有機化合物
本発明は、真核細胞培養方法における使用および興味ある組換え産物の発現のための新規選択系に関する。選択系は、外因性機能性膜結合葉酸受容体遺伝子と興味ある産物をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の真核細胞への導入に基づき、細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞で広く利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、真核細胞培養方法における使用および興味ある組換え産物の発現のための新規選択系に関する。選択系は、外因性機能性の膜結合葉酸受容体遺伝子と興味ある産物をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の真核細胞への導入に基づき、細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞で広く利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
選択マーカーおよび選択系は遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術および真核細胞培養における組換え産物、例えば、抗体、ホルモンおよび核酸の生産において広く使用される。このような優性選択マーカーおよび選択系の主要目的は選択可能な遺伝子を導入し、選択的な培養条件下に暴露し、興味ある組換え産物の高レベルの生産が可能である細胞を提供することである。
【０００３】
今日までに、３つの主な選択マーカー系を利用している：
【０００４】
（ａ）グルタミン合成酵素系：酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）はグルタミン酸およびアンモニアからグルタミンの生合成に関与する。この生合成反応は哺乳動物細胞においてグルタミン形成のための唯一の経路を提供する。したがって、培養培地中においてグルタミンの非存在下で、酵素ＧＳは培養中の哺乳動物細胞の生存に不可欠である。重要なことには、マウス骨髄腫細胞を含む特定の哺乳動物細胞系はＧＳの十分な発現を欠いており、したがって、外からグルタミンの添加なしに生存することができない。したがって、このような細胞系は、この系において選択可能なマーカーとして機能することができ、グルタミンを欠いている培地中で細胞培養を可能にする、トランスフェクトされたＧＳ遺伝子のための適当なアクセプターである。対照的に、広く使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような細胞系は十分なＧＳを発現し、グルタミン−フリー培地における培養を支える。したがって、これらのＣＨＯ細胞がＧＳ遺伝子のトランスフェクションのためにレシピエント細胞として使用されるとき、特異的かつ強力なＧＳ阻害剤のメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）は、高レベルのトランスフェクトされたＧＳ遺伝子を発現するトランスフェクタントのみがグルタミン−フリー培地中で生存することができるように、内因性ＧＳ活性を阻害するために適用することができる。ＧＳ系の主な不利な点は、興味ある標的遺伝子を安定に過剰発現する細胞を確立するために、比較的に長期（すなわち２−６月）の選択的な培養の点である。別の不利な点は選択的な圧力の増加のための細胞毒性剤のＭＳＸの頻繁な利用である。興味ある組換え産物（例えば、抗体のようなポリペプチド）と一緒でのこのような細胞毒性剤の存在は、この細胞毒性剤を取り除くためにさらなる精製工程を必要とし得る。
【０００５】
（ｂ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ／ＭＴＸ選択系：ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）はジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）へのＮＡＤＰ−依存還元を触媒する。次にＴＨＦはプリンおよびチミジル酸のデノボ生合成においてそれぞれ使用される１０−ホルミル−ＴＨＦおよび５，１０−メチレン−ＴＨＦに相互転換される。ＤＨＦは５，１０−メチレン−ＴＨＦ−依存反応におけるｄＵＭＰのｄＴＭＰへの変換を触媒するチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の触媒活性の副産物である。したがって、ＤＨＦＲはＤＮＡ複製のために必要であるプリンおよびピリミジンヌクレオチドの生合成に不可欠であるＴＨＦ補因子のリサイクルのために極めて重要である。したがって、（すなわち標的されたゲノム欠失により）ＤＨＦＲ遺伝子を欠いている細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）はヌクレオチドフリーである培地中でＤＨＦＲ遺伝子のトランスフェクションのためのレシピエントとして使用することができる。トランスフェクション後、細胞を非常に強力なＤＨＦＲ阻害剤（Ｋｄ＝１ｐＭ）である抗葉酸剤ＭＴＸの濃度において段階的な増加に付し、それにより細胞に増加したレベルのＤＨＦＲを生産させることができる。選択の複数の循環により、選択可能なマーカーＤＨＦＲは頻繁に有意な遺伝子増幅を引き起こす。さらに、ＭＴＸに対する主な耐性を有する変異マウスＤＨＦＲも、トランスフェクタント細胞において高レベルのＭＴＸ−耐性の獲得を顕著に高める、優性選択可能なマーカーとして広く使用されている。ＤＨＦＲ／ＭＴＸ選択系の主な不利な点は、この技術が変異原細胞毒性剤のＭＴＸを利用し、容易にレシピエント細胞の遺伝子型を変え得ることである。さらに、このような薬剤を扱う人間を保護するために、特定の安全対策を取り得る。これは頻繁に、興味ある標的遺伝子の発現が還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）における機能喪失突然変異および／またはＲＦＣ遺伝子発現の喪失（これら両方はＭＴＸ摂取を破壊する）により起こらない、ＭＴＸ−耐性細胞集団を引き起こす。別の不利な点は、変異原剤ＭＴＸが、培養培地に含まれる過剰発現され、分泌された標的産物（例えば、抗体のようなポリペプチド）を容易に汚染し、それにより、この変異原化合物ＭＴＸを取り除くために必要な労働集約型で、時間がかかり、高額なクロマトグラフ法が必要であり得ることである。加えて、最終産物においてＭＴＸが存在しないことは、それぞれのアッセイにより測定する必要がある。
【０００６】
（ｃ）還元型葉酸キャリア選択系：還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）は、５−メチル−ＴＨＦおよび５−ホルミル−ＴＨＦのような還元型葉酸の摂取のための主な輸送体として働く、遍在的に発現される膜糖タンパク質である。しかしながら、ＲＦＣは酸化型葉酸、葉酸に対して非常に乏しい親和性を示す。したがって、ＲＦＣの発現を欠いているか、またはゲノムＲＦＣ位置を欠失している細胞は、５−ホルミル−ＴＨＦのような還元型葉酸を培養培地から段階的に不足にさせ、それにより細胞に増加したレベルのこの葉酸輸送体を発現させる条件下で、選択可能なマーカー遺伝子ＲＦＣのトランスフェクションのためのレシピエントとして働くことができる。ＲＦＣ選択系に関していくつかの不利な点がある：ａ）１つは内因性ＲＦＣ位置が標的ノックアウトまたは機能喪失突然変異によりノックアウトされているか、または不活性化されているＲＦＣ−ｎｕｌｌ レシピエント細胞を使用しなければならない。ｂ）ＲＦＣは葉酸に対して極度に乏しい輸送親和性を有し、したがって、この酸化型葉酸は選択のために使用することができない。ｃ）一方向の葉酸摂取系であり、以下に詳細に説明されている普通の葉酸−受容体ベース系とは対照的に、ＲＦＣは葉酸の等しく強力な取り込みおよび排出を示す二方向の葉酸輸送体である。これは、葉酸欠乏の条件下で、ＲＦＣ過剰発現が、過剰発現したＲＦＣを介して葉酸をさらに排出するレシピエント細胞に有害であり得ることを意味する。
【０００７】
本発明の目的は上記の先行技術の選択系を越える特定の利点を有する新規代謝選択系を提供することである。新規選択系は、細胞培養培地中の葉酸の使用および発現ベクターを介して興味ある産物を生産することを意図された組換え真核細胞に導入された葉酸受容体の存在に基づく。この新規手段は内因性葉酸受容体（ＦＲ）遺伝子の事前の欠失を必要としない。ＦＲ選択可能な遺伝子ならびに（ポリペプチドのような）興味ある産物をコードするポリヌクレオチドの両方を有するベクターの導入後、細胞を極度に限界濃度の葉酸を含む選択的な培地中で培養する。したがって、ＦＲを顕著に過剰発現する細胞のみが細胞培養、ＤＮＡ複製および細胞増殖を維持するために十分な葉酸を取ることができ、それにより興味ある標的産物の過剰発現が可能となる。
【０００８】
酸化型葉酸、すなわち葉酸、ならびに還元型葉酸またはテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）として知られている葉酸の還元された誘導体は真核細胞、特に哺乳動物細胞におけるプリン、チミジル酸および特定のアミノ酸の生合成のために必須の補因子および／または補酵素であるＢ−９ビタミンのグループである。ＴＨＦ補因子はＤＮＡ複製、したがって細胞増殖のために特に極めて重要である。具体的に、ＴＨＦ補因子はプリンおよびチミジル酸、アミノ酸ならびにＤＮＡのＣｐＧアイランドのメチル化を含むメチル基代謝のデノボ生合成を含む一連の相互接続された代謝経路において一炭素単位の供与体として機能する。具体的に、１０−ホルミル−ＴＨＦ（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）を含むＴＨＦ補因子は、プリンのデノボ生合成に関与する２つの重要なデノボホルミルトランスフェラーゼ反応における一炭素単位を与える。第１の酵素であるグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴＦ）はプリンのイミダゾール環の形成に関するが、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲＴＦ）が介在するさらに下流の反応はプリン中間体のイノシン５’−一リン酸（ＩＭＰ）を産生する。後者はＡＭＰおよびＧＭＰの制御された生合成のための重要な前駆体として働く。さらに、５，１０−メチレン−ＴＨＦ（５，１０−ＣＨ２−ＴＨＦ）は、酵素であるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）に関する極めて重要な補因子として機能する別の重要なＴＨＦ補酵素である。ＴＳはｄＵＭＰからチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）の形成を触媒する。したがって、これらの葉酸−依存酵素は、ＤＮＡ複製に不可欠であるプリンおよびチミンヌクレオチドのデノボ生合成の重要なメディエーターである。それ自体、これらの葉酸−依存酵素は、抗葉酸剤として知られている葉酸アンタゴニストの活性のための標的として同定された。例えば、４−アミノ葉酸類似体であるアミノプテリンおよびその相同体である４−アミノ−１０−メチル葉酸メトトレキサート（ＭＴＸ）は、小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の化学療法に関する診療に導入された代謝拮抗剤の第１のクラスであった。抗葉酸剤は、骨肉腫、乳癌、原発性中枢神経系リンパ腫、絨毛癌および妊娠性トロホブラスト腫瘍を含む他のヒト悪性腫瘍の処置のために現在使用されている異なる化学療法レジメンの現在、重要な成分である。
【０００９】
自身が葉酸を合成する多数の原核生物、植物、菌類および特定の生物(protest)とは対照的に、哺乳動物および他の真核細胞種はＴＨＦ補因子生合成を欠いており、したがって外因性源からそれらを得る必要がある。３つの独立した輸送系が現在、哺乳動物細胞における葉酸および抗葉酸剤の摂取を介在することが知られている：
【００１０】
ａ）還元型葉酸の補因子の主な細胞輸送系は還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）である。ＲＦＣ（溶質キャリアファミリー１９メンバー１、ＳＬＣ１９Ａ１としても既知である）は、非常に高い細胞内レベルに蓄積することで知られているアデニンヌクレオチドのような有機リン酸ならびにチアミン一リン酸およびピロリン酸を交換することにより、還元型葉酸の困難な輸送を介在する二方向の促進キャリアとして機能する〜８５ｋＤａの膜糖タンパク質を遍在的に発現させる。ＲＦＣはロイコボリン（５−ホルミル−ＴＨＦ；Ｋｔ＝１μＭ）を含むＴＨＦ補因子に対して高い親和性を示すが、酸化型葉酸である葉酸に対して非常に乏しい輸送親和性（Ｋｔ＝２００−４００μＭ）を有する。
【００１１】
ｂ）葉酸摂取の別の経路は最近クローニングされたプロトン共役葉酸輸送体（ＰＣＦＴ、ＳＬＣ４６Ａとしても既知である）である。ＰＣＦＴはＲＦＣと独立して発現するようであり、酸性ｐＨ（５．５）で最適に機能し、そして酸化型（例えば、葉酸）およびＴＨＦ補因子（すなわち還元型葉酸）ならびにＭＴＸを含む種々の親水性抗葉酸剤の両方の流入を介在する。生理学的ｐＨ（７．４）ではなく酸性ｐＨ（５．５）で葉酸および抗葉酸剤の最適輸送を示すＰＣＦＴは、上部小腸における葉酸および抗葉酸剤の両方の吸収において重要な役割を有する。
【００１２】
ｃ）本発明が基づく第３の輸送経路は葉酸受容体（ＦＲ）を含む。ＦＲは、３つの別個の遺伝子、ＦＲα（ＦＲアルファ）、ＦＲβ（ＦＲベータ）およびＦＲγ（ＦＲガンマ）によってコードされる高親和性の葉酸結合糖タンパク質である。ＦＲα（またはＦＲ−アルファ）は、また、成体葉酸結合タンパク質またはＦＤＰとして、葉酸受容体１またはＦＯＬＲ（マウスにおいてｆｏｌｂｐ１）として、および卵巣癌関連抗原またはＭＯｖ１８として知られている。ＦＲβ（またはＦＲベータ）は、また、ＦＯＬＲ２（胎児）およびＦＢＰ／ＰＬ−１（胎盤）として知られている。ＦＲγ（またはＦＲガンマ）は、また、ＦＯＬＲ３およびＦＲ−Ｇとして知られている（M.D. Salazar and M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-52.により概説されている）。よく特徴付けられている成熟ＦＲは〜７０−８０％のアミノ酸同一性で同種のタンパク質であり、２２９から２３６個のアミノ酸ならびに２から３個のＮ−グリコシル化部位を含む。ＦＲα（ＦＲアルファ）およびＦＲβ（ＦＲベータ）は膜結合、特にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー、細胞表面糖タンパク質であるが、ＦＲγはＧＰＩアンカーを欠いており、分泌されるタンパク質である。ＦＲα（ＦＲアルファ）およびＦＲβ（ＦＲベータ）は、葉酸（Ｋｄ＝０．１−１ｎＭ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ；ロメテレキソール；Ｋｉ＝０．４−１．３ｎＭ 基質として［３Ｈ］葉酸を使用する）およびＢＧＣ９４５（これは還元型葉酸キャリアを介するのでなく単にＦＲα（ＦＲアルファ）を介して特異的に輸送されるシクロペンタ［ｇ］キナゾリン−ベースのチミジル酸シンターゼ阻害剤である）（Ｋｄ＝１ｎＭ）に対して高親和性を示すが、ＭＴＸ（Ｋｄ＞１００ｎＭ）に対して非常に低い親和性を示す。葉酸および抗葉酸剤のＦＲ−依存摂取は受容体−介在エンドサイトーシスの古典的メカニズムを介して前進する。遺伝子ノックアウト試験によって、ＦＲα（ＦＲアルファ）（マウスにおいて、Ｆｏｌｂｐ１としても知られている）が初期胚発生および母体の葉酸補充のために不可欠であり、子宮内における胚を死亡から救出し、正常発生を可能にすることが示されている。
【００１３】
今日までに知られている選択系の１つ以上の不利な点を克服する安全で極めて効率の良いコスト的に有効な選択系に対する継続した必要性がある。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明は、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクターに関する。
【００１５】
本発明は、さらに、細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、ベクターによってコードされる機能性葉酸受容体を細胞により発現するように該発現ベクターが安定に導入された真核細胞に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、興味ある産物を高収率で安定に発現することができる組換え真核細胞を提供するための選択方法に関する。
【００１７】
本発明は、高収率で興味ある産物の生産方法において好都合に利用することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明において、今回驚くべきことに、興味ある産物を生産することができる組換え真核細胞を提供するための選択系が、細胞培養培地中の葉酸の限定された利用に基づくことができることを見出した。該系は広く、すなわち細胞生存性が葉酸摂取に依存する真核細胞に適用できる。
【００１９】
該新規系は、細胞毒性剤の非存在下で高レベルの組換え産物を安定に過剰発現する、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞クローンの迅速な選択、スクリーニングおよび確立のために使用することができる。さらに、他の既知の選択系と対照的に、例えば、内因性遺伝子を変異またはノックアウトすることにより提供された修飾された細胞に対して必須の必要性がない（ときどき実行可能であるが）。例えば、ＦＲα（ＦＲアルファ）は、例えば、ＲＦＣがロイコボリン（Ｋｔ＝１μＭ）に対するよりも、ＦＡ（ＫＤ＝０．１ｎＭ）に対して高い親和性を示し、一方向経路を介して細胞に葉酸を輸送するため、本発明は特に培養培地からの段階的な葉酸（例えば、葉酸）欠乏を介して、顕著に改良された優性の代謝選択可能なマーカーとしてのＦＲα（ＦＲアルファ）および他の葉酸受容体の使用のために提供する。新規葉酸−ベース選択は、種々の過剰発現系において日常的に使用される細胞毒性剤選択の非存在下で、培養された哺乳動物細胞における標的タンパク質の迅速な安定な高レベルの過剰発現のために非常に適している優れた戦略である。
【００２０】
新規選択系は、先行技術で利用できる選択系を越えるいくつかの重要な利点を示す。
【００２１】
１． 本発明による選択系は非常に迅速な選択系である：葉酸欠乏４週間以内に、興味ある標的遺伝子を発現する細胞集団またはクローン細胞誘導体を容易に単離することができる。これは、標的遺伝子の選択および安定化に２−６月必要であり得る上記ＧＳ系と対照的である。
【００２２】
２． 本発明による選択系はトランスフェクション前に内因性ＦＲα（アルファ）、β（ベータ）またはγ（ガンマ）遺伝子のゲノム欠失または減衰を必要とせず、したがって、いくつかの内因性ＦＲ遺伝子発現が存在するときでさえ、すべてのレシピエント細胞に適用することができる。この重要な利点はＦＲα（ＦＲアルファ）トランスフェクション後の、細胞を培養培地から急激かつ激しい葉酸（例えば、葉酸）の欠乏に暴露することができる事実に基づく。結果として、有意な量の選択可能なＦＲα（ＦＲアルファ）マーカーを発現するトランスフェクタント細胞のみが十分な葉酸を輸送し、ＤＮＡ複製および細胞増殖を維持することができる。これは内因性ＦＲα（ＦＲアルファ）遺伝子の発現において有意な上昇の欠如で起こる。これは、レシピエント細胞を内因性ＤＨＦＲ遺伝子に関して頻繁に欠失する、上記ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系と対照的である（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞およびＣＨＯ Ｄｕｘ細胞）。
【００２３】
ｃ） 本発明による選択系は、内因性ＲＦＣの増加した発現を含む葉酸摂取の別の経路の増加した発現を介する選択的な圧力の軽減による選択のストリンジェンシーの喪失に苦しまない。この重要な利点は、ＦＲα（ＦＲアルファ）が葉酸に対して優れた親和性（Ｋｄ＝０．１ｎＭ）を有するが、ＲＦＣは葉酸に対して極度に乏しい親和性（Ｋｍ＝０．２−０．４ｍＭ）を示す事実による。対照的に、ＭＴＸ選択において、選択可能なマーカー発現を有さないか、または発現の乏しいＭＴＸ−耐性細胞を頻繁に得られるため、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系を含む種々の先行技術の選択系は選択のストリンジェンシーの厳しい喪失に苦しむ。ＲＦＣの機能の喪失の代わりに、主なＭＴＸ輸送体は頻繁にＭＴＸ耐性メカニズムとなり得る。これはＲＦＣ遺伝子における不活性化変異の頻繁な発生またはＲＦＣ遺伝子発現の激しい喪失により示されている。
【００２４】
ｄ） 本発明による選択系は、レシピエント細胞ならびに興味ある標的遺伝子の遺伝子型を変え得る、ＤＨＦＲ系におけるＭＴＸまたはＧＳ系におけるＭＳＸのような細胞毒性剤および／または変異原化合物を使用しない。むしろ、ＦＲ選択は培養培地からのビタミンの欠乏の原理を利用する。
【００２５】
したがって、１つの局面において、本発明は機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド（すなわち、選択可能なマーカー遺伝子）および興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクターに関する。
【００２６】
本発明における機能性膜結合葉酸受容体は、特に真核細胞への葉酸の一方向の取り込みまたは摂取ができる機能性膜結合受容体として定義される。
【００２７】
本発明における葉酸は酸化型葉酸（すなわち、葉酸）または還元型葉酸のいずれかであり得る。一般的に、葉酸を機能性膜結合葉酸受容体により真核細胞に取り込むことができる限り、このような葉酸は本発明において有用であり得る。酸化型葉酸の好ましい例は葉酸である。還元型葉酸の好ましい例は、５−メチル−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸である。
【００２８】
好ましい態様において、本発明の発現ベクターは機能性膜結合葉酸受容体および興味ある産物の両方を真核細胞において発現させることができる。
【００２９】
第２のポリヌクレオチドによってコードされる興味ある産物は、第２のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝情報の転写、翻訳または発現の他の何らかの事象により生産することができるすべての生物学的産物であり得る。この点において、該産物は発現産物であり得る。例えば、好ましい態様において、このような産物はポリペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される。“ポリペプチド”はペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸のポリマーを含む分子を意味する。“ポリペプチド”なる用語はあらゆる長さのポリペプチドを含み、大きな分子（例えば、約５０個以上のアミノ酸を含む）の場合、“タンパク質”と呼ばれ、小さい分子（例えば、２−４９個のアミノ酸を含む）の場合、“ペプチド”と呼ばれ得る。該産物は薬学的または治療的に活性な化合物またはアッセイなどにおいて利用される研究道具であり得る。特に好ましい態様において、該産物はポリペプチド、好ましくは薬学的または治療的に活性なポリペプチドまたは診断または他のアッセイなどにおいて利用される研究道具である。より好ましい態様において、ポリペプチドは免疫グロブリン分子または抗体またはそれらのフラグメント（特に機能性フラグメント）、例えば、キメラまたは部分的にもしくは全体的にヒト化抗体である。このような抗体は診断抗体または薬学的もしくは治療的に活性な抗体であり得る。典型的に、興味ある産物は発現のために使用される真核細胞宿主細胞と異種であり、これは宿主細胞がトランスフェクション前に興味ある産物を天然または内因性的に生産しないことを意味する。むしろ、興味ある産物の生産または発現を達成するために、興味ある産物をコードするポリヌクレオチドは、特に本発明における発現ベクターとのトランスフェクションにより、真核細胞宿主細胞に導入されるべきである。
【００３０】
本発明におけるベクターは直線形態または、好ましくは、円形態、例えば、プラスミドで存在し得る。
【００３１】
興味あるポリヌクレオチドの発現のために使用されるベクターは、通常、転写を駆動するために適当な転写調節因子、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写停止または終結シグナルを含む。所望の産物がタンパク質であるとき、通常、適当な翻訳調節因子、例えば、リボソームを動員するために適当な５’キャップ構造による５’非翻訳領域および翻訳プロセスを終結するための終止コドンがベクター中に含まれる。特に、選択可能なマーカー遺伝子として働くポリヌクレオチドならびに興味ある産物をコードするポリヌクレオチドの両方は、適当なプロモーターに存在する転写因子のコントロール下で転写される。選択可能なマーカー遺伝子および興味ある産物の遺伝子の両方の得られる転写産物は、かなりのレベルのタンパク質発現（すなわち翻訳）を容易にする機能性翻訳因子を有する。
【００３２】
したがって、好ましい態様は、本発明において第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが別個の転写プロモーターのコントロール下である発現ベクターに関する。一般的に、真核細胞において第１および／または第２のポリヌクレオチドの発現、特に転写を促進することができるプロモーターが適当である。好ましい態様において、別個の転写プロモーターが同じである。別の好ましい態様において、別個の転写プロモーターが異なっている。好ましくは、転写プロモーターはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される。これらの好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターはＣＭＶプロモーターまたは、より好ましくはＳＶ４０プロモーターである。特に好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターはＳＶ４０プロモーターである。
【００３３】
本発明の発現ベクターの他の好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは共通の転写プロモーターのコントロール下である。好ましくは、このような転写プロモーターはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される。これらのさらに好ましい態様において、共通の転写プロモーターはＳＶ４０プロモーターである。このような共通の転写プロモーターを有する発現ベクターのさらに好ましい態様は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド間に機能的に位置するＩＲＥＳ因子を含む。
【００３４】
本発明において利用される発現ベクターに関する手段により真核細胞宿主細胞に導入された膜結合葉酸受容体は、本発明において機能性である、すなわち利用される真核細胞と適合性である限り、あらゆる種由来であり得る。好ましくは、哺乳動物種由来の葉酸受容体、例えば、齧歯動物由来のもの、または、さらに好ましくは、ヒト葉酸受容体を使用する。一般的に、真核宿主細胞に導入され、選択マーカーとして利用される葉酸受容体は宿主細胞の内因性葉酸受容体と同種または異種であり得る。それが同種であるとき、それは宿主細胞と同じ種由来であり、例えば、宿主細胞の内因性葉酸受容体と同一であり得る。それが異種であるとき、それは宿主細胞以外の他の種由来であり、したがって宿主細胞の内因性葉酸受容体と相違であり得る。一般的に、選択マーカーとして利用される導入された葉酸受容体は宿主細胞と異種である。例えば、ヒト由来葉酸受容体は齧歯動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に対する選択マーカーとして使用され得る。
【００３５】
好ましくは、本発明の発現ベクターの第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される。機能性変異体は、すなわち真核細胞により摂取し、細胞の葉酸代謝を介して細胞の生存に寄与することができる、生理学的態様において機能性である葉酸受容体の誘導体を含む。例えば、葉酸受容体の変異型は置換、欠失および／または付加のような１個以上のアミノ酸変異体ならびにポリマー、例えば、ポリエチレングリコール構造（ＰＥＧ）のような化学的な部分が葉酸受容体と結合している化学誘導体を含む。好ましくは、第１のポリヌクレオチドによってコードされる葉酸受容体はヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）、ヒト葉酸受容体ベータ（ｈＦＲβ）またはそれらの機能性変異体である。さらに好ましくは、好ましくは下記アミノ酸配列（配列番号１、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有するヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である：
ＭＡＱＲＭＴＴＱＬＬＬＬＬＶＷＶＡＶＶＧＥＡＱＴＲＩＡＷＡＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫＰＧＰＥＤＫＬＨＥＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶＬＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥＱＷＷＥＤＣＲＴＳＹＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷＮＷＴＳＧＦＮＫＣＡＶＧＡＡＣＱＰＦＨＦＹＦＰＴＰＴＶＬＣＮＥＩＷＴＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＰＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＳＧＡＧＰＷＡＡＷＰＦＬＬＳＬＡＬＭＬＬＷＬＬＳ
【００３６】
他の好ましい態様は下記アミノ酸配列（配列番号２、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有するヒト葉酸受容体ベータ（ｈＦＲβ）に関する：
ＭＶＷＫＷＭＰＬＬＬＬＬＶＣＶＡＴＭＣＳＡＱＤＲＴＤＬＬＮＶＣＭＤＡＫＨＨＫＴＫＰＧＰＥＤＫＬＨＤＱＣＳＰＷＫＫＮＡＣＣＴＡＳＴＳＱＥＬＨＫＤＴＳＲＬＹＮＦＮＷＤＨＣＧＫＭＥＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＮＱＴＷＲＫＥＲＦＬＤＶＰＬＣＫＥＤＣＱＲＷＷＥＤＣＨＴＳＨＴＣＫＳＮＷＨＲＧＷＤＷＴＳＧＶＮＫＣＰＡＧＡＬＣＲＴＦＥＳＹＦＰＴＰＡＡＬＣＥＧＬＷＳＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＳＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＨＶＮＡＧＥＭＬＨＧＴＧＧＬＬＬＳＬＡＬＭＬＱＬＷＬＬＧ
【００３７】
あるいは、本発明は天然環境において膜結合しない葉酸受容体に関する。このような非膜結合受容体を、例えば、非膜結合葉酸受容体と別のポリペプチドの膜貫通領域の融合タンパク質を提供することにより、膜結合するように変異させることができる。他の変異型も可能であり、これは当業者が容易に利用できる。この点において、好ましい例は可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）、好ましくはヒト可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）に基づく。それらのより好ましい態様において、ヒト可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）は下記アミノ酸配列（配列番号３、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有する：
ＭＤＭＡＷＱＭＭＱＬ ＬＬＬＡＬＶＴＡＡＧ ＳＡＱＰＲＳＡＲＡＲ ＴＤＬＬＮＶＣＭＮＡ ＫＨＨＫＴＱＰＳＰＥ ＤＥＬＹＧＱＣＳＰＷ ＫＫＮＡＣＣＴＡＳＴ ＳＱＥＬＨＫＤＴＳＲ ＬＹＮＦＮＷＤＨＣＧ ＫＭＥＰＴＣＫＲＨＦ ＩＱＤＳＣＬＹＥＣＳ ＰＮＬＧＰＷＩＲＱＶ ＮＱＳＷＲＫＥＲＩＬ ＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥ ＲＷＷＥＤＣＲＴＳＹ ＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷ ＮＷＴＳＧＩＮＥＣＰ ＡＧＡＬＣＳＴＦＥＳ ＹＦＰＴＰＡＡＬＣＥ ＧＬＷＳＨＳＦＫＶＳ ＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩ ＱＭＷＦＤＳＡＱＧＮ ＰＮＥＥＶＡＫＦＹＡ ＡＡＭＮＡＧＡＰＳＲ ＧＩＩＤＳ
次に、これは、本発明の内容の葉酸摂取ができる機能性膜結合葉酸受容体を形成するために、変異、あるいは遺伝的に改変または誘導体化され得る。
【００３８】
さらなる局面において、本発明における発現ベクターは１つ以上の付加的な選択マーカーをコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含み得る。したがって、好ましい態様において、本発明の葉酸系と１つ以上の異なる選択系（例えば、ｎｅｏ／Ｇ４１８）を利用する共選択を最適な実施を提供するために適用することができる。
【００３９】
別の局面において、本発明は、細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドが安定に導入された真核細胞であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する真核細胞に関する。それらの好ましい態様において、機能性膜結合葉酸受容体および興味ある産物は真核細胞により発現する。
【００４０】
発現ベクターを介して細胞系に導入された機能性膜結合葉酸受容体に加えて、本発明における真核細胞は少なくとも１つの内因性機能性の一方向機能性葉酸輸送系、特に１つ以上の内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含み得る。以下に記載されているとおり、選択方法がこのような内因性の一方向機能性葉酸輸送系の存在下でさえ、すなわちこのような内因系を維持している場所でさえ利用することができることが、本発明の利点である。したがって、さらなる好ましい態様は、少なくとも１つの内因性の一方向機能性葉酸輸送系を含む本発明の真核細胞であって、このような内因性の一方向機能性葉酸輸送系が好ましくは少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含む真核細胞に関する。それらの好ましい態様において、内因性機能性の膜結合葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）および葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）からなる群から選択される。
【００４１】
他の好ましい態様は、少なくとも、例えば、１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含む内因性の一方向機能性葉酸輸送系が完全な活性を欠いている、すなわち減衰している、本発明における真核細胞に関する。このような減衰は、例えば、点突然変異、遺伝子破壊などによる、例えば、問題の内因性葉酸輸送系、例えば、内因性機能性の膜結合葉酸受容体の何らかのタイプの突然変異生成により提供され得る。該減衰は部分的または全体的であり得る。後者の場合、本発明における真核細胞は内因性機能性の一方向機能性葉酸輸送系、例えば、内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含まない。したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明の発現ベクターを安定に導入され、少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体の完全な活性を欠いている、真核細胞に関する。
【００４２】
該宿主細胞に導入された発現ベクターに関して、本明細書に記載されている好ましい態様を含む本発明のすべての発現ベクターが利用することができる。本発明の真核細胞の好ましい態様において、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドは同じ発現ベクターに位置する。好ましくは、このような発現ベクターは本発明における、すなわち本明細書に記載されている発現ベクターである。
【００４３】
本発明における真核細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および菌類からなる群から選択される。菌類および植物細胞に関して、これらは、通常、葉酸に関して原栄養性である（すなわち、このような細胞はこれらの細胞生存性、すなわち細胞培養および増殖のために必要な葉酸を自発的に合成することができる）。本発明は、特に葉酸に対する栄養要求性となり得るこのような菌類および植物細胞を含む。これは、例えば、遺伝子操作によるものであり得る、すなわち、今回、細胞はそれらの細胞生存に必要な十分な量の葉酸を合成することができない。例えば、適当な代謝経路を介して葉酸を内因的に生合成するこのような菌類または植物細胞の能力は、例えば、適当な標的遺伝子の遺伝子破壊もしくは遺伝子サイレンシングまたは重要な酵素の阻害などにより不活性化される。
【００４４】
それらの好ましい態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは、このような哺乳動物細胞は齧歯動物細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群から選択される。特に好ましくは齧歯動物細胞であり、好ましくはＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、マウス３Ｔ３繊維芽細胞およびＳＰ２／０細胞からなる群から選択される。さらに特に好ましい齧歯動物細胞はＣＨＯ細胞である。また、好ましくはヒト細胞であり、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択される。さらに好ましくはサル細胞であり、好ましくは、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。
【００４５】
他の態様において、本発明は、細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞を提供し、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入することを含む本発明における真核細胞の生産方法であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する方法に関する。好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ発現ベクターに位置し、より好ましい態様において、該ベクターは本発明における、すなわち本明細書に記載されている発現ベクターである。
【００４６】
本発明のさらに他の局面は、細胞に導入された発現ベクターによってコードされる興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択方法であって、
（ｉ）細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入された複数の真核細胞を提供し（第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する）、
（ｉｉ）限界濃度の葉酸を有する細胞培養培地中で該複数の真核細胞を培養し、それにより興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を得る
ことを含む方法に関する。原則として、このような葉酸は酸化型葉酸または還元型葉酸であり得る。好ましいものは酸化型葉酸、特に葉酸である。
【００４７】
葉酸の限界量に関して、培地中の適当な濃度は宿主細胞の必要条件および適用される選択条件のストリンジェンシーにしたがって当業者により測定することができる。葉酸(folic acid)を葉酸(folate)として、例えば、ＣＨＯ宿主細胞と使用する場合、ストリンジェントな選択方法のための細胞培養培地中の葉酸の適当な濃度は約１００ｎＭ以下、好ましくは約３０ｎＭ以下または約１０ｎＭ以下である。例えば、葉酸の適当な濃度は０．００１ｎＭ−１００ｎＭの範囲、好ましくは０．０１ｎＭ−１００ｎＭの範囲、より好ましくは０．１ｎＭ−１００ｎＭの範囲または１ｎＭ−１００ｎＭの範囲の任意の値を有し得る。同様に好ましくは０．００１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、０．０１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、０．１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、１ｎＭ−３０ｎＭの範囲または３ｎＭ−１０ｎＭの範囲である。例えば、選択に適当な細胞培養培地中の葉酸濃度は１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭまたは３０ｎＭであり得る。
【００４８】
ロイコボリンのような還元型葉酸を選択方法において使用する場合、それらの濃度は再び宿主細胞の必要条件および適用される選択条件のストリンジェンシーにしたがって当業者により測定することができる。細胞培養培地中のロイコボリンの濃度は、例えば、ストリンジェントな選択方法のために０．２ｎＭ−２ｎＭの範囲であり得る。
【００４９】
それらのさらなる態様において、選択方法はさらに興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を同定および単離することを含む。
【００５０】
選択方法のさらに好ましい態様において、複数の真核細胞は本発明における、すなわち本明細書に記載されている真核細胞から構成される。
【００５１】
本発明のこの局面のさらなる好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５２】
本発明の他の態様は、
（ｉ）本発明における、すなわち本明細書に記載されている選択方法を実施し、
（ｉｉ）該細胞培養培地または該細胞から興味ある産物を単離する
ことを含む、興味ある産物の生産方法に関する。
【００５３】
さらに、本発明のこの局面の好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５４】
本発明にしたがって生産された興味ある産物、例えば、ポリペプチドは、当分野で既知の方法により、回収され、さらに精製され、単離され得る。例えば、該ポリペプチドは遠心分離、濾過、限外濾過、抽出または沈降を含むが、これらに限定されない慣用の手段により栄養培地から回収され得る。精製は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動手段（例えば、分取等電点分画）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈降）または抽出を含むが、これらに限定されない種々の当分野で既知の手段により実施され得る。
【００５５】
本発明のさらなる局面は、真核細胞の細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択のための選択マーカーとしての機能性膜結合葉酸受容体の使用に関する。このような使用の好ましい態様において、葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される。好ましくは、本発明のこの局面で利用される葉酸受容体はそれぞれのヒト葉酸受容体であり、ヒト葉酸受容体アルファ（ＦＲα）が好ましい。本発明のこの局面のさらに好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５６】
本明細書に記載されている文献および文書の全ての内容を出典明示により本明細書に包含させる。
【００５７】
以下の実施例は、なんら本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明するために提供する。特に、実施例は本発明の好ましい態様に関する。
【実施例】
【００５８】
実施例
一般的に、本明細書に記載されている物質、例えば、試薬は当業者に知られており、市販されており、製造業者の指示にしたがって使用することができる。
【００５９】
実施例１：葉酸−受容体ベース選択系を利用する組換え抗体の高レベル発現
実施例１．１：発現ベクター
（ｉ）分泌されるＩｇＧ１型の組換えヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、および（ｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子としてヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）をコードするポリヌクレオチドを含む別個の発現カセットの両方を有する真核細胞、特にＣＨＯ細胞における発現に適当であるプラスミドベクター（すなわち試験ベクター）を、培養培地中で限界濃度の葉酸、すなわち葉酸下でｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）−トランスフェクトされた細胞の選択の効率を調べるために構築する。ヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）の発現はＳＶ４０プロモーターおよび標準（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルのコントロール下である。組換え抗体の発現はＣＭＶプロモーターおよび標準（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルのコントロール下である。コントロール（すなわちコントロールベクター）として、同じ抗体をコードし、ｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）発現カセットを欠いているが、選択可能なマーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる、同様の発現ベクターを使用する。
【００６０】
実施例１．２：細胞および培養条件
株ＣＨＯ−Ｋ１由来のチャイニーズハムスター卵巣細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む適当な化学的に定義された培養培地で懸濁培養条件で維持する。
【００６１】
細胞生存の葉酸依存の分析のために、２３００ｎＭから０．１ｎＭの範囲の葉酸濃度を使用して葉酸飢餓実験を行う。細胞をこのような培地で培養し、細胞生存性を生存細胞のパーセントを定量するために分析する。表１は上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で得られた結果を要約する。
【００６２】
表１：異なる葉酸濃度でのＣＨＯ細胞の生存：
【表１】
【００６３】
これらの結果は、この特定の宿主細胞系に対して、１００ｎＭ以下、好ましくは３０ｎＭ以下の葉酸濃度が安定にトランスフェクトされた細胞の葉酸受容体ベース選択のための有意な選択圧力を生むために適当であることを示す。
【００６４】
実施例１．３：トランスフェクションおよび選択
細胞をエレクトロポレーションによりｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）発現カセットを含む試験ベクターまたはｈＦＲアルファ ｈＦＲαを欠いているコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトする。次にトランスフェクタント細胞を適当な濃度のグルタミンおよび２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸で補った培地中で１２５ｍｌ振とうフラスコ中の懸濁培養条件下で培養する。トランスフェクションの４８時間後、細胞を限界量の葉酸、すなわち１０ｎＭまたは１ｎＭの葉酸を含む培地に移し、試験ベクターでトランスフェクトされたサンプルに対して２４−ウェルプレートにおいて本発明による選択方法を開始する。加えて、コントロールプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、選択剤、すなわち０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地に加えることにより選択するか（すなわちコントロール１）、または何ら選択なしに培養する（すなわちコントロール２）。首尾よくこの選択スキームから回収した細胞を６−ウェルプレートに移し、さらに抗体生産レベルの分析のために振とうフラスコに拡大する。
【００６５】
実施例１．４：抗体生産の分析
トランスフェクタントおよび葉酸不足細胞集団から、振とうフラスコ中の過集密バッチ培養物を抗体発現レベルを分析するために製造する。細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地中に２×１０５細胞／ｍＬで播種し、懸濁培養（すなわち振とう）条件下でインキュベートする。１４日目、細胞培養の上清を回収し、タンパク質−Ａ ＨＰＬＣ方法論、すなわち精製の親和性型を使用して抗体レベルを分析する。ＩｇＧ分子は主にそれらのＦｃ−部分を介してカラムに特異的に結合するが、他のタンパク質はマトリックスと相互作用せずカラムを通過する。低いｐＨ条件下で、捕獲されたＩｇＧタンパク質をカラムから溶離し、ＵＶ吸収測定を介して定量し、そして、必要なとき、さらに精製し、単離する。
【００６６】
実施例１．５：結果
この研究の目的は、葉酸遺伝子、特にｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）遺伝子が葉酸欠乏条件下で選択可能なマーカーとして働き、それにより興味ある産物、例えば、モノクローナル抗体を共過剰発現する細胞を選択することができる、概念の証明を提供するためである。コントロールとして、選択可能なマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターも使用する。トランスフェクション後、細胞を、培地中の葉酸濃度を２．３μＭ（マイクロＭ）から１０ｎＭまたは１ｎＭに急激に減少させることによりストリンジェント選択に付す。葉酸受容体を有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を葉酸欠乏の条件下で容易に回収し、選択的な培地においてさらに拡大することができる。対照的に、コントロールベクターの場合、葉酸の濃度は変化なしに維持されるが、Ｇ４１８での選択圧力または全く選択圧力なしのいずれかを適用する。選択された細胞集団を、２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地中で過成長（すなわち過集密）懸濁（すなわち振とう）フラスコ培養を使用して、抗体生産に関して分析する。次に培養培地中の抗体の濃度を１４日目に測定する。下記表１に示されるとおり、葉酸受容体を含むプラスミドでトランスフェクトされ、そして葉酸アベイラビリティを減少することにより選択された細胞は組換え抗体を過剰発現する。これらのトランスフェクタント細胞集団により生産された抗体の量はコントロールベクターでトランスフェクトされ、Ｇ４１８で選択された細胞と比較して高い。さらなるコントロールとして、選択圧力を適用しないとき、抗体生産しない細胞が得られる。これらのデータは、現在の葉酸受容体遺伝子の手段が興味ある組換え産物を過剰発現する細胞を迅速に確立するために独立型の優性の代謝選択可能なマーカーとして容易に適用することができる、概念の証明を提供する。
【００６７】
表２：（Ｃ葉酸：選択中の培地中の葉酸の濃度；ＣＧ４１８：選択中の培地中のＧ４１８の濃度；ＣｍＡｂ：過成長培養中の培地中の分泌される抗体の濃度）
【表２】
【００６８】
実施例２：組換え抗体生産レベルは培養培地中の葉酸濃度の減少に応じて増加する
実施例２．１：発現ベクター
上記実施例１．１に記載されているプラスミドベクター（すなわち試験ベクター）を提供する。
【００６９】
実施例２．２：細胞および培養条件
株ＣＨＯ−Ｋ１由来のチャイニーズハムスター卵巣細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む化学的に定義された培養培地ＲＰＭＩ−１６４０において単層培養条件下で維持する。該細胞は本明細書外に記載されているＲＦＣ輸送体活性を欠いている(Assaraf, Y.G. and Schimke, R.T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7154-7158; Rothem, L., et al., Mol. Pharmacol. 68: 616-624)。このようなＲＦＣ−欠損細胞を実施例におけるこのさらなるキャリア系による葉酸飢餓の可能性のある副行路を避けるために使用する。
【００７０】
実施例２．３：トランスフェクションおよび選択
ＲＦＣ−欠損 Ｃ１５細胞をエレクトロポレーションにより試験ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション４８時間後、細胞を選択可能なマーカーならびに組換え抗体の両方の発現を促進するために３０ｎＭの葉酸を補った葉酸−フリー培地中で増殖させ、次に希釈クローニングに付す。細胞を５細胞／ｍｌの最終密度に希釈し、９６−ウェルプレートに１００μｌ／ウェル（すなわち０．５細胞／ウェル）で播種する。次にクローンを０．２５ｎＭの葉酸および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中に維持する。選択方法の最適性能を提供するために、さらなる選択系（すなわちｎｅｏ／Ｇ４１８）と一緒に本発明の葉酸系を利用する共選択を適用する。次に、抗体過剰発現をさらに支持し、確立するように、最も高いレベルの抗体生産を行うクローンを低い葉酸濃度（すなわち１２００ｐＭ、６００ｐＭおよび６０ｐＭ）下で培養する。これは種々のクローンにおける抗体発現のさらなる分析により確認される。
【００７１】
実施例２．４：抗体生産の分析
抗体生産の分析を原則として上記実施例１．４に記載されているとおりに実施する。分泌される抗体の濃度を以下のとおりＥＬＩＳＡアッセイを使用してモニタリングする：Ｍａｘｉｓｏｒｐ マイクロプレートを抗−ヒトＩｇＧで被覆する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むバッファーでブロックし、数回洗浄後、分泌される抗体サンプルの複数回希釈物を加える。次に、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼからなるペルオキシダーゼ−結合二次抗体を加える。最後に、発色ペルオキシダーゼ基質を加え、得られる色素濃度をそれぞれのウェルにおいて分光学的に測定し、次に既知のＩｇＧ濃度の標準濃度と比較する。
【００７２】
２．５：結果
以下の表２に記載されているとおり、組換え抗体生産のレベルは葉酸欠乏のストリンジェンシーと相関する。したがって、葉酸濃度が培地中で減少するとき、抗体生産レベルは増加する。これらの結果は、ｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）遺伝子が葉酸欠乏の条件下で組換えタンパク質の過剰発現のために使用することができる有効な選択可能なマーカーであるという概念の証明のさらなる確認である。
【００７３】
表３：（Ｃ葉酸：培地中の葉酸の濃度；ＣｍＡｂ：培地中に分泌される抗体の濃度）
【表３】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、真核細胞培養方法における使用および興味ある組換え産物の発現のための新規選択系に関する。選択系は、外因性機能性の膜結合葉酸受容体遺伝子と興味ある産物をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の真核細胞への導入に基づき、細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞で広く利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
選択マーカーおよび選択系は遺伝子工学、組換えＤＮＡ技術および真核細胞培養における組換え産物、例えば、抗体、ホルモンおよび核酸の生産において広く使用される。このような優性選択マーカーおよび選択系の主要目的は選択可能な遺伝子を導入し、選択的な培養条件下に暴露し、興味ある組換え産物の高レベルの生産が可能である細胞を提供することである。
【０００３】
今日までに、３つの主な選択マーカー系を利用している：
【０００４】
（ａ）グルタミン合成酵素系：酵素グルタミン合成酵素（ＧＳ）はグルタミン酸およびアンモニアからグルタミンの生合成に関与する。この生合成反応は哺乳動物細胞においてグルタミン形成のための唯一の経路を提供する。したがって、培養培地中においてグルタミンの非存在下で、酵素ＧＳは培養中の哺乳動物細胞の生存に不可欠である。重要なことには、マウス骨髄腫細胞を含む特定の哺乳動物細胞系はＧＳの十分な発現を欠いており、したがって、外からグルタミンの添加なしに生存することができない。したがって、このような細胞系は、この系において選択可能なマーカーとして機能することができ、グルタミンを欠いている培地中で細胞培養を可能にする、トランスフェクトされたＧＳ遺伝子のための適当なアクセプターである。対照的に、広く使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような細胞系は十分なＧＳを発現し、グルタミン−フリー培地における培養を支える。したがって、これらのＣＨＯ細胞がＧＳ遺伝子のトランスフェクションのためにレシピエント細胞として使用されるとき、特異的かつ強力なＧＳ阻害剤のメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）は、高レベルのトランスフェクトされたＧＳ遺伝子を発現するトランスフェクタントのみがグルタミン−フリー培地中で生存することができるように、内因性ＧＳ活性を阻害するために適用することができる。ＧＳ系の主な不利な点は、興味ある標的遺伝子を安定に過剰発現する細胞を確立するために、比較的に長期（すなわち２−６月）の選択的な培養の点である。別の不利な点は選択的な圧力の増加のための細胞毒性剤のＭＳＸの頻繁な利用である。興味ある組換え産物（例えば、抗体のようなポリペプチド）と一緒でのこのような細胞毒性剤の存在は、この細胞毒性剤を取り除くためにさらなる精製工程を必要とし得る。
【０００５】
（ｂ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ／ＭＴＸ選択系：ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）はジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）へのＮＡＤＰ−依存還元を触媒する。次にＴＨＦはプリンおよびチミジル酸のデノボ生合成においてそれぞれ使用される１０−ホルミル−ＴＨＦおよび５，１０−メチレン−ＴＨＦに相互転換される。ＤＨＦは５，１０−メチレン−ＴＨＦ−依存反応におけるｄＵＭＰのｄＴＭＰへの変換を触媒するチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）の触媒活性の副産物である。したがって、ＤＨＦＲはＤＮＡ複製のために必要であるプリンおよびピリミジンヌクレオチドの生合成に不可欠であるＴＨＦ補因子のリサイクルのために極めて重要である。したがって、（すなわち標的されたゲノム欠失により）ＤＨＦＲ遺伝子を欠いている細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）はヌクレオチドフリーである培地中でＤＨＦＲ遺伝子のトランスフェクションのためのレシピエントとして使用することができる。トランスフェクション後、細胞を非常に強力なＤＨＦＲ阻害剤（Ｋｄ＝１ｐＭ）である抗葉酸剤ＭＴＸの濃度において段階的な増加に付し、それにより細胞に増加したレベルのＤＨＦＲを生産させることができる。選択の複数の循環により、選択可能なマーカーＤＨＦＲは頻繁に有意な遺伝子増幅を引き起こす。さらに、ＭＴＸに対する主な耐性を有する変異マウスＤＨＦＲも、トランスフェクタント細胞において高レベルのＭＴＸ−耐性の獲得を顕著に高める、優性選択可能なマーカーとして広く使用されている。ＤＨＦＲ／ＭＴＸ選択系の主な不利な点は、この技術が変異原細胞毒性剤のＭＴＸを利用し、容易にレシピエント細胞の遺伝子型を変え得ることである。さらに、このような薬剤を扱う人間を保護するために、特定の安全対策を取り得る。これは頻繁に、興味ある標的遺伝子の発現が還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）における機能喪失突然変異および／またはＲＦＣ遺伝子発現の喪失（これら両方はＭＴＸ摂取を破壊する）により起こらない、ＭＴＸ−耐性細胞集団を引き起こす。別の不利な点は、変異原剤ＭＴＸが、培養培地に含まれる過剰発現され、分泌された標的産物（例えば、抗体のようなポリペプチド）を容易に汚染し、それにより、この変異原化合物ＭＴＸを取り除くために必要な労働集約型で、時間がかかり、高額なクロマトグラフ法が必要であり得ることである。加えて、最終産物においてＭＴＸが存在しないことは、それぞれのアッセイにより測定する必要がある。
【０００６】
（ｃ）還元型葉酸キャリア選択系：還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）は、５−メチル−ＴＨＦおよび５−ホルミル−ＴＨＦのような還元型葉酸の摂取のための主な輸送体として働く、遍在的に発現される膜糖タンパク質である。しかしながら、ＲＦＣは酸化型葉酸、葉酸に対して非常に乏しい親和性を示す。したがって、ＲＦＣの発現を欠いているか、またはゲノムＲＦＣ位置を欠失している細胞は、５−ホルミル−ＴＨＦのような還元型葉酸を培養培地から段階的に不足にさせ、それにより細胞に増加したレベルのこの葉酸輸送体を発現させる条件下で、選択可能なマーカー遺伝子ＲＦＣのトランスフェクションのためのレシピエントとして働くことができる。ＲＦＣ選択系に関していくつかの不利な点がある：ａ）１つは内因性ＲＦＣ位置が標的ノックアウトまたは機能喪失突然変異によりノックアウトされているか、または不活性化されているＲＦＣ−ｎｕｌｌ レシピエント細胞を使用しなければならない。ｂ）ＲＦＣは葉酸に対して極度に乏しい輸送親和性を有し、したがって、この酸化型葉酸は選択のために使用することができない。ｃ）一方向の葉酸摂取系であり、以下に詳細に説明されている普通の葉酸−受容体ベース系とは対照的に、ＲＦＣは葉酸の等しく強力な取り込みおよび排出を示す二方向の葉酸輸送体である。これは、葉酸欠乏の条件下で、ＲＦＣ過剰発現が、過剰発現したＲＦＣを介して葉酸をさらに排出するレシピエント細胞に有害であり得ることを意味する。
【０００７】
本発明の目的は上記の先行技術の選択系を越える特定の利点を有する新規代謝選択系を提供することである。新規選択系は、細胞培養培地中の葉酸の使用および発現ベクターを介して興味ある産物を生産することを意図された組換え真核細胞に導入された葉酸受容体の存在に基づく。この新規手段は内因性葉酸受容体（ＦＲ）遺伝子の事前の欠失を必要としない。ＦＲ選択可能な遺伝子ならびに（ポリペプチドのような）興味ある産物をコードするポリヌクレオチドの両方を有するベクターの導入後、細胞を極度に限界濃度の葉酸を含む選択的な培地中で培養する。したがって、ＦＲを顕著に過剰発現する細胞のみが細胞培養、ＤＮＡ複製および細胞増殖を維持するために十分な葉酸を取ることができ、それにより興味ある標的産物の過剰発現が可能となる。
【０００８】
酸化型葉酸、すなわち葉酸、ならびに還元型葉酸またはテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）として知られている葉酸の還元された誘導体は真核細胞、特に哺乳動物細胞におけるプリン、チミジル酸および特定のアミノ酸の生合成のために必須の補因子および／または補酵素であるＢ−９ビタミンのグループである。ＴＨＦ補因子はＤＮＡ複製、したがって細胞増殖のために特に極めて重要である。具体的に、ＴＨＦ補因子はプリンおよびチミジル酸、アミノ酸ならびにＤＮＡのＣｐＧアイランドのメチル化を含むメチル基代謝のデノボ生合成を含む一連の相互接続された代謝経路において一炭素単位の供与体として機能する。具体的に、１０−ホルミル−ＴＨＦ（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）を含むＴＨＦ補因子は、プリンのデノボ生合成に関与する２つの重要なデノボホルミルトランスフェラーゼ反応における一炭素単位を与える。第１の酵素であるグリシンアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＧＡＲＴＦ）はプリンのイミダゾール環の形成に関するが、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲＴＦ）が介在するさらに下流の反応はプリン中間体のイノシン５’−一リン酸（ＩＭＰ）を産生する。後者はＡＭＰおよびＧＭＰの制御された生合成のための重要な前駆体として働く。さらに、５，１０−メチレン−ＴＨＦ（５，１０−ＣＨ２−ＴＨＦ）は、酵素であるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）に関する極めて重要な補因子として機能する別の重要なＴＨＦ補酵素である。ＴＳはｄＵＭＰからチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）の形成を触媒する。したがって、これらの葉酸−依存酵素は、ＤＮＡ複製に不可欠であるプリンおよびチミンヌクレオチドのデノボ生合成の重要なメディエーターである。それ自体、これらの葉酸−依存酵素は、抗葉酸剤として知られている葉酸アンタゴニストの活性のための標的として同定された。例えば、４−アミノ葉酸類似体であるアミノプテリンおよびその相同体である４−アミノ−１０−メチル葉酸メトトレキサート（ＭＴＸ）は、小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の化学療法に関する診療に導入された代謝拮抗剤の第１のクラスであった。抗葉酸剤は、骨肉腫、乳癌、原発性中枢神経系リンパ腫、絨毛癌および妊娠性トロホブラスト腫瘍を含む他のヒト悪性腫瘍の処置のために現在使用されている異なる化学療法レジメンの現在、重要な成分である。
【０００９】
自身が葉酸を合成する多数の原核生物、植物、菌類および特定の生物(protest)とは対照的に、哺乳動物および他の真核細胞種はＴＨＦ補因子生合成を欠いており、したがって外因性源からそれらを得る必要がある。３つの独立した輸送系が現在、哺乳動物細胞における葉酸および抗葉酸剤の摂取を介在することが知られている：
【００１０】
ａ）還元型葉酸の補因子の主な細胞輸送系は還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）である。ＲＦＣ（溶質キャリアファミリー１９メンバー１、ＳＬＣ１９Ａ１としても既知である）は、非常に高い細胞内レベルに蓄積することで知られているアデニンヌクレオチドのような有機リン酸ならびにチアミン一リン酸およびピロリン酸を交換することにより、還元型葉酸の困難な輸送を介在する二方向の促進キャリアとして機能する〜８５ｋＤａの膜糖タンパク質を遍在的に発現させる。ＲＦＣはロイコボリン（５−ホルミル−ＴＨＦ；Ｋｔ＝１μＭ）を含むＴＨＦ補因子に対して高い親和性を示すが、酸化型葉酸である葉酸に対して非常に乏しい輸送親和性（Ｋｔ＝２００−４００μＭ）を有する。
【００１１】
ｂ）葉酸摂取の別の経路は最近クローニングされたプロトン共役葉酸輸送体（ＰＣＦＴ、ＳＬＣ４６Ａとしても既知である）である。ＰＣＦＴはＲＦＣと独立して発現するようであり、酸性ｐＨ（５．５）で最適に機能し、そして酸化型（例えば、葉酸）およびＴＨＦ補因子（すなわち還元型葉酸）ならびにＭＴＸを含む種々の親水性抗葉酸剤の両方の流入を介在する。生理学的ｐＨ（７．４）ではなく酸性ｐＨ（５．５）で葉酸および抗葉酸剤の最適輸送を示すＰＣＦＴは、上部小腸における葉酸および抗葉酸剤の両方の吸収において重要な役割を有する。
【００１２】
ｃ）本発明が基づく第３の輸送経路は葉酸受容体（ＦＲ）を含む。ＦＲは、３つの別個の遺伝子、ＦＲα（ＦＲアルファ）、ＦＲβ（ＦＲベータ）およびＦＲγ（ＦＲガンマ）によってコードされる高親和性の葉酸結合糖タンパク質である。ＦＲα（またはＦＲ−アルファ）は、また、成体葉酸結合タンパク質またはＦＤＰとして、葉酸受容体１またはＦＯＬＲ（マウスにおいてｆｏｌｂｐ１）として、および卵巣癌関連抗原またはＭＯｖ１８として知られている。ＦＲβ（またはＦＲベータ）は、また、ＦＯＬＲ２（胎児）およびＦＢＰ／ＰＬ−１（胎盤）として知られている。ＦＲγ（またはＦＲガンマ）は、また、ＦＯＬＲ３およびＦＲ−Ｇとして知られている（M.D. Salazar and M. Ratnam, Cancer Metastasis Rev. 2007 26(1), pp.141-52.により概説されている）。よく特徴付けられている成熟ＦＲは〜７０−８０％のアミノ酸同一性で同種のタンパク質であり、２２９から２３６個のアミノ酸ならびに２から３個のＮ−グリコシル化部位を含む。ＦＲα（ＦＲアルファ）およびＦＲβ（ＦＲベータ）は膜結合、特にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー、細胞表面糖タンパク質であるが、ＦＲγはＧＰＩアンカーを欠いており、分泌されるタンパク質である。ＦＲα（ＦＲアルファ）およびＦＲβ（ＦＲベータ）は、葉酸（Ｋｄ＝０．１−１ｎＭ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ；ロメテレキソール；Ｋｉ＝０．４−１．３ｎＭ 基質として［３Ｈ］葉酸を使用する）およびＢＧＣ９４５（これは還元型葉酸キャリアを介するのでなく単にＦＲα（ＦＲアルファ）を介して特異的に輸送されるシクロペンタ［ｇ］キナゾリン−ベースのチミジル酸シンターゼ阻害剤である）（Ｋｄ＝１ｎＭ）に対して高親和性を示すが、ＭＴＸ（Ｋｄ＞１００ｎＭ）に対して非常に低い親和性を示す。葉酸および抗葉酸剤のＦＲ−依存摂取は受容体−介在エンドサイトーシスの古典的メカニズムを介して前進する。遺伝子ノックアウト試験によって、ＦＲα（ＦＲアルファ）（マウスにおいて、Ｆｏｌｂｐ１としても知られている）が初期胚発生および母体の葉酸補充のために不可欠であり、子宮内における胚を死亡から救出し、正常発生を可能にすることが示されている。
【００１３】
今日までに知られている選択系の１つ以上の不利な点を克服する安全で極めて効率の良いコスト的に有効な選択系に対する継続した必要性がある。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明は、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクターに関する。
【００１５】
本発明は、さらに、細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、ベクターによってコードされる機能性葉酸受容体を細胞により発現するように該発現ベクターが安定に導入された真核細胞に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、興味ある産物を高収率で安定に発現することができる組換え真核細胞を提供するための選択方法に関する。
【００１７】
本発明は、高収率で興味ある産物の生産方法において好都合に利用することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明において、今回驚くべきことに、興味ある産物を生産することができる組換え真核細胞を提供するための選択系が、細胞培養培地中の葉酸の限定された利用に基づくことができることを見出した。該系は広く、すなわち細胞生存性が葉酸摂取に依存する真核細胞に適用できる。
【００１９】
該新規系は、細胞毒性剤の非存在下で高レベルの組換え産物を安定に過剰発現する、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞クローンの迅速な選択、スクリーニングおよび確立のために使用することができる。さらに、他の既知の選択系と対照的に、例えば、内因性遺伝子を変異またはノックアウトすることにより提供された修飾された細胞に対して必須の必要性がない（ときどき実行可能であるが）。例えば、ＦＲα（ＦＲアルファ）は、例えば、ＲＦＣがロイコボリン（Ｋｔ＝１μＭ）に対するよりも、ＦＡ（ＫＤ＝０．１ｎＭ）に対して高い親和性を示し、一方向経路を介して細胞に葉酸を輸送するため、本発明は特に培養培地からの段階的な葉酸（例えば、葉酸）欠乏を介して、顕著に改良された優性の代謝選択可能なマーカーとしてのＦＲα（ＦＲアルファ）および他の葉酸受容体の使用のために提供する。新規葉酸−ベース選択は、種々の過剰発現系において日常的に使用される細胞毒性剤選択の非存在下で、培養された哺乳動物細胞における標的タンパク質の迅速な安定な高レベルの過剰発現のために非常に適している優れた戦略である。
【００２０】
新規選択系は、先行技術で利用できる選択系を越えるいくつかの重要な利点を示す。
【００２１】
１． 本発明による選択系は非常に迅速な選択系である：葉酸欠乏４週間以内に、興味ある標的遺伝子を発現する細胞集団またはクローン細胞誘導体を容易に単離することができる。これは、標的遺伝子の選択および安定化に２−６月必要であり得る上記ＧＳ系と対照的である。
【００２２】
２． 本発明による選択系はトランスフェクション前に内因性ＦＲα（アルファ）、β（ベータ）またはγ（ガンマ）遺伝子のゲノム欠失または減衰を必要とせず、したがって、いくつかの内因性ＦＲ遺伝子発現が存在するときでさえ、すべてのレシピエント細胞に適用することができる。この重要な利点はＦＲα（ＦＲアルファ）トランスフェクション後の、細胞を培養培地から急激かつ激しい葉酸（例えば、葉酸）の欠乏に暴露することができる事実に基づく。結果として、有意な量の選択可能なＦＲα（ＦＲアルファ）マーカーを発現するトランスフェクタント細胞のみが十分な葉酸を輸送し、ＤＮＡ複製および細胞増殖を維持することができる。これは内因性ＦＲα（ＦＲアルファ）遺伝子の発現において有意な上昇の欠如で起こる。これは、レシピエント細胞を内因性ＤＨＦＲ遺伝子に関して頻繁に欠失する、上記ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系と対照的である（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞およびＣＨＯ Ｄｕｘ細胞）。
【００２３】
ｃ） 本発明による選択系は、内因性ＲＦＣの増加した発現を含む葉酸摂取の別の経路の増加した発現を介する選択的な圧力の軽減による選択のストリンジェンシーの喪失に苦しまない。この重要な利点は、ＦＲα（ＦＲアルファ）が葉酸に対して優れた親和性（Ｋｄ＝０．１ｎＭ）を有するが、ＲＦＣは葉酸に対して極度に乏しい親和性（Ｋｍ＝０．２−０．４ｍＭ）を示す事実による。対照的に、ＭＴＸ選択において、選択可能なマーカー発現を有さないか、または発現の乏しいＭＴＸ−耐性細胞を頻繁に得られるため、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系を含む種々の先行技術の選択系は選択のストリンジェンシーの厳しい喪失に苦しむ。ＲＦＣの機能の喪失の代わりに、主なＭＴＸ輸送体は頻繁にＭＴＸ耐性メカニズムとなり得る。これはＲＦＣ遺伝子における不活性化変異の頻繁な発生またはＲＦＣ遺伝子発現の激しい喪失により示されている。
【００２４】
ｄ） 本発明による選択系は、レシピエント細胞ならびに興味ある標的遺伝子の遺伝子型を変え得る、ＤＨＦＲ系におけるＭＴＸまたはＧＳ系におけるＭＳＸのような細胞毒性剤および／または変異原化合物を使用しない。むしろ、ＦＲ選択は培養培地からのビタミンの欠乏の原理を利用する。
【００２５】
したがって、１つの局面において、本発明は機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド（すなわち、選択可能なマーカー遺伝子）および興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクターに関する。
【００２６】
本発明における機能性膜結合葉酸受容体は、特に真核細胞への葉酸の一方向の取り込みまたは摂取ができる機能性膜結合受容体として定義される。
【００２７】
本発明における葉酸は酸化型葉酸（すなわち、葉酸）または還元型葉酸のいずれかであり得る。一般的に、葉酸を機能性膜結合葉酸受容体により真核細胞に取り込むことができる限り、このような葉酸は本発明において有用であり得る。酸化型葉酸の好ましい例は葉酸である。還元型葉酸の好ましい例は、５−メチル−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−テトラヒドロ葉酸、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸である。
【００２８】
好ましい態様において、本発明の発現ベクターは機能性膜結合葉酸受容体および興味ある産物の両方を真核細胞において発現させることができる。
【００２９】
第２のポリヌクレオチドによってコードされる興味ある産物は、第２のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝情報の転写、翻訳または発現の他の何らかの事象により生産することができるすべての生物学的産物であり得る。この点において、該産物は発現産物であり得る。例えば、好ましい態様において、このような産物はポリペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される。“ポリペプチド”はペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸のポリマーを含む分子を意味する。“ポリペプチド”なる用語はあらゆる長さのポリペプチドを含み、大きな分子（例えば、約５０個以上のアミノ酸を含む）の場合、“タンパク質”と呼ばれ、小さい分子（例えば、２−４９個のアミノ酸を含む）の場合、“ペプチド”と呼ばれ得る。該産物は薬学的または治療的に活性な化合物またはアッセイなどにおいて利用される研究道具であり得る。特に好ましい態様において、該産物はポリペプチド、好ましくは薬学的または治療的に活性なポリペプチドまたは診断または他のアッセイなどにおいて利用される研究道具である。より好ましい態様において、ポリペプチドは免疫グロブリン分子または抗体またはそれらのフラグメント（特に機能性フラグメント）、例えば、キメラまたは部分的にもしくは全体的にヒト化抗体である。このような抗体は診断抗体または薬学的もしくは治療的に活性な抗体であり得る。典型的に、興味ある産物は発現のために使用される真核細胞宿主細胞と異種であり、これは宿主細胞がトランスフェクション前に興味ある産物を天然または内因性的に生産しないことを意味する。むしろ、興味ある産物の生産または発現を達成するために、興味ある産物をコードするポリヌクレオチドは、特に本発明における発現ベクターとのトランスフェクションにより、真核細胞宿主細胞に導入されるべきである。
【００３０】
本発明におけるベクターは直線形態または、好ましくは、円形態、例えば、プラスミドで存在し得る。
【００３１】
興味あるポリヌクレオチドの発現のために使用されるベクターは、通常、転写を駆動するために適当な転写調節因子、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写停止または終結シグナルを含む。所望の産物がタンパク質であるとき、通常、適当な翻訳調節因子、例えば、リボソームを動員するために適当な５’キャップ構造による５’非翻訳領域および翻訳プロセスを終結するための終止コドンがベクター中に含まれる。特に、選択可能なマーカー遺伝子として働くポリヌクレオチドならびに興味ある産物をコードするポリヌクレオチドの両方は、適当なプロモーターに存在する転写因子のコントロール下で転写される。選択可能なマーカー遺伝子および興味ある産物の遺伝子の両方の得られる転写産物は、かなりのレベルのタンパク質発現（すなわち翻訳）を容易にする機能性翻訳因子を有する。
【００３２】
したがって、好ましい態様は、本発明において第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが別個の転写プロモーターのコントロール下である発現ベクターに関する。一般的に、真核細胞において第１および／または第２のポリヌクレオチドの発現、特に転写を促進することができるプロモーターが適当である。好ましい態様において、別個の転写プロモーターが同じである。別の好ましい態様において、別個の転写プロモーターが異なっている。好ましくは、転写プロモーターはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される。これらの好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターはＣＭＶプロモーターまたは、より好ましくはＳＶ４０プロモーターである。特に好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターはＳＶ４０プロモーターである。
【００３３】
本発明の発現ベクターの他の好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは共通の転写プロモーターのコントロール下である。好ましくは、このような転写プロモーターはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される。これらのさらに好ましい態様において、共通の転写プロモーターはＳＶ４０プロモーターである。このような共通の転写プロモーターを有する発現ベクターのさらに好ましい態様は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド間に機能的に位置するＩＲＥＳ因子を含む。
【００３４】
本発明において利用される発現ベクターに関する手段により真核細胞宿主細胞に導入された膜結合葉酸受容体は、本発明において機能性である、すなわち利用される真核細胞と適合性である限り、あらゆる種由来であり得る。好ましくは、哺乳動物種由来の葉酸受容体、例えば、齧歯動物由来のもの、または、さらに好ましくは、ヒト葉酸受容体を使用する。一般的に、真核宿主細胞に導入され、選択マーカーとして利用される葉酸受容体は宿主細胞の内因性葉酸受容体と同種または異種であり得る。それが同種であるとき、それは宿主細胞と同じ種由来であり、例えば、宿主細胞の内因性葉酸受容体と同一であり得る。それが異種であるとき、それは宿主細胞以外の他の種由来であり、したがって宿主細胞の内因性葉酸受容体と相違であり得る。一般的に、選択マーカーとして利用される導入された葉酸受容体は宿主細胞と異種である。例えば、ヒト由来葉酸受容体は齧歯動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に対する選択マーカーとして使用され得る。
【００３５】
好ましくは、本発明の発現ベクターの第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される。機能性変異体は、すなわち真核細胞により摂取し、細胞の葉酸代謝を介して細胞の生存に寄与することができる、生理学的態様において機能性である葉酸受容体の誘導体を含む。例えば、葉酸受容体の変異型は置換、欠失および／または付加のような１個以上のアミノ酸変異体ならびにポリマー、例えば、ポリエチレングリコール構造（ＰＥＧ）のような化学的な部分が葉酸受容体と結合している化学誘導体を含む。好ましくは、第１のポリヌクレオチドによってコードされる葉酸受容体はヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）、ヒト葉酸受容体ベータ（ｈＦＲβ）またはそれらの機能性変異体である。さらに好ましくは、好ましくは下記アミノ酸配列（配列番号１、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有するヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である：
ＭＡＱＲＭＴＴＱＬＬＬＬＬＶＷＶＡＶＶＧＥＡＱＴＲＩＡＷＡＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫＰＧＰＥＤＫＬＨＥＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶＬＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥＱＷＷＥＤＣＲＴＳＹＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷＮＷＴＳＧＦＮＫＣＡＶＧＡＡＣＱＰＦＨＦＹＦＰＴＰＴＶＬＣＮＥＩＷＴＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＰＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＳＧＡＧＰＷＡＡＷＰＦＬＬＳＬＡＬＭＬＬＷＬＬＳ
【００３６】
他の好ましい態様は下記アミノ酸配列（配列番号２、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有するヒト葉酸受容体ベータ（ｈＦＲβ）に関する：
ＭＶＷＫＷＭＰＬＬＬＬＬＶＣＶＡＴＭＣＳＡＱＤＲＴＤＬＬＮＶＣＭＤＡＫＨＨＫＴＫＰＧＰＥＤＫＬＨＤＱＣＳＰＷＫＫＮＡＣＣＴＡＳＴＳＱＥＬＨＫＤＴＳＲＬＹＮＦＮＷＤＨＣＧＫＭＥＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＮＱＴＷＲＫＥＲＦＬＤＶＰＬＣＫＥＤＣＱＲＷＷＥＤＣＨＴＳＨＴＣＫＳＮＷＨＲＧＷＤＷＴＳＧＶＮＫＣＰＡＧＡＬＣＲＴＦＥＳＹＦＰＴＰＡＡＬＣＥＧＬＷＳＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＳＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＨＶＮＡＧＥＭＬＨＧＴＧＧＬＬＬＳＬＡＬＭＬＱＬＷＬＬＧ
【００３７】
あるいは、本発明は天然環境において膜結合しない葉酸受容体に関する。このような非膜結合受容体を、例えば、非膜結合葉酸受容体と別のポリペプチドの膜貫通領域の融合タンパク質を提供することにより、膜結合するように変異させることができる。他の変異型も可能であり、これは当業者が容易に利用できる。この点において、好ましい例は可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）、好ましくはヒト可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）に基づく。それらのより好ましい態様において、ヒト可溶性葉酸受容体ガンマ（ＦＲγ）は下記アミノ酸配列（配列番号３、１文字表記、Ｎ−末端からＣ−末端への方向で示されている）を有する：
ＭＤＭＡＷＱＭＭＱＬ ＬＬＬＡＬＶＴＡＡＧ ＳＡＱＰＲＳＡＲＡＲ ＴＤＬＬＮＶＣＭＮＡ ＫＨＨＫＴＱＰＳＰＥ ＤＥＬＹＧＱＣＳＰＷ ＫＫＮＡＣＣＴＡＳＴ ＳＱＥＬＨＫＤＴＳＲ ＬＹＮＦＮＷＤＨＣＧ ＫＭＥＰＴＣＫＲＨＦ ＩＱＤＳＣＬＹＥＣＳ ＰＮＬＧＰＷＩＲＱＶ ＮＱＳＷＲＫＥＲＩＬ ＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥ ＲＷＷＥＤＣＲＴＳＹ ＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷ ＮＷＴＳＧＩＮＥＣＰ ＡＧＡＬＣＳＴＦＥＳ ＹＦＰＴＰＡＡＬＣＥ ＧＬＷＳＨＳＦＫＶＳ ＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩ ＱＭＷＦＤＳＡＱＧＮ ＰＮＥＥＶＡＫＦＹＡ ＡＡＭＮＡＧＡＰＳＲ ＧＩＩＤＳ
次に、これは、本発明の内容の葉酸摂取ができる機能性膜結合葉酸受容体を形成するために、変異、あるいは遺伝的に改変または誘導体化され得る。
【００３８】
さらなる局面において、本発明における発現ベクターは１つ以上の付加的な選択マーカーをコードする１つ以上のさらなるポリヌクレオチドをさらに含み得る。したがって、好ましい態様において、本発明の葉酸系と１つ以上の異なる選択系（例えば、ｎｅｏ／Ｇ４１８）を利用する共選択を最適な実施を提供するために適用することができる。
【００３９】
別の局面において、本発明は、細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドが安定に導入された真核細胞であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する真核細胞に関する。それらの好ましい態様において、機能性膜結合葉酸受容体および興味ある産物は真核細胞により発現する。
【００４０】
発現ベクターを介して細胞系に導入された機能性膜結合葉酸受容体に加えて、本発明における真核細胞は少なくとも１つの内因性機能性の一方向機能性葉酸輸送系、特に１つ以上の内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含み得る。以下に記載されているとおり、選択方法がこのような内因性の一方向機能性葉酸輸送系の存在下でさえ、すなわちこのような内因系を維持している場所でさえ利用することができることが、本発明の利点である。したがって、さらなる好ましい態様は、少なくとも１つの内因性の一方向機能性葉酸輸送系を含む本発明の真核細胞であって、このような内因性の一方向機能性葉酸輸送系が好ましくは少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含む真核細胞に関する。それらの好ましい態様において、内因性機能性の膜結合葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）および葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）からなる群から選択される。
【００４１】
他の好ましい態様は、少なくとも、例えば、１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含む内因性の一方向機能性葉酸輸送系が完全な活性を欠いている、すなわち減衰している、本発明における真核細胞に関する。このような減衰は、例えば、点突然変異、遺伝子破壊などによる、例えば、問題の内因性葉酸輸送系、例えば、内因性機能性の膜結合葉酸受容体の何らかのタイプの突然変異生成により提供され得る。該減衰は部分的または全体的であり得る。後者の場合、本発明における真核細胞は内因性機能性の一方向機能性葉酸輸送系、例えば、内因性機能性の膜結合葉酸受容体を含まない。したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明の発現ベクターを安定に導入され、少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体の完全な活性を欠いている、真核細胞に関する。
【００４２】
該宿主細胞に導入された発現ベクターに関して、本明細書に記載されている好ましい態様を含む本発明のすべての発現ベクターが利用することができる。本発明の真核細胞の好ましい態様において、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドは同じ発現ベクターに位置する。好ましくは、このような発現ベクターは本発明における、すなわち本明細書に記載されている発現ベクターである。
【００４３】
本発明における真核細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および菌類からなる群から選択される。菌類および植物細胞に関して、これらは、通常、葉酸に関して原栄養性である（すなわち、このような細胞はこれらの細胞生存性、すなわち細胞培養および増殖のために必要な葉酸を自発的に合成することができる）。本発明は、特に葉酸に対する栄養要求性となり得るこのような菌類および植物細胞を含む。これは、例えば、遺伝子操作によるものであり得る、すなわち、今回、細胞はそれらの細胞生存に必要な十分な量の葉酸を合成することができない。例えば、適当な代謝経路を介して葉酸を内因的に生合成するこのような菌類または植物細胞の能力は、例えば、適当な標的遺伝子の遺伝子破壊もしくは遺伝子サイレンシングまたは重要な酵素の阻害などにより不活性化される。
【００４４】
それらの好ましい態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは、このような哺乳動物細胞は齧歯動物細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群から選択される。特に好ましくは齧歯動物細胞であり、好ましくはＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、マウス３Ｔ３繊維芽細胞およびＳＰ２／０細胞からなる群から選択される。さらに特に好ましい齧歯動物細胞はＣＨＯ細胞である。また、好ましくはヒト細胞であり、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択される。さらに好ましくはサル細胞であり、好ましくは、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。
【００４５】
他の態様において、本発明は、細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞を提供し、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入することを含む本発明における真核細胞の生産方法であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する方法に関する。好ましい態様において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ発現ベクターに位置し、より好ましい態様において、該ベクターは本発明における、すなわち本明細書に記載されている発現ベクターである。
【００４６】
本発明のさらに他の局面は、細胞に導入された発現ベクターによってコードされる興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択方法であって、
（ｉ）細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入された複数の真核細胞を提供し（第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する）、
（ｉｉ）限界濃度の葉酸を有する細胞培養培地中で該複数の真核細胞を培養し、それにより興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を得る
ことを含む方法に関する。原則として、このような葉酸は酸化型葉酸または還元型葉酸であり得る。好ましいものは酸化型葉酸、特に葉酸である。
【００４７】
葉酸の限界量に関して、培地中の適当な濃度は宿主細胞の必要条件および適用される選択条件のストリンジェンシーにしたがって当業者により測定することができる。葉酸(folic acid)を葉酸(folate)として、例えば、ＣＨＯ宿主細胞と使用する場合、ストリンジェントな選択方法のための細胞培養培地中の葉酸の適当な濃度は約１００ｎＭ以下、好ましくは約３０ｎＭ以下または約１０ｎＭ以下である。例えば、葉酸の適当な濃度は０．００１ｎＭ−１００ｎＭの範囲、好ましくは０．０１ｎＭ−１００ｎＭの範囲、より好ましくは０．１ｎＭ−１００ｎＭの範囲または１ｎＭ−１００ｎＭの範囲の任意の値を有し得る。同様に好ましくは０．００１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、０．０１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、０．１ｎＭ−３０ｎＭの範囲、１ｎＭ−３０ｎＭの範囲または３ｎＭ−１０ｎＭの範囲である。例えば、選択に適当な細胞培養培地中の葉酸濃度は１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭまたは３０ｎＭであり得る。
【００４８】
ロイコボリンのような還元型葉酸を選択方法において使用する場合、それらの濃度は再び宿主細胞の必要条件および適用される選択条件のストリンジェンシーにしたがって当業者により測定することができる。細胞培養培地中のロイコボリンの濃度は、例えば、ストリンジェントな選択方法のために０．２ｎＭ−２ｎＭの範囲であり得る。
【００４９】
それらのさらなる態様において、選択方法はさらに興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を同定および単離することを含む。
【００５０】
選択方法のさらに好ましい態様において、複数の真核細胞は本発明における、すなわち本明細書に記載されている真核細胞から構成される。
【００５１】
本発明のこの局面のさらなる好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５２】
本発明の他の態様は、
（ｉ）本発明における、すなわち本明細書に記載されている選択方法を実施し、
（ｉｉ）該細胞培養培地または該細胞から興味ある産物を単離する
ことを含む、興味ある産物の生産方法に関する。
【００５３】
さらに、本発明のこの局面の好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５４】
本発明にしたがって生産された興味ある産物、例えば、ポリペプチドは、当分野で既知の方法により、回収され、さらに精製され、単離され得る。例えば、該ポリペプチドは遠心分離、濾過、限外濾過、抽出または沈降を含むが、これらに限定されない慣用の手段により栄養培地から回収され得る。精製は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動手段（例えば、分取等電点分画）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈降）または抽出を含むが、これらに限定されない種々の当分野で既知の手段により実施され得る。
【００５５】
本発明のさらなる局面は、真核細胞の細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択のための選択マーカーとしての機能性膜結合葉酸受容体の使用に関する。このような使用の好ましい態様において、葉酸受容体は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される。好ましくは、本発明のこの局面で利用される葉酸受容体はそれぞれのヒト葉酸受容体であり、ヒト葉酸受容体アルファ（ＦＲα）が好ましい。本発明のこの局面のさらに好ましい態様は、特に真核細胞および発現ベクターに対して本明細書に記載されている。
【００５６】
本明細書に記載されている文献および文書の全ての内容を出典明示により本明細書に包含させる。
【００５７】
以下の実施例は、なんら本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明するために提供する。特に、実施例は本発明の好ましい態様に関する。
【実施例】
【００５８】
実施例
一般的に、本明細書に記載されている物質、例えば、試薬は当業者に知られており、市販されており、製造業者の指示にしたがって使用することができる。
【００５９】
実施例１：葉酸−受容体ベース選択系を利用する組換え抗体の高レベル発現
実施例１．１：発現ベクター
（ｉ）分泌されるＩｇＧ１型の組換えヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセット、および（ｉｉ）選択可能なマーカー遺伝子としてヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）をコードするポリヌクレオチドを含む別個の発現カセットの両方を有する真核細胞、特にＣＨＯ細胞における発現に適当であるプラスミドベクター（すなわち試験ベクター）を、培養培地中で限界濃度の葉酸、すなわち葉酸下でｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）−トランスフェクトされた細胞の選択の効率を調べるために構築する。ヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）の発現はＳＶ４０プロモーターおよび標準（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルのコントロール下である。組換え抗体の発現はＣＭＶプロモーターおよび標準（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルのコントロール下である。コントロール（すなわちコントロールベクター）として、同じ抗体をコードし、ｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）発現カセットを欠いているが、選択可能なマーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる、同様の発現ベクターを使用する。
【００６０】
実施例１．２：細胞および培養条件
株ＣＨＯ−Ｋ１由来のチャイニーズハムスター卵巣細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む適当な化学的に定義された培養培地で懸濁培養条件で維持する。
【００６１】
細胞生存の葉酸依存の分析のために、２３００ｎＭから０．１ｎＭの範囲の葉酸濃度を使用して葉酸飢餓実験を行う。細胞をこのような培地で培養し、細胞生存性を生存細胞のパーセントを定量するために分析する。表１は上記ＣＨＯ−Ｋ１細胞系で得られた結果を要約する。
【００６２】
表１：異なる葉酸濃度でのＣＨＯ細胞の生存：
【表１】
【００６３】
これらの結果は、この特定の宿主細胞系に対して、１００ｎＭ以下、好ましくは３０ｎＭ以下の葉酸濃度が安定にトランスフェクトされた細胞の葉酸受容体ベース選択のための有意な選択圧力を生むために適当であることを示す。
【００６４】
実施例１．３：トランスフェクションおよび選択
細胞をエレクトロポレーションによりｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）発現カセットを含む試験ベクターまたはｈＦＲアルファ ｈＦＲαを欠いているコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトする。次にトランスフェクタント細胞を適当な濃度のグルタミンおよび２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸で補った培地中で１２５ｍｌ振とうフラスコ中の懸濁培養条件下で培養する。トランスフェクションの４８時間後、細胞を限界量の葉酸、すなわち１０ｎＭまたは１ｎＭの葉酸を含む培地に移し、試験ベクターでトランスフェクトされたサンプルに対して２４−ウェルプレートにおいて本発明による選択方法を開始する。加えて、コントロールプラスミドでトランスフェクトされた細胞を、選択剤、すなわち０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地に加えることにより選択するか（すなわちコントロール１）、または何ら選択なしに培養する（すなわちコントロール２）。首尾よくこの選択スキームから回収した細胞を６−ウェルプレートに移し、さらに抗体生産レベルの分析のために振とうフラスコに拡大する。
【００６５】
実施例１．４：抗体生産の分析
トランスフェクタントおよび葉酸不足細胞集団から、振とうフラスコ中の過集密バッチ培養物を抗体発現レベルを分析するために製造する。細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地中に２×１０５細胞／ｍＬで播種し、懸濁培養（すなわち振とう）条件下でインキュベートする。１４日目、細胞培養の上清を回収し、タンパク質−Ａ ＨＰＬＣ方法論、すなわち精製の親和性型を使用して抗体レベルを分析する。ＩｇＧ分子は主にそれらのＦｃ−部分を介してカラムに特異的に結合するが、他のタンパク質はマトリックスと相互作用せずカラムを通過する。低いｐＨ条件下で、捕獲されたＩｇＧタンパク質をカラムから溶離し、ＵＶ吸収測定を介して定量し、そして、必要なとき、さらに精製し、単離する。
【００６６】
実施例１．５：結果
この研究の目的は、葉酸遺伝子、特にｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）遺伝子が葉酸欠乏条件下で選択可能なマーカーとして働き、それにより興味ある産物、例えば、モノクローナル抗体を共過剰発現する細胞を選択することができる、概念の証明を提供するためである。コントロールとして、選択可能なマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターも使用する。トランスフェクション後、細胞を、培地中の葉酸濃度を２．３μＭ（マイクロＭ）から１０ｎＭまたは１ｎＭに急激に減少させることによりストリンジェント選択に付す。葉酸受容体を有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を葉酸欠乏の条件下で容易に回収し、選択的な培地においてさらに拡大することができる。対照的に、コントロールベクターの場合、葉酸の濃度は変化なしに維持されるが、Ｇ４１８での選択圧力または全く選択圧力なしのいずれかを適用する。選択された細胞集団を、２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む培地中で過成長（すなわち過集密）懸濁（すなわち振とう）フラスコ培養を使用して、抗体生産に関して分析する。次に培養培地中の抗体の濃度を１４日目に測定する。下記表１に示されるとおり、葉酸受容体を含むプラスミドでトランスフェクトされ、そして葉酸アベイラビリティを減少することにより選択された細胞は組換え抗体を過剰発現する。これらのトランスフェクタント細胞集団により生産された抗体の量はコントロールベクターでトランスフェクトされ、Ｇ４１８で選択された細胞と比較して高い。さらなるコントロールとして、選択圧力を適用しないとき、抗体生産しない細胞が得られる。これらのデータは、現在の葉酸受容体遺伝子の手段が興味ある組換え産物を過剰発現する細胞を迅速に確立するために独立型の優性の代謝選択可能なマーカーとして容易に適用することができる、概念の証明を提供する。
【００６７】
表２：（Ｃ葉酸：選択中の培地中の葉酸の濃度；ＣＧ４１８：選択中の培地中のＧ４１８の濃度；ＣｍＡｂ：過成長培養中の培地中の分泌される抗体の濃度）
【表２】
【００６８】
実施例２：組換え抗体生産レベルは培養培地中の葉酸濃度の減少に応じて増加する
実施例２．１：発現ベクター
上記実施例１．１に記載されているプラスミドベクター（すなわち試験ベクター）を提供する。
【００６９】
実施例２．２：細胞および培養条件
株ＣＨＯ−Ｋ１由来のチャイニーズハムスター卵巣細胞を２．３μＭ（マイクロＭ）の葉酸を含む化学的に定義された培養培地ＲＰＭＩ−１６４０において単層培養条件下で維持する。該細胞は本明細書外に記載されているＲＦＣ輸送体活性を欠いている(Assaraf, Y.G. and Schimke, R.T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7154-7158; Rothem, L., et al., Mol. Pharmacol. 68: 616-624)。このようなＲＦＣ−欠損細胞を実施例におけるこのさらなるキャリア系による葉酸飢餓の可能性のある副行路を避けるために使用する。
【００７０】
実施例２．３：トランスフェクションおよび選択
ＲＦＣ−欠損 Ｃ１５細胞をエレクトロポレーションにより試験ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション４８時間後、細胞を選択可能なマーカーならびに組換え抗体の両方の発現を促進するために３０ｎＭの葉酸を補った葉酸−フリー培地中で増殖させ、次に希釈クローニングに付す。細胞を５細胞／ｍｌの最終密度に希釈し、９６−ウェルプレートに１００μｌ／ウェル（すなわち０．５細胞／ウェル）で播種する。次にクローンを０．２５ｎＭの葉酸および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中に維持する。選択方法の最適性能を提供するために、さらなる選択系（すなわちｎｅｏ／Ｇ４１８）と一緒に本発明の葉酸系を利用する共選択を適用する。次に、抗体過剰発現をさらに支持し、確立するように、最も高いレベルの抗体生産を行うクローンを低い葉酸濃度（すなわち１２００ｐＭ、６００ｐＭおよび６０ｐＭ）下で培養する。これは種々のクローンにおける抗体発現のさらなる分析により確認される。
【００７１】
実施例２．４：抗体生産の分析
抗体生産の分析を原則として上記実施例１．４に記載されているとおりに実施する。分泌される抗体の濃度を以下のとおりＥＬＩＳＡアッセイを使用してモニタリングする：Ｍａｘｉｓｏｒｐ マイクロプレートを抗−ヒトＩｇＧで被覆する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むバッファーでブロックし、数回洗浄後、分泌される抗体サンプルの複数回希釈物を加える。次に、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼからなるペルオキシダーゼ−結合二次抗体を加える。最後に、発色ペルオキシダーゼ基質を加え、得られる色素濃度をそれぞれのウェルにおいて分光学的に測定し、次に既知のＩｇＧ濃度の標準濃度と比較する。
【００７２】
２．５：結果
以下の表２に記載されているとおり、組換え抗体生産のレベルは葉酸欠乏のストリンジェンシーと相関する。したがって、葉酸濃度が培地中で減少するとき、抗体生産レベルは増加する。これらの結果は、ｈＦＲアルファ（ｈＦＲα）遺伝子が葉酸欠乏の条件下で組換えタンパク質の過剰発現のために使用することができる有効な選択可能なマーカーであるという概念の証明のさらなる確認である。
【００７３】
表３：（Ｃ葉酸：培地中の葉酸の濃度；ＣｍＡｂ：培地中に分泌される抗体の濃度）
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクター。
【請求項２】
興味ある産物がポリペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項３】
興味ある産物がポリペプチドである、請求項２に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項４】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが別個の転写プロモーターのコントロール下である、前の請求項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項５】
転写プロモーターが同じである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
転写プロモーターが異なっている、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項４から６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが共通の転写プロモーターのコントロール下である、請求項１から３のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項９】
共通の転写プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該ベクターが第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド間に機能的に位置するＩＲＥＳ因子を含む、請求項８または９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体が葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される、前の請求項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１２】
第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体がヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドが安定に導入された真核細胞であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する真核細胞。
【請求項１４】
該細胞が少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体の完全な活性を欠いている、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
機能性膜結合葉酸受容体をコードする該第１のポリヌクレオチド、および興味ある産物をコードする該第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターに位置する、請求項１３または１４に記載の真核細胞。
【請求項１６】
発現ベクターが請求項１から１２のいずれかに定義されているとおりである、請求項１３から１５のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１７】
該真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３から１６のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１８】
該哺乳動物細胞が齧歯動物細胞である、請求項１７に記載の真核細胞。
【請求項１９】
該齧歯動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の真核細胞。
【請求項２０】
細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞を提供し、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入することを含む請求項１３から１９のいずれかに記載の真核細胞の生産方法であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する方法。
【請求項２１】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターに位置する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
発現ベクターが請求項１から１２のいずれかに定義されているとおりである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞に導入された発現ベクターによってコードされる興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択方法であって、
（ｉ）細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入された複数の真核細胞を提供し（第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する）、
（ｉｉ）限界濃度の葉酸を有する細胞培養培地中で該複数の真核細胞を培養し、それにより興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を得る
ことを含む、方法。
【請求項２４】
興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を同定および単離することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数の真核細胞が請求項１３から１９のいずれかに定義されているとおりの真核細胞から構成される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）請求項２３から２５のいずれかに記載の選択方法を実施し、
（ｉｉ）該細胞培養培地または該細胞から興味ある産物を単離する
ことを含む、興味ある産物の生産方法
【請求項２７】
真核細胞の細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択のための選択マーカーとしての機能性膜結合葉酸受容体の使用。
【請求項２８】
葉酸受容体が葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
葉酸受容体がヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である、請求項２８に記載の使用。
【請求項１】
機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む真核細胞発現ベクター。
【請求項２】
興味ある産物がポリペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項３】
興味ある産物がポリペプチドである、請求項２に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項４】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが別個の転写プロモーターのコントロール下である、前の請求項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項５】
転写プロモーターが同じである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
転写プロモーターが異なっている、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドの転写をコントロールするプロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項４から６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが共通の転写プロモーターのコントロール下である、請求項１から３のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項９】
共通の転写プロモーターがＳＶ４０プロモーターである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該ベクターが第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド間に機能的に位置するＩＲＥＳ因子を含む、請求項８または９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体が葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される、前の請求項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１２】
第１のポリヌクレオチドによってコードされる機能性膜結合葉酸受容体がヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドが安定に導入された真核細胞であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する真核細胞。
【請求項１４】
該細胞が少なくとも１つの内因性機能性の膜結合葉酸受容体の完全な活性を欠いている、請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
機能性膜結合葉酸受容体をコードする該第１のポリヌクレオチド、および興味ある産物をコードする該第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターに位置する、請求項１３または１４に記載の真核細胞。
【請求項１６】
発現ベクターが請求項１から１２のいずれかに定義されているとおりである、請求項１３から１５のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１７】
該真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３から１６のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項１８】
該哺乳動物細胞が齧歯動物細胞である、請求項１７に記載の真核細胞。
【請求項１９】
該齧歯動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の真核細胞。
【請求項２０】
細胞生存性が葉酸摂取に依存している真核細胞を提供し、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入することを含む請求項１３から１９のいずれかに記載の真核細胞の生産方法であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する方法。
【請求項２１】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターに位置する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
発現ベクターが請求項１から１２のいずれかに定義されているとおりである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞に導入された発現ベクターによってコードされる興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択方法であって、
（ｉ）細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、発現ベクターに位置し、機能性膜結合葉酸受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および発現ベクターに位置し、興味ある産物をコードする第２のポリヌクレオチドを導入された複数の真核細胞を提供し（第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターに位置する）、
（ｉｉ）限界濃度の葉酸を有する細胞培養培地中で該複数の真核細胞を培養し、それにより興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を得る
ことを含む、方法。
【請求項２４】
興味ある産物の安定な発現を達成する真核細胞を同定および単離することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数の真核細胞が請求項１３から１９のいずれかに定義されているとおりの真核細胞から構成される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）請求項２３から２５のいずれかに記載の選択方法を実施し、
（ｉｉ）該細胞培養培地または該細胞から興味ある産物を単離する
ことを含む、興味ある産物の生産方法
【請求項２７】
真核細胞の細胞生存性が葉酸摂取に依存しており、興味ある産物を安定に発現することができる真核細胞の選択のための選択マーカーとしての機能性膜結合葉酸受容体の使用。
【請求項２８】
葉酸受容体が葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）およびそれらの機能性変異体からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
葉酸受容体がヒト葉酸受容体アルファ（ｈＦＲα）である、請求項２８に記載の使用。
【公表番号】特表２０１１−５０５８６１（Ｐ２０１１−５０５８６１Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８７６４（Ｐ２０１０−５３８７６４）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０７５９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０７５９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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