有機溶剤の脱溶剤による疎水性表面への溶解アナライトの付着の改良
本発明は、付着させる前に水性アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤することにより、疎水性表面、例えばＤＩＯＳ−ＭＳ基板に、関心のあるアナライトを付着させる方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６０／４２０３９１号（ａｔｔｏｒｎｅｙ ｄｏｃｋｅｔ ｎｏ．ＷＣＺ−０３５−１）の特典を主張し、その内容全体は参考として本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
質量分析（「ＭＳ」）は、試料分子の分子量を、また、その試料を同定するために試料のフラグメンテーションの特徴を求めるために日常的に使用されている。気相においてＭＳを実施することができ、低い圧力の電気的に中性の試料が電子線の中を通過する。電子線は試料に衝突し、１つまたは複数の電子を放出させ、その後には、その試料は結果として正の電荷でイオン化されている。次に、イオン化された試料は、磁場内を通り、その場を通るイオン化試料の経路に応じて、分子の質量／イオン電荷が求められる。
【０００３】
試料の質量を求める別の方法は、飛行時間（「ＴＯＦ」）である。ＴＯＦにおいては、試料イオンが、既知の電圧により加速され、試料イオンまたはそのフラグメントが既知の距離を移動するのに要する時間が測定される。
【０００４】
気相に容易に持ち込めない分子は、ＭＳにより分析するのはより難しい。高分子量試料を揮発させるいくつかの方法が存在する。試料分子が基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に付着している（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）場合、その試料はその基板に吸着されていると言われる。脱離は、基板に吸着されている分子が基板から離れる時に起こる。基本的なＭＳにおけるように、気相試料を用いて開始する代わりに、基板上に吸着された試料に脱離ＭＳを適用することができる。
【０００５】
脱離ＭＳ法の１つは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）である。この方法によれば、試料は、気化過程の一部として有機マトリックスから試料へプロトンを移動させることによりイオン化される。試料は電子線イオン化またはプロトン移動イオン化によりイオン化される。
【０００６】
典型的なＭＡＬＤＩ実験においては、試料は、レーザーのパルス照射により気化する光吸収性有機固体マトリックスに溶解され、試料は気化したマトリックスと共に運ばれる。これは広く使用されている強力な方法であるが、ＭＡＬＤＩは、約７００未満のｍ／Ｚ（すなわち、質量と電荷の比）の測定をマトリックスが邪魔するために、一般に、小さな分子の研究には適切でない。ＭＡＬＤＩはまた、例えば、マトリックスが試料イオンと付加物を生成して分析の邪魔をし得るので、大きな分子の分析においてもかなりの限界がある。
【０００７】
より新しいＭＳ法では、マトリックスのない直接レーザー脱離／イオン化法が可能である。このような方法には、アナライト担持基板を減圧下に照射することによる、多孔質光吸収性半導体上のアナライトのイオン化が含まれる。米国特許第６２８８３９０号と、対応する国際ＰＣＴ出願ＷＯ ００／５４３０９を参照。このような直接脱離ＭＳ法によれば、多孔質半導体基板、例えばシリコンは、疎水性の基（例えばエチルフェニル基）と結合する。試料は基板に乗せられ、次に、（場合によっては電圧を加えて）紫外線で照射される。このような方法の利点は、マトリックスを使用する必要がないので、この方法は小さな分子の分析により適っていることである。
【０００８】
さらに、アナライトはマトリックスなしで直接検出され得る。基板を化学的または構造的に修飾して、基板の脱離／イオン化の特性を最適化することができる。多孔質シリコン上脱離／イオン化（「ＤＩＯＳ」）ＭＳ基板のいくつかの例が、Ｚ．Ｓｈｅｎ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、６１２−１９（２００１）；Ｊ．Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、４９３２−３７（２００１）：および、Ｒ．Ａ．Ｋｒｕｓｅ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、７３、３６３９−４５（２００１）、に記載されている。ＤＩＯＳ−ＭＳによる全細胞の分析もまた実際に行われた。Ｒ．Ａ．Ｋｒｕｓｅ、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、３６、１３１７−３２（２００１）。
【０００９】
ＤＩＯＳ−ＭＳ法の前途有望さにもかかわらず、この方法は、１つの基板に付けることができる試料の数により限界づけられている。典型的な実験条件では、アナライト溶液は、例えば、有機／水の混合溶剤系を用いてクロマトグラフィによる分離が実施されたＨＰＬＣ画分であり、かなりの量の有機溶剤を含んでいる。これは、例えばアセトリニトリルのような有機溶剤を多量に含む試料を付けることが、しばしば望まれるという、ＤＩＯＳ−ＭＳについての主な問題を象徴している。ＤＩＯＳ−ＭＳ基板は疎水性であるから、同じ様に疎水性の試料は、基板に乗せられた場合に広がるであろう。これらの溶液の接触角は９０°未満であるから、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）によりＤＩＯＳチップの広い部分に広がる。このために、基板上に乗せることができる試料の数が制限されるだけでなく、また、ＭＳ分析の感度を弱める。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＩＯＳ−ＭＳに使用される多孔質シリコン基板は疎水性である。ＤＩＯＳ−ＭＳチップ上での水性試料の接触角は９０°を超えるので、試料が付けられた時、水性試料は玉のようになり広がらないという理由で、水性試料が、ＤＩＯＳ−ＭＳに使用された場合、特にうまく行く。本発明は、ＤＩＯＳ−ＭＳ基板への試料の付着の間に有機溶剤を除去することにより、従来技術における前記の問題を克服する。感度を低下させ、また１つのチップ上に付着させることができる試料の数を減少させる、広がる効果が、結果として、克服される。
【００１１】
本発明は、ＬＤＩ実験における試料の付着に使用される典型的な有機溶剤は、水よりも揮発性であるという事実を利用する。こうして、アナライトが有機溶剤と水を含む溶液に溶けていたら、この場合、試料の付着の間に迅速な脱溶剤を行えば、その有機溶剤は水より速く蒸発するであろう。この場合、アナライトは、概ね（ｐｒｉｍａｒｉｌｙ）水の性質をもち接触角が９０°を超える溶剤混合物として、疎水性表面、例えば、ＤＩＯＳ−ＭＳチップ上に付着する。水性溶液として疎水性表面に付着させることにより、疎水性ウィッキング効果が最少化され、アナライトをかなり小さい領域に集中させる（ｆｏｃｕｓ）ようにするので、感度と、表面の所定の領域に付着させ得る試料の数が増加する。本明細書における付着法は、有機溶剤を選択的に除去し、同時に、概ね水性の試料溶液を疎水性表面に付着させる独特の能力をもつ。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
こうして、本発明は、アナライトを疎水性表面に付着させる方法を提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明はまた、ＤＩＯＳチップおよび／または質量分析装置と、上で要約された本発明の方法によるその使用説明書を備えるキットを提供する。
【００１４】
さらに本発明は、アナライトを疎水性表面上に付着させることによる、質量分析用の試料調製方法もまた提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させることにより、質量分析のための試料を調製するステップと；を含む。
【００１５】
本発明は、疎水性表面にアナライトを付着させる方法を提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；を含む。
【００１６】
本発明によれば、アナライトは一般に、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物、タンパク質またはタンパク質の混合物、あるいは、ペプチドまたはペプチドの混合物を含めて（これらに限定はされないが）、生体試料のような、例えば、百万ダルトンまでの、広い範囲の分子量の如何なる実験試料であってもよい。同様に、アナライトは合成ポリマーまたは合成ポリマーの混合物であってもよい。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、疎水性表面には、例えば、シリコン、ガリウム砒素、または窒化ガリウム系の、多孔質半導体が含まれる。特定の実施形態においては、多孔質半導体は、シリコン上脱離／イオン化（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ、「ＤＩＯＳ」チップである。ＤＩＯＳチップは、例えば、Ｊ．Ｗｅｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、２４３−４６（１９９９）；Ｇ．Ｅ．ＳｉｕｚｄａｋのＰＣＴ Ｗ０ ００／５４３０９；および、Ｇ．Ｅ．Ｓｉｕｚｄａｋの米国特許第６２８８３９０号；に記載されている。
【００１８】
通常、有機溶剤を含む試料はＤＩＯＳチップ上で広い領域に広がる傾向があるので、感度が悪くなり、また所定のＤＩＯＳチップ上で試験できる試料の数が少なくなる。これは、有機溶液が９０°未満の接触角を生成させる傾向があるという事実の結果である。水性溶剤はＤＩＯＳチップの広い領域に試料を広げさせない。
【００１９】
本発明の方法は、脱溶剤により、試料の付着中に、水性溶剤よりも有機溶剤を優先的に除去する。「脱溶剤すること」および「脱溶剤」という用語は、本明細書では交換可能な仕方で使用されており、本発明に従って脱溶剤の後にアナライト溶液が概ね水性であるように、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含むアナライト溶液から１種または複数の有機溶剤を除去することを表そうとするものである。
【００２０】
「概ね水性のアナライト溶液」におけるような「概ね水性」という用語は、疎水性表面に付着させた時に、アナライトの分析（例えば、質量分析）を難しくする（例えば、感度を低下させる）ように表面に沿ってウィッキングを起こさない、あるいは広がらないアナライト溶液を表す。手短に言えば、本発明に従って脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液は、分析の感度を上げることと、分析され得る試料の数を増やすことにより、従来技術の試料調製および付着の方法に伴う問題を回避する。
【００２１】
本発明の一実施形態においては、脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液の有機溶剤含量は、疎水性表面に付着させた時に、その脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が約９０°を超える表面との接触角をもつようなものである。例えば、Ａｄａｍｓｏｎ、Ａｒｔｈｕｒ Ｗ．（カリフォルニア州、ロサンゼルスの南カリフォルニア大学、化学科）による「Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ（表面の物理化学）」（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓの一部門、ニューヨーク）の３５５頁「ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ（接触角の測定）」に説明されるような、様々な標準的実験法を用いて、接触角を測定することができる。特定の実施形態においては、接触角は、約９０°を超え、約１１５°までの範囲である。通常、本発明による、脱溶剤後の概ね水性のアナライト溶液の有機溶剤含量は、アナライト溶液の約５容量％から約１０容量％の範囲である。
【００２２】
一実施形態においては、アナライト溶液は、例えば、概ね水性のアナライト溶液が得られるのに十分な温度、圧力、流量で、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎの米国特許第４８４３２４３号、Ｔ．Ｐｒｅｖｏｓｔの米国特許第５７７２９６４号、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎの米国特許第５７７０２７２号に記載されるもののような、加熱されたキャピラリーネブライザーを通してアナライト溶液を素早く注ぐことによるサーモスプレ法により脱溶剤される。正確な条件は特定のアナライトにより決まり、最適な条件の決定は十分に当業者の理解の範囲内にあるであろう。溶液は、好ましくは、再現性のあるやり方で、それ程水を除去することも試料に熱劣化を引き起こすこともなしに有機溶剤が除去されるように、十分に迅速に加熱されるべきである。例として、温度は、約３０〜２００℃（あるいは３０〜１５０℃）、圧力は、約１０〜６０ＰＳＩ（あるいは１０〜３０ＰＳＩ）、流量は、約０．０５〜５０μＬ／ｍｉｎ（あるいは、０．１〜２０μＬ／ｍｉｎ）であり得る。
【００２３】
加熱キャピラリーネブライザ−による付着の間の脱溶剤により、有機溶剤は優先的に除去され、概ね水性の溶液に溶けたアナライトが残される。概ね水性の溶液としてＤＩＯＳチップに付着する試料は、チップの限られた領域内に留まる傾向があり、チップの広い領域に広がらないであろうから、感度と、１つのＢＩＯＳチップに採集する（ｃｏｌｌｅｃｔ）ことができる試料の数が増大する。加熱キャピラリーネブライザーを使用する本発明の方法は、アナライトを約０．３ｍｍのトラック幅（例えば、約１ｍｍから約０．１ｍｍのトラック幅）をもってＤＩＯＳ表面上に付着させること、そして、２．５ｍｍウェルへの従来のピペットによる付着法に比べて少なくとも２倍の領域集中における利得（ｇａｉｎ ｉｎ ｓｐａｔｉａｌ ｆｏｃｕｓ）を得ること（より好ましくは、約２．５と約６．５倍の間の、付着領域集中の利得）ができる。このように、例えば、質量分析の試料の調製に本発明の方法を利用することができ、その場合には、試料を隣接する一連のトラックまたはスポットとして付着させることができる。
【００２４】
脱溶剤される有機溶剤は、アセトニトリル、有機アルコール（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）エーテル（例えば、ジエチルエーテル）、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、およびこれらの混合物であり得る。
【００２５】
アナライト溶液はまた、イオンペア試薬、例えば、ギ酸、酢酸、およびトリフロオロ酢酸を含めて、ＨＰＬＣ溶剤系において通常使用されるものを含み得る。
【００２６】
例示的な一実施形態において、アナライト溶液は、約１０〜７０％のアセトニトリル、約１０〜７０％の水、および、約０．１〜２．０％のトリフルオロ酢酸を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＤＩＯＳチップおよび／または質量分析装置と、本発明の方法を実施するための使用説明書を備えるキットも提供する。本発明の方法において使用するのに適する質量分析装置は、ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州、Ｍｉｌｆｏｒｄ）である。
【００２８】
本発明の付着方法は、ペプチドマスフィンガープリンティング分析を含めて、様々な分析法での、タンパク質および消化タンパク質のアナライトの付着において使用するのに適している。より詳細には、ＬＣ−ＭＡＬＤＩまたはＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐにより得られる質量スペクトルのデータは、消化タンパク質分離物の取得および分析とペプチドマスフィンガープリンティング分析に適している。
【００２９】
（実施例）
本発明は、本発明の方法の適用を説明する以下の非限定的実施例によりさらに例示される。
【実施例１】
【００３０】
標準ペプチドを、ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（Ｗａｔｅｒｓ）に直接注入し（Ｈａｒｖａｒｄシリンジポンプ）、加熱キャピラリーネブライザ−を通過させ、それから、隣接する一連のトラック（間隔は４．５ｍｍ）としてＤＩＯＳチップ上に付着させた。この標準ペプチド（１ｐｍｏｌ／μＬ）は、３０％のアセトニトリル、７０％の水、および０．１％のＴＦＡの溶液として、１０μＬ／ｍｉｎの流量で直接注がれた。脱溶剤の温度は５５℃であり、ネブライザー窒素ガスを２０ＰＳＩの圧力に保った。ノズルとＢＩＯＳチップの間の距離は１０ｍｍであった。試料採取中のステージ速度は１０ｍｍ／ｍｉｎであった。質量スペクトル分析を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ（登録商標）装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＵＫ，Ｌｔｄ．）を用いて行った。トラックのＹ−方向を横切りレーザーをスキャンする（ｓｐｅｐ ｙｓｃａｎ ｔＤ ｄ０９）ことにより、トラックの幅を測定した（図１）。ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（Ｗａｔｅｒｓ）は、直径１ｍｍの噴霧（ｓｐｒａｙ）を生じる。
【００３１】
データから、ＤＩＯＳチップ上にスプレで吹き付けられた試料は、幅１．２ｍｍ（ＦＷＨＭ（半値全幅））の狭い試料トラックに集中していたことが示される。このトラックを横切るスキャンの中央および端からの４つの質量スペクトルが図２に示されている。各質量スペクトルは、注入されたペプチドの質量と、ＤＩＯＳチップ上のどこにレーザーが照射されたかを示す位置、ｘ、ｙを表示している。これらのデータから、トラックのベースライン幅は２ｍｍであり、トラックのＦＷＨＭ幅は１．２ｍｍである。脱溶剤なしで、ＤＩＯＳチップ上に滴下した同じ溶液（アセトニトリル３０％）は、この溶液の接触角が９０°未満であったという事実のために、スプレ試料で起こったよりもずっと広い領域に広がる。トラック幅が１．２ｍｍであることにより、最初試料は３０％アセトニトリルに溶けていたにもかかわらず、それがＤＩＯＳ表面に付着した後、それ程ウィッキングを起こさなかったことを示している。１０μＬ／ｍｉｎの流量と、１０ｍｍ／ｍｉｎのステージ速度（採取速度）で、１μＬのカラムが１ｍｍのトラックに採取された。この試料付着方法は、有機溶剤含有溶液において試料付着中にＤＩＯＳチップで通常見られるウィッキング効果を最少化しながら、ＤＩＯＳチップに試料のトラックまたはスポットを採集するのに使用され得る。
【実施例２】
【００３２】
以下の例示的な本発明の方法を、試料調製と操作についての以下の技法と装置を用いて実施した。
【００３３】
ＣａｐＬＣ
ＣａｐＬＣを、典型的な、水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの勾配クロマトグラフィにより、３μＬ／ｍｉｎで運転した。使用されたカラムは、粒径が５μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ０．３２×１５０ｍｍであった。
【００３４】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ
ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐを、ＬＣＤＩＯＳ作業のために元々備わるステンレス鋼キャピラリーと、直接注出し付着領域を集中させる作業のための新しい石英ガラスのキャピラリーを用いて運転した。典型的なノズル温度は４０から７０℃であった。典型的なステージ速度は２．５から１０ｍｍ／ｍｉｎの範囲であった。
【００３５】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（Ｗａｔｅｒｓ）を、ペプチドマスフィンガープリント用の、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．０のＳＣＮ４２９のベータ５バージョンとＭａｌｄｉＡｕｔｏ／ＰＬＧＳ２を用いて運転した。
【００３６】
付着領域の集中
標準ペプチド、Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢを、シリンジポンプを用いてＤＩＯＳチップに直接注いだ。トラックとスポットをレーザースキャンしてＤＩＯＳ表面上の付着の幅を求めた。この幅はベースラインとＦＷＨＭとして、付着領域集中度を求めるために繰返し測定された。流量は、５０％のアセトニトリル、５０％の水、０．１％のＴＦＡおよび１０ｍＭのクエン酸アンモニウムとして、（異なると指摘されない限り）２μＬ／ｍｉｎである。ステージは（異なると指摘されない限り）２．５ｍｍ／ｍｉｎで動かされる。領域集中についての比較となる付着点は、直径２．５ｍｍの通常のウェルである。このウェルの面積は、従って４．９１ｍｍ２である。
【００３７】
ｐｉｃｏｆｒｉｔキャピラリー（７５×１５μｍ）を用いて、１μＬ／ｍｉｎで直接注がれたＤＩＯＳ上のトラック幅は、平均で、ＦＷＨＭが０．３ｍｍ、ベースラインが０．７ｍｍである（表１）。１μＬ／ｍｉｎの流量と２．５ｍｍ／ｍｉｎのステージ速度で、１μＬの容積は、２．５ｍｍの長さのトラックに付着する。こうして、付着面積は、０．７×２．５ｍｍ、すなわち１．７５ｍｍ２である。これは、４．９１ｍｍ２のウェルの通常面積に対して、付着領域集中における、２．８倍の向上を示している。
【００３８】
【表１】
【００３９】
先端テーパー付き（ｔａｐｅｒ−ｔｉｐ）キャピラリー（２０×２０μｍ）を用いて、２μＬ／ｍｉｎで直接注いだＤＩＯＳ上のスポットの直径は、ＦＷＨＭが０．４ｍｍ、ベースラインが１．０ｍｍである（表１）。スポット時間は０．５分であるから、１μＬが１スポットに付着する。付着スポットの面積は０．７９ｍｍ２であり、領域集中における６．１倍の改善である。
【００４０】
定量的ＤＩＯＳ
Ｇｌｕ−ｆｉｂを内部標準として用い、１００ｆｍｏｌ／μＬで一定に保った。アンギオテンシンＩの濃度をほぼ２桁に渡り変化させた。ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐで試料を付着させたＤＩＯＳの定量的性質を評価するのに使用されるＳＩＣピークと比について、繰返し測定した。
【００４１】
ＬＣ−ＭＡＬＤ分析によるピークの積分で使用されるパラメータは次の値を含んでいた：平滑化と、ＡｐｅｘＴｒａｃｋピーク積分が可能であった；ＡｐｅｘＴｒａｃｋピーク検出パラメータは、ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｎｏｉｓｅ ｏｆ ７、０．５４４（最小）の５％高さでのピーク幅、０．００のベースライン開始点しきい値および０．５０％のベースライン終了点しきい値を含んでいた；また、クロマトグラム平滑化は平均法（ｍｅａｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。
【００４２】
データは半定量的であり、加熱キャピラリーネブライザーとＤＩＯＳチップの組合せがどの程度定量的であり得るかを決めるにはさらなる研究がなされねばならない。下の表に結果を要約する。
【００４３】
【表２】
【００４４】
ＬＣ−ＤＩＯＳ
トリプシンで消化された４種のタンパク質混合物の分離物を、加熱キャピラリーネブライザーを用いてＤＩＯＳ表面に採集した。クロマトグラムとＰＭＦの結果は次の通り。
【００４５】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離物からの基準ピーク強度クロマトグラムが図６に示されており、タンパク質１種あたり３００ｆｍｏｌの坦持でのＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離の２次元マッピングが図７に描かれている。複雑な混合物から複数のペプチドを分離し検出するＬＣ−ＤＩＯＳの能力は、図７に与えられる２次元スキャンにより示されている。質量と電荷の比の大部分は約２０００Ｄａ未満である。各ピークまたは抽出イオンクロマトグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）は、ベースラインで約１．４ｍｍの幅である（図８）。これは図７に示されているものと同じＸＩＣである。複数のＸＩＣスペクトルが図９に示されており、この図は、本発明の付着方法によりＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離からＤＩＯＳチップ上に付着させたアナライトのＸ方向での領域集中を示している。
【００４６】
ＰＭＦの結果を調べるために、ＭａｌｄｉＡｕｔｏソフトウェアとＰＬＧＳ２を用いて、質量分析器による分離体を分析した。ＰＭＦの結果は、質量の正確さに優れ、予想されるように、ｍ／ｚの小さいペプチドに大きく偏っていることを示している。
【００４７】
参考としての組込み
本明細書において引用された特許、公開特許出願および他の参考文献のすべての全内容は、ここで明示的に、参考としてそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
均等物
当業者は、本明細書に記載された具体的な手順に対する多くの均等物を認める、あるいは、日常的な実験法にすぎないものを用いて確かめることができるであろう。このような均等物は本発明の範囲内にあると考えられており、また請求範囲により包含されている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の方法によりＤＩＯＳ基板上に付着した材料のＹ方向のプロットを示す図である。
【図２Ａ】このトラックへの交線の端部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｂ】このトラックへの交線の中央部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｃ】このトラックへの交線の別の中央部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｄ】このトラックへの交線の別の端部の質量スペクトルを示す図である。
【図３】ｐｒｅｐ−ＬＣ−ＭＡＬＤＩによる一連の試料ウェルへの付着物のラスタープロフィール（一連のピークは一連のウェル：すなわち、Ａ２、Ａ３、Ａ４など（４．５ｍｍピッチ）を表す）を示す図である。
【図４】Ｇｌｕ−ｆｉｂ（１００ｆｍｏｌ／μＬ）からのＳＩＣピークのプロットを示す図である。
【図５】アンギオテンシンＩ（２５、５０、１００、５００、および１０００ｆｍｏｌ／μＬ）からのＳＩＣピークのプロットを示す図である。
【図６】４種のタンパク質のトリプシン消化物のＣａｐＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ基準ピーククロマトグラムを示す図である。
【図７】３００ｆｍｏｌ／タンパク質の担持での図６のタンパク質混合物についてのＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離の２次元マッピングである。
【図８】ＤＩＯＳチップ上へのペプチドの付着の集中を示す抽出イオンクロマトグラムである。
【図９】ＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離を用いてＤＩＯＳチップ上に付着させたアナライトの付着領域が分離されていることを示す様々なＸＩＣの抜粋である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６０／４２０３９１号（ａｔｔｏｒｎｅｙ ｄｏｃｋｅｔ ｎｏ．ＷＣＺ−０３５−１）の特典を主張し、その内容全体は参考として本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
質量分析（「ＭＳ」）は、試料分子の分子量を、また、その試料を同定するために試料のフラグメンテーションの特徴を求めるために日常的に使用されている。気相においてＭＳを実施することができ、低い圧力の電気的に中性の試料が電子線の中を通過する。電子線は試料に衝突し、１つまたは複数の電子を放出させ、その後には、その試料は結果として正の電荷でイオン化されている。次に、イオン化された試料は、磁場内を通り、その場を通るイオン化試料の経路に応じて、分子の質量／イオン電荷が求められる。
【０００３】
試料の質量を求める別の方法は、飛行時間（「ＴＯＦ」）である。ＴＯＦにおいては、試料イオンが、既知の電圧により加速され、試料イオンまたはそのフラグメントが既知の距離を移動するのに要する時間が測定される。
【０００４】
気相に容易に持ち込めない分子は、ＭＳにより分析するのはより難しい。高分子量試料を揮発させるいくつかの方法が存在する。試料分子が基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に付着している（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）場合、その試料はその基板に吸着されていると言われる。脱離は、基板に吸着されている分子が基板から離れる時に起こる。基本的なＭＳにおけるように、気相試料を用いて開始する代わりに、基板上に吸着された試料に脱離ＭＳを適用することができる。
【０００５】
脱離ＭＳ法の１つは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）である。この方法によれば、試料は、気化過程の一部として有機マトリックスから試料へプロトンを移動させることによりイオン化される。試料は電子線イオン化またはプロトン移動イオン化によりイオン化される。
【０００６】
典型的なＭＡＬＤＩ実験においては、試料は、レーザーのパルス照射により気化する光吸収性有機固体マトリックスに溶解され、試料は気化したマトリックスと共に運ばれる。これは広く使用されている強力な方法であるが、ＭＡＬＤＩは、約７００未満のｍ／Ｚ（すなわち、質量と電荷の比）の測定をマトリックスが邪魔するために、一般に、小さな分子の研究には適切でない。ＭＡＬＤＩはまた、例えば、マトリックスが試料イオンと付加物を生成して分析の邪魔をし得るので、大きな分子の分析においてもかなりの限界がある。
【０００７】
より新しいＭＳ法では、マトリックスのない直接レーザー脱離／イオン化法が可能である。このような方法には、アナライト担持基板を減圧下に照射することによる、多孔質光吸収性半導体上のアナライトのイオン化が含まれる。米国特許第６２８８３９０号と、対応する国際ＰＣＴ出願ＷＯ ００／５４３０９を参照。このような直接脱離ＭＳ法によれば、多孔質半導体基板、例えばシリコンは、疎水性の基（例えばエチルフェニル基）と結合する。試料は基板に乗せられ、次に、（場合によっては電圧を加えて）紫外線で照射される。このような方法の利点は、マトリックスを使用する必要がないので、この方法は小さな分子の分析により適っていることである。
【０００８】
さらに、アナライトはマトリックスなしで直接検出され得る。基板を化学的または構造的に修飾して、基板の脱離／イオン化の特性を最適化することができる。多孔質シリコン上脱離／イオン化（「ＤＩＯＳ」）ＭＳ基板のいくつかの例が、Ｚ．Ｓｈｅｎ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、６１２−１９（２００１）；Ｊ．Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、４９３２−３７（２００１）：および、Ｒ．Ａ．Ｋｒｕｓｅ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、７３、３６３９−４５（２００１）、に記載されている。ＤＩＯＳ−ＭＳによる全細胞の分析もまた実際に行われた。Ｒ．Ａ．Ｋｒｕｓｅ、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、３６、１３１７−３２（２００１）。
【０００９】
ＤＩＯＳ−ＭＳ法の前途有望さにもかかわらず、この方法は、１つの基板に付けることができる試料の数により限界づけられている。典型的な実験条件では、アナライト溶液は、例えば、有機／水の混合溶剤系を用いてクロマトグラフィによる分離が実施されたＨＰＬＣ画分であり、かなりの量の有機溶剤を含んでいる。これは、例えばアセトリニトリルのような有機溶剤を多量に含む試料を付けることが、しばしば望まれるという、ＤＩＯＳ−ＭＳについての主な問題を象徴している。ＤＩＯＳ−ＭＳ基板は疎水性であるから、同じ様に疎水性の試料は、基板に乗せられた場合に広がるであろう。これらの溶液の接触角は９０°未満であるから、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）によりＤＩＯＳチップの広い部分に広がる。このために、基板上に乗せることができる試料の数が制限されるだけでなく、また、ＭＳ分析の感度を弱める。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＤＩＯＳ−ＭＳに使用される多孔質シリコン基板は疎水性である。ＤＩＯＳ−ＭＳチップ上での水性試料の接触角は９０°を超えるので、試料が付けられた時、水性試料は玉のようになり広がらないという理由で、水性試料が、ＤＩＯＳ−ＭＳに使用された場合、特にうまく行く。本発明は、ＤＩＯＳ−ＭＳ基板への試料の付着の間に有機溶剤を除去することにより、従来技術における前記の問題を克服する。感度を低下させ、また１つのチップ上に付着させることができる試料の数を減少させる、広がる効果が、結果として、克服される。
【００１１】
本発明は、ＬＤＩ実験における試料の付着に使用される典型的な有機溶剤は、水よりも揮発性であるという事実を利用する。こうして、アナライトが有機溶剤と水を含む溶液に溶けていたら、この場合、試料の付着の間に迅速な脱溶剤を行えば、その有機溶剤は水より速く蒸発するであろう。この場合、アナライトは、概ね（ｐｒｉｍａｒｉｌｙ）水の性質をもち接触角が９０°を超える溶剤混合物として、疎水性表面、例えば、ＤＩＯＳ−ＭＳチップ上に付着する。水性溶液として疎水性表面に付着させることにより、疎水性ウィッキング効果が最少化され、アナライトをかなり小さい領域に集中させる（ｆｏｃｕｓ）ようにするので、感度と、表面の所定の領域に付着させ得る試料の数が増加する。本明細書における付着法は、有機溶剤を選択的に除去し、同時に、概ね水性の試料溶液を疎水性表面に付着させる独特の能力をもつ。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
こうして、本発明は、アナライトを疎水性表面に付着させる方法を提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明はまた、ＤＩＯＳチップおよび／または質量分析装置と、上で要約された本発明の方法によるその使用説明書を備えるキットを提供する。
【００１４】
さらに本発明は、アナライトを疎水性表面上に付着させることによる、質量分析用の試料調製方法もまた提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させることにより、質量分析のための試料を調製するステップと；を含む。
【００１５】
本発明は、疎水性表面にアナライトを付着させる方法を提供する。この方法は、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；概ね水性のアナライト溶液となるのに十分な条件の下で、アナライト溶液から有機溶剤を脱溶剤するステップと；脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；を含む。
【００１６】
本発明によれば、アナライトは一般に、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物、タンパク質またはタンパク質の混合物、あるいは、ペプチドまたはペプチドの混合物を含めて（これらに限定はされないが）、生体試料のような、例えば、百万ダルトンまでの、広い範囲の分子量の如何なる実験試料であってもよい。同様に、アナライトは合成ポリマーまたは合成ポリマーの混合物であってもよい。
【００１７】
本発明の一実施形態においては、疎水性表面には、例えば、シリコン、ガリウム砒素、または窒化ガリウム系の、多孔質半導体が含まれる。特定の実施形態においては、多孔質半導体は、シリコン上脱離／イオン化（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ、「ＤＩＯＳ」チップである。ＤＩＯＳチップは、例えば、Ｊ．Ｗｅｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、２４３−４６（１９９９）；Ｇ．Ｅ．ＳｉｕｚｄａｋのＰＣＴ Ｗ０ ００／５４３０９；および、Ｇ．Ｅ．Ｓｉｕｚｄａｋの米国特許第６２８８３９０号；に記載されている。
【００１８】
通常、有機溶剤を含む試料はＤＩＯＳチップ上で広い領域に広がる傾向があるので、感度が悪くなり、また所定のＤＩＯＳチップ上で試験できる試料の数が少なくなる。これは、有機溶液が９０°未満の接触角を生成させる傾向があるという事実の結果である。水性溶剤はＤＩＯＳチップの広い領域に試料を広げさせない。
【００１９】
本発明の方法は、脱溶剤により、試料の付着中に、水性溶剤よりも有機溶剤を優先的に除去する。「脱溶剤すること」および「脱溶剤」という用語は、本明細書では交換可能な仕方で使用されており、本発明に従って脱溶剤の後にアナライト溶液が概ね水性であるように、水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含むアナライト溶液から１種または複数の有機溶剤を除去することを表そうとするものである。
【００２０】
「概ね水性のアナライト溶液」におけるような「概ね水性」という用語は、疎水性表面に付着させた時に、アナライトの分析（例えば、質量分析）を難しくする（例えば、感度を低下させる）ように表面に沿ってウィッキングを起こさない、あるいは広がらないアナライト溶液を表す。手短に言えば、本発明に従って脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液は、分析の感度を上げることと、分析され得る試料の数を増やすことにより、従来技術の試料調製および付着の方法に伴う問題を回避する。
【００２１】
本発明の一実施形態においては、脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液の有機溶剤含量は、疎水性表面に付着させた時に、その脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が約９０°を超える表面との接触角をもつようなものである。例えば、Ａｄａｍｓｏｎ、Ａｒｔｈｕｒ Ｗ．（カリフォルニア州、ロサンゼルスの南カリフォルニア大学、化学科）による「Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ（表面の物理化学）」（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓの一部門、ニューヨーク）の３５５頁「ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ（接触角の測定）」に説明されるような、様々な標準的実験法を用いて、接触角を測定することができる。特定の実施形態においては、接触角は、約９０°を超え、約１１５°までの範囲である。通常、本発明による、脱溶剤後の概ね水性のアナライト溶液の有機溶剤含量は、アナライト溶液の約５容量％から約１０容量％の範囲である。
【００２２】
一実施形態においては、アナライト溶液は、例えば、概ね水性のアナライト溶液が得られるのに十分な温度、圧力、流量で、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎの米国特許第４８４３２４３号、Ｔ．Ｐｒｅｖｏｓｔの米国特許第５７７２９６４号、Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎの米国特許第５７７０２７２号に記載されるもののような、加熱されたキャピラリーネブライザーを通してアナライト溶液を素早く注ぐことによるサーモスプレ法により脱溶剤される。正確な条件は特定のアナライトにより決まり、最適な条件の決定は十分に当業者の理解の範囲内にあるであろう。溶液は、好ましくは、再現性のあるやり方で、それ程水を除去することも試料に熱劣化を引き起こすこともなしに有機溶剤が除去されるように、十分に迅速に加熱されるべきである。例として、温度は、約３０〜２００℃（あるいは３０〜１５０℃）、圧力は、約１０〜６０ＰＳＩ（あるいは１０〜３０ＰＳＩ）、流量は、約０．０５〜５０μＬ／ｍｉｎ（あるいは、０．１〜２０μＬ／ｍｉｎ）であり得る。
【００２３】
加熱キャピラリーネブライザ−による付着の間の脱溶剤により、有機溶剤は優先的に除去され、概ね水性の溶液に溶けたアナライトが残される。概ね水性の溶液としてＤＩＯＳチップに付着する試料は、チップの限られた領域内に留まる傾向があり、チップの広い領域に広がらないであろうから、感度と、１つのＢＩＯＳチップに採集する（ｃｏｌｌｅｃｔ）ことができる試料の数が増大する。加熱キャピラリーネブライザーを使用する本発明の方法は、アナライトを約０．３ｍｍのトラック幅（例えば、約１ｍｍから約０．１ｍｍのトラック幅）をもってＤＩＯＳ表面上に付着させること、そして、２．５ｍｍウェルへの従来のピペットによる付着法に比べて少なくとも２倍の領域集中における利得（ｇａｉｎ ｉｎ ｓｐａｔｉａｌ ｆｏｃｕｓ）を得ること（より好ましくは、約２．５と約６．５倍の間の、付着領域集中の利得）ができる。このように、例えば、質量分析の試料の調製に本発明の方法を利用することができ、その場合には、試料を隣接する一連のトラックまたはスポットとして付着させることができる。
【００２４】
脱溶剤される有機溶剤は、アセトニトリル、有機アルコール（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）エーテル（例えば、ジエチルエーテル）、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、およびこれらの混合物であり得る。
【００２５】
アナライト溶液はまた、イオンペア試薬、例えば、ギ酸、酢酸、およびトリフロオロ酢酸を含めて、ＨＰＬＣ溶剤系において通常使用されるものを含み得る。
【００２６】
例示的な一実施形態において、アナライト溶液は、約１０〜７０％のアセトニトリル、約１０〜７０％の水、および、約０．１〜２．０％のトリフルオロ酢酸を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＤＩＯＳチップおよび／または質量分析装置と、本発明の方法を実施するための使用説明書を備えるキットも提供する。本発明の方法において使用するのに適する質量分析装置は、ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州、Ｍｉｌｆｏｒｄ）である。
【００２８】
本発明の付着方法は、ペプチドマスフィンガープリンティング分析を含めて、様々な分析法での、タンパク質および消化タンパク質のアナライトの付着において使用するのに適している。より詳細には、ＬＣ−ＭＡＬＤＩまたはＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐにより得られる質量スペクトルのデータは、消化タンパク質分離物の取得および分析とペプチドマスフィンガープリンティング分析に適している。
【００２９】
（実施例）
本発明は、本発明の方法の適用を説明する以下の非限定的実施例によりさらに例示される。
【実施例１】
【００３０】
標準ペプチドを、ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（Ｗａｔｅｒｓ）に直接注入し（Ｈａｒｖａｒｄシリンジポンプ）、加熱キャピラリーネブライザ−を通過させ、それから、隣接する一連のトラック（間隔は４．５ｍｍ）としてＤＩＯＳチップ上に付着させた。この標準ペプチド（１ｐｍｏｌ／μＬ）は、３０％のアセトニトリル、７０％の水、および０．１％のＴＦＡの溶液として、１０μＬ／ｍｉｎの流量で直接注がれた。脱溶剤の温度は５５℃であり、ネブライザー窒素ガスを２０ＰＳＩの圧力に保った。ノズルとＢＩＯＳチップの間の距離は１０ｍｍであった。試料採取中のステージ速度は１０ｍｍ／ｍｉｎであった。質量スペクトル分析を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ（登録商標）装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＵＫ，Ｌｔｄ．）を用いて行った。トラックのＹ−方向を横切りレーザーをスキャンする（ｓｐｅｐ ｙｓｃａｎ ｔＤ ｄ０９）ことにより、トラックの幅を測定した（図１）。ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ（Ｗａｔｅｒｓ）は、直径１ｍｍの噴霧（ｓｐｒａｙ）を生じる。
【００３１】
データから、ＤＩＯＳチップ上にスプレで吹き付けられた試料は、幅１．２ｍｍ（ＦＷＨＭ（半値全幅））の狭い試料トラックに集中していたことが示される。このトラックを横切るスキャンの中央および端からの４つの質量スペクトルが図２に示されている。各質量スペクトルは、注入されたペプチドの質量と、ＤＩＯＳチップ上のどこにレーザーが照射されたかを示す位置、ｘ、ｙを表示している。これらのデータから、トラックのベースライン幅は２ｍｍであり、トラックのＦＷＨＭ幅は１．２ｍｍである。脱溶剤なしで、ＤＩＯＳチップ上に滴下した同じ溶液（アセトニトリル３０％）は、この溶液の接触角が９０°未満であったという事実のために、スプレ試料で起こったよりもずっと広い領域に広がる。トラック幅が１．２ｍｍであることにより、最初試料は３０％アセトニトリルに溶けていたにもかかわらず、それがＤＩＯＳ表面に付着した後、それ程ウィッキングを起こさなかったことを示している。１０μＬ／ｍｉｎの流量と、１０ｍｍ／ｍｉｎのステージ速度（採取速度）で、１μＬのカラムが１ｍｍのトラックに採取された。この試料付着方法は、有機溶剤含有溶液において試料付着中にＤＩＯＳチップで通常見られるウィッキング効果を最少化しながら、ＤＩＯＳチップに試料のトラックまたはスポットを採集するのに使用され得る。
【実施例２】
【００３２】
以下の例示的な本発明の方法を、試料調製と操作についての以下の技法と装置を用いて実施した。
【００３３】
ＣａｐＬＣ
ＣａｐＬＣを、典型的な、水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの勾配クロマトグラフィにより、３μＬ／ｍｉｎで運転した。使用されたカラムは、粒径が５μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ ０．３２×１５０ｍｍであった。
【００３４】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐ
ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐを、ＬＣＤＩＯＳ作業のために元々備わるステンレス鋼キャピラリーと、直接注出し付着領域を集中させる作業のための新しい石英ガラスのキャピラリーを用いて運転した。典型的なノズル温度は４０から７０℃であった。典型的なステージ速度は２．５から１０ｍｍ／ｍｉｎの範囲であった。
【００３５】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（Ｗａｔｅｒｓ）を、ペプチドマスフィンガープリント用の、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．０のＳＣＮ４２９のベータ５バージョンとＭａｌｄｉＡｕｔｏ／ＰＬＧＳ２を用いて運転した。
【００３６】
付着領域の集中
標準ペプチド、Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢを、シリンジポンプを用いてＤＩＯＳチップに直接注いだ。トラックとスポットをレーザースキャンしてＤＩＯＳ表面上の付着の幅を求めた。この幅はベースラインとＦＷＨＭとして、付着領域集中度を求めるために繰返し測定された。流量は、５０％のアセトニトリル、５０％の水、０．１％のＴＦＡおよび１０ｍＭのクエン酸アンモニウムとして、（異なると指摘されない限り）２μＬ／ｍｉｎである。ステージは（異なると指摘されない限り）２．５ｍｍ／ｍｉｎで動かされる。領域集中についての比較となる付着点は、直径２．５ｍｍの通常のウェルである。このウェルの面積は、従って４．９１ｍｍ２である。
【００３７】
ｐｉｃｏｆｒｉｔキャピラリー（７５×１５μｍ）を用いて、１μＬ／ｍｉｎで直接注がれたＤＩＯＳ上のトラック幅は、平均で、ＦＷＨＭが０．３ｍｍ、ベースラインが０．７ｍｍである（表１）。１μＬ／ｍｉｎの流量と２．５ｍｍ／ｍｉｎのステージ速度で、１μＬの容積は、２．５ｍｍの長さのトラックに付着する。こうして、付着面積は、０．７×２．５ｍｍ、すなわち１．７５ｍｍ２である。これは、４．９１ｍｍ２のウェルの通常面積に対して、付着領域集中における、２．８倍の向上を示している。
【００３８】
【表１】
【００３９】
先端テーパー付き（ｔａｐｅｒ−ｔｉｐ）キャピラリー（２０×２０μｍ）を用いて、２μＬ／ｍｉｎで直接注いだＤＩＯＳ上のスポットの直径は、ＦＷＨＭが０．４ｍｍ、ベースラインが１．０ｍｍである（表１）。スポット時間は０．５分であるから、１μＬが１スポットに付着する。付着スポットの面積は０．７９ｍｍ２であり、領域集中における６．１倍の改善である。
【００４０】
定量的ＤＩＯＳ
Ｇｌｕ−ｆｉｂを内部標準として用い、１００ｆｍｏｌ／μＬで一定に保った。アンギオテンシンＩの濃度をほぼ２桁に渡り変化させた。ＬＣ−ＭＡＬＤＩｐｒｅｐで試料を付着させたＤＩＯＳの定量的性質を評価するのに使用されるＳＩＣピークと比について、繰返し測定した。
【００４１】
ＬＣ−ＭＡＬＤ分析によるピークの積分で使用されるパラメータは次の値を含んでいた：平滑化と、ＡｐｅｘＴｒａｃｋピーク積分が可能であった；ＡｐｅｘＴｒａｃｋピーク検出パラメータは、ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｎｏｉｓｅ ｏｆ ７、０．５４４（最小）の５％高さでのピーク幅、０．００のベースライン開始点しきい値および０．５０％のベースライン終了点しきい値を含んでいた；また、クロマトグラム平滑化は平均法（ｍｅａｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。
【００４２】
データは半定量的であり、加熱キャピラリーネブライザーとＤＩＯＳチップの組合せがどの程度定量的であり得るかを決めるにはさらなる研究がなされねばならない。下の表に結果を要約する。
【００４３】
【表２】
【００４４】
ＬＣ−ＤＩＯＳ
トリプシンで消化された４種のタンパク質混合物の分離物を、加熱キャピラリーネブライザーを用いてＤＩＯＳ表面に採集した。クロマトグラムとＰＭＦの結果は次の通り。
【００４５】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離物からの基準ピーク強度クロマトグラムが図６に示されており、タンパク質１種あたり３００ｆｍｏｌの坦持でのＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離の２次元マッピングが図７に描かれている。複雑な混合物から複数のペプチドを分離し検出するＬＣ−ＤＩＯＳの能力は、図７に与えられる２次元スキャンにより示されている。質量と電荷の比の大部分は約２０００Ｄａ未満である。各ピークまたは抽出イオンクロマトグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）は、ベースラインで約１．４ｍｍの幅である（図８）。これは図７に示されているものと同じＸＩＣである。複数のＸＩＣスペクトルが図９に示されており、この図は、本発明の付着方法によりＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離からＤＩＯＳチップ上に付着させたアナライトのＸ方向での領域集中を示している。
【００４６】
ＰＭＦの結果を調べるために、ＭａｌｄｉＡｕｔｏソフトウェアとＰＬＧＳ２を用いて、質量分析器による分離体を分析した。ＰＭＦの結果は、質量の正確さに優れ、予想されるように、ｍ／ｚの小さいペプチドに大きく偏っていることを示している。
【００４７】
参考としての組込み
本明細書において引用された特許、公開特許出願および他の参考文献のすべての全内容は、ここで明示的に、参考としてそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
均等物
当業者は、本明細書に記載された具体的な手順に対する多くの均等物を認める、あるいは、日常的な実験法にすぎないものを用いて確かめることができるであろう。このような均等物は本発明の範囲内にあると考えられており、また請求範囲により包含されている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の方法によりＤＩＯＳ基板上に付着した材料のＹ方向のプロットを示す図である。
【図２Ａ】このトラックへの交線の端部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｂ】このトラックへの交線の中央部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｃ】このトラックへの交線の別の中央部の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｄ】このトラックへの交線の別の端部の質量スペクトルを示す図である。
【図３】ｐｒｅｐ−ＬＣ−ＭＡＬＤＩによる一連の試料ウェルへの付着物のラスタープロフィール（一連のピークは一連のウェル：すなわち、Ａ２、Ａ３、Ａ４など（４．５ｍｍピッチ）を表す）を示す図である。
【図４】Ｇｌｕ−ｆｉｂ（１００ｆｍｏｌ／μＬ）からのＳＩＣピークのプロットを示す図である。
【図５】アンギオテンシンＩ（２５、５０、１００、５００、および１０００ｆｍｏｌ／μＬ）からのＳＩＣピークのプロットを示す図である。
【図６】４種のタンパク質のトリプシン消化物のＣａｐＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ基準ピーククロマトグラムを示す図である。
【図７】３００ｆｍｏｌ／タンパク質の担持での図６のタンパク質混合物についてのＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離の２次元マッピングである。
【図８】ＤＩＯＳチップ上へのペプチドの付着の集中を示す抽出イオンクロマトグラムである。
【図９】ＬＣ−ＭＡＬＤＩ分離を用いてＤＩＯＳチップ上に付着させたアナライトの付着領域が分離されていることを示す様々なＸＩＣの抜粋である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；
概ね水性のアナライトとするのに十分な条件の下で、前記アナライト溶液から前記有機溶剤を脱溶剤するステップと；
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；
を含む、アナライトを疎水性表面に付着させる方法。
【請求項２】
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が、前記疎水性表面に付着する時、約９０°を超える前記表面との接触角をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触角が、約９０°を超え、約１１５°未満の範囲である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アナライト溶液が、約１μｍ未満の厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アナライト溶液が、約０．１と約１μｍの間の厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アナライト溶液が、約０．３μｍの厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が、前記アナライト溶液の約５容量％から約１０容量％の範囲の有機溶剤含量を備える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アナライトが生体試料である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アナライトがタンパク質またはタンパク質の混合物である請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記アナライトがペプチドまたはペプチドの混合物である請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記アナライトが合成ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性表面が多孔質半導体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多孔質半導体が、シリコン、ガリウム砒素、または窒化ガリウム系である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多孔質半導体が、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）チップである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機溶剤が、アセトニトリル、有機アルコール、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶剤が、アセトニトリル、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アナライト溶液が、イオンペア試薬をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオンペア試薬が、ギ酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アナライト溶液が、約１０〜７０％のアセトニトリル、約１０〜７０％の水、および、約０．１〜２．０％のトリフルオロ酢酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記有機溶剤がサーモスプレ法により脱溶剤される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記有機溶剤が、概ね水性のアナライト溶液とするのに十分な温度、圧力、および流量で、キャピラリーネブライザーを通して前記アナライト溶液を素早く注ぐことにより、脱溶剤される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記温度が約３０〜２００℃であり、前記圧力が約１０〜６０ＰＳＩであり、また前記流量が約０．０５〜５０μＬ／ｍｉｎである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記温度が約３０〜１５０℃であり、前記圧力が約１０〜３０ＰＳＩであり、また前記流量が約０．１〜２０μＬ／ｍｉｎである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の概ね水性のアナライト溶液を、隣接する一連のトラックまたはスポットとして付着させる請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記の概ね水性のアナライト溶液に、多くても約１０容量％の有機溶剤しかない請求項１または２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液に多くても約５容量％の有機溶剤しかない請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＩＯＳチップまたは質量分析装置と、請求項１に記載の方法によるこれらの使用説明書を含むキット。
【請求項２８】
水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；
概ね水性のアナライトとするのに十分な条件の下で、前記アナライト溶液から前記有機溶剤を脱溶剤するステップと；
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させることにより、質量分析のための試料を調製するステップと；
を含む、アナライトを疎水性表面に付着させることによる質量分析用試料の調製方法。
【請求項１】
水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；
概ね水性のアナライトとするのに十分な条件の下で、前記アナライト溶液から前記有機溶剤を脱溶剤するステップと；
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させるステップと；
を含む、アナライトを疎水性表面に付着させる方法。
【請求項２】
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が、前記疎水性表面に付着する時、約９０°を超える前記表面との接触角をもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触角が、約９０°を超え、約１１５°未満の範囲である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アナライト溶液が、約１μｍ未満の厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アナライト溶液が、約０．１と約１μｍの間の厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アナライト溶液が、約０．３μｍの厚さをもつトラックとして前記疎水性表面上に付着する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液が、前記アナライト溶液の約５容量％から約１０容量％の範囲の有機溶剤含量を備える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アナライトが生体試料である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アナライトがタンパク質またはタンパク質の混合物である請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記アナライトがペプチドまたはペプチドの混合物である請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記アナライトが合成ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性表面が多孔質半導体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多孔質半導体が、シリコン、ガリウム砒素、または窒化ガリウム系である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多孔質半導体が、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）チップである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機溶剤が、アセトニトリル、有機アルコール、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記有機溶剤が、アセトニトリル、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アナライト溶液が、イオンペア試薬をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオンペア試薬が、ギ酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アナライト溶液が、約１０〜７０％のアセトニトリル、約１０〜７０％の水、および、約０．１〜２．０％のトリフルオロ酢酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記有機溶剤がサーモスプレ法により脱溶剤される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記有機溶剤が、概ね水性のアナライト溶液とするのに十分な温度、圧力、および流量で、キャピラリーネブライザーを通して前記アナライト溶液を素早く注ぐことにより、脱溶剤される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記温度が約３０〜２００℃であり、前記圧力が約１０〜６０ＰＳＩであり、また前記流量が約０．０５〜５０μＬ／ｍｉｎである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記温度が約３０〜１５０℃であり、前記圧力が約１０〜３０ＰＳＩであり、また前記流量が約０．１〜２０μＬ／ｍｉｎである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の概ね水性のアナライト溶液を、隣接する一連のトラックまたはスポットとして付着させる請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記の概ね水性のアナライト溶液に、多くても約１０容量％の有機溶剤しかない請求項１または２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液に多くても約５容量％の有機溶剤しかない請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＩＯＳチップまたは質量分析装置と、請求項１に記載の方法によるこれらの使用説明書を含むキット。
【請求項２８】
水と１種または複数の有機溶剤との混合物を含む溶剤にアナライトを溶かすことによりアナライト溶液を調製するステップと；
概ね水性のアナライトとするのに十分な条件の下で、前記アナライト溶液から前記有機溶剤を脱溶剤するステップと；
前記の脱溶剤された概ね水性のアナライト溶液を疎水性表面上に付着させることにより、質量分析のための試料を調製するステップと；
を含む、アナライトを疎水性表面に付着させることによる質量分析用試料の調製方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５０４０９８（Ｐ２００６−５０４０９８Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４７０９８（Ｐ２００４−５４７０９８）
【出願日】平成１５年１０月２１日（２００３．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３６７７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８４０２
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月２１日（２００３．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３６７７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８４０２
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【出願人】（５０４４３８２５５）ウオーターズ・インベストメンツ・リミテツド (80)
【Ｆターム（参考）】
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