有核赤血球の測定方法
血液試料中の有核赤血球を測定する方法を提供する。上記方法は、成熟赤血球を溶解させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、それに続いて、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光測定によって、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光測定によって、または軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光測定によって、フローセル中の有核赤血球を分析するステップと、その後、それらの測定シグナルおよび／または関数を用いることによって、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年２月１日に出願された出願番号第１１／０４８，０８６号の一部継続出願である。出願番号第１１／０４８，０８６号は、２００４年２月１０日に出願された仮特許出願第６０／５４３，１６２号の米国特許法１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。これらの特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、光学測定およびインピーダンス測定によって有核赤血球を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
正常な末梢血は、無核の成熟赤血球を含有する。有核赤血球（ＮＲＢＣ）すなわち赤芽球は、未熟な赤血球である。それらは通常、骨髄内に存在し、末梢血中には存在しない。しかし、貧血および白血病など、ある種の疾患では、有核赤血球が末梢血中にも存在する。したがって、ＮＲＢＣの測定は臨床で重要である。伝統的には、有核赤血球の識別および計数は手作業で行われる。その方法は、顕微鏡スライド上に血液試料を塗沫し、そのスライドを染色するステップと、それに続いて、個々のスライドを手作業で画像分析するステップとを含む。有核赤血球濃度は、１００細胞の白血球（ＷＢＣ）あたりのＮＲＢＣの数として報告される。通常は、血液塗抹標本上の同じ領域に存在する２００細胞の白血球と、ＮＲＢＣの数とを計数し、その数を２で割って、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数としてＮＲＢＣ濃度を表す。このアプローチは非常に時間がかかり、同時に、スライドを分析する個人の解釈によって主観的となる。
【０００４】
近年、有核赤血球を識別するためのいくつかの蛍光フローサイトメトリー法が開発された。これらの方法は、有核赤血球を他の細胞型と識別するのに核特異的な染色法を利用するが、これは、有核赤血球を、それらの電気的または光学的特性に基づいてのみ識別するのが困難であるためである。
【０００５】
特許文献１（Ｉｎａｍｉら）は、有核赤血球を識別する蛍光法を開示する。この方法は、第１液および第２液を用いた２工程染色を用いる。Ｉｎａｍｉらは、有核赤血球内に拡散して、それらの核を特異的に染色する赤芽球染色色素を第１液に含有させ、次いで二次元プロット上で有核赤血球の群を他の細胞群から分離し、それによってＮＲＢＣ識別の結果が計算されることを教示した。
【０００６】
特許文献２（Ｋｉｍら）は、有核赤血球および白血球のフローサイトメトリー分析の方法を開示する。この方法は、有核赤血球細胞核を生体核染色に曝露するために、全血試料から赤血球およびＮＲＢＣ細胞質を溶解させ、白血球内への生体核染色の浸潤を最小限にすること、ならびに蛍光および２通りの角度の散乱光を測定することによって試料を分析することを含む。この方法は、破片からのシグナル（蛍光および非蛍光）を遮断し、軸方向光減失（ＡＬＬ）トリガーより下で、かつ蛍光トリガー（ＦＬ３）より上の範囲にあるシグナルをＮＲＢＣとして特定するトリプルトリガー法（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を特徴とする。この方法では、ＮＲＢＣと白血球の識別を得るために、試薬を４２℃にまで暖める必要がある。
【０００７】
特許文献３（Ｋｉｍら）は、有核赤血球をサブクラスに分類するための多目的溶解試薬を用いる方法を開示する。この方法は、核染色物を含有する多目的溶解試薬で血液試料を溶解させるステップと、昇温温度で試料混合物をインキュベートするステップと、ＮＲＢＣを含めた有核血球を自動化された電気光学的血液計測手段で測定するステップとを含む。
【０００８】
特許文献４（Ｋｉｍら）は、血液試料中のＮＲＢＣ、白血球（ＷＢＣ）、損傷白血球、および白血球亜集団をフローサイトメトリーによって識別する方法を開示する。この方法は、血液試料を溶解させるステップと、有核赤血球およびいかなる損傷白血球も生体核染色で染色するステップと、蛍光、軸方向光減失、および３°から１０°までの散乱光シグナルを測定することによって試料混合物を分析するステップと、蛍光および散乱光シグナルからの三次元プロットを構築するステップと、ＷＢＣ、ＮＲＢＣ、損傷ＷＢＣ、およびＷＢＣサブクラス相違を識別および計数するステップとを含む。
【０００９】
特許文献５は、有核赤血球を識別および計数するための試薬および方法を開示する。この方法は、赤血球を溶解させるステップと、白血球および有核赤血球を染色するステップと、少なくとも１つの散乱光パラメータおよび少なくとも１つの蛍光パラメータを測定することによって試料をアッセイするステップとを含む。
【００１０】
上述の方法は、蛍光および散乱光測定を併せることによって有核赤血球および白血球の識別および計数を可能にする。しかし、蛍光測定は、複雑かつ高価な検出方法である。
【００１１】
特許文献６（Ｌｉら）は、有核赤血球を識別する方法を開示する。この方法は、成熟赤血球を溶解させるステップと、散乱光測定によってフローセル中の試料を分析して、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップとを含む。散乱光測定は、１０°未満の２通りの角度の低角散乱光シグナルを用いることによって行い。この方法は、電気的および光学的分析を用いた白血球の同時識別をさらに含み、上記電気的分析がＤＣインピーダンス測定である。
【００１２】
特許文献７（Ｌｉら）は、有核赤血球を他の細胞型と識別するために、２通りの角度の散乱光測定を用いる方法であって、第１の散乱光シグナルが低角散乱光シグナルであり、第２の散乱光シグナルが中角または直角散乱光シグナルである方法をさらに開示する。
【００１３】
特許文献８（Ｌｉら）はまた、有核赤血球を識別する方法を開示する。この方法は、血液試料中の赤血球を溶解試薬で溶解させるステップと、非集束流開口部（ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓｅｄ ｆｌｏｗ ａｐｅｒｔｕｒｅ）におけるＤＣインピーダンス測定によって有核血球を測定するステップと、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血液試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。
【００１４】
特許文献９（Ｈｕｏら）は、血液試料の第１アリコートおよび第２アリコートを、それぞれ第１の溶解試薬系および第２の溶解試薬系で別々に溶解させ；第１の試料混合物を、ＤＣインピーダンス、ラジオ周波数、および散乱光測定によってフローセルで測定し；非集束流開口部におけるＤＣインピーダンス測定によって、第２の試料混合物中の細胞分布を測定し、残留血球を計数し；それぞれ第１の試料混合物の測定および第２の試料混合物の測定から得られた血球分布パターンを分析し；複合分析をさらに行って、ＮＲＢＣを他の細胞型と識別し、血液試料中のＮＲＢＣの数を決定することによって有核赤血球を識別する方法を教示する。
【００１５】
有核赤血球のサイズ、散乱光、および蛍光特性によって測定した場合、他の細胞型からのものと、シグナルが潜在的に重なり合うため、有核赤血球を他の細胞型（特に白血球）と識別するのは技術的に困難であることが知られている。従来技術の検出系および検出方法は、測定の費用、簡単さ、および効率に関してさらに改善することができる。
【００１６】
さらに、ある種の細胞型および／または細胞性物質は、有核赤血球測定を妨害する傾向があることが知られている。測定に使用される検出方法に応じて、妨害物質が相違しうる。例えば、有核赤血球を測定するのに蛍光測定を用いる場合には、老化した白血球が測定を妨げる傾向がある。これは、試料混合物を調製するのに使用される試薬によって、それらが溶解される傾向があり、溶解された白血球の核が有核赤血球と重なりあう傾向があるためである。有核赤血球を測定するのに散乱光およびインピーダンス測定を用いる場合、巨大血小板、血小板凝集塊、および鎌状赤血球が妨害を引き起こしうることが見いだされている。これは、上記測定のうちの１つまたは複数において、これらの物質が有核赤血球と重なり合う可能性があるためである。
【特許文献１】米国特許第５，２９８，４２６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５５９，０３７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４８，２２５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８７９，９００号明細書
【特許文献５】欧州特許第１００４８８０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８７４，３１０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９１７，５８４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４１０，３３０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，４７２，２１５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以上のことに基づいて、有核赤血球を識別および計数するための、単純で、より安価で、それでもなお信頼できる検出方法および装置の必要性が依然として存在している。とりわけ妨害物質の存在下における、測定精度のさらなる改善の必要性も存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
一実施形態では、本発明は、血球試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。中角散乱光シグナルは、約１５°から約７０°までの範囲、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲で測定する。有核赤血球と他の細胞型との識別には、上記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数、上記軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を用いることができる。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、血球試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に上記血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。上記低角散乱光シグナルは、１０°未満、好ましくは約１°から約７°までの範囲で測定する。有核赤血球と上記他の細胞型との識別は、上記中角散乱光および低角散乱光シグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数、上記軸方向光減失および低角散乱光シグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を使用しうる。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は血液試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。有核赤血球と上記他の細胞型との識別は、上記軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記軸方向光減失および低角散乱光シグナルの関数、上記低角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光および低角散乱光シグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数上記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および低角散乱光シグナルの関数、上記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルの関数、上記軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を使用しうる。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、有核赤血球を他の細胞型と識別する識別分析法を対象とする。ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを得ると、まず、他の１つまたは複数の測定シグナルと併せた中角散乱光シグナルまたはその関数を用いて、細胞破片を有核赤血球および白血球と識別し、低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、有核赤血球を白血球と識別する。細胞破片には、血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、または未溶解赤血細胞膜が含まれる。上記方法は、血液試料の補正白血球数を取得および報告するステップをさらに含む。
【００２２】
後に続く「発明を実施するための最良の形態」から、よりよく理解されるであろうが、本発明は、核染色および高価な蛍光検出法を使用せずに、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、ならびに低角および中角散乱光の測定を利用した有核赤血球の識別を提供するという点で、従来技術と比較して特に有利である。この方法の追加の特徴は、それが、有核赤血球を様々な妨害物質とさらに識別するために、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、または軸方向光減失の測定と共に中角散乱光の測定を併用することである。本発明は、後に続く「発明を実施するための最良の形態」から、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
一実施形態では、本発明は、軸方向光減失測定およびＤＣインピーダンス測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。上記方法は、成熟赤血球を溶解させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルを測定することによって、フローセル中の試料を分析するステップと、軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。
【００２４】
上記有核赤血球の測定は、光学測定およびインピーダンス測定を用いて、集束流フローセル中で行う。血球などの粒子がフローセルの開口部を通過する際に、それは、照射供給源からの入射光を散乱させ、全方向への散乱光の放射を引き起こす。散乱光シグナルは、入射光ビームとの相対における、０°から１８０°の間の様々な角度で、光検出器によって検出できる。各細胞集団は、大なり小なり、異なった散乱光特性を有することが見出されており、それを様々な細胞集団の識別に利用することができる。入射光から１０°未満に検出される散乱光シグナルは、一般的に低角散乱光と呼ばれる。低角散乱光の特徴は、細胞の内容物と共に、細胞のサイズによっても影響されることである。
【００２５】
軸方向光減失（ＡＬＬ、前方消光としても知られている）は、概ね、粒子が入射光ビームを通過することによる光エネルギーの減少であり、光検出器によって検出される。入射光ビームが粒子にあたると、光は散乱するか、吸収される。それらは両方とも入射光からエネルギーを除去し、入射ビームは減衰する。この減衰は消光と呼ばれる。入射光のビームの軸に沿って見た場合、それは軸方向光減失と呼ばれる。通常、ＡＬＬシグナルは、入射光からの約０°から約１°までの角度で検出される。本発明の好ましい実施形態では、入射光軸から約０．５°未満の環状領域でＡＬＬシグナルを収集する。ＡＬＬシグナルは、細胞のサイズに強く影響される。
【００２６】
軸方向光減失測定は入射光ビームからのエネルギー減失を測定し、一方、低角散乱光測定は光の増大を測定するので、これら２つの異なった光学特性を測定するには、異なった電子回路が必要である。図１０に示す通り、ＡＬＬシグナルを測定するのに使用される電子回路は反転増幅器を用い、一方、低角散乱光シグナルを測定するのに使用される電子回路は非反転増幅器を用いる。
【００２７】
ＡＬＬおよび低角散乱光シグナルを測定するには、光学検出器集合体を用いる。本発明の目的には、多数のデザインの光学検出装置が使用できる。一実施形態では、光学検出器集合体がプリント回路基板（ＰＣＢ）上に配置された適切なサイズおよび幾何学的配置の２つの個別な光検出器を含有する。一方の光検出器は、ＡＬＬシグナルを測定するのに使用され、もう一方の光検出器は、低角散乱光シグナルを測定するのに使用される。光検出器からのシグナルは、以下に記載する、実験用血液分析機内の条件付け回路（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）に送られる。別の実施形態では、光学検出器集合体は、ＡＬＬおよび散乱光シグナルを測定するのに適したサイズおよび幾何学的配置感知領域を有するプラナーフォトダイオードアレイを含有する。フォトダイオードアレイからのシグナルは、実験用血液分析機内の条件付け回路に送られる。さらに別の実施形態では、光学検出器集合体は、ＡＬＬおよび散乱光シグナルを測定するための光ファイバーアレイを含有する。適した光ファイバーアレイは、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第６７９８５０８号に詳細に記載されている。別の実施形態では、光学検出器集合体は、入射光から約１５°から約７０°まで、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲内の中角散乱光シグナルを検出する光検出器を含有する。
【００２８】
一方、伝導性溶液中に懸濁された粒子または血球がフローセルを通過する際に、インピーダンス変化により電気的シグナルを測定することができる。パルス波形、高さ、および幅は、粒子のサイズに直接的に関係しており、測定された粒子のサイズに変換することができる。異なったサイズの２つ以上の粒子が測定された場合、測定から得られた頻度ヒストグラムによって、粒子のサイズ分布を表すことができる。ＤＣインピーダンス測定装置を備えた血液分析機による血球計算およびサイズ決定に用いられる検出方法は、概ね、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第２６５６５０８号、第３８１００１１号、および第５１２５７３７号に記載されている。
【００２９】
本発明の目的で血液試料を溶解させるのに適した試薬系の１つには、米国特許第４５２１５１８号、第４５２８２７４号、第５９３５８５７号に記載の希釈剤などの等張血液希釈剤、ならびに米国特許第５７６３２８０号、第５８３４３１５号、および第６５７３１０２に記載の溶解試薬などの溶解試薬が含まれ、これらの開示を参照により全体として本明細書に組み込む。別法では、上記試薬系は、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第５８８２９３４号に記載の等張溶解試薬でもありうる。この試薬は、血液試料を希釈し、同時に、後続の分析用に赤血球を溶解する。
【００３０】
実施例１は、軸方向光減失およびＤＣインピーダンス測定を用いて、有核赤血球を識別する方法を例示する。図１Ａは、実施例１に記載の試薬および手順を用いて処理および分析された、有核赤血球を含有する臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から分離されるクラスターを形成する。
【００３１】
図１Ｂは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。容易に見て取れるように、有核赤血球が属する領域にはいかなる細胞集団も存在しない。考察の便宜上、この領域をＮＲＢＣ領域と呼ぶ。異なった散布図では、ＮＲＢＣ領域が散布図内の異なった部分でありうることが知られている。
【００３２】
試料のＮＲＢＣ濃度は、特定されたＮＲＢＣクラスター（図１Ａ）内の細胞数を白血球（ＷＢＣ）の数で割り、その商に１００を掛けることによって計算できる。ＮＲＢＣ濃度は、手作業の参照方法の単位と同じ、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数値として報告でき、または全血１マイクロリットル（μＬ）あたりのＮＲＢＣの絶対数としても報告できる。
【００３３】
さらに、図１Ａおよび１Ｂに示されている通り、軸方向光減失およびＤＣインピーダンス測定を用いて、白血球は、４つの亜集団にさらに識別される。上記４つの亜集団には、リンパ球、単球、好中球、および好酸球が含まれる。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失測定および低角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失および低角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失シグナルおよび低角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。低角散乱光シグナルは、好ましくは１０°未満、より好ましくは約１°から約７°、最も好ましくは約４°から約６°で測定される。
【００３５】
図２Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＡＬＬ対ＬＳ１（５．１°における散乱光）散布図を示す。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離されるクラスターを形成する。
【００３６】
図２Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合も、有核赤血球が属する領域にはいかなるクラスターも存在しない。
【００３７】
さらに、図２Ａおよび２Ｂに示されている通り、軸方向光減失および低角散乱光測定を用いて、白血球は３つの亜集団にさらに識別される。上記３つの亜集団には、リンパ球、単球および好中球の合計、ならびに好酸球が含まれる。
【００３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンス測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。低角散乱光シグナルは、前述のものと同じ範囲、すなわち約１°から約７°、より好ましくは約４°から約６°で測定する。
【００３９】
より詳細には、一実施形態では、軸方向光減失シグナルと、低角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数とを用いることによって、散布図を構築する。一例として、図３Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合、関数Ｆ１は（（ＤＣ＋ＬＳ１）／ＤＣ×１０００）に等しい。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離する。図３Ｂは、図１Ｂで示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【００４０】
別の例として、図４Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。この場合、関数Ｆ２は（ＤＣ／（ＤＣ＋ＬＳ１）×１０００）に等しい。この散布図に示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離する。図４Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【００４１】
他の細胞型からの有核赤血球の分離は、ＤＣおよびＬＳ１の関数を用いることによって、さらに強化されたことが、図３Ａおよび４Ａによって示された例示から明らかである。
【００４２】
別法ではＤＣ、ＬＳ１、およびＡＬＬの１つまたは複数の関数を用いて、他の細胞型からの有核赤血球の分離を強化できることが見いだされた。さらに、上記に論じた、有核赤血球を識別するためにＤＣおよびＡＬＬを用いる実施形態、ならびにＡＬＬおよび低角散乱光測定を用いる実施形態では、他の細胞型からの有核赤血球の分離をさらに強化するために、ＤＣおよびＡＬＬの１つまたは複数の関数、またはＡＬＬおよびＬＳ１の１つまたは複数の関数を利用することができる。
【００４３】
実施例３は、有核赤血球を他の細胞型と識別するのに、異なった試薬系および前述の本発明の方法を用いる別の例を例示する。図５Ａ、６Ａ、７Ａ、および８Ａに示されている通り、有核赤血球は、それぞれＤＶ対ＡＬＬ、ＬＳ１対ＡＬＬ、Ｆ１対ＡＬＬ、およびＦ２対ＡＬＬで、白血球および細胞破片から明確に分離される。
【００４４】
上述の通り、有核赤血球は、それらを蛍光測定で測定した場合でさえ、他の細胞型、とりわけ白血球と重なりあう可能性がある。本発明の方法は、この特定の未成熟な赤血細胞集団を計数するために、複数のパラメータおよびそれらの関数を用いて、有核赤血球の識別を強化する。
【００４５】
図９に示し、実施例４に記載する通り、実施例１に記載の方法および試薬を用いて、１３２の臨床標本を含めた合計３３６の全血試料を分析した。ＮＲＢＣの結果は、Ｆ１対ＡＬＬ散布図を用いた識別分析から得た。図９は、下記に記載のフローサイトメトリー参照方法の結果と、本発明の方法を用いて得られた結果との間の線形相関を図示する。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られたＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。本明細書で言及する中角散乱光シグナルは、入射光からの約１５°から約７０°まで、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲で測定できる。
【００４７】
代替の実施形態では、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法は、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光測定を併用する。この実施形態では、溶解された血液試料を、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによってフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの測定は上述されている。
【００４８】
中角散乱光シグナルを、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、または軸方向光減失シグナルと併用した二次元分析は、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのにとりわけ有効であることが見いだされた。さらに、中角散乱光、ＤＣインピーダンス、および軸方向光減失シグナルの組合せ、または中角散乱光、低角散乱光、および軸方向光減失シグナルの組合せも、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのに有効である。さらに、中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの１つまたは複数の関数、中角散乱光および低角散乱光シグナルの１つまたは複数の関数、または中角散乱光および軸方向光減失シグナルの１つまたは複数の関数も、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのに使用できる。
【００４９】
上記細胞破片は、血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、および未溶解赤血細胞膜を含有すると特定されており、したがって、これらの細胞性物質を一般に細胞破片と呼ぶ。通常、正常血液試料およびほとんどの臨床血液試料では、溶解された際に、わずかな量の細胞破片が存在し、それは白血球と同様に有核赤血球から分離される。しかし、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、および鎌状赤血球の存在下では、これらの物質が、本発明の、１つまたは複数の有核赤血球測定方法を妨害しうる。したがって、それらは妨害物質とも呼ばれる。
【００５０】
妨害は、２通りの異なった様式で引き起こされうることが見出されている。一様式では、細胞破片は、ＮＲＢＣ領域に伸長し、有核赤血球と重なり合う可能性があり、それによって、ＮＲＢＣ計数の直接的上昇が引き起こされる。ＮＲＢＣ測定へのこの型の妨害は、血液試料が有核赤血球を含有しようが含有しまいが、存在しうることを理解するべきである。血液試料がいかなる有核赤血球も含有しない場合でも、なお、妨害物質はＮＲＢＣ領域に伸長し、試料がＮＲＢＣ試料として報告される可能性があり、それにより偽陽性報告が引き起こされる。別の様式では、細胞破片が白血球、とりわけリンパ球と重なり合う可能性がある。この状況では、白血球の測定数が誤りとなりうる。有核赤血球を計算および報告するのに、１００ＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数として、白血球数が用いられる場合、この比率は、ＷＢＣに関する誤りによって影響されうる。妨害物質の出自、例えば、血小板凝集塊か、鎌状赤血球かに応じて、細胞破片の分布パターンは、散布図中で相違しうるものであり、上記に論じた妨害のいずれか、または両方が存在しうる。
【００５１】
上述の通り、中角散乱光測定を他の測定またはその関数と併用して強化された、白血球および／または有核赤血球からの細胞破片の分離は、妨害物質の存在下における、白血球および／または有核赤血球からの細胞破片の分離を補助し、これらの物質が有核赤血球の測定を妨害するのを防止できる。
【００５２】
実施例５は、妨害物質を含有する臨床血液試料の有核赤血球測定と、中角散乱光および他の測定を用いた、有核赤血球および／または白血球からの妨害物質の改善された分離とを例示する。図１１Ａは、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、細胞破片はリンパ球と重なり合っている。図１１Ｂは、同じ血液試料のＬＳ２（２０°から４３°）対ＤＣ散布図を示す。示されている通り、中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球および白血球の両方から、細胞破片が明確に分離される。
【００５３】
図１２Ａは、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ散布図を示す。示されている通り、細胞破片は有核赤血球および白血球と重なり合う。図１２Ｂは、同じ血液試料のＬＳ１対ＬＳ２散布図を示す。示されている通り、有核赤血球および白血球の両方からの細胞破片の分離は、中角散乱光シグナルを用いることによって、実質的に改善される。当業者には理解できるように、細胞破片の分布パターンは、血小板凝集塊の存在下と、鎌状赤血球の存在下とでは相違している。ＬＳ２対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、もしくはＡＬＬ対ＬＳ２などの異なった測定、またはこれらのシグナルの関数は、異なった型の妨害物質を識別する際に、異なった力を有しうる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する、有核赤血球は、得られた、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、他の細胞型と識別される。軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの測定は上述されている。この方法は、有核赤血球と他の細胞型との、および妨害物質または細胞破片との識別をさらに強化するために多次元測定を利用する。多次元測定は、各次元、または異なった細胞型のための異なった次元の様々な組合せの識別力を利用する。
【００５５】
一実施形態では、有核赤血球を他の細胞型から効果的に識別するために、識別分析を提供する。より詳細には、上述の通り、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを得ると、最初に、中角散乱光シグナルの二次元解析をＤＣインピーダンス、軸方向光減失、または低角散乱光シグナルと併用して、有核赤血球および白血球から細胞破片が識別される。さらに、中角散乱光シグナル、およびＤＣインピーダンス、軸方向光減失、または低角散乱光シグナルの１つまたは複数の関数を細胞破片の識別に使用できる。識別に際して、細胞破片をゲートアウトして、もはや識別分析ステップに存在しないようにすることも、散布図で色標識するなど、同定することもできる。その後、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および低角散乱光シグナル、または上述のものなど、これらの１つもしくは複数の関数、または他の適した数学関数を用いた１つもしくは複数の二次元解析を用いて、有核赤血球を白血球と識別する。第２ステップでは、有核赤血球を白血球と識別するために、中角散乱光シグナルまたはその関数も、上述した１つまたは複数の他のシグナルと併用できる。
【００５６】
一例では、第１ステップで、図１１Ｂに示すＬＳ２対ＤＣ散布図から、細胞破片をゲートアウトすることができる。別法では、細胞破片を白血球および有核赤血球と識別するために、ＬＳ２およびＤＣの関数をＡＬＬと併用することができる。図１１Ｃは、上述した、血小板凝集塊を含有する臨床試料のＦ３対ＡＬＬ散布図を示す。本明細書中では、Ｆ３をＡｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ２）×Ｓ３と定義する。Ｓ３は、表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。Ａｔａｎは、数学関数であるアークタンジェントを表し、当業者には既知の標準方程式によって定義されている。図１１Ｃに示されている通り、細胞破片は、散布図における異なった領域に分布する。輪郭分析またはクラスター分析に際して、細胞破片をこの散布図からゲートアウトすることができる。細胞破片を分離した後、有核赤血球と白血球との識別分析は、図１１Ｄに示されている通り、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて実施できる。本明細書では、Ｆ４をＡｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ１）×Ｓ４と定義する。Ｓ４は表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。示されている通り、有核赤血球は、白血球から明確に分離される。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を計数する。この実施例では、輪郭分析またはクラスター分析が使用されているが、テンプレートマッチング、バレーサーチ（ｖａｌｌｅｙ ｓｅａｒｃｈ）またはダイレクトカット（ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｔ）などの他の一般的に使用されている集団識別技法も、細胞破片を識別し、ならびに有核赤血球を白血球と識別するのに使用できることを理解するべきである。
【００５７】
別の実施例では、第１ステップで、図１２Ｂに示されている通り、ＬＳ１対ＬＳ２散布図から細胞破片をゲートアウトすることができる。別法では、細胞破片を白血球および有核赤血球と識別するために、ＬＳ２およびＬＳ１の関数をＡＬＬと併用することができる。図１２Ｃは、上述した、鎌状赤血球を含有する臨床試料のＦ５対ＡＬＬ散布図を示す。本明細書では、Ｆ５をＡｔａｎ（ＬＳ２／ＬＳ１）×Ｓ５と定義する。Ｓ５は表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。示されている通り、細胞破片の分離は、この散布図でさらに強化することができ、細胞破片は、上述のクラスター分析または他の分化技法を用いて、この散布図からゲートアウトすることができる。上述の方法と同様に、細胞破片を分離した後、図１２Ｄで示されている通り、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて、有核赤血球を白血球と識別する識別分析を行うことができる。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球は、白血球と識別され、計数される。
【００５８】
さらに、有核赤血球の分化および計数に際して、上述した方法および／または様々な測定シグナルの追加関数を用いて、白血球をそれらの亜集団にさらに識別することができる。
【００５９】
別の実施形態では、上記方法が白血球数の補正をさらに含む。歴史的に、直流インピーダンス法を用いて白血球を計数する場合、有核赤血球も、白血球と識別されないので、白血球と共に計数されるか、または部分的に計数される。有核赤血球によって引き起こされる妨害は、過大な誤った白血球数をもたらしうる。伝統的には、ＷＢＣ数は、測定器から報告されたＷＢＣ数から、手作業の識別法によって得られた有核赤血球の数を引くことによって、手作業で補正される。本発明の方法では、白血球数へのこの集団の寄与を自動的に補正することができる。より詳細には、試料混合物中に残留している血球の総数を、以下に記載の装置を用い、上述した測定を用いて試料混合物の分析中に得ることができる。試料混合物中に残留している、検出閾値を超えた血球は、主として、白血球および存在しているならば有核赤血球を含めた有核血球、ならびに少量の細胞破片であることが知られている。上述の通り、有核赤血球および細胞破片を白血球と識別する際に、残留血球の総数から、有核赤血球および細胞破片を引くことによって、補正白血球数を得ることができる。補正されたＷＢＣは、血液分析機によって自動的に報告させることができ、検査技師は、さらなる手作業の補正を必要とされない。
【００６０】
有核血球を識別する上述の方法を可能にする装置は、（ａ）試料混合物の進入および進出のための入口手段および出口手段を含有する集束流フローセル、（ｂ）有核血球を含有する血球試料をフローセル入口に導入して、フローセルを通る有核血球の流れを引き起こす導入手段、（ｃ）その光線の軸が有核血球の流れに対して直角にフローセルを通過するように配置された入射光ビーム、（ｄ）軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体、ならびに（ｅ）細胞がフローセルの開口部を通過する際に、インピーダンスシグナルを測定するＤＣインピーダンス検出器を含有する。
【００６１】
上述の通り、軸方向光減失および低角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体は、いくつかの装置設計を有しうる。以下に記載する実施例１で使用される実験用血液分析機では、光学検出器集合体が２つの個別の光検出器を有する。すなわち、１つは軸方向光減失シグナル測定用であり、もう１つは低角散乱光シグナル測定用である。実施例５で使用される、中角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体は、中角散乱光シグナル測定用の３番目の光検出器を含有する。
【００６２】
一実施形態では、上記フローセルは、軸方向光減失、低角散乱光、中角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルの測定を可能にする、開口部の寸法が３０から２５０μｍの範囲にある正方形のフローセルでありうる。上記フローセルは、５０μｍの正方形のフローセルであることがより好ましい。正方形のフローセルは、正方形の横断切片を有する開口部を有し、正方形の外形を有する。上記測定には、他のフローセル配置、例えば、三角形、長方形、および多角形も使用できる。約１°から約７°までの範囲の低角散乱光シグナルが検出されることが好ましい。約４°から約６°までの低角散乱光シグナルが検出されることが、より好ましい。約２０°から約４５°までの範囲の中角散乱光シグナルが検出されることが好ましい。ＤＣインピーダンス検出器は、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第５１２５７３７号に詳細に記載されている。
【００６３】
さらに、上記装置は、試料混合物をフローセルを通して定量的に送達する容量型ポンプをさらに含有する。したがって、試料混合物の定量的細胞数を得ることができる。
【００６４】
以下の実施例は、本発明を例示的するものであり、いかなる意味でも、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。前述の開示に従って、他の様々な構成要素および部分も利用できることが理解されよう。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
末梢血とも呼ばれる抗凝血化全血試料１４μｌを、等張血液希釈液Ｉｓｏｔｏｎ（登録商標）３Ｅ（米国フロリダ州マイアミ（Ｍｉａｍｉ）所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品）６１４μＬで希釈し、実験用血液分析機の混合チャンバー中で溶解試薬１２５μＬと混合した。溶解試薬を添加した約９秒後に、有核赤血球の識別分析用に、シース液であるＩｓｏｔｏｎ（登録商標）３Ｅと共に試料混合物をフローセルに送達させた。上記溶解試薬は、赤血球の溶解用および有核赤血球の分析用の活性成分、すなわち３６ｇ／Ｌのドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（５０％溶液）および３．６ｇ／Ｌのテトラデシルトリメチルアンモニウムクロライドを含有し、ｐＨ約４を有する水溶液であった。
【００６６】
実験用血液分析機は、試料混合物中の細胞がフローセル内を通過した際のＤＣインピーダンス、低角散乱光、および軸方向光減失シグナルの検出系を装備していた。上記検出系は、上述のＤＣインピーダンス検出器および光学検出器集合体を含有していた。上記光学検出器集合体は、１．９±０．５°、３．０±０．５°、３．７±０．５°、５．１±０．５°、６．０±０．５°、および７．０±０．５°を含めた、入射光から１０°未満の様々な低角における散乱光シグナル、ならびに軸方向光減失（０°から０．５°）の検出を可能にするものであった。より詳細には、ＮＲＢＣを本発明における他の細胞型と識別するのに、５．１±０．５°における低角散乱光シグナルおよび軸方向光減失（０°から０．５°）を用いた。これらは、散布図で、それぞれＬＳ１およびＡＬＬと記述された。上記検出系を用いて、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および軸方向光減失を併せて検出することも、それらのうち１または２つを選択的に検出することもできよう。各赤血球が５０μｍフローセルの中を通過する際に、上記検出系によってそれを測定した。データは１２ビットのアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）の分解能で取得した。
【００６７】
図１Ａは、臨床血液試料から得られたＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。この図は、白血球および細胞破片と識別されるＮＲＢＣ集団のクラスターを示している。分析された試料のＮＲＢＣ濃度は、特定された有核赤血球の数を白血球（ＷＢＣ）で割って、１００を掛けることによって計算する。ＮＲＢＣ濃度は、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数として報告され、これは手作業の参照方法の単位と同じものである。この試料では、上述の方法を用いて得られた結果は７．８％であったが、これは参照方法と一致していた。
【００６８】
図２Ａは、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料から、上述の方法を用いて得られたＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この散布図に示されている通り、有核赤血球は、この場合も、白血球から、および細胞破片から明確に分離されたクラスターを形成した。
【００６９】
（実施例２）
実施例１で記載したものと同じ試薬および手順を用いて、新鮮な正常全血試料を分析した。図１Ｂは、得られた、正常血液試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、有核赤血球細胞が属する領域にはいかなる細胞集団も存在していなかった。
【００７０】
さらに、図１Ａおよび１Ｂに示されている通り、白血球は、４つの亜集団、すなわちリンパ球、単球、好中球、および好酸球にさらに分離された。
【００７１】
図２Ｂは、得られた、図１Ｂに示したものと同じ正常血液細胞のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合も、有核赤血球が属する領域にはいかなるクラスターも存在しなかった。
【００７２】
この場合も、図２Ａおよび２Ｂに示されている通り、白血球は、３つの亜集団、すなわちリンパ球、単球および好中球の合計、ならびに好酸球にさらに分離された。
【００７３】
（実施例３）
有核赤血球を含有する臨床全血試料、および新鮮な正常全血試料を、実施例１で記載した手順を用いて、実施例１で記載したものと同等な検出系を備えた別の実験用血液分析機で分析した。但し、データは１４ビットＡＤＣ分解能で取得した。用いた溶解試薬および希釈剤は、Ｌｙｓｅ Ｓ（登録商標）４およびＩｓｏｔｏｎ（登録商標）４（米国フロリダ州マイアミ所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品）であった。
【００７４】
得られた散布図を図５Ａから８Ｂに示す。図５Ａ、６Ａ、７Ａ、および８Ａに示されている通り、臨床試料中の有核赤血球は、それぞれＤＶ対ＡＬＬ、ＬＳ１対ＡＬＬ、Ｆ１対ＡＬＬ、およびＦ２対ＡＬＬで、白血球及び細胞破片から明確に分離する。正常血液試料から得られた図５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂに示されている通り、有核赤血球が属する領域にはいかなる細胞集団も存在しなかった。分解能が異なるので、図５Ａから８Ｂの散布図の軸スケールは図１Ａから４Ｂに示したものとは異なることが知られている。しかし、様々な集団相互の相対的位置は同じに維持されている。
【００７５】
（実施例４）
１３２の臨床試料を含めた総計３３６の全血試料を、実施例１で記載した手順および試薬を用いて分析した。ＮＲＢＣの結果は、Ｆ１対ＡＬＬ散布図を用いた識別分析から得た。前述の通り、Ｆ１はＤＣおよびＬＳ１の関数であり、（（ＤＣ＋ＬＳ１）／ＤＣ×１０００））に等しい。
【００７６】
参照ＮＲＢＣ値は、手作業の参照方法およびフローサイトメトリー法を用いて得た。手作業ＮＲＢＣ参照方法を用いた場合には、Ｗｒｉｇｈｔ染色法で染色した各試料の塗沫標本で２００細胞のＷＢＣを計数し、同じ領域に存在するＮＲＢＣの数を計数し、２で割った。この値をＮＲＢＣ／１００ＷＢＣとして報告する。フローサイトメトリー法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている「Ｎｅｗ Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｔｅｄ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３７巻、２９１〜３０１頁、１９９９年に記載されている。図９は、本発明の方法を用いて得られたＮＲＢＣ結果と、フローサイトメトリー参照法を用いたものとの間での良好な補正を示している。
【００７７】
（実施例５）
フローセル内を通過する細胞のＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを検出する検出系を備えた実験用血液分析機で、実施例１で記載した手順を用いて、様々な臨床全血試料を分析した。上記検出系では、ＤＣインピーダンス検出器、ならびに軸方向光減失および低角散乱光シグナルを検出するための光学検出器集合体の２つの光検出器は、実施例１で用いたものと同じであった。上記光学検出器集合体は、入射光から２０°から４３°までの範囲における中角散乱光シグナルを測定するための第３の光検出器をさらに含有していた。これはＬＳ２と呼ばれた。実施例１に記載の通り、血液試料を溶解および希釈するのに、Ｌｙｓｅ Ｓ（登録商標）４および等張血液希釈剤を用いた。等張血液希釈剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５９３５８５７号に記載されている。
【００７８】
一部の臨床全血試料は、鎌形赤血球、巨大赤血球、および血小板凝集塊を含有していた。図１１Ａおよび１１Ｂは、血小板凝集塊を含有する血液試料に特徴的な典型的な細胞破片分布を示す。図１１Ａは、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。示されている通り、細胞破片はリンパ球と重なり合っていた。図１１Ｂは、同じ血液試料のＬＳ２対ＤＣ散布図である。示されている通り、中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの二次元散布図を用いると、細胞破片は、有核赤血球および白血球から十分に分離された。図１１Ｃは、Ｆ３対ＡＬＬ散布図である。Ｆ３は、Ａｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ２）×Ｓ３と定義され、式中、Ｓ３は６００であった。示されている通り、細胞破片は、散布図における異なった領域に分布した。輪郭分析またはクラスター分析に際して、この散布図から細胞破片をゲートアウトした。細胞破片を分離した後、有核赤血球を白血球と識別する識別分析をＦ４対ＡＬＬ散布図で行った。Ｆ４は、Ａｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ１）×Ｓ４と定義され、式中、Ｓ４は６００であった。図１１Ｄに示されている通り、有核赤血球は白血球から明確に分離した。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を計数した。
【００７９】
図１２Ａ〜１２Ｄは、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料の様々な散布図を示す。図１２ＡはＬＳ１対ＤＣ散布図である。示されている通り、細胞破片は、有核赤血球および白血球の両方と重なり合っていた。図１２ＢはＬＳ１対ＬＳ２散布図である。示されている通り、中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球および白血球の両方からの細胞破片の分離が実質的に改善された。図１２ＣはＦ５対ＡＬＬ散布図を示す。Ｆ５は、Ａｔａｎ（ＬＳ２／ＬＳ１）×Ｓ５と定義され、式中、Ｓ５は６００であった。示されている通り、有核赤血球および白血球からの細胞破片の分離は、この散布図でさらに強化された。細胞破片をゲートアウトした後、図１２Ｄに示されている通り、有核赤血球を白血球と識別する識別分析を、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて行った。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を白血球と識別して、計数した。
【００８０】
特に好ましい実施形態に関して本発明を記載した。しかし、本発明の趣旨から逸脱せずに、様々な変化を加えることができ、そのような変化も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものであることが理解されよう。添付されている図面で本発明を詳細に説明し、図によって示したが、これらは、本発明の範囲を限定するものではなく、その好ましい実施形態の例示として理解するべきである。しかし、上記明細書に記載されおり、添付されている特許請求の範囲およびそれらの法的等価物に定義されている本発明の趣旨および範囲の中で、様々な改変および変化を加えることができることが明らかであろう。本明細書中に引用されたすべての特許および他の出版物を、参照により本明細書に明示的に組む。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて分析された臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。図１Ｂは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて分析された正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。
【図２】図２Ａは、図１Ａに示した臨床全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。図２Ｂは、図１Ｂに示した正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図３】図３Ａは、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図である。図３Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図４】図４Ａは、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図である。図４Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【図５】図５Ａは、実施例３に記載の試薬および方法を用いて分析された臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。図５Ｂは、実施例３に記載の試薬および方法を用いて分析された正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。
【図６】図６Ａは、図５Ａに示した臨床全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。図６Ｂは、図５Ｂに示した正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図７】図７Ａは、図５Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図である。図７Ｂは、図５Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図８】図８Ａは、図５Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図である。図８Ｂは、図５Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【図９】図９は、フローサイトメトリー参照方法で得られた結果と、実施例４に記載の本発明の方法で得られたものとの間の相関曲線である。
【図１０】図１０は、低角散乱光および軸方向光減失シグナルを処理する光学検出器集合体で使用された電気回路の略図である。
【図１１−１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、および１１Ｄは、それぞれ、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ、ＬＳ２対ＤＣ、Ｆ３対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１１−２】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、および１１Ｄは、それぞれ、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ、ＬＳ２対ＤＣ、Ｆ３対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１２−１】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、それぞれ、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、Ｆ５対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１２−２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、それぞれ、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、Ｆ５対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年２月１日に出願された出願番号第１１／０４８，０８６号の一部継続出願である。出願番号第１１／０４８，０８６号は、２００４年２月１０日に出願された仮特許出願第６０／５４３，１６２号の米国特許法１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。これらの特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、光学測定およびインピーダンス測定によって有核赤血球を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
正常な末梢血は、無核の成熟赤血球を含有する。有核赤血球（ＮＲＢＣ）すなわち赤芽球は、未熟な赤血球である。それらは通常、骨髄内に存在し、末梢血中には存在しない。しかし、貧血および白血病など、ある種の疾患では、有核赤血球が末梢血中にも存在する。したがって、ＮＲＢＣの測定は臨床で重要である。伝統的には、有核赤血球の識別および計数は手作業で行われる。その方法は、顕微鏡スライド上に血液試料を塗沫し、そのスライドを染色するステップと、それに続いて、個々のスライドを手作業で画像分析するステップとを含む。有核赤血球濃度は、１００細胞の白血球（ＷＢＣ）あたりのＮＲＢＣの数として報告される。通常は、血液塗抹標本上の同じ領域に存在する２００細胞の白血球と、ＮＲＢＣの数とを計数し、その数を２で割って、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数としてＮＲＢＣ濃度を表す。このアプローチは非常に時間がかかり、同時に、スライドを分析する個人の解釈によって主観的となる。
【０００４】
近年、有核赤血球を識別するためのいくつかの蛍光フローサイトメトリー法が開発された。これらの方法は、有核赤血球を他の細胞型と識別するのに核特異的な染色法を利用するが、これは、有核赤血球を、それらの電気的または光学的特性に基づいてのみ識別するのが困難であるためである。
【０００５】
特許文献１（Ｉｎａｍｉら）は、有核赤血球を識別する蛍光法を開示する。この方法は、第１液および第２液を用いた２工程染色を用いる。Ｉｎａｍｉらは、有核赤血球内に拡散して、それらの核を特異的に染色する赤芽球染色色素を第１液に含有させ、次いで二次元プロット上で有核赤血球の群を他の細胞群から分離し、それによってＮＲＢＣ識別の結果が計算されることを教示した。
【０００６】
特許文献２（Ｋｉｍら）は、有核赤血球および白血球のフローサイトメトリー分析の方法を開示する。この方法は、有核赤血球細胞核を生体核染色に曝露するために、全血試料から赤血球およびＮＲＢＣ細胞質を溶解させ、白血球内への生体核染色の浸潤を最小限にすること、ならびに蛍光および２通りの角度の散乱光を測定することによって試料を分析することを含む。この方法は、破片からのシグナル（蛍光および非蛍光）を遮断し、軸方向光減失（ＡＬＬ）トリガーより下で、かつ蛍光トリガー（ＦＬ３）より上の範囲にあるシグナルをＮＲＢＣとして特定するトリプルトリガー法（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を特徴とする。この方法では、ＮＲＢＣと白血球の識別を得るために、試薬を４２℃にまで暖める必要がある。
【０００７】
特許文献３（Ｋｉｍら）は、有核赤血球をサブクラスに分類するための多目的溶解試薬を用いる方法を開示する。この方法は、核染色物を含有する多目的溶解試薬で血液試料を溶解させるステップと、昇温温度で試料混合物をインキュベートするステップと、ＮＲＢＣを含めた有核血球を自動化された電気光学的血液計測手段で測定するステップとを含む。
【０００８】
特許文献４（Ｋｉｍら）は、血液試料中のＮＲＢＣ、白血球（ＷＢＣ）、損傷白血球、および白血球亜集団をフローサイトメトリーによって識別する方法を開示する。この方法は、血液試料を溶解させるステップと、有核赤血球およびいかなる損傷白血球も生体核染色で染色するステップと、蛍光、軸方向光減失、および３°から１０°までの散乱光シグナルを測定することによって試料混合物を分析するステップと、蛍光および散乱光シグナルからの三次元プロットを構築するステップと、ＷＢＣ、ＮＲＢＣ、損傷ＷＢＣ、およびＷＢＣサブクラス相違を識別および計数するステップとを含む。
【０００９】
特許文献５は、有核赤血球を識別および計数するための試薬および方法を開示する。この方法は、赤血球を溶解させるステップと、白血球および有核赤血球を染色するステップと、少なくとも１つの散乱光パラメータおよび少なくとも１つの蛍光パラメータを測定することによって試料をアッセイするステップとを含む。
【００１０】
上述の方法は、蛍光および散乱光測定を併せることによって有核赤血球および白血球の識別および計数を可能にする。しかし、蛍光測定は、複雑かつ高価な検出方法である。
【００１１】
特許文献６（Ｌｉら）は、有核赤血球を識別する方法を開示する。この方法は、成熟赤血球を溶解させるステップと、散乱光測定によってフローセル中の試料を分析して、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップとを含む。散乱光測定は、１０°未満の２通りの角度の低角散乱光シグナルを用いることによって行い。この方法は、電気的および光学的分析を用いた白血球の同時識別をさらに含み、上記電気的分析がＤＣインピーダンス測定である。
【００１２】
特許文献７（Ｌｉら）は、有核赤血球を他の細胞型と識別するために、２通りの角度の散乱光測定を用いる方法であって、第１の散乱光シグナルが低角散乱光シグナルであり、第２の散乱光シグナルが中角または直角散乱光シグナルである方法をさらに開示する。
【００１３】
特許文献８（Ｌｉら）はまた、有核赤血球を識別する方法を開示する。この方法は、血液試料中の赤血球を溶解試薬で溶解させるステップと、非集束流開口部（ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓｅｄ ｆｌｏｗ ａｐｅｒｔｕｒｅ）におけるＤＣインピーダンス測定によって有核血球を測定するステップと、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血液試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。
【００１４】
特許文献９（Ｈｕｏら）は、血液試料の第１アリコートおよび第２アリコートを、それぞれ第１の溶解試薬系および第２の溶解試薬系で別々に溶解させ；第１の試料混合物を、ＤＣインピーダンス、ラジオ周波数、および散乱光測定によってフローセルで測定し；非集束流開口部におけるＤＣインピーダンス測定によって、第２の試料混合物中の細胞分布を測定し、残留血球を計数し；それぞれ第１の試料混合物の測定および第２の試料混合物の測定から得られた血球分布パターンを分析し；複合分析をさらに行って、ＮＲＢＣを他の細胞型と識別し、血液試料中のＮＲＢＣの数を決定することによって有核赤血球を識別する方法を教示する。
【００１５】
有核赤血球のサイズ、散乱光、および蛍光特性によって測定した場合、他の細胞型からのものと、シグナルが潜在的に重なり合うため、有核赤血球を他の細胞型（特に白血球）と識別するのは技術的に困難であることが知られている。従来技術の検出系および検出方法は、測定の費用、簡単さ、および効率に関してさらに改善することができる。
【００１６】
さらに、ある種の細胞型および／または細胞性物質は、有核赤血球測定を妨害する傾向があることが知られている。測定に使用される検出方法に応じて、妨害物質が相違しうる。例えば、有核赤血球を測定するのに蛍光測定を用いる場合には、老化した白血球が測定を妨げる傾向がある。これは、試料混合物を調製するのに使用される試薬によって、それらが溶解される傾向があり、溶解された白血球の核が有核赤血球と重なりあう傾向があるためである。有核赤血球を測定するのに散乱光およびインピーダンス測定を用いる場合、巨大血小板、血小板凝集塊、および鎌状赤血球が妨害を引き起こしうることが見いだされている。これは、上記測定のうちの１つまたは複数において、これらの物質が有核赤血球と重なり合う可能性があるためである。
【特許文献１】米国特許第５，２９８，４２６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５５９，０３７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４８，２２５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８７９，９００号明細書
【特許文献５】欧州特許第１００４８８０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８７４，３１０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９１７，５８４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４１０，３３０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，４７２，２１５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以上のことに基づいて、有核赤血球を識別および計数するための、単純で、より安価で、それでもなお信頼できる検出方法および装置の必要性が依然として存在している。とりわけ妨害物質の存在下における、測定精度のさらなる改善の必要性も存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
一実施形態では、本発明は、血球試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。中角散乱光シグナルは、約１５°から約７０°までの範囲、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲で測定する。有核赤血球と他の細胞型との識別には、上記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数、上記軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を用いることができる。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、血球試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に上記血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。上記低角散乱光シグナルは、１０°未満、好ましくは約１°から約７°までの範囲で測定する。有核赤血球と上記他の細胞型との識別は、上記中角散乱光および低角散乱光シグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数、上記軸方向光減失および低角散乱光シグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を使用しうる。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は血液試料中の有核赤血球を測定する方法を対象とする。上記方法は、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル中の上記試料混合物を分析するステップと、得られた軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。有核赤血球と上記他の細胞型との識別は、上記軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記軸方向光減失および低角散乱光シグナルの関数、上記低角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数、上記中角散乱光および低角散乱光シグナルの関数、上記中角散乱光および軸方向光減失シグナルの関数上記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および低角散乱光シグナルの関数、上記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルの関数、上記軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの関数、またはこれらの組合せを含めた１つまたは複数の関数を使用しうる。
【００２１】
さらに別の実施形態では、本発明は、有核赤血球を他の細胞型と識別する識別分析法を対象とする。ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを得ると、まず、他の１つまたは複数の測定シグナルと併せた中角散乱光シグナルまたはその関数を用いて、細胞破片を有核赤血球および白血球と識別し、低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、有核赤血球を白血球と識別する。細胞破片には、血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、または未溶解赤血細胞膜が含まれる。上記方法は、血液試料の補正白血球数を取得および報告するステップをさらに含む。
【００２２】
後に続く「発明を実施するための最良の形態」から、よりよく理解されるであろうが、本発明は、核染色および高価な蛍光検出法を使用せずに、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、ならびに低角および中角散乱光の測定を利用した有核赤血球の識別を提供するという点で、従来技術と比較して特に有利である。この方法の追加の特徴は、それが、有核赤血球を様々な妨害物質とさらに識別するために、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、または軸方向光減失の測定と共に中角散乱光の測定を併用することである。本発明は、後に続く「発明を実施するための最良の形態」から、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
一実施形態では、本発明は、軸方向光減失測定およびＤＣインピーダンス測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。上記方法は、成熟赤血球を溶解させる試薬系に血球試料を曝露するステップと、軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルを測定することによって、フローセル中の試料を分析するステップと、軸方向光減失およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、上記血球試料中の有核赤血球を報告するステップとを含む。
【００２４】
上記有核赤血球の測定は、光学測定およびインピーダンス測定を用いて、集束流フローセル中で行う。血球などの粒子がフローセルの開口部を通過する際に、それは、照射供給源からの入射光を散乱させ、全方向への散乱光の放射を引き起こす。散乱光シグナルは、入射光ビームとの相対における、０°から１８０°の間の様々な角度で、光検出器によって検出できる。各細胞集団は、大なり小なり、異なった散乱光特性を有することが見出されており、それを様々な細胞集団の識別に利用することができる。入射光から１０°未満に検出される散乱光シグナルは、一般的に低角散乱光と呼ばれる。低角散乱光の特徴は、細胞の内容物と共に、細胞のサイズによっても影響されることである。
【００２５】
軸方向光減失（ＡＬＬ、前方消光としても知られている）は、概ね、粒子が入射光ビームを通過することによる光エネルギーの減少であり、光検出器によって検出される。入射光ビームが粒子にあたると、光は散乱するか、吸収される。それらは両方とも入射光からエネルギーを除去し、入射ビームは減衰する。この減衰は消光と呼ばれる。入射光のビームの軸に沿って見た場合、それは軸方向光減失と呼ばれる。通常、ＡＬＬシグナルは、入射光からの約０°から約１°までの角度で検出される。本発明の好ましい実施形態では、入射光軸から約０．５°未満の環状領域でＡＬＬシグナルを収集する。ＡＬＬシグナルは、細胞のサイズに強く影響される。
【００２６】
軸方向光減失測定は入射光ビームからのエネルギー減失を測定し、一方、低角散乱光測定は光の増大を測定するので、これら２つの異なった光学特性を測定するには、異なった電子回路が必要である。図１０に示す通り、ＡＬＬシグナルを測定するのに使用される電子回路は反転増幅器を用い、一方、低角散乱光シグナルを測定するのに使用される電子回路は非反転増幅器を用いる。
【００２７】
ＡＬＬおよび低角散乱光シグナルを測定するには、光学検出器集合体を用いる。本発明の目的には、多数のデザインの光学検出装置が使用できる。一実施形態では、光学検出器集合体がプリント回路基板（ＰＣＢ）上に配置された適切なサイズおよび幾何学的配置の２つの個別な光検出器を含有する。一方の光検出器は、ＡＬＬシグナルを測定するのに使用され、もう一方の光検出器は、低角散乱光シグナルを測定するのに使用される。光検出器からのシグナルは、以下に記載する、実験用血液分析機内の条件付け回路（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）に送られる。別の実施形態では、光学検出器集合体は、ＡＬＬおよび散乱光シグナルを測定するのに適したサイズおよび幾何学的配置感知領域を有するプラナーフォトダイオードアレイを含有する。フォトダイオードアレイからのシグナルは、実験用血液分析機内の条件付け回路に送られる。さらに別の実施形態では、光学検出器集合体は、ＡＬＬおよび散乱光シグナルを測定するための光ファイバーアレイを含有する。適した光ファイバーアレイは、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第６７９８５０８号に詳細に記載されている。別の実施形態では、光学検出器集合体は、入射光から約１５°から約７０°まで、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲内の中角散乱光シグナルを検出する光検出器を含有する。
【００２８】
一方、伝導性溶液中に懸濁された粒子または血球がフローセルを通過する際に、インピーダンス変化により電気的シグナルを測定することができる。パルス波形、高さ、および幅は、粒子のサイズに直接的に関係しており、測定された粒子のサイズに変換することができる。異なったサイズの２つ以上の粒子が測定された場合、測定から得られた頻度ヒストグラムによって、粒子のサイズ分布を表すことができる。ＤＣインピーダンス測定装置を備えた血液分析機による血球計算およびサイズ決定に用いられる検出方法は、概ね、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第２６５６５０８号、第３８１００１１号、および第５１２５７３７号に記載されている。
【００２９】
本発明の目的で血液試料を溶解させるのに適した試薬系の１つには、米国特許第４５２１５１８号、第４５２８２７４号、第５９３５８５７号に記載の希釈剤などの等張血液希釈剤、ならびに米国特許第５７６３２８０号、第５８３４３１５号、および第６５７３１０２に記載の溶解試薬などの溶解試薬が含まれ、これらの開示を参照により全体として本明細書に組み込む。別法では、上記試薬系は、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第５８８２９３４号に記載の等張溶解試薬でもありうる。この試薬は、血液試料を希釈し、同時に、後続の分析用に赤血球を溶解する。
【００３０】
実施例１は、軸方向光減失およびＤＣインピーダンス測定を用いて、有核赤血球を識別する方法を例示する。図１Ａは、実施例１に記載の試薬および手順を用いて処理および分析された、有核赤血球を含有する臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から分離されるクラスターを形成する。
【００３１】
図１Ｂは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。容易に見て取れるように、有核赤血球が属する領域にはいかなる細胞集団も存在しない。考察の便宜上、この領域をＮＲＢＣ領域と呼ぶ。異なった散布図では、ＮＲＢＣ領域が散布図内の異なった部分でありうることが知られている。
【００３２】
試料のＮＲＢＣ濃度は、特定されたＮＲＢＣクラスター（図１Ａ）内の細胞数を白血球（ＷＢＣ）の数で割り、その商に１００を掛けることによって計算できる。ＮＲＢＣ濃度は、手作業の参照方法の単位と同じ、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数値として報告でき、または全血１マイクロリットル（μＬ）あたりのＮＲＢＣの絶対数としても報告できる。
【００３３】
さらに、図１Ａおよび１Ｂに示されている通り、軸方向光減失およびＤＣインピーダンス測定を用いて、白血球は、４つの亜集団にさらに識別される。上記４つの亜集団には、リンパ球、単球、好中球、および好酸球が含まれる。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失測定および低角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失および低角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失シグナルおよび低角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。低角散乱光シグナルは、好ましくは１０°未満、より好ましくは約１°から約７°、最も好ましくは約４°から約６°で測定される。
【００３５】
図２Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＡＬＬ対ＬＳ１（５．１°における散乱光）散布図を示す。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離されるクラスターを形成する。
【００３６】
図２Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合も、有核赤血球が属する領域にはいかなるクラスターも存在しない。
【００３７】
さらに、図２Ａおよび２Ｂに示されている通り、軸方向光減失および低角散乱光測定を用いて、白血球は３つの亜集団にさらに識別される。上記３つの亜集団には、リンパ球、単球および好中球の合計、ならびに好酸球が含まれる。
【００３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンス測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失、低角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。低角散乱光シグナルは、前述のものと同じ範囲、すなわち約１°から約７°、より好ましくは約４°から約６°で測定する。
【００３９】
より詳細には、一実施形態では、軸方向光減失シグナルと、低角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの関数とを用いることによって、散布図を構築する。一例として、図３Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合、関数Ｆ１は（（ＤＣ＋ＬＳ１）／ＤＣ×１０００）に等しい。示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離する。図３Ｂは、図１Ｂで示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【００４０】
別の例として、図４Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて得られた、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。この場合、関数Ｆ２は（ＤＣ／（ＤＣ＋ＬＳ１）×１０００）に等しい。この散布図に示されている通り、有核赤血球は、白血球から、および細胞破片から明確に分離する。図４Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【００４１】
他の細胞型からの有核赤血球の分離は、ＤＣおよびＬＳ１の関数を用いることによって、さらに強化されたことが、図３Ａおよび４Ａによって示された例示から明らかである。
【００４２】
別法ではＤＣ、ＬＳ１、およびＡＬＬの１つまたは複数の関数を用いて、他の細胞型からの有核赤血球の分離を強化できることが見いだされた。さらに、上記に論じた、有核赤血球を識別するためにＤＣおよびＡＬＬを用いる実施形態、ならびにＡＬＬおよび低角散乱光測定を用いる実施形態では、他の細胞型からの有核赤血球の分離をさらに強化するために、ＤＣおよびＡＬＬの１つまたは複数の関数、またはＡＬＬおよびＬＳ１の１つまたは複数の関数を利用することができる。
【００４３】
実施例３は、有核赤血球を他の細胞型と識別するのに、異なった試薬系および前述の本発明の方法を用いる別の例を例示する。図５Ａ、６Ａ、７Ａ、および８Ａに示されている通り、有核赤血球は、それぞれＤＶ対ＡＬＬ、ＬＳ１対ＡＬＬ、Ｆ１対ＡＬＬ、およびＦ２対ＡＬＬで、白血球および細胞破片から明確に分離される。
【００４４】
上述の通り、有核赤血球は、それらを蛍光測定で測定した場合でさえ、他の細胞型、とりわけ白血球と重なりあう可能性がある。本発明の方法は、この特定の未成熟な赤血細胞集団を計数するために、複数のパラメータおよびそれらの関数を用いて、有核赤血球の識別を強化する。
【００４５】
図９に示し、実施例４に記載する通り、実施例１に記載の方法および試薬を用いて、１３２の臨床標本を含めた合計３３６の全血試料を分析した。ＮＲＢＣの結果は、Ｆ１対ＡＬＬ散布図を用いた識別分析から得た。図９は、下記に記載のフローサイトメトリー参照方法の結果と、本発明の方法を用いて得られた結果との間の線形相関を図示する。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られたＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および中角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。本明細書で言及する中角散乱光シグナルは、入射光からの約１５°から約７０°まで、好ましくは約２０°から約４５°までの範囲で測定できる。
【００４７】
代替の実施形態では、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法は、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光測定を併用する。この実施形態では、溶解された血液試料を、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによってフローセル内で分析する。有核赤血球は、得られた軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いることによって、他の細胞型と識別される。軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの測定は上述されている。
【００４８】
中角散乱光シグナルを、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、または軸方向光減失シグナルと併用した二次元分析は、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのにとりわけ有効であることが見いだされた。さらに、中角散乱光、ＤＣインピーダンス、および軸方向光減失シグナルの組合せ、または中角散乱光、低角散乱光、および軸方向光減失シグナルの組合せも、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのに有効である。さらに、中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの１つまたは複数の関数、中角散乱光および低角散乱光シグナルの１つまたは複数の関数、または中角散乱光および軸方向光減失シグナルの１つまたは複数の関数も、細胞破片を白血球および／または有核赤血球と識別するのに使用できる。
【００４９】
上記細胞破片は、血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、および未溶解赤血細胞膜を含有すると特定されており、したがって、これらの細胞性物質を一般に細胞破片と呼ぶ。通常、正常血液試料およびほとんどの臨床血液試料では、溶解された際に、わずかな量の細胞破片が存在し、それは白血球と同様に有核赤血球から分離される。しかし、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、および鎌状赤血球の存在下では、これらの物質が、本発明の、１つまたは複数の有核赤血球測定方法を妨害しうる。したがって、それらは妨害物質とも呼ばれる。
【００５０】
妨害は、２通りの異なった様式で引き起こされうることが見出されている。一様式では、細胞破片は、ＮＲＢＣ領域に伸長し、有核赤血球と重なり合う可能性があり、それによって、ＮＲＢＣ計数の直接的上昇が引き起こされる。ＮＲＢＣ測定へのこの型の妨害は、血液試料が有核赤血球を含有しようが含有しまいが、存在しうることを理解するべきである。血液試料がいかなる有核赤血球も含有しない場合でも、なお、妨害物質はＮＲＢＣ領域に伸長し、試料がＮＲＢＣ試料として報告される可能性があり、それにより偽陽性報告が引き起こされる。別の様式では、細胞破片が白血球、とりわけリンパ球と重なり合う可能性がある。この状況では、白血球の測定数が誤りとなりうる。有核赤血球を計算および報告するのに、１００ＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数として、白血球数が用いられる場合、この比率は、ＷＢＣに関する誤りによって影響されうる。妨害物質の出自、例えば、血小板凝集塊か、鎌状赤血球かに応じて、細胞破片の分布パターンは、散布図中で相違しうるものであり、上記に論じた妨害のいずれか、または両方が存在しうる。
【００５１】
上述の通り、中角散乱光測定を他の測定またはその関数と併用して強化された、白血球および／または有核赤血球からの細胞破片の分離は、妨害物質の存在下における、白血球および／または有核赤血球からの細胞破片の分離を補助し、これらの物質が有核赤血球の測定を妨害するのを防止できる。
【００５２】
実施例５は、妨害物質を含有する臨床血液試料の有核赤血球測定と、中角散乱光および他の測定を用いた、有核赤血球および／または白血球からの妨害物質の改善された分離とを例示する。図１１Ａは、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、細胞破片はリンパ球と重なり合っている。図１１Ｂは、同じ血液試料のＬＳ２（２０°から４３°）対ＤＣ散布図を示す。示されている通り、中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球および白血球の両方から、細胞破片が明確に分離される。
【００５３】
図１２Ａは、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ散布図を示す。示されている通り、細胞破片は有核赤血球および白血球と重なり合う。図１２Ｂは、同じ血液試料のＬＳ１対ＬＳ２散布図を示す。示されている通り、有核赤血球および白血球の両方からの細胞破片の分離は、中角散乱光シグナルを用いることによって、実質的に改善される。当業者には理解できるように、細胞破片の分布パターンは、血小板凝集塊の存在下と、鎌状赤血球の存在下とでは相違している。ＬＳ２対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、もしくはＡＬＬ対ＬＳ２などの異なった測定、またはこれらのシグナルの関数は、異なった型の妨害物質を識別する際に、異なった力を有しうる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明は、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光測定を併用して、有核赤血球を他の細胞型と識別する方法を提供する。この実施形態では、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、溶解された血液試料をフローセル内で分析する、有核赤血球は、得られた、軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、他の細胞型と識別される。軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの測定は上述されている。この方法は、有核赤血球と他の細胞型との、および妨害物質または細胞破片との識別をさらに強化するために多次元測定を利用する。多次元測定は、各次元、または異なった細胞型のための異なった次元の様々な組合せの識別力を利用する。
【００５５】
一実施形態では、有核赤血球を他の細胞型から効果的に識別するために、識別分析を提供する。より詳細には、上述の通り、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを得ると、最初に、中角散乱光シグナルの二次元解析をＤＣインピーダンス、軸方向光減失、または低角散乱光シグナルと併用して、有核赤血球および白血球から細胞破片が識別される。さらに、中角散乱光シグナル、およびＤＣインピーダンス、軸方向光減失、または低角散乱光シグナルの１つまたは複数の関数を細胞破片の識別に使用できる。識別に際して、細胞破片をゲートアウトして、もはや識別分析ステップに存在しないようにすることも、散布図で色標識するなど、同定することもできる。その後、ＤＣインピーダンス、軸方向光減失、および低角散乱光シグナル、または上述のものなど、これらの１つもしくは複数の関数、または他の適した数学関数を用いた１つもしくは複数の二次元解析を用いて、有核赤血球を白血球と識別する。第２ステップでは、有核赤血球を白血球と識別するために、中角散乱光シグナルまたはその関数も、上述した１つまたは複数の他のシグナルと併用できる。
【００５６】
一例では、第１ステップで、図１１Ｂに示すＬＳ２対ＤＣ散布図から、細胞破片をゲートアウトすることができる。別法では、細胞破片を白血球および有核赤血球と識別するために、ＬＳ２およびＤＣの関数をＡＬＬと併用することができる。図１１Ｃは、上述した、血小板凝集塊を含有する臨床試料のＦ３対ＡＬＬ散布図を示す。本明細書中では、Ｆ３をＡｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ２）×Ｓ３と定義する。Ｓ３は、表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。Ａｔａｎは、数学関数であるアークタンジェントを表し、当業者には既知の標準方程式によって定義されている。図１１Ｃに示されている通り、細胞破片は、散布図における異なった領域に分布する。輪郭分析またはクラスター分析に際して、細胞破片をこの散布図からゲートアウトすることができる。細胞破片を分離した後、有核赤血球と白血球との識別分析は、図１１Ｄに示されている通り、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて実施できる。本明細書では、Ｆ４をＡｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ１）×Ｓ４と定義する。Ｓ４は表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。示されている通り、有核赤血球は、白血球から明確に分離される。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を計数する。この実施例では、輪郭分析またはクラスター分析が使用されているが、テンプレートマッチング、バレーサーチ（ｖａｌｌｅｙ ｓｅａｒｃｈ）またはダイレクトカット（ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｔ）などの他の一般的に使用されている集団識別技法も、細胞破片を識別し、ならびに有核赤血球を白血球と識別するのに使用できることを理解するべきである。
【００５７】
別の実施例では、第１ステップで、図１２Ｂに示されている通り、ＬＳ１対ＬＳ２散布図から細胞破片をゲートアウトすることができる。別法では、細胞破片を白血球および有核赤血球と識別するために、ＬＳ２およびＬＳ１の関数をＡＬＬと併用することができる。図１２Ｃは、上述した、鎌状赤血球を含有する臨床試料のＦ５対ＡＬＬ散布図を示す。本明細書では、Ｆ５をＡｔａｎ（ＬＳ２／ＬＳ１）×Ｓ５と定義する。Ｓ５は表示スケール係数であり、望ましい機器表示スケールに基づいて選択できる。示されている通り、細胞破片の分離は、この散布図でさらに強化することができ、細胞破片は、上述のクラスター分析または他の分化技法を用いて、この散布図からゲートアウトすることができる。上述の方法と同様に、細胞破片を分離した後、図１２Ｄで示されている通り、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて、有核赤血球を白血球と識別する識別分析を行うことができる。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球は、白血球と識別され、計数される。
【００５８】
さらに、有核赤血球の分化および計数に際して、上述した方法および／または様々な測定シグナルの追加関数を用いて、白血球をそれらの亜集団にさらに識別することができる。
【００５９】
別の実施形態では、上記方法が白血球数の補正をさらに含む。歴史的に、直流インピーダンス法を用いて白血球を計数する場合、有核赤血球も、白血球と識別されないので、白血球と共に計数されるか、または部分的に計数される。有核赤血球によって引き起こされる妨害は、過大な誤った白血球数をもたらしうる。伝統的には、ＷＢＣ数は、測定器から報告されたＷＢＣ数から、手作業の識別法によって得られた有核赤血球の数を引くことによって、手作業で補正される。本発明の方法では、白血球数へのこの集団の寄与を自動的に補正することができる。より詳細には、試料混合物中に残留している血球の総数を、以下に記載の装置を用い、上述した測定を用いて試料混合物の分析中に得ることができる。試料混合物中に残留している、検出閾値を超えた血球は、主として、白血球および存在しているならば有核赤血球を含めた有核血球、ならびに少量の細胞破片であることが知られている。上述の通り、有核赤血球および細胞破片を白血球と識別する際に、残留血球の総数から、有核赤血球および細胞破片を引くことによって、補正白血球数を得ることができる。補正されたＷＢＣは、血液分析機によって自動的に報告させることができ、検査技師は、さらなる手作業の補正を必要とされない。
【００６０】
有核血球を識別する上述の方法を可能にする装置は、（ａ）試料混合物の進入および進出のための入口手段および出口手段を含有する集束流フローセル、（ｂ）有核血球を含有する血球試料をフローセル入口に導入して、フローセルを通る有核血球の流れを引き起こす導入手段、（ｃ）その光線の軸が有核血球の流れに対して直角にフローセルを通過するように配置された入射光ビーム、（ｄ）軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体、ならびに（ｅ）細胞がフローセルの開口部を通過する際に、インピーダンスシグナルを測定するＤＣインピーダンス検出器を含有する。
【００６１】
上述の通り、軸方向光減失および低角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体は、いくつかの装置設計を有しうる。以下に記載する実施例１で使用される実験用血液分析機では、光学検出器集合体が２つの個別の光検出器を有する。すなわち、１つは軸方向光減失シグナル測定用であり、もう１つは低角散乱光シグナル測定用である。実施例５で使用される、中角散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器集合体は、中角散乱光シグナル測定用の３番目の光検出器を含有する。
【００６２】
一実施形態では、上記フローセルは、軸方向光減失、低角散乱光、中角散乱光、およびＤＣインピーダンスシグナルの測定を可能にする、開口部の寸法が３０から２５０μｍの範囲にある正方形のフローセルでありうる。上記フローセルは、５０μｍの正方形のフローセルであることがより好ましい。正方形のフローセルは、正方形の横断切片を有する開口部を有し、正方形の外形を有する。上記測定には、他のフローセル配置、例えば、三角形、長方形、および多角形も使用できる。約１°から約７°までの範囲の低角散乱光シグナルが検出されることが好ましい。約４°から約６°までの低角散乱光シグナルが検出されることが、より好ましい。約２０°から約４５°までの範囲の中角散乱光シグナルが検出されることが好ましい。ＤＣインピーダンス検出器は、参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第５１２５７３７号に詳細に記載されている。
【００６３】
さらに、上記装置は、試料混合物をフローセルを通して定量的に送達する容量型ポンプをさらに含有する。したがって、試料混合物の定量的細胞数を得ることができる。
【００６４】
以下の実施例は、本発明を例示的するものであり、いかなる意味でも、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。前述の開示に従って、他の様々な構成要素および部分も利用できることが理解されよう。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
末梢血とも呼ばれる抗凝血化全血試料１４μｌを、等張血液希釈液Ｉｓｏｔｏｎ（登録商標）３Ｅ（米国フロリダ州マイアミ（Ｍｉａｍｉ）所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品）６１４μＬで希釈し、実験用血液分析機の混合チャンバー中で溶解試薬１２５μＬと混合した。溶解試薬を添加した約９秒後に、有核赤血球の識別分析用に、シース液であるＩｓｏｔｏｎ（登録商標）３Ｅと共に試料混合物をフローセルに送達させた。上記溶解試薬は、赤血球の溶解用および有核赤血球の分析用の活性成分、すなわち３６ｇ／Ｌのドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（５０％溶液）および３．６ｇ／Ｌのテトラデシルトリメチルアンモニウムクロライドを含有し、ｐＨ約４を有する水溶液であった。
【００６６】
実験用血液分析機は、試料混合物中の細胞がフローセル内を通過した際のＤＣインピーダンス、低角散乱光、および軸方向光減失シグナルの検出系を装備していた。上記検出系は、上述のＤＣインピーダンス検出器および光学検出器集合体を含有していた。上記光学検出器集合体は、１．９±０．５°、３．０±０．５°、３．７±０．５°、５．１±０．５°、６．０±０．５°、および７．０±０．５°を含めた、入射光から１０°未満の様々な低角における散乱光シグナル、ならびに軸方向光減失（０°から０．５°）の検出を可能にするものであった。より詳細には、ＮＲＢＣを本発明における他の細胞型と識別するのに、５．１±０．５°における低角散乱光シグナルおよび軸方向光減失（０°から０．５°）を用いた。これらは、散布図で、それぞれＬＳ１およびＡＬＬと記述された。上記検出系を用いて、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および軸方向光減失を併せて検出することも、それらのうち１または２つを選択的に検出することもできよう。各赤血球が５０μｍフローセルの中を通過する際に、上記検出系によってそれを測定した。データは１２ビットのアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）の分解能で取得した。
【００６７】
図１Ａは、臨床血液試料から得られたＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。この図は、白血球および細胞破片と識別されるＮＲＢＣ集団のクラスターを示している。分析された試料のＮＲＢＣ濃度は、特定された有核赤血球の数を白血球（ＷＢＣ）で割って、１００を掛けることによって計算する。ＮＲＢＣ濃度は、ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの数として報告され、これは手作業の参照方法の単位と同じものである。この試料では、上述の方法を用いて得られた結果は７．８％であったが、これは参照方法と一致していた。
【００６８】
図２Ａは、図１Ａで示したものと同じ臨床全血試料から、上述の方法を用いて得られたＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この散布図に示されている通り、有核赤血球は、この場合も、白血球から、および細胞破片から明確に分離されたクラスターを形成した。
【００６９】
（実施例２）
実施例１で記載したものと同じ試薬および手順を用いて、新鮮な正常全血試料を分析した。図１Ｂは、得られた、正常血液試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図を示す。示されている通り、有核赤血球細胞が属する領域にはいかなる細胞集団も存在していなかった。
【００７０】
さらに、図１Ａおよび１Ｂに示されている通り、白血球は、４つの亜集団、すなわちリンパ球、単球、好中球、および好酸球にさらに分離された。
【００７１】
図２Ｂは、得られた、図１Ｂに示したものと同じ正常血液細胞のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。この場合も、有核赤血球が属する領域にはいかなるクラスターも存在しなかった。
【００７２】
この場合も、図２Ａおよび２Ｂに示されている通り、白血球は、３つの亜集団、すなわちリンパ球、単球および好中球の合計、ならびに好酸球にさらに分離された。
【００７３】
（実施例３）
有核赤血球を含有する臨床全血試料、および新鮮な正常全血試料を、実施例１で記載した手順を用いて、実施例１で記載したものと同等な検出系を備えた別の実験用血液分析機で分析した。但し、データは１４ビットＡＤＣ分解能で取得した。用いた溶解試薬および希釈剤は、Ｌｙｓｅ Ｓ（登録商標）４およびＩｓｏｔｏｎ（登録商標）４（米国フロリダ州マイアミ所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品）であった。
【００７４】
得られた散布図を図５Ａから８Ｂに示す。図５Ａ、６Ａ、７Ａ、および８Ａに示されている通り、臨床試料中の有核赤血球は、それぞれＤＶ対ＡＬＬ、ＬＳ１対ＡＬＬ、Ｆ１対ＡＬＬ、およびＦ２対ＡＬＬで、白血球及び細胞破片から明確に分離する。正常血液試料から得られた図５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂに示されている通り、有核赤血球が属する領域にはいかなる細胞集団も存在しなかった。分解能が異なるので、図５Ａから８Ｂの散布図の軸スケールは図１Ａから４Ｂに示したものとは異なることが知られている。しかし、様々な集団相互の相対的位置は同じに維持されている。
【００７５】
（実施例４）
１３２の臨床試料を含めた総計３３６の全血試料を、実施例１で記載した手順および試薬を用いて分析した。ＮＲＢＣの結果は、Ｆ１対ＡＬＬ散布図を用いた識別分析から得た。前述の通り、Ｆ１はＤＣおよびＬＳ１の関数であり、（（ＤＣ＋ＬＳ１）／ＤＣ×１０００））に等しい。
【００７６】
参照ＮＲＢＣ値は、手作業の参照方法およびフローサイトメトリー法を用いて得た。手作業ＮＲＢＣ参照方法を用いた場合には、Ｗｒｉｇｈｔ染色法で染色した各試料の塗沫標本で２００細胞のＷＢＣを計数し、同じ領域に存在するＮＲＢＣの数を計数し、２で割った。この値をＮＲＢＣ／１００ＷＢＣとして報告する。フローサイトメトリー法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている「Ｎｅｗ Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｔｅｄ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３７巻、２９１〜３０１頁、１９９９年に記載されている。図９は、本発明の方法を用いて得られたＮＲＢＣ結果と、フローサイトメトリー参照法を用いたものとの間での良好な補正を示している。
【００７７】
（実施例５）
フローセル内を通過する細胞のＤＣインピーダンス、軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを検出する検出系を備えた実験用血液分析機で、実施例１で記載した手順を用いて、様々な臨床全血試料を分析した。上記検出系では、ＤＣインピーダンス検出器、ならびに軸方向光減失および低角散乱光シグナルを検出するための光学検出器集合体の２つの光検出器は、実施例１で用いたものと同じであった。上記光学検出器集合体は、入射光から２０°から４３°までの範囲における中角散乱光シグナルを測定するための第３の光検出器をさらに含有していた。これはＬＳ２と呼ばれた。実施例１に記載の通り、血液試料を溶解および希釈するのに、Ｌｙｓｅ Ｓ（登録商標）４および等張血液希釈剤を用いた。等張血液希釈剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５９３５８５７号に記載されている。
【００７８】
一部の臨床全血試料は、鎌形赤血球、巨大赤血球、および血小板凝集塊を含有していた。図１１Ａおよび１１Ｂは、血小板凝集塊を含有する血液試料に特徴的な典型的な細胞破片分布を示す。図１１Ａは、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。示されている通り、細胞破片はリンパ球と重なり合っていた。図１１Ｂは、同じ血液試料のＬＳ２対ＤＣ散布図である。示されている通り、中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルの二次元散布図を用いると、細胞破片は、有核赤血球および白血球から十分に分離された。図１１Ｃは、Ｆ３対ＡＬＬ散布図である。Ｆ３は、Ａｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ２）×Ｓ３と定義され、式中、Ｓ３は６００であった。示されている通り、細胞破片は、散布図における異なった領域に分布した。輪郭分析またはクラスター分析に際して、この散布図から細胞破片をゲートアウトした。細胞破片を分離した後、有核赤血球を白血球と識別する識別分析をＦ４対ＡＬＬ散布図で行った。Ｆ４は、Ａｔａｎ（ＤＣ／ＬＳ１）×Ｓ４と定義され、式中、Ｓ４は６００であった。図１１Ｄに示されている通り、有核赤血球は白血球から明確に分離した。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を計数した。
【００７９】
図１２Ａ〜１２Ｄは、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料の様々な散布図を示す。図１２ＡはＬＳ１対ＤＣ散布図である。示されている通り、細胞破片は、有核赤血球および白血球の両方と重なり合っていた。図１２ＢはＬＳ１対ＬＳ２散布図である。示されている通り、中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球および白血球の両方からの細胞破片の分離が実質的に改善された。図１２ＣはＦ５対ＡＬＬ散布図を示す。Ｆ５は、Ａｔａｎ（ＬＳ２／ＬＳ１）×Ｓ５と定義され、式中、Ｓ５は６００であった。示されている通り、有核赤血球および白血球からの細胞破片の分離は、この散布図でさらに強化された。細胞破片をゲートアウトした後、図１２Ｄに示されている通り、有核赤血球を白血球と識別する識別分析を、Ｆ４対ＡＬＬ散布図を用いて行った。輪郭分析またはクラスター分析に際して、有核赤血球を白血球と識別して、計数した。
【００８０】
特に好ましい実施形態に関して本発明を記載した。しかし、本発明の趣旨から逸脱せずに、様々な変化を加えることができ、そのような変化も、添付された特許請求項の範囲に包含されるものであることが理解されよう。添付されている図面で本発明を詳細に説明し、図によって示したが、これらは、本発明の範囲を限定するものではなく、その好ましい実施形態の例示として理解するべきである。しかし、上記明細書に記載されおり、添付されている特許請求の範囲およびそれらの法的等価物に定義されている本発明の趣旨および範囲の中で、様々な改変および変化を加えることができることが明らかであろう。本明細書中に引用されたすべての特許および他の出版物を、参照により本明細書に明示的に組む。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて分析された臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。図１Ｂは、実施例１に記載の試薬および方法を用いて分析された正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。
【図２】図２Ａは、図１Ａに示した臨床全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。図２Ｂは、図１Ｂに示した正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図３】図３Ａは、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図である。図３Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図４】図４Ａは、図１Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図である。図４Ｂは、図１Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【図５】図５Ａは、実施例３に記載の試薬および方法を用いて分析された臨床全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。図５Ｂは、実施例３に記載の試薬および方法を用いて分析された正常全血試料のＤＣ対ＡＬＬ散布図である。
【図６】図６Ａは、図５Ａに示した臨床全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図である。図６Ｂは、図５Ｂに示した正常全血試料のＬＳ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図７】図７Ａは、図５Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図である。図７Ｂは、図５Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ１対ＡＬＬ散布図を示す。
【図８】図８Ａは、図５Ａに示したものと同じ臨床全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図である。図８Ｂは、図５Ｂに示したものと同じ正常全血試料のＦ２対ＡＬＬ散布図を示す。
【図９】図９は、フローサイトメトリー参照方法で得られた結果と、実施例４に記載の本発明の方法で得られたものとの間の相関曲線である。
【図１０】図１０は、低角散乱光および軸方向光減失シグナルを処理する光学検出器集合体で使用された電気回路の略図である。
【図１１−１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、および１１Ｄは、それぞれ、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ、ＬＳ２対ＤＣ、Ｆ３対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１１−２】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、および１１Ｄは、それぞれ、血小板凝集塊を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＡＬＬ、ＬＳ２対ＤＣ、Ｆ３対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１２−１】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、それぞれ、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、Ｆ５対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【図１２−２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄは、それぞれ、鎌状赤血球を含有する臨床血液試料のＬＳ１対ＤＣ、ＬＳ１対ＬＳ２、Ｆ５対ＡＬＬ、およびＦ４対ＡＬＬ散布図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露して、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップで、前記中角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失とＤＣインピーダンスシグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露し、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記低角散乱光シグナルを１０°未満で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記低角散乱光シグナルを約１°から約７°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、前記中角散乱光と低角散乱光シグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失と低角散乱光シグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露し、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記低角散乱光シグナルを１０°未満で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記低角散乱光シグナルを約１°から約７°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップで、前記軸方向光減失とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記軸方向光減失と低角散乱光シグナルの関数、前記低角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光と低角散乱光シグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および低角散乱光シグナルの関数、前記軸方向光減失と、ＤＣインピーダンスと、中角散乱光シグナルの関数、前記軸方向光減失と、低角散乱光と、中角散乱光シグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、
前記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、細胞破片を前記有核赤血球および前記白血球と識別するステップと、
前記低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、前記有核赤血球を前記白血球と識別するステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、
前記中角散乱光、ＤＣインピーダンス、および軸方向光減失シグナルを用いて、細胞破片を前記有核赤血球および前記白血球と識別するステップと、
前記低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、前記有核赤血球を前記白血球と識別するステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞破片が血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、または未溶解赤血細胞膜を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
白血球亜集団を識別および報告するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）における前記試料混合物中の残留血球数を得るステップと、前記有核赤血球および細胞破片を前記残留血球数から減算して、補正白血球数を得るステップと、前記血液試料中の前記補正白血球数を報告するステップとをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露して、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップで、前記中角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失とＤＣインピーダンスシグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露し、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記低角散乱光シグナルを１０°未満で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記低角散乱光シグナルを約１°から約７°までの範囲で測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、前記中角散乱光と低角散乱光シグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失と低角散乱光シグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
血球試料中の有核赤血球を測定する方法であって、
（ａ）試薬系に前記血球試料を曝露し、成熟赤血球を溶解させ、試料混合物を形成させるステップと、
（ｂ）軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを測定することによって、フローセル内の前記試料混合物を分析するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、低角散乱光、および中角散乱光シグナルを用いて、有核赤血球を他の細胞型と識別するステップと、
（ｄ）前記血球試料中の有核赤血球を報告するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記中角散乱光シグナルを約１５°から約７０°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記中角散乱光シグナルを約２０°から約４５°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記低角散乱光シグナルを１０°未満で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記低角散乱光シグナルを約１°から約７°までの範囲で測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップで、前記軸方向光減失とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記軸方向光減失と低角散乱光シグナルの関数、前記低角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光とＤＣインピーダンスシグナルの関数、前記中角散乱光と低角散乱光シグナルの関数、前記中角散乱光と軸方向光減失シグナルの関数、前記軸方向光減失、ＤＣインピーダンス、および低角散乱光シグナルの関数、前記軸方向光減失と、ＤＣインピーダンスと、中角散乱光シグナルの関数、前記軸方向光減失と、低角散乱光と、中角散乱光シグナルの関数、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された１つまたは複数の関数を用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、
前記中角散乱光およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、細胞破片を前記有核赤血球および前記白血球と識別するステップと、
前記低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、前記有核赤血球を前記白血球と識別するステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記有核赤血球を他の細胞型と識別するステップが、
前記中角散乱光、ＤＣインピーダンス、および軸方向光減失シグナルを用いて、細胞破片を前記有核赤血球および前記白血球と識別するステップと、
前記低角散乱光、軸方向光減失、およびＤＣインピーダンスシグナルを用いて、前記有核赤血球を前記白血球と識別するステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞破片が血小板、大型血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、鎌状赤血球、または未溶解赤血細胞膜を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
白血球亜集団を識別および報告するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）における前記試料混合物中の残留血球数を得るステップと、前記有核赤血球および細胞破片を前記残留血球数から減算して、補正白血球数を得るステップと、前記血液試料中の前記補正白血球数を報告するステップとをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【公表番号】特表２００９−５２４８２２（Ｐ２００９−５２４８２２Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５２３０６（Ｐ２００８−５５２３０６）
【出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６１８４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７０９４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０７３１６７８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６１８４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８７０９４
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０７３１６７８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (34)
【Ｆターム（参考）】
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