有機ポリマー粒子およびその製造方法
【課題】カルボキシル基を利用して、抗体または抗原等のタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い有機ポリマー粒子およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】有機ポリマー粒子は下記式（１）で表される構造を有する。
【化１】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【解決手段】有機ポリマー粒子は下記式（１）で表される構造を有する。
【化１】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い有機ポリマー粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機ポリマー粒子および磁性粒子は、例えば、感染症・癌マーカー・ホルモン等の検査対象物質の検出を行なうため、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相として用いられている。このような診断薬においては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が粒子上に固定化される。サンプル中の検査対象物質は一次プローブを介して粒子上に捕捉された後、第二の検査用プローブと反応する。第二の検査用プローブ（二次プローブ）は蛍光物質や酵素で標識されており、蛍光や酵素反応によって検出が行われる。
【０００３】
近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。
【０００４】
これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、粒子上に結合した一次プローブであるタンパクのコンフォメーションが変化するなどの原因で、結合後の一次プローブの活性が維持できないことが挙げられる。
従来、このような一次プローブの活性を維持する方法として、一次プローブの結合時に多価アルコールを共存させたり、粒子に結合したハイブリッドタンパクを介して一次プローブを結合させたりする方法が開示されている（特許文献１，２）。しかしながら、一次プローブの結合時に多価アルコールを共存させる方法では、一次プローブの活性が不十分になる。また、ハイブリッドタンパクを介する方法は、製造が煩雑で高コストとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３０４３８６号公報
【特許文献２】国際公開第９７／３５９６４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い有機ポリマー粒子およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、水に難溶性のカルボン酸モノマーを含む重合体からなる有機ポリマー粒子が、生化学・医薬品分野で特出する高感度を発現することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）で表される構造を有する。
【化４】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【０００９】
この場合、前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１０】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（２）で表される構造を有する。
【化５】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【００１１】
この場合、前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１２】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（３）で表される構造を有する。
【化６】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【００１３】
この場合、前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１４】
上記有機ポリマー粒子は磁性体を含有することができる。
【００１５】
上記有機ポリマー粒子において、粒子の表面は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）と、他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体から構成されることができる。
【００１６】
この場合、核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子と、前記母粒子を覆うように設けられた前記共重合体からなる共重合体層と、を含むことができる。
【００１７】
上記有機ポリマー粒子はタンパク結合用であることができる。
【００１８】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子の製造方法は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造およびエチレン性不飽和基を有する化合物を含むモノマー部を重合する工程を有する。
【発明の効果】
【００１９】
上記有機ポリマー粒子によれば、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い。
【００２０】
上記有機ポリマー粒子は、一次プローブを結合させた後の一次プローブの活性が高いため、診断薬などに応用したときに高感度を発現する。このため、上記有機ポリマー粒子は、診断薬などの用途に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子およびその製造方法について説明する。
【００２２】
１．有機ポリマー粒子およびその製造方法
１．１．有機ポリマー粒子の構成
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する特定の構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）（以下、単に「カルボン酸モノマー（Ａ）」ともいう。）に由来するカルボキシル基を有する。ここで、化合物（Ａ）に由来するカルボキシル基とは、カルボン酸モノマー（Ａ）に含まれるカルボキシル基をいう。
【００２３】
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー性粒子は、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下のカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有することができる。カルボン酸モノマー（Ａ）は、１分子中にラジカル重合性の不飽和二重結合とカルボキシル基とを有することができる。
【００２４】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は例えば、少なくとも表面がポリマー部からなり、このポリマー部は、カルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を含有することができる。この場合、ポリマー部は、カルボン酸モノマー（Ａ）を重合して形成されたものであってもよく、あるいは、カルボン酸モノマー（Ａ）および他の共重合可能なモノマー（Ｂ）からなるモノマー部を重合して形成された共重合体であってもよい。
【００２５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、全体がポリマー部から構成されていてもよいし、あるいは、コア・シェル構造を有していて、ポリマー部がシェルであってもよい。
【００２６】
例えば、常用されるアクリル酸やメタクリル酸などの水への溶解度が高いカルボン酸モノマーを重合してポリマー部を形成する場合、水溶性のポリマーが生成しやすく、このような水溶性ポリマーが粒子表面に結合または吸着していると、粒子表面に結合した生体関連物質（例えばタンパク）の活性部位を立体的に阻害したり、結合した生体関連物質（例えばタンパク）のコンフォメーションをポリカルボン酸のチャージによって破壊したりして、活性を低下させる結果、感度が低下すると推測される。
【００２７】
これに対して、本実施形態に係る有機ポリマー性粒子によれば、特定のカルボン酸モノマーを使用してポリマー部が形成されていることにより、水溶性ポリマーが生成しにくい
ため、高感度を発現すると推測される。
【００２８】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、カルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基は、高感度を発現する因子であり、かつ、水溶性カルボジイミドなどを用いたエステル化またはアミド化による公知の活性化により、検査用プローブ（一次プローブ）（例えばタンパク）の結合を容易にする。一次プローブとして使用可能であるタンパクおよびその結合方法については後述する。
【００２９】
カルボン酸モノマー（Ａ）は、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、最も好ましくは５質量％以下である。カルボン酸モノマー（Ａ）の２５℃における水への溶解度が２０質量％を超えると高感度を発現しない。
【００３０】
本発明において、２５℃におけるモノマーの水への溶解度は、対象となるモノマーを２５℃の蒸留水に少量ずつ添加し、攪拌したとき、モノマーが分離する直前の水溶液中のモノマーの質量％である。
【００３１】
カルボン酸モノマー（Ａ）としては、例えば、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸（２−（meth）acryloyloxyethyl succinate）、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸（２−（meth）acryloyloxyethyl phthalate）、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸（２−（meth）acryloyloxyethyl hexahydrophthalate
）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸（２−（meth）acryloyloxypropyl succinate）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸（２−（meth）acryloyloxypropyl phthalate）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸（２−（meth）acryloyloxypropyl hexahydrophthalate）などの（メタ）アクリル酸誘導体；ｐ−ビニル安息香酸、ビニルフェニル酢酸などの芳香族系誘導体；ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸が挙げられる。これらのカルボン酸モノマー（Ａ）のうち、高感度が得られ、かつ、重合が容易であることから、好ましくは（メタ）アクリル酸誘導体であり、より好ましくはヒドロキシアルキル（メタ）アクリレートとジカルボン酸とのモノエステル化物であり、さらに好ましくは２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸であり、最も好ましくは２−メタクリロイロキシエチルフタル酸である。
【００３２】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）ないし（３）で表される構造を有することができる。
【００３３】
【化７】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【化８】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【化９】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【００３４】
一般式（１）において、ＡまたはＢで表されるアルキリデン基としては、例えば、エチリデン基，イソプロピリデン基，イソブチリデン基等が挙げられ、ＡまたはＢで表されるアルキレン基としては、例えば、メチレン基，ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基等が挙げられ、Ａで表されるシクロヘキシレン基としては、例えば、１，２−シクロヘキシレン基，１，３−シクロヘキシレン基，１，４−シクロヘキシレン基等が挙げられ、Ａで表されるフェニレン基としては、例えば、１，２−フェニレン基，１，３−フェニレン基，１，４−フェニレン基等が挙げられる。このうち、Ｂで表されるアルキレン基がジメチレン基またはトリメチレン基であるのが好ましい。
【００３５】
一般式（２）において、Ｄで表されるアルキレン基としては、例えば、ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、ノナメチレン基、ウンデカメチレン基、トリデカメチレン基等が挙げられる。
【００３６】
一般式（３）において、Ｅで表されるアルキリデン基としては、例えば、エチリデン基，イソプロピリデン基，イソブチリデン基等が挙げられ、アルキレン基としては、例えば、メチレン基，ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【００３７】
上記式（１）ないし（３）で表される構造は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）に含まれる構造であってもよい。
【００３８】
例えば、前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００３９】
また、例えば、前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００４０】
さらに、例えば、前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００４１】
上記式（１）ないし（３）で表される構造は粒子表面において、結合した生体関連物質（例えばタンパク）の活性部位を立体的に阻害したり、結合した生体関連物質（例えばタンパク）のコンフォメーションを破壊したりすることがないため、高感度を発現することができる。
【００４２】
なお、本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、下記式（１）ないし（３）で表される構造のうち少なくとも１つを有することができる。
【００４３】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）ないし（３）で表される構造を少なくとも表面に有することができ、上述のポリマー部が該構造を有していることが好ましい。
【００４４】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子のポリマー部において、カルボキシル基の量は、該粒子の固形分に対して、好ましくは１〜３００μｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２〜２００μｍｏｌ／ｇであり、最も好ましくは５〜１００μｍｏｌ／ｇである。カルボキシル基の量が１μｍｏｌ／ｇ未満では、一次プローブの結合が困難になることがあり、一方、３００μｍｏｌ／ｇを超えると、非特異吸着が増加する場合がある。カルボキシル基の水素イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオンなどの陽イオンで置換されていても良い。
【００４５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子の数平均粒径（以下、単に「粒径」という。）は、好ましくは、０．０１〜１５μｍであり、さら好ましくは０．０３〜１０μｍであり、最も好ましくは０．０５〜１０μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求めることができる。ここで、粒径が０．０１μｍ未満の場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、タンパクや核酸等の生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１５μｍを超えると、比表面積が小さくなり、生理活性物質の捕捉量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
【００４６】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、通常、適当な分散媒に分散させて用いられる。使用できる分散媒としては、有機ポリマー粒子を溶解したり、あるいは、有機ポリマー粒子を膨潤させたりしない分散媒が好ましい。好ましい分散媒としては、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで、水系媒体とは、水、または水と水に混和する有機溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体等）との混合物をいう。
【００４７】
１．２．有機ポリマー粒子の製造
１．２．１．モノマー部の組成
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、モノマー部を重合して得られるポリマー部を形成することにより製造することができる。以下、モノマー部を構成する各モノマーについて説明する。
【００４８】
１．２．１−１．カルボン酸モノマー（Ａ）
カルボン酸モノマー（Ａ）の種類については、上述の通りである。
【００４９】
使用するモノマー部中におけるカルボン酸モノマー（Ａ）の比率は、モノマー部１００
質量％中に好ましくは２質量％以上であり、さらに好ましくは５質量％以上である。モノマー部中のカルボン酸モノマー（Ａ）の比率が２質量％未満であると、一次プローブの結合が困難になることがある。
【００５０】
１．２．１−２．他の共重合可能なモノマー（Ｂ）
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）としては、非架橋性（単官能）モノマー、架橋性（多官能）モノマーのいずれも使用することができ、これらを併用してもよい。
【００５１】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）のうち、非架橋性（単官能）モノマーとしては、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレートなどの親水性官能基を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミドなどの親水性モノマー、および、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルを例示することができる。
【００５２】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）のうち、架橋性（多官能）モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。さらに、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。
【００５３】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）として、本発明の効果の発現を妨げない範囲で、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などの水への溶解度が２０質量％を超えるカルボン酸モノマーを使用しても良い。
【００５４】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）の量は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）以外の残余の量である。
【００５５】
１．２．２．重合方法
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合等の定法を用いて製造が可能である。より具体的には、本発明の一実施形態の有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、本発明の一実施形態の有機ポリマー粒子は、特公昭５７−２４３６９号公報記載のシード粒子（母粒子）を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９８３年（Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ Ｅｄ． ２１，９３７（１９８３））記載の重合方法、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、および特開昭６１−２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。これらの方法の中では、シード粒子（核粒子）を用いる二段膨潤重合法が、粒径の変動係数を小さくすることができるため好ましい。シード粒子（核粒子）は、ポリスチレンまたはスチレン系共重合体等を用いることができる。そして、二段膨潤重合法により追加されるポリマー部は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）の単独重合体、あるいは、カルボン酸モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）の共重合体からなる。
【００５６】
上記モノマー部の重合の際に使用可能な乳化剤としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩などのアニオン系界面活性剤；アルキルアミン塩、アルキル四級アミン塩などのカチオン系界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ブロック型ポリエーテルなどのノニオン系界面活性剤；カルボン酸型（例えば、アミノ酸型、ベタイン酸型など）、スルホン酸型などの両性界面活性剤、商品名で、ラテムルＳ−１８０Ａ、ＰＤ−１０４〔花王社製〕、エレミノールＪＳ−２〔三洋化成社製〕、アクアロンＨＳ−１０、ＫＨ−１０、ＲＮ−１０、ＲＮ−２０、ＲＮ−３０、ＲＮ−５０〔第一工業製薬社製〕、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ、ＳＲ−１０、ＮＥ−２０、ＮＥ−３０、ＮＥ−４０〔旭電化工業社製〕、Ａｎｔｏｘ ＭＳ−６０〔日本乳化剤社製〕などの反応性乳化剤などのいずれでも使用可能である。特に、反応性乳化剤を用いると、粒子の分散性に優れるため好ましい。また、親水性基を有するポリマーのうち分散機能を有するものも乳化剤として使用することができる。このようなポリマーとしては、スチレン・マレイン酸共重合体、スチレン・アクリル酸共重合体、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリコール、ポリイソプレンのスルホン化物、水添スチレン・ブタジエン共重合体のスルホン化物、スチレン・マレイン酸共重合体のスルホン化物、スチレン・アクリル酸共重合体のスルホン化物などを挙げることができる。これらの乳化剤は、１種単独であるいは２種以上を併用することができる。乳化剤の使用量は特に限定されるものではないが、モノマー部として使用するモノマーの合計量１００重量部に対し、通常、０．１〜５０重量部であり、好ましくは０．２〜２０重量部であり、さらに好ましくは０．５〜５重量部である。０．１重量部未満では、乳化が充分でなく、ラジカル重合時の安定性が低下し好ましくない。一方、５０重量部を超えると、泡立ちが問題となり好ましくない。
【００５７】
モノマー部の重合の際に使用されるラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシマレイン酸、コハク酸パーオキサイド、２，２’−アゾビス〔２−Ｎ−ベンジルアミジノ〕プロパン塩酸塩などの水溶性開始剤；ベンゾイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、クミルパーオキシネオデカノエート、クミルパーオキシオクトエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性開始剤；酸性亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、アスコルビン酸などの還元剤を併用したレドックス系開始剤などが使用できる。
【００５８】
１．３．磁性体を含有する有機ポリマー粒子およびその製造
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、磁性体を含有する有機ポリマー粒子（以下、「磁性体含有有機ポリマー粒子」という。）であってもよい。磁性体含有有機ポリマー粒子は、例えば遠心分離器等を用いずに、磁石を用いて分離することができるため、被検体からの粒子の分離工程を簡素化または自動化することができる点で有用である。
【００５９】
磁性体含有有機ポリマー粒子は、（Ｉ）有機ポリマー等の非磁性体の連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマー等の非磁性体をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマー等の非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子の２次凝集体層（磁性体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層の有機ポリマー層をシェルとする粒子等が挙げられる。これらの中では、（ＩＩＩ）前記磁性体微粒子の２次凝集体層を含む母粒子をコアとし、有機ポリマー層をシェルとする粒子が好ましい。なお、各種構造の磁性体含有有機ポリマー粒子に用いる有機ポリマーのうち、コア・シェル型粒子のコア部分を除いて、粒子最表面を形成するポリマーは、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下のカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有することが必要である。
【００６０】
最も好ましい磁性体含有有機ポリマー粒子においては、核粒子と、この核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子を覆うように、有機ポリマー層が設けられている。ここで、有機ポリマー層は上述の製造方法により得られる。すなわち、有機ポリマー層は、カルボン酸モノマー（Ａ）を含むモノマー部を重合して得られる。また、この有機ポリマー層は、カルボン酸モノマー（Ａ）と他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体層であることが好ましい。
【００６１】
ここで、有機ポリマー層の膜厚は０．０１μｍ以上であることが好ましい。有機ポリマー層の膜厚が０．０１μｍ以上であることにより、超常磁性微粒子が漏れ出るのを防止することができる。
【００６２】
核粒子の表面に超常磁性微粒子の磁性体層が形成された母粒子の製造方法としては、例えば、非磁性の有機ポリマー粒子と超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製することができる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいは、ジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性の有機ポリマー粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から自ずと決定される。本実施形態に係る粒子で使用する超常磁性微粒子は、例えば、粒子径５〜２０ｎｍ程度のフェライトおよび／またはマグネタイトの微粒子が好適に使用できる。
【００６３】
より具体的な重合方法については、特開２００４−２０５４８１号公報等に開示されている通りである。
【００６４】
１．４．用途
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用でき、特に、抗原または抗体等の一次プローブとしてのタンパクを結合させた免疫検査用のタンパク結合粒子として、特出する高感度を発現することができる。
【００６５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、検査対象となる物質は、免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生体関連物質および化学物質である。本発明において、生体関連物質とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク（例えば、酵素、抗体、アプタマー、受容体等）、ペプチド（例えばグルタチオン等）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞等）等が挙げられる。
【００６６】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子によれば、カルボキシル基を有するポリマー部が粒子の表面に導入されているため、実際に使用するにあたり、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤によりカルボキシル基を活性化し、一次プローブと粒子とを混合することで、一次プローブを粒子の表面に化学的に結合させることができる。
【００６７】
一次プローブを粒子の表面に結合させた後、過剰の一次プローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性化カルボキシル基を不活化する。また、一次プローブを粒子の表面に結合させた後、通常行われるブロッキングの操作をしてもよく、上述の不活化工程において、アルブミン等のブロッキング剤を併用してもかまわない。以降は、粒子を用いた通常の分析工程に移行すればよい。
【００６８】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子に担持することができるプローブはタンパクであり、このうち抗原または抗体が好ましい。この場合、抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗トロンビン＝アンチトロンビン複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクロブロブリン検査用抗β２−ミクロブロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【００６９】
２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００７０】
２．１．評価方法
２．１．１．粒径
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、粒子の数平均粒径およびその変動係数を測定した。
【００７１】
２．１．２．カルボキシル基含有量
粒子１ｇ（固形分）を含む水分散体を用いて、特開平１０−２７０２３３号公報に記載された電導度滴定によって、見かけの表面荷電量を求め、さらに、分散媒（水）のみを用いた同様の測定でバックグラウンドの荷電量を求め、これらの荷電量の差から、粒子のカルボキシル基含有量を求めた。
【００７２】
２．１．３．ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定）
抗ＡＦＰ抗体を感作させた、後述する各実施例・比較例で得られた粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名：Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）を用いた。
【００７３】
２．２．実施例１
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」２ｇを１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０ｇに混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３ｇおよび水４１ｇの入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器でスチレン９６ｇおよびジビニルベンゼン４ｇを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００ｇに乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、８０℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これを核粒子とする（核粒子の作製）。数平均粒径は１．５μｍであった。
【００７４】
次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【００７５】
次いで、上記核粒子１５ｇおよび上記疎水化された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子を得た（母粒子の作製）。
【００７６】
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５質量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５質量％を含む水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５質量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５質量％を含む水溶液７５ｇに、モノマー部としてシクロヘキシルメタクリレート１２ｇおよび２−メタクリロイロキシエチルフタル酸３ｇと、ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇとを入れて超音波で分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後、７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。以上の工程により、コアである母粒子を覆う共重合体層を形成した。磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉ）とする。なお、２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の２５℃における水への溶解度は、０．２質量％未満である。
【００７７】
この粒子（ｉ）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は９μｍｏｌ／ｇであった。
【００７８】
次に、この粒子（ｉ）１０ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。次に、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１００μｇを加え１８時間室温で反応した。反応後、粒子を磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したタンパク結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。このタンパク結合粒子を用いて、化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、この粒子（ｉ）のシグナル強度は１５２８０９（ＲＩＵ）であった。
【００７９】
２．３．実施例２
２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の代わりに２−メタクリロイロキシエチルコハク酸を用いた以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉｉ）とする。なお、２−メタクリロイロキシエチルコハク酸の２５℃における水への溶解度は、０．２質量％未満である。
【００８０】
この粒子（ｉｉ）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は１２μｍｏｌ／ｇであった。
【００８１】
次に、実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉｉ）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉｉ）のシグナル強度は１４９２５０（ＲＩＵ）であった。
【００８２】
２．４．比較例１
２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の代わりにメタクリル酸を用いた以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉ’）とする。なお、メタクリル酸の２５℃における水への溶解度は、１００質量％である。
【００８３】
この粒子（ｉ’）の粒径は２．２μｍであり、カルボキシル基含有量は１６μｍｏｌ／ｇであった。
【００８４】
次に、実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉ’）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉ’）のシグナル強度は５５５９１（ＲＩＵ）であった。
【００８５】
以上の結果から、実施例１、２で得られた粒子（ｉ）および（ｉｉ）は、特定の構造を有するカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有するため、比較例１で得られた粒子（ｉ’）と比較して感度が高いことが理解できる。
【００８６】
２．５．参考例１
シクロヘキシルメタクリレート１４．９ｇおよび２−メタクリロイロキシエチルフタル酸０．１ｇを使用した以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分
散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉｉ’）とする。
【００８７】
この粒子（ｉｉ’）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は２μｍｏｌ／ｇであった。
【００８８】
実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉｉ’）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉｉ’）のシグナル強度は５６４４３（ＲＩＵ）であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い有機ポリマー粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機ポリマー粒子および磁性粒子は、例えば、感染症・癌マーカー・ホルモン等の検査対象物質の検出を行なうため、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相として用いられている。このような診断薬においては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が粒子上に固定化される。サンプル中の検査対象物質は一次プローブを介して粒子上に捕捉された後、第二の検査用プローブと反応する。第二の検査用プローブ（二次プローブ）は蛍光物質や酵素で標識されており、蛍光や酵素反応によって検出が行われる。
【０００３】
近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。
【０００４】
これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、粒子上に結合した一次プローブであるタンパクのコンフォメーションが変化するなどの原因で、結合後の一次プローブの活性が維持できないことが挙げられる。
従来、このような一次プローブの活性を維持する方法として、一次プローブの結合時に多価アルコールを共存させたり、粒子に結合したハイブリッドタンパクを介して一次プローブを結合させたりする方法が開示されている（特許文献１，２）。しかしながら、一次プローブの結合時に多価アルコールを共存させる方法では、一次プローブの活性が不十分になる。また、ハイブリッドタンパクを介する方法は、製造が煩雑で高コストとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３０４３８６号公報
【特許文献２】国際公開第９７／３５９６４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い有機ポリマー粒子およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、水に難溶性のカルボン酸モノマーを含む重合体からなる有機ポリマー粒子が、生化学・医薬品分野で特出する高感度を発現することを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）で表される構造を有する。
【化４】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【０００９】
この場合、前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１０】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（２）で表される構造を有する。
【化５】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【００１１】
この場合、前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１２】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子は、下記式（３）で表される構造を有する。
【化６】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【００１３】
この場合、前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来することができる。
【００１４】
上記有機ポリマー粒子は磁性体を含有することができる。
【００１５】
上記有機ポリマー粒子において、粒子の表面は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）と、他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体から構成されることができる。
【００１６】
この場合、核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子と、前記母粒子を覆うように設けられた前記共重合体からなる共重合体層と、を含むことができる。
【００１７】
上記有機ポリマー粒子はタンパク結合用であることができる。
【００１８】
本発明の一態様に係る有機ポリマー粒子の製造方法は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造およびエチレン性不飽和基を有する化合物を含むモノマー部を重合する工程を有する。
【発明の効果】
【００１９】
上記有機ポリマー粒子によれば、カルボキシル基を利用して、抗体または抗原などのタンパクをはじめとする生体関連物質と化学結合することができ、かつ、結合した生体関連物質の検出感度が高い。
【００２０】
上記有機ポリマー粒子は、一次プローブを結合させた後の一次プローブの活性が高いため、診断薬などに応用したときに高感度を発現する。このため、上記有機ポリマー粒子は、診断薬などの用途に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子およびその製造方法について説明する。
【００２２】
１．有機ポリマー粒子およびその製造方法
１．１．有機ポリマー粒子の構成
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー粒子は、カルボキシル基を有する特定の構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）（以下、単に「カルボン酸モノマー（Ａ）」ともいう。）に由来するカルボキシル基を有する。ここで、化合物（Ａ）に由来するカルボキシル基とは、カルボン酸モノマー（Ａ）に含まれるカルボキシル基をいう。
【００２３】
本発明の一実施形態に係る有機ポリマー性粒子は、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下のカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有することができる。カルボン酸モノマー（Ａ）は、１分子中にラジカル重合性の不飽和二重結合とカルボキシル基とを有することができる。
【００２４】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は例えば、少なくとも表面がポリマー部からなり、このポリマー部は、カルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を含有することができる。この場合、ポリマー部は、カルボン酸モノマー（Ａ）を重合して形成されたものであってもよく、あるいは、カルボン酸モノマー（Ａ）および他の共重合可能なモノマー（Ｂ）からなるモノマー部を重合して形成された共重合体であってもよい。
【００２５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、全体がポリマー部から構成されていてもよいし、あるいは、コア・シェル構造を有していて、ポリマー部がシェルであってもよい。
【００２６】
例えば、常用されるアクリル酸やメタクリル酸などの水への溶解度が高いカルボン酸モノマーを重合してポリマー部を形成する場合、水溶性のポリマーが生成しやすく、このような水溶性ポリマーが粒子表面に結合または吸着していると、粒子表面に結合した生体関連物質（例えばタンパク）の活性部位を立体的に阻害したり、結合した生体関連物質（例えばタンパク）のコンフォメーションをポリカルボン酸のチャージによって破壊したりして、活性を低下させる結果、感度が低下すると推測される。
【００２７】
これに対して、本実施形態に係る有機ポリマー性粒子によれば、特定のカルボン酸モノマーを使用してポリマー部が形成されていることにより、水溶性ポリマーが生成しにくい
ため、高感度を発現すると推測される。
【００２８】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、カルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基は、高感度を発現する因子であり、かつ、水溶性カルボジイミドなどを用いたエステル化またはアミド化による公知の活性化により、検査用プローブ（一次プローブ）（例えばタンパク）の結合を容易にする。一次プローブとして使用可能であるタンパクおよびその結合方法については後述する。
【００２９】
カルボン酸モノマー（Ａ）は、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、最も好ましくは５質量％以下である。カルボン酸モノマー（Ａ）の２５℃における水への溶解度が２０質量％を超えると高感度を発現しない。
【００３０】
本発明において、２５℃におけるモノマーの水への溶解度は、対象となるモノマーを２５℃の蒸留水に少量ずつ添加し、攪拌したとき、モノマーが分離する直前の水溶液中のモノマーの質量％である。
【００３１】
カルボン酸モノマー（Ａ）としては、例えば、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸（２−（meth）acryloyloxyethyl succinate）、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸（２−（meth）acryloyloxyethyl phthalate）、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸（２−（meth）acryloyloxyethyl hexahydrophthalate
）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸（２−（meth）acryloyloxypropyl succinate）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸（２−（meth）acryloyloxypropyl phthalate）、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸（２−（meth）acryloyloxypropyl hexahydrophthalate）などの（メタ）アクリル酸誘導体；ｐ−ビニル安息香酸、ビニルフェニル酢酸などの芳香族系誘導体；ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸が挙げられる。これらのカルボン酸モノマー（Ａ）のうち、高感度が得られ、かつ、重合が容易であることから、好ましくは（メタ）アクリル酸誘導体であり、より好ましくはヒドロキシアルキル（メタ）アクリレートとジカルボン酸とのモノエステル化物であり、さらに好ましくは２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸であり、最も好ましくは２−メタクリロイロキシエチルフタル酸である。
【００３２】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）ないし（３）で表される構造を有することができる。
【００３３】
【化７】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【化８】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【化９】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【００３４】
一般式（１）において、ＡまたはＢで表されるアルキリデン基としては、例えば、エチリデン基，イソプロピリデン基，イソブチリデン基等が挙げられ、ＡまたはＢで表されるアルキレン基としては、例えば、メチレン基，ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基等が挙げられ、Ａで表されるシクロヘキシレン基としては、例えば、１，２−シクロヘキシレン基，１，３−シクロヘキシレン基，１，４−シクロヘキシレン基等が挙げられ、Ａで表されるフェニレン基としては、例えば、１，２−フェニレン基，１，３−フェニレン基，１，４−フェニレン基等が挙げられる。このうち、Ｂで表されるアルキレン基がジメチレン基またはトリメチレン基であるのが好ましい。
【００３５】
一般式（２）において、Ｄで表されるアルキレン基としては、例えば、ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、ノナメチレン基、ウンデカメチレン基、トリデカメチレン基等が挙げられる。
【００３６】
一般式（３）において、Ｅで表されるアルキリデン基としては、例えば、エチリデン基，イソプロピリデン基，イソブチリデン基等が挙げられ、アルキレン基としては、例えば、メチレン基，ジメチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン基，ペンタメチレン基，ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【００３７】
上記式（１）ないし（３）で表される構造は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）に含まれる構造であってもよい。
【００３８】
例えば、前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００３９】
また、例えば、前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００４０】
さらに、例えば、前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来することが好ましい。
【００４１】
上記式（１）ないし（３）で表される構造は粒子表面において、結合した生体関連物質（例えばタンパク）の活性部位を立体的に阻害したり、結合した生体関連物質（例えばタンパク）のコンフォメーションを破壊したりすることがないため、高感度を発現することができる。
【００４２】
なお、本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、下記式（１）ないし（３）で表される構造のうち少なくとも１つを有することができる。
【００４３】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、下記式（１）ないし（３）で表される構造を少なくとも表面に有することができ、上述のポリマー部が該構造を有していることが好ましい。
【００４４】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子のポリマー部において、カルボキシル基の量は、該粒子の固形分に対して、好ましくは１〜３００μｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２〜２００μｍｏｌ／ｇであり、最も好ましくは５〜１００μｍｏｌ／ｇである。カルボキシル基の量が１μｍｏｌ／ｇ未満では、一次プローブの結合が困難になることがあり、一方、３００μｍｏｌ／ｇを超えると、非特異吸着が増加する場合がある。カルボキシル基の水素イオンは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオンなどの陽イオンで置換されていても良い。
【００４５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子の数平均粒径（以下、単に「粒径」という。）は、好ましくは、０．０１〜１５μｍであり、さら好ましくは０．０３〜１０μｍであり、最も好ましくは０．０５〜１０μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求めることができる。ここで、粒径が０．０１μｍ未満の場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、タンパクや核酸等の生体関連物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１５μｍを超えると、比表面積が小さくなり、生理活性物質の捕捉量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
【００４６】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、通常、適当な分散媒に分散させて用いられる。使用できる分散媒としては、有機ポリマー粒子を溶解したり、あるいは、有機ポリマー粒子を膨潤させたりしない分散媒が好ましい。好ましい分散媒としては、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで、水系媒体とは、水、または水と水に混和する有機溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体等）との混合物をいう。
【００４７】
１．２．有機ポリマー粒子の製造
１．２．１．モノマー部の組成
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、モノマー部を重合して得られるポリマー部を形成することにより製造することができる。以下、モノマー部を構成する各モノマーについて説明する。
【００４８】
１．２．１−１．カルボン酸モノマー（Ａ）
カルボン酸モノマー（Ａ）の種類については、上述の通りである。
【００４９】
使用するモノマー部中におけるカルボン酸モノマー（Ａ）の比率は、モノマー部１００
質量％中に好ましくは２質量％以上であり、さらに好ましくは５質量％以上である。モノマー部中のカルボン酸モノマー（Ａ）の比率が２質量％未満であると、一次プローブの結合が困難になることがある。
【００５０】
１．２．１−２．他の共重合可能なモノマー（Ｂ）
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）としては、非架橋性（単官能）モノマー、架橋性（多官能）モノマーのいずれも使用することができ、これらを併用してもよい。
【００５１】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）のうち、非架橋性（単官能）モノマーとしては、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレートなどの親水性官能基を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミドなどの親水性モノマー、および、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルを例示することができる。
【００５２】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）のうち、架橋性（多官能）モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。さらに、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ（メタ）アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。
【００５３】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）として、本発明の効果の発現を妨げない範囲で、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などの水への溶解度が２０質量％を超えるカルボン酸モノマーを使用しても良い。
【００５４】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）の量は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）以外の残余の量である。
【００５５】
１．２．２．重合方法
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合等の定法を用いて製造が可能である。より具体的には、本発明の一実施形態の有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、本発明の一実施形態の有機ポリマー粒子は、特公昭５７−２４３６９号公報記載のシード粒子（母粒子）を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９８３年（Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ Ｅｄ． ２１，９３７（１９８３））記載の重合方法、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、および特開昭６１−２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。これらの方法の中では、シード粒子（核粒子）を用いる二段膨潤重合法が、粒径の変動係数を小さくすることができるため好ましい。シード粒子（核粒子）は、ポリスチレンまたはスチレン系共重合体等を用いることができる。そして、二段膨潤重合法により追加されるポリマー部は、上述のカルボン酸モノマー（Ａ）の単独重合体、あるいは、カルボン酸モノマー（Ａ）およびモノマー（Ｂ）の共重合体からなる。
【００５６】
上記モノマー部の重合の際に使用可能な乳化剤としては、例えば、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩などのアニオン系界面活性剤；アルキルアミン塩、アルキル四級アミン塩などのカチオン系界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ブロック型ポリエーテルなどのノニオン系界面活性剤；カルボン酸型（例えば、アミノ酸型、ベタイン酸型など）、スルホン酸型などの両性界面活性剤、商品名で、ラテムルＳ−１８０Ａ、ＰＤ−１０４〔花王社製〕、エレミノールＪＳ−２〔三洋化成社製〕、アクアロンＨＳ−１０、ＫＨ−１０、ＲＮ−１０、ＲＮ−２０、ＲＮ−３０、ＲＮ−５０〔第一工業製薬社製〕、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ、ＳＲ−１０、ＮＥ−２０、ＮＥ−３０、ＮＥ−４０〔旭電化工業社製〕、Ａｎｔｏｘ ＭＳ−６０〔日本乳化剤社製〕などの反応性乳化剤などのいずれでも使用可能である。特に、反応性乳化剤を用いると、粒子の分散性に優れるため好ましい。また、親水性基を有するポリマーのうち分散機能を有するものも乳化剤として使用することができる。このようなポリマーとしては、スチレン・マレイン酸共重合体、スチレン・アクリル酸共重合体、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリコール、ポリイソプレンのスルホン化物、水添スチレン・ブタジエン共重合体のスルホン化物、スチレン・マレイン酸共重合体のスルホン化物、スチレン・アクリル酸共重合体のスルホン化物などを挙げることができる。これらの乳化剤は、１種単独であるいは２種以上を併用することができる。乳化剤の使用量は特に限定されるものではないが、モノマー部として使用するモノマーの合計量１００重量部に対し、通常、０．１〜５０重量部であり、好ましくは０．２〜２０重量部であり、さらに好ましくは０．５〜５重量部である。０．１重量部未満では、乳化が充分でなく、ラジカル重合時の安定性が低下し好ましくない。一方、５０重量部を超えると、泡立ちが問題となり好ましくない。
【００５７】
モノマー部の重合の際に使用されるラジカル重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシマレイン酸、コハク酸パーオキサイド、２，２’−アゾビス〔２−Ｎ−ベンジルアミジノ〕プロパン塩酸塩などの水溶性開始剤；ベンゾイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、クミルパーオキシネオデカノエート、クミルパーオキシオクトエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性開始剤；酸性亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、アスコルビン酸などの還元剤を併用したレドックス系開始剤などが使用できる。
【００５８】
１．３．磁性体を含有する有機ポリマー粒子およびその製造
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、磁性体を含有する有機ポリマー粒子（以下、「磁性体含有有機ポリマー粒子」という。）であってもよい。磁性体含有有機ポリマー粒子は、例えば遠心分離器等を用いずに、磁石を用いて分離することができるため、被検体からの粒子の分離工程を簡素化または自動化することができる点で有用である。
【００５９】
磁性体含有有機ポリマー粒子は、（Ｉ）有機ポリマー等の非磁性体の連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子、（ＩＩ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、有機ポリマー等の非磁性体をシェルとする粒子、（ＩＩＩ）有機ポリマー等の非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子の２次凝集体層（磁性体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層の有機ポリマー層をシェルとする粒子等が挙げられる。これらの中では、（ＩＩＩ）前記磁性体微粒子の２次凝集体層を含む母粒子をコアとし、有機ポリマー層をシェルとする粒子が好ましい。なお、各種構造の磁性体含有有機ポリマー粒子に用いる有機ポリマーのうち、コア・シェル型粒子のコア部分を除いて、粒子最表面を形成するポリマーは、２５℃における水への溶解度が２０質量％以下のカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有することが必要である。
【００６０】
最も好ましい磁性体含有有機ポリマー粒子においては、核粒子と、この核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子を覆うように、有機ポリマー層が設けられている。ここで、有機ポリマー層は上述の製造方法により得られる。すなわち、有機ポリマー層は、カルボン酸モノマー（Ａ）を含むモノマー部を重合して得られる。また、この有機ポリマー層は、カルボン酸モノマー（Ａ）と他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体層であることが好ましい。
【００６１】
ここで、有機ポリマー層の膜厚は０．０１μｍ以上であることが好ましい。有機ポリマー層の膜厚が０．０１μｍ以上であることにより、超常磁性微粒子が漏れ出るのを防止することができる。
【００６２】
核粒子の表面に超常磁性微粒子の磁性体層が形成された母粒子の製造方法としては、例えば、非磁性の有機ポリマー粒子と超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製することができる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいは、ジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性の有機ポリマー粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から自ずと決定される。本実施形態に係る粒子で使用する超常磁性微粒子は、例えば、粒子径５〜２０ｎｍ程度のフェライトおよび／またはマグネタイトの微粒子が好適に使用できる。
【００６３】
より具体的な重合方法については、特開２００４−２０５４８１号公報等に開示されている通りである。
【００６４】
１．４．用途
本実施形態に係る有機ポリマー粒子は、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用でき、特に、抗原または抗体等の一次プローブとしてのタンパクを結合させた免疫検査用のタンパク結合粒子として、特出する高感度を発現することができる。
【００６５】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子において、検査対象となる物質は、免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生体関連物質および化学物質である。本発明において、生体関連物質とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク（例えば、酵素、抗体、アプタマー、受容体等）、ペプチド（例えばグルタチオン等）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞等）等が挙げられる。
【００６６】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子によれば、カルボキシル基を有するポリマー部が粒子の表面に導入されているため、実際に使用するにあたり、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤によりカルボキシル基を活性化し、一次プローブと粒子とを混合することで、一次プローブを粒子の表面に化学的に結合させることができる。
【００６７】
一次プローブを粒子の表面に結合させた後、過剰の一次プローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性化カルボキシル基を不活化する。また、一次プローブを粒子の表面に結合させた後、通常行われるブロッキングの操作をしてもよく、上述の不活化工程において、アルブミン等のブロッキング剤を併用してもかまわない。以降は、粒子を用いた通常の分析工程に移行すればよい。
【００６８】
本実施形態に係る有機ポリマー粒子に担持することができるプローブはタンパクであり、このうち抗原または抗体が好ましい。この場合、抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗トロンビン＝アンチトロンビン複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２−ミクロブロブリン検査用抗β２−ミクロブロブリン抗体、α１−ミクログロブリン検査用抗α１―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
【００６９】
２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００７０】
２．１．評価方法
２．１．１．粒径
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、粒子の数平均粒径およびその変動係数を測定した。
【００７１】
２．１．２．カルボキシル基含有量
粒子１ｇ（固形分）を含む水分散体を用いて、特開平１０−２７０２３３号公報に記載された電導度滴定によって、見かけの表面荷電量を求め、さらに、分散媒（水）のみを用いた同様の測定でバックグラウンドの荷電量を求め、これらの荷電量の差から、粒子のカルボキシル基含有量を求めた。
【００７２】
２．１．３．ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定）
抗ＡＦＰ抗体を感作させた、後述する各実施例・比較例で得られた粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名：Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７）を用いた。
【００７３】
２．２．実施例１
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」２ｇを１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０ｇに混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３ｇおよび水４１ｇの入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器でスチレン９６ｇおよびジビニルベンゼン４ｇを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００ｇに乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、８０℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これを核粒子とする（核粒子の作製）。数平均粒径は１．５μｍであった。
【００７４】
次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【００７５】
次いで、上記核粒子１５ｇおよび上記疎水化された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子を得た（母粒子の作製）。
【００７６】
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５質量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５質量％を含む水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する母粒子１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５質量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５質量％を含む水溶液７５ｇに、モノマー部としてシクロヘキシルメタクリレート１２ｇおよび２−メタクリロイロキシエチルフタル酸３ｇと、ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇとを入れて超音波で分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後、７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。以上の工程により、コアである母粒子を覆う共重合体層を形成した。磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。以上により、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉ）とする。なお、２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の２５℃における水への溶解度は、０．２質量％未満である。
【００７７】
この粒子（ｉ）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は９μｍｏｌ／ｇであった。
【００７８】
次に、この粒子（ｉ）１０ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。次に、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１００μｇを加え１８時間室温で反応した。反応後、粒子を磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したタンパク結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。このタンパク結合粒子を用いて、化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、この粒子（ｉ）のシグナル強度は１５２８０９（ＲＩＵ）であった。
【００７９】
２．３．実施例２
２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の代わりに２−メタクリロイロキシエチルコハク酸を用いた以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉｉ）とする。なお、２−メタクリロイロキシエチルコハク酸の２５℃における水への溶解度は、０．２質量％未満である。
【００８０】
この粒子（ｉｉ）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は１２μｍｏｌ／ｇであった。
【００８１】
次に、実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉｉ）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉｉ）のシグナル強度は１４９２５０（ＲＩＵ）であった。
【００８２】
２．４．比較例１
２−メタクリロイロキシエチルフタル酸の代わりにメタクリル酸を用いた以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉ’）とする。なお、メタクリル酸の２５℃における水への溶解度は、１００質量％である。
【００８３】
この粒子（ｉ’）の粒径は２．２μｍであり、カルボキシル基含有量は１６μｍｏｌ／ｇであった。
【００８４】
次に、実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉ’）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉ’）のシグナル強度は５５５９１（ＲＩＵ）であった。
【００８５】
以上の結果から、実施例１、２で得られた粒子（ｉ）および（ｉｉ）は、特定の構造を有するカルボン酸モノマー（Ａ）に由来するカルボキシル基を有するため、比較例１で得られた粒子（ｉ’）と比較して感度が高いことが理解できる。
【００８６】
２．５．参考例１
シクロヘキシルメタクリレート１４．９ｇおよび２−メタクリロイロキシエチルフタル酸０．１ｇを使用した以外は、実施例１と同様にして、磁性体含有有機ポリマー粒子の分
散液を得た。得られた粒子を粒子（ｉｉ’）とする。
【００８７】
この粒子（ｉｉ’）の粒径は２．８μｍであり、カルボキシル基含有量は２μｍｏｌ／ｇであった。
【００８８】
実施例１における粒子（ｉ）と同様にして、粒子（ｉｉ’）について化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）を実施した。その結果、粒子（ｉｉ’）のシグナル強度は５６４４３（ＲＩＵ）であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化１】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【請求項２】
請求項１において、
前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項３】
下記式（２）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化２】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【請求項４】
請求項３において、
前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項５】
下記式（３）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化３】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【請求項６】
請求項５において、
前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかにおいて、
磁性体を含有する、有機ポリマー粒子。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかにおいて、
粒子の表面は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）と、他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体から構成される、有機ポリマー粒子。
【請求項９】
請求項８において、
核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子と、
前記母粒子を覆うように設けられた前記共重合体からなる共重合体層と、
を含む、有機ポリマー粒子。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかにおいて、
タンパク結合用である、有機ポリマー粒子。
【請求項１１】
前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造およびエチレン性不飽和基を有する化合物を含むモノマー部を重合する工程を有する、有機ポリマー粒子の製造方法。
【請求項１】
下記式（１）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化１】
・・・・・（１）
（式中、Ａはアルキリデン基、アルキレン基、シクロヘキシレン基、またはフェニレン基を表し、Ｂは炭素数１〜６の直鎖または分岐のアルキレン基またはアルキリデン基を表す。）
【請求項２】
請求項１において、
前記式（１）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、および２−（メタ）アクリロイロキシプロピルヘキサヒドロフタル酸からなる群から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項３】
下記式（２）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化２】
・・・・・（２）
（式中、Ｄは炭素数２〜１３の直鎖または分岐のアルキレン基を表す。）
【請求項４】
請求項３において、
前記式（２）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルコハク酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項５】
下記式（３）で表される構造を有する、有機ポリマー粒子。
【化３】
・・・・・（３）
（式中、Ｅは炭素数１〜１２の分岐していてもよいアルキレン基またはアルキリデン基、あるいは単結合を表す。）
【請求項６】
請求項５において、
前記式（３）で表される構造が、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸、２−（メタ）アクリロイロキシプロピルフタル酸、ｐ−ビニル安息香酸、およびビニルフェニル酢酸から選ばれる少なくとも１つに由来する、有機ポリマー粒子。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかにおいて、
磁性体を含有する、有機ポリマー粒子。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかにおいて、
粒子の表面は、前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造および重合性不飽和基を有する化合物（Ａ）と、他の共重合可能なモノマー（Ｂ）との共重合体から構成される、有機ポリマー粒子。
【請求項９】
請求項８において、
核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の磁性体層とを含む母粒子と、
前記母粒子を覆うように設けられた前記共重合体からなる共重合体層と、
を含む、有機ポリマー粒子。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかにおいて、
タンパク結合用である、有機ポリマー粒子。
【請求項１１】
前記式（１）ないし（３）のいずれかで表される構造およびエチレン性不飽和基を有する化合物を含むモノマー部を重合する工程を有する、有機ポリマー粒子の製造方法。
【公開番号】特開２０１２−６２４７５（Ｐ２０１２−６２４７５Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３３７１０（Ｐ２０１１−２３３７１０）
【出願日】平成２３年１０月２５日（２０１１．１０．２５）
【分割の表示】特願２００６−２６４６４６（Ｐ２００６−２６４６４６）の分割
【原出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（０００００４１７８）ＪＳＲ株式会社 (3,320)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２５日（２０１１．１０．２５）
【分割の表示】特願２００６−２６４６４６（Ｐ２００６−２６４６４６）の分割
【原出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（０００００４１７８）ＪＳＲ株式会社 (3,320)
【Ｆターム（参考）】
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