産のリスクがある妊娠中の対象を特定する方法が記載される。早産のリスクがあり得る妊娠初中期にある妊娠中の対象の特定に利用され得る第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーが同定されている。かかるマーカーにより、早産と、同様の症状を呈する他の状態との間の分別診断が可能となり得る。早産のリスクがより高い対象を早期に特定するならば、かかる対象をより綿密にモニタすることができるため、多大な価値がもたらされ得る。
【００２６】
本明細書に記載される方法を用いた妊娠中の対象の試験は、早産の指標となる第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを対象において定量可能な、妊娠中の任意の時点で行うことができる。例えば、一態様において第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーは妊娠約２０週〜約３４週に試験され得る。別の態様において、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーは妊娠約２４週〜約３２週に試験され得る。これらの範囲は限定として理解されてはならないことに留意すべきであり、従って試験は妊娠中のいかなる時点で実施されてもよい。むしろこれらの範囲は、かかる試験が対象の大多数で行われる可能性が最も高い妊娠周期の期間を示すために提供される。
【００２７】
早産のリスクがある対象の特定に有用なバイオマーカーとしては、様々なペプチド及び他の生体分子が含まれる。本明細書に記載される技術及び方法を用いて、早産の発生率と相関する特定のペプチド及び他の生体分子が同定されている。これらのペプチド及び他の生体分子の１つ又は複数を定量することにより、対象についての早産リスクの何らかの指標が提供され、従って予防的処置の機会が提供され得る。早産合併症を予測する任意のバイオマーカーが本発明の特許請求の範囲の範囲内にあると見なされるべきであることに留意しなければならない。しかしながら一態様では、早産合併症に関連する第１のバイオマーカー又は第２のバイオマーカーの非限定的な例として、対照の対象（すなわち、早産合併症を起こさなかった妊婦）と統計的に有意差が認められ（ｐ≦０．０１）、ｐ（確率）値＜０．０２をカットオフとする生体分子及びペプチドが含まれてもよい。
【００２８】
一態様において、バイオマーカーは第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを含む。この態様では、第１のバイオマーカーは、ＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号１）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号２）、ＮＶＨＳＡＧＡＡＧＳＲＭ（Ｏ）ＮＦＲＰＧＶＬＳＳＲＱＬＧＬＰＧＰＰＤＶＰＤＨＡＡＹＨＰＦ（配列番号３）、又はそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を有するペプチドなどの、早産に関連するペプチドを含み得る。別の態様では、第２のバイオマーカーは、早産に関連する完全長タンパク質又はタンパク質のペプチド断片を含み得る。この第２のバイオマーカーとしては、限定はされないが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。さらに別の態様では、第２のバイオマーカーとして、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。これらの完全長タンパク質の配列は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能である。
【００２９】
本願の中であらゆる目的から本明細書によって全体として参照により援用される国際公開第２００８／０７９４０７号パンフレットに開示されるとおりの、バイオマーカーの同定に用いられるプロテオミクス技法を用いて、妊娠中の対象における早産リスク評価用バイオマーカーを同定及び定量することができる。一態様において、早産の可能性について妊娠中の対象を試験する方法は、生体試料中に存在する早産に関連する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせの濃度又は量の、対照（すなわち、早産を起こさない妊婦における１つ又は複数のバイオマーカーの相対的な濃度又は量）と比較した差を検出するステップを含み得る。一態様において、プロテオミクスのシステム及び方法を用いて第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを同定及び定量することができる。例えば、異なる生体試料からの複数の質量スペクトルを比較し、非生物学的な変動を補償する手法を用いた後に定量的に異なる質量イオンを特定し、目的のバイオマーカーを分離し、及び特性決定するステップを用いることができる。かかる方法は、複数の生体試料の各々を分画して複数の溶出液を形成し、複数の溶出時間における複数の溶出液の各々から複数の質量スペクトルを得て、生体試料間で定量的に異なるように見える目的の分子イオンピークを求めるステップを含み得る。この方法はさらに、生体試料間で実質的にばらつきのない内因性の基準分子であって、目的のピークと実質的に同様の溶出時間及び質量対電荷比を有する基準分子に対応する質量スペクトル基準ピークを同定するステップと、目的のピークを内因性基準分子の質量スペクトルピークに対して正規化することで複数の溶出液にわたり各生体試料についての非生物学的変動を補償するステップとを含み得る。この方法は、複数の衝突エネルギーの各々を一ランずつ使用する衝突誘導フラグメンテーション試験を行うステップと、得られた複数のフラグメントイオン質量スペクトルを平均化することなく合計して、単一の累積娘フラグメント質量スペクトルを形成するステップと、娘フラグメント質量スペクトルを使用してアミノ酸配列データを確立するステップであって、次にそれが単一のアライメントされた質量スペクトル中の目的のピークに対応するペプチドの同定において使用されるステップとをさらに含み得る。
【００３０】
別の態様において、第１及び第２のバイオマーカーを含む生体試料を分画して複数の溶出液を形成することができ、複数の溶出時間における複数の溶出液の各々から複数の質量スペクトルが得られ、複数の溶出液の各々の中に溶出する内因性アライメント分子に対応する質量スペクトルアライメントピークが特定される。この方法は、複数の溶出液の各々からの質量スペクトルアライメントピークをアライメントすることにより、各溶出液からの複数の質量スペクトルをアライメントするステップと、複数のアライメントされた質量スペクトルを合計して単一のアライメントされた質量スペクトルを形成するステップと、単一のアライメントされた質量スペクトル中の目的のピークに対応するペプチドを同定するステップとをさらに含み得る。様々な技法が企図されるが、一態様において複数の質量スペクトルをアライメントするステップは、複数の質量スペクトルを視覚的にアライメントするステップをさらに含み得る。加えて、複数の生体試料中に存在する複数の生体分子の各々を分画するステップは数多くの方法により達成することができ、例えばキャピラリー液体クロマトグラフィー（ｃＬＣ）により達成されてもよい。本明細書に記載される第１及び第２のバイオマーカーを検出及び定量するための具体的な方法及びパラメータは、実施例に提供する。
【００３１】
本明細書に記載される第１及び第２のバイオマーカーの検出及び定量に用いられるプロテオミクス技法は、全ての血清にとって天然の分子であって、標本負荷量、イオン化効率及び質量分析器感度の差を補正するために使用することのできる内部標準となる分子を利用する。上記の考察に加え、あるピークが比較群の間で定量的に同様であると示すことができ、候補バイオマーカーと同じ溶出ウィンドウでカラムから溶出し、その質量対電荷比が候補バイオマーカーと同様であり、且つ十分に豊富にあって、いずれの標本においてもノイズのレベルの３倍より多い量である場合、そのピークが基準として選択される。本明細書に記載される基準ピークは、標本処理、クロマトグラフ負荷量、イオン化効率又は機器感度のばらつきに関連する、しかしピーク量が生物学的に異なることに起因するのではないピーク高さ又はピーク面積を定量的に補正するためのものである。この基準は内部定量標準と称される。他の態様では、外部標準を使用してバイオマーカーの定量を促進することができる。この態様では、既知量の化合物を生体試料に添加することができ、それによりバイオマーカーの標準に対する比を計算することができる。次にこの比を対照試料からの比と比較することにより、早産リスクを評価することができる。
【００３２】
上記に説明したとおり、配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせを含む第１のバイオマーカーが、早産の予測因子として同定されている。内部定量標準を使用して配列番号１〜３を定量した。配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）に使用される基準（すなわち、内部標準）のｍ／ｚは、モノアイソトピックピークのその＋３の荷電状態について６７３．３６であった。中性親質量は２０１７．０７質量単位であり、クロマトグラフィー溶出時間は１５．５分であった。しかしながら溶出時間が日によって、又はカラム交換でいくらか変わることを考慮し、溶出時間はその溶出時間の内部時間標準に対する割合として（０．９９６８、すなわちそれは内部時間標準と比べてそれ自体の滞留時間の０．００３２倍早く溶出する）、及びその溶出時間の配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）と比較した割合として（１．０５５８、すなわちそれは、バイオマーカーと比べてそれ自体の溶出時間の０．０５２８６早く溶出する）、提供される。
【００３３】
第２の内部定量標準は配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）及び配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の基準とした。基準分子のｍ／ｚはその＋５の荷電状態で８４２．３９であり、中性親質量は４２０６．０７質量単位であった。クロマトグラフィー溶出時間は約１５．８分であった。しかしながら溶出時間のばらつきを考慮し、その溶出時間は内部時間標準及び配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の溶出時間との関連で記述することがより適切である。内部時間標準との関連では、内部定量標準は内部時間標準の溶出後に溶出時間それ自体の溶出時間の０．０１５９倍という率（又は時間標準マーカーの１．０１６１の比）で溶出した。配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）との関連では、内部定量マーカーはそれ自体の溶出時間の０．０５３９倍という率でバイオマーカーの後に（又はバイオマーカーの溶出時間の１．０７００の率で）溶離した。
【００３４】
個々の質量は溶出時間（滞留時間）により定義され得るが、溶出時間（滞留時間）はまた、内部時間標準の関数として表現することもできる。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカー（ｔｉｍｅ ｍａｋｅｒ）と目的のピークに後続する時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置により決定される。この決定がＲｆ値と見なされる。Ｒｆ値は以下のとおり計算される：
Ｒｆ＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）。
【００３５】
上記に説明される技法を用いることで、配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせを含む第１のバイオマーカーが早産の指標として同定されている。第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）の同定及び定量に関する具体的な詳細は実施例に提供する。配列番号１〜３のさらなる構造特性は以下に提供する。ペプチドである配列番号１は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が６７７、平均質量が２０２６．９８ダルトン、平均溶出時間が１４．３０±０．４７分、及びＲｆ値が０．５３５±０．０５２である。
【００３６】
ペプチドである配列番号２は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が８５７、平均質量が４２７９．２５ダルトン、平均溶出時間が１７．２０±２．０４分、及びＲｆ値が０．７８１±０．０８６である。
【００３７】
ペプチドである配列番号３は、質量イオンピーク（ｍ／ｚ）が８６０、平均質量が４２９５．２５ダルトン、平均溶出時間が１６．１３±１．９７分、及びＲｆ値が０．６９５±０．１３４である。
【００３８】
上記に説明される、この例の範囲内にある技法を用いて、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーが、第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせるとき早産の指標として同定されている。
【００３９】
従って、早産の可能性について妊娠中の対象を評価する方法が提供される。一態様において、この方法は、対象の生体試料中において早産に関連する本明細書に記載される第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを検出するステップを含み、第１のバイオマーカーは、配列であって、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３により表される配列と同一の、又は相同なアミノ酸配列を有し、及び第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む。次に、生体試料中の第１及び第２のバイオマーカーの存在量が定量される。第１及び第２のバイオマーカーの存在量は、処理及び分離の後に、同様に生体試料中に存在する内部標準となる基準分子の関数として計測される。用語「存在量」は、本明細書で使用されるとき、所与の質量スペクトルにおける質量分析器により計測される特定の質量のイオンの数、又は全溶出間隔に相当するいくつかの質量スペクトル中に観測される特定の質量のイオンの合計数を表す。この内部標準に対してバイオマーカー存在量を正規化すると、非生物学的変動が低下し、リスク予測におけるバイオマーカーの利用能が向上する。別の言い方をすれば、対象間において比較的一定した存在量で生体試料中に存在する分子を基準に選択することにより、特に長期間にわたり分散し得る別々の日に実施されるランを比較するとき、生体試料の処理のばらつきを補正することができる。このため、バイオマーカーの相対的存在量は、含まれる特定のバイオマーカーによって異なり得る。従って各バイオマーカー／基準比について特定のカットオフ値を設定してもよく、それによりバイオマーカーピーク存在量の基準ピーク存在量に対する比が特定の値を上回る、又は下回ることから早産リスクの実質的な増加を予測し得る。
【００４０】
早産の可能性についての試験はまた、対象からの生体試料中の第１及び第２のバイオマーカーの存在量を、同じバイオマーカーの正常出産の指標となる既知の存在量と比較することにより達成されてもよい。一態様において、第１のバイオマーカーが、単独での、又は配列番号２及び３との任意の組み合わせでの配列番号１である場合に、対象において計測される配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５０％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される単独での、又は配列番号２及び３との組み合わせでの配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３０％未満であるならば、早産が生じ得る。さらに別の態様において、対象において計測される単独での、又は配列番号２及び３との組み合わせでの配列番号１の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１０％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４１】
別の態様において、第１のバイオマーカーが配列番号２である場合に、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５０％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３０％未満であるならば、早産が生じ得る。さらに別の態様において、対象において計測される配列番号２の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１０％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４２】
さらなる態様において、第１のバイオマーカーが配列番号３である場合に、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約５５％未満であるならば、早産が生じ得る。別の態様において、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約３５％未満であるならば、早産が示唆され得る。さらに別の態様において、対象において計測される配列番号３の存在量が少なくとも妊娠２２週で対照の存在量の約１５％未満であるならば、早産が生じ得る。
【００４３】
第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを含み得る任意の種類の生体試料をスクリーニングすることができ、非限定的な例として、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、組織、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）及び第２のバイオマーカーは、ほとんどの妊婦に存在するが、早産を起こすことになる多くの妊婦は、正常出産を経た女性と比較して妊娠中の第１のバイオマーカーの血清中濃度が低かった。しかしながら、第２のバイオマーカー（すなわちコルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）については、スクリーニングした特定のタンパク質又はペプチドに応じて、後に早産を起こすことになった女性で正常出産を経た女性と比較して低いことも、又は高いこともあった。第２のバイオマーカーの血清中濃度に関するさらなる詳細は、実施例の節の表１６を参照されたい。第２のバイオマーカーは過去に早産の予測可能性が評価されたことは注目に値する。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＲＬ，Ｉａｍｓ ＪＤ，Ｍｅｒｃｅｒ ＢＭ，Ｍｅｉｓ ＰＪ，Ｍｏａｗａｄ Ａ，Ｄａｓ Ａ，Ｍｉｏｄｏｖｎｉｋ Ｍ，Ｖａｎｄｏｒｓｔｅｎ ＰＪ，Ｃａｒｉｔｉｓ ＳＮ，Ｔｈｕｒｎａｕ Ｇ，Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ ＭＰ；「Ｍａｔｅｒｎａｌ−Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｔｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｔｈｅ Ｐｒｅｔｅｒｍ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ：ｔｏｗａｒｄ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｍａｒｋｅｒ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ」 Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２００１；１８５（３）：６４３−５１頁を参照のこと。しかしながら、上述の参考文献が指摘するとおり、第２のバイオマーカー（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）は、第１のバイオマーカーが存在しない状態で検出及び定量されるときには、ＰＴＢの臨床予測に使用するのに十分な特異度又は感度が得られなかった。
【００４５】
一態様において、ＰＴＢ症例群は第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）が対照群ほど多量ではなかった。従って、対象からの生体試料中の第１のバイオマーカーの１つ又は複数の存在量を、早産を起こさなかった対象からの既知の対照濃度と、又は試験対象からの既知のバイオマーカー濃度と比較することで、早産を予測し得る。第１のバイオマーカーの存在量がより高い又は低い対象は早産リスクが高いことがあり得るため、ひいては適切な処置が可能な十分に早い時期に特定され得る。早産の予測における特定のバイオマーカーの存在量について、以下に詳細に記載する。
【００４６】
一態様では、早産の対象及び対照の対象のバイオマーカー存在量を計算するため、妊娠２８週の第１のバイオマーカーについてｌｏｇ比をとった。例えば、ｌｏｇ ６７６．７／６７３．３６（配列番号１／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．５７９±０．１０１の対照平均及び−０．０１５±０．０９０のＰＴＢ平均が得られた。ｌｏｇ ８５６．８／８４２．８（配列番号２／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．２３１±０．１０２の対照平均（早産を起こさなかった対象）及び−０．１４９±０．０９５のＰＴＢ平均（早産のリスクがある対象）が得られた（実施例の表１２）。実施例の１２に関しては、他のバイオマーカーのｌｏｇ比を計算した。ｌｏｇ ８６０．０／８４２．８（配列番号３／基準ピーク）のｌｏｇ比から、０．２０１±０．０９６の対照平均及び−０．２０４±０．０８８のＰＴＢ平均が得られた。別の言い方をすれば、早産のリスクがある対象は、配列番号１の減少、配列番号２の減少、及び配列番号３の減少を、個々に、或いは同時に示す可能性が最も高いものと思われる。
【００４７】
この説明を念頭に置けば、一態様では、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約１．０未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．８未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号１（ｍ／ｚ ６７７）の存在量の、ｍ／ｚ ６７３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００４８】
さらに、一態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．５未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号２（ｍ／ｚ ８５７）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．４４未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００４９】
加えて、一態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．６未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。別の態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．４未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。さらに別の態様において、配列番号３（ｍ／ｚ ８６０）の存在量の、ｍ／ｚ ８４３の基準分子の存在量に対する比が、少なくとも妊娠２２週で約０．２未満と計測される場合、早産リスクの実質的な増加が予測され得る。
【００５０】
特定の態様において、上記で計算されるｌｏｇ比を使用して、早産を起こすリスクがある妊婦のリスクを統計的に予測し得る。第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの予測力の一般的な一尺度は、その感度及び特異度である。「感度」は、本明細書で使用されるとき、真陽性率（例えば、バイオマーカーによって正しく特定される、後に早産を起こす妊婦の百分率）として定義される統計学用語である。用語「特異度」は、本明細書で使用されるとき、真陰性率（例えば、正しく特定される、合併症を伴わない妊娠の妊婦の百分率）として定義される。早産の予測に本明細書に記載されるとおりの第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを使用するため、数値的閾値が設定される。数値的閾値を設定するため、特定のバイオマーカーに対する値の範囲が最低値から最高値まで、及び各時点における陽性として正しく特定される対象の割合、及び同じ時点における陽性として誤って特定される対照の割合について考慮される。特定のバイオマーカーについての値の範囲は、特定のデータセットについて最低値から最高値まで実際の定量値をとることにより計算され得る。これは受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）と称される。一態様において、偽陽性率は２０％に限られてもよく、一般にはこれが臨床試験の最大耐容値と考えられる。偽陽性率（すなわち、バイオマーカーによって早産を起こすリスクがあると特定される、合併症を伴わない妊娠の女性の百分率）は、１００％から真陰性率を減じて計算される。２０％以下の偽陽性率（８０％以上の特異度に等しい）の閾値が、ある人にリスクがあるか、それともリスクがないかについての判断に使用される閾値を決定する。
【００５１】
実施例の表１３及び表１４に関連して、早産のリスクがある対象を特定するための、４つのｌｏｇ比の各々（すなわち第１のバイオマーカー）に対する閾値を決定した。各々に対する閾値は、２０％以下の偽陽性率と同じである８０％以上の特異度（真陰性率）となるように計算した。数学的に決定された閾値を用いて、４つの比から独立して感度（真陽性）の比及び特異度（真陰性）の比が提供された（表１３及び表１４）。表１４を参照すると、配列番号１の比（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）が、早産の予測に関して最も高い感度（６５％）及び特異度（８５％）をもたらした。従ってこの態様では、妊婦に存在する配列番号１（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）の同定及び定量が、早産を起こす可能性の正確な予測因子となる。配列番号１の比（すなわちｌｏｇ ６７７／６７３）が有用であるが、また、ｌｏｇ比の組み合わせを使用して早産リスクを予測し得ることも企図される。従って、本明細書に特定される第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）は、早産リスクの有力な予測ツールである。
【００５２】
本明細書に記載される第１のバイオマーカーは早産を予測することができる。しかしながら、ある場合には第２のバイオマーカーをスクリーニング及び定量することにより、早産試験の予測値を改良してもよい。一態様において、対象からの生体試料が第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーについてスクリーニングされてもよく、ここで第１のバイオマーカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせにより表される配列と同一の又は相同なアミノ酸配列であり、第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせである。この態様において、第２のバイオマーカーを単独でスクリーニングする場合、それはＰＴＢの指標とはならない。しかしながら、第２のバイオマーカーを第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）と組み合わせてスクリーニングすると、第１のバイオマーカー単独でのスクリーニングと比較してＰＴＢの予測感度が増加する。一態様では、ＰＴＢについて第１及び第２のバイオマーカーが共にスクリーニングされるとき、感度は８０％超又は８０〜９０％である。特定の態様において、感度は９０％以上である。別の態様では、ＰＴＢについて第１及び第２のバイオマーカーが共にスクリーニングされるとき、特異度は少なくとも８０％である。比較として、第１のバイオマーカーのみが検出及び定量されるとき、感度は約６５％である。
【００５３】
一態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも２つのタンパク質である。
【００５４】
別の態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも３つのタンパク質である。
【００５５】
さらなる態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型から選択される少なくとも４つのタンパク質である。
【００５６】
さらに別の態様において、第２のバイオマーカーが生体試料中でスクリーニングされるとき、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む５つのタンパク質である。
【００５７】
表１〜６は、限定はされないが、ＰＴＢの予測のためにスクリーニングされ得る第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの可能な組み合わせを含む。これらの表中、第１のバイオマーカーは、配列番号１（単独、或いは配列番号２及び３との組み合わせ）、配列番号２（単独、或いは配列番号１及び３との組み合わせ）、及び配列番号３（単独、或いは配列番号１及び２との組み合わせ）を含み、第２のバイオマーカーは、タンパク質（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせ）の様々な組み合わせを含む。例えば表１では、第１のバイオマーカーは配列番号１であり、及び第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むリストから選択される。従って、一態様において第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子を含むことができる。別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子及びトロンビン−抗トロンビン複合体を含むことができる。さらに別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、トロンビン−抗トロンビン複合体、及びフェリチンを含むことができる。さらに別の態様において、第１のバイオマーカーは配列番号１、２、及び３を含むことができ、且つ第２のバイオマーカーはコルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含むことができる。表１〜６は、各々がこの方法論によって解釈され得る。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
【表６】
【００６４】
予測値はまた、利用される試験又はアッセイのタイプ（本明細書ではその一部をさらに詳細に考察する）によっても異なり得る。複数のバイオマーカー（すなわち、第１及び第２のバイオマーカー）の存在及び量を評価することにより、早産の予測に有用なフィンガープリントを生成することが可能である。例えば、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとを決定し、定量すると、本明細書に記載される方法の予測値は増加し得る（実施例の節を参照のこと）。しかしながらＰＴＢを発症する女性がより少数しか含まれないこともあり、これは早産を起こすリスクが指示され易くなる。目的のペプチドを含み得る任意のタイプの生体試料をスクリーニングすることができ、かかる非限定的な例としては、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、組織、及びそれらの組み合わせが挙げられる。しかしながら一態様では、対象から採取された血清試料中のペプチドについてスクリーニングすることが好都合であり得る。別の態様では、対象から採取された血液試料中のペプチドについてスクリーニングすることが好都合であり得る。
【００６５】
本明細書にはまた、妊娠中の対象が早産を起こす確率を予測するために利用され得る単離されたペプチド（すなわち、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカー）及び単離されたペプチドの混合物についても記載される。かかるタンパク質及びペプチドは多くの試験アッセイで陽性対照として、並びに抗体の産生用に、有用であり得る。一態様において、例えば単離タンパク質又はペプチドは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３により表される配列と同一の、又は相同なアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーである。別の態様において、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの組み合わせを含む単離タンパク質又はペプチドである。ペプチド合成は当該技術分野において公知であり、当業者であれば、ペプチド配列を入手した後には、様々な技法を用いて本明細書に開示されるペプチドを合成可能であろうことが理解される。かかる技法としては、限定なしに、液相合成法及び固相合成法、並びに様々な化学的ライゲーション方法、いくつか例を挙げれば、事前のチオール捕捉（ｐｒｉｏｒ ｔｈｉｏｌ ｃａｐｔｕｒｅ）、ネイティブ化学ライゲーション、発現タンパク質ライゲーション、アシル開始捕捉（ａｃｙｌ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ）、及びシュタウディンガーライゲーション法などを挙げることができる。加えて、ペプチドはまた組換えＤＮＡ技術を用いて合成されてもよい。
【００６６】
特定の態様では、上記に説明されるプロテオミクス技法を用いてバイオマーカーを同定及び定量することができる；しかしながら本明細書では、一致する生体試料中のバイオマーカーの検出及び／又は定量が可能な他の方法を用いることができる。可能なペプチドアッセイの一種として、イムノアッセイが挙げられる。同種法、及び異種法、並びに競合法及び非競合法を含め、特定のペプチドについて抗体を利用して生体試料をスクリーニングする数多くのイムノアッセイプロトコルが公知である。例えば、かかる技法は固体支持体の使用、免疫沈降等を含み得る。しかしながら、概してペプチドを検出するためのイムノアッセイは、標識された抗体の使用を伴うことが多い。かかる標識はいかなる種類の公知の材料を含んでもよく、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識等が挙げられる。そのため、かかるイムノアッセイ試験は当該技術分野において公知であり、生体試料中のペプチドの検出に利用される特定の方法が、本発明の特許請求の範囲の範囲に限定されるものとして解釈されるべきではないことは理解されなければならない。イムノアッセイについては以下でさらに詳しく考察する。
【００６７】
他の態様では、本明細書に記載されるとおりの第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとに対して特異的免疫反応性を有する抗体を使用することができる。一態様において、例えば、配列番号１からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。別の態様において、配列番号２からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。さらに別の態様において、配列番号３からなるアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに対して免疫学的特異性を有する抗体が提供される。
【００６８】
一態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがコルチコトロピン放出因子である、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがデフェンシンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがフェリチンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがラクトフェリンである、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーがトロンビン−抗トロンビン複合体である、抗体が提供される。別の態様において、第２のバイオマーカーに免疫学的特異性を有する抗体であって、第２のバイオマーカーが腫瘍壊死α受容体１型である、抗体が提供される。
【００６９】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、又は組換えであってよく、及び当該技術分野において公知の任意の方法により産生され得る。抗体断片もまた本発明の範囲内にあると考えられる。本発明の態様に係る抗体は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物由来であってよい。一態様において、例えば抗体は、ヒト、ネズミ科動物（例えば、マウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ニワトリ等に由来することができる。
【００７０】
一態様では、ポリクローナル抗体を利用して生体試料中の本明細書に記載される第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを独立して検出及び定量することにより、早産リスクを評価し得る。ポリクローナル抗体は、当業者に公知の様々な手順により産生することができる。例えばポリクローナル抗体は、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギ等のインビボ宿主動物で産生されてもよい。宿主動物は、遊離ペプチドか、或いは担体にカップリングされたペプチドで、例えば腹腔内注射及び／又は皮内注射によって免疫される。注射材料は、典型的には約１００μｇのペプチド又は担体タンパク質を含む乳剤である。免疫応答を増加させるため、宿主種に応じて様々なアジュバントが用いられ得る。アジュバントの例としては、限定なしに、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができる。これらの及び他のアジュバントは、当該技術分野において公知である。検出することのできる有効な抗体力価をもたらすため、数回のブースター注射が、ある場合には約２週間おきに必要となり得る。免疫化された動物の血清中の抗体力価は、抗体の選択により、例えば当該技術分野において公知の方法に従うペプチドの固体支持体上への吸着及び選択された抗体の溶出により増加させることができる。
【００７１】
別の態様において、モノクローナル抗体を利用して生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーを独立して検出及び定量することにより、早産リスクを評価し得る。モノクローナル抗体とは、ただ１種の抗原のみを認識する抗体を指す。このような抗体は、単一の抗体産生ハイブリドーマの娘細胞により生成される。モノクローナル抗体は、典型的にはそれが免疫反応を生じる任意のエピトープについて単一の結合親和性を呈する。モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位であって、各々が異なるエピトープに対して免疫特異性を有する抗体分子、例えば二重特異性モノクローナル抗体を含み得る。モノクローナル抗体は、当業者に公知の様々な方法により得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７頁（１９７５年）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８７年、１９９２年）；及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ「ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９２年、１９９３年）（各々が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００７２】
また、本明細書において有用な抗体は単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、又はより高い多重度の特異性）であってよいことにも留意すべきである。多重特異性抗体はペプチドの種々のエピトープに対して特異的であってもよく、又は目的のペプチドと、異種ペプチド又は固体支持体材料などの異種エピトープとの双方に対して特異的であってもよい。さらに抗体はまた、本明細書に記載されるバイオマーカーの任意の領域から調製されてもよい。
【００７３】
例として、モノクローナル抗体は十分に確立された方法を用いて調製することができる。一態様において、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技法を用いて調製される。かかる方法では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が免疫剤（例えば、本発明の態様に係るペプチド）で免疫され、その免疫剤に特異的に結合し得る抗体を産生する、又はその産生能を有するリンパ球が誘導される。或いは、リンパ球はインビトロで免疫されてもよい。次にリンパ球はポリエチレングリコールなどの好適な融剤を用いて不死化細胞系と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞系は、多くの場合に、げっ歯類、ウサギ、ウシ及びヒト起源の形質転換された哺乳動物細胞、特に骨髄腫細胞である。ラット又はマウス骨髄腫細胞系が用いられることが多い。ハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含む好適な培養培地中で培養され得る。例えば親細胞に酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。
【００７４】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地が、モノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。かかる技法及びアッセイは当該技術分野において公知である。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、細胞を限界希釈手順によりサブクローニングし、公知の方法により成長させ得る。モノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー等により培養培地から単離又は精製され得る。モノクローナル抗体はまた、本明細書によって参照により援用される米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの、組換えＤＮＡ方法により作製することもできる。当業者に公知の他の抗体生成方法が、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７５】
従って一態様では、早産の可能性について妊娠中の対象を試験する方法が提供される。かかる方法は、対象から生体試料を採取するステップと、生体試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させるステップであって、試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させると、第１の抗体が第１のバイオマーカーを結合して第１の抗体−抗原複合体を形成し、第２の抗体が第２のバイオマーカーを結合して第２の抗体−抗原複合体を形成し；第１のバイオマーカーはアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、第２のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、第１の抗体−抗原複合体及び第２の抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を定量するステップとを含み得る。次に、第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を、早産を起こさなかった生体試料からの同じバイオマーカーの量と比較する。生体試料中の目的のバイオマーカーの存在及び量が、早産リスクの指標を提供する。
【００７６】
説明したとおり、生体試料中のペプチドを検出及び／又は定量可能な様々なイムノアッセイが公知である。一態様において、イムノアッセイは競合アッセイであってもよい。例えば、試験ペプチドの配列を有する標識したペプチドをペプチド配列の少なくとも一部分に特異的な抗体に接触させ、抗体−抗原（又はペプチド）複合体を形成させる。そのペプチド／抗体混合物に生体試料を加え、生体試料中に存在する目的の任意のペプチドを標識ペプチドと競合させると、標識の強度が減少する。競合アッセイは一段階又は二段階プロトコルを含んでもよく、それらは当該技術分野において公知である。
【００７７】
別の態様において、イムノアッセイは非競合的アッセイ、すなわちサンドイッチアッセイであってもよい。かかるアッセイでは、概してより高いレベルのアッセイ感度及び特異度がもたらされる。非競合アッセイフォーマットもまた、一段階又は二段階プロトコルを利用し得る。概してかかるアッセイは物理的な支持体上に固定化された抗体を含み、ここで固定化された抗体は目的のバイオマーカー（すなわち第１又は第２のバイオマーカー）に対して免疫学的特異性を有する。同様に目的のペプチドに対して免疫学的特異性を有する標識抗体と共に、生体試料が支持体に加えられる。生体試料中に存在するペプチドが、支持体に沿って固定化された抗体に結合し得る。標識抗体もまた目的のペプチドに結合し、従って同様に物理的な基板にペプチド及び固定化抗体を介して固定化される。次に標識抗体の標識を検出することにより生体試料中の第１のバイオマーカー及び第２のバイオマーカーの量を定量し、対照（すなわち、早産を起こさない妊娠中の対象）と比較することができる。プロトコルによっては、標識を検出する前に、固定化されなかった標識抗体を洗浄により除くことができる。この場合、標識の強度は、生体試料中に存在する第１のバイオマーカー及び／又は第２のバイオマーカーの量量に比例する。
【００７８】
当該技術分野において公知の数多くの固体支持基板構成が企図される。かかる基板としては、抗体又は抗体アンカーなどの検出材料を固定化するための任意の好適な基板が含まれ得る。例えば、好適な基板としては、任意の固体有機、生体高分子、又は無機支持体材料などの、抗体の機能に著しい影響を及ぼすことなく検出材料との結合を形成可能な任意の固体支持体を挙げることができる。有機固体支持体材料の例としては、限定なしに、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリアクリルアミドなどのアクリル共重合体等のポリマーを挙げることができる。生体高分子支持体材料の例としては、限定なしに、セルロース、ポリデキストラン、アガロース、コラーゲン、キチン等を挙げることができる。無機支持体材料の例としては、限定なしに、ガラスビーズ（多孔質及び非多孔質）、ステンレス鋼、ＺｒＯ２、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、及びＮｉＯなどの多孔質セラミックスを含む金属酸化物、砂等を挙げることができる。
【００７９】
本明細書では、当該技術分野において公知の数多くの特異的アッセイ方法を用いることができる。かかる特異的アッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、ネフェロメトリック阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、化学発光磁気イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）等のプロトコルを挙げることができる。
【００８０】
様々な検出可能標識（すなわち指標）が、本発明の態様に従い抗体にカップリングされ得る。適切な標識としては、限定なしに、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、３２Ｐ等）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）等）、蛍光部分又はタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、ＢＦＰ等）、又は発光部分（例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ ＣＯＲＰ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から供給されるＱｄｏｔ（登録商標）ナノ粒子）を挙げることができる。上述の様々なイムノアッセイの実施において使用される一般的な方法は、当業者に公知である。
【００８１】
一態様において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡを含んでもよく、ここでは抗原（すなわち、第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、又はそれらの組み合わせ）が、限定はされないが９６ウェルプレートを含めた固体表面に結合され、次に抗原特異的モノクローナル抗体が加えられる。インキュベーション期間後、一次抗体が洗浄により除かれ、結合したモノクローナル抗体を認識する二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼＨＲＰで修飾されている）が加えられる。二回目のインキュベーション後、過剰な二次抗体が洗浄により除かれ、化学発光生成物又は蛍光生成物を生成する添加されたＨＲＰ用基質が添加され、「色」すなわち光が計測される。
【００８２】
イムノアッセイに加え、生体試料中のペプチドを検出するためのさらなる方法が企図され、そのいずれも本発明の範囲内にあると見なされ得る。一態様では、例えば質量分析（ＭＳ）技法が利用されてもよい。一つの具体例としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化などのハイスループットＭＳ分析技法を挙げることができる。かかる技法では、試料が毎時数百個の生体試料を高速処理することのできる特殊な設備に送られ得る。
【００８３】
本明細書にはまた、妊娠中の対象からの生体試料を試験して早産リスクを評価するためのキットも記載される。かかるキットは、病院、診療所、参照試験所、医院等により用いられ、医学的な判断を下すこと、及び必要であれば利用可能な治療又は介入を提供することを支援し得る。加えて、かかるキットはまた、早産に関連する他の医学的状態の診断、予後判定、又はリスク評価も可能にし得る。
【００８４】
従って一態様では、早産の可能性について妊娠中の対象を試験するためのキットが提供される。かかるキットは、第１の抗体と第２の抗体であって、第１の抗体は、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する第１のバイオマーカーに選択的に結合して第１の抗体−抗原複合体を形成する能力を有し、及び第２の抗体は、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーに選択的に結合して第２の抗体−抗原複合体を形成する能力を有する、第１の抗体と第２の抗体と；第１の抗体−抗原複合体及び第２の抗体−抗原複合体の形成をアッセイするため第１の抗体及び第２の抗体に機能上関連付けられる指標と、を含み得る。キットはさらに、利用される特定の試験アッセイに必要又は有益な任意の試薬を含み得る。
【００８５】
このキットは生体試料中のバイオマーカーを検出及び定量する任意の手段を含むことができ、キットの内容物は必然的に用いられる検出アッセイの種類に応じて異なり得る。必要な試薬に加え、キットは、第１及び第２のバイオマーカーとの結合用の抗体、固体基板、抗体−抗原複合体の検出用のさらなる抗体等を含み得る。示唆されているとおり、抗体又は抗体断片は、遊離形態で、又はプラスチック皿、試験管、試験ロッド、ビーズ等の基板に固定化されて存在し得る。キットはまた、陽性又は陰性対照の検出及び／又は標識に好適な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液など、並びに説明書も含むことができる。
【実施例】
【００８６】
以下の例は、本明細書に記載され、且つ特許請求される化合物、組成物、及び方法がどのように作製及び評価されるかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるとともに、単に例示であることが意図され、発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定するよう意図するものではない。数（例えば、量、温度等）に関しては正確を期すよう努めているが、いくらかの誤差及び偏差は考慮されなければならない。特に指示がない限り、部分数は重量部であり、温度は℃単位であるか、又は周囲温度であり、及び圧力は大気圧又はその近傍である。反応条件、例えば、構成成分の濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力及びその他の、記載されるプロセスから得られる生成物の純度及び収率を向上させるために使用することのできる反応範囲及び条件には、数多くの変形例及び組み合わせがある。かかるプロセス条件を最適化するには、妥当なルーチンの実験のみで十分である。
【００８７】
血清採取
試験には１６０人の妊婦が関与し、妊娠２４週又は２８週で血液を採取し、妊娠の最後まで追跡調査した。これらの女性のうち８０人は早産（ＰＴＢ）のエビデンスなく合併症を伴わない妊娠を経た。これを対照群とした。女性のうち８０人はＰＴＢ（妊娠３７週未満）であった。これらの女性をＰＴＢ症例群とした。これらの１６０人の女性の血清を、本明細書に記載されるプロテオミクス技法を用いて試験した。この試験に関わった各群の統計データを表７に掲載する。
【００８８】
【表７】
【００８９】
アセトニトリル沈殿
２容量のＨＰＬＣ等級アセトニトリル（４００μＬ）を２００μＬの血清に添加し、５秒間ボルテックスにかけ、室温で３０分間静置した。次に（血清コレクション）からの試料を室温でＩＥＣ Ｍｉｃｒｏｍａｘ ＲＦ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に上清のアリコートを、３００μＬのＨＰＬＣ等級の水が入った微量遠心管に移した。試料を短時間ボルテックスにかけて溶液を混合し、次にそれをＬａｂｃｏｎｃｏ ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）において約２００μＬまで凍結乾燥した。凍結乾燥前に添加するこの容量の水は、溶液からのアセトニトリルの完全な取り出しを促進する。アセトニトリルはタンパク質濃度の決定に用いられるアッセイと適合しないため、これは必須である。製造者の指示に従い実施されるＢｉｏ−Ｒａｄマイクロタイタープレートタンパク質アッセイを用いて上清タンパク質濃度を決定した。４μｇのタンパク質を含むアリコートを新しい微量遠心管に移し、ほぼ乾固するまで凍結乾燥した。ＨＰＬＣ水で試料を２０μＬとし、次に２０μＬの８８％ギ酸を使用して酸性化した。
【００９０】
セプタムを有するポリプロピレン製スナップキャップで封閉された２５０μＬ円錐ポリプロピレンバイアル（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に、アセトニトリル処理した（沈殿後の）血清試料（４０μＬ）を充填し、４℃に保たれたＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー４８ウェルプレートに入れた。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーにより、０．１％のギ酸で酸性化したＨＰＬＣ水を使用して５μＬの各血清試料を液体クロマトグラフィー保護カラムに４０μＬ／分の流量で注入した。酸性化水で保護カラムから塩及び他の不純物を洗浄により除いた。ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーはカラムに負荷する容量の３倍を引き込むため、試料が限られた容量になったとき、手作業で試料を注入する必要があった。これは、１０μＬ容量の試料を保護カラム上流の空のループに注入し、試料の代わりに１０μＬのＨＰＬＣ水試料を注入するようにＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラーをプログラムして達成した。円錐バイアルから負荷されたかのようにして保護カラムに血清試料を負荷し、脱塩した。
【００９１】
質量スペクトル分析のための液体クロマトグラフィー分離法
キャピラリー液体クロマトグラフィー（ｃＣＬ）を実施して試料を分画した。キャピラリーＬＣは、インハウスで組み立てられた１ｍｍ（１６．２μＬ）のマイクロボア保護カラム（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）と、１５ｃｍ×２５０μｍ内径のキャピラリーカラムとを使用する。保護カラムはドライパックし、キャピラリーカラムはＰＯＲＯＳ Ｒ１逆相媒体（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用してスラリーパックした。水相（９８％ＨＰＬＣ等級Ｈ２Ｏ、２％アセトニトリル、０１．％ギ酸）と有機相（２％ＨＰＬＣ Ｈ２Ｏ、９８％アセトニトリル、０．１％ギ酸）とを使用して、カラム平衡化及びクロマトグラフ分離を実施した。分離は、９５％水溶液での３分間のカラム平衡から開始し、次に２．７５％／分の勾配で６０％有機相まで増加させ、次に７％／分で９５％有機相の濃度まで増加させて達成した。勾配は９５％有機相で７分間保持して試料のうちより疎水性が高い成分を溶出させ、次に勾配を５分間で９５％水相に戻し、その濃度に２分間保持してカラムを再度平衡化した。分離は全て、５μＬ／分の流量で実施した。クロマトグラフィーでは、Ａｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により制御して、ＦＡＭＯＳ（登録商標）オートサンプラー（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）と共にＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＨＰＬＣポンプシステムを使用した。
【００９２】
ＭＳ分析
毎日試料ラン前に外部標準を使用してＭＳ校正を実施した。必要に応じて、信号対雑音比が最適化され、且つ感度が最大化されるように設定を調整した。
【００９３】
ｃＬＣシステムは質量分析器に直接連結した。キャピラリーカラムからの溶出物は、ＩｏｎＳｐｒａｙ源（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を介してＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ Ｉ 四重極直交飛行時間型質量分析器に送り込まれた。ｍ／ｚ ５００〜２５００についてのデータを収集し、これは５分で開始し、５５分で終了した。５μＬ／分の流量では、試料が保護カラムから質量分析器に至るまで５分かかり、従って５分より前には有用なデータを得ることができないため、開始時間の遅延をプログラムした。データの収集、処理及び予備的なフォーマット作成は、ＢｉｏＡｎａｌｙｓｔアドオン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して達成される。
【００９４】
５分から５５分まで各標本について全ｃＬＣ溶出期間にわたり１秒ごとの質量スペクトルを得た。全イオンクロマトグラムとして報告される、各対象についてのｃＬＣにより分画されたタンパク質除去血清の溶出プロファイルを調べ、前回実行したヒト血清と一致することを確認した。全体の存在量が正常の５０％未満若しくは正常の２００％超である標本、又は３つの幅の広いイオン強度領域の特徴系列を欠く標本は、再実行するか、又は標本が分析の再実行に不十分な場合には除外した。
【００９５】
ピークアライメント
試料は別々の日に実行にかけられ、及びカラムは溶出時間が異なり得るため、有効なクロマトグラム（有効なクロマトグラム約１５分〜３５分）の全体を通じて約２分おきに溶出する平均存在量の１０個の内因性分子種を決定した。目的の溶出領域に対して２分間のウィンドウを設定することにより、ファイルサイズを管理し易いまま維持した。各溶出時間マーカーについての所望のｍ／ｚ領域の溶出は、ＭＳコンピュータのＥｘｔｒａｃｔ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ＸＩＣ）機能を使用して可視化される。次に各標本ランについてアライメントピークの溶出時間の各々を決定し、次にＳｅｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ機能を用いることにより２分間ウィンドウの中心として使用した。これにより当該のウィンドウについて全てのランの位置が同じ中点にアライメントされる。次にＳｈｏｗ Ｓｐｅｃｔｒａ機能を使用して、全ての質量スペクトルから単一の平均質量スペクトルを作成することができる。
【００９６】
データ分析
Ｑ−Ｓｔａｒ（ｑ−ＴＯＦ）質量分析器をサポートするソフトウェアプログラムＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）により、１６件の個別の液体クロマトグラフィーランを編集し、同様の溶出時間におけるそれらのラン内の質量スペクトルを比較することが可能である。上記に説明したとおり、２０分間の期間の有効な溶出に対して１０個の２分間ウィンドウを設定し、データファイルサイズを管理し易いまま維持した。同様に上記に説明したとおり、２分間ウィンドウをアライメントした。１０個の２分間溶出間隔のうち、最初に分析すべき間隔を二番目の２分間ウィンドウとし、これは典型的にはより多くのペプチド種が存在したため選択した。ペプチドをその多価状態の特徴的な外観により同定した。この多価状態は、単一のピーク又は１質量／電荷単位だけ離れた複数のピークではなく、個々のピークが１質量／電荷単位未満しか離れていない、ガウス形状を有する十分に定義された一群のピークとして見える。ＰＴＢを起こした８人の対象群、及び対照（ＰＴＢなし）からの８人の対象群を色分けして重ね合わせた。次にデータを視覚的に調べ、１色が優位を占めるように見える分子種を記録した。使用したソフトウェアは１６個の試料のみの視覚化に制限されていた。１６より大きいサンプリングサイズについては、データセットの多重比較を行った。さらに考慮すべき化合物については、データセットの少なくとも３分の２で２つの群間に同じ外観上の違いを観測する必要があった。
【００９７】
次に、２つの試験群の間で異なるように見えた分子を個々に調べた。これらの候補種は全てペプチドであった。定量データを抽出する前に質量スペクトルを調べ、ペプチドピークが同じｍ／ｚを有し、且つ同じ荷電状態も表すことを確認し、それにより同じペプチドについて検討していることをさらに確認した。加えて、２つの群間で存在量の違いが示されなかった第２の近傍ピークを基準として選択した。このピークを使用して目的の候補ピークを正規化し、標本の処理、標本の負荷量及びイオン化効率におけるばらつきを補正した。
【００９８】
次にＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアにより分子種を「抽出」し、各個別のランにおける個々の分子種のピーク最大値を決定する。この機能は特定のｍ／ｚを２分間溶出ウィンドウに限って調べるものではなかったため、従ってｃＬＣ溶出時間のアライメントに用いられるピークをさらに用いることにより、溶出プロファイルにおける位置が同じであったことを確認し、ひいては毎回同じ分子種が選択されたことを確認してもよい。
【００９９】
各分子種についてのピーク高さを、その存在量の妥当な推定であると考えた。各候補化合物の存在量を表にし、各候補種の計算値の、近傍の基準種との比をとった。単一の種を考慮していたため、２つの群間のこのペプチドの存在量のあり得る差の評価においては一変量統計解析を用いた。
【０１００】
内因性時間アライメント分子
時間アライメントに使用される基準ピークの質量及び典型的な溶出時間を表８に要約する。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
全ての妊婦血清中に存在するこれらの内因性分子種の位置情報により、それらをキャピラリー液体クロマトグラフィー溶出プロファイル中のＰＴＢバイオマーカーのアライメント及び位置特定用の時間マーカーに使用することもまた可能となる。
【０１０３】
バイオマーカー特性
時間アライメント後、ＰＴＢ症例群及び対照群を各々色付けして複数の質量スペクトルを重ね合わせる最初のプロセスで、バイオマーカー候補を視覚的に同定した。主に１色のように見えるこれらのピークをさらに試験した。次に個々のスペクトルを、ＱｑＴＯＦ質量分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用のオペレーティングシステムであるＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたコンピュータによるピーク高さの決定に供した。次にバイオマーカーの量を表にした。加えて、症例群と対照群との間で定量的に違いがなかった、同じ時間ウィンドウ内に生じた第２のピークもまた選択した。これは非生物学的ばらつきの低減を可能にする内因性標準に相当した。これは、候補ピークの量を内因性標準の量で除算することにより達成した。各標本についての比の大きさを記録し、ＰＴＢ症例群と対照群とを比較するスチューデントｔ検定を用いて統計的有意差を求めた。
【０１０４】
第１のバイオマーカーについて、３つの種には十分な差があり（ｐ≦０．０００１）、２つの群の優れた分離を可能にし得ることが示唆される。３つのＰＴＢバイオマーカーを含む第１のバイオマーカーについての個々の質量及び溶出時間を表９に要約する。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
溶出時間（滞留時間）は内部時間標準の関数として表した。これは、バイオマーカーに先行する時間マーカーと目的のピークに後続する時間マーカーとの間の目的のピークの相対位置により決定した。これは以下の式により計算した：
Ｒｆ＝（バイオマーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）／（後続の時間マーカーの溶出時間−先行する時間マーカーの溶出時間）
【０１０７】
Ｒｆ値は、実際の溶出時間と比べて信頼性がより高かった。溶出時間は新しいカラムによって、又は既存のカラムの汚れによる性能の変化によって変わり得るが、Ｒｆがそれらの変化で変わることはなかった。第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）のＲｆ値を表１０に提供する。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
内因性共溶出標準を参照することによるばらつきの低減
現在の血清プロテオミクス手法の特徴の一つは、あらゆる種に存在した、且つ症例群と対照群との間で差がなかった内因性分子の使用である。この内部標準に対してバイオマーカー存在量を正規化することにより、非生物学的変動が低下し、リスク予測におけるバイオマーカーの利用能力が向上した。正規化は、目的のピーク存在量の基準ピークによる数学的除算を含んだ。存在量は機械導出値であった。所与の分子の存在量は、所与の質量スペクトル中における質量分析器により計測される特定の質量のイオンの数、又は全溶出間隔に相当するいくつかの質量スペクトルで観測される特定の質量のイオンの合計数を表す。分子は、典型的にはクロマトグラフィーカラムから出るまでに１．０〜１．５分を要し、一方で質量スペクトルは当該の溶出間隔の間、１秒ごとに取得される。
【０１１０】
第１のバイオマーカーについて、３つの内部基準を使用した。ピークｍ／ｚ ６７６．７（配列番号１）については、ｍ／ｚ ６７３．３の共溶出基準ピークを使用した。ピークｍ／ｚ ８５６．８（配列番号２）及びピーク８６０．０（配列番号３）については、ｍ／ｚ ８４３．８の共溶出基準ピークを選択した。これらの比を用いてｌｏｇ比の平均を計算した（表１１及び表１２）。
【０１１１】
第１のバイオマーカーのうちの３つ（すなわち配列番号１（ｍ／ｚ ６７６．７）、配列番号２（ｍ／ｚ ８５６．８）、及び配列番号３（ｍ／ｚ ８６０．０）が、症例群と対照群との間で定量的に有意差があることが分かった。表１１及び表１２は、それぞれ妊娠２４週及び２８週における症例群及び対照群のバイオマーカー存在量を掲載する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
第１のバイオマーカーを用いた早産を起こすリスクがある女性の予測
上記に説明したとおり、バイオマーカーの予測力の一般的な一尺度は、その感度及び特異度であった。表１３及び表１４に示されるとおり第１のバイオマーカーの閾値を決定し、ＰＴＢを発症するリスクがある対象を特定した。各々についての閾値は、特異度（真陰性率）が８０％以上となるように計算した。前述のとおり、これは２０％以下の偽陽性率と同じである。これらの数学的に決定された閾値を用いると、表１３及び表１４に要約するとおり、４つの比から独立して以下の感度（真陽性）及び特異度（真陰性）の比率がもたらされた。
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】
【表１４】
【０１１７】
感度は、真陽性率、又は具体的にこの場合は、バイオマーカーにより正しく特定される、後にＰＴＢを発症する妊婦の百分率として定義される統計学用語である。特異度は、真陰性率、又はこの場合は、正しく特定される、合併症を伴わない妊娠の妊婦の百分率として定義される。バイオマーカーをこのように予測に使用するには数値的閾値を設定しなければならない。そのような数値を設定するため、典型的にはバイオマーカーについての値の範囲が、最低値から最高値まで、及び各時点における陽性として正しく特定される対象の割合、及び同じ時点における陽性として誤って特定される対照の割合について考慮される。これは受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）と称される。偽陽性率は２０％に限られる。一般にはこれが臨床試験の最大耐容値と考えられる。偽陽性率（バイオマーカーにより後のＰＴＢのリスクがあるとして特定される、合併症を伴わない妊娠の女性、対照群の百分率）は、真陰性率を１００％から減じて計算される。２０％以下の偽陽性率（８０％以上の特異度に等しい）である閾値であればいずれも、ある人にリスクがあるか、それともリスクがないかについての判断に使用される閾値を決定する。４つの比の各々について、後のＰＴＢリスクがある対象を特定することが可能な閾値を決定した。各々についての閾値を、特異度（真陰性率）が８０％以上となるように計算した。前述のとおり、これは２０％以下の偽陽性率と同じである。これらの数学的に決定された閾値を用いて、表１３及び表１４に要約するとおり、４つの比から独立して以下の感度（真陽性）及び特異度（真陰性）の比率がもたらされた。後のＰＴＢを予測する６７７（配列番号１）のピークの能力がピークの組み合わせによって大幅に向上することはなかった。
【０１１８】
図１は、２４週及び２８週での試料採取後の、後に起こるＰＴＢを予測する第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）の予測能力を実証するＲＯＣ曲線を示す。来院ごとの各マーカーについての曲線下面積及び９５％信頼区間もまた含まれる。
【０１１９】
第１のバイオマーカーのアイデンティティ
２つの質量分析器間に衝突セルを含むタンデムＭＳを用いて親ペプチドのフラグメンテーションを生じさせ、第２のＭＳステップで観測されるフラグメンテーションパターンから検索可能なデータベース（ＭＡＳＣＯＴ）と比較してアミノ配列を決定した。ペプチドのうちの３つは同じ親タンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖４（ＩＴＩＨ４）に由来し、一方、最終的なペプチドは第２のタンパク質のインターαトリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質（ＩＨＲＰ）から得られた。表１５は第１のバイオマーカーのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１〜３）を提供する。
【０１２０】
【表１５】
【０１２１】
これらのペプチドは、インターαトリプシンインヒビターと称されるタンパク質スーパーファミリーから生じるように思われる。より具体的には、ペプチドは、現在インターαトリプシンインヒビター重鎖４のアイソフォームと考えられている２つの異なるタンパク質、すなわちアイソフォーム１（ＩＴＩＨ４−１）及びアイソフォーム２（ＩＴＩＨ４−２）に由来するように思われる。２つのアイソフォームはいくらかの配列相同性を有するが、他方には認められないアミノ酸部分も有する。２つのアイソフォームは、単に他方を切断したものではない。
【０１２２】
「第２のバイオマーカー」の分析
コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む６つのさらなるバイオマーカー（「第２のバイオマーカー」と定義される）、又はそれらの組み合わせを、第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３又はそれらの任意の組み合わせ）の組み合わせと共に分析した。
【０１２３】
配列番号１〜３を含む第１のバイオマーカーについて、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型を含む第２のバイオマーカーと組み合わせてロジスティック回帰分析を実施した。受信者動作特性曲線を用いた分類性能には第１のバイオマーカー（すなわち配列番号１〜３）を用いた。全ての統計的検定について、名目両側ｐ値は、ｐ値＜０．０５として定義される統計的有意性で報告した。これらの分析にはＳＡＳ バージョン８．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用した。
【０１２４】
第２のバイオマーカーの相対存在量
症例群と対照群との間で存在量に有意差がある第２のバイオマーカー（すなわち、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型）を表１６に掲載する。上記に説明される方法により第２のバイオマーカーの存在量を決定した。
【０１２５】
【表１６】
【０１２６】
第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせを使用した、早産を起こすリスクがある女性の予測
直前に考察したとおり、第１のバイオマーカーは、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、腫瘍壊死因子α受容体１型（ＴＮＦａｒ）、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、フェリチン（ＦＥＲ）及びラクトフェリチン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ）（ＬＡＣＴＯ）を含む５つのさらなるタンパク質（すなわち、第２のバイオマーカー）と組み合わせることで、８９．８％の感度及び８１．０％の特異度を有するバイオマーカーのパネルを提供することができる。ロジスティック回帰モデルを用いて、種々のマーカーのこれらの様々な組み合わせを検討した。モデルから、患者についての予測確率が示された。従って、マーカーの組み合わせのカットオフ値は予測確率に基づく。各分析では、≧８０％の特異度をもたらす確率を使用した。
【０１２７】
どの種が２つの臨床群間のより良い判別をもたらしたかを決定するため、第１のバイオマーカー（すなわち、ｍ／ｚ ６７７（配列番号１）、８５７（配列番号２）、８６０（配列番号３））＋第２のバイオマーカー（すなわち、５つのタンパク質バイオマーカーのうちの４つ）を組み合わせて試験して、５つのさらなるタンパク質バイオマーカーの各々を除いた効果、従って、完全なパネル（８つのバイオマーカー）から以下を除いたものの効果を確認し、以下の感度及び特異度が得られた。
【０１２８】
【表１７】
【０１２９】
これらのデータは、群間の最良のさらなる判別をもたらす２つのタンパク質がＴＮＦａｒ及びＣＲＦであることを示唆している。
【０１３０】
完全パネル及び１つのタンパク質を除いた他の組み合わせは、妥当な感度及び特異度（８０％／８０％）のバイオマーカーの組み合わせを提供するが、商業的にはより少ないバイオマーカーの使用が望ましいこともある。この目的から、以下のより少数の組み合わせを評価し、結果は以下のとおりであった。
【０１３１】
【表１８】
【０１３２】
図２は、２８週の試料採取後の、後に起こるＰＴＢを予測する以下のとおりの９つの予測因子：配列番号１、配列番号２、配列番号３、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型の組み合わせを含んだ第１及び第２のバイオマーカーの予測能力を実証するＲＯＣを作成したことを示す。曲線下面積及び９５％信頼区間もまた報告する。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡアッセイＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。目的のペプチド（抗原）に対して免疫学的特異性を有する第１の抗体を９６ウェルマイクロタイタープレートの表面上に吸着させる。既知の段階的濃度の目的とするペプチドの２５マイクロリットルの血清又は標準を個々にウェルに添加する。血清を第１の抗体と３０分間インキュベートする。ウェル表面にコーティングされた第１の抗体が抗原を結合して固定化する。同様にその抗原に対して免疫学的特異性を有する第２の抗体を含む２００マイクロリットルの第２の溶液を各ウェルに添加する。第２の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又は化学発光前駆体などのマーカーで標識されている。ウェルを３０分間インキュベートして第２の抗体を抗原−第１の抗体複合体と結合させることで、それ自体がウェル表面に結合している抗体−抗原−抗体「サンドイッチ」が形成される。次にウェルを慎重且つ完全に洗浄し、結合していない第２の抗体を全て取り除く。次に、第２の抗体標識に特異的な基質を含む溶液を添加する。西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、結合した第２の抗体の量に対応してウェル内で色の変化が起こる。化学発光マーカーの場合、基質は非化学発光分子種から光を放つ化学発光生成物に変換される。この生成物から放たれる光はウェル内に存在する抗原の量に比例し、特定の波長で放たれる光を計測してその強度を記録する特殊な分光計「プレートリーダー」により計測される。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡアッセイＩＩ
以下のＥＬＩＳＡアッセイは、生体試料中の目的とするバイオマーカーの検出及び定量に利用することができる。このアッセイはＥＬＩＳＡアッセイＩと同様であり、但し第２の抗体はビオチン分子で標識される。抗体−抗原−抗体の形成後にウェルを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合するストレプトアビジンを含む溶液をウェルに添加してビオチン分子と反応させる。この特定のアッセイでは、未着色の基質が着色された生成物に変換される。その特定の波長の吸光度として計測される色の強度が、ウェル内に存在する抗原の量に比例する。その吸光度を、既知の段階的濃度の抗原の一連の校正用標準の吸光度対濃度のプロットと比較することにより、未知試料の濃度を推定することができる。
【０１３５】
上述の組成物及び適用形態は、本発明の好ましい実施形態の例示に過ぎないことが理解されるべきである。当業者は本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく数多くの変形例及び代替的な構成を考案することができ、添付の特許請求の範囲がかかる変形例及び構成を網羅することが意図される。従って、本発明は上記において、現時点で本発明の最も実用的で好ましい実施形態であると見なされるものに関連して特殊性及び詳細を伴い説明されたが、当業者には、限定はされないがサイズ、材料、形状、形態、機能及び動作方法、組立て及び使用が異なるものを含め、数多くの変形例を、本明細書に示される原理及び概念から逸脱することなく実施し得ることは明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
（ａ）前記対象からの生体試料中に存在する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせを検出するステップであって、前記第１のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
（ｂ）前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を計測するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を、早産を起こさなかった対象から得られた対照生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
早産リスクの増加を特定するステップが、対照生体試料中の前記少なくとも１つのペプチドの対照濃度と比べて前記生体試料中の前記少なくとも１つのペプチドの存在量が有意に低いことを決定するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を、前記対象からの前記生体試料中の基準分子の対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、又は配列番号３を有する少なくとも２つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、又は配列番号３を有する少なくとも３つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも３つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも４つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のバイオマーカーが配列番号１である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出ステップ（ａ）がプロテオミクス技法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出ステップ（ａ）が、（１）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記生体試料を抗体と接触させるステップであって、前記抗体が、前記第１のバイオマーカー又は前記第２のバイオマーカーのいずれかに対して免疫学的特異性を有する、ステップと；（２）前記抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中の前記第１又は前記第２のバイオマーカーを検出するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が担体分子にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が固体支持体にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体−抗原複合体の形成後、前記固体支持体上の前記抗体に結合していない前記生体試料の任意の成分が除去される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が血清である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が血液である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
（ａ）前記対象から生体試料を採取するステップと、
（ｂ）前記生体試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させるステップであって、前記試料を前記第１の抗体と前記第２の抗体とに接触させると、前記第１の抗体が第１のバイオマーカーに結合して第１の抗体−抗原複合体を形成し、及び前記第２の抗体が第２のバイオマーカーに結合して第２の抗体−抗原複合体を形成し；前記第１のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
（ｃ）前記第１の抗体−抗原複合体及び前記第２の抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中のその前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するステップと、
（ｄ）前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を、早産を起こさなかった対象における同じバイオマーカーの量と比較するステップであって、それにより前記早産リスクを評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記第１の抗体及び前記第２の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
妊娠中の対象における早産リスクを評価するためのキットであって、
（ａ）少なくとも第１の抗体及び第２の抗体であって、前記第１の抗体が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を含むアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに選択的に結合して第１の抗体−抗原複合体を形成する能力を有し、及び前記第２の抗体が、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーに選択的に結合して第２の抗体−抗原複合体を形成する能力を有する、第１の抗体及び第２の抗体と、
（ｂ）前記第１の抗体−抗原複合体及び前記第２の抗体−抗原複合体の形成をアッセイするため前記第１の抗体及び前記第２の抗体と機能上関連付けられる指標と、
を含む、キット。
【請求項２５】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するように構成される指標をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記第１の抗体及び前記第２の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項１】
妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
（ａ）前記対象からの生体試料中に存在する第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとの組み合わせを検出するステップであって、前記第１のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
（ｂ）前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）が、前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を計測するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を、早産を起こさなかった対象から得られた対照生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
早産リスクの増加を特定するステップが、対照生体試料中の前記少なくとも１つのペプチドの対照濃度と比べて前記生体試料中の前記少なくとも１つのペプチドの存在量が有意に低いことを決定するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの存在量を、前記対象からの前記生体試料中の基準分子の対照濃度と比較するステップであって、それにより早産リスクの増加を特定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、又は配列番号３を有する少なくとも２つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のバイオマーカーが、アミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、又は配列番号３を有する少なくとも３つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも２つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも３つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型からなる群から選択される少なくとも４つのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、及び腫瘍壊死因子α受容体１型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のバイオマーカーが配列番号１である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出ステップ（ａ）がプロテオミクス技法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出ステップ（ａ）が、（１）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記生体試料を抗体と接触させるステップであって、前記抗体が、前記第１のバイオマーカー又は前記第２のバイオマーカーのいずれかに対して免疫学的特異性を有する、ステップと；（２）前記抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中の前記第１又は前記第２のバイオマーカーを検出するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が担体分子にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が固体支持体にカップリングされる、又はそれとコンジュゲート化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体−抗原複合体の形成後、前記固体支持体上の前記抗体に結合していない前記生体試料の任意の成分が除去される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が、血清、血漿、血液、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、子宮頸膣液、洗浄液、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が血清である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体試料が血液である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
妊娠中の対象における早産リスクの評価方法であって、
（ａ）前記対象から生体試料を採取するステップと、
（ｂ）前記生体試料を第１の抗体と第２の抗体とに接触させるステップであって、前記試料を前記第１の抗体と前記第２の抗体とに接触させると、前記第１の抗体が第１のバイオマーカーに結合して第１の抗体−抗原複合体を形成し、及び前記第２の抗体が第２のバイオマーカーに結合して第２の抗体−抗原複合体を形成し；前記第１のバイオマーカーがアミノ酸配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、又はそれらの任意の組み合わせを含み、及び前記第２のバイオマーカーが、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含むタンパク質である、ステップと、
（ｃ）前記第１の抗体−抗原複合体及び前記第２の抗体−抗原複合体の形成についてアッセイするステップであって、それにより前記生体試料中のその前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するステップと、
（ｄ）前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を、早産を起こさなかった対象における同じバイオマーカーの量と比較するステップであって、それにより前記早産リスクを評価するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記第１の抗体及び前記第２の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
妊娠中の対象における早産リスクを評価するためのキットであって、
（ａ）少なくとも第１の抗体及び第２の抗体であって、前記第１の抗体が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を含むアミノ酸配列を有する第１のバイオマーカーに選択的に結合して第１の抗体−抗原複合体を形成する能力を有し、及び前記第２の抗体が、コルチコトロピン放出因子、デフェンシン、フェリチン、ラクトフェリン、トロンビン−抗トロンビン複合体、腫瘍壊死因子α受容体１型、又はそれらの任意の組み合わせを含む第２のバイオマーカーに選択的に結合して第２の抗体−抗原複合体を形成する能力を有する、第１の抗体及び第２の抗体と、
（ｂ）前記第１の抗体−抗原複合体及び前記第２の抗体−抗原複合体の形成をアッセイするため前記第１の抗体及び前記第２の抗体と機能上関連付けられる指標と、
を含む、キット。
【請求項２５】
前記生体試料中の前記第１のバイオマーカー及び前記第２のバイオマーカーの量を定量するように構成される指標をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記第１の抗体及び前記第２の抗体が独立してモノクローナル抗体を含む、請求項２４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０２５８４（Ｐ２０１３−５０２５８４Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５６８０（Ｐ２０１２−５２５６８０）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４５９５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２５２６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０６０５１４２９）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (25)
【出願人】（５９２０８７６４７）ブリガム・ヤング・ユニバーシティ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＧＨＡＭ ＹＯＵＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５１２０４１４６９）アイエイチシー ヘルス サービシーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４５９５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２２５２６
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０６０５１４２９）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション (25)
【出願人】（５９２０８７６４７）ブリガム・ヤング・ユニバーシティ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＧＨＡＭ ＹＯＵＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５１２０４１４６９）アイエイチシー ヘルス サービシーズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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