有機化合物、有機化合物の製造方法、及び抗ピロリ菌剤
【課題】新規な有機化合物、及び抗ピロリ菌剤を提供する。
【解決手段】有機化合物は下記一般式（１）で示される構造を有する。抗ピロリ菌剤は下記一般式（１）で示される構造を有する有機化合物を有効成分として含有する。緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【解決手段】有機化合物は下記一般式（１）で示される構造を有する。抗ピロリ菌剤は下記一般式（１）で示される構造を有する有機化合物を有効成分として含有する。緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ピロリ菌活性を有する有機化合物、その製造方法、及び抗ピロリ菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、ヒト等の胃や十二指腸に生息するらせん型の細菌であり、胃炎、胃潰瘍、胃がん、及び十二指腸潰瘍等の疾病を引き起こす原因細菌として知られている。現在、ピロリ菌の除菌療法としては、抗生物質を用いた療法、例えば胃酸過多による副作用を抑えるためのプロトンポンプ阻害剤１剤（ランソプラゾール、又はオメプラゾール）と、抗生物質２剤（アモキシシリン及びクラリスロマイシン）の３剤を併用したトリプルセラピーが用いられている。このトリプルセラピーによる除菌成功率は９０％を超えるとされてきたが、抗生物質耐性菌株の増加による除菌失敗例も数多く報告されるようになってきている。
【０００３】
そのため、近年では耐性菌株を生み出し難いと考えられる天然物由来、特に食品素材由来の抗ピロリ菌剤に注目が集まっている。このような天然物由来の抗ピロリ菌剤としては、例えば特許文献１に開示されるものが知られている。特許文献１の抗ピロリ菌剤は、月見草に含有される特定のポリフェノールが有する抗ピロリ菌活性に基づくものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３５２６４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から新規な有機化合物を単離したことによりなされたものである。また、かかる化合物について抗ピロリ菌活性を見出したことによりなされたものである。本発明の目的は、医薬品・食品等の様々な用途に適用することができる有機化合物、及びその製造方法を提供することにある。また、有用な抗ピロリ菌活性を発揮する抗ピロリ菌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために請求項１に記載の有機化合物は、下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の有機化合物は、請求項１に記載の発明において、下記理化学的性質）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の有機化合物は、請求項１に記載の発明において、下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする。
【０００９】
請求項４に記載の抗ピロリ菌剤は、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の有機化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
請求項５に記載の有機化合物の製造方法は、下記一般式（１）：
【化２】
で示される有機化合物の製造方法であって、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いて、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規な有機化合物、その製造方法、及び抗ピロリ菌剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第２中間精製物のＨＰＬＣチャート。
【図２】実施例１の吸光スペクトル。
【図３】実施例１におけるＴＯＦ−ＭＳの測定結果。
【図４】実施例１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図５】実施例１のＤＥＰＴ１３５スペクトル。
【図６】実施例１のＤＥＰＴ９０スペクトル。
【図７】実施例１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図８】実施例１のＨＭＱＣスペクトル。
【図９】実施例１のＨＭＢＣスペクトル。
【図１０】実施例１のＨＨ−ＣＯＳＹスペクトル。
【図１１】実施例２の吸光スペクトル。
【図１２】実施例２におけるＴＯＦ−ＭＳの測定結果。
【図１３】実施例２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１４】実施例２のＤＥＰＴ１３５スペクトル。
【図１５】実施例２のＤＥＰＴ９０スペクトル。
【図１６】実施例２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図１７】実施例２のＨＭＱＣスペクトル。
【図１８】実施例２のＨＭＢＣスペクトル。
【図１９】実施例２のＨＨ−ＣＯＳＹスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を具体化した実施形態の有機化合物及び抗ピロリ菌剤を詳細に説明する。
本実施形態の有機化合物は、下記一般式（１）：
【化３】
に示される有機化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）である。
【００１３】
上記有機化合物は、５位、６位、７位、８位、９位、及び１０位に合計６個の不斉炭素を有している。そのため、理論上６４個（２６個）の立体異性体が存在する。それら上記有機化合物の立体異性体のなかでも、さらに下記理化学的性質を有する２種類の立体異性体（以下、それぞれ有機化合物１及び有機化合物２と記載する。）は入手容易性に優れている。
【００１４】
有機化合物１は以下の理化学的性質を有する。
ＮＭＲスペクトル（図４及び図７参照）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
有機化合物２は以下の理化学的性質を有する。
【００１５】
ＮＭＲスペクトル（図１３及び図１６参照）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
次に、本実施形態の有機化合物のうち、例えば上記有機化合物１及び有機化合物２を得る方法について説明する。
【００１６】
上記有機化合物１及び有機化合物２は、緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）のデュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）に属する微細網の藻体を原料として抽出工程及び単離工程を経ることにより得られる。
【００１７】
［原料］
原料となる緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体としては、例えばデュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、及びデュナリエラ・バーダウィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｂａｒｄａｗｉｌ）が挙げられる。上記微細網の藻体は、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体（例えば、商業ベースで大量栽培生産されている藻体）であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。
【００１８】
また、上記微細網の藻体なかでも、β−カロテン等のカロテノイドを細胞内に蓄積した外観が赤色（黄橙色）を呈する藻体を用いることが特に好ましい。上記微細網の藻体は、通常の生育条件では光合成色素（クロロフィルａ，ｂ）を体内に蓄積するため、外観が緑色を呈するが、特定の条件（例えば、高塩濃度）で生育した場合には、β−カロテン等のカロテノイドを生合成するとともに同カロテノイドを細胞内に蓄積して赤色を呈する。外観が赤色を呈する藻体は、公知の生育方法、例えば特開２００７−２１０９１７号公報に記載されている方法により得ることができる。
【００１９】
また、原料としての上記微細網の藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。
【００２０】
［抽出工程］
抽出工程は、原料としての上記微細網の藻体から、上記有機化合物１及び有機化合物２を含む抽出物を抽出する工程である。抽出工程に用いる抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。上記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等の低級アルコール類、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられる。なお、抽出溶媒中に、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、その他の添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。
【００２１】
抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷水抽出、温水抽出、熱水抽出、及び蒸気抽出のいずれの方法を用いてもよいが、特に冷水抽出を用いることが好ましい。また、抽出温度は０〜３０℃であることが好ましく、０〜１５℃であることがより好ましい。なお、抽出時間は特に限定されるものではないが、１０〜１２０分間程度であることが好ましい。
【００２２】
抽出操作としては、抽出溶媒中に原料である上記微細網の藻体を所定時間浸漬させる。その際、抽出溶媒中における原料の濃度は特に限定されないが、５〜５０質量％とすることが好ましく、５〜１５質量％とすることがより好ましい。原料の濃度を５％未満とした場合には、得られる抽出液中における上記有機化合物１及び有機化合物２の濃度が低くなることから濃縮処理等の後処理が煩雑となる。一方、原料の濃度が５０％を超える場合には、上記有機化合物１及び有機化合物２の回収率が低くなるおそれがある。
【００２３】
こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の原料に対して一回のみ行なってもよいし、複数回繰り返して行なってもよい。そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液（上清）と原料の残渣とを分離する。固液分離処理の方法としては、例えばろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、必要に応じて得られた抽出液（抽出物）の濃縮を行う。
【００２４】
［単離工程］
単離工程は、抽出工程にて得られた抽出物中に含まれる上記有機化合物１及び有機化合物２を単離する工程である。上記有機化合物１及び有機化合物２は、上記抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより単離される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法で上記有機化合物１及び有機化合物２を単離・精製することができる。
【００２５】
なお、本実施形態の有機化合物は、上記微細網の藻体から抽出及び単離する方法に限らず、有機化学合成（半合成を含む）等により製造してもよい。
次に、本実施形態の抗ピロリ菌剤について説明する。
【００２６】
本実施形態の抗ピロリ菌剤は、上記一般式（１）で示される有機化合物を有効成分として含有する。この抗ピロリ菌剤は、例えば健康食品や食品等の飲食品等の添加剤、医薬品、及び医薬部外品として有用である。抗ピロリ菌剤は液状であってもよいし、固体状であってもよい。それらの剤形としては、特に限定されないが、例えば散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、溶剤、香料、甘味料等の添加剤を配合してもよい。
【００２７】
次に、本実施形態における効果について以下に記載する。
（１）本実施形態の有機化合物は新規化合物であり、医薬品・飲食品等の様々な用途に適用することができる。
【００２８】
（２）本実施形態の有機化合物は抗ピロリ菌活性を発揮する。したがって、同有機化合物を有効成分とする抗ピロリ菌剤を提供することができる。
（３）本実施形態の有機化合物は、抗ピロリ菌活性を有する公知の抗生物質（例えば、アモキシシリン、クラリスロマイシン、及びメトロニダゾール）と併用した場合にも、抗生物質の抗ピロリ菌活性を阻害することなく、抗生物質と協調して抗ピロリ菌活性を発揮することができる。また、抗生物質耐性のピロリ菌にも適用することができる。
【００２９】
（４）本実施形態の有機化合物のなかでも、特定の理化学的性質を示す上記有機化合物１及び有機化合物２は、入手容易性の観点において優れている。
（５）上記有機化合物１及び有機化合物２は、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体に含まれる天然成分であることから、抗ピロリ菌剤として用いた場合に耐性菌株を生み出し難いという利点がある。また、天然成分であることから、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。
【実施例】
【００３０】
次に、実施例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜抽出工程＞
外観が赤色を呈するデュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）の乾燥粉末（１２０ｇ）に酢酸エチル（１Ｌ）を添加して一日、氷冷状態で浸漬させた後、上清を採取した。また、沈殿物に対して、酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加して３０分間浸漬させた後、上清を採取した。そして、この沈殿物に対する再抽出操作を合計４回繰り返した。得られた全ての上清をコットンフィルタにてろ過するとともに、そのろ液を濃縮することにより、固形状の抽出物（乾燥重量９．３０ｇ）を得た。この抽出物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させることによりデュナリエラ・サリーナ抽出液を調整した。
【００３１】
＜単離工程＞
［１．シリカゲルオープンカラムによる分画］
１００％ヘキサンにて活性化させたシリカゲルカラム（４０ｍｍＩ．Ｄ．×３５０ｍｍ）に、上記デュナリエラ・サリーナ抽出液（４．６５ｇ（藻体６０ｇ当量））をアプライした。そして、４４Ｌのヘキサン・酢酸エチル混合溶液（９：１）を用いて溶出処理を行った後、さらに４４Ｌのヘキサン・酢酸エチル混合溶媒（７：３）を用いて溶出処理を行った。ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒（７：３）による溶出処理にて得られた画分を回収し、これを減圧濃縮することにより第１中間精製物（０．８９ｇ）を得た。
【００３２】
［２．ＯＤＳオープンカラムによる分画］
１００％メタノールを用いてＯＤＳオープンカラム（３０ｍｍＩ．Ｄ．×１３０ｍｍ）を活性化させた後、１００ｍＬの７０％メタノール水溶液、及び１００ｍＬの５０％メタノール水溶液を用いてカラム内の溶媒を順次置換した。その後、第１中間精製物（０．７３ｇ（藻体５０ｇ当量））を５０％メタノール水溶液に溶解させたものを上記ＯＤＳオープンカラムにアプライした。そして、９２０ｍＬの５０％メタノール水溶液を用いて溶出処理を行った後、さらに９２０ｍＬの７０％メタノール水溶液を用いて溶出処理を行った。７０％メタノール水溶液による溶出処理にて得られた画分を回収し、これを減圧濃縮することにより第２中間精製物を得た。
【００３３】
［３．ＨＰＬＣによる分画］
逆相高速液体クロマトグラフィを用いて第２中間精製物の精製を行った。この精製においては、保持時間２０〜２２分に現れるピークにて確認される画分、及び保持時間２２〜２４分に現れるピークにて確認される画分をそれぞれ回収した。このときのＨＰＬＣチャートを図１に示す。そして、保持時間２０〜２２分に現れるピークにて確認される画分を濃縮乾固することにより、目的の化合物（実施例１）を得た。また、保持時間２２〜２４分に現れるピークにて確認される画分を濃縮乾固することにより、目的の化合物（実施例２）を得た。なお、ＨＰＬＣの処理条件は以下のとおりである。
【００３４】
ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（１０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３０℃
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：６５％メタノール／水
ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２５４ｎｍ
＜実施例１の構造解析＞
［１．吸光スペクトル分析］
分光光度計を用いて、デュナリエラ・サリーナより単離した実施例１を、濃度４０μｍ／ｍＬとなるように７０％メタノール水溶液に溶解させて試験液を調製した。そして、この試験液について波長２００〜４００ｎｍにおける吸光スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。吸光スペクトル分析の結果から、実施例１は２３１ｎｍに極大吸収をもつことが示された。
【００３５】
［２．ＴＯＦ−ＭＳ分析］
実施例１の分子量を特定するためにＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果を図３に示す。ポジティブモードにてｍ／ｚ３６１［Ｍ＋Ｈ］＋に分子量ピークが認められたことから、実施例１の分子量は３６０であると考えられる。なお、ＴＯＦ−ＭＳ分析の条件は以下のとおりである。
【００３６】
分析方法：インフュージョン分析
試料濃度：１ｐｐｍ（７０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１０μＬ／ｍｉｎ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：７０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ＥＳＩ
Ｍｏｄｅ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ：２０Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５０℃
［３．ＮＭＲ分析］
実施例１の分子構造を特定するためにＮＭＲ分析を行った。所定量の実施例１を分取し、これを重水素置換メタノールに溶解させて水素を置換した。その後、デシケータ内にて完全に乾燥させた後、クロロホルムに溶解させて各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ１３５、ＤＥＰＴ９０、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。各ＮＭＲ分析において得られたＮＭＲスペクトルを図４〜１０に示すとともに、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表１及び２に示す。なお、ＮＭＲ分析の条件は以下のとおりである。
【００３７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：１２５ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲ：５００ＭＨｚ
基準物質：テトラメチルシラン（ＴＭＳ）
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ９０、及びＤＥＰＴ１３５の結果から、１８種の炭素ピークが認められ、ＣＨ３を５個、ＣＨ２を３個、ＣＨを５個、Ｃを５個有することが示された。また、ケミカルシフトから酸素と結合した炭素が７個あり、そのうち１個は１９７．４ｐｐｍのシグナルを有することから共役したケトン基であると考えられる。そして、二重結合性の炭素のシグナルが２本存在し、二重結合が一つ存在すると考えられる。一方、１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＱＣの分析結果から、各炭素に対応する水素ピークが示された。とくに、二重結合性の炭素に対応する水素ピークのカップリング定数（Ｊ＝１６．０Ｈｚ）からトランス型の二重結合が存在することが示された。
【００４０】
上記のＮＭＲ分析の結果より導き出される実施例１の組成式はＣ１８Ｈ２６Ｏ７（分子量３５４）となる。しかし、この分子量はＴＯＦ−ＭＳ分析の結果（ｍ／ｚ＝３６０）より６低いことから、６個の酸素に水素が結合していると考えられる。したがって、ＴＯＦ−ＭＳ分析とＮＭＲ分析の結果から、実施例１の組成式はＣ１８Ｈ３２Ｏ７と決定した。
【００４１】
また、ＨＭＢＣ及びＨＨ−ＣＯＳＹの結果から、実施例１は下記一般式（２）、（３）に示す部分構造を有することが示唆される。
【００４２】
【化４】
さらに、ＨＨ−ＣＯＳＹの結果を見ると、Ｈ３とＨ４、Ｈ２−ａ、及びＨ２−ｂ間のカップリングが認められ、Ｈ３はマルチプレットであることから、Ｈ３の結合する炭素の両隣に水素と結合した炭素が結合していると考えられる。また、Ｈ７とＨ８間のカップリングが認められ、Ｈ７はダブレットであることから、Ｈ７の結合する炭素は４級炭素と結合していると考えられる。以上の結果から、実施例１は下記一般式（１）に示す構造を有する有機化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）であると構造決定した。
【００４３】
【化５】
＜実施例２の構造解析＞
［１．吸光スペクトル分析］
分光光度計を用いて、デュナリエラ・サリーナより単離した実施例２を、濃度８０μｍ／ｍＬとなるように７０％メタノール水溶液に溶解させて試験液を調製した。そして、この試験液について波長２００〜４００ｎｍにおける吸光スペクトルを測定した。その結果を図１１に示す。吸光スペクトル分析の結果から、実施例１は２３２ｎｍに極大吸収をもつことが示された。
【００４４】
［２．ＴＯＦ−ＭＳ分析］
実施例２の分子量を特定するためにＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果を図１２に示す。ポジティブモードにてｍ／ｚ３６１［Ｍ＋Ｈ］＋に分子量ピークが認められたことから、実施例２の分子量は３６０であると考えられる。なお、ＴＯＦ−ＭＳ分析の条件は上記と同様である。
【００４５】
［３．ＮＭＲ分析］
実施例２の分子構造を特定するためにＮＭＲ分析を行った。所定量の実施例２を分取し、これを重水素置換メタノールに溶解させて水素を置換した。その後、デシケータ内にて完全に乾燥させた後、クロロホルムに溶解させて各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ１３５、ＤＥＰＴ９０、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。各ＮＭＲ分析において得られたＮＭＲスペクトルを図１３〜１９に示すとともに、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表３及び４に示す。
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ９０、及びＤＥＰＴ１３５の結果、並びに１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＨ−ＣＯＳＹの結果から、実施例１と同様に実施例２の構造解析を行った。その結果、実施例２も上記一般式（１）に示す構造を有する化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）であると構造決定した。
【００４８】
なお、実施例１及び実施例２のＮＭＲ分析の結果は非常に類似しているものの、同じではなかった。この結果から、実施例１と実施例２とは互いに立体異性体の関係であると考えられる。そこで、実施例１及び実施例２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を比較した。その結果を表５に示す。
【００４９】
【表５】
表５に示すように、実施例２においては実施例１と比較して、Ｃ６及びＣ１０がそれぞれ１．３ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ高磁場へ、Ｃ８及びＣ９がそれぞれ２．６ｐｐｍ、１．６ｐｐｍ低磁場へシフトしている。この結果から、実施例１と実施例２とは、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、及びＣ１０付近の不斉炭素の立体構造が異なっていると考えられる。
【００５０】
＜抗ピロリ菌活性の評価＞
実施例１及び実施例２によるピロリ菌の増殖抑制効果（抗ピロリ菌活性）をディスク拡散法により評価した。ブルセラ寒天培地にて２日間微好気培養したピロリ菌をブルセラ液体培地に混和して、波長６００ｎｍで吸光度０．６を示す懸濁液を調製した。また、直径６ｍｍのディスク（Ｗｈａｔｍａｎ製Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ＡｓｓａｙＤｉｓｃｓ）に試料（実施例１、実施例２、又は実施例１と実施例２との質量比１：１の混合物）の溶液を染み込ませ、これを減圧乾燥させることにより、試料（乾燥質量９μｇ）を含むディスクを作成した。
【００５１】
そして、ブルセラ寒天培地に上記懸濁液を塗布するとともに、そのブルセラ寒天培地上に上記試料を含むディスクを置いた。３日間の微好気培養（３７℃、１０％ＣＯ２）の後、ブルセラ寒天培地に形成された阻止円の直径を定規にて測定し、この阻止円の直径に基づいて実施例１及び実施例２によるピロリ菌の増殖抑制効果を評価した。なお、本評価試験はＫＹＵ１（ＮＣＴＣ１１６３７株（米国）を高知大学医学部でスナネズミ感染を繰り返し分離した高度胃内感染定着株、抗生物質感受性株）、ＴＫ１４０２（日本、メトロニダゾール耐性株）、及びＮＹ３１（日本、クラリスロマイシン耐性株）の異なるピロリ菌３菌株についてそれぞれ行った。その結果を表６に示す。
【００５２】
【表６】
表６に示すように、ピロリ菌３菌株に対して、実施例１では１２〜１８ｍｍ、実施例２では１１〜１４ｍｍ、実施例１と実施例２の混合物では１２〜１６ｍｍの阻止円の形成を確認することができた。この結果から、実施例１及び実施例２は共に薬剤耐性のないピロリ菌だけでなく、薬剤耐性を有するピロリ菌に対しても同様の増殖抑制効果を発揮することが示された。なお、互いに異性体の関係にある実施例１及び２が略同等の抗ピロリ菌活性を有することから、上記一般式（１）で示される他の異性体においても、抗ピロリ菌活性を有することが推認される。
【００５３】
＜抗生物質との比較試験＞
臨床で用いられている抗生物質であるアモキシシリン（ＡＭＰＣ）、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）、及びメトロニダゾール（ＭＮＺ）の抗ピロリ菌活性を評価し、実施例１及び実施例２との抗ピロリ菌活性の比較を行った。本試験においても、ディスク拡散法によりピロリ菌の増殖抑制効果を評価したが、ここではディスクに含ませる試料の量を変化させて１１〜１８ｍｍの阻止円を形成するために必要な試料の量（乾燥質量）を求めた。その結果を表７に示す。
【００５４】
【表７】
上記抗ピロリ菌活性の評価の結果から、実施例１及び実施例２の場合には、１１〜１８ｍｍの阻止円を形成するために必要な試料の量は約９μｇであった。これに対して、表７に示すように、アモキシリンの場合には、同様の阻止円を形成するために必要な試料の量は０．０１〜０．０１２μｇであり、３オーダー程度低い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。クラリスロマイシンの場合には、同様の阻止円を形成するために試料の量は０．００５〜０．０３μｇであり、３オーダー程度低い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。メトロニダゾールの場合には、同様の阻止円を形成するために必要な試料の量は４〜１００μｇであり、各実施例と同程度、又は各実施例よりも１オーダー程度高い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。これらの結果から、実施例１及び実施例２は、メトロニダゾールと同程度、又はそれ以上の抗ピロリ菌活性を有することが分かる。
【００５５】
＜抗生物質との併用試験＞
実施例１及び実施例２と各抗生物質とを併用した場合におけるピロリ菌の増殖抑制効果をディスク拡散法により評価した。本試験では、９μｇ（乾燥質量）の実施例１又は実施例２を含むディスクに対して、上記試験にて１１〜１８ｍｍの阻止円の形成が認められた含量（上記表７に示した量）で各抗生物質をさらに含ませるように処理したディスクを使用して試験を行った。また、比較対照として、実施例１、実施例２、及び各抗生物質を単独で含ませたディスクを用いて同様の試験を行った。その結果を表８に示す。
【００５６】
【表８】
表８に示すように、菌株ＫＹＵ１に対して、実施例１、実施例２、及び各抗生物質単独の場合には１４〜１７ｍｍの阻止円の形成が確認された。一方、実施例１又は実施例２と各抗生物質とを併用した場合には、単独の場合よりも大きい１５〜２５ｍｍの阻止円の形成が確認された。また、菌株ＴＫ１４０２及び菌株ＮＹ３１に対しても同様に、実施例１又は実施例２と各抗生物質とを併用した場合には、単独の場合よりも大きい阻止円の形成が確認された。これらの結果から、実施例１及び実施例２は抗生物質の抗ピロリ菌活性を阻害することなく、抗生物質と協調して抗ピロリ菌活性を発揮することが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ピロリ菌活性を有する有機化合物、その製造方法、及び抗ピロリ菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、ヒト等の胃や十二指腸に生息するらせん型の細菌であり、胃炎、胃潰瘍、胃がん、及び十二指腸潰瘍等の疾病を引き起こす原因細菌として知られている。現在、ピロリ菌の除菌療法としては、抗生物質を用いた療法、例えば胃酸過多による副作用を抑えるためのプロトンポンプ阻害剤１剤（ランソプラゾール、又はオメプラゾール）と、抗生物質２剤（アモキシシリン及びクラリスロマイシン）の３剤を併用したトリプルセラピーが用いられている。このトリプルセラピーによる除菌成功率は９０％を超えるとされてきたが、抗生物質耐性菌株の増加による除菌失敗例も数多く報告されるようになってきている。
【０００３】
そのため、近年では耐性菌株を生み出し難いと考えられる天然物由来、特に食品素材由来の抗ピロリ菌剤に注目が集まっている。このような天然物由来の抗ピロリ菌剤としては、例えば特許文献１に開示されるものが知られている。特許文献１の抗ピロリ菌剤は、月見草に含有される特定のポリフェノールが有する抗ピロリ菌活性に基づくものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３５２６４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から新規な有機化合物を単離したことによりなされたものである。また、かかる化合物について抗ピロリ菌活性を見出したことによりなされたものである。本発明の目的は、医薬品・食品等の様々な用途に適用することができる有機化合物、及びその製造方法を提供することにある。また、有用な抗ピロリ菌活性を発揮する抗ピロリ菌剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために請求項１に記載の有機化合物は、下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の有機化合物は、請求項１に記載の発明において、下記理化学的性質）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の有機化合物は、請求項１に記載の発明において、下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする。
【０００９】
請求項４に記載の抗ピロリ菌剤は、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の有機化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
請求項５に記載の有機化合物の製造方法は、下記一般式（１）：
【化２】
で示される有機化合物の製造方法であって、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いて、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規な有機化合物、その製造方法、及び抗ピロリ菌剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第２中間精製物のＨＰＬＣチャート。
【図２】実施例１の吸光スペクトル。
【図３】実施例１におけるＴＯＦ−ＭＳの測定結果。
【図４】実施例１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図５】実施例１のＤＥＰＴ１３５スペクトル。
【図６】実施例１のＤＥＰＴ９０スペクトル。
【図７】実施例１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図８】実施例１のＨＭＱＣスペクトル。
【図９】実施例１のＨＭＢＣスペクトル。
【図１０】実施例１のＨＨ−ＣＯＳＹスペクトル。
【図１１】実施例２の吸光スペクトル。
【図１２】実施例２におけるＴＯＦ−ＭＳの測定結果。
【図１３】実施例２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１４】実施例２のＤＥＰＴ１３５スペクトル。
【図１５】実施例２のＤＥＰＴ９０スペクトル。
【図１６】実施例２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図１７】実施例２のＨＭＱＣスペクトル。
【図１８】実施例２のＨＭＢＣスペクトル。
【図１９】実施例２のＨＨ−ＣＯＳＹスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を具体化した実施形態の有機化合物及び抗ピロリ菌剤を詳細に説明する。
本実施形態の有機化合物は、下記一般式（１）：
【化３】
に示される有機化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）である。
【００１３】
上記有機化合物は、５位、６位、７位、８位、９位、及び１０位に合計６個の不斉炭素を有している。そのため、理論上６４個（２６個）の立体異性体が存在する。それら上記有機化合物の立体異性体のなかでも、さらに下記理化学的性質を有する２種類の立体異性体（以下、それぞれ有機化合物１及び有機化合物２と記載する。）は入手容易性に優れている。
【００１４】
有機化合物１は以下の理化学的性質を有する。
ＮＭＲスペクトル（図４及び図７参照）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
有機化合物２は以下の理化学的性質を有する。
【００１５】
ＮＭＲスペクトル（図１３及び図１６参照）：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
次に、本実施形態の有機化合物のうち、例えば上記有機化合物１及び有機化合物２を得る方法について説明する。
【００１６】
上記有機化合物１及び有機化合物２は、緑藻網（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）のデュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）に属する微細網の藻体を原料として抽出工程及び単離工程を経ることにより得られる。
【００１７】
［原料］
原料となる緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体としては、例えばデュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、及びデュナリエラ・バーダウィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｂａｒｄａｗｉｌ）が挙げられる。上記微細網の藻体は、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体（例えば、商業ベースで大量栽培生産されている藻体）であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。
【００１８】
また、上記微細網の藻体なかでも、β−カロテン等のカロテノイドを細胞内に蓄積した外観が赤色（黄橙色）を呈する藻体を用いることが特に好ましい。上記微細網の藻体は、通常の生育条件では光合成色素（クロロフィルａ，ｂ）を体内に蓄積するため、外観が緑色を呈するが、特定の条件（例えば、高塩濃度）で生育した場合には、β−カロテン等のカロテノイドを生合成するとともに同カロテノイドを細胞内に蓄積して赤色を呈する。外観が赤色を呈する藻体は、公知の生育方法、例えば特開２００７−２１０９１７号公報に記載されている方法により得ることができる。
【００１９】
また、原料としての上記微細網の藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態であってもよい。
【００２０】
［抽出工程］
抽出工程は、原料としての上記微細網の藻体から、上記有機化合物１及び有機化合物２を含む抽出物を抽出する工程である。抽出工程に用いる抽出溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。上記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等の低級アルコール類、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられる。なお、抽出溶媒中に、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、その他の添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。
【００２１】
抽出方法としては、公知の抽出方法、例えば冷水抽出、温水抽出、熱水抽出、及び蒸気抽出のいずれの方法を用いてもよいが、特に冷水抽出を用いることが好ましい。また、抽出温度は０〜３０℃であることが好ましく、０〜１５℃であることがより好ましい。なお、抽出時間は特に限定されるものではないが、１０〜１２０分間程度であることが好ましい。
【００２２】
抽出操作としては、抽出溶媒中に原料である上記微細網の藻体を所定時間浸漬させる。その際、抽出溶媒中における原料の濃度は特に限定されないが、５〜５０質量％とすることが好ましく、５〜１５質量％とすることがより好ましい。原料の濃度を５％未満とした場合には、得られる抽出液中における上記有機化合物１及び有機化合物２の濃度が低くなることから濃縮処理等の後処理が煩雑となる。一方、原料の濃度が５０％を超える場合には、上記有機化合物１及び有機化合物２の回収率が低くなるおそれがある。
【００２３】
こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の原料に対して一回のみ行なってもよいし、複数回繰り返して行なってもよい。そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液（上清）と原料の残渣とを分離する。固液分離処理の方法としては、例えばろ過や遠心分離等の公知の分離法を用いることができる。また、必要に応じて得られた抽出液（抽出物）の濃縮を行う。
【００２４】
［単離工程］
単離工程は、抽出工程にて得られた抽出物中に含まれる上記有機化合物１及び有機化合物２を単離する工程である。上記有機化合物１及び有機化合物２は、上記抽出物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより単離される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やＯＤＳ担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法で上記有機化合物１及び有機化合物２を単離・精製することができる。
【００２５】
なお、本実施形態の有機化合物は、上記微細網の藻体から抽出及び単離する方法に限らず、有機化学合成（半合成を含む）等により製造してもよい。
次に、本実施形態の抗ピロリ菌剤について説明する。
【００２６】
本実施形態の抗ピロリ菌剤は、上記一般式（１）で示される有機化合物を有効成分として含有する。この抗ピロリ菌剤は、例えば健康食品や食品等の飲食品等の添加剤、医薬品、及び医薬部外品として有用である。抗ピロリ菌剤は液状であってもよいし、固体状であってもよい。それらの剤形としては、特に限定されないが、例えば散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、賦形剤、基剤、乳化剤、安定剤、溶剤、香料、甘味料等の添加剤を配合してもよい。
【００２７】
次に、本実施形態における効果について以下に記載する。
（１）本実施形態の有機化合物は新規化合物であり、医薬品・飲食品等の様々な用途に適用することができる。
【００２８】
（２）本実施形態の有機化合物は抗ピロリ菌活性を発揮する。したがって、同有機化合物を有効成分とする抗ピロリ菌剤を提供することができる。
（３）本実施形態の有機化合物は、抗ピロリ菌活性を有する公知の抗生物質（例えば、アモキシシリン、クラリスロマイシン、及びメトロニダゾール）と併用した場合にも、抗生物質の抗ピロリ菌活性を阻害することなく、抗生物質と協調して抗ピロリ菌活性を発揮することができる。また、抗生物質耐性のピロリ菌にも適用することができる。
【００２９】
（４）本実施形態の有機化合物のなかでも、特定の理化学的性質を示す上記有機化合物１及び有機化合物２は、入手容易性の観点において優れている。
（５）上記有機化合物１及び有機化合物２は、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体に含まれる天然成分であることから、抗ピロリ菌剤として用いた場合に耐性菌株を生み出し難いという利点がある。また、天然成分であることから、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。
【実施例】
【００３０】
次に、実施例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
＜抽出工程＞
外観が赤色を呈するデュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）の乾燥粉末（１２０ｇ）に酢酸エチル（１Ｌ）を添加して一日、氷冷状態で浸漬させた後、上清を採取した。また、沈殿物に対して、酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加して３０分間浸漬させた後、上清を採取した。そして、この沈殿物に対する再抽出操作を合計４回繰り返した。得られた全ての上清をコットンフィルタにてろ過するとともに、そのろ液を濃縮することにより、固形状の抽出物（乾燥重量９．３０ｇ）を得た。この抽出物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解させることによりデュナリエラ・サリーナ抽出液を調整した。
【００３１】
＜単離工程＞
［１．シリカゲルオープンカラムによる分画］
１００％ヘキサンにて活性化させたシリカゲルカラム（４０ｍｍＩ．Ｄ．×３５０ｍｍ）に、上記デュナリエラ・サリーナ抽出液（４．６５ｇ（藻体６０ｇ当量））をアプライした。そして、４４Ｌのヘキサン・酢酸エチル混合溶液（９：１）を用いて溶出処理を行った後、さらに４４Ｌのヘキサン・酢酸エチル混合溶媒（７：３）を用いて溶出処理を行った。ヘキサン・酢酸エチル混合溶媒（７：３）による溶出処理にて得られた画分を回収し、これを減圧濃縮することにより第１中間精製物（０．８９ｇ）を得た。
【００３２】
［２．ＯＤＳオープンカラムによる分画］
１００％メタノールを用いてＯＤＳオープンカラム（３０ｍｍＩ．Ｄ．×１３０ｍｍ）を活性化させた後、１００ｍＬの７０％メタノール水溶液、及び１００ｍＬの５０％メタノール水溶液を用いてカラム内の溶媒を順次置換した。その後、第１中間精製物（０．７３ｇ（藻体５０ｇ当量））を５０％メタノール水溶液に溶解させたものを上記ＯＤＳオープンカラムにアプライした。そして、９２０ｍＬの５０％メタノール水溶液を用いて溶出処理を行った後、さらに９２０ｍＬの７０％メタノール水溶液を用いて溶出処理を行った。７０％メタノール水溶液による溶出処理にて得られた画分を回収し、これを減圧濃縮することにより第２中間精製物を得た。
【００３３】
［３．ＨＰＬＣによる分画］
逆相高速液体クロマトグラフィを用いて第２中間精製物の精製を行った。この精製においては、保持時間２０〜２２分に現れるピークにて確認される画分、及び保持時間２２〜２４分に現れるピークにて確認される画分をそれぞれ回収した。このときのＨＰＬＣチャートを図１に示す。そして、保持時間２０〜２２分に現れるピークにて確認される画分を濃縮乾固することにより、目的の化合物（実施例１）を得た。また、保持時間２２〜２４分に現れるピークにて確認される画分を濃縮乾固することにより、目的の化合物（実施例２）を得た。なお、ＨＰＬＣの処理条件は以下のとおりである。
【００３４】
ｃｏｌｕｍｎ：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（１０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３０℃
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：６５％メタノール／水
ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２５４ｎｍ
＜実施例１の構造解析＞
［１．吸光スペクトル分析］
分光光度計を用いて、デュナリエラ・サリーナより単離した実施例１を、濃度４０μｍ／ｍＬとなるように７０％メタノール水溶液に溶解させて試験液を調製した。そして、この試験液について波長２００〜４００ｎｍにおける吸光スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。吸光スペクトル分析の結果から、実施例１は２３１ｎｍに極大吸収をもつことが示された。
【００３５】
［２．ＴＯＦ−ＭＳ分析］
実施例１の分子量を特定するためにＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果を図３に示す。ポジティブモードにてｍ／ｚ３６１［Ｍ＋Ｈ］＋に分子量ピークが認められたことから、実施例１の分子量は３６０であると考えられる。なお、ＴＯＦ−ＭＳ分析の条件は以下のとおりである。
【００３６】
分析方法：インフュージョン分析
試料濃度：１ｐｐｍ（７０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１０μＬ／ｍｉｎ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：７０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ＥＳＩ
Ｍｏｄｅ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ：２０Ｖ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５０℃
［３．ＮＭＲ分析］
実施例１の分子構造を特定するためにＮＭＲ分析を行った。所定量の実施例１を分取し、これを重水素置換メタノールに溶解させて水素を置換した。その後、デシケータ内にて完全に乾燥させた後、クロロホルムに溶解させて各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ１３５、ＤＥＰＴ９０、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。各ＮＭＲ分析において得られたＮＭＲスペクトルを図４〜１０に示すとともに、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表１及び２に示す。なお、ＮＭＲ分析の条件は以下のとおりである。
【００３７】
１３Ｃ−ＮＭＲ：１２５ＭＨｚ
１Ｈ−ＮＭＲ：５００ＭＨｚ
基準物質：テトラメチルシラン（ＴＭＳ）
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ９０、及びＤＥＰＴ１３５の結果から、１８種の炭素ピークが認められ、ＣＨ３を５個、ＣＨ２を３個、ＣＨを５個、Ｃを５個有することが示された。また、ケミカルシフトから酸素と結合した炭素が７個あり、そのうち１個は１９７．４ｐｐｍのシグナルを有することから共役したケトン基であると考えられる。そして、二重結合性の炭素のシグナルが２本存在し、二重結合が一つ存在すると考えられる。一方、１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＱＣの分析結果から、各炭素に対応する水素ピークが示された。とくに、二重結合性の炭素に対応する水素ピークのカップリング定数（Ｊ＝１６．０Ｈｚ）からトランス型の二重結合が存在することが示された。
【００４０】
上記のＮＭＲ分析の結果より導き出される実施例１の組成式はＣ１８Ｈ２６Ｏ７（分子量３５４）となる。しかし、この分子量はＴＯＦ−ＭＳ分析の結果（ｍ／ｚ＝３６０）より６低いことから、６個の酸素に水素が結合していると考えられる。したがって、ＴＯＦ−ＭＳ分析とＮＭＲ分析の結果から、実施例１の組成式はＣ１８Ｈ３２Ｏ７と決定した。
【００４１】
また、ＨＭＢＣ及びＨＨ−ＣＯＳＹの結果から、実施例１は下記一般式（２）、（３）に示す部分構造を有することが示唆される。
【００４２】
【化４】
さらに、ＨＨ−ＣＯＳＹの結果を見ると、Ｈ３とＨ４、Ｈ２−ａ、及びＨ２−ｂ間のカップリングが認められ、Ｈ３はマルチプレットであることから、Ｈ３の結合する炭素の両隣に水素と結合した炭素が結合していると考えられる。また、Ｈ７とＨ８間のカップリングが認められ、Ｈ７はダブレットであることから、Ｈ７の結合する炭素は４級炭素と結合していると考えられる。以上の結果から、実施例１は下記一般式（１）に示す構造を有する有機化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）であると構造決定した。
【００４３】
【化５】
＜実施例２の構造解析＞
［１．吸光スペクトル分析］
分光光度計を用いて、デュナリエラ・サリーナより単離した実施例２を、濃度８０μｍ／ｍＬとなるように７０％メタノール水溶液に溶解させて試験液を調製した。そして、この試験液について波長２００〜４００ｎｍにおける吸光スペクトルを測定した。その結果を図１１に示す。吸光スペクトル分析の結果から、実施例１は２３２ｎｍに極大吸収をもつことが示された。
【００４４】
［２．ＴＯＦ−ＭＳ分析］
実施例２の分子量を特定するためにＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果を図１２に示す。ポジティブモードにてｍ／ｚ３６１［Ｍ＋Ｈ］＋に分子量ピークが認められたことから、実施例２の分子量は３６０であると考えられる。なお、ＴＯＦ−ＭＳ分析の条件は上記と同様である。
【００４５】
［３．ＮＭＲ分析］
実施例２の分子構造を特定するためにＮＭＲ分析を行った。所定量の実施例２を分取し、これを重水素置換メタノールに溶解させて水素を置換した。その後、デシケータ内にて完全に乾燥させた後、クロロホルムに溶解させて各種ＮＭＲ分析（１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ１３５、ＤＥＰＴ９０、１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）を行った。各ＮＭＲ分析において得られたＮＭＲスペクトルを図１３〜１９に示すとともに、１３Ｃ−ＮＭＲ及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を表３及び４に示す。
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ９０、及びＤＥＰＴ１３５の結果、並びに１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＨＨ−ＣＯＳＹの結果から、実施例１と同様に実施例２の構造解析を行った。その結果、実施例２も上記一般式（１）に示す構造を有する化合物（（Ｅ）−８−（１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，６，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔ−３−ｅｎ−２−ｏｎｅ）であると構造決定した。
【００４８】
なお、実施例１及び実施例２のＮＭＲ分析の結果は非常に類似しているものの、同じではなかった。この結果から、実施例１と実施例２とは互いに立体異性体の関係であると考えられる。そこで、実施例１及び実施例２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値（ｐｐｍ）を比較した。その結果を表５に示す。
【００４９】
【表５】
表５に示すように、実施例２においては実施例１と比較して、Ｃ６及びＣ１０がそれぞれ１．３ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ高磁場へ、Ｃ８及びＣ９がそれぞれ２．６ｐｐｍ、１．６ｐｐｍ低磁場へシフトしている。この結果から、実施例１と実施例２とは、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、及びＣ１０付近の不斉炭素の立体構造が異なっていると考えられる。
【００５０】
＜抗ピロリ菌活性の評価＞
実施例１及び実施例２によるピロリ菌の増殖抑制効果（抗ピロリ菌活性）をディスク拡散法により評価した。ブルセラ寒天培地にて２日間微好気培養したピロリ菌をブルセラ液体培地に混和して、波長６００ｎｍで吸光度０．６を示す懸濁液を調製した。また、直径６ｍｍのディスク（Ｗｈａｔｍａｎ製Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ＡｓｓａｙＤｉｓｃｓ）に試料（実施例１、実施例２、又は実施例１と実施例２との質量比１：１の混合物）の溶液を染み込ませ、これを減圧乾燥させることにより、試料（乾燥質量９μｇ）を含むディスクを作成した。
【００５１】
そして、ブルセラ寒天培地に上記懸濁液を塗布するとともに、そのブルセラ寒天培地上に上記試料を含むディスクを置いた。３日間の微好気培養（３７℃、１０％ＣＯ２）の後、ブルセラ寒天培地に形成された阻止円の直径を定規にて測定し、この阻止円の直径に基づいて実施例１及び実施例２によるピロリ菌の増殖抑制効果を評価した。なお、本評価試験はＫＹＵ１（ＮＣＴＣ１１６３７株（米国）を高知大学医学部でスナネズミ感染を繰り返し分離した高度胃内感染定着株、抗生物質感受性株）、ＴＫ１４０２（日本、メトロニダゾール耐性株）、及びＮＹ３１（日本、クラリスロマイシン耐性株）の異なるピロリ菌３菌株についてそれぞれ行った。その結果を表６に示す。
【００５２】
【表６】
表６に示すように、ピロリ菌３菌株に対して、実施例１では１２〜１８ｍｍ、実施例２では１１〜１４ｍｍ、実施例１と実施例２の混合物では１２〜１６ｍｍの阻止円の形成を確認することができた。この結果から、実施例１及び実施例２は共に薬剤耐性のないピロリ菌だけでなく、薬剤耐性を有するピロリ菌に対しても同様の増殖抑制効果を発揮することが示された。なお、互いに異性体の関係にある実施例１及び２が略同等の抗ピロリ菌活性を有することから、上記一般式（１）で示される他の異性体においても、抗ピロリ菌活性を有することが推認される。
【００５３】
＜抗生物質との比較試験＞
臨床で用いられている抗生物質であるアモキシシリン（ＡＭＰＣ）、クラリスロマイシン（ＣＡＭ）、及びメトロニダゾール（ＭＮＺ）の抗ピロリ菌活性を評価し、実施例１及び実施例２との抗ピロリ菌活性の比較を行った。本試験においても、ディスク拡散法によりピロリ菌の増殖抑制効果を評価したが、ここではディスクに含ませる試料の量を変化させて１１〜１８ｍｍの阻止円を形成するために必要な試料の量（乾燥質量）を求めた。その結果を表７に示す。
【００５４】
【表７】
上記抗ピロリ菌活性の評価の結果から、実施例１及び実施例２の場合には、１１〜１８ｍｍの阻止円を形成するために必要な試料の量は約９μｇであった。これに対して、表７に示すように、アモキシリンの場合には、同様の阻止円を形成するために必要な試料の量は０．０１〜０．０１２μｇであり、３オーダー程度低い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。クラリスロマイシンの場合には、同様の阻止円を形成するために試料の量は０．００５〜０．０３μｇであり、３オーダー程度低い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。メトロニダゾールの場合には、同様の阻止円を形成するために必要な試料の量は４〜１００μｇであり、各実施例と同程度、又は各実施例よりも１オーダー程度高い濃度で各実施例と同様の抗ピロリ菌活性を発揮することが示された。これらの結果から、実施例１及び実施例２は、メトロニダゾールと同程度、又はそれ以上の抗ピロリ菌活性を有することが分かる。
【００５５】
＜抗生物質との併用試験＞
実施例１及び実施例２と各抗生物質とを併用した場合におけるピロリ菌の増殖抑制効果をディスク拡散法により評価した。本試験では、９μｇ（乾燥質量）の実施例１又は実施例２を含むディスクに対して、上記試験にて１１〜１８ｍｍの阻止円の形成が認められた含量（上記表７に示した量）で各抗生物質をさらに含ませるように処理したディスクを使用して試験を行った。また、比較対照として、実施例１、実施例２、及び各抗生物質を単独で含ませたディスクを用いて同様の試験を行った。その結果を表８に示す。
【００５６】
【表８】
表８に示すように、菌株ＫＹＵ１に対して、実施例１、実施例２、及び各抗生物質単独の場合には１４〜１７ｍｍの阻止円の形成が確認された。一方、実施例１又は実施例２と各抗生物質とを併用した場合には、単独の場合よりも大きい１５〜２５ｍｍの阻止円の形成が確認された。また、菌株ＴＫ１４０２及び菌株ＮＹ３１に対しても同様に、実施例１又は実施例２と各抗生物質とを併用した場合には、単独の場合よりも大きい阻止円の形成が確認された。これらの結果から、実施例１及び実施例２は抗生物質の抗ピロリ菌活性を阻害することなく、抗生物質と協調して抗ピロリ菌活性を発揮することが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする有機化合物。
【請求項２】
下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする請求項１に記載の有機化合物。
【請求項３】
下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする請求項１に記載の有機化合物。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の有機化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ピロリ菌剤。
【請求項５】
下記一般式（１）：
【化２】
で示されることを特徴とする有機化合物の製造方法であって、
水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いて、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、
前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
で示されることを特徴とする有機化合物。
【請求項２】
下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．５（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．５（ＣＨ２，Ｃ−３），３１．９（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．１（Ｃ，Ｃ−５），６５．５（Ｃ，Ｃ−６），５２．９（ＣＨ，Ｃ−７），７７．４（ＣＨ，Ｃ−８），６３．４（Ｃ，Ｃ−９），５９．２（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．１（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．８（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．４（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．３（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１４．６（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），３．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−７），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１０），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．４６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする請求項１に記載の有機化合物。
【請求項３】
下記理化学的性質：
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３４．１（Ｃ，Ｃ−１），３７．６（ＣＨ２，Ｃ−２），１９．６（ＣＨ２，Ｃ−３），３２．０（ＣＨ２，Ｃ−４），７９．５（Ｃ，Ｃ−５），６４．２（Ｃ，Ｃ−６），５２．８（ＣＨ，Ｃ−７），８０．０（ＣＨ，Ｃ−８），６５．０（Ｃ，Ｃ−９），５８．３（ＣＨ，Ｃ−１０），１３４．３（ＣＨ，Ｃ−１１），１４０．５（ＣＨ，Ｃ−１２），１９７．４（Ｃ，Ｃ−１３），２７．６（ＣＨ３，Ｃ−１４），２４．６（ＣＨ３，Ｃ−１５），２５．５（ＣＨ３，Ｃ−１６），２３．９（ＣＨ３，Ｃ−１７），１５．０（ＣＨ３，Ｃ−１８）
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２ａ），１．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２ｂ），１．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３），１．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−４ａ），１．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−４ｂ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−７），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），３．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１０），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，Ｈ−１１），６．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−１２），２．２９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１４），１．１６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１５），０．７３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１６），１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１７），１．５１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）
を有することを特徴とする請求項１に記載の有機化合物。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の有機化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ピロリ菌剤。
【請求項５】
下記一般式（１）：
【化２】
で示されることを特徴とする有機化合物の製造方法であって、
水、親水性有機溶媒、又は水と親水性有機溶媒との混合溶媒を用いて、緑藻網オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細網の藻体から前記有機化合物を含む抽出物を抽出する抽出工程と、
前記抽出物から前記有機化合物を単離する単離工程とを有することを特徴とする有機化合物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１２−２１４４２６（Ｐ２０１２−２１４４２６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８２２４８（Ｐ２０１１−８２２４８）
【出願日】平成２３年４月１日（２０１１．４．１）
【出願人】（５９３２０６９６４）マイクロアルジェコーポレーション株式会社 (17)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１日（２０１１．４．１）
【出願人】（５９３２０６９６４）マイクロアルジェコーポレーション株式会社 (17)
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
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