更年期障害改善剤及び栄養補助食品
【課題】鱈、ニシン、鮭等の腹子外皮である卵巣外皮を酵素分解して、更年期障害の改善や健康維持に貢献する更年期障害改善剤及び栄養補助食品を提供する。
【解決手段】鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とする更年期障害改善剤である。さらに、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む更年期障害改善剤及び栄養補助食品である。または、鮭の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる更年期障害改善剤及び栄養補助食品である。
【解決手段】鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とする更年期障害改善剤である。さらに、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む更年期障害改善剤及び栄養補助食品である。または、鮭の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる更年期障害改善剤及び栄養補助食品である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して成る成分を含む更年期障害改善剤及び栄養補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
水産加工食品のうち、魚卵の水産加工により発生する魚卵外皮である卵巣外皮は、ほとんどが産業廃棄物として処分されていたが、近年、特許文献１，２に開示されているように、医薬品や化粧品、栄養補助食品として利用されている。
【０００３】
特許文献１には、魚類の卵巣外皮（魚卵外皮）を予めオゾン水で処理した後、その構成蛋白質である筋原線維蛋白質を酵素分解して、アミノ酸及びペプチドを抽出する方法が開示されている。このアミノ酸及びペプチドは、特に必須アミノ酸が多く含まれていることから、機能性栄養補助食品等として極めて有用である。また、ペプチドを多く含有するアミノ酸成分にはＡＣＥ阻害活性を備え、血圧上昇抑制剤（降圧剤）として作用するとされている。
【０００４】
また特許文献２には、鮭の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して抽出した成分を含む肌荒れ改良剤が開示されている。
【特許文献１】特許３６９１４９７号公報
【特許文献２】特許３８９９１１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この魚類の卵巣外皮を酵素分解したアミノ酸及びペプチドは、農薬やＰＣＢ、重金属等の有害物質を含まず、安全性が高い。しかも、未だその機能は充分に解明されてはいないものであり、有効な利用方法が求められている。
【０００６】
本発明の目的は、上記背景技術に鑑みて成されたもので、鱈、ニシン、鮭等の腹子外皮である卵巣外皮を酵素分解して、更年期障害の改善や健康維持に有効な更年期障害改善剤及び栄養補助食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とする更年期障害改善剤である。
【０００８】
またこの発明は、鮭等の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む更年期障害改善剤である。
【０００９】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる更年期障害改善剤である。さらに、前記主成分に、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させるものでも良い。
【００１０】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む栄養補助食品である。
【００１１】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含む栄養補助食品である。前記栄養補助食品は、例えば清涼飲料である。
【発明の効果】
【００１２】
この発明の更年期障害改善剤は、有害物質を含まず、副作用がなく、安定的に作用するもので、長期間の服用が可能な薬剤である。
【００１３】
またこの発明の栄養補助食品は、従来廃棄されていた部分を有効に活用するもので、有害物質を含まず、副作用がなく安定的に摂取可能な食品である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態の更年期障害改善剤及び栄養補助食品について説明する。始めに、更年期障害改善剤及び栄養補助食品に用いられる成分の、魚卵外皮の酵素分解によるアミノ酸及びペプチド（以下、アミノ酸成分と称す。）の製造方法の一例について説明する。
【００１５】
先ず、魚卵外皮である卵巣外皮を冷水で洗浄した後、室温以下のオゾン水で処理する。これにより、付着細菌の除菌及び脱脂肪等が行なわれ、さらに構成蛋白である筋原線維蛋白の収縮蛋白質（ミオシン）の変成が防止される。オゾン水処理は、洗浄、脱水した卵巣外皮を冷水を入れたタンク中で撹拌しながら、オゾン発生装置からオゾン濃度０．２〜１０ｐｐｍ／Ｌで供給し、５〜３０分間室温以下で処理する。卵巣外皮が分散状態で存在しているオゾン処理液は、溶存しているオゾンを消失させるために、撹拌しながら酵素反応温度、３５〜５０℃付近まで加温する。
【００１６】
オゾンが消失した後、バチルス属（Bacillus subtilis）の産生する蛋白分解酵素により収縮蛋白質（ミオシン）を分解する。次に、この分解液をそのまま、或いは分解液中の酵素を８０℃以上に加温し、１５分以上撹拌して、酵素を失活させた後、絲状菌（Aspergillus oryzae）の産生する蛋白分解酵素を用いて、さらに低分子化と他種類の魚卵蛋白に由来する苦味やアミノ酸臭等の分解処理を行なう。この両酵素による処理は、卵巣外皮に対し０．０２〜０．２質量％の酵素を用いて、撹拌の下、処理温度３５〜５５℃、処理時間２〜５時間、いずれもほぼ同じ条件で行なわれる。
【００１７】
酵素処理を終えた処理液は、酵素を失活させた後、８００メッシュの濾布を用いた遠心分離により固形物を除去し、さらに限外濾過法によりコロイド状不純物を除去する。得られたアミノ酸成分を含む濾液は、使用目的により、そのままの状態であるいは、適度の濃度に濃縮して、液状で利用することができる。
【００１８】
アミノ酸成分を粉末として得る場合は、濾液を常圧乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥法などにより水分を速やかに除去する。乾燥方法としては、成分の分解を極力回避するため、減圧乾燥法あるいは噴霧乾燥法が適している。また、乾燥温度についても、１３０℃以下で行うことが望ましく、この温度を超えると有効成分の分解が始まり、品質の低下を招く。従って、好ましくは、乾燥温度は７０〜１３０℃である。
【００１９】
得られたアミノ酸成分からなる粉末は、各種のアミノ酸及びそれらのペプチドが含まれる。蛋白分解酵素、特にバチルス属（Bacillus subtilis）の産生する蛋白分解酵素の使用量が少ない場合（０．０５質量％以下）、ペプチドが多く含まれたアミノ酸成分が得られる。
【００２０】
このようにして得られたアミノ酸成分は、後述する実施例に示すように定期的な摂取により、更年期障害改善剤として機能する。即ち、例えば、鮭の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分は、更年期障害による様々な不快感や体の機能の低下を抑える薬剤として用いることができる。さらに、このアミノ酸成分に、イソフラボンと、高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を加えたものは、より効果的に更年期障害を抑制する。
【００２１】
また、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分と、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む材料は、栄養補助食品として継続的に摂取することにより、更年期障害からくる不快感等を抑える働きをする。
【００２２】
さらに、鮭等の魚の卵巣外皮を処理したアミノ酸成分と、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含む材料は、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる機能を有する。従って、これを定期的に摂取することにより、後述する実施例に示すように、更年期障害の一つである、肌の乾燥や弾力性の欠如を回復させ、肌の健康を維持することができる。
【００２３】
また、摂取しやすい形態として、このアミノ酸成分を、ブドウ糖等を加えた水に溶解し、さらに各種ビタミンを加えたドリンク剤または清涼飲料とすると良い。これにより、より簡易に栄養補助食品として継続的に摂取することができる。
【００２４】
この更年期障害改善剤及び栄養補助食品は、魚の卵巣外皮抽出成分を、例えばドリンクや顆粒・錠剤等の形に製剤したものであり、さらには、栄養補助食品等の食品として摂取することにより、更年期障害による皮膚の諸症状を緩和し、その他ののぼせ等の不快感も改善することができる。
【実施例１】
【００２５】
次に、本発明の実施例と比較例とを比較して示す。先ず、鮭の卵巣外皮由来ペプチドを用いて、女性の更年期障害に対する改善効果を検証した。試験方法は、３５歳以上の女性１５名を対象に、一般的な更年期障害の改善効果に関する１ヶ月のモニター試験を実施した。
【００２６】
実施内容は、３種類の処方ドリンク(50ml／本)を調整した。処方を表１に示す。
【表１】
【００２７】
被験者を無作為に３群に分け、指定の処方ドリンクＡ，Ｂ，Ｃの別に各群３０日間飲み続けてもらった。更年期障害の改善効果は、アンケートによるクッパーマン指数を用いて開始時と終了時の変化によって評価した。その変化の結果を各群毎に以下の表に示す。
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
この実施例の実験により、更年期障害による種々の体調不良が、この発明の実施例である鮭等の魚の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分と、イソフラボン及び高麗人参を含有させることにより、より更年期障害抑制効果が大きいことが分かった。また、鮭等の魚の卵巣外皮由来のアミノ酸成分、イソフラボン及び高麗人参にも、更年期障害による不快感を緩和する効果があることが分かった。
【実施例２】
【００３０】
次に、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、鮭の卵巣外皮由来ペプチドと、コラーゲン及びヒアルロン酸を被験品とするコラーゲン産生能に関する細胞試験を実施した。また、被験品の同細胞に対する細胞増殖性への影響についても併せて検討を行なった。
【００３１】
線維芽細胞は、真皮のコラーゲン線維（膠原線維）、弾性線維（エラスチン）の主成分であるコラーゲンをつくるものであり、線維芽細胞は真皮の中に存在し、少しずつコラーゲンをつくる一方で、少しずつコラーゲンを分解する。
【００３２】
線維芽細胞によるコラーゲン線維の合成と分解はコントロールされていて、合成と分解のバランスがとれているが、分解が合成を上回ればシワ、たるみ、肌老化が進行し、逆に合成が分解を上回れば、シワ、たるみ、肌老化の進行を抑える。正常な大人の場合、合成量と分解量は同じで、コラーゲンの総量は変わらずただ入れ替わりだけがおこるが、活性酸素等により線維芽細胞がダメージを受けると、コラーゲン繊維の合成と分解のバランス崩れて、皮膚の老化につながるものである。
【００３３】
実験方法
細胞：正常ヒト皮膚線維芽細胞（以下、NB1RGBと称す。 理研Cell Bank）
細胞ストレイン番号−RCB0222
培地：10%牛胎仔血清含有イーグルMEM培地
基礎培地イーグルMEMに牛胎仔血清を10%になるように添加。
【００３４】
試薬
細胞評価：コラーゲンステインキット（コスモバイオ社）
陽性対象：アスコルビン酸（以下、APMgと称す。）（和光純薬工業）
細胞評価：MTT（同仁化学）
【００３５】
被験品
被験品１：鮭の卵巣外皮由来ペプチド（以下、Sample A）
被験品２：コラーゲン＋ヒアルロン酸（コラーゲン：ヒアルロン酸＝９０：１０、質量比）（以下、Sample B）
被験品３：鮭の卵巣外皮由来ペプチド＋コラーゲン＋ヒアルロン酸（卵巣外皮由来ペプチド：コラーゲン：ヒアルロン酸＝５０：４５：５、質量比）（以下、Sample C）
Sample
A〜Sample Cについては、10%牛胎仔血清含有イーグルMEM培地にて以下のように溶解した。
Sample
A〜Sample C（0.5%、1%、2%）３段階
NB1RGBの培養
NB1RGBを96穴マイクロタイタープレートに2.0×104 cell/wellになるように播種（100μl）して24hr前培養したのち、基本培地または各濃度に調製した被験品（Sample A〜Sample C）を100μl添加して、CO2インキュベーター（37℃，5%CO2）内で48hr培養した。
【００３６】
コラーゲン産生能評価
基本培養後、培地成分を除去するためPBS(-)を用いて各ウェルを100μlで2回洗浄し、キット染色液（シリウスレッド＋ファーストグリーン含有）を50μl 添加後、室温（23℃±1℃）・暗所にて30min静置させた。
【００３７】
各ウェルをPBS(-)を用いて着色が目視出来なくなるまで洗浄し，100 μlのキット抽出液（含メタノール）にて室温で1min抽出した。これをマイクロプレートリーダーにより570 - 595nm の吸光度を測定し、得られた吸光度はNB1RGBの細胞内コラーゲン量としてコラーゲン生成能の指標とした。被験品の陽性対象としてはAPMgを用い、最終濃度が50μMになるように100μl添加して同様に培養した。
【００３８】
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響については、MTT還元法で確認した。
基本培養後、0.5% MTT水溶液を各ウェルに20 μl 添加して37℃で2hrインキュベーションを行った。インキュベーション後の培地成分を除去するために，各ウェルをHEPES緩衝液でそれぞれ100μlずつ2回洗浄した後，100 μlの0.04M 塩酸含有イソプロパノール溶液を分注してさらに1hrインキュベーションを行い，生成したフォルマザンを抽出した。これをマイクロプレートリーダーにより570 - 655 nm の吸光度を測定し、その値を細胞増殖性の指標とした。
【００３９】
コラーゲン産生能評価
NB1RGBのコラーゲン合成能、に与えるSample A〜Sample Cの影響についてそれぞれ図１から図３に示す。Sample Aについては、図１の斜線を付したグラフに示すように、各濃度（0.5〜2%）ともに陽性対照であるAPMgと比べるとコラーゲン量は低かったものの、未処理（non treatment）と比較するとコラーゲン量は高かった。
【００４０】
Sample Bにおいては、図２の斜線を付したグラフに示すように、0.5%でAPMgとほぼ同等、1%および2%でAPMgよりもコラーゲン量が高かった。
【００４１】
Sample A及びSample Bの混合品であるSample Cでは、図３の斜線を付したグラフに示すように、全ての濃度（0.5〜2%）で未処理及びAPMgよりもコラーゲン量は高かった。
【００４２】
また、コラーゲン以外の蛋白（non collagen）は、図１〜図３の白地のグラフに示すように、Sample A〜Sample Cの各濃度においても未処理（non
treatment）と同様であった。
【００４３】
この結果から、Sample A〜Sample Cの全てにおいてNB1RGBの蛋白産生能においてコラーゲン特異的に産生能向上効果が見られた。また、Samle Cにおいて最もコラーゲン量が高かったことから、サーモンオバリーペプチド（SOP）とコラーゲン＋ヒアルロン酸はそれぞれでもコラーゲン産生能向上効果が見られているが、併用する事によって相乗効果が期待出来ることがわかった。
【００４４】
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響
Sample
A〜Sample CのNB1RGBに対する細胞増殖性への影響について図４〜図６に示す。図示するように、Sample A〜Sample Cの全ての濃度において、未処理（non treatment）とほぼ同様であったことから、本被験品の細胞毒性は見られず安全性が確認された。
【００４５】
この試験により、鮭卵巣外皮由来のアミノ酸成分、及びコラーゲン＋ヒアルロン酸のそれぞれで正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン特異的な産生能向上効果が見られ、かつそれらの混合品においては相乗効果が確認された。また、被験品の同細胞に対する細胞増殖性への影響についても毒性は見られず安全性が確認された。
【実施例３】
【００４６】
この実施例では、表４に示す処方の鮭の卵巣外皮由来ペプチドを用いた栄養補助食品であるドリンクについて、女性の更年期障害に対する改善効果を検証した。対象者は、更年期症状があるが治療を受けるほどではない、という女性１７名に４週間、８名（うちプラセボ４名）に６週間（２週間延長）に亘り、表４に示す処方の飲料500mgを毎朝服用させた。
【００４７】
試飲前・１週間後・４週間後・（１週間中断ののち）５週間後・６週間後において、肌状態の変化を測定した。また試飲前・４週間後・（１週間中断ののち）５週間後・６週間後に採血を実施し、生化学的手法を用いて体内の変化を調査した。また、更年期指数や肌状態変化をアンケート回答というかたちで調査した。
【００４８】
【表４】
【００４９】
結果、肌に関しては「かさつき」「くすみ」「なめらかさ」「化粧のり」「化粧もち」「シミの改善」「毛穴ひきしめ」という項目における有効性が示唆された。多くが1週間以内に肌状態の改善を自覚しており、また一時中断した時点でほぼ全員において状態が一時悪化したが、飲用を再開した群は再び改善した。一方、プラセボ群は悪化したままという結果が得られた。よって、この実施例の処方による飲料の肌改善効果が確認された。
【００５０】
血液検査の結果では、ビタミン群等の変化に一定の規則性は発見できなかったが、女性ホルモンのバランスを調整している可能性が示唆された。また、中性脂肪値も改善するモニターが多かったことから、脂質代謝の改善に寄与する可能性も示唆された。自覚変化としては、「疲労回復」「睡眠の質改善」「寝つき改善」「イライラ解消」に対し、多くのモニターが1週間以内の改善を訴えまた。更年期指数変化を追っても、１週間ごとに全員の指数が改善しており、更年期女性への症状緩和の効果もみられた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品１であるサンプルＡの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図２】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品２であるサンプルＢの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図３】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品３であるサンプルＣの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図４】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＡの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【図５】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＢの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【図６】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＣの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して成る成分を含む更年期障害改善剤及び栄養補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
水産加工食品のうち、魚卵の水産加工により発生する魚卵外皮である卵巣外皮は、ほとんどが産業廃棄物として処分されていたが、近年、特許文献１，２に開示されているように、医薬品や化粧品、栄養補助食品として利用されている。
【０００３】
特許文献１には、魚類の卵巣外皮（魚卵外皮）を予めオゾン水で処理した後、その構成蛋白質である筋原線維蛋白質を酵素分解して、アミノ酸及びペプチドを抽出する方法が開示されている。このアミノ酸及びペプチドは、特に必須アミノ酸が多く含まれていることから、機能性栄養補助食品等として極めて有用である。また、ペプチドを多く含有するアミノ酸成分にはＡＣＥ阻害活性を備え、血圧上昇抑制剤（降圧剤）として作用するとされている。
【０００４】
また特許文献２には、鮭の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して抽出した成分を含む肌荒れ改良剤が開示されている。
【特許文献１】特許３６９１４９７号公報
【特許文献２】特許３８９９１１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この魚類の卵巣外皮を酵素分解したアミノ酸及びペプチドは、農薬やＰＣＢ、重金属等の有害物質を含まず、安全性が高い。しかも、未だその機能は充分に解明されてはいないものであり、有効な利用方法が求められている。
【０００６】
本発明の目的は、上記背景技術に鑑みて成されたもので、鱈、ニシン、鮭等の腹子外皮である卵巣外皮を酵素分解して、更年期障害の改善や健康維持に有効な更年期障害改善剤及び栄養補助食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とする更年期障害改善剤である。
【０００８】
またこの発明は、鮭等の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む更年期障害改善剤である。
【０００９】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる更年期障害改善剤である。さらに、前記主成分に、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させるものでも良い。
【００１０】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む栄養補助食品である。
【００１１】
またこの発明は、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含む栄養補助食品である。前記栄養補助食品は、例えば清涼飲料である。
【発明の効果】
【００１２】
この発明の更年期障害改善剤は、有害物質を含まず、副作用がなく、安定的に作用するもので、長期間の服用が可能な薬剤である。
【００１３】
またこの発明の栄養補助食品は、従来廃棄されていた部分を有効に活用するもので、有害物質を含まず、副作用がなく安定的に摂取可能な食品である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態の更年期障害改善剤及び栄養補助食品について説明する。始めに、更年期障害改善剤及び栄養補助食品に用いられる成分の、魚卵外皮の酵素分解によるアミノ酸及びペプチド（以下、アミノ酸成分と称す。）の製造方法の一例について説明する。
【００１５】
先ず、魚卵外皮である卵巣外皮を冷水で洗浄した後、室温以下のオゾン水で処理する。これにより、付着細菌の除菌及び脱脂肪等が行なわれ、さらに構成蛋白である筋原線維蛋白の収縮蛋白質（ミオシン）の変成が防止される。オゾン水処理は、洗浄、脱水した卵巣外皮を冷水を入れたタンク中で撹拌しながら、オゾン発生装置からオゾン濃度０．２〜１０ｐｐｍ／Ｌで供給し、５〜３０分間室温以下で処理する。卵巣外皮が分散状態で存在しているオゾン処理液は、溶存しているオゾンを消失させるために、撹拌しながら酵素反応温度、３５〜５０℃付近まで加温する。
【００１６】
オゾンが消失した後、バチルス属（Bacillus subtilis）の産生する蛋白分解酵素により収縮蛋白質（ミオシン）を分解する。次に、この分解液をそのまま、或いは分解液中の酵素を８０℃以上に加温し、１５分以上撹拌して、酵素を失活させた後、絲状菌（Aspergillus oryzae）の産生する蛋白分解酵素を用いて、さらに低分子化と他種類の魚卵蛋白に由来する苦味やアミノ酸臭等の分解処理を行なう。この両酵素による処理は、卵巣外皮に対し０．０２〜０．２質量％の酵素を用いて、撹拌の下、処理温度３５〜５５℃、処理時間２〜５時間、いずれもほぼ同じ条件で行なわれる。
【００１７】
酵素処理を終えた処理液は、酵素を失活させた後、８００メッシュの濾布を用いた遠心分離により固形物を除去し、さらに限外濾過法によりコロイド状不純物を除去する。得られたアミノ酸成分を含む濾液は、使用目的により、そのままの状態であるいは、適度の濃度に濃縮して、液状で利用することができる。
【００１８】
アミノ酸成分を粉末として得る場合は、濾液を常圧乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥法などにより水分を速やかに除去する。乾燥方法としては、成分の分解を極力回避するため、減圧乾燥法あるいは噴霧乾燥法が適している。また、乾燥温度についても、１３０℃以下で行うことが望ましく、この温度を超えると有効成分の分解が始まり、品質の低下を招く。従って、好ましくは、乾燥温度は７０〜１３０℃である。
【００１９】
得られたアミノ酸成分からなる粉末は、各種のアミノ酸及びそれらのペプチドが含まれる。蛋白分解酵素、特にバチルス属（Bacillus subtilis）の産生する蛋白分解酵素の使用量が少ない場合（０．０５質量％以下）、ペプチドが多く含まれたアミノ酸成分が得られる。
【００２０】
このようにして得られたアミノ酸成分は、後述する実施例に示すように定期的な摂取により、更年期障害改善剤として機能する。即ち、例えば、鮭の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分は、更年期障害による様々な不快感や体の機能の低下を抑える薬剤として用いることができる。さらに、このアミノ酸成分に、イソフラボンと、高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を加えたものは、より効果的に更年期障害を抑制する。
【００２１】
また、鮭等の魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分と、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含む材料は、栄養補助食品として継続的に摂取することにより、更年期障害からくる不快感等を抑える働きをする。
【００２２】
さらに、鮭等の魚の卵巣外皮を処理したアミノ酸成分と、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含む材料は、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させる機能を有する。従って、これを定期的に摂取することにより、後述する実施例に示すように、更年期障害の一つである、肌の乾燥や弾力性の欠如を回復させ、肌の健康を維持することができる。
【００２３】
また、摂取しやすい形態として、このアミノ酸成分を、ブドウ糖等を加えた水に溶解し、さらに各種ビタミンを加えたドリンク剤または清涼飲料とすると良い。これにより、より簡易に栄養補助食品として継続的に摂取することができる。
【００２４】
この更年期障害改善剤及び栄養補助食品は、魚の卵巣外皮抽出成分を、例えばドリンクや顆粒・錠剤等の形に製剤したものであり、さらには、栄養補助食品等の食品として摂取することにより、更年期障害による皮膚の諸症状を緩和し、その他ののぼせ等の不快感も改善することができる。
【実施例１】
【００２５】
次に、本発明の実施例と比較例とを比較して示す。先ず、鮭の卵巣外皮由来ペプチドを用いて、女性の更年期障害に対する改善効果を検証した。試験方法は、３５歳以上の女性１５名を対象に、一般的な更年期障害の改善効果に関する１ヶ月のモニター試験を実施した。
【００２６】
実施内容は、３種類の処方ドリンク(50ml／本)を調整した。処方を表１に示す。
【表１】
【００２７】
被験者を無作為に３群に分け、指定の処方ドリンクＡ，Ｂ，Ｃの別に各群３０日間飲み続けてもらった。更年期障害の改善効果は、アンケートによるクッパーマン指数を用いて開始時と終了時の変化によって評価した。その変化の結果を各群毎に以下の表に示す。
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
この実施例の実験により、更年期障害による種々の体調不良が、この発明の実施例である鮭等の魚の卵巣外皮を蛋白分解酵素で処理して成るアミノ酸成分と、イソフラボン及び高麗人参を含有させることにより、より更年期障害抑制効果が大きいことが分かった。また、鮭等の魚の卵巣外皮由来のアミノ酸成分、イソフラボン及び高麗人参にも、更年期障害による不快感を緩和する効果があることが分かった。
【実施例２】
【００３０】
次に、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、鮭の卵巣外皮由来ペプチドと、コラーゲン及びヒアルロン酸を被験品とするコラーゲン産生能に関する細胞試験を実施した。また、被験品の同細胞に対する細胞増殖性への影響についても併せて検討を行なった。
【００３１】
線維芽細胞は、真皮のコラーゲン線維（膠原線維）、弾性線維（エラスチン）の主成分であるコラーゲンをつくるものであり、線維芽細胞は真皮の中に存在し、少しずつコラーゲンをつくる一方で、少しずつコラーゲンを分解する。
【００３２】
線維芽細胞によるコラーゲン線維の合成と分解はコントロールされていて、合成と分解のバランスがとれているが、分解が合成を上回ればシワ、たるみ、肌老化が進行し、逆に合成が分解を上回れば、シワ、たるみ、肌老化の進行を抑える。正常な大人の場合、合成量と分解量は同じで、コラーゲンの総量は変わらずただ入れ替わりだけがおこるが、活性酸素等により線維芽細胞がダメージを受けると、コラーゲン繊維の合成と分解のバランス崩れて、皮膚の老化につながるものである。
【００３３】
実験方法
細胞：正常ヒト皮膚線維芽細胞（以下、NB1RGBと称す。 理研Cell Bank）
細胞ストレイン番号−RCB0222
培地：10%牛胎仔血清含有イーグルMEM培地
基礎培地イーグルMEMに牛胎仔血清を10%になるように添加。
【００３４】
試薬
細胞評価：コラーゲンステインキット（コスモバイオ社）
陽性対象：アスコルビン酸（以下、APMgと称す。）（和光純薬工業）
細胞評価：MTT（同仁化学）
【００３５】
被験品
被験品１：鮭の卵巣外皮由来ペプチド（以下、Sample A）
被験品２：コラーゲン＋ヒアルロン酸（コラーゲン：ヒアルロン酸＝９０：１０、質量比）（以下、Sample B）
被験品３：鮭の卵巣外皮由来ペプチド＋コラーゲン＋ヒアルロン酸（卵巣外皮由来ペプチド：コラーゲン：ヒアルロン酸＝５０：４５：５、質量比）（以下、Sample C）
Sample
A〜Sample Cについては、10%牛胎仔血清含有イーグルMEM培地にて以下のように溶解した。
Sample
A〜Sample C（0.5%、1%、2%）３段階
NB1RGBの培養
NB1RGBを96穴マイクロタイタープレートに2.0×104 cell/wellになるように播種（100μl）して24hr前培養したのち、基本培地または各濃度に調製した被験品（Sample A〜Sample C）を100μl添加して、CO2インキュベーター（37℃，5%CO2）内で48hr培養した。
【００３６】
コラーゲン産生能評価
基本培養後、培地成分を除去するためPBS(-)を用いて各ウェルを100μlで2回洗浄し、キット染色液（シリウスレッド＋ファーストグリーン含有）を50μl 添加後、室温（23℃±1℃）・暗所にて30min静置させた。
【００３７】
各ウェルをPBS(-)を用いて着色が目視出来なくなるまで洗浄し，100 μlのキット抽出液（含メタノール）にて室温で1min抽出した。これをマイクロプレートリーダーにより570 - 595nm の吸光度を測定し、得られた吸光度はNB1RGBの細胞内コラーゲン量としてコラーゲン生成能の指標とした。被験品の陽性対象としてはAPMgを用い、最終濃度が50μMになるように100μl添加して同様に培養した。
【００３８】
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響については、MTT還元法で確認した。
基本培養後、0.5% MTT水溶液を各ウェルに20 μl 添加して37℃で2hrインキュベーションを行った。インキュベーション後の培地成分を除去するために，各ウェルをHEPES緩衝液でそれぞれ100μlずつ2回洗浄した後，100 μlの0.04M 塩酸含有イソプロパノール溶液を分注してさらに1hrインキュベーションを行い，生成したフォルマザンを抽出した。これをマイクロプレートリーダーにより570 - 655 nm の吸光度を測定し、その値を細胞増殖性の指標とした。
【００３９】
コラーゲン産生能評価
NB1RGBのコラーゲン合成能、に与えるSample A〜Sample Cの影響についてそれぞれ図１から図３に示す。Sample Aについては、図１の斜線を付したグラフに示すように、各濃度（0.5〜2%）ともに陽性対照であるAPMgと比べるとコラーゲン量は低かったものの、未処理（non treatment）と比較するとコラーゲン量は高かった。
【００４０】
Sample Bにおいては、図２の斜線を付したグラフに示すように、0.5%でAPMgとほぼ同等、1%および2%でAPMgよりもコラーゲン量が高かった。
【００４１】
Sample A及びSample Bの混合品であるSample Cでは、図３の斜線を付したグラフに示すように、全ての濃度（0.5〜2%）で未処理及びAPMgよりもコラーゲン量は高かった。
【００４２】
また、コラーゲン以外の蛋白（non collagen）は、図１〜図３の白地のグラフに示すように、Sample A〜Sample Cの各濃度においても未処理（non
treatment）と同様であった。
【００４３】
この結果から、Sample A〜Sample Cの全てにおいてNB1RGBの蛋白産生能においてコラーゲン特異的に産生能向上効果が見られた。また、Samle Cにおいて最もコラーゲン量が高かったことから、サーモンオバリーペプチド（SOP）とコラーゲン＋ヒアルロン酸はそれぞれでもコラーゲン産生能向上効果が見られているが、併用する事によって相乗効果が期待出来ることがわかった。
【００４４】
被験品のNB1RGBに対する細胞増殖性への影響
Sample
A〜Sample CのNB1RGBに対する細胞増殖性への影響について図４〜図６に示す。図示するように、Sample A〜Sample Cの全ての濃度において、未処理（non treatment）とほぼ同様であったことから、本被験品の細胞毒性は見られず安全性が確認された。
【００４５】
この試験により、鮭卵巣外皮由来のアミノ酸成分、及びコラーゲン＋ヒアルロン酸のそれぞれで正常ヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲン特異的な産生能向上効果が見られ、かつそれらの混合品においては相乗効果が確認された。また、被験品の同細胞に対する細胞増殖性への影響についても毒性は見られず安全性が確認された。
【実施例３】
【００４６】
この実施例では、表４に示す処方の鮭の卵巣外皮由来ペプチドを用いた栄養補助食品であるドリンクについて、女性の更年期障害に対する改善効果を検証した。対象者は、更年期症状があるが治療を受けるほどではない、という女性１７名に４週間、８名（うちプラセボ４名）に６週間（２週間延長）に亘り、表４に示す処方の飲料500mgを毎朝服用させた。
【００４７】
試飲前・１週間後・４週間後・（１週間中断ののち）５週間後・６週間後において、肌状態の変化を測定した。また試飲前・４週間後・（１週間中断ののち）５週間後・６週間後に採血を実施し、生化学的手法を用いて体内の変化を調査した。また、更年期指数や肌状態変化をアンケート回答というかたちで調査した。
【００４８】
【表４】
【００４９】
結果、肌に関しては「かさつき」「くすみ」「なめらかさ」「化粧のり」「化粧もち」「シミの改善」「毛穴ひきしめ」という項目における有効性が示唆された。多くが1週間以内に肌状態の改善を自覚しており、また一時中断した時点でほぼ全員において状態が一時悪化したが、飲用を再開した群は再び改善した。一方、プラセボ群は悪化したままという結果が得られた。よって、この実施例の処方による飲料の肌改善効果が確認された。
【００５０】
血液検査の結果では、ビタミン群等の変化に一定の規則性は発見できなかったが、女性ホルモンのバランスを調整している可能性が示唆された。また、中性脂肪値も改善するモニターが多かったことから、脂質代謝の改善に寄与する可能性も示唆された。自覚変化としては、「疲労回復」「睡眠の質改善」「寝つき改善」「イライラ解消」に対し、多くのモニターが1週間以内の改善を訴えまた。更年期指数変化を追っても、１週間ごとに全員の指数が改善しており、更年期女性への症状緩和の効果もみられた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品１であるサンプルＡの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図２】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品２であるサンプルＢの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図３】この発明の鮭の卵巣由来ペプチドの作用について、培地で増殖させる正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いて実験したもので、被験品３であるサンプルＣの各濃度における細胞内コラーゲン量をコラーゲン生成能の指標とし、コラーゲン及びコラーゲン以外の蛋白を吸光度で測定したグラフである。
【図４】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＡの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【図５】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＢの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【図６】被験品の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖性への影響については、ＭＴＴ還元法で確認したもので、サンプルＣの各濃度における細胞増殖性及び比較対象の細胞増殖性を、吸光度で測定したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とすることを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項２】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含むことを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項３】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させることを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項４】
前記主成分に、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させることを特徴とする請求項３記載の更年期障害改善剤。
【請求項５】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含むことを特徴とする栄養補助食品。
【請求項６】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含むことを特徴とする栄養補助食品。
【請求項７】
前記栄養補助食品は清涼飲料であることを特徴とする請求項５または６記載の栄養補助食品。
【請求項１】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とすることを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項２】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含むことを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項３】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させることを特徴とする更年期障害改善剤。
【請求項４】
前記主成分に、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含み、人繊維芽細胞のコラーゲン生産能を向上させることを特徴とする請求項３記載の更年期障害改善剤。
【請求項５】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、イソフラボン及び高麗人参またはその抽出物の少なくとも一方を含むことを特徴とする栄養補助食品。
【請求項６】
魚の卵巣外皮を、蛋白分解酵素で処理して成るペプチドまたはアミノ酸を主成分とし、コラーゲン及びヒアルロン酸の少なくとも一方を含むことを特徴とする栄養補助食品。
【請求項７】
前記栄養補助食品は清涼飲料であることを特徴とする請求項５または６記載の栄養補助食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−８３７６２（Ｐ２０１０−８３７６２Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５０９９８（Ｐ２００８−２５０９９８）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年６月１１日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａ−ｏｃｅａｎ．ｃｏｍ／」「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａ−ｏｃｅａｎ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ」に発表
【出願人】（３９７０４５５８５）協和薬品株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年６月１１日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａ−ｏｃｅａｎ．ｃｏｍ／」「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａ−ｏｃｅａｎ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ」に発表
【出願人】（３９７０４５５８５）協和薬品株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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