ＣＣＨＣ亜鉛配位残基を含むジンクフィンガーをここで開示する。また、これらのＣＣＨＣジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質及び融合タンパク質並びにこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドについても述べる。遺伝子エディティング及び遺伝子調節のためにこれらのタンパク質を使用する方法も説明する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
非正準（非Ｃ_２Ｈ_２）ジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質であって、非正準ジンクフィンガーがＤＮＡ結合に関与するらせん部分を有し、らせん部分の亜鉛配位領域がアミノ酸配列ＨＸ_１Ｘ_２ＲＣＸ_Ｌ（配列番号２）を含み、及びジンクフィンガータンパク質が標的配列に結合するように操作されている、前記ジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
Ｘ_１がＡであり、及びＸ_２がＱである、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項３】
Ｘ_１がＫであり、及びＸ_２がＥである、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項４】
Ｘ_１がＴであり、及びＸ_２がＲである、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項５】
Ｘ_ＬがＧである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項６】
少なくとも１つのジンクフィンガーが、配列Ｃｙｓ−（Ｘ^Ａ）_２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ^Ｂ）_１２−Ｈｉｓ−（Ｘ^Ｃ）_３−５−Ｃｙｓ−（Ｘ^Ｄ）_１−１０（配列番号３）［式中、Ｘ^Ａ、Ｘ^Ｂ、Ｘ^Ｃ及びＸ^Ｄはいずれのアミノ酸でもよい］を含む、請求項１から請求項５のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項７】
表１、２、３又は４のいずれかに示す配列のいずれかを含む、請求項１から請求項６のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項８】
Ｘ^Ｄが配列ＱＬＶ又はＱＫＰを含む、請求項６又は請求項７のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項９】
配列ＱＬＶ又はＱＫＰがジンクフィンガーの３個のＣ末端アミノ酸残基である、請求項８に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１０】
Ｘ^Ｄが１、２又は３個のＧｌｙ（Ｇ）残基を含む、請求項６から請求項９のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１１】
ジンクフィンガーの少なくとも１つが、請求項１から請求項１０のいずれかに記載のＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、複数のジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質。
【請求項１２】
ジンクフィンガータンパク質が３、４、５又は６個のジンクフィンガーを含む、請求項１１に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１３】
フィンガー２がＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、請求項１１又は１２に記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１４】
Ｃ末端ジンクフィンガーがＣＣＨＣフィンガーを含む、請求項１１から請求項１３のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１５】
少なくとも２個のジンクフィンガーがＣＣＨＣフィンガーを含む、請求項１１から請求項１４のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１６】
ジンクフィンガータンパク質が、表８に示す配列のいずれかを含み、ＩＰＰ２−Ｋ遺伝子内の標的配列に結合するように操作されている、請求項１１から請求項１５のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
【請求項１７】
請求項１から請求項１６のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質及び１又はそれ以上の機能性ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項１８】
（ａ）切断ハーフドメイン、
（ｂ）請求項１から請求項１６のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質、及び
（ｃ）切断ハーフドメインとジンクフィンガータンパク質の間に介在するＺＣリンカー
を含む融合タンパク質。
【請求項１９】
ＺＣリンカーの長さが５アミノ酸である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ＺＣリンカーのアミノ酸配列がＧＬＲＧＳ（配列番号４）である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ＺＣリンカーの長さが６アミノ酸である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ＺＣリンカーのアミノ酸配列がＧＧＬＲＧＳ（配列番号５）である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１から請求項１６のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質又は請求項１７から請求項２２のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
細胞において、請求項１８から請求項２２のいずれかに記載の一対の融合タンパク質を発現させることを含む、植物細胞中の細胞クロマチンの標的切断のための方法であって、
（ａ）融合タンパク質の標的配列が互いの１０ヌクレオチド内であり、及び
（ｂ）融合タンパク質が二量体化して、標的配列の間に位置するＤＮＡを切断する、
前記方法。
【請求項２５】
宿主植物細胞における標的遺伝子組み換えの方法であって、
（ａ）融合タンパク質の標的配列が選択された宿主標的遺伝子座に存在する、宿主細胞において、請求項１８から請求項２２のいずれかに記載の一対の融合タンパク質を発現させること、及び
（ｂ）宿主標的遺伝子座において配列変化を示す組換え宿主細胞を同定すること
を含む前記方法。
【請求項２６】
配列変化が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、遺伝物質の置換及びそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される突然変異である、請求項２４又は請求項２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項２４から請求項２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
外因性ポリヌクレオチドが、宿主標的遺伝子座に相同な配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
植物が、単子葉植物、双子葉植物、裸子植物及び真核層類からなる群より選択される、請求項２４から請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アブラナ科の成員及びシロイヌナズナからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
植物が樹木である、請求項２４から請求項２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
標的配列がＩＰＰ２Ｋ遺伝子内に存在する、請求項２４から請求項３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＩＰＰ２Ｋ遺伝子を不活性化する又は変化させることを含む、種子中のフィチン酸のレベルを低下させるための方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載のＩＰＰ２−Ｋ遺伝子を不活性化する又は変化させることを含む、種子においてリンをより代謝的に使用可能にするための方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項１６のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質、請求項１７から請求項２２のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む植物細胞。
【請求項３６】
細胞が種子である、請求項３５に記載の植物細胞。
【請求項３７】
種子がトウモロコシ種子である、請求項３６に記載の植物細胞。
【請求項３８】
ＩＰＰ２−Ｋが部分的に又は完全に不活性化されている、請求項３５から請求項３７のいずれかに記載の植物細胞。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【図７７】

【図７８】

【図７９】

【図８０】

【図８１】

【図８２】

【図８３】

【図８４】

【図８５】

【図８６】

【図８７】

【図８８】

【図８９】

【図９０】

【図９１】

【図９２】

【公表番号】特表２０１０−５１２７４５（Ｐ２０１０−５１２７４５Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４１３７３（Ｐ２００９−５４１３７３）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２５４５５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７６２９０
【国際公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ　アグロサイエンシィズ　エルエルシー (197)
【出願人】（５００４２６１３５）サンガモ　バイオサイエンシーズ，　インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】