有機汚染を安定に自己洗浄するためのポリマー改質酵素を含むコーティング
【課題】表面上もしくはコーティング中の有機汚染の除去を促進し、維持洗浄の必要性を最小にする新規な材料もしくはコーティングを提供する。
【解決手段】基材上の有機汚染の除去を促進する方法であって、
化学改質酵素をベースと結合させて水安定化活性コーティング材料を形成すること、
前記活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、前記活性コーティング材料で基材をコーティングすること
を含む方法。
【解決手段】基材上の有機汚染の除去を促進する方法であって、
化学改質酵素をベースと結合させて水安定化活性コーティング材料を形成すること、
前記活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、前記活性コーティング材料で基材をコーティングすること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分を含むコーティング組成物、及び有機汚染の除去を促進するためにこの組成物を用いる方法に関する。特定の態様において、本発明は、表面への虫汚染付着を防ぐための組成物及び方法、並びにベース材料に化学改質蛋白質を混入させて虫の体成分を分解させることによる虫汚染の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの戸外の表面は、鳥のフン、松やに、及び虫の体のような天然由来の汚染もしくは損傷に曝されている。結果として、残留している汚染は表面に不快な跡を付け、物品の外観を損なうことになる。
【０００３】
従来の自己洗浄コーティング及び表面は、無機材料を除去する水ローリングもしくはシーティングをベースとしている。これらは無機よごれの除去にはある程度のレベルの効果を示すが、生物源からの汚染（これは様々なタイプの有機ポリマー、脂肪、オイル、及び蛋白質からなり、その各々はコーティングの表面下に深く拡散する）の洗浄にはあまり効果がない。従来の方法は、表面への汚染の付着を低減させ、適当なナノ複合材料を含むポリマーコーティングにより疎水性、疎油性及び超両疎性が表面に与えられる「ロータス効果」を利用してその除去を促進することを目的としている。典型的なコーティングはフッ素及びナノ複合材料を含み、優れたロールオフ特性及びとても高い水と油の接触角を有している。サンドブラストガラスのような粗い表面に用いた場合、ナノコーティングは耐汚染性を与えるフィラーとして機能する。この「消極的な」方法の欠点は、光沢の高い表面に用いるには適さないことである。それは、ロータス効果が表面粗さに基づくものであるからである。
【０００４】
光触媒コーティングは有機汚染の自己洗浄を促進するものとして期待されている。太陽光を照射すると、ＴｉＯ2のような光触媒は有機汚れを化学的に破壊し、次いで超親水性表面上に形成された水シートにより洗い落とされる。例として、米国特許出願公開2009／104086において、指紋汚れの分解を促進するために光触媒ＴｉＯ2が用いられた。この方法の主要な欠点は、ＴｉＯ2によるポリマーコーティングの酸化障害のため無機表面に用いることに限定されることである。また、この方法は、ＴｉＯ2が汚れを分解するのみならず、ペイント中の樹脂も酸化するため、自動車コーティングにはあまり適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、表面上もしくはコーティング中の有機汚染の除去を促進し、維持洗浄の必要性を最小にする新規な材料もしくはコーティングに対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
有機汚染の除去を促進する方法が提供され、この方法は化学改質酵素をベースと結合させることにより水安定化活性一時的コーティング材料を提供し、酵素が活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、基材を活性コーティング材料でコーティングすることを含む。
【０００７】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望により前記コーティングを水中に３０分以上浸した後に有機汚染の成分を分解することができ、所望によりこのコーティングは水中に３０分浸した後、活性を５０％以上保持する。
【０００８】
化学改質された酵素は、所望により細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、もしくはリパーゼのような加水分解酵素である。この酵素は、ポリマー部分により、所望によりポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子により化学改質されている。ポリオキシエチレンは、所望により1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する。ある態様においては、ポリオキシエチレンは前記酵素との反応前に、スクシンイミジルエステルをさらに含む。ポリマー部分は所望により、末端アミノ基のような酵素上又はリシン上のアミノ基に直接もしくは間接的に共有結合している。ある態様において、ポリマー部分は酵素によりシステインに直接もしくは間接的に共有結合している。ポリマー部分は所望により、線状であっても分枝であってもよい。
【０００９】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望によりベースの少なくとも１つの成分に共有結合し、又はベースに非共有結合するかもしくはベースに混合されている。そのようなコーティングは、基材上に存在する場合、このコーティングが酵素としてサーモリシンを含む場合、0.0075ユニット／cm2以上の表面活性を有する。
【００１０】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望により酵素とは独立のベースに結合した第一のポリオキシエチレンを含む。コーティング中の酵素に対するベースの重量比は、所望により２：１〜２０：１である。組成物は所望により、第二のポリオキシエチレンにより化学改質された酵素を含む。第一もしくは第二のポリオキシエチレンは、所望により1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する。第一及び第二のポリオキシエチレンは、所望によりオキシエチレンの同じポリマーを有する。第一のポリオキシエチレンは、所望によりスクシンイニミジルエステルにより誘導化されている。第二のポリオキシエチレンは、所望により酵素との反応前にスクシンイニミジルエステルにより誘導化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一態様による水安定化活性一時的コーティング組成物の形成の略図である。
【００１２】
【図２】本発明の一態様による酵素の化学改質及びそのベースへの混入の略図である。
【００１３】
【図３】本発明の一態様による化学改質酵素の均質混入の略図である。
【００１４】
【図４Ａ】水洗浄後の残留活性により示す化学改質酵素を服務コーティングの水安定性を示すグラフである。
【図４Ｂ】水洗浄前後の水接触角を示すグラフである。
【００１５】
【図５】基材に適用後の水安定化コーティング上の食品汚れの促進された除去を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の記載は単なる説明であり、発明の範囲、用途等を限定するものではない。本発明の限定しない規定及び用語により説明する。これらの規定及び用語は発明の範囲もしくは実施を限定するものではなく、単に説明のため用いる。
【００１７】
コーティングとして有用な組成物が提供され、コーティング材料と結合した酵素は、コーティングを水に曝露する間もしくは曝露した後に酵素活性寿命を向上させるように改質されている。このコーティングは永久的コーティングとして用いられる他のコーティング材料よりもいくつかの利点を有する一時的コーティングであり、コートされた物品の有用な寿命を延長するものではない。一時的コーティングは適用が比較的簡単であり、家庭において素人により行うことができ、又は専門家によって行うこともできる。本発明の改質酵素を含む一時的コーティングの使用は、生物活性表面を規則的に延長し、並びに輝き、保護及び水流出のような他の品質を向上させる。
【００１８】
本発明のコーティングは風化による酵素活性の損失に対して耐性を示す。ここで風化とは、周囲環境もしくは実験室のいずれかにおける水、熱、ＵＶ光、もしくは他の原因への曝露を含む。本発明によるコーティングは、水中への浸漬のような水への曝露による風化に予想外の耐性を有する。このように、風化は水への浸漬を含む。
【００１９】
ここではコーティングに関して説明するが、有機汚染除去を促進するためのコーティングが必要ない基材もしくは物品であってもよい。ここで「コーティング」は、１以上の基材の表面上に層をなすような材料を意味し、又は基材材料自身を含んでいてもよい。ある態様において、「コーティング」は、基材を除き、基材を覆うために用いられる材料である。本発明の方法及び組成物は、コーティングと結合した酵素と称される。当業者は、本明細書の記載が基材自身にも同様に適用可能であることを認識している。
【００２０】
本発明は、有機汚染の成分を選択的に分解し、汚染の除去を促進する、酵素の触媒活性に基づいている。有機汚染の例は、有機ポリマー、脂肪、オイル、又は蛋白質を含む。本発明の組成物及び方法は、水安定化活性な一時的コーティングによる有機汚染の活性な破壊を提供する。従来の一時的コーティング材料は有機汚染を分解する能力を有しているが、本発明者は、永久コーティングとは異なり、この一時的コーティングは水に曝露されると急速に不活性化され、コーティングの予想される寿命が役に立たないほどまで低下することを見出した。酵素安定性を促進する無限のメカニズムのうち、本発明者は、ベースと混入する前に酵素上に１以上のポリマー部分を添加すると、得られるコーティング材料の水安定性を劇的に向上させることを見出した。
【００２１】
水安定化活性一時的コーティング材料組成物は、化学改質された酵素と結合したベースを含み、所望により、ベースと結合した第一のポリオキシエチレンを含み、この第一のポリオキシエチレンは酵素とは独立のものである（すなわち、酵素に共有結合していない）。この組成物は、食品汚れ、虫汚れ、指紋、及び他の環境上若しくは人工的汚れのような有機汚染の自己洗浄用のコーティングとして有用である。
【００２２】
この組成物は水安定化コーティングである。この「水安定化」とは、結合した有機汚染の自己洗浄もしくは解放に対するコーティングの活性を意味し、非化学改質蛋白質を有する同様のコーティングと比較して化学改質蛋白質の存在により活性が高まる。水安定化コーティングは所望により、水中に３０分浸した後に５０〜９０％、若しくはそれ以上の活性を保持する。水安定化コーティングは所望により、水中の９０分浸した後に１５％以上の活性を保持する。
【００２３】
この組成物は一時的コーティングである。ここで「一時的」とは、３０分〜３ヶ月の間に実施可能なものと規定する。一時的の限界は、所望によりコーティングが曝される環境条件により規定される。所望により、一時的は本発明の組成物の適用からその後の水との接触もしくは水への浸漬までのいずれかの時間である。ある態様において、一時的は３ヶ月以下であり、所望により２ヶ月未満であり、所望により６、５、４、３、２、もしくは１週間未満である。所望により、一時的は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１日未満である。ある態様において、「一時的」は本発明の組成物を基材に適用してから水と３０、６０、もしくは９０分、もしくはそれ以上浸漬もしくは接触させるまでの間である。
【００２４】
この組成物はベース材料を含む。ベースとは、当該分野において公知の市販入手可能なもしくはその他から入手可能な自動車用、家具用、床用、靴用、金属用、もしくは他の表面コンディショナー、研磨材又は保護材である。ベースの例は、天然由来ワックス、例えばパラフィンワックス、微結晶石油ワックス、カルナバワックス、カンデリラ植物ワックス、モンタンコール由来ワックス；合成ポリマーワックス、例えば酸化ポリエチレン；シリコーンベースワックス、例えば米国特許第7,753,998に記載のもの、アミノ官能性シリコーン；米国特許第5,073,407号及び5,968,238号に記載されているような水中ノニオンもしくはアニオン界面活性剤；及び表面コンディショニング、研磨もしくは保護に一般に用いられている他の材料、並びにこれらの混合物を含む。
【００２５】
ベースの好適な例は、自動車用の研磨剤を含む。自動車用研磨剤の例は、1)TURTLE WAXカルナバカーワックスＴ−６（石油蒸留物中にシリコーン樹脂を含むカルナバワックス）、2)米国特許第5,073,407号に記載のDURA SHINE、3)PLASTX合成ポリマー自動車研磨剤、4)炭化水素とシリコーン樹脂のブレンドであるTURTLE WAX ICE合成研磨剤、5)米国特許第7,503,963号に記載のEAGLE ONE NANOWAX、6)米国特許第7,067,573号に記載のNU FINISH NF-76、及び7)ブラジルカルナバとモンタンワックス及び光反射性ポリマーのブレンドであるTURTLE WAX PLATINUMを含む。
【００２６】
この組成物は少なくとも１種の活性蛋白質を含む。活性蛋白質はプロテアーゼもしくは加水分解酵素のような酵素の活性を有する巨大分子である。「蛋白質」とは、ペプチド結合により共有結合し、酵素の活性を有する３以上の天然、合成、もしくは誘導体アミノ酸である。従って、「蛋白質」は３〜１００個、もしくはそれ以上のアミノ酸を含み、約150〜350,000ダルトンの分子量を有する。蛋白質は、生命体のゲノムによりエンコードされた生物により産生された蛋白性分子の長さに適合する、３以上のアミノ酸の長さの隣接する分子配列を有する分子である。蛋白質の例は、酵素、抗体、受容体、輸送蛋白質、構造蛋白質、又はこれらの組み合わせを含む。蛋白質は、リガンド、医薬、抗原、もしくはハプテンのような他の物質と特異的に相互作用をすることができる。蛋白質は１種以上のホモもしくはヘテロポリマー部分の添加により化学的に改質される。「類似体」とは、ビオチニル化を除きホモもしくはヘテロポリマー基による化学改質を除く。
【００２７】
蛋白質は所望により、１種以上のリン、硫黄の分子の付加もしくは除去による、又はビオチン、アビジン、フルオロフォア、ルミフォアのような側基、又は精製、検出、もしくは溶解度等の特性を変える他の側基の付加によるような、そのままのポリペプチド配列から改質される。
【００２８】
この記載は酵素である蛋白質に関するものであるが、他の蛋白質活性成分も同様に可能である。酵素は所望により生物活性酵素である。生物活性酵素は生物組織、環境、もしくは食品中の分子の化学結合を開裂する。酵素は所望により、ペプチド結合を開裂することができるプロテアーゼであり、例えばバクテリアプロテアーゼもしくはその類似体を含む。酵素として機能する蛋白質は所望により、遺伝子によりエンコードされる野生タイプのアミノ酸配列と同じである。蛋白質は、天然の有機体中の蛋白質の配列に適合するアミノ酸配列を有する場合、「野生タイプ」とよばれる。蛋白質は所望により、野生タイプ蛋白質の配列と類似の配列及び／又は構造及び／又は酵素としての構造及び機能を含む、野生タイプ酵素と機能的に等価である。機能的に等価の酵素は、野生タイプ酵素のＥＣ分類の化学反応を触媒するような、野生タイプ酵素と類似のもしくは同じ酵素特性を有し、及び／又は配列及び／又は構造による野生タイプ酵素に関連する酵素の化学反応を触媒するような他の酵素特性を有する。酵素は、野生タイプ形態の酵素により触媒される反応（例えば、ＥＣ分類に用いられる反応）を触媒する同等の機能を含む。限定しない例として、「アミラーゼ」は、高い反応速度、低い反応速度、変化した基質特性、高いもしくは低い基質結合親和力等によるような活性が変化しても、アミラーゼ活性を保持するアミラーゼと機能的に等価物を含む。機能的に等価物の例は、野生タイプ酵素配列の突然変異体、例えば配列切断、アミノ酸置換、アミノ酸変異、及び／又は融合蛋白質等を含む。
【００２９】
酵素はコーティング中もしくは上に固定され、有機汚染成分のより小さな分子への分解を触媒する。理論付けようとするものではないが、より小さな分子はコーティングの表面への接着が弱く、重力又は水、空気、もしくは他の流体による穏やかな洗浄によりコーティングからの有機汚染物質の除去が促進される。このように、本発明は表面からの有機汚染の除去用の組成物及び方法として有用である。
【００３０】
酵素は通常、酵素委託（ＥＣ）番号としての標準命名法に従い記載される。使用可能な酵素の例は、ＥＣ１，オキシドレダクターゼ；ＥＣ２，トランスフェラーゼ；ＥＣ３、ヒドロラーゼ；ＥＣ４，リアーゼ；ＥＣ５、イソメラーゼ；又はＥＣ６、リガーゼを含む。これらのカテゴリーにおける酵素は本発明の態様による組成物中に含まれ得る。
【００３１】
具体的な態様において、含まれる酵素はヒドロラーゼ、例えばグルコシダーゼ、プロテアーゼ、又はリパーゼである。グルコシダーゼの非限定的例は、アミラーゼ、キチナーゼ、及びリゾチームを含む。プロテアーゼの非限定的例は、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、スブチリシン、パパイン、エラスターゼ、及びプラスミノーゲンを含む。リパーゼの非限定的例は、パンクレアチンリパーゼ及びリポ蛋白リパーゼを含む。酵素として機能する蛋白質の例は、米国特許出願公開No.2010/0210745に記載されている。
【００３２】
アミラーゼは、コーティング組成物のある態様において存在する酵素である。アミラーゼはでんぷんを分解する活性を有する。いくつかのタイプのアミラーゼが使用可能であり、具体的にはオリゴ糖及び多糖中の(1->4)-α−Ｄ−グルコシド結合の末端加水分解に関与するα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。α−アミラーゼはBacillus subtilis由来であり、Genbank Accesion No.ACM91731(SEQ ID NO:1)にみられる配列、又はその類似体を有し、SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列によりエンコードされる。特定の例は、Sigma Aldrich Co., St. Louis, MOより入手可能なBacillus subtilisからのα−アミラーゼである。他のα−アミラーゼは、Geobacillus stearothermophilus (Accession No:AAA22227)、Aspergillus oryzae (Accession No: CAA31220)、Homo sapiens (Accession No: BAA14130)、Bacillus amyloliquefaciens (Accession No: ADE44086)、Bacillus licheniformis (Accession No: CAA01355)、又は他の生命体もしくは類似体由来のものを含む。様々な生命体からのβ−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、又はその類似体も同様に蛋白質−ポリマー組成物に使用可能である。
【００３３】
アミラーゼ酵素の例は、1000Ｕ／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有し、ここで１Ｕ（ユニット）は、Zulkowskyのポテトでんぷん（例えば、190℃においてグリセロールにより処理したでんぷん、Ber. Deutsch. Chem. Ges, 1880; 13:1395)からの非蛋白質消化を作用させる酵素の量と規定される。具体的には、このアミラーゼは1,000Ｕ／ｇ〜500,000Ｕ／ｇ、もしくはそれ以上の活性を有する。
【００３４】
プロテアーゼは所望により、サーモリシンがプロトタイププロテアーゼ（EC3.4.24.27)又はその類似体である、細菌サーモリシン様プロテアーゼのＭ４族のメンバーのような細菌メタロプロテアーゼである。プロテアーゼは所望により、Bacillus stearothermophilus (Bacillus thermoproteolyticus Var. Rokko)(例えば、Amano Enzyme U.S.A., Co(Elgin, IL)より入手可能な商品名"THERMOASE C160"として販売されている）、もしくはその類似体由来の細菌中性サーモリシン様プロテアーゼである。プロテアーゼは所望により、KreigらのJ. Biol. Chem., 2000; 275(40):31115-20に示されているあらゆるプロテアーゼである。プロテアーゼの具体例は、Bacillis cereus (Accession No.P05806)、Lactobacillis sp. (Accession No.Q48857)、Bacillis megaterium (Accession No.Q00891)、Bacillis sp. (Accession No.Q59223)、Alicyclobacillis acidocaldarious (Accession No.Q43880)、Bacillis caldolyticus (Accession No.P23384)、Bacillis thermoproteolyticus (Accession No.P00800)、Bacillus stearothermophilus (Accession No.P43133)、Bacillus subtilis (Accession No.P06142)、Bacillus amyloliquefaciens (Accession No.P06832)、Lysteria monocytogenes (Accession No.P34025;P23224)からのサーモリシンさまプロテアーゼを含む。
【００３５】
野生タイププロテアーゼは、天然の生命体にみられるものと同じアミノ酸配列を有するプロテアーゼである。野生タイププロテアーゼの具体例は、GenBank Accession No.P06874及びSEQ ID NO:3に示され、Takagi M.ら、J. Bacteriol., 1985; 163(3):824-831及びSEQ ID NO:4に見られるヌクレオチド配列エンコードSEQ ID NO:3である。
【００３６】
プロテアーゼ活性を調べる方法は公知であり、当該分野において標準的である。具体的には、プロテアーゼ蛋白質もしくはその類似体中のプロテアーゼ活性のスクリーニングは、プロテアーゼもしくはその類似体をプロテアーゼの天然もしくは合成基質と接触させ、そして基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、プロテアーゼにより開裂され、当該分野によって公知の方法により容易に測定されるフォリン陽性アミノ酸及びペプチド（チロシンとして計算される）を放出するカゼインを含む。Bachem AG, Bubendorf, Switzerlandより得られる合成基質フリルアクリロイル化トリペプチド3-(2-フリルアクリロイル)-L-グリシル-L-ロイシン-L-アラニンも同様に使用可能である。
【００３７】
特定のプロテアーゼは、10,000ユニット／ｇプロテアーゼもしくはそれ以上を有する。ある態様において、プロテアーゼは、１ユニットが37℃、ｐＨ7.2で反応を行った場合に、ミルクカゼインから非蛋白質消化生成物を遊離し（最終濃度0.5％）、初期の反応段階で１分あたり１μモルのチロシンに匹敵するフォリンカラーを与える酵素の量と規定されるサーモリシンである。プロテアーゼ活性は10,000PU/g〜1,500,000U/gである。より低いプロテアーゼ活性も使用可能である。プロテアーゼ活性は所望により、300,000U/gを超える。所望により、プロテアーゼ活性は300,000U/g〜2,000,000U/gもしくはそれ以上である。
【００３８】
蛋白質は所望によりリパーゼである。野生タイプリパーゼは天然生命体にみられるものと同じアミノ酸配列を有するリパーゼである。野生タイプリパーゼの具体例は、GenBank Accession o.ACL68189及びSEQ ID NO:5にみられる。野生タイプリパーゼをエンコードするヌクレオチドの例は、Accession No.FJ536288及びSEQ ID NO:6にみられる。
【００３９】
リパーゼ活性はユニット／グラムで規定される。１ユニットは、基質トリアセチン（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Product No.90240）を用いてｐＨ7.4、40℃において１分あたり１μモルの酢酸を加水分解する酵素の量に相当する。SEQ ID NO:5のリパーゼは200ユニット／ｇの活性を有する。
【００４０】
リパーゼ活性を調べる方法は公知であり、当該分野において標準的である。具体的には、リパーゼ蛋白質もしくはその類似体のリパーゼ活性のスクリーニングは、リパーゼもしくはその類似体をリパーゼの天然もしくは合成基質と接触させ、そして基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、トリアシルリパーゼにより開裂され、当該分野によって公知の方法により容易に測定される酪酸もしくは酢酸を放出するトリブチリン及びトリアセチンを含む。
【００４１】
蛋白質は所望により、１種以上の共同因子イオン又は蛋白質と機能する。共同因子イオンは、例えば亜鉛、コバルト、又はカルシウムである。
【００４２】
使用可能な蛋白質のクローニング、発現、及び精製は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ２版, Vol.1-3, Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubeltら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992；及びShort Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、Wiley-Interscience, New York, 2002に開示されている方法により実施可能である。
【００４３】
蛋白質中に存在する天然由来のアミノ酸の例は、一般的なアミノ酸であるアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンを含む。天然もしくは化学的に変性されたアミノ酸の誘導体も所望により存在してもよく、例えばα−アスパラギン、２−アミノブタン酸もしくは２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノカプリン酸（２−アミノデカン酸）、６−アミノカプロン酸、α−グルタミン、２−アミノヘプタン酸、６−アミノヘキサン酸、α−アミノイソ酪酸（２−アミノアラニン）、３−アミノイソ酪酸、β−アラニン、allo-ヒドロキシリシン、allo-イソロイシン、４−アミノ−７−メチルヘプタン酸、４−アミノ−５−フェニルペンタン酸、２−アミノピメル酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシベンゼンペンタン酸、２−アミノスベリン酸、２−カルボキシアゼチジン、β−アラニン、β−アスパラギン酸、ビフェニルアラニン、3,6-
ジアミノヘキサン酸、ブタン酸、シクロブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、Ｎ５−アミノカルボニルオルニチン、シクロペンチルアラニン、シクロプロピルアラニン、３−スルホアラニン、2,4-ジアミノブタン酸、ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、ジフェニルアラニン、N,N-ジメチルグリシン、ジアミノピメル酸、2,3-ジアミノプロパン酸、Ｓ−エチルチオシステイン、Ｎ−エチルアスパラギン、Ｎ−エチルグリシン、４−アザフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、γ−グルタミン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシ酢酸、ピログルタミン酸、ホモアルギニン、ホモシステイン酸、ホモシステイン、ホモヒスチジン、２−ヒドロキシイソ吉草酸、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、ホモプロリン、ホモセリン、２−ヒドロキシペンタノン酸、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン、２−カルボキシオクタヒドロインドール、３−カルボキシイソキノリン、イソバリン、２−ヒドロキシプロパン酸（乳酸）、メルカプト酢酸、メルカプトブタン酸、サルコシン、４−メチル−３−ヒドロキシプロリン、メルカプトプロパン酸、ノルロイシン、ニペコチン酸、ノルチロシン、ノルバリン、ω−アミノ酸、オルニチン、ペニシラミン（３−メルカプトバリン）、２−フェニルグリシン、２−カルボキシピペリジン、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、２−アミノ−３−（４−スルホフェニル）プロピオン酸、１−アミノ−１−カルボキシシクロペンタン、３−チエニルアラニン、ε−Ｎ−トリメチルリシン、３−チアゾリルアラニン、４−カルボン酸、α−アミノ-2,4-ジオキシピリミジンプロパン酸、及び２−ナフチルアラニンである。
【００４４】
蛋白質は当該分野において公知の様々な方法によって得られ、その方法の例は、細胞もしくは生命体からの単離、化学合成、核酸配列の発現、及び蛋白質の部分加水分解を含む。化学的な蛋白質合成方法は当該分野において公知であり、固相ペプチド合成及び溶液相ペプチド合成、又はHackeng,TMらのProc Natl Acad Sci USA, 1997;94(15):7845-50の方法を含む。蛋白質は天然もしくは非天然蛋白質であってよい。「天然」とは、細胞、組織もしくは生命体に内生する蛋白質を意味し、対立遺伝子型変形を含む。非天然蛋白質は天然生命体から合成された又は変性細胞、組織もしくは生命体に見られないものを含む。
【００４５】
蛋白質の構造に改質もしくは変形を行ってよく、活性酵素と同じ特性を有する分子が得られる（例えば、保存アミノ酸置換）。例えば、ある種のアミノ酸は活性を損なうことなく配列中の他のアミノ酸と置換することができ、又は未改質蛋白質の活性を低下させるもしくは高めることができる。蛋白質の機能的活性を規定するのは相互作用能力及び蛋白質の特性であるから、ある種のアミノ酸配列置換を蛋白質配列中で行うことができ、同様のもしくは他の望ましい特性を有する蛋白質を得ることができる。天然の蛋白質とアミノ酸配列が１００％同じではない蛋白質は類似体とよばれる。類似体は所望により、１以上のアミノ酸置換、改質、欠失、付加、又は他の変化を含み、但しそのような変化は野生タイプのものと同じタイプの活性（例えば加水分解）を有する蛋白質を形成するものであるとする。そのような変化を行う際に、アミノ酸の親水性もしくは水療インデックスが考慮される。そのような変化において、親水性もしくは水療インデックスが±２、もしくは±１、又は±0.5内にあるアミノ酸を用いて行われる。
【００４６】
アミノ酸置換は所望により、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。考慮される特性の変化を起こす置換基の例は当業者に周知であり、（当初の残基：置換基の例）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ，Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｃｌｕ，Ｃｙｓ，Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ，Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ，Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｌｉｅ，Ｌｅｕ）を含む。特に、蛋白質の態様は野性タイプ蛋白質と約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％配列が同一である類似体を含む。
【００４７】
さらに上記特徴は所望により、酵素活性の低いもしくは高い蛋白質を調製する際において考慮される。例えば、蛋白質中の基質結合サイト、外部サイト、共同因子結合サイト、触媒サイト、もしくは他のサイトにおける置換基は基質に対する酵素の活性を変化させる。そのような置換基を考慮するにあたり、公知の天然もしくは天然様酵素の配列を考慮してもよい。例えば、Miki, Yら、Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 1996; 1:191-199によるような、サーモロイシン中のAsp213に対応する突然変異体も使用可能である。所望により、セリン単独もしくはＧ８Ｃ／Ｎ６０Ｃ／Ｓ６５Ｐの置換基と共に、Ｌ１４４のサーモリシンにおける置換は、野性タイプ酵素よりも５〜１０倍触媒効率を高めるために使用可能である。（Yasukawa, K.及びInouye, K, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins & Proteomics, 2007; 1774-1281-1288）。Ｎ１１６Ｄ、Ｑ１１９Ｒ、Ｄ１５０Ｅ及びＱ２２５ＲのBacillus stearothermophilusからの細菌中性プロテアーゼにおける突然変異体並びに他の突然変異体は同様に触媒活性を高める（De Kreig,A,ら、J. Biol. Chem., 2002; 277:15432-15438）。De Kreigはまた、蛋白質の触媒活性を高めるもしくは低下させる複式置換基を教示している（Id. 及び De Kreigら、Eur J. Biochem, 2001; 268(18):4985-4991）。これら又は他のサイトにおける他の置換基は所望により、酵素活性に同じ効果をもたらす。サイト方向性突然変異生成及びDe Kreig, Eur J. Biochem, 2001;268(18):4985-4991の方法によるような蛋白質活性の選別は当該分野のレベル内であり、一般的である。
【００４８】
蛋白質は所望により、野性タイプ蛋白質の類似体である。蛋白質の類似体は野性タイプ蛋白質と同じ条件においた場合に、同じ基質に対して野性タイプ酵素と同じレベルの活性を有するアミノ酸配列を有する。類似体は所望により、野性タイプ蛋白質の500％、250％、200％、150％、110％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、25％、10％、５％、又はこれらの間のあらゆる値を有する。類似体を形成するために野性タイプ蛋白質に対するあらゆる改質を用いてもよい。例えば、アミノ酸置換、付加、除去、架橋、ジスルフィド結合の除去もしくは付加、又は他の改質を用いて類似体を形成してよい。類似体は所望により、２以上の野性タイプ蛋白質、フラグメントの配列を含む融合蛋白質である。
【００４９】
蛋白質活性を調べる方法は公知であり、当該分野において一般的である。例えば、酵素の活性の選別は、酵素を天然もしくは合成基質と接触させ、基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、カゼイン（これはプロテアーゼにより開裂されて当該分野において公知の方法により容易に測定されるフォリン陽性アミノ酸及びペプチド（チロシンとして計算される）を放出する）を含む。合成基質である、Bachem AG, Bubendorf, Switzerlandより得られるフリルアクリロイル化トリペプチドである3-(2-フリルアクリロイル)-L-グリシル-L-ロイシン-L-アラニンが使用可能である。α−アミラーゼの基質の例は、長鎖炭水化物、例えばスターチを構成するアミロースもしくはアミロペクチンを含む。α−アミラーゼ活性を選抜する他の方法は、Fischer and Stein, Biochem,Prep., 1961, 8, 27-33の比色分析法を含む。当業者は様々な材料に存在する酵素の活性を調べる方法を容易に想定できるであろう。
【００５０】
蛋白質は例えば組み換え体である。蛋白質をエンコードする核酸配列をクローンする、合成するもしくは得る方法は公知であり、当該分野において一般的である。同様に、細胞形質転換及び蛋白質発現の方法も同様に公知である。SEQ ID NO:1の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例は、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:2である。SEQ ID NO:3の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例は、登録番号M11446及びSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列である。SEQ ID NO:5の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例はヌクレオチド配列SEQ ID NO:6である。
【００５１】
蛋白質は、付随タグ、改質、融合蛋白質におけるような他の蛋白質、又は当該分野において公知の他の改質もしくは組み合わせにより共発現されてもよい。タグの例は、６ＸＨｉｓ、ＦＬＡＧ、ビオチン、ユビキノン、ＳＵＭＯ、又は当該分野において公知の他のタグを含む。タグは、ファクターＸａ、トロンビン、Lifesensors Inc., Malvern, PAより得られるようなＳＵＭＯ蛋白質、又はトリプシンを含む当該分野において公知の酵素により開裂可能な標的配列により蛋白質に結合することによるような開裂可能である。さらに、化学的開裂は同様に使用可能である。
【００５２】
蛋白質発現は、例えば蛋白質核酸配列の転写、蛋白質核酸配列から転写されたＲＮＡの転換等により達成される。核酸配列の類似体は、蛋白質に転換された際に野性タイプ蛋白質もしくは野性タイプ蛋白質の類似体を形成するあらゆる配列である。蛋白質発現は所望により、例えば大腸菌（E. Coli）、ヒーラ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣細胞のような細胞をベースとするシステムにおいて行われる。細胞を含まない発現システムも同様に使用可能である。
【００５３】
蛋白質の多くの類似体が使用可能であり、蛋白質配列の機能を高める、低下させる、又は変えないアミノ酸置換、改質、もしくは他のアミノ酸変化を含む本発明の範囲内である。いくつかの後転換改質も同様に本発明の範囲内であり、例えば非天然アミノ酸の混入、ホスホリル化、グリコシル化、ビオチン、フルオロフォア、ルミフォア、放射活性基、抗原、又は他の分子のような測基の付加を含む。
【００５４】
本発明に係る蛋白質は１以上のポリマー部分の付加により化学改質されている。ポリマー部分は所望により、直鎖、分枝鎖、又はこれらの組み合わせである。このポリマー部分は所望により、ホモマー又はヘテロマーである。ポリマー部分の例は、炭水化物もしくはポリオキシエチレン（ポリエチレングリコールもしくはＰＥＧとして知られている）の１以上の分子を含む。
【００５５】
ポリマー部分の例は、限定するものではないが、ポリオキシエチレン及びポリオキシエチレン誘導体のようなポリアルキルアルコール及びグリコール（例えば酸素を含むヘテロアルキルを含む）；官能化デキストランを含むデキストラン；スチレンポリマー；ポリエチレン及び誘導体；限定するものではないが、ヘパリンのポリマー、ポリガラクツロン酸、ムチン、核酸及びその類似体（改質リボースホスフェート主鎖、グルタミン酸、アスパラギン酸、合成ポリマーのカルボン酸、燐酸、およびスルホン酸誘導体のポリペプチドを含む）を含むポリアニオン；及びポリカチオン（アクリルアミド及び2-アクリルアミド-2-メチルプロパントリメチルアミン、ポリ(N-エチル-4-ビニルピリジン）もしくは同様の４級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマー及びデキストラン共役体、ポリミキシンＢスルフェート、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば強ポリカチオンポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、スペルミン、スペルミジン、及びプロタミンのような蛋白質、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン及びポリオルニチンをベースとするポリカチオンを含む）；及びこれらの混合物及び誘導体を含む。好適な付加ポリマーは、Roberts, M.J.ら、(2002)"Chemistry for peptide and protein PEGylation" Adv.Drug Deliv.Rev.54, 459-476; Kinsler,O.ら、(2002)"Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates" Adv.Drug Deliv. Rev.54; 米国特許出願番号60/360,722;US 5,795,569; US 5,766,581; EP01064951; 米国特許6,340,742;WO 00176640;WO002017;EP0822199A2;WO0249673A2;US 4,002,531;US 5,183,550;5;US 5,985,263; US 5,990,237; US 6,461,802; US 6,495,659; US 6,448,369; US 6,437,025; US 5,900,461; US 6,413,507; US 5,446,090; US 5,672,662; US 6,214,966; US 6,258,351; US 5,932,462; US 5,919,455; US 6,113,906; US 5,985,236; WO9428024A1; US 6,340,742; US 6,420,339及びWO0187925A2に示されている。
【００５６】
ポリオキシエチレンは一般的構造−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−を有し、ここでｎは所望により２〜2000の整数である。所望により、ｎは50〜500、100〜250、あるいは150〜250の整数である。ポリオキシエチレンは所望により、当該分野において公知の１以上の様々な化学物質を用いて蛋白質に結合するサイズで提供される。ポリオキシエチレンは所望により、１級アミン（例えばリシン側鎖もしくは蛋白質Ｎ末端）、チオール（システイン残基）、又はヒスチジンと共有結合している。リシンはしばしば蛋白質の表面に現れ、リシン側鎖におけるポリオキシエチレンの結合は反応生成物の混合物を形成する。Ｎ末端のｐＫａはリシン側鎖のｐＫａとは大きく異なっているため、改質するためにＮ末端を特異的に標的とすることが可能である。同様に、ほとんどの蛋白質は遊離システイン残基をわずかに含むため、システイン（天然もしくは人工）はポリオキシエチレンとのサイト特異的相互作用の標的とされる。
【００５７】
ポリオキシエチレンは所望により、１つの末端がアルコキシ基のような比較的不活性の基で末端キャップされ、他方の末端がリンカー部分によりさらに改質されてもよいヒドロキシル基であるように末端キャップされている。「ＰＥＧ」とは、ポリオキシエチレンを意味し、ＰＥＧに続く数字（下付きではない）は分子量を意味する。従って、「PEG10000」は分子量が約10,000ダルトンであるＰＥＧ部分である。本発明者は、直鎖PEG10000が他のＰＥＧ分子よりも優れていることを見出した。
【００５８】
「ＰＥＧ化」は、１以上のアミノ酸におけるリンカーによる１以上のＰＥＧ部分の結合による蛋白質の改質を意味する。ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）部分は、Ｎ末端α−アミノ基上の又はγ−蛋白質上のリシン残基上の求核置換（アシル化）により、例えばＰＥＧスクシンイミジルエステルと結合する。所望により、ポリオキシエチレン部分は、ＰＥＧ−アルデヒド及び還元剤、例えばシアノホウ化水素ナトリウムを用いて、蛋白質中に存在するアミノ基上での還元性アシル化によって結合する。所望により、ポリオキシエチレン部分は、例えばＰＥＧマレイミド試薬を用いてマイケル付加反応において不対システイン残基の側鎖に結合する。リンカーに結合したポリオキシエチレン部分は所望により、JenLem Technology USA, Allen, TXより入手可能である。米国特許出願NO.2009/0306337に教示されているあらゆるＰＥＧ分子が使用可能である。米国特許出願NO.2009/0306337は蛋白質にＰＥＧ基を結合する方法も教示している。ＰＥＧは所望により、中間エステル、アミド、ウレタン、もしくは他の結合により蛋白質に結合する。
【００５９】
ある態様において、蛋白質は、ポリオキシエチレン用のサイト特異的混入サイトを与えるために追加システインを混入した加水分解酵素の類似体である。ある態様において、リシンもしくはヒスチジン残基が、ポリオキシエチレンの分子の結合を阻害するように標的１級アミンを有さない他のアミノ酸で置換されている。システイン、リシン、もしくはヒスチジンのようなアミノ酸残基の選択は、所望の改質度による。所望により、US Pat No.7,642,340に記載されているように、シミュレーションコンピュータプログラムを用いてポリマーによる改質が蛋白質の機能を阻害するか否かを予想する。
【００６０】
本発明において用いられる蛋白質は所望により、一置換である、すなわち蛋白質分子中の１つのアミノ酸残基に又はＮ−末端アミノ酸残基に結合しているただ１つのポリマー部分を有するものである。あるいは、１つの蛋白質上に２、３、４、もしくはそれ以上のポリマー部分が存在してもよい。蛋白質が１より多くのポリマー部分を含むような態様において、所望により、Ｎ末端アミノ酸残基又はアミノ酸基に同じ部分が結合する。しかしながら、個々のポリマー基は、その大きさ及び長さが互いに異なっていてよく、また蛋白質上の位置も異なっていてよい。
【００６１】
水もしくは他の流体中に浸漬もしくは接触した際にコーティング組成物からの蛋白質の浸出速度を制御するために、所望により蛋白質上の１以上のサイトにおける１以上のポリマー部分の可逆的結合が用いられる。この態様において、ポリマーは共有結合されるが、例えば加熱、水洗浄、もしくは単なる時間の経過のような風化にさらされる。この結合は所望により、蛋白質とポリマーの間のもしくは蛋白質とポリマーの間に存在するリンカー内における結合である。
【００６２】
本発明の方法は、コーティング材料を形成するための、ベースに混入された１以上の活性な化学改質された蛋白質を含む本発明の組成物を用いる。蛋白質は所望により、ベース材料に非共有結合及び／又は共有結合しており、又は封入された蛋白質を製造するためのような製造の間にベース材料と混合することにより又は表面に結合することによりベース材料と結合している。ある態様において、蛋白質は、蛋白質とベース材料の１以上の成分との間の直接共有相互作用により又はリンカーによる結合によってベース材料と共有結合している。
【００６３】
コーティング中において蛋白質をベース材料と結合させるにはいくつかの方法がある。その１つは、共有結合を適用することである。詳細には、蛋白質の遊離アミノ基をベースの活性基に共有結合させる。そのような活性基は、アルコール、チオール、アルデヒド、カルボン酸、無水物、エポキシ、エステル、又はこれらのあらゆる組み合わせを含む。蛋白質を混入させるこの方法は独特な利点をもたらす。第１に、共有結合は蛋白質をベースに永久的につなぎ、蛋白質の浸出の少ない最終組成物の一体部分を構成する。第２に、共有結合は酵素寿命を長くする。時間と共に、蛋白質は通常、ポリペプチド鎖のほぐれのために活性を失う。共有結合のような化学結合はそのようなほぐれを有効に制限し、蛋白質の寿命を向上させる。蛋白質の寿命は通常、固定された蛋白質と物理的に吸着されたもしくは遊離の蛋白質との活性低下の料を比較することにより決定される。
【００６４】
蛋白質は所望により、１：１〜１：２０（酵素：ベース）の重量比でベースと結合する。所望により、蛋白質は１：２〜１：１５、さらには１：４〜１：１２の重量比でベースと結合する。
【００６５】
蛋白質は所望により、基材中に均質に分散し、均質な蛋白質プラットフォームを形成する。
【００６６】
材料に蛋白質を結合させる化学的方法は、蛋白質中及び材料成分中に存在する官能基によって異なる。そのような方法は多く存在する。例えば、蛋白質（例えば酵素）を他の物質に結合する方法は、O'SullivanらのMethods in Enzymology, 1981; 73:147-166及びErlanger, Methods in Exzymology, 1980; 70:85-104に記載されている。
【００６７】
蛋白質は所望により、基材上に層をなすコーティング中に存在し、ここで蛋白質は所望により、ベース材料に取り込まれ、混合され、改質され、ベース材料もしくはベース材料上の層と一体になる。
【００６８】
水安定化コーティング組成物は所望により、組成物材料の特性を変えるための１種以上の添加剤を含む。そのような添加剤の例は、米国特許出願No:13/024,794もしくは米国特許No.5,559,163に記載されているものを含むＵＶ吸収剤もしくはラジカルスカベンジャーのような１種以上の光安定剤、可塑剤、湿潤剤、防腐剤、界面活性剤、滑剤、顔料、充填剤、及び垂れ下がり抵抗を高める添加剤を含む。
【００６９】
本発明の方法は所望により、蛋白質が活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素分解できるように、吸い安定化活性一時的コーティング材料により基材をコートすることを含む。基材は本発明のコーティングによりコートすることができるものであればどのような表面であってもよい。基材は所望により、厚さ１０ｍｍのポリ塩化ビニルシートの可撓性に相当する可撓性を有するものである。基材は第１の表面及び第２の表面を有し、第１の表面及び第２の表面は反対側にある。コーティングは所望により、基材の第１の面、第２の面、その両方、又は基材の全体を覆う。水安定化活性コーティングによる基材のコーティングは、コーティング上に存在する場合に有機汚染の除去もしくは開放を促進する自己洗浄表面を与える。
【００７０】
基材は本発明の組成物によりコートされる能力によってのみ限定される。例えば、基材は金属、木材、天然もしくは合成ポリマー、例えばガラス繊維もしくは他のプラスチック、樹脂、ペイント、ラッカー、石、皮革、他の材料、又はこれらの組み合わせである。基材は所望により、ウッドフロアーもしくはコートされたウッドフロアーである。基材は所望により、ポリウレタン保護剤によりコートされた木材のようなサブコーティングを含み、サブコーティングはペイント、ワニス、もしくは他の保護剤である。水安定化一時的活性コーティング材料は所望により、サブコーティング材料を覆うことにより基材と接触する。
【００７１】
本発明の態様に係る水安定化コーティングは、基材に対する優れた接着、環境損傷に対する保護、腐食に対する保護を与え、さらに蛋白質の活性を与える。従って、ある態様において、水安定化活性一時的材料のコーティングは、受容体、抗体もしくはレクチンのリガンド又は酵素の基質である検体の検出のような多くの用途において有用な、酵素活性を与える。特定の態様において、コーティングは汚染形成材料の１以上の成分の酵素による分解による汚染に対する耐性を与える。
【００７２】
水安定化組成物が生物材料、食品材料、もしくは環境材料と接触して有機汚染を形成する場合、酵素もしくは酵素の組み合わせがこの汚染もしくはその成分と接触する。この接触は蛋白質の酵素活性を汚染成分と相互作用させて酵素により汚染成分を変え、基材もしくはコーティングからのその除去を促進する。
【００７３】
本発明の態様において、蛋白質は組成物中に0.1〜50wt％、１〜30wt％、１〜20wt％、１〜10wt％、２〜８wt％、３〜６wt％の量で含まれる。
【００７４】
酵素含有コーティングは通常ユニット／cm2で表される表面活性を有する。THERMOASE C160（Bacillus stearothermophilus由来のサーモリシン）のようなサーモリシンを含むコーティングは所望により、水に曝露される前に、0.0075ユニット／cm2より高い表面活性を有する。ある態様において、サーモリシン表面活性は0.0075ユニット／cm2〜0.05ユニット／cm2である。所望により、サーモリシン表面活性は0.0075ユニット／cm2〜0.1ユニット／cm2である。所望により、サーモリシン表面活性は0.01ユニット／cm2〜0.05ユニット／cm2である。Bacillis subtilis由来のα−アミラーゼを含むコーティングにおいて、水に曝露する前の典型的な表面活性は0.01ユニット／cm2より高い。ある態様において、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜1.5ユニット／cm2である。所望により、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜2.5ユニット／cm2である。所望により、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜1.0ユニット／cm2である。ある態様において、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜4.0ユニット／cm2である。酵素濃度を高めることにより、野性タイプ類似体のような比活性のより高い酵素を用いることにより、又はベース材料との結合の間の酵素活性を安定化することにより、さらに高い表面活性を達成することができる。
【００７５】
本発明の汚染の除去を促進する方法は、蛋白質が活性であるあらゆる温度において機能する。所望により、本発明の方法は４℃において行われる。所望により、本発明の方法は25℃において行われる。所望により、本発明の方法は周囲温度において行われる。所望により、本発明の方法は４℃〜125℃において行われる。
【００７６】
基材もしくは基材上のコーティングの材料と組み合わせた蛋白質の存在は、除去を促進するために汚染を破壊する。
【００７７】
本発明の方法は、酵素が活性でありかつ有機汚染の１以上の成分を開裂することができるように、酵素を含むコーティングを提供することを含む。特定の態様において、有機汚染は昆虫、指紋、もしくは環境由来のような有機物をベースとする。
【００７８】
本明細書において有機汚染とは、生命体、食品、もしくは環境要因がコーティングと接触した後に残っている汚染、マーク、もしくは残留物を意味する。有機汚染はコーティングが昆虫の体と接触した後に残っているマークもしくは残留物に限られない。他の有機汚染源の例は、昆虫の羽根、足、もしくは他の付属物、鳥の糞、食品もしくは食品の成分、指紋もしくはコーティングが生命体と接触した後に残る残留物、又は水もしｋは土中に存在する細菌もしくは分子のような他の有機汚染源である。
【００７９】
水安定化一時的活性コーティング材料の製造方法は、蛋白質の水溶液と市販入手可能なベース材料を、例えばプロペラ混合によりもしくは主導混合により混合して均一にもしくは不均一に化学改質された蛋白質を分散させ、水安定化一時的コーティング材料を形成することを含む。
【００８０】
以下の非限定例により本発明の様々な態様を説明する。この例は説明のためであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲及び精神から離れることなく改変可能である。
【実施例】
【００８１】
例１
水安定化活性一時的コーティング材料
【００８２】
材料：凍結乾燥したコオロギをペットショップから購入する。コオロギの体は58.3％の蛋白質を含んでいると報告されている（D. Wangら、Entomologic Sinica, 2004; 11:275-283）。Bacillus subtilis(EC3.2.1.1)からのα−アミラーゼKLEISTASE SD80、Aspergillus nigerからのリパーゼ（リパーゼA12(EC3.1.1.3)、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＡ、Protin AY-10、B. sterothermophilus TLP（THERMOASE C160)、及びTHERMOASE GL30（B. sterothermophilusTLPの低活性製剤）をAMANO Enzyme Inc.（日本、名古屋）から得る。ウシの血清からのウシ血清アルブミン（BSA）、ジャガイモからのでんぷん、小麦からのでんぷん、マルトース、酒石酸カリウムナトリウム、3,5-ジニトロサリチル酸、Ｎａ2(ＰＯ4)、ＮａＣｌ、Ｋ2(ＰＯ4)、カゼイン、トリクロロ酢酸、フォリン−チオカルトフェノール試薬、Ｎａ2(ＣＯ3)、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、チロシン、p-ニトリフェニルパルミテート、エタノール、ヨウ素、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトヘキソース、デキストリン（10kDa及び40kDa）をSigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USAより得る。アルミニウムパネル及び８パス湿潤フィルムアプリケーターをPaul N. Gardner Company, Inc., (Pompano Beach, FL)より購入する。市販のベース製剤：1)TURTLE WAXカルナバカーワックスＴ−６（石油蒸留物中にシリコーン樹脂を含むカルナバワックス）；2)米国特許第5,073,407号に記載されているようなDURA SHINE；3)PLASTX、合成ポリマーオートポリッシュ；4)TURTLE WAX ICE、炭化水素とシリコン樹脂の合成ブレンドである合成ポリッシュ；5)米国特許第7,503,963号に記載されているようなEAGLE ONE NANOWAX；6)米国特許第7,067,573号に記載されているようなNUFINISH NF-76；及び7)ブラジルカルナバとバイエルンモンタンワックスを光反射性ポリマーと組み合わせたブレンドであるTURTLE WAX PLATINULシリーズワックスを自動車部品サプライヤーから購入する。凍結乾燥したコオロギはFluker Laboratories (Port Allen, LA)から得る。分子量の異なるスクシンイミジルエステルを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体はFishersci (Pottburg, PA)より得る。
【００８３】
例２
酵素の調製
【００８４】
リパーゼ、α−アミラーゼ、及びサーモリシンを原料粉末から超遠心により調製する。α−アミラーゼについては、原料粉末（6.75g）からの150mLの溶液をDI水中で調製する。サーモリシンについては、1.5gのB. sterothermophilusサーモリシン様プロテアーゼ（ＴＬＰ）の150mL溶液をDI水中で調製する。リパーゼについては、1.5gのリパーゼA12の150mL溶液をDI水中で調製する。原料粉末中の不溶な大きな不純物を200nmのＰＴＦＥフィルター上でろ過により除去する。得られた溶液の蛋白質濃度は20mg/mLであり（ブラッドフォード法により測定）、氷上で保持する。
【００８５】
超遠心は55psiの圧力において150mLのAmiconセル（氷で冷却）を用い、Millipore (Billerica, MA)の30kDaカットオフの超遠心膜を用いる。超遠心を３回繰返し、各実験ごとに150mLのDI水に戻す。最終の残っている精製した蛋白質溶液をBradford法により定量し、化学改質及びコーティング材料の製造に用いる濃度に希釈する。50、100、200もしくは300mg/mLの精製した酵素の溶液を用いてコーティングを調製する。
【００８６】
例３
酵素のＰＥＧ化
精製した酵素（α−アミラーゼ、サーモリシン、又はリパーゼ）をスクシンイミジルエステルにより誘導化されたＰＥＧ（単官能性直鎖PEG10000、PEG12000、PEG20000、又は組み合わせ）と１：５の酵素：ＰＥＧのモル比で0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ7.5中において混合し、穏やかに撹拌しながら室温において200rpmで60分間振盪する。未反応ＰＥＧを含む沈殿を適当な分子量カットオフのフィルターでろ過して除く。
【００８７】
例４
例１の市販ワックス１−７及び濃厚なＰＥＧ化酵素（未反応ＰＥＧを除去しないでＰＥＧ化前に200mg/ml）を1000rpmで４：１〜12：１のベース：酵素の重量比で激しく撹拌し、冷１のベース組成物を用いて水安定化一時的コーティング材料調製液を調製する。調製液Ａ〜ＫＫＫを表１に示す。
【表１】
【００８８】
表１の調剤液を布で広げ、所望により磨くことにより様々な基材に適用する。フリーな（固定されていない）酵素を有するベースおよび未反応ＰＥＧ（酵素を含まない）を有するベースを対照として同じ条件で用いる。各材料を、ガラス板、石英板、プラスチック、アルミニウムパネルを含む様々な表面に広げる。ベースの製造者により示される場合、コーティングは３分間乾燥され、次いで紙タオルを用いて手で磨かれる。
【００８９】
各コーティングは均一な酵素の分布を含む。調剤液Ａ−ＫＫＫでコートしたテストパネルを蛍光顕微鏡で調べ、酵素分布の均一性を測定する。対照として、未改質酵素（例えば化学的に改質されていないα−アミラーゼ）またはＰＥＧ化酵素を含むコーティングでテストパネルをコートする。酵素の固有の蛍光を用いて酵素分布を検出する。スライドガラスにコーティングを塗り、カバーガラスで覆い、４８８ｎｍの波長の光をあてる。5.313秒の暴露時間で５７０ｎｍにおいて蛍光を検出する。図３は２００倍での調剤液Ａの分布を示し、両方の調剤液における酵素の均一な分布を示している。調剤液Ｂ−ＫＫＫを用いて同様の結果が観察される。
【００９０】
例５：コーティングの耐候性
コートしたアルミニウムパネルを1.2cm×1.9cmのテストサイズに切り、室温においてＤＩ水に０分、３０分、又は９０分撹拌しながら浸すことにより耐候試験を行う。テストパネルを取り出し、ＤＩ水で２０秒洗浄し、次いで残っている酵素活性を調べる。
【００９１】
α−アミラーゼ含有コーティングをコートしたテストパネルを、6.7mM塩化ナトリウムを含む20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.9）中のαアミラーゼ基質１％w/vジャガイモでんぷんと反応させてアミド分解活性の検出により調べる。基質溶液（２mL）をコートしたテストパネル（1.2cm×1.9cm）の１つの長方形の一片に加え、２５℃で３分間インキュベーションする。同じ量の形成した還元糖をUV-VIS分光計（Cary 300-Varian Inc., Walnut Creek, CA, USA）を用いて540nmで検出する。α−アミラーゼ活性の１ユニットは、室温において３分間にでんぷんから放出される1.0mgの還元糖（マルトースに対して予め検量した標準曲線から計算する）と規定される。
【００９２】
サーモリシンにより調製したコーティングを、Folin and Ciocalteau, J.Biol.Chem., 1927; 73: 627-50の方法に従って蛋白質分解表面活性について調べる。すなわち、リン酸ナトリウム（0.05M; pH7.5）緩衝液溶液中の２％(w/v)カゼイン１mLを、200μlの酢酸ナトリウム、５mMの酢酸カルシウム（10mM; pH7.5)とともに基質として用いる。基質溶液を水槽に３分間浸し、37℃にする。B. sterothermophilusＴＬＰベースコーティングをコートした１片のサンプル（1.2×1.9cm）を加え、ついで200rpmで１０分間振盪して反応を開始し、１mLの110mMトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液を加えることにより反応を停止させる。この混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで遠心する。ＴＣＡ可溶性画分400μL中のチロシンを、25％(v/v)Folin-Ciocalteau試薬及び１mLの0.5M炭酸ナトリウムを用いて660nmで測定する。１ユニットの活性は、３７℃において1分あたり1.0μモルのチロシンに等しい吸光度を生ずるカゼインを加水分解する酵素の量と規定される。この結果をユニット／cm2に変換する。
【００９３】
コーティング調剤液の水安定性を示す残留活性を、未改質酵素（遊離酵素）と比較した調剤液Ａ（表１）を用いて図４Ａに示す。ＰＥＧ化酵素を含む調剤液Ａは、水洗浄しないコーティングに対して３０分及び９０分において約７０％及び30％の活性を示す。未改質酵素（遊離酵素）を含むコーティングは、水洗浄しないコーティングに対して３０分及び９０分において１０％未満及び1.5％の活性を示す。このレベルの水安定性は表１の調剤液Ｂ−ＫＫＫを用いても観察される。これらの結果は、化学改質された酵素を含むコーティングが、未改質酵素を含むコーティングと比較して水洗浄に対して安定であることを示している。
【００９４】
ＰＥＧ化酵素含有コーティングの水耐久性も水接触角の保持により観察される。水接触角はコーティングのような表面の疎水性もしくは親水性のめやすとして用いられる。親水性の高い表面は０度〜３０度の接触角で水滴を保持する。疎水性の高い表面は９０度以上の接触角を示す。水接触角の変化は表面もしくはコーティングの化学的組成の変化を示す。水接触角は、付着液滴法を用いてゴニオメータを用いて平坦なコートしたガラスプレート上で測定する。図４Ｂに示すように、酵素の改質がないと、コーティングから酵素がほぼ完全に浸出し、水接触角が低下することになる。対照的に、４６％酵素−ＰＥＧにより同じ水浸漬条件で酵素を含まないベース材料よりも低いレベルに水接触角が保たれる（図４Ｂ）。
【００９５】
例６：有機汚染の調製、コートされた基材への適用及びコーティング調剤液の自己洗浄活性
この調製にあたって、60gの凍結乾燥したコオロギをブレンダー（Oster、600ワット）により10分間粉砕することによって粉末にする。２ｇのコオロギ粉末を６mLのＤＩ水と激しく混合することにより汚染溶液を調製する。均一な間隔のテンプレートを用いてコーティング表面上に汚染を適用する。このコオロギの汚染を４０℃で５分間乾燥させる。各テストパネルをガラス皿に載せ、ＲＴにおいて300rpmで振盪させながら200mLのＤＩ水で数回洗浄する。汚染除去の時間を記録する。誤差を小さくするため、最初と最後の時間を含めない。８つの汚染スポットの平均洗浄時間を汚染除去時間として平均する。ＰＥＧ化サーモリシン含有コーティングでコートしたテストパネルは、ベース材料のみでコートしたパネルと比較して、穏やかな洗浄による改良された汚染除去を示す。
【００９６】
表１のアミラーゼ含有コーティングを、例４と同様にアルミニウムテストパネルもしくは標準コンパクトディスク上のプラスチック表面上に載せる。マヨネーズのサンプル0.3gをテストパネルの様々な部位に載せ、次いで周囲条件で２分間乾燥させ、直立させて放置する。このマヨネーズはその高い粘度に寄与する脂肪及びでんぷんのような巨大分子を含み、テストパネルを垂直に保持した場合にマヨネーズが重力によって滑り落ちることを防ぐ、コーティング表面に高い摩擦力を与える。改質α−アミラーゼを含むコーティングは乳化剤の加水分解を触媒し、汚染−コーティング界面での相分離の結果として粘度を大きく低下させ、垂直に傾けるとテストパネルから汚染が滑り落ちることとなる。
【００９７】
同様に、アルミニウムテストパネルに表１の調剤液Ａ、ＰＥＧを含み酵素を含まない調剤液Ａ、又は対照として酵素もしくはＰＥＧを含まないコーティングをコートする。図５に示すように、酵素を含まないコーティング（Ｉ）又はＰＥＧ−コーティング（II）でコートしたテストパネルは垂直に傾けてもマヨネーズの移動は示さない。しかし、ＰＥＧ化酵素を含むコーティングは明らかな自己洗浄を示す（図５）。
【００９８】
ＰＥＧ化リパーゼを含む表１のコーティングを用いてガラスもしくは透明表面からの指紋の除去を調べる。ガラス基板上にて１：６（Ｉ）および１：１２（II）（例４）の酵素希釈においてＰＥＧ化リパーゼ含有調剤液による指紋の自己洗浄をテストする。テストパネルをＰＥＧ化リパーゼ含有ベース材料もしくは対照材料（酵素含まず）でコートし、室温において24時間インキュベートする。このテストパネルにヒトの指紋を付ける又は顔の皮膚と接触させる。次いでコートしたテストパネルを120℃のオーブン中で１〜６時間インキュベートする。残っている指紋をより目視できるように、コーティングを流れるＤＩ水（50mL/sec）で１分間洗浄し、風乾する。加熱する前に、各コーティングを同じレベルの指紋による汚染を行う。加熱後、酵素を含まないコーティングは明らかな残留汚染を示したが、ＰＥＧ化リパーゼを含むコーティングは残留汚染が大きく低下し、酵素濃度が高いほど汚染低下レベルは低下している。
【００９９】
本明細書の記載に加えて、本発明の様々な改良は当業者に明らかである。そのような改良は請求の範囲内にある。
【０１００】
特に示さない限り、すべての試薬は当該分野において公知の出処より入手可能であり、又は当業者によって合成可能である。蛋白質の調製及び精製方法は当該分野の範囲内にある。
【０１０１】
参考文献リスト
Harris, J. M. and Kozlowski, A. (2001), Improvement in protein PEGylation: peglated interferons for treatment of hepatitis C.J.Control Release 72, 217-224
【０１０２】
Veronese , F. and Harris, J. M. Eds. (2002), Peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Review 54(4), 453-609
【０１０３】
Veronese, F. M.; Pasut, G. (2005), PEGylation, successful approach to drug delivery, Drug Discovery Today 10(21): 1451-1458
【０１０４】
Veronese, F. M.; Harris, J. M. (2002), Introduction and overview of peptide and protein pegylation, Advanced Drug Delivery Reviews 54(4): 453-456
【０１０５】
Domodaran V. B.; Fee C. J. (2010), Protein PEGylation: An overview of chemistry and process considerations, European Pharmaceutical Review 15(1): 18-26
【０１０６】
Harris, J. M.; Chess, R. B. (2003), Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nature Reviews Drug Discovery 2, 214-221
【０１０７】
Rodriguez-Martinez J. A.ら、(2008) Stabilization of a-Chymotrypsin Upon PEGylation. Correlates With Reduced Structural Dynamics. Biotechnology and Bioengineering, 101, 1142-1149
【０１０８】
Li, J.; Kao, W. J. (2003), Synthesis of Polyethylene Glycol (PEG) Derivatives and PEGylated-Peptide Biopolymer Conjugates, Biomacromolecules 4, 1055-1067
【０１０９】
本明細書に示す特許及び文献は本発明が関係する分野におけるレベルを示すものである。これらの特許及び文献は参考として含まれる。
【０１１０】
前記記載は本発明の特定の態様を説明するものであり、これらに限定されるものではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分を含むコーティング組成物、及び有機汚染の除去を促進するためにこの組成物を用いる方法に関する。特定の態様において、本発明は、表面への虫汚染付着を防ぐための組成物及び方法、並びにベース材料に化学改質蛋白質を混入させて虫の体成分を分解させることによる虫汚染の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの戸外の表面は、鳥のフン、松やに、及び虫の体のような天然由来の汚染もしくは損傷に曝されている。結果として、残留している汚染は表面に不快な跡を付け、物品の外観を損なうことになる。
【０００３】
従来の自己洗浄コーティング及び表面は、無機材料を除去する水ローリングもしくはシーティングをベースとしている。これらは無機よごれの除去にはある程度のレベルの効果を示すが、生物源からの汚染（これは様々なタイプの有機ポリマー、脂肪、オイル、及び蛋白質からなり、その各々はコーティングの表面下に深く拡散する）の洗浄にはあまり効果がない。従来の方法は、表面への汚染の付着を低減させ、適当なナノ複合材料を含むポリマーコーティングにより疎水性、疎油性及び超両疎性が表面に与えられる「ロータス効果」を利用してその除去を促進することを目的としている。典型的なコーティングはフッ素及びナノ複合材料を含み、優れたロールオフ特性及びとても高い水と油の接触角を有している。サンドブラストガラスのような粗い表面に用いた場合、ナノコーティングは耐汚染性を与えるフィラーとして機能する。この「消極的な」方法の欠点は、光沢の高い表面に用いるには適さないことである。それは、ロータス効果が表面粗さに基づくものであるからである。
【０００４】
光触媒コーティングは有機汚染の自己洗浄を促進するものとして期待されている。太陽光を照射すると、ＴｉＯ2のような光触媒は有機汚れを化学的に破壊し、次いで超親水性表面上に形成された水シートにより洗い落とされる。例として、米国特許出願公開2009／104086において、指紋汚れの分解を促進するために光触媒ＴｉＯ2が用いられた。この方法の主要な欠点は、ＴｉＯ2によるポリマーコーティングの酸化障害のため無機表面に用いることに限定されることである。また、この方法は、ＴｉＯ2が汚れを分解するのみならず、ペイント中の樹脂も酸化するため、自動車コーティングにはあまり適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、表面上もしくはコーティング中の有機汚染の除去を促進し、維持洗浄の必要性を最小にする新規な材料もしくはコーティングに対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
有機汚染の除去を促進する方法が提供され、この方法は化学改質酵素をベースと結合させることにより水安定化活性一時的コーティング材料を提供し、酵素が活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、基材を活性コーティング材料でコーティングすることを含む。
【０００７】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望により前記コーティングを水中に３０分以上浸した後に有機汚染の成分を分解することができ、所望によりこのコーティングは水中に３０分浸した後、活性を５０％以上保持する。
【０００８】
化学改質された酵素は、所望により細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、もしくはリパーゼのような加水分解酵素である。この酵素は、ポリマー部分により、所望によりポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子により化学改質されている。ポリオキシエチレンは、所望により1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する。ある態様においては、ポリオキシエチレンは前記酵素との反応前に、スクシンイミジルエステルをさらに含む。ポリマー部分は所望により、末端アミノ基のような酵素上又はリシン上のアミノ基に直接もしくは間接的に共有結合している。ある態様において、ポリマー部分は酵素によりシステインに直接もしくは間接的に共有結合している。ポリマー部分は所望により、線状であっても分枝であってもよい。
【０００９】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望によりベースの少なくとも１つの成分に共有結合し、又はベースに非共有結合するかもしくはベースに混合されている。そのようなコーティングは、基材上に存在する場合、このコーティングが酵素としてサーモリシンを含む場合、0.0075ユニット／cm2以上の表面活性を有する。
【００１０】
水安定化活性一時的コーティング材料は、所望により酵素とは独立のベースに結合した第一のポリオキシエチレンを含む。コーティング中の酵素に対するベースの重量比は、所望により２：１〜２０：１である。組成物は所望により、第二のポリオキシエチレンにより化学改質された酵素を含む。第一もしくは第二のポリオキシエチレンは、所望により1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する。第一及び第二のポリオキシエチレンは、所望によりオキシエチレンの同じポリマーを有する。第一のポリオキシエチレンは、所望によりスクシンイニミジルエステルにより誘導化されている。第二のポリオキシエチレンは、所望により酵素との反応前にスクシンイニミジルエステルにより誘導化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一態様による水安定化活性一時的コーティング組成物の形成の略図である。
【００１２】
【図２】本発明の一態様による酵素の化学改質及びそのベースへの混入の略図である。
【００１３】
【図３】本発明の一態様による化学改質酵素の均質混入の略図である。
【００１４】
【図４Ａ】水洗浄後の残留活性により示す化学改質酵素を服務コーティングの水安定性を示すグラフである。
【図４Ｂ】水洗浄前後の水接触角を示すグラフである。
【００１５】
【図５】基材に適用後の水安定化コーティング上の食品汚れの促進された除去を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下の記載は単なる説明であり、発明の範囲、用途等を限定するものではない。本発明の限定しない規定及び用語により説明する。これらの規定及び用語は発明の範囲もしくは実施を限定するものではなく、単に説明のため用いる。
【００１７】
コーティングとして有用な組成物が提供され、コーティング材料と結合した酵素は、コーティングを水に曝露する間もしくは曝露した後に酵素活性寿命を向上させるように改質されている。このコーティングは永久的コーティングとして用いられる他のコーティング材料よりもいくつかの利点を有する一時的コーティングであり、コートされた物品の有用な寿命を延長するものではない。一時的コーティングは適用が比較的簡単であり、家庭において素人により行うことができ、又は専門家によって行うこともできる。本発明の改質酵素を含む一時的コーティングの使用は、生物活性表面を規則的に延長し、並びに輝き、保護及び水流出のような他の品質を向上させる。
【００１８】
本発明のコーティングは風化による酵素活性の損失に対して耐性を示す。ここで風化とは、周囲環境もしくは実験室のいずれかにおける水、熱、ＵＶ光、もしくは他の原因への曝露を含む。本発明によるコーティングは、水中への浸漬のような水への曝露による風化に予想外の耐性を有する。このように、風化は水への浸漬を含む。
【００１９】
ここではコーティングに関して説明するが、有機汚染除去を促進するためのコーティングが必要ない基材もしくは物品であってもよい。ここで「コーティング」は、１以上の基材の表面上に層をなすような材料を意味し、又は基材材料自身を含んでいてもよい。ある態様において、「コーティング」は、基材を除き、基材を覆うために用いられる材料である。本発明の方法及び組成物は、コーティングと結合した酵素と称される。当業者は、本明細書の記載が基材自身にも同様に適用可能であることを認識している。
【００２０】
本発明は、有機汚染の成分を選択的に分解し、汚染の除去を促進する、酵素の触媒活性に基づいている。有機汚染の例は、有機ポリマー、脂肪、オイル、又は蛋白質を含む。本発明の組成物及び方法は、水安定化活性な一時的コーティングによる有機汚染の活性な破壊を提供する。従来の一時的コーティング材料は有機汚染を分解する能力を有しているが、本発明者は、永久コーティングとは異なり、この一時的コーティングは水に曝露されると急速に不活性化され、コーティングの予想される寿命が役に立たないほどまで低下することを見出した。酵素安定性を促進する無限のメカニズムのうち、本発明者は、ベースと混入する前に酵素上に１以上のポリマー部分を添加すると、得られるコーティング材料の水安定性を劇的に向上させることを見出した。
【００２１】
水安定化活性一時的コーティング材料組成物は、化学改質された酵素と結合したベースを含み、所望により、ベースと結合した第一のポリオキシエチレンを含み、この第一のポリオキシエチレンは酵素とは独立のものである（すなわち、酵素に共有結合していない）。この組成物は、食品汚れ、虫汚れ、指紋、及び他の環境上若しくは人工的汚れのような有機汚染の自己洗浄用のコーティングとして有用である。
【００２２】
この組成物は水安定化コーティングである。この「水安定化」とは、結合した有機汚染の自己洗浄もしくは解放に対するコーティングの活性を意味し、非化学改質蛋白質を有する同様のコーティングと比較して化学改質蛋白質の存在により活性が高まる。水安定化コーティングは所望により、水中に３０分浸した後に５０〜９０％、若しくはそれ以上の活性を保持する。水安定化コーティングは所望により、水中の９０分浸した後に１５％以上の活性を保持する。
【００２３】
この組成物は一時的コーティングである。ここで「一時的」とは、３０分〜３ヶ月の間に実施可能なものと規定する。一時的の限界は、所望によりコーティングが曝される環境条件により規定される。所望により、一時的は本発明の組成物の適用からその後の水との接触もしくは水への浸漬までのいずれかの時間である。ある態様において、一時的は３ヶ月以下であり、所望により２ヶ月未満であり、所望により６、５、４、３、２、もしくは１週間未満である。所望により、一時的は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１日未満である。ある態様において、「一時的」は本発明の組成物を基材に適用してから水と３０、６０、もしくは９０分、もしくはそれ以上浸漬もしくは接触させるまでの間である。
【００２４】
この組成物はベース材料を含む。ベースとは、当該分野において公知の市販入手可能なもしくはその他から入手可能な自動車用、家具用、床用、靴用、金属用、もしくは他の表面コンディショナー、研磨材又は保護材である。ベースの例は、天然由来ワックス、例えばパラフィンワックス、微結晶石油ワックス、カルナバワックス、カンデリラ植物ワックス、モンタンコール由来ワックス；合成ポリマーワックス、例えば酸化ポリエチレン；シリコーンベースワックス、例えば米国特許第7,753,998に記載のもの、アミノ官能性シリコーン；米国特許第5,073,407号及び5,968,238号に記載されているような水中ノニオンもしくはアニオン界面活性剤；及び表面コンディショニング、研磨もしくは保護に一般に用いられている他の材料、並びにこれらの混合物を含む。
【００２５】
ベースの好適な例は、自動車用の研磨剤を含む。自動車用研磨剤の例は、1)TURTLE WAXカルナバカーワックスＴ−６（石油蒸留物中にシリコーン樹脂を含むカルナバワックス）、2)米国特許第5,073,407号に記載のDURA SHINE、3)PLASTX合成ポリマー自動車研磨剤、4)炭化水素とシリコーン樹脂のブレンドであるTURTLE WAX ICE合成研磨剤、5)米国特許第7,503,963号に記載のEAGLE ONE NANOWAX、6)米国特許第7,067,573号に記載のNU FINISH NF-76、及び7)ブラジルカルナバとモンタンワックス及び光反射性ポリマーのブレンドであるTURTLE WAX PLATINUMを含む。
【００２６】
この組成物は少なくとも１種の活性蛋白質を含む。活性蛋白質はプロテアーゼもしくは加水分解酵素のような酵素の活性を有する巨大分子である。「蛋白質」とは、ペプチド結合により共有結合し、酵素の活性を有する３以上の天然、合成、もしくは誘導体アミノ酸である。従って、「蛋白質」は３〜１００個、もしくはそれ以上のアミノ酸を含み、約150〜350,000ダルトンの分子量を有する。蛋白質は、生命体のゲノムによりエンコードされた生物により産生された蛋白性分子の長さに適合する、３以上のアミノ酸の長さの隣接する分子配列を有する分子である。蛋白質の例は、酵素、抗体、受容体、輸送蛋白質、構造蛋白質、又はこれらの組み合わせを含む。蛋白質は、リガンド、医薬、抗原、もしくはハプテンのような他の物質と特異的に相互作用をすることができる。蛋白質は１種以上のホモもしくはヘテロポリマー部分の添加により化学的に改質される。「類似体」とは、ビオチニル化を除きホモもしくはヘテロポリマー基による化学改質を除く。
【００２７】
蛋白質は所望により、１種以上のリン、硫黄の分子の付加もしくは除去による、又はビオチン、アビジン、フルオロフォア、ルミフォアのような側基、又は精製、検出、もしくは溶解度等の特性を変える他の側基の付加によるような、そのままのポリペプチド配列から改質される。
【００２８】
この記載は酵素である蛋白質に関するものであるが、他の蛋白質活性成分も同様に可能である。酵素は所望により生物活性酵素である。生物活性酵素は生物組織、環境、もしくは食品中の分子の化学結合を開裂する。酵素は所望により、ペプチド結合を開裂することができるプロテアーゼであり、例えばバクテリアプロテアーゼもしくはその類似体を含む。酵素として機能する蛋白質は所望により、遺伝子によりエンコードされる野生タイプのアミノ酸配列と同じである。蛋白質は、天然の有機体中の蛋白質の配列に適合するアミノ酸配列を有する場合、「野生タイプ」とよばれる。蛋白質は所望により、野生タイプ蛋白質の配列と類似の配列及び／又は構造及び／又は酵素としての構造及び機能を含む、野生タイプ酵素と機能的に等価である。機能的に等価の酵素は、野生タイプ酵素のＥＣ分類の化学反応を触媒するような、野生タイプ酵素と類似のもしくは同じ酵素特性を有し、及び／又は配列及び／又は構造による野生タイプ酵素に関連する酵素の化学反応を触媒するような他の酵素特性を有する。酵素は、野生タイプ形態の酵素により触媒される反応（例えば、ＥＣ分類に用いられる反応）を触媒する同等の機能を含む。限定しない例として、「アミラーゼ」は、高い反応速度、低い反応速度、変化した基質特性、高いもしくは低い基質結合親和力等によるような活性が変化しても、アミラーゼ活性を保持するアミラーゼと機能的に等価物を含む。機能的に等価物の例は、野生タイプ酵素配列の突然変異体、例えば配列切断、アミノ酸置換、アミノ酸変異、及び／又は融合蛋白質等を含む。
【００２９】
酵素はコーティング中もしくは上に固定され、有機汚染成分のより小さな分子への分解を触媒する。理論付けようとするものではないが、より小さな分子はコーティングの表面への接着が弱く、重力又は水、空気、もしくは他の流体による穏やかな洗浄によりコーティングからの有機汚染物質の除去が促進される。このように、本発明は表面からの有機汚染の除去用の組成物及び方法として有用である。
【００３０】
酵素は通常、酵素委託（ＥＣ）番号としての標準命名法に従い記載される。使用可能な酵素の例は、ＥＣ１，オキシドレダクターゼ；ＥＣ２，トランスフェラーゼ；ＥＣ３、ヒドロラーゼ；ＥＣ４，リアーゼ；ＥＣ５、イソメラーゼ；又はＥＣ６、リガーゼを含む。これらのカテゴリーにおける酵素は本発明の態様による組成物中に含まれ得る。
【００３１】
具体的な態様において、含まれる酵素はヒドロラーゼ、例えばグルコシダーゼ、プロテアーゼ、又はリパーゼである。グルコシダーゼの非限定的例は、アミラーゼ、キチナーゼ、及びリゾチームを含む。プロテアーゼの非限定的例は、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、スブチリシン、パパイン、エラスターゼ、及びプラスミノーゲンを含む。リパーゼの非限定的例は、パンクレアチンリパーゼ及びリポ蛋白リパーゼを含む。酵素として機能する蛋白質の例は、米国特許出願公開No.2010/0210745に記載されている。
【００３２】
アミラーゼは、コーティング組成物のある態様において存在する酵素である。アミラーゼはでんぷんを分解する活性を有する。いくつかのタイプのアミラーゼが使用可能であり、具体的にはオリゴ糖及び多糖中の(1->4)-α−Ｄ−グルコシド結合の末端加水分解に関与するα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を含む。α−アミラーゼはBacillus subtilis由来であり、Genbank Accesion No.ACM91731(SEQ ID NO:1)にみられる配列、又はその類似体を有し、SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列によりエンコードされる。特定の例は、Sigma Aldrich Co., St. Louis, MOより入手可能なBacillus subtilisからのα−アミラーゼである。他のα−アミラーゼは、Geobacillus stearothermophilus (Accession No:AAA22227)、Aspergillus oryzae (Accession No: CAA31220)、Homo sapiens (Accession No: BAA14130)、Bacillus amyloliquefaciens (Accession No: ADE44086)、Bacillus licheniformis (Accession No: CAA01355)、又は他の生命体もしくは類似体由来のものを含む。様々な生命体からのβ−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、又はその類似体も同様に蛋白質−ポリマー組成物に使用可能である。
【００３３】
アミラーゼ酵素の例は、1000Ｕ／ｇ以上のプロテアーゼ活性を有し、ここで１Ｕ（ユニット）は、Zulkowskyのポテトでんぷん（例えば、190℃においてグリセロールにより処理したでんぷん、Ber. Deutsch. Chem. Ges, 1880; 13:1395)からの非蛋白質消化を作用させる酵素の量と規定される。具体的には、このアミラーゼは1,000Ｕ／ｇ〜500,000Ｕ／ｇ、もしくはそれ以上の活性を有する。
【００３４】
プロテアーゼは所望により、サーモリシンがプロトタイププロテアーゼ（EC3.4.24.27)又はその類似体である、細菌サーモリシン様プロテアーゼのＭ４族のメンバーのような細菌メタロプロテアーゼである。プロテアーゼは所望により、Bacillus stearothermophilus (Bacillus thermoproteolyticus Var. Rokko)(例えば、Amano Enzyme U.S.A., Co(Elgin, IL)より入手可能な商品名"THERMOASE C160"として販売されている）、もしくはその類似体由来の細菌中性サーモリシン様プロテアーゼである。プロテアーゼは所望により、KreigらのJ. Biol. Chem., 2000; 275(40):31115-20に示されているあらゆるプロテアーゼである。プロテアーゼの具体例は、Bacillis cereus (Accession No.P05806)、Lactobacillis sp. (Accession No.Q48857)、Bacillis megaterium (Accession No.Q00891)、Bacillis sp. (Accession No.Q59223)、Alicyclobacillis acidocaldarious (Accession No.Q43880)、Bacillis caldolyticus (Accession No.P23384)、Bacillis thermoproteolyticus (Accession No.P00800)、Bacillus stearothermophilus (Accession No.P43133)、Bacillus subtilis (Accession No.P06142)、Bacillus amyloliquefaciens (Accession No.P06832)、Lysteria monocytogenes (Accession No.P34025;P23224)からのサーモリシンさまプロテアーゼを含む。
【００３５】
野生タイププロテアーゼは、天然の生命体にみられるものと同じアミノ酸配列を有するプロテアーゼである。野生タイププロテアーゼの具体例は、GenBank Accession No.P06874及びSEQ ID NO:3に示され、Takagi M.ら、J. Bacteriol., 1985; 163(3):824-831及びSEQ ID NO:4に見られるヌクレオチド配列エンコードSEQ ID NO:3である。
【００３６】
プロテアーゼ活性を調べる方法は公知であり、当該分野において標準的である。具体的には、プロテアーゼ蛋白質もしくはその類似体中のプロテアーゼ活性のスクリーニングは、プロテアーゼもしくはその類似体をプロテアーゼの天然もしくは合成基質と接触させ、そして基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、プロテアーゼにより開裂され、当該分野によって公知の方法により容易に測定されるフォリン陽性アミノ酸及びペプチド（チロシンとして計算される）を放出するカゼインを含む。Bachem AG, Bubendorf, Switzerlandより得られる合成基質フリルアクリロイル化トリペプチド3-(2-フリルアクリロイル)-L-グリシル-L-ロイシン-L-アラニンも同様に使用可能である。
【００３７】
特定のプロテアーゼは、10,000ユニット／ｇプロテアーゼもしくはそれ以上を有する。ある態様において、プロテアーゼは、１ユニットが37℃、ｐＨ7.2で反応を行った場合に、ミルクカゼインから非蛋白質消化生成物を遊離し（最終濃度0.5％）、初期の反応段階で１分あたり１μモルのチロシンに匹敵するフォリンカラーを与える酵素の量と規定されるサーモリシンである。プロテアーゼ活性は10,000PU/g〜1,500,000U/gである。より低いプロテアーゼ活性も使用可能である。プロテアーゼ活性は所望により、300,000U/gを超える。所望により、プロテアーゼ活性は300,000U/g〜2,000,000U/gもしくはそれ以上である。
【００３８】
蛋白質は所望によりリパーゼである。野生タイプリパーゼは天然生命体にみられるものと同じアミノ酸配列を有するリパーゼである。野生タイプリパーゼの具体例は、GenBank Accession o.ACL68189及びSEQ ID NO:5にみられる。野生タイプリパーゼをエンコードするヌクレオチドの例は、Accession No.FJ536288及びSEQ ID NO:6にみられる。
【００３９】
リパーゼ活性はユニット／グラムで規定される。１ユニットは、基質トリアセチン（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Product No.90240）を用いてｐＨ7.4、40℃において１分あたり１μモルの酢酸を加水分解する酵素の量に相当する。SEQ ID NO:5のリパーゼは200ユニット／ｇの活性を有する。
【００４０】
リパーゼ活性を調べる方法は公知であり、当該分野において標準的である。具体的には、リパーゼ蛋白質もしくはその類似体のリパーゼ活性のスクリーニングは、リパーゼもしくはその類似体をリパーゼの天然もしくは合成基質と接触させ、そして基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、トリアシルリパーゼにより開裂され、当該分野によって公知の方法により容易に測定される酪酸もしくは酢酸を放出するトリブチリン及びトリアセチンを含む。
【００４１】
蛋白質は所望により、１種以上の共同因子イオン又は蛋白質と機能する。共同因子イオンは、例えば亜鉛、コバルト、又はカルシウムである。
【００４２】
使用可能な蛋白質のクローニング、発現、及び精製は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ２版, Vol.1-3, Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubeltら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992；及びShort Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、Wiley-Interscience, New York, 2002に開示されている方法により実施可能である。
【００４３】
蛋白質中に存在する天然由来のアミノ酸の例は、一般的なアミノ酸であるアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、及びチロシンを含む。天然もしくは化学的に変性されたアミノ酸の誘導体も所望により存在してもよく、例えばα−アスパラギン、２−アミノブタン酸もしくは２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノカプリン酸（２−アミノデカン酸）、６−アミノカプロン酸、α−グルタミン、２−アミノヘプタン酸、６−アミノヘキサン酸、α−アミノイソ酪酸（２−アミノアラニン）、３−アミノイソ酪酸、β−アラニン、allo-ヒドロキシリシン、allo-イソロイシン、４−アミノ−７−メチルヘプタン酸、４−アミノ−５−フェニルペンタン酸、２−アミノピメル酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシベンゼンペンタン酸、２−アミノスベリン酸、２−カルボキシアゼチジン、β−アラニン、β−アスパラギン酸、ビフェニルアラニン、3,6-
ジアミノヘキサン酸、ブタン酸、シクロブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、Ｎ５−アミノカルボニルオルニチン、シクロペンチルアラニン、シクロプロピルアラニン、３−スルホアラニン、2,4-ジアミノブタン酸、ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノ酪酸、ジフェニルアラニン、N,N-ジメチルグリシン、ジアミノピメル酸、2,3-ジアミノプロパン酸、Ｓ−エチルチオシステイン、Ｎ−エチルアスパラギン、Ｎ−エチルグリシン、４−アザフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、γ−グルタミン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ヒドロキシ酢酸、ピログルタミン酸、ホモアルギニン、ホモシステイン酸、ホモシステイン、ホモヒスチジン、２−ヒドロキシイソ吉草酸、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、ホモプロリン、ホモセリン、２−ヒドロキシペンタノン酸、５−ヒドロキシリシン、４−ヒドロキシプロリン、２−カルボキシオクタヒドロインドール、３−カルボキシイソキノリン、イソバリン、２−ヒドロキシプロパン酸（乳酸）、メルカプト酢酸、メルカプトブタン酸、サルコシン、４−メチル−３−ヒドロキシプロリン、メルカプトプロパン酸、ノルロイシン、ニペコチン酸、ノルチロシン、ノルバリン、ω−アミノ酸、オルニチン、ペニシラミン（３−メルカプトバリン）、２−フェニルグリシン、２−カルボキシピペリジン、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）、２−アミノ−３−（４−スルホフェニル）プロピオン酸、１−アミノ−１−カルボキシシクロペンタン、３−チエニルアラニン、ε−Ｎ−トリメチルリシン、３−チアゾリルアラニン、４−カルボン酸、α−アミノ-2,4-ジオキシピリミジンプロパン酸、及び２−ナフチルアラニンである。
【００４４】
蛋白質は当該分野において公知の様々な方法によって得られ、その方法の例は、細胞もしくは生命体からの単離、化学合成、核酸配列の発現、及び蛋白質の部分加水分解を含む。化学的な蛋白質合成方法は当該分野において公知であり、固相ペプチド合成及び溶液相ペプチド合成、又はHackeng,TMらのProc Natl Acad Sci USA, 1997;94(15):7845-50の方法を含む。蛋白質は天然もしくは非天然蛋白質であってよい。「天然」とは、細胞、組織もしくは生命体に内生する蛋白質を意味し、対立遺伝子型変形を含む。非天然蛋白質は天然生命体から合成された又は変性細胞、組織もしくは生命体に見られないものを含む。
【００４５】
蛋白質の構造に改質もしくは変形を行ってよく、活性酵素と同じ特性を有する分子が得られる（例えば、保存アミノ酸置換）。例えば、ある種のアミノ酸は活性を損なうことなく配列中の他のアミノ酸と置換することができ、又は未改質蛋白質の活性を低下させるもしくは高めることができる。蛋白質の機能的活性を規定するのは相互作用能力及び蛋白質の特性であるから、ある種のアミノ酸配列置換を蛋白質配列中で行うことができ、同様のもしくは他の望ましい特性を有する蛋白質を得ることができる。天然の蛋白質とアミノ酸配列が１００％同じではない蛋白質は類似体とよばれる。類似体は所望により、１以上のアミノ酸置換、改質、欠失、付加、又は他の変化を含み、但しそのような変化は野生タイプのものと同じタイプの活性（例えば加水分解）を有する蛋白質を形成するものであるとする。そのような変化を行う際に、アミノ酸の親水性もしくは水療インデックスが考慮される。そのような変化において、親水性もしくは水療インデックスが±２、もしくは±１、又は±0.5内にあるアミノ酸を用いて行われる。
【００４６】
アミノ酸置換は所望により、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。考慮される特性の変化を起こす置換基の例は当業者に周知であり、（当初の残基：置換基の例）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ，Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ，Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｃｌｕ，Ｃｙｓ，Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ，Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ，Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ，Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｌｉｅ，Ｌｅｕ）を含む。特に、蛋白質の態様は野性タイプ蛋白質と約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％配列が同一である類似体を含む。
【００４７】
さらに上記特徴は所望により、酵素活性の低いもしくは高い蛋白質を調製する際において考慮される。例えば、蛋白質中の基質結合サイト、外部サイト、共同因子結合サイト、触媒サイト、もしくは他のサイトにおける置換基は基質に対する酵素の活性を変化させる。そのような置換基を考慮するにあたり、公知の天然もしくは天然様酵素の配列を考慮してもよい。例えば、Miki, Yら、Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 1996; 1:191-199によるような、サーモロイシン中のAsp213に対応する突然変異体も使用可能である。所望により、セリン単独もしくはＧ８Ｃ／Ｎ６０Ｃ／Ｓ６５Ｐの置換基と共に、Ｌ１４４のサーモリシンにおける置換は、野性タイプ酵素よりも５〜１０倍触媒効率を高めるために使用可能である。（Yasukawa, K.及びInouye, K, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins & Proteomics, 2007; 1774-1281-1288）。Ｎ１１６Ｄ、Ｑ１１９Ｒ、Ｄ１５０Ｅ及びＱ２２５ＲのBacillus stearothermophilusからの細菌中性プロテアーゼにおける突然変異体並びに他の突然変異体は同様に触媒活性を高める（De Kreig,A,ら、J. Biol. Chem., 2002; 277:15432-15438）。De Kreigはまた、蛋白質の触媒活性を高めるもしくは低下させる複式置換基を教示している（Id. 及び De Kreigら、Eur J. Biochem, 2001; 268(18):4985-4991）。これら又は他のサイトにおける他の置換基は所望により、酵素活性に同じ効果をもたらす。サイト方向性突然変異生成及びDe Kreig, Eur J. Biochem, 2001;268(18):4985-4991の方法によるような蛋白質活性の選別は当該分野のレベル内であり、一般的である。
【００４８】
蛋白質は所望により、野性タイプ蛋白質の類似体である。蛋白質の類似体は野性タイプ蛋白質と同じ条件においた場合に、同じ基質に対して野性タイプ酵素と同じレベルの活性を有するアミノ酸配列を有する。類似体は所望により、野性タイプ蛋白質の500％、250％、200％、150％、110％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、25％、10％、５％、又はこれらの間のあらゆる値を有する。類似体を形成するために野性タイプ蛋白質に対するあらゆる改質を用いてもよい。例えば、アミノ酸置換、付加、除去、架橋、ジスルフィド結合の除去もしくは付加、又は他の改質を用いて類似体を形成してよい。類似体は所望により、２以上の野性タイプ蛋白質、フラグメントの配列を含む融合蛋白質である。
【００４９】
蛋白質活性を調べる方法は公知であり、当該分野において一般的である。例えば、酵素の活性の選別は、酵素を天然もしくは合成基質と接触させ、基質の酵素による開裂を測定することを含む。このための基質の例は、カゼイン（これはプロテアーゼにより開裂されて当該分野において公知の方法により容易に測定されるフォリン陽性アミノ酸及びペプチド（チロシンとして計算される）を放出する）を含む。合成基質である、Bachem AG, Bubendorf, Switzerlandより得られるフリルアクリロイル化トリペプチドである3-(2-フリルアクリロイル)-L-グリシル-L-ロイシン-L-アラニンが使用可能である。α−アミラーゼの基質の例は、長鎖炭水化物、例えばスターチを構成するアミロースもしくはアミロペクチンを含む。α−アミラーゼ活性を選抜する他の方法は、Fischer and Stein, Biochem,Prep., 1961, 8, 27-33の比色分析法を含む。当業者は様々な材料に存在する酵素の活性を調べる方法を容易に想定できるであろう。
【００５０】
蛋白質は例えば組み換え体である。蛋白質をエンコードする核酸配列をクローンする、合成するもしくは得る方法は公知であり、当該分野において一般的である。同様に、細胞形質転換及び蛋白質発現の方法も同様に公知である。SEQ ID NO:1の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例は、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:2である。SEQ ID NO:3の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例は、登録番号M11446及びSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列である。SEQ ID NO:5の蛋白質配列をエンコードするｃＤＮＡの例はヌクレオチド配列SEQ ID NO:6である。
【００５１】
蛋白質は、付随タグ、改質、融合蛋白質におけるような他の蛋白質、又は当該分野において公知の他の改質もしくは組み合わせにより共発現されてもよい。タグの例は、６ＸＨｉｓ、ＦＬＡＧ、ビオチン、ユビキノン、ＳＵＭＯ、又は当該分野において公知の他のタグを含む。タグは、ファクターＸａ、トロンビン、Lifesensors Inc., Malvern, PAより得られるようなＳＵＭＯ蛋白質、又はトリプシンを含む当該分野において公知の酵素により開裂可能な標的配列により蛋白質に結合することによるような開裂可能である。さらに、化学的開裂は同様に使用可能である。
【００５２】
蛋白質発現は、例えば蛋白質核酸配列の転写、蛋白質核酸配列から転写されたＲＮＡの転換等により達成される。核酸配列の類似体は、蛋白質に転換された際に野性タイプ蛋白質もしくは野性タイプ蛋白質の類似体を形成するあらゆる配列である。蛋白質発現は所望により、例えば大腸菌（E. Coli）、ヒーラ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣細胞のような細胞をベースとするシステムにおいて行われる。細胞を含まない発現システムも同様に使用可能である。
【００５３】
蛋白質の多くの類似体が使用可能であり、蛋白質配列の機能を高める、低下させる、又は変えないアミノ酸置換、改質、もしくは他のアミノ酸変化を含む本発明の範囲内である。いくつかの後転換改質も同様に本発明の範囲内であり、例えば非天然アミノ酸の混入、ホスホリル化、グリコシル化、ビオチン、フルオロフォア、ルミフォア、放射活性基、抗原、又は他の分子のような測基の付加を含む。
【００５４】
本発明に係る蛋白質は１以上のポリマー部分の付加により化学改質されている。ポリマー部分は所望により、直鎖、分枝鎖、又はこれらの組み合わせである。このポリマー部分は所望により、ホモマー又はヘテロマーである。ポリマー部分の例は、炭水化物もしくはポリオキシエチレン（ポリエチレングリコールもしくはＰＥＧとして知られている）の１以上の分子を含む。
【００５５】
ポリマー部分の例は、限定するものではないが、ポリオキシエチレン及びポリオキシエチレン誘導体のようなポリアルキルアルコール及びグリコール（例えば酸素を含むヘテロアルキルを含む）；官能化デキストランを含むデキストラン；スチレンポリマー；ポリエチレン及び誘導体；限定するものではないが、ヘパリンのポリマー、ポリガラクツロン酸、ムチン、核酸及びその類似体（改質リボースホスフェート主鎖、グルタミン酸、アスパラギン酸、合成ポリマーのカルボン酸、燐酸、およびスルホン酸誘導体のポリペプチドを含む）を含むポリアニオン；及びポリカチオン（アクリルアミド及び2-アクリルアミド-2-メチルプロパントリメチルアミン、ポリ(N-エチル-4-ビニルピリジン）もしくは同様の４級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマー及びデキストラン共役体、ポリミキシンＢスルフェート、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば強ポリカチオンポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、スペルミン、スペルミジン、及びプロタミンのような蛋白質、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン及びポリオルニチンをベースとするポリカチオンを含む）；及びこれらの混合物及び誘導体を含む。好適な付加ポリマーは、Roberts, M.J.ら、(2002)"Chemistry for peptide and protein PEGylation" Adv.Drug Deliv.Rev.54, 459-476; Kinsler,O.ら、(2002)"Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates" Adv.Drug Deliv. Rev.54; 米国特許出願番号60/360,722;US 5,795,569; US 5,766,581; EP01064951; 米国特許6,340,742;WO 00176640;WO002017;EP0822199A2;WO0249673A2;US 4,002,531;US 5,183,550;5;US 5,985,263; US 5,990,237; US 6,461,802; US 6,495,659; US 6,448,369; US 6,437,025; US 5,900,461; US 6,413,507; US 5,446,090; US 5,672,662; US 6,214,966; US 6,258,351; US 5,932,462; US 5,919,455; US 6,113,906; US 5,985,236; WO9428024A1; US 6,340,742; US 6,420,339及びWO0187925A2に示されている。
【００５６】
ポリオキシエチレンは一般的構造−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−を有し、ここでｎは所望により２〜2000の整数である。所望により、ｎは50〜500、100〜250、あるいは150〜250の整数である。ポリオキシエチレンは所望により、当該分野において公知の１以上の様々な化学物質を用いて蛋白質に結合するサイズで提供される。ポリオキシエチレンは所望により、１級アミン（例えばリシン側鎖もしくは蛋白質Ｎ末端）、チオール（システイン残基）、又はヒスチジンと共有結合している。リシンはしばしば蛋白質の表面に現れ、リシン側鎖におけるポリオキシエチレンの結合は反応生成物の混合物を形成する。Ｎ末端のｐＫａはリシン側鎖のｐＫａとは大きく異なっているため、改質するためにＮ末端を特異的に標的とすることが可能である。同様に、ほとんどの蛋白質は遊離システイン残基をわずかに含むため、システイン（天然もしくは人工）はポリオキシエチレンとのサイト特異的相互作用の標的とされる。
【００５７】
ポリオキシエチレンは所望により、１つの末端がアルコキシ基のような比較的不活性の基で末端キャップされ、他方の末端がリンカー部分によりさらに改質されてもよいヒドロキシル基であるように末端キャップされている。「ＰＥＧ」とは、ポリオキシエチレンを意味し、ＰＥＧに続く数字（下付きではない）は分子量を意味する。従って、「PEG10000」は分子量が約10,000ダルトンであるＰＥＧ部分である。本発明者は、直鎖PEG10000が他のＰＥＧ分子よりも優れていることを見出した。
【００５８】
「ＰＥＧ化」は、１以上のアミノ酸におけるリンカーによる１以上のＰＥＧ部分の結合による蛋白質の改質を意味する。ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）部分は、Ｎ末端α−アミノ基上の又はγ−蛋白質上のリシン残基上の求核置換（アシル化）により、例えばＰＥＧスクシンイミジルエステルと結合する。所望により、ポリオキシエチレン部分は、ＰＥＧ−アルデヒド及び還元剤、例えばシアノホウ化水素ナトリウムを用いて、蛋白質中に存在するアミノ基上での還元性アシル化によって結合する。所望により、ポリオキシエチレン部分は、例えばＰＥＧマレイミド試薬を用いてマイケル付加反応において不対システイン残基の側鎖に結合する。リンカーに結合したポリオキシエチレン部分は所望により、JenLem Technology USA, Allen, TXより入手可能である。米国特許出願NO.2009/0306337に教示されているあらゆるＰＥＧ分子が使用可能である。米国特許出願NO.2009/0306337は蛋白質にＰＥＧ基を結合する方法も教示している。ＰＥＧは所望により、中間エステル、アミド、ウレタン、もしくは他の結合により蛋白質に結合する。
【００５９】
ある態様において、蛋白質は、ポリオキシエチレン用のサイト特異的混入サイトを与えるために追加システインを混入した加水分解酵素の類似体である。ある態様において、リシンもしくはヒスチジン残基が、ポリオキシエチレンの分子の結合を阻害するように標的１級アミンを有さない他のアミノ酸で置換されている。システイン、リシン、もしくはヒスチジンのようなアミノ酸残基の選択は、所望の改質度による。所望により、US Pat No.7,642,340に記載されているように、シミュレーションコンピュータプログラムを用いてポリマーによる改質が蛋白質の機能を阻害するか否かを予想する。
【００６０】
本発明において用いられる蛋白質は所望により、一置換である、すなわち蛋白質分子中の１つのアミノ酸残基に又はＮ−末端アミノ酸残基に結合しているただ１つのポリマー部分を有するものである。あるいは、１つの蛋白質上に２、３、４、もしくはそれ以上のポリマー部分が存在してもよい。蛋白質が１より多くのポリマー部分を含むような態様において、所望により、Ｎ末端アミノ酸残基又はアミノ酸基に同じ部分が結合する。しかしながら、個々のポリマー基は、その大きさ及び長さが互いに異なっていてよく、また蛋白質上の位置も異なっていてよい。
【００６１】
水もしくは他の流体中に浸漬もしくは接触した際にコーティング組成物からの蛋白質の浸出速度を制御するために、所望により蛋白質上の１以上のサイトにおける１以上のポリマー部分の可逆的結合が用いられる。この態様において、ポリマーは共有結合されるが、例えば加熱、水洗浄、もしくは単なる時間の経過のような風化にさらされる。この結合は所望により、蛋白質とポリマーの間のもしくは蛋白質とポリマーの間に存在するリンカー内における結合である。
【００６２】
本発明の方法は、コーティング材料を形成するための、ベースに混入された１以上の活性な化学改質された蛋白質を含む本発明の組成物を用いる。蛋白質は所望により、ベース材料に非共有結合及び／又は共有結合しており、又は封入された蛋白質を製造するためのような製造の間にベース材料と混合することにより又は表面に結合することによりベース材料と結合している。ある態様において、蛋白質は、蛋白質とベース材料の１以上の成分との間の直接共有相互作用により又はリンカーによる結合によってベース材料と共有結合している。
【００６３】
コーティング中において蛋白質をベース材料と結合させるにはいくつかの方法がある。その１つは、共有結合を適用することである。詳細には、蛋白質の遊離アミノ基をベースの活性基に共有結合させる。そのような活性基は、アルコール、チオール、アルデヒド、カルボン酸、無水物、エポキシ、エステル、又はこれらのあらゆる組み合わせを含む。蛋白質を混入させるこの方法は独特な利点をもたらす。第１に、共有結合は蛋白質をベースに永久的につなぎ、蛋白質の浸出の少ない最終組成物の一体部分を構成する。第２に、共有結合は酵素寿命を長くする。時間と共に、蛋白質は通常、ポリペプチド鎖のほぐれのために活性を失う。共有結合のような化学結合はそのようなほぐれを有効に制限し、蛋白質の寿命を向上させる。蛋白質の寿命は通常、固定された蛋白質と物理的に吸着されたもしくは遊離の蛋白質との活性低下の料を比較することにより決定される。
【００６４】
蛋白質は所望により、１：１〜１：２０（酵素：ベース）の重量比でベースと結合する。所望により、蛋白質は１：２〜１：１５、さらには１：４〜１：１２の重量比でベースと結合する。
【００６５】
蛋白質は所望により、基材中に均質に分散し、均質な蛋白質プラットフォームを形成する。
【００６６】
材料に蛋白質を結合させる化学的方法は、蛋白質中及び材料成分中に存在する官能基によって異なる。そのような方法は多く存在する。例えば、蛋白質（例えば酵素）を他の物質に結合する方法は、O'SullivanらのMethods in Enzymology, 1981; 73:147-166及びErlanger, Methods in Exzymology, 1980; 70:85-104に記載されている。
【００６７】
蛋白質は所望により、基材上に層をなすコーティング中に存在し、ここで蛋白質は所望により、ベース材料に取り込まれ、混合され、改質され、ベース材料もしくはベース材料上の層と一体になる。
【００６８】
水安定化コーティング組成物は所望により、組成物材料の特性を変えるための１種以上の添加剤を含む。そのような添加剤の例は、米国特許出願No:13/024,794もしくは米国特許No.5,559,163に記載されているものを含むＵＶ吸収剤もしくはラジカルスカベンジャーのような１種以上の光安定剤、可塑剤、湿潤剤、防腐剤、界面活性剤、滑剤、顔料、充填剤、及び垂れ下がり抵抗を高める添加剤を含む。
【００６９】
本発明の方法は所望により、蛋白質が活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素分解できるように、吸い安定化活性一時的コーティング材料により基材をコートすることを含む。基材は本発明のコーティングによりコートすることができるものであればどのような表面であってもよい。基材は所望により、厚さ１０ｍｍのポリ塩化ビニルシートの可撓性に相当する可撓性を有するものである。基材は第１の表面及び第２の表面を有し、第１の表面及び第２の表面は反対側にある。コーティングは所望により、基材の第１の面、第２の面、その両方、又は基材の全体を覆う。水安定化活性コーティングによる基材のコーティングは、コーティング上に存在する場合に有機汚染の除去もしくは開放を促進する自己洗浄表面を与える。
【００７０】
基材は本発明の組成物によりコートされる能力によってのみ限定される。例えば、基材は金属、木材、天然もしくは合成ポリマー、例えばガラス繊維もしくは他のプラスチック、樹脂、ペイント、ラッカー、石、皮革、他の材料、又はこれらの組み合わせである。基材は所望により、ウッドフロアーもしくはコートされたウッドフロアーである。基材は所望により、ポリウレタン保護剤によりコートされた木材のようなサブコーティングを含み、サブコーティングはペイント、ワニス、もしくは他の保護剤である。水安定化一時的活性コーティング材料は所望により、サブコーティング材料を覆うことにより基材と接触する。
【００７１】
本発明の態様に係る水安定化コーティングは、基材に対する優れた接着、環境損傷に対する保護、腐食に対する保護を与え、さらに蛋白質の活性を与える。従って、ある態様において、水安定化活性一時的材料のコーティングは、受容体、抗体もしくはレクチンのリガンド又は酵素の基質である検体の検出のような多くの用途において有用な、酵素活性を与える。特定の態様において、コーティングは汚染形成材料の１以上の成分の酵素による分解による汚染に対する耐性を与える。
【００７２】
水安定化組成物が生物材料、食品材料、もしくは環境材料と接触して有機汚染を形成する場合、酵素もしくは酵素の組み合わせがこの汚染もしくはその成分と接触する。この接触は蛋白質の酵素活性を汚染成分と相互作用させて酵素により汚染成分を変え、基材もしくはコーティングからのその除去を促進する。
【００７３】
本発明の態様において、蛋白質は組成物中に0.1〜50wt％、１〜30wt％、１〜20wt％、１〜10wt％、２〜８wt％、３〜６wt％の量で含まれる。
【００７４】
酵素含有コーティングは通常ユニット／cm2で表される表面活性を有する。THERMOASE C160（Bacillus stearothermophilus由来のサーモリシン）のようなサーモリシンを含むコーティングは所望により、水に曝露される前に、0.0075ユニット／cm2より高い表面活性を有する。ある態様において、サーモリシン表面活性は0.0075ユニット／cm2〜0.05ユニット／cm2である。所望により、サーモリシン表面活性は0.0075ユニット／cm2〜0.1ユニット／cm2である。所望により、サーモリシン表面活性は0.01ユニット／cm2〜0.05ユニット／cm2である。Bacillis subtilis由来のα−アミラーゼを含むコーティングにおいて、水に曝露する前の典型的な表面活性は0.01ユニット／cm2より高い。ある態様において、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜1.5ユニット／cm2である。所望により、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜2.5ユニット／cm2である。所望により、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜1.0ユニット／cm2である。ある態様において、α−アミラーゼ表面活性は0.01ユニット／cm2〜4.0ユニット／cm2である。酵素濃度を高めることにより、野性タイプ類似体のような比活性のより高い酵素を用いることにより、又はベース材料との結合の間の酵素活性を安定化することにより、さらに高い表面活性を達成することができる。
【００７５】
本発明の汚染の除去を促進する方法は、蛋白質が活性であるあらゆる温度において機能する。所望により、本発明の方法は４℃において行われる。所望により、本発明の方法は25℃において行われる。所望により、本発明の方法は周囲温度において行われる。所望により、本発明の方法は４℃〜125℃において行われる。
【００７６】
基材もしくは基材上のコーティングの材料と組み合わせた蛋白質の存在は、除去を促進するために汚染を破壊する。
【００７７】
本発明の方法は、酵素が活性でありかつ有機汚染の１以上の成分を開裂することができるように、酵素を含むコーティングを提供することを含む。特定の態様において、有機汚染は昆虫、指紋、もしくは環境由来のような有機物をベースとする。
【００７８】
本明細書において有機汚染とは、生命体、食品、もしくは環境要因がコーティングと接触した後に残っている汚染、マーク、もしくは残留物を意味する。有機汚染はコーティングが昆虫の体と接触した後に残っているマークもしくは残留物に限られない。他の有機汚染源の例は、昆虫の羽根、足、もしくは他の付属物、鳥の糞、食品もしくは食品の成分、指紋もしくはコーティングが生命体と接触した後に残る残留物、又は水もしｋは土中に存在する細菌もしくは分子のような他の有機汚染源である。
【００７９】
水安定化一時的活性コーティング材料の製造方法は、蛋白質の水溶液と市販入手可能なベース材料を、例えばプロペラ混合によりもしくは主導混合により混合して均一にもしくは不均一に化学改質された蛋白質を分散させ、水安定化一時的コーティング材料を形成することを含む。
【００８０】
以下の非限定例により本発明の様々な態様を説明する。この例は説明のためであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲及び精神から離れることなく改変可能である。
【実施例】
【００８１】
例１
水安定化活性一時的コーティング材料
【００８２】
材料：凍結乾燥したコオロギをペットショップから購入する。コオロギの体は58.3％の蛋白質を含んでいると報告されている（D. Wangら、Entomologic Sinica, 2004; 11:275-283）。Bacillus subtilis(EC3.2.1.1)からのα−アミラーゼKLEISTASE SD80、Aspergillus nigerからのリパーゼ（リパーゼA12(EC3.1.1.3)、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＡ、Protin AY-10、B. sterothermophilus TLP（THERMOASE C160)、及びTHERMOASE GL30（B. sterothermophilusTLPの低活性製剤）をAMANO Enzyme Inc.（日本、名古屋）から得る。ウシの血清からのウシ血清アルブミン（BSA）、ジャガイモからのでんぷん、小麦からのでんぷん、マルトース、酒石酸カリウムナトリウム、3,5-ジニトロサリチル酸、Ｎａ2(ＰＯ4)、ＮａＣｌ、Ｋ2(ＰＯ4)、カゼイン、トリクロロ酢酸、フォリン−チオカルトフェノール試薬、Ｎａ2(ＣＯ3)、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、チロシン、p-ニトリフェニルパルミテート、エタノール、ヨウ素、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトヘキソース、デキストリン（10kDa及び40kDa）をSigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USAより得る。アルミニウムパネル及び８パス湿潤フィルムアプリケーターをPaul N. Gardner Company, Inc., (Pompano Beach, FL)より購入する。市販のベース製剤：1)TURTLE WAXカルナバカーワックスＴ−６（石油蒸留物中にシリコーン樹脂を含むカルナバワックス）；2)米国特許第5,073,407号に記載されているようなDURA SHINE；3)PLASTX、合成ポリマーオートポリッシュ；4)TURTLE WAX ICE、炭化水素とシリコン樹脂の合成ブレンドである合成ポリッシュ；5)米国特許第7,503,963号に記載されているようなEAGLE ONE NANOWAX；6)米国特許第7,067,573号に記載されているようなNUFINISH NF-76；及び7)ブラジルカルナバとバイエルンモンタンワックスを光反射性ポリマーと組み合わせたブレンドであるTURTLE WAX PLATINULシリーズワックスを自動車部品サプライヤーから購入する。凍結乾燥したコオロギはFluker Laboratories (Port Allen, LA)から得る。分子量の異なるスクシンイミジルエステルを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体はFishersci (Pottburg, PA)より得る。
【００８３】
例２
酵素の調製
【００８４】
リパーゼ、α−アミラーゼ、及びサーモリシンを原料粉末から超遠心により調製する。α−アミラーゼについては、原料粉末（6.75g）からの150mLの溶液をDI水中で調製する。サーモリシンについては、1.5gのB. sterothermophilusサーモリシン様プロテアーゼ（ＴＬＰ）の150mL溶液をDI水中で調製する。リパーゼについては、1.5gのリパーゼA12の150mL溶液をDI水中で調製する。原料粉末中の不溶な大きな不純物を200nmのＰＴＦＥフィルター上でろ過により除去する。得られた溶液の蛋白質濃度は20mg/mLであり（ブラッドフォード法により測定）、氷上で保持する。
【００８５】
超遠心は55psiの圧力において150mLのAmiconセル（氷で冷却）を用い、Millipore (Billerica, MA)の30kDaカットオフの超遠心膜を用いる。超遠心を３回繰返し、各実験ごとに150mLのDI水に戻す。最終の残っている精製した蛋白質溶液をBradford法により定量し、化学改質及びコーティング材料の製造に用いる濃度に希釈する。50、100、200もしくは300mg/mLの精製した酵素の溶液を用いてコーティングを調製する。
【００８６】
例３
酵素のＰＥＧ化
精製した酵素（α−アミラーゼ、サーモリシン、又はリパーゼ）をスクシンイミジルエステルにより誘導化されたＰＥＧ（単官能性直鎖PEG10000、PEG12000、PEG20000、又は組み合わせ）と１：５の酵素：ＰＥＧのモル比で0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ7.5中において混合し、穏やかに撹拌しながら室温において200rpmで60分間振盪する。未反応ＰＥＧを含む沈殿を適当な分子量カットオフのフィルターでろ過して除く。
【００８７】
例４
例１の市販ワックス１−７及び濃厚なＰＥＧ化酵素（未反応ＰＥＧを除去しないでＰＥＧ化前に200mg/ml）を1000rpmで４：１〜12：１のベース：酵素の重量比で激しく撹拌し、冷１のベース組成物を用いて水安定化一時的コーティング材料調製液を調製する。調製液Ａ〜ＫＫＫを表１に示す。
【表１】
【００８８】
表１の調剤液を布で広げ、所望により磨くことにより様々な基材に適用する。フリーな（固定されていない）酵素を有するベースおよび未反応ＰＥＧ（酵素を含まない）を有するベースを対照として同じ条件で用いる。各材料を、ガラス板、石英板、プラスチック、アルミニウムパネルを含む様々な表面に広げる。ベースの製造者により示される場合、コーティングは３分間乾燥され、次いで紙タオルを用いて手で磨かれる。
【００８９】
各コーティングは均一な酵素の分布を含む。調剤液Ａ−ＫＫＫでコートしたテストパネルを蛍光顕微鏡で調べ、酵素分布の均一性を測定する。対照として、未改質酵素（例えば化学的に改質されていないα−アミラーゼ）またはＰＥＧ化酵素を含むコーティングでテストパネルをコートする。酵素の固有の蛍光を用いて酵素分布を検出する。スライドガラスにコーティングを塗り、カバーガラスで覆い、４８８ｎｍの波長の光をあてる。5.313秒の暴露時間で５７０ｎｍにおいて蛍光を検出する。図３は２００倍での調剤液Ａの分布を示し、両方の調剤液における酵素の均一な分布を示している。調剤液Ｂ−ＫＫＫを用いて同様の結果が観察される。
【００９０】
例５：コーティングの耐候性
コートしたアルミニウムパネルを1.2cm×1.9cmのテストサイズに切り、室温においてＤＩ水に０分、３０分、又は９０分撹拌しながら浸すことにより耐候試験を行う。テストパネルを取り出し、ＤＩ水で２０秒洗浄し、次いで残っている酵素活性を調べる。
【００９１】
α−アミラーゼ含有コーティングをコートしたテストパネルを、6.7mM塩化ナトリウムを含む20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.9）中のαアミラーゼ基質１％w/vジャガイモでんぷんと反応させてアミド分解活性の検出により調べる。基質溶液（２mL）をコートしたテストパネル（1.2cm×1.9cm）の１つの長方形の一片に加え、２５℃で３分間インキュベーションする。同じ量の形成した還元糖をUV-VIS分光計（Cary 300-Varian Inc., Walnut Creek, CA, USA）を用いて540nmで検出する。α−アミラーゼ活性の１ユニットは、室温において３分間にでんぷんから放出される1.0mgの還元糖（マルトースに対して予め検量した標準曲線から計算する）と規定される。
【００９２】
サーモリシンにより調製したコーティングを、Folin and Ciocalteau, J.Biol.Chem., 1927; 73: 627-50の方法に従って蛋白質分解表面活性について調べる。すなわち、リン酸ナトリウム（0.05M; pH7.5）緩衝液溶液中の２％(w/v)カゼイン１mLを、200μlの酢酸ナトリウム、５mMの酢酸カルシウム（10mM; pH7.5)とともに基質として用いる。基質溶液を水槽に３分間浸し、37℃にする。B. sterothermophilusＴＬＰベースコーティングをコートした１片のサンプル（1.2×1.9cm）を加え、ついで200rpmで１０分間振盪して反応を開始し、１mLの110mMトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液を加えることにより反応を停止させる。この混合物を３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで遠心する。ＴＣＡ可溶性画分400μL中のチロシンを、25％(v/v)Folin-Ciocalteau試薬及び１mLの0.5M炭酸ナトリウムを用いて660nmで測定する。１ユニットの活性は、３７℃において1分あたり1.0μモルのチロシンに等しい吸光度を生ずるカゼインを加水分解する酵素の量と規定される。この結果をユニット／cm2に変換する。
【００９３】
コーティング調剤液の水安定性を示す残留活性を、未改質酵素（遊離酵素）と比較した調剤液Ａ（表１）を用いて図４Ａに示す。ＰＥＧ化酵素を含む調剤液Ａは、水洗浄しないコーティングに対して３０分及び９０分において約７０％及び30％の活性を示す。未改質酵素（遊離酵素）を含むコーティングは、水洗浄しないコーティングに対して３０分及び９０分において１０％未満及び1.5％の活性を示す。このレベルの水安定性は表１の調剤液Ｂ−ＫＫＫを用いても観察される。これらの結果は、化学改質された酵素を含むコーティングが、未改質酵素を含むコーティングと比較して水洗浄に対して安定であることを示している。
【００９４】
ＰＥＧ化酵素含有コーティングの水耐久性も水接触角の保持により観察される。水接触角はコーティングのような表面の疎水性もしくは親水性のめやすとして用いられる。親水性の高い表面は０度〜３０度の接触角で水滴を保持する。疎水性の高い表面は９０度以上の接触角を示す。水接触角の変化は表面もしくはコーティングの化学的組成の変化を示す。水接触角は、付着液滴法を用いてゴニオメータを用いて平坦なコートしたガラスプレート上で測定する。図４Ｂに示すように、酵素の改質がないと、コーティングから酵素がほぼ完全に浸出し、水接触角が低下することになる。対照的に、４６％酵素−ＰＥＧにより同じ水浸漬条件で酵素を含まないベース材料よりも低いレベルに水接触角が保たれる（図４Ｂ）。
【００９５】
例６：有機汚染の調製、コートされた基材への適用及びコーティング調剤液の自己洗浄活性
この調製にあたって、60gの凍結乾燥したコオロギをブレンダー（Oster、600ワット）により10分間粉砕することによって粉末にする。２ｇのコオロギ粉末を６mLのＤＩ水と激しく混合することにより汚染溶液を調製する。均一な間隔のテンプレートを用いてコーティング表面上に汚染を適用する。このコオロギの汚染を４０℃で５分間乾燥させる。各テストパネルをガラス皿に載せ、ＲＴにおいて300rpmで振盪させながら200mLのＤＩ水で数回洗浄する。汚染除去の時間を記録する。誤差を小さくするため、最初と最後の時間を含めない。８つの汚染スポットの平均洗浄時間を汚染除去時間として平均する。ＰＥＧ化サーモリシン含有コーティングでコートしたテストパネルは、ベース材料のみでコートしたパネルと比較して、穏やかな洗浄による改良された汚染除去を示す。
【００９６】
表１のアミラーゼ含有コーティングを、例４と同様にアルミニウムテストパネルもしくは標準コンパクトディスク上のプラスチック表面上に載せる。マヨネーズのサンプル0.3gをテストパネルの様々な部位に載せ、次いで周囲条件で２分間乾燥させ、直立させて放置する。このマヨネーズはその高い粘度に寄与する脂肪及びでんぷんのような巨大分子を含み、テストパネルを垂直に保持した場合にマヨネーズが重力によって滑り落ちることを防ぐ、コーティング表面に高い摩擦力を与える。改質α−アミラーゼを含むコーティングは乳化剤の加水分解を触媒し、汚染−コーティング界面での相分離の結果として粘度を大きく低下させ、垂直に傾けるとテストパネルから汚染が滑り落ちることとなる。
【００９７】
同様に、アルミニウムテストパネルに表１の調剤液Ａ、ＰＥＧを含み酵素を含まない調剤液Ａ、又は対照として酵素もしくはＰＥＧを含まないコーティングをコートする。図５に示すように、酵素を含まないコーティング（Ｉ）又はＰＥＧ−コーティング（II）でコートしたテストパネルは垂直に傾けてもマヨネーズの移動は示さない。しかし、ＰＥＧ化酵素を含むコーティングは明らかな自己洗浄を示す（図５）。
【００９８】
ＰＥＧ化リパーゼを含む表１のコーティングを用いてガラスもしくは透明表面からの指紋の除去を調べる。ガラス基板上にて１：６（Ｉ）および１：１２（II）（例４）の酵素希釈においてＰＥＧ化リパーゼ含有調剤液による指紋の自己洗浄をテストする。テストパネルをＰＥＧ化リパーゼ含有ベース材料もしくは対照材料（酵素含まず）でコートし、室温において24時間インキュベートする。このテストパネルにヒトの指紋を付ける又は顔の皮膚と接触させる。次いでコートしたテストパネルを120℃のオーブン中で１〜６時間インキュベートする。残っている指紋をより目視できるように、コーティングを流れるＤＩ水（50mL/sec）で１分間洗浄し、風乾する。加熱する前に、各コーティングを同じレベルの指紋による汚染を行う。加熱後、酵素を含まないコーティングは明らかな残留汚染を示したが、ＰＥＧ化リパーゼを含むコーティングは残留汚染が大きく低下し、酵素濃度が高いほど汚染低下レベルは低下している。
【００９９】
本明細書の記載に加えて、本発明の様々な改良は当業者に明らかである。そのような改良は請求の範囲内にある。
【０１００】
特に示さない限り、すべての試薬は当該分野において公知の出処より入手可能であり、又は当業者によって合成可能である。蛋白質の調製及び精製方法は当該分野の範囲内にある。
【０１０１】
参考文献リスト
Harris, J. M. and Kozlowski, A. (2001), Improvement in protein PEGylation: peglated interferons for treatment of hepatitis C.J.Control Release 72, 217-224
【０１０２】
Veronese , F. and Harris, J. M. Eds. (2002), Peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Review 54(4), 453-609
【０１０３】
Veronese, F. M.; Pasut, G. (2005), PEGylation, successful approach to drug delivery, Drug Discovery Today 10(21): 1451-1458
【０１０４】
Veronese, F. M.; Harris, J. M. (2002), Introduction and overview of peptide and protein pegylation, Advanced Drug Delivery Reviews 54(4): 453-456
【０１０５】
Domodaran V. B.; Fee C. J. (2010), Protein PEGylation: An overview of chemistry and process considerations, European Pharmaceutical Review 15(1): 18-26
【０１０６】
Harris, J. M.; Chess, R. B. (2003), Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nature Reviews Drug Discovery 2, 214-221
【０１０７】
Rodriguez-Martinez J. A.ら、(2008) Stabilization of a-Chymotrypsin Upon PEGylation. Correlates With Reduced Structural Dynamics. Biotechnology and Bioengineering, 101, 1142-1149
【０１０８】
Li, J.; Kao, W. J. (2003), Synthesis of Polyethylene Glycol (PEG) Derivatives and PEGylated-Peptide Biopolymer Conjugates, Biomacromolecules 4, 1055-1067
【０１０９】
本明細書に示す特許及び文献は本発明が関係する分野におけるレベルを示すものである。これらの特許及び文献は参考として含まれる。
【０１１０】
前記記載は本発明の特定の態様を説明するものであり、これらに限定されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上の有機汚染の除去を促進する方法であって、
化学改質酵素をベースと結合させて水安定化活性一時的コーティング材料を形成すること、
前記活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、前記活性コーティング材料で基材をコーティングすること
を含む方法。
【請求項２】
前記水安定化活性コーティング材料が、このコーティングを水中に３０分以上浸した後に有機汚染の成分を分解することができる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記活性コーティング材料が水中に３０分浸した後に５０％以上の活性を保持している、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が加水分解酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素が細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、又はリパーゼである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子の付加により化学的に改質されている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリオキシエチレンが1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ポリオキシエチレンが介在するウレタン結合により前記酵素に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ポリオキシエチレンが前記酵素のアミノ基に直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリオキシエチレン基が前記酵素内のシステインに直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリオキシエチレンが分枝分子である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素がアミラーゼであり、前記コーティングの表面活性が0.01ユニット／cm2以上である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が前記ベースの少なくとも１つの成分に共有結合している、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が前記ベースに共有結合しておらず又は前記ベースに混合されている、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ベース、
前記ベースと結合した化学改質酵素、及び
前記ベースと結合した第一のポリオキシエチレン
を含み、前記第一のポリオキシエチレンが前記酵素とは無関係であり、前記ベース、前記酵素、及び前記第一のポリオキシエチレンが水安定化活性コーティング組成物を形成する、水安定化活性コーティング組成物。
【請求項１６】
前記ベース及び前記酵素が２：１〜２０：１の重量比で存在している、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記酵素が加水分解酵素である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
前記加水分解酵素が細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、又はリパーゼである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記酵素が第二のポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子に共有結合することにより化学的に改質されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
前記第一のポリオキシエチレンが1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する、請求項１５又は１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記第一のポリオキシエチレン及び第二のポリオキシエチレンがオキシエチレンの同じポリマーを有する、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
前記第一のポリオキシエチレンがスクシンイニミジルエステルにより誘導体化されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項２３】
前記第二のポリオキシエチレンが介在するウレタン結合により前記酵素に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
前記第二のポリオキシエチレンが前記酵素のアミノ基に直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
前記第二のポリオキシエチレン基が前記酵素内のシステインに直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２６】
前記第一のポリオキシエチレンが分枝分子である、請求項１５又は１９記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１５記載の水安定化活性コーティング組成物、及び
基材
を含む生物活性水安定自己洗浄表面であって、前記水安定化活性コーティング組成物が前記基材の表面を覆っている生物活性水安定自己洗浄表面。
【請求項２８】
前記酵素がサーモリシンであり、前記水安定化活性コーティング組成物の表面活性が0.0075ユニット／cm2以上である、請求項２７記載の表面。
【請求項１】
基材上の有機汚染の除去を促進する方法であって、
化学改質酵素をベースと結合させて水安定化活性一時的コーティング材料を形成すること、
前記活性コーティング材料と接触した有機汚染の成分を酵素により分解することができるように、前記活性コーティング材料で基材をコーティングすること
を含む方法。
【請求項２】
前記水安定化活性コーティング材料が、このコーティングを水中に３０分以上浸した後に有機汚染の成分を分解することができる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記活性コーティング材料が水中に３０分浸した後に５０％以上の活性を保持している、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が加水分解酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素が細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、又はリパーゼである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子の付加により化学的に改質されている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ポリオキシエチレンが1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ポリオキシエチレンが介在するウレタン結合により前記酵素に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ポリオキシエチレンが前記酵素のアミノ基に直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリオキシエチレン基が前記酵素内のシステインに直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリオキシエチレンが分枝分子である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素がアミラーゼであり、前記コーティングの表面活性が0.01ユニット／cm2以上である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が前記ベースの少なくとも１つの成分に共有結合している、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が前記ベースに共有結合しておらず又は前記ベースに混合されている、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ベース、
前記ベースと結合した化学改質酵素、及び
前記ベースと結合した第一のポリオキシエチレン
を含み、前記第一のポリオキシエチレンが前記酵素とは無関係であり、前記ベース、前記酵素、及び前記第一のポリオキシエチレンが水安定化活性コーティング組成物を形成する、水安定化活性コーティング組成物。
【請求項１６】
前記ベース及び前記酵素が２：１〜２０：１の重量比で存在している、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記酵素が加水分解酵素である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
前記加水分解酵素が細菌中性サーモリシン様プロテアーゼ、アミラーゼ、又はリパーゼである、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記酵素が第二のポリオキシエチレンの少なくとも１つの分子に共有結合することにより化学的に改質されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項２０】
前記第一のポリオキシエチレンが1,000〜15,000ダルトンの分子量を有する、請求項１５又は１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記第一のポリオキシエチレン及び第二のポリオキシエチレンがオキシエチレンの同じポリマーを有する、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
前記第一のポリオキシエチレンがスクシンイニミジルエステルにより誘導体化されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項２３】
前記第二のポリオキシエチレンが介在するウレタン結合により前記酵素に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
前記第二のポリオキシエチレンが前記酵素のアミノ基に直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
前記第二のポリオキシエチレン基が前記酵素内のシステインに直接的にもしくは間接的に共有結合している、請求項１９記載の組成物。
【請求項２６】
前記第一のポリオキシエチレンが分枝分子である、請求項１５又は１９記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１５記載の水安定化活性コーティング組成物、及び
基材
を含む生物活性水安定自己洗浄表面であって、前記水安定化活性コーティング組成物が前記基材の表面を覆っている生物活性水安定自己洗浄表面。
【請求項２８】
前記酵素がサーモリシンであり、前記水安定化活性コーティング組成物の表面活性が0.0075ユニット／cm2以上である、請求項２７記載の表面。
【図１】
【図２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図３】
【図５】
【図２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２３３１８６（Ｐ２０１２−２３３１８６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１０３３４８（Ｐ２０１２−１０３３４８）
【出願日】平成２４年４月２７日（２０１２．４．２７）
【出願人】（５０７３４２２６１）トヨタ モーター エンジニアリング アンド マニュファクチャリング ノース アメリカ，インコーポレイティド (135)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０３３４８（Ｐ２０１２−１０３３４８）
【出願日】平成２４年４月２７日（２０１２．４．２７）
【出願人】（５０７３４２２６１）トヨタ モーター エンジニアリング アンド マニュファクチャリング ノース アメリカ，インコーポレイティド (135)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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