有糸分裂阻害剤耐性癌の治療における使用のためのＮ−４（−（（３−（２−アミノ−４ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン
本発明は、タキサンなどの有糸分裂阻害剤および／またはオーロラキナーゼ阻害剤を含めた他の抗癌剤を含めた化学療法剤に治療耐性になった固形腫瘍を含めた癌を治療するための化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンまたは医薬として許容できるこの塩を使用する方法に関する。本発明には、この化合物を含む医薬組成物を癌患者に投与することによってこうした治療に難治性の癌を治療する方法も含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年９月１１日に出願された米国仮出願第６１／２４１，５２７号の利益を主張し、その明細書をこれによって本明細書に参照によりその全体を組み込む。
【０００２】
本発明は、有糸分裂阻害剤および／または他の化学療法剤に治療耐性になった、固形腫瘍を含めた癌を治療するためのＮ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は人類に影響する最も広汎な疾患の１種であり、世界中で死亡の主要な原因である。合衆国だけでも、癌は死亡の第二の主要な原因であり、心疾患だけがこれを上回る。癌はしばしば、正常な細胞プロセスの調節解除または調節されない細胞増殖を特徴とする。癌性細胞に形質転換した細胞は、制御されずにおよび調節されずに増殖する傾向があり、一部の場合において癌の転移または広がりにつながる。細胞増殖の調節解除は、細胞周期の進行を制御する細胞経路に関与する１種または複数の遺伝子の改変に起因し得る。または調節解除は、細胞が細胞周期の１つの期から別の未チェック期に移行するのを可能にする１つまたは複数の細胞周期チェックポイント調節因子におけるＤＮＡ改変（これらに限定しないが、突然変異、増幅、再構成、欠失、およびエピジェネティックな遺伝子サイレンシングを含める。）に起因し得る。他には、細胞機構自体における改変が、適切に検出または修復されない有糸分裂のエラーをもたらす可能性もあり、細胞を未チェックの細胞周期に進ませる可能性もある。
【０００４】
有糸分裂は、真核細胞が複製染色体を２つの同一の娘核に分離するプロセスである。一般に、その後直ちに、核、細胞質、小器官および細胞膜を、これらの細胞成分をおよそ均等に含有する２個の娘細胞に分割する細胞質分裂が続く。有糸分裂および細胞質分裂はともに、互いに対しておよびそれらの親細胞に対して遺伝学的に同一な２個の娘細胞に母細胞を分割する、細胞周期の有糸分裂（Ｍ）期を規定する。
【０００５】
有糸分裂のプロセスは複雑であり、高度に調節されている。事象の順序は、一連の活動の完了および次の活動の開始に対応する異なる期に分かれている。これらの段階は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期および分裂終期である。有糸分裂のプロセス中、複製染色体は凝縮し、姉妹染色分体を細胞の両極に引っ張る線維に付着する。次いで細胞は細胞質分裂において分割して、２個の同一の娘細胞を生じる。有糸分裂におけるエラーは、アポトーシスを介して細胞を死滅させる可能性があり、または癌に至り得る染色体の誤分離を引き起こす可能性がある。
【０００６】
通常、ＤＮＡエラー（例えば、ＤＮＡ損傷）が検出されると、細胞周期チェックポイントが活性化される。ゲノムに対するこれらのエラーを修復することができなければ、細胞は通常アポトーシスを起こす。しかし、細胞がその細胞周期を進み、未チェックで進行することが可能であれば、その後、より多くの突然変異が時間とともに蓄積し得る。これらの遺伝子改変は自然に生じる可能性があり、最終的に、適応を介して前悪性または悪性の腫瘍特徴（例えば、制御されない増殖）を持つ細胞子孫をもたらす。
【０００７】
有糸分裂阻害剤は、微小管の機能を阻害する抗癌剤である。微小管は、紡錘体装置の形成および有糸分裂の終わりの細胞質分裂において重要な役割を果たすα−チューブリンおよびβ−チューブリンヘテロ二量体によって形成されるタンパク質ポリマーである。微小管を標的とする抗癌剤は、癌細胞の増殖に干渉するための証明された手法の代表である。
【０００８】
有糸分裂阻害剤のいくつかの部類が抗癌剤として開発された。タキサンは、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）を含める有糸分裂阻害剤の最も有名な部類である。ビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含める微小管不安定化剤の部類である。他の新たな部類として、エポシロン（イクサベピロン）が挙げられる。これらの有糸分裂阻害剤は、微小管の安定化または不安定化のいずれかによって癌細胞の増殖を防止する働きをする。微小管のこの直接阻害は、アポトーシスを介する細胞静止および細胞死、または分裂期細胞死をもたらす。パクリタキセルは、見出されたタキサン系の最初の化合物であった。パクリタキセルの構造類似体であるドセタキセルが後に見出された。パクリタキセルおよびドセタキセルは、一般に、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、食道癌、前立腺癌およびＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を含めて、様々なヒト悪性腫瘍を治療するために使用される。タキサンの主な副作用は骨髄抑制、主に好中球減少であり、一方他の副作用として、末梢性浮腫および神経毒性（末梢神経障害）が挙げられる。
【０００９】
タキサンに対する耐性は、癌治療の成功の複雑な因子であり、しばしば、ｍｄｒ−１コード遺伝子およびその産物であるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現増加を伴う。タキサンに対する耐性獲得の他の実証された機序として、チューブリン突然変異、過剰発現、増幅およびアイソタイプスイッチ）が挙げられる。α−またはβ−チューブリンにおける突然変異は、タキサンが微小管上の正確な場所に結合することを阻害し、これは、薬物の効果を無効にする。さらに、一部の耐性細胞はまた、有糸分裂の完了を促進する酵素であるオーロラキナーゼの増加も示す。
【００１０】
ビンカアルカロイド（ビンカ（Ｖｉｎｃａｓ）；植物アルカロイドとも称される）は、微小管のβ−チューブリンサブユニットに結合し、α−チューブリンサブユニットと重合するそれらの能力を遮断することで、完全な微小管を形成することができる。このことは、無傷の紡錘体の非存在下において複製染色体が分裂プレートに沿って整列することができないため、細胞周期を分裂中期において静止させ、アポトーシス細胞死をもたらす。研究は、二量体の非対称ビンカアルカロイドであるビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを同定した。これらのそれぞれが膀胱および精巣癌、カポジ肉腫、神経芽細胞腫およびホジキン病、ならびに肺癌および乳癌を含めた癌の治療に有用である。ビンカアルカロイドの主要な副作用は、患者において神経毒性および骨髄抑制を引き起こす可能性があることである。
【００１１】
ビンカアルカロイドに対する耐性は、実験モデルにおいて速やかに生じることができる。ビンカアルカロイドの抗腫瘍効果は、Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰ１などＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター媒介薬物流出トランスポーターを過剰発現する多剤耐性細胞系において遮断することができる。耐性の他の形態は、阻害剤のこれらの標的への結合を防止するβ−チューブリンにおける突然変異に由来する。
【００１２】
他の化学療法剤として、イリノテカンおよびトポテカン（Ｉ型阻害剤）ならびにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテノポシド（ＩＩ型阻害剤）などのトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡ合成に影響し、特に、ＤＮＡの転写および複製を防止することによって作用する。
【００１３】
化学療法剤のまた別の部類は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびミトキサントロンを含めて、アントラサイクリン抗生物質の部類である。現在、アントラサイクリンは、リンパ腫、白血病、ならびに子宮癌、卵巣癌、肺癌および乳癌を含めて、多数の癌を治療するために使用される。アントラサイクリンは、ＤＮＡ鎖を切断する遊離酸素ラジカルを形成し、それによってＤＮＡの合成および機能を阻害することによって作用する。アントラサイクリンの主な副作用の１つは、心筋の細胞を損傷し、心毒性に至る可能性があることである。
【００１４】
限定することなく化学療法剤および有糸分裂阻害剤を含めた抗癌剤の耐性は、癌の治療における主要な欠点となっている。こうした耐性は、多くの異なる薬物の効果に対して交差耐性になった患者をもたらした。さらに特に、多剤耐性が問題である。さらに、抗癌剤治療に対するこうした耐性は、必然的に、患者の死亡につながる。その結果として、薬剤耐性の発生は、依然として全ての抗癌剤治療法に関連する問題であり、すなわち、タキサンおよびビンカアルカロイドなどの化学療法剤ならびに規制認可のための臨床試験を受けている抗癌剤を用いる伝統的な治療を含めた癌治療に対してすでに応答しない、またはわずかな効果しかない癌の治療を特定する必要が依然としてある。
【００１５】
［図面の簡単な説明］
［図１］ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、ｐ−ヒストンＨ３ ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図２］ＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞系およびＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール耐性細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、細胞周期ＤＮＡ含量ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図３］ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１タキソール耐性細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、細胞周期ＤＮＡ含量ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図４］ＡＭＧ９００が確立したＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５異種移植片腫瘍の成長をどれほど阻害するかを例示するグラフである。
［図５］確立したＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール耐性異種移植片の成長に対するＡＭＧ９００およびタキソール治療の効果を示すグラフである。
［図６］ＨＣＴ１１６親細胞系、ＡＺＤ１１５２耐性ＨＣＴ１１６細胞系およびパクリタキセル耐性細胞系に対するＡＭＧ９００の効果を示すグラフである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、パクリタキセルおよびドセタキセルを含めたタキサン、ならびにドキソルビシンおよび癌の治療のための臨床試験において投与される他の薬剤を含めた他の化学療法剤など、標準治療である政府により認可された有糸分裂阻害剤に難治性である固形腫瘍および癌細胞を含めて、進行癌を治療するための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン（本明細書において「ＡＭＧ９００」または「該化合物」とも称する。）およびその医薬として許容できる塩の形態の使用を提供する。ＡＭＧ９００は、以下の化学構造を有する。
【００１７】
【化１】
【００１８】
本発明は、有糸分裂阻害剤を含めた化学療法剤で以前に治療された患者における癌および癌細胞の治療的、予防的、急性または慢性治療のための、この化合物またはこの医薬として許容できる塩の形態を含む医薬組成物の使用をさらに提供する。一実施形態において、本発明は、紡錘体阻害剤および抗微小管剤を含めた有糸分裂阻害剤、またはドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシドおよびミトキサントロンを含めて、癌化学療法（本明細書において化学療法剤とも称する。）に使用される他の薬物で以前に治療された対象における癌の治療方法のための医薬および医薬組成物の製造におけるＡＭＧ９００の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、対象における非小細胞肺癌、乳癌およびホルモン難治性前立腺癌を含めたタキサン耐性腫瘍型を治療する方法を提供し、該方法は、タキサン耐性腫瘍を治療するためのＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩の有効投与量を対象に投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
オーロラキナーゼ阻害剤であるＡＭＧ９００は、ヒト臨床試験において、ＡＺＤ１１５２を含めてチューブリン（パクリタキセル、イクサベピロン、およびビンカアルカロイドなど）および他の化学療法剤（ドキソルビシンなど）を標的とする現在の標準治療癌治療剤に勝る驚くべき予想外の利点を提供することが見出された。特に、ＡＭＧ９００は、例えばα−またはβ−チューブリンタンパク質におけるＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター媒介薬物流出、チューブリン遺伝子の増幅もしくは改変、または構造変化を介することを含めて様々な提唱されている機序を介して、交差耐性になった腫瘍の進行または成長の阻害または緩徐化における効力を有糸分裂阻害剤にもたらす。さらに、ＡＭＧ９００は、細胞周期のＧ２Ｍ期において増殖細胞を標的とし、したがって、微小管を標的とする抗有糸分裂薬に見られる末梢神経障害を引き起こすおそれがないものと考えられる。
【００２０】
定義
以下の定義は、さらに、本明細書に記載されている本発明の範囲を理解するのに役立つはずである。
【００２１】
「癌」および「癌性」という用語は、本明細書において使用される場合、調節されない細胞成長を通常特徴とする対象における生理学的条件を指すまたは表す。癌の例として、限定することなく、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病が挙げられる。こうした癌のより特定の例として、扁平上皮癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌腫および頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の任意の一具体的形態に限定されないが、本発明の方法は、対象において、限定することなく化学療法剤、有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンなどを含めた抗癌剤を用いる治療にある程度耐性になった癌、ならびにこうした抗癌剤を用いる治療後に再発した癌に特に有効であると思われる。
【００２２】
「化学療法剤」という用語は、本明細書において使用される場合、癌性細胞を死滅させることによる癌の治療を指す。この用語はさらに、癌を治療するために使用される抗悪性腫瘍薬、または標準化治療計画に使用されるこれらの薬物の併用を指す。化学療法剤の例として、限定することなく、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどのアルキル化試薬；ビンカアルカロイド（例として、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンが挙げられる。）およびタキサンを含めたアルカロイド（例として、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセルが挙げられる。）；イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンおよび他などの様々な抗悪性腫瘍薬が挙げられる。
【００２３】
「含む」という用語は、制限が無いことを意味し、示されている構成成分を含めるが他の成分を排除しない。
【００２４】
「多剤耐性」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる化学構造の複数の薬物に耐性、および／または異なる標的を対象とする薬物に耐性の癌細胞を指す。
【００２５】
「難治性」という用語は、本明細書で使用される場合、複数の治療治癒剤に対する耐性を含めて、治療、刺激（治療法）または療法に対する非服従、耐性または非応答性を指すと意図される。癌または腫瘍を特徴づける文脈における「難治性」は、本明細書において使用される場合、非応答性であるまたは１種もしくは複数の抗癌剤を用いる治療に対する耐性もしくは減少した応答を有する癌または腫瘍を指すと意図される。該治療は通常、長期にわたって連続的、持続的および／または反復性であり、耐性を発生させたまたは全く同じ治療に対して難治性になった癌または腫瘍をもたらす。
【００２６】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトならびに雌ウシ、ウマ、イヌおよびネコなどの動物を含めて、任意の哺乳動物を指す。したがって、本発明は、ヒト患者ならびに獣医的対象および患者に使用することができる。本発明の一実施形態において、対象はヒトである。
【００２７】
「治療効果のある」という成句は、従来の抗有糸分裂癌治療法による癌の治療を終えた癌または腫瘍の大きさもしくは重症度における低減を達成する一方、従来の抗有糸分裂癌治療法に通常伴う有害な副作用を低減または回避する化合物（ＡＭＧ９００）の量を定量化すると意図される。
【００２８】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、限定することなく、治癒療法、予防療法および防止療法を含めた治療法を指す。予防的治療は、一般に、個体において、障害の発現を一斉に防止することまたは障害の前臨床的に明らかな段階の発現を遅延させることのいずれかから構成される。
【００２９】
「医薬として許容できる塩」という用語は、アルカリ金属塩を形成するため、および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を包含する。塩の性質は、医薬として許容できれば重要ではない。該化合物の適当な医薬として許容できる酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製することができる。こうした無機酸の例として、限定することなく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸が挙げられる。有機酸の例として、限定することなく、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、複素環式、カルボンおよびスルホンの部類が挙げられ、これらの例は、ギ酸、酢酸、アジピン酸、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル、エンボン酸（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ドデシルスルホン酸、グルコヘプタン酸、グリセロホスホン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パルモン酸、ペクチン酸、過硫酸、２−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、メシル酸、ウンデカン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸である。
【００３０】
該化合物の適当な医薬として許容できる塩基付加塩として、限定することなく、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される塩などの金属塩、または第１級、第２級、第３級アミン、およびカフェイン、アルギニン、ジエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、アイスチジン、グルカミン、イソプロピルアミン、リシン、モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミンなどの環状アミンを含めた置換アミンを含めて、有機塩基から作製される塩が挙げられる。本明細書において企図される塩の全ては、例えば適切な酸または塩基と該化合物とを反応させることによって、対応する化合物から常法により調製することができる。
【００３１】
ＡＭＧ９００であるＮ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンは、ＰＣＴ公報ＷＯ２００７０８７２７６、実施例方法Ａ１またはＡ２の７０頁に記載されている手順と類似した手順であるが、１−クロロ−４−（４−メチル−２−チエニル）フタラジンを出発原料として使用し、実施例１５（５０頁）、２５（５５頁）および３０（５９頁）と併せて調製することができる。これらの手順は米国特許第７，５６０，５５１号にも記載されており、この明細書を本明細書によって全体を参照により本明細書に組み込む。具体的には、ＡＭＧ９００は下記の実施例１に記載されている通りに調製することができる。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
【化２】
【００３３】
Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン（ＡＭＧ９００）の合成
【００３４】
ステップ１：４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン
イソプロパノール浴に置いたアルゴンパージした５００ｍＬ丸底フラスコ中で、ナトリウム金属（３．４０ｇ、１４８ｍｍｏｌ）をゆっくりメタノール（１８０ｍＬ）に添加した。混合物を室温で（ＲＴ）約３０分間撹拌した。これに、グアニジン塩酸塩（１２．０ｍＬ、１８２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで３０分間撹拌し、続いて（Ｅ）−１−（２−クロロピリジン−３−イル）−３−（ジメチルアミノ）プロパ−２−エン−１−オン（１２．０ｇ、５７．０ｍｍｏｌ）を添加し、空気冷却器を取り付け、反応物を油浴に移動し、ここで約５０℃に２４時間加熱した。メタノールのおよそ半分を減圧下で蒸発させ、固体を真空下で濾過し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）およびＨ２Ｏで洗浄し、空気乾燥させることで、４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンをオフホワイトの固体として得た。ＭＳｍ／ｚ＝２０７［Ｍ＋１］１。Ｃ９Ｈ７ＣｌＮ４の算出：２０６．６３。
【００３５】
ステップ２：４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン
再密封可能なチューブに、４−アミノフェノール（１．３ｇ、１２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（７．８ｇ、２４ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１６ｍｌ、０．７５Ｍ）を添加した。混合物を１００℃に５分間加熱し、次いで、４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン（２．５ｇ、１２ｍｍｏｌ）添加し、反応混合物を１３０℃に終夜加熱した。ＬＣＭＳによって判断された完了時に、反応混合物をＲＴに冷却させ、水で希釈した。生じた沈殿物を濾過し、固体を水およびジエチルエーテルで洗浄した。固体を次いで９：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨに溶かし、溶出液として９：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨを用いてシリカゲルのパッドに通過させた。溶媒を真空中で濃縮することで、所望の生成物である４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンを生成した。ＭＳｍ／ｚ＝２８０［Ｍ＋１］＋。Ｃ１５Ｈ１３Ｎ５Ｏの算出：２７９．３０。
【００３６】
ステップ３：１−クロロ−４−（４−メチルチオフェン−２−イル）フタラジン
１，４−ジクロロフタラジン（１．４０ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）、４−メチルチオフェン−２−イルボロン酸（９９９ｍｇ、７．０３ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）（７２１ｍｇ、９８５μｍｏｌ）を、密封チューブ中に添加した。チューブをアルゴンでパージした。次いで炭酸ナトリウム（水中２．０Ｍ）（７．７４ｍｌ、１５．５ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（３５．２ｍｌ、７．０３ｍｍｏｌ）添加した。チューブを密封し、ＲＴで５分間撹拌し、予熱した油浴中に１１０℃で置いた。１時間後、ＬＣ−ＭＳは、生成物および副生成物（二重カップリング）、ならびに出発原料ジクロロフタラジンを示した。反応物をＲＴに冷却し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）の助剤を用いてセライトのパッドに通して濾過し、濃縮し、カラム上に充填した。Ｈｅｘを使用するカラムクロマトグラフィーによって生成物を精製することでトップスポットを除去し、次いで８０：２０のヘキサン：ＥｔＯＡｃで生成物を回収した。生成物１−クロロ−４−（４−メチルチオフェン−２−イル）フタラジンを黄色固体として得た。ＬＣ−ＭＳは、生成物に少量のジクロロフタラジンおよびビスカップリング副生成物が混入していることを示した。ＭＳｍ／ｚ＝２６１［Ｍ＋１］＋。Ｃ１３Ｈ９ＣｌＮ２Ｓの算出：２６０．１２。
【００３７】
ステップ４：Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン
４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンおよび１−クロロ−４−（４−メチル−２−チエニル）フタラジンに、ｔＢｕＯＨを添加した。生じた混合物を１００℃で密封チューブ中にて１６時間加熱した。反応物をジエチルエーテルおよび飽和炭酸ナトリウムで希釈し、激しく振盪した。生じた固体を濾過し、水、ジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させることで、Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンをオフホワイトの固体として得た。ＭＳｍ／ｚ＝５０４［Ｍ＋Ｈ］＋。Ｃ２８Ｎ２１Ｎ７ＯＳの算出：５０３．５８。
【００３８】
ＬＣ−ＭＳ方法：
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＸＤＢ−Ｃ８（３．５μ）逆相カラム（４．６×７５ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔモデル１１００ＬＣ−ＭＳＤシステム上にて３０℃で試料を分析した。流量は一定で、約０．７５ｍＬ／分から約１．０ｍＬ／分の範囲であった。
【００３９】
移動相は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＯＡｃ）および溶媒Ｂ（ＡｃＣＮ／０．１％ＨＯＡｃ）の混合物を使用し、勾配１０％から９０％の溶媒Ｂは９分の時間周期であった。この勾配に続き、０．５分の時間で１０％溶媒Ｂに戻り、２．５分の１０％溶媒Ｂでカラムを再平衡化（フラッシュ）した。
【００４０】
他の方法を使用することでＡＭＧ９００を合成することもできる。ＡＭＧ９００を合成するのに有用な多くの合成化学転換、ならびに保護基方法論は、当技術分野において知られている。有用な有機化学的転換の文献として、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；Ａ．ＫａｔｒｉｔｚｋｙおよびＡ．Ｐｏｚｈａｒｓｋｉ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（２００１）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（１９８４）；Ｊ．Ｓｅｙｄｅｎ−Ｐｅｎｎｅ、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｌｕｍｉｎｏ− ａｎｄ Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、（１９９７）；ならびにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ、編集、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）が挙げられる。
【００４１】
一部が以前にタキサンおよびビンカアルカロイドを含めて標準治療の有糸分裂阻害剤ならびに他の化学療法剤に暴露され、耐性を発生させた様々な細胞系（インビトロ）および多発性固形腫瘍型（インビボ）における腫瘍進行を低減または阻害する能力に関して、ＡＭＧ９００を試験した。以下の実施例および得られたデータは、パクリタキセルなどの有糸分裂阻害剤、およびドキソルビシンなど化学療法と併せて使用される他の薬物を含めて、現在の標準治療の療法に耐性の癌を含めた癌を治療するためのＡＭＧ９００の能力を例証する。特段の表示がない限り、ＡＭＧ９００の遊離塩基形態が以下の実施例で使用された。
【００４２】
［実施例２］
オーロラキナーゼＡおよびＢ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗増殖効果をインビトロにおいて３２種のヒト腫瘍細胞系を使用して評価した。表１および表２に示されている通り、ＡＭＧ９００は、固体および血液腫瘍細胞系の両方にわたって抗増殖活性を呈した。この抗増殖活性は、低ナノモル範囲（１ｎＭから５ｎＭのＥＣ５０値）におけるＡＭＧ９００の濃度で見られた。重要なことに、これらのＡＭＧ９００感受性固形腫瘍細胞系（ＨＣＴ１５、ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５、７６９ＰおよびＳＮＵ４４９）の４種は、パクリタキセルおよび他の化学療法剤に耐性である。異なる化学構造の複数の薬物に耐性および／または異なる標的を対象とした薬物に耐性の癌細胞は、「多剤耐性」と呼ばれる。癌細胞によって利用される多剤耐性（ＭＤＲ）の１つの顕著な機序は、ｍｄｒ−１遺伝子産物であるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）などのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのファミリーによって媒介される薬物流出である。例えば、ドキソルビシン耐性ヒト子宮細胞系ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５はＰ−ｇｐを発現し、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、エトポシドおよびミトキサントロンを含めて多くの化学療法剤に耐性（親系統の３０倍から１２００倍）である。ＭＤＲ発現細胞におけるＡＭＧ９００の活性をさらに調査するため、３種のタキソール耐性腫瘍細胞系を試験し、それぞれの親細胞系と比較した。図１−３および表３に示されている通り、全３種におけるＡＭＧ９００保持効力は、ＥＣ５０値が＜２ｎＭであるタキソール耐性および感受性腫瘍細胞系に匹敵した。タキソールは、親系統と比較してＰ−ｇｐ発現腫瘍亜系における効力の有意な減少（１０倍から１００倍）を示した。ともにこれらのデータは、ＡＭＧ９００がリン酸化ヒストンＨ３（オーロラキナーゼＢの基部基質）を阻害し、パクリタキセルおよび他の化学療法剤に耐性の腫瘍細胞系の細胞分裂を阻止することを表している。
【００４３】
材料および方法
試験材料
試験物質：ＡＭＧ９００
製剤：ＤＭＳＯ
供給源：Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
方法
インビトロにおける子宮、乳房および肺の組織から得られた親細胞系および薬剤耐性腫瘍細胞系に対するＡＭＧ９００の活性を評価した。細胞周期およびｐ−ヒストンＨ３評価項目をフローサイトメトリーおよびハイコンテント細胞画像化によって、それぞれ評価した。
【００４８】
ヒト細胞および細胞培養
ヒト腫瘍細胞系は、特段の表示がない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。全ての細胞は、摂氏３７度にて５％ＣＯ２の雰囲気中で保持される。乳腺腫瘍由来のＣＡＬ５１（ＡＣＣ３０２）細胞系をＤＳＭＺ（ＧｍｂＨ）から得た。大腸腫瘍由来のＨＣＴ−１１６＿ＪＨ（遺伝子型ｐ２１＋／＋）およびＨＣＴ−１１６＿ＪＨ（遺伝子型ｐ２１−／−）の細胞系を、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから許可を受けて得た。
【００４９】
【表４】
【００５０】
ＡＭＧ９００で処理された固形腫瘍細胞系のパネル：抗増殖性アッセイ（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ）
Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗ９６ウェルプレートにおいて１００μＬの適切な完全培地中に３０００細胞または５０００細胞／ウェルの密度で、細胞系成長速度（遅い対早いとして広く定義されている。）に応じて腫瘍細胞を播種した。全ての希釈をＢｉｏｍｅｋ ＦＸワークステーションを使用して行った。翌日、ＡＭＧ９００（１１点用量範囲０．１５６μΜから０．０００３μΜ）を用いて培地中最終ＤＭＳＯ濃度０．１２％で細胞を処理した。２４時間後、化合物を含有する培地を除去し、細胞を完全培地で洗浄した。細胞を次いで、新鮮な完全培地（化合物なし）１００μＬ中で４８時間インキュベートした。４８時間後、固定緩衝液１００μＬを完全培地１００μＬに添加することによって細胞を固定化した。細胞を室温で１０分間インキュベートした。固定緩衝液を吸引し、細胞を次いで洗浄緩衝液１００μＬ中にて３０分間室温で透過性にし、続いてＤＮＡ染色緩衝液１００μＬを添加し、室温にて３０分間暗所でインキュベートした。次に、細胞を洗浄緩衝液１００μＬで洗浄し、分析まで１００μＬ １×ＰＢＳ中に摂氏４度で貯蔵した。９６ウェルプレートをＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ画像化システム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）上でスキャンすることによって、細胞データを染色した。個々の細胞の核領域および強度の定量化をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＤＮＡ染料蛍光に基づいて行った。ＤＭＳＯ処理対照ウェルに基づく核領域上の閾値を、核デブリおよび倍数性細胞由来の正常な大きさの核の数を定量化するために設定した。この閾値の値を適用することで、１０×の倍率を使用して６画像視野／ウェル中の正常核の数を数え上げた。４パラメータ式を使用して用量濃度曲線およびＥＣ５０値を算出した。
【００５１】
ＡＭＧ９００で処理された血液細胞系のパネル：多パラメータ細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
３００μＬの深い９６ウェルプレートにおいて適切な完全培地１５０μＬ中に１００，０００細胞／ウェルの密度で腫瘍細胞を播種した。ＡＭＧ９００（１０点用量範囲０．１５６μΜから０．０００３μΜ）を用いて培地中０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。収集時間の２時間前、ＢｒｄＵを用いて培地中１：１００の最終濃度で細胞をパルス標識した。４８時間後、培地１００μＬを各ウェルからマルチウェルピペッターで除去した。次いで、細胞を培地２００μＬ中のＰＣＲチューブストリップに移した。細胞を２０００ｒｐｍにて１８℃で４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を次いで氷冷９０％メタノール２００μＬ中に固定化し、少なくとも２４時間−２０℃で貯蔵した後、抗体およびＤＮＡ染色した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液２００μＬで洗浄し、次いで、１００μＬの酸緩衝液を用いて室温で１時間、暗所で処理した。細胞を２回２００μＬの洗浄緩衝液で（ｐＨ試験紙で確認してｐＨが７．０まで）洗浄した。抗ＢｒｄＵ−Ａｌｅｘａ６４７（３μｇ／ｍＬ）および抗カスパーゼ３−ＦＩＴＣ（２０μＬ／ウェル）の抗体カクテルを用いて洗浄緩衝液中で２時間、室温にて暗所で細胞をインキュベートした。染色細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液２００μＬで洗浄した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて終夜４℃にて暗所で細胞を対比染色した。データを取得し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ対照および低／高薬物処理群に基づき、ＤＮＡ含量、ＢｒｄＵ、およびカスパーゼ３陽性／陰性集団に従って閾値ゲートを適用した。データは、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量、４Ｎ＋ＤＮＡ含量、ＢｒｄＵ、およびカスパーゼ３切断陽性集団の百分率として表した。４パラメータ式を使用して濃度応答曲線およびＥＣ５０値を算出した。
【００５２】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理されたＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５細胞系およびＭＥＳ−ＳＡ細胞系：ｐ−ヒストンＨ３アッセイ（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ）
ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５およびＭＥＳ−ＳＡ細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度にて９６ウェルプレート上において完全培地中に平板培養し、２４時間培養した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点濃度範囲（１．２５μΜから０．００２４μΜ）にわたり２４時間、培地中０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。細胞を洗浄し、２×ホルムアルデヒド固定緩衝液１００μＬを１０分間および室温で添加することによって固定化した。細胞を洗浄し、洗浄緩衝液１００μＬで１５分間透過性にした。細胞をｐ−ヒストンＨ３抗体（５μｇ／ｍＬ）で免疫染色し、室温で２時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液１００μＬで洗浄した。次に、ヤギ抗ウサギアレキサ４８８コンジュゲート抗体（１．５μｇ／ｍＬ）を用いて、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ＤＮＡ染料（１μｇ／ｍＬ）を補充した洗浄緩衝液中で細胞をインキュベートし、室温にて暗所で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄緩衝液１００μＬで洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）にて生物学的応用アルゴリズム（Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｖ２）を使用して９６ウェルプレートを分析した。ｐ−ヒストンＨ３＋対象物（６画像視野／ウェルと１０×目的物との総和）の百分率を使用することで、４パラメータ式を使用して濃度応答曲線およびＥＣ５０値を作成した。
【００５３】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理されたＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞系およびタキソール耐性細胞系：細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
ＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞およびＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール抵抗性細胞を、５００，０００細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートにおいて適切な完全培地２ｍＬ中に播種した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて６点濃度範囲にわたり培地中０．０５％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。２４時間後、細胞をＢｒｄＵ（１：１００の希釈）でパルス標識し、収集した。細胞を１６００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、氷冷９０％メタノール９００μＬ中に固定化し、−２０℃で貯蔵した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液２００μＬで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて終夜４℃にて暗所で染色した。データを取得し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ処理対照および低／高薬物処理群に基づき、＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量およびＳｕｂＧ１陽性集団に従って閾値ゲートを適用した。データは、＋４Ｎ ＤＮＡおよびＳｕｂＧ１陽性亜集団の百分率として表した。＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量またはＳｕｂＧ１細胞ＥＣ５０値を、４パラメータ式を使用して算出した。
【００５４】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｆ１１）−ｌｕｃ親細胞系およびタキソール耐性細胞系：細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｆ１１）−ｌｕｃ親細胞およびタキソール−抵抗性細胞を、２５０，０００細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートにおいて適切な培地１ｍＬ中に、２連で播種した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点濃度範囲にわたり０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度にてタキソールフリー培地中で細胞を処理した。２４時間後、１×トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を収集し、ＰＣＲチューブに移した。細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を氷冷９０％メタノール２００μＬ中に固定化し、−２０℃で少なくとも２４時間貯蔵した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて３０分間４℃にて暗所で染色した。データ取得の前に追加のＰＩ４００μＬを添加した。データを取得し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ対照および低／高薬物処理群に基づき、＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量に従って閾値ゲートを適用した。データは、＋４Ｎ ＤＮＡ含量陽性集団に対する対照の百分率として表した。＋４Ｎ ＤＮＡ含量細胞ＥＣ５０値を、４パラメータ式を使用して定めた。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
【表７】
【００５８】
【表８】
【００５９】
子宮腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）を用いて１０点用量範囲（０．００２４μΜから１．２５μΜ）にわたり２４時間処理した。細胞を次いで固定化し、ｐ−ヒストンＨ３抗体で染色し、ＤＮＡ染料（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ）で対比染色した。画像化ベースの分析（Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎ ＶＴｉ）を行うことで、ｐ−ヒストンＨ３陽性細胞の百分率を測定した。用量応答曲線は、ｐ−ヒストンＨ３陽性細胞に対してＤＭＳＯ処理対照（ＰＯＣ）の百分率としてプロットしたＡＭＧ９００濃度またはタキソール濃度のいずれかを表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６０】
【表９】
【００６１】
肺腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて６点用量範囲にわたり２４時間処理した。フローサイトメトリーベースの細胞周期分析を行うことで、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞またはＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率を測定した。ＡＭＧ９００に関する用量応答曲線は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。タキソールに関する用量応答曲線は、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
乳腺腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点用量範囲にわたり２４時間処理した。フローサイトメトリーベースの細胞周期分析を行うことで、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞またはＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率を測定した。ＡＭＧ９００に関する用量応答曲線は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。タキソールに関する用量応答曲線は、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６４】
［実施例３］
オーロラキナーゼ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗増殖効力を、胸腺欠損ヌードマウスにおいて成長させた乳癌、大腸癌、白血病、肺癌、膵臓癌および子宮癌のモデルを含めて、複数のヒト癌異種移植片モデルにおいてインビボで評価した。ＡＭＧ９００を経口的に、１週当たり連続して２日間３．７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、または毎日３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、腫瘍が確立した時に開始した研究の持続期間中マウスに投与した。試薬、溶液、装置、ＡＭＧ９００の製剤化、腫瘍体積測定および算出は、一般に、下記の実施例４に記載されている通りである。ＡＭＧ９００は、溶媒対照群と比較して試験した全ての異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害することが判明した（表４）。
【００６５】
【表１１】
【００６６】
ＡＭＧ９００の効果を、腫瘍異種移植片としてインビボで成長させた多剤耐性細胞系ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５で試験した。ＡＭＧ９００を経口的に、１週当たり２日間連続して１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、または毎日３．０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、研究の持続期間中マウスに投与した。投薬は、腫瘍が確立した時（腫瘍を埋込み後１０日）に開始した。ＡＭＧ９００処理は、溶媒対照群と比較して、ＡＭＧ９００の用量およびスケジュールの両方を使用して統計的に有意な腫瘍成長阻害をもたらした（図４；ｐ＜０．０００１、Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定）。匹敵する腫瘍成長阻害が、驚くべきことに、同様の処理スケジュールを使用する２つの他の薬剤耐性モデル（ＨＣＴ１５およびＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール−ｒ［耐性］）においても達成された（表４を参照のこと。）。
【００６７】
【表１２】
【００６８】
ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５多剤耐性細胞（２×１０６）を雌性胸腺欠損ヌードマウスの右側腹部における皮下に注入した。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を１０日目に開始し、この時腫瘍は約１００ｍｍ３であった。ＡＭＧ９００（ＢＩＤ）を間欠的または連続的のいずれかでマウスにＰＯ投薬した。全ての群に研究の間中、毎日栄養補給剤を供給することで、体重を維持した。データは各群に対する平均値±ＳＥＭを表している（１群当たりｎ＝１０）。Ｐ値は、ＲＭＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ事後検定によって決定されたビヒクルおよびＡＭＧ９００で治療された群間の統計的差異に対応している。矢印は投薬の開始を示す。
【００６９】
［実施例４］
オーロラキナーゼ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗腫瘍効果を、胸腺欠損ヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール耐性腫瘍異種移植片に対してインビボで評価した。マウスにＡＭＧ９００（ＢＩＤ）を間欠的または連続的のいずれかでＰＯ投薬した。マウスにパクリタキセル（タキソール）を５日／週、ＩＰ投薬した。内部Ａｍｇｅｎ化合物をこの研究における陽性対照として使用した（データ非表示）。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を１２日目に開始し、この時腫瘍は確立した。全ての群に研究の間中、毎日栄養補給剤を供給することで、体重を維持した。
【００７０】
動物および組織
種／系統：胸腺欠損ヌード
数／性別：１２５／雌性
平均重量：ランダム化当日２０−３０グラム
組織型：ＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール耐性
供給源：Ａｍｇｅｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ
対象の疾患状態：担腫瘍マウス
動物ケア：ＡＭＡＬＡＲ施設
【００７１】
試験材料
被験物質：ＡＭＧ９００
製造者：Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．
被験物質：タキソール
製造者：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ
【００７２】
重要な試薬調合
試験化合物：ＡＭＧ９００
ストック濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ
製剤：毎週、７日以内に使用
ビヒクル：２％ＨＰＭＣ／１％ＴＷ８０ ｐＨ２．２
用量（個々の体重で１０ｍＬ／ｋｇ）：用量範囲：０．２０−０．３０ｍＬ
投与の経路：ＰＯ
試験化合物：タキソール
ストック濃度：６ｍｇ／ｍＬ
製剤：Ｂｕｒｔ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｙから購入
製造者：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ’ｓ Ｓｑｕｉｂｂ
ビヒクル：生理食塩水
用量（個々の体重で１０ｍＬ／ｋｇ）：用量範囲：０．２０−０．３０ｍＬ
投与の経路：ＩＰ
【００７３】
製剤
ＡＭＧ９００（遊離塩基）を１．５ｍｇ／ｍＬおよび０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の懸濁液に製剤化した。投薬容量は１０ｍＬ／ｋｇに相当する。タキソール（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）をＢｕｒｔ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｎｅｗｂｕｒｙ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から市販で購入し、６ｍｇ／ｍＬのストック濃度から１．２５ｍｇ／ｍＬの希釈標準溶液に毎日希釈した。
【００７４】
【表１３】
【００７５】
ＡＭＧ９００に関する投薬期の持続期間は３週であり、タキソール群に関しては２週であった。腫瘍をデジタルノギスで測定し、マウスを１週当たり２回秤量した。腫瘍体積を以下の通りに算出した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝［（Ｗ２×Ｌ）／２］、ここで、幅（Ｗ）は２回測定の小さい方と定義し、長さ（Ｌ）は２回測定の大きい方と定義する。腫瘍阻害を以下の通りに算出した。最初、対照および全ての治療群に関する［初期腫瘍体積マイナス最終腫瘍体積］を得る；次に、対照腫瘍体積で除して１を減じ、次いで１００を乗じた治療腫瘍体積における変化を得る。以下の表５および図５は、腫瘍体積および腫瘍成長阻害の結果を示している。
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【００７８】
図５は、確立したＨ４６０−タキソール耐性腫瘍の成長に対するＡＭＧ９００およびタキソール治療の効果を例証している。細胞（１動物当たり２×１０６）を雌性ヌードマウスの右側腹部における皮下に注入した（１群当たりｎ＝１０）。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を腫瘍埋込み（矢印）後１２日目に開始し、この時腫瘍はおよそ１７０ｍｍ３であった。マウスに３週間毎日１回または２回、ＰＯまたはＩＰで投薬した。データは各群に関する平均値±ＳＥを表している。＊Ｐ値（非表示）は、反復測定ＳｈｅｆｆｅのＡＮＯＶＡで時間をかけてＳＴＡＴ ｖｉｅｗを使用して分析した、ビヒクルおよびＡＭＧ９００またはタキソールで治療した群間の統計的差異に対応する。凡例に列挙されているスケジュール日数は、日／週を表す。全ての群に研究の間中栄養補給剤を供給した。
【００７９】
上記の図５が例証している通り、ＡＭＧ９００を用いる担腫瘍マウスの治療は、連続的（７日間３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（６０％阻害、ｐ＝０．０００３））または間欠的（２日オン／５日オフ／週の間１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（６６％阻害、ｐ＜０．０００１））のいずれかで投与した場合、腫瘍成長を有意に阻害した。タキソールは、この実験において２回の投薬サイクル中５日／週の間ＩＰで１２．５ｍｇ／ｋｇを投薬した場合、腫瘍成長を有意に阻害することができなかった（２０％阻害、ｐ＝０．５３９９）。
【００８０】
３種のよく特徴づけられたオーロラキナーゼ阻害剤ＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０（ＭＫ−０４５７とも一般に称される。）およびＰＨＡ−７３９３５８（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）に耐性である腫瘍細胞系においてＡＭＧ９００が依然として活性であると見出したことは驚くべきであり予想外であった。これらの実験に使用された阻害剤は、文献において公表され、特徴づけられている化合物である。例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ（２００９）１８（４）３７９−３９８頁；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ、（２００９）１９（３）、３２１−３５６頁を参照されたい。進行性または転移性固形腫瘍を有する患者のＩ期におけるＤａｎｕｓｅｒｔｉｂ（ＰＨＡ−７３９３５８）の、化学構造を含める詳細な安全性、耐容性およびｐＫプロファイルは、Ｓｔｅｅｇｈｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２７、２００９で入手可能である。
【００８１】
下記に提示されているデータは、３種の上述の周知のオーロラキナーゼ阻害剤が、同じタキソール抵抗性細胞においてヒストンＨ３のリン酸化を阻害する能力と比較して、タキソール耐性細胞系におけるＡＭＧ９００の活性を示している。
【００８２】
［実施例５］
３種のオーロラキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７およびＰＨＡ−７３９３５８）を、Ｐ−ｇｐまたはＢＣＲＰ薬物流出トランスポーターのいずれかを発現するＭＤＲ腫瘍細胞系のサブセットにおいて評価した。予想外にも、ＡＭＧ９００は、Ｐ−ｇｐまたはＢＣＲＰの状態にかかわりなく、試験した全ての細胞系にわたって均一のＩＣ５０値またはＥＣ５０値（２ｎｍｏｌ／Ｌから３ｎｍｏｌ／Ｌ）で、ｐ−ヒストンＨ３を阻害し、または倍数性を誘導した。対照的に、他のオーロラキナーゼ阻害剤は、下記の表６で示されている通り、対応する感受性腫瘍細胞系と比較して、１つまたは複数のＭＤＲ細胞系において強力ではなかった。
【００８３】
材料および方法
化合物材料：以下の化合物に関する分子構造は、パブリックドメインにおいて入手可能である。パクリタキセルおよびドセタキセル、ＭＬＮ８０５４、ＭＫ−０４５７、ＡＺＤ１１５２ならびにＰＨＡ−７３９３５８。該材料は、タキサンが適用可能であるような市販供給源から購入した。
【００８４】
細胞系：腫瘍細胞系は、別段の指定がない限り、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＰＴＸおよびＮＣＩ−Ｈ４６０−ＰＴＸの細胞系は、増加する濃度のパクリタキセルの存在下で６カ月の期間をかけて細胞を成長させることによって確立した。ＨＣＴ１１６ ＡＺＤ１１５２耐性細胞系は、ＡＺＤ１１５２の存在下８０ｎｍｏｌ／Ｌで、細胞を成長させることによって確立した。
【００８５】
動物：全ての実験手順は、動物実験委員会および米国農務省の規則に従って行われた。第４週から第６週の雌性胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｉａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）は滅菌ケージ内に収容し、無菌条件下で保持した。動物を収容する実験室は、交互明暗サイクル（それぞれ１２時間）を提供し、実験動物管理公認協会規定の基準を満たした。飼料、水および栄養補給剤は、無制限に提供された。全ての薬物は、各マウスの個々の体重に基づいて投与された。
【００８６】
蛍光ベースの細胞画像化アッセイ：全てのハイコンテント細胞アッセイは、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）上で行った。腫瘍細胞系は、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７またはＰＨＡ−７３９３５８（濃度範囲は効力に基づいて変動。）で処理した。該細胞は、すでに記載した（１）の通り、抗ｐ−ヒストンＨ３ Ｓｅｒ１０抗体で細胞内染色をするために調製した。検出は、抗ウサギＩｇＧ−アレキサ−５６８抗体およびＤＡＰＩで行った。ｐ−ヒストンＨ３の細胞レベルは、陽性細胞の百分率を決定するため、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ２アルゴリズム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して分析した。画像化アッセイに関し、濃度応答曲線ならびに対応するＩＣ５０値およびＥＣ５０値は、患部細胞対ＤＭＳＯ対照の百分率を使用して算出した。
【００８７】
コロニー形成アッセイ：腫瘍細胞は、ＡＭＧ９００、パクリタキセルまたはＡＺＤ１１５２（０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ）で４８時間処理し、完全培地で２回洗浄し、細胞を１ウェル当たり５０００細胞の密度で薬物フリーの完全培地において再平板培養した。細胞は、ＤＭＳＯ対照ウェルがコンフルエントになるまで成長させた。細胞をクリスタルバイオレット染料（Ｓｉｇｍａ）で染色し、蒸留水で洗浄し、デジタルスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して画像化した。
【００８８】
４Ｎ以上のＤＮＡ含量アッセイ：腫瘍細胞は、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７またはＰＨＡ−７３９３５８（範囲濃度は効力に基づいて変動する。）で２４時間処理し、すでに記載した（１）の通りに細胞周期分析（ＤＮＡ染色のみ）用に加工した。細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。濃度応答曲線および対応するＥＣ５０値は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量の細胞対ＤＭＳＯ対照の百分率を使用して算出した。
【００８９】
Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰの細胞表面染色：Ｐ−ｇｐ（ＡＢＣＢ１）およびＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２）の細胞表面発現は、氷上にて３０分間ＦＩＴＣ−コンジュゲートＰ−ｇｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＡＰＣ−コンジュゲートＢＣＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗体で生体細胞を染色することによって決定した。一致するアイソタイプ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を対照として、ならびに生存能染色７−アミノアクチノマイシンＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することで、死細胞を除外した。細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。
【００９０】
オーロラキナーゼ遺伝子分析：全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡは、凍結ＨＣＴ１１６細胞ペレット（３種のＡＺＤ１１５２−抵抗性細胞サブクローンおよび１種の親細胞対照）から、標準的核酸抽出方法を使用して単離した。全ＲＮＡは、ｃＤＮＡを生成するのに使用した（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。全長のオーロラＡおよびＢの遺伝子転写物のＰＣＲ増幅は、Ｅｘｐａｎｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。ＰＣＲプライマー対は以下のものを含める。オーロラＡ（ＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＴＧおよびＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＣ）、オーロラＢ（ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧおよびＡＣＣＣＧＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＴＣ）。オーロラＣの７つのエクソンは、上記したのと同じＰＣＲキットを使用してゲノムＤＮＡから、５’および３’隣接イントロン（（ＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＧおよびＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ）、（ＡＡＧＧＧＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣおよびＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＣ）、（ＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧおよびＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣ）、（ＧＧＴＡＡＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＧおよびＣＡＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＧ）、（ＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣおよびＡＧＡＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＣ）、および（ＡＣＡＧＴＧＡＧＡＣＴＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧおよびＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧ））に基づく７つのプライマーセットを使用して増幅した。ＰＣＲ ＤＮＡ生成物は、製造者の推奨プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした。該オーロラＡ、ＢおよびＣの遺伝子生成物を含有する精製プラスミドは、隣接するベクタープライマーを使用してジデオキシサイクル配列決定にかけた。配列決定反応物は３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析し、出力配列はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して分析した。
【００９１】
表６は、ＡＭＧ９００が多剤耐性腫瘍細胞系全体にわたる均一な効力を呈することを例証している。
【００９２】
【表１６】
【００９３】
同様の実験を、下記表６−Ｂに示されている追加の細胞系で行った。
【００９４】
【表１７】
【００９５】
［実施例６］
さらに、ＡＭＧ９００を、オーロラキナーゼＢの選択的阻害剤であるＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させたＨＣＴ−１１６細胞に関してインビボで評価した。この実験は、オーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性の可能な代替機序も一部明らかにした。したがって、ＨＣＴ１１６細胞をＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させた。ＡＭＧ９００の活性を次いで、ＨＣＴ１１６親細胞系およびＡＺＤ１１５２耐性細胞系において評価した。
【００９６】
ＡＭＧ９００は、驚くべきことに、倍数性を誘発し、ＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させたＨＣＴ１１６亜系のコロニー形成を阻害することが見出された。ＡＭＧ９００に関する細胞４Ｎ以上のＤＮＡ含量ＥＣ５０値は、それぞれ、ＡＺＤ１１５２の３４ｎｍｏｌ／Ｌおよび６７２ｎｍｏｌ／Ｌと比較して、２ｎｍｏｌ／Ｌおよび５ｎｍｏｌ／Ｌであった（図６−Ａ）。ＡＭＧ９００は両方のＨＣＴ１１６細胞系において濃度≧５ｎｍｏｌ／Ｌでコロニー形成を阻害したが、一方変異亜系はＡＺＤ１１５２に対して５０ｎｍｏｌ／Ｌで非感受性であった（図６−Ｂ）。ＨＣＴ１１６細胞系の両方がパクリタキセルに対して同等に感受性であり、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現に陰性であった（図６−Ｃ）。興味深いことに、ＨＣＴ１１６変異亜系はオーロラＢ遺伝子（ＴＧＧ→ＴＴＧ；Ｗ２２１Ｌ）の１つの対立遺伝子においてミスセンス変異を有しているが、一方突然変異はオーロラＡおよびＣ遺伝子において全く検出されなかった。これらの結果は、ＡＭＧ９００が、ＡＺＤ１１５２に耐性である腫瘍細胞、およびさらに特に、ＡＺＤ１１５２に耐性の原因であり得るオーロラＢにおけるヘテロ接合変異を保有する腫瘍細胞において活性を維持することを示唆している。したがって、予想外に肯定的データが、ＡＺＤ１１５２に耐性であった腫瘍細胞を処理するのに依然として効果的であるというＭＡＧ９００の驚くべき能力を示している。
【００９７】
【表１８】
【００９８】
方法
図６−Ａ：ＨＣＴ１１６細胞系は、増加する濃度のＡＭＧ９００またはＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。フローサイトメトリーを使用することで、ＤＭＳＯ処理対照（ＰＯＣ）の百分率として表された４Ｎ以上のＤＮＡ含量で細胞の蓄積を査定した。濃度応答曲線および算出ＥＣ５０値は、２つの独立した実験から決定した（棒線、±ＳＤ）。
【００９９】
図６−Ｂ：コロニー形成アッセイは、ＨＣＴ１１６細胞系（親およびＡＺＤ１１５２耐性）で行った。細胞は、ＤＭＳＯ、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２またはパクリタキセルで表示濃度にて４８時間処理し、阻害剤のない完全培地において再平板培養した。ＤＭＳＯ処理細胞がコンフルエンスに達した後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、画像化した（二通りのウェル）。
【０１００】
図６−Ｃ：フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＰ−ｇｐおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＢＣＲＰの抗体で共染色したＨＣＴ１１６細胞系（親およびＡＺＤ１１５２耐性）の細胞表面におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現の程度は、フローサイトメトリーによって評価および分析した。アイソタイプ対照を各細胞系に使用することで、バックグラウンドの蛍光を確立した。ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５およびＲＰＭＩ８２２６の細胞系を、それぞれＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現の陽性対照として使用した。
【０１０１】
動物：
５−６週齢の雌性胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を入手し、滅菌ケージに入れて収容した。逆浸透水およびオートクレーブした飼料を無制限に供給した。全ての動物研究は、国際ＩＡＣＵＣプロトコル下で行い、全てのＡＡＡＬＡＣ規定を満たした。
【０１０２】
薬力学アッセイ（ホスホ−ヒストンＨ３の検出）：
確立したヒトＨＣＴ１１６またはＣｏｌｏ２０５の異種移植片腫瘍を持つマウスに、単一経口用量の対照（ビヒクル単独）またはＡＭＧ９００を表示投与量で投与した（１群当たりｎ＝３匹の動物）。３時間または６時間で、腫瘍、骨髄または皮膚組織を薬力学評価（ｐ−ヒストンＨ３レベル）用に回収した。血漿も薬物動態分析用に回収した。
【０１０３】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）：腫瘍を単一細胞懸濁液中に分離し、９０％メタノール中に−２０℃で少なくとも２４時間固定化した。細胞を次いで抗ｐ−ヒストンＨ３（ｓｅｒ−１０）および抗サイトケラチンの抗体で染色し、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。データは、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＬＳＲＩＩフローサイトメーターで取得した。細胞周期のＧ２Ｍ期における骨髄およびサイトケラチン陽性腫瘍の細胞は、ｐ−ヒストンＨ３に関して評価した。腫瘍および骨髄の細胞を、ｐ−ヒストンＨ３ベースライン対照として役立たせるため、ビヒクル処理マウスから回収した。統計的有意性は、一方向ＡＮＯＶＡ分析によって決定した。
【０１０４】
レーザー走査型サイトメトリー（ＬＳＣ）：ＦＦＰＥ組織試料（皮膚および腫瘍）由来の三通りの切片に、抗ｐ−ヒストンＨ３抗体、続いてアレキサ６３３コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して染色した。ＤＮＡ染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含めて、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止剤をスライドに乗せた。４０×対物（０．５μの画素分解能）を使用するＬＳＣに画像を取り込んだ。ｐ−ヒストンＨ３の事象数は、定義されている赤色蛍光閾値に基づいて決定した。２０μｍ２より大きい事象のみを計数した。輪郭事象を画像ギャラリーに再配置することで、分割の精度を検証した。データは、Ｄｕｎｎｅｔｔ補正を適用するＳＡＳ Ｖ９．３を使用して分析した。全ての統計試験は、アルファ＝０．０５の有意水準で評価した。
【０１０５】
細針吸引液（ＦＮＡ）：腫瘍吸引液は、所定および一貫したパターン（３×）の腫瘍を囲む皮膚における小さい切込みを介して２５規格針を挿入することによって回収し、次いで、２％パラホルムアルデヒド中に排出した。細胞を顕微鏡スライド上でサイトスピンし、ＥｐＣＡＭ（上皮性腫瘍マーカー、アレキサフルオル４８８）およびｐＨＨ３（有糸分裂マーカー、アレキサフルオル６４７）に特異的な抗体で染色し、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ含量）で対比染色した。ｉＣｙｔｅＬＳＣ（レーザー４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６３３ｎｍ、ＰＭＴフィルター：４５０／４０、５３０／３０、６５０／ＬＰ）を使用することで、４０ｘ倍率視野画像を取り込み、ＥｐＣＡＭ、ｐＨＨ３およびＤＮＡ含量を定量化した。集団の統合性は、細胞の画像をギャラリーに再配置することによって検証した。Ｇ２ＭにおけるＥｐＣＡＭ、ｐＨＨ３陽性細胞の数が報告された。データは、平均値＋／−平均値（ＳＥＭ）の標準誤差として表した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ Ｄｕｎｎｅｔｔ事後分析によって決定した。
【０１０６】
血漿におけるＡＭＧ９００濃度（薬物動態アッセイ）：
血漿試料（５０μＬ）を溶媒混合物（９０％メタノール、０．０１％トリフルオロ酢酸との１０％水）の添加によって抽出することで、分析物および沈殿物の血漿タンパク質を単離した。抽出試料におけるＡＭＧ９００濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、逆相液体クロマトグラフィーを使用してバリアンＰｕｒｓｕｉｔ ＰＦＰ分析用カラム（２．０×３０ｍｍ、５ミクロン）上にて、水中０．１％ギ酸（移動相Ａ）および０．１％ギ酸とのアセトニトリル（移動相Ｂ）で決定した。
【０１０７】
異種移植片モデル：
２×１０６ヒトＨＣＴ１１６大腸腫瘍細胞をマウスに皮下注入した。腫瘍が確立した時（およそ２００ｍｍ３）、マウスを実験治療群にランダム化し（ｎ＝１０）、実験の持続期間中、毎日１．５ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇ、または間欠的に３．７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ９００で経口的に治療した。マウスに栄養補給剤を連日供給した。腫瘍体積および体重は、それぞれノギスおよび分析用デジタルスケールを使用して１週当たり２回報告した。腫瘍データは平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭによって表した。腫瘍成長阻害の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（ＲＭＡＮＯＶＡ）、続いてＳｃｈｅｆｆｅ事後分析の反復測定によって決定した。
【０１０８】
［実施例７］
腫瘍成長に対するＡＭＧ９００のインビボ効果を、３種のＭＤＲ異種移植片モデルを含めて、５種の異なる腫瘍型（乳房、大腸、肺、膵臓および子宮）由来のヒト異種移植片のパネルにおいて評価した。確立腫瘍を有するマウスにＡＭＧ９００を１５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｄ．にて１週当たり２連続日で３週間、または３ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｄ．にて毎日３週間、経口的に投与した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）の最大百分率を下記の表７において、各異種移植片モデルに関して報告する。ＴＧＩの百分率は、研究期間中の、ビヒクル処理対照およびＡＭＧ９００処理の腫瘍体積における変化の間の差異として算出した。ビヒクル処理対照と比較した統計的に有意な腫瘍成長阻害をＲＭＡＮＯＶＡ、続いてＳｃｈｅｆｆｅまたはＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって決定し、アスタリスクによって示す（＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００５）。
【０１０９】
ＡＭＧ９００は、ビヒクル処理対照群と比較して全ての９異種移植片モデルにおいて有意な抗腫瘍活性（５０％から９７％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を呈した。重要なことに、ＡＭＧ９００は、それぞれの最大耐量で投与されたドセタキセルまたはパクリタキセルのいずれかに耐性であったＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５（８４％ＴＧＩ、Ｐ＜０．０００１）およびＮＣＩ−Ｈ４６０−ＰＴＸ（６６％ＴＧＩ、Ｐ＜０．０００１）の異種移植片モデルにおいて活性であった。
【０１１０】
したがって、ＡＭＧ９００は、多剤耐性モデルおよび標準治療有糸分裂阻害剤を含めて、インビボにおける複数のヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する。具体的に、データは、ＡＭＧ９００が驚くべきことにＨＣＴ１１６腫瘍におけるオーロラＢの活性を阻害し、多様な腫瘍型を代表する複数の異種移植片の成長を抑制することを示している。
【０１１１】
【表１９】
【０１１２】
適応
腫瘍がオーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性を発生させる機序は、異なる薬剤に対して異なる可能性がある。癌表現型を促進する分子力の明快な理解が、所与の治療法に対する特定可能な遺伝子的または後成的感受性を活用できる分子標的の医薬または治療法の基礎をもたらす一方で、治療法に対する耐性の遺伝的基礎を理解することも重要である。この遺伝的理解は、予期される患者集団を層別化する追加のフィルターをもたらすことができる。例えば、公表されている遺伝的証拠は、臨床評価を現在受けているオーロラキナーゼ阻害剤ＡＺＤ１１５２、および潜在的に別の臨床化合物ＶＸ−６８０が、ＭＤＲ１またはＢＣＲＰを過剰発現する腫瘍細胞において比較的効果がない可能性があると示唆している。ＤＮＡ修復欠陥結腸癌系ＨＣＴ１１６の選択中に出現するオーロラＢキナーゼドメイン変異は、耐性をもたらす可能性がある。これらの触媒ドメイン変異は、細胞をＡＺＤ１１５２およびＶＸ−６８０に耐性の状態にするのに十分であることも判明し、これらの薬剤に対する耐性がＭＤＲから独立して生じ得ることを示した。Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ、（２００９）９、９０−１０２頁。
【０１１３】
本発明は、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）およびビンカアルカロイドなどの有糸分裂阻害剤を含めた伝統的標準治療化学療法剤に難治性であった癌を治療するための能力を保有する、オーロラキナーゼ阻害剤である化合物ＡＭＧ９００を提供する。さらに、ＡＭＧ９００は、限定しないがＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０およびＰＨＡ−７３９３５８を含めた薬剤を阻害する他のオーロラキナーゼに耐性である癌を治療するための能力を有する。一般に、こうした腫瘍は、抗癌剤を用いる以前の治療および／または延長した治療の結果として耐性を発生させる。すなわち、本発明の一実施形態において、対象における癌を治療する方法が提供され、該方法は、癌を抗癌剤で以前に治療された対象に、有効投与量の化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンを投与することを含む。別の実施形態において、抗癌剤は化学療法剤である。別の実施形態において、化学療法剤は有糸分裂阻害剤またはアントラサイクリンである。また別の実施形態において、化学療法剤は、タキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびミトキサントロンからなる群から選択される薬剤である。また別の実施形態において、抗癌剤は、ＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である。
【０１１４】
このように、ＡＭＧ９００は、タキサン標準治療の療法で以前に治療された制御されない細胞成長および異常細胞周期の調節を含めて、細胞増殖障害を治療するのに使用することができる。
【０１１５】
この目的のため、ＡＭＧ９００は、再発したまたは難治性になった、限定しないが、例えば様々な固体および血液由来の腫瘍を含めた癌、限定することなく膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含める。）、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌および皮膚癌（扁平上皮癌腫を含める。）を含めた癌腫；リンパ系の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含める。）；骨髄系の造血器腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬおよびＣＭＬ）、脊髄形成異常性症候群および前骨髄球性白血病を含める。）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫および横紋筋肉腫、ならびに他の肉腫を含める、例えば軟組織および骨）；中枢および末梢神経系の腫瘍（星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫を含める。）；ならびに他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌およびカポジ肉腫を含める。）などの予防または治療に有用である。ホルモンなどでの抗癌治療に難治性になった前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、胆管腺癌または他の癌型などの癌も、ＡＭＧ９００で治療することができる。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、対象における子宮癌、乳癌、非小細胞肺癌を含めた肺癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌、腎臓癌、肝臓癌、前骨髄球性白血病を含めた白血病、慢性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌ならびに骨髄癌からなる群から選択される１種または複数の癌を治療する方法を提供し、該方法は、対象に有効投与量のＡＭＧ９００を投与することを含み、ここで、対象の癌は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシドおよびミトキサントロンからなる群から選択される１種または複数の化学療法剤で以前に治療され、これらに難治性になったものである。別の実施形態において、本発明は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌および前立腺癌、またはリンパ腫もしくは白血病からなる群から選択される１種または複数の癌を治療する方法を提供する。ＡＭＧ９００は、限定することなく膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、非小細胞肺、頭頸部、食道、胃、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および前立腺の腫瘍を含めて、進行性固形腫瘍を治療するのにも有用である。
【０１１７】
本発明は、固形腫瘍、肉腫（特にユーイング肉腫および骨肉腫）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、白血病およびリンパ腫を含めた造血器悪性腫瘍、腫瘍誘発胸膜または心膜液貯留、ならびに悪性腹水の治療のための方法も提供する。
【０１１８】
ヒト治療に有用である上に、該化合物は、コンパニオンアニマル、哺乳動物を含めた外来動物および家畜、ならびにげっ歯類などの獣医治療にも有用である。例えば、ウマ、イヌおよびネコを含めて動物は、標準治療癌化学療法の治療に難治性の癌のためにＡＭＧ９００で同様に治療することができる。
【０１１９】
製剤
ＡＭＧ９００は、１種または複数の無毒性の医薬として許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバント（本明細書において「賦形剤」材料として集合的に称される。）を伴って、化合物（本発明の医薬活性成分またはＡＰＩである。）Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンを含む医薬組成物として癌対象に投与することができる。ＡＭＧ９００またはこの医薬として許容できる塩形態は、製薬の従来の方法に従って加工することで、ヒトおよび他の哺乳動物を含めて患者に投与するための薬用組成物および医薬組成物を生成することができる。
【０１２０】
該医薬組成物は、任意の適当な経路によって、こうした経路に適合し、目的とする難治性癌治療に有効な用量で対象に投与することができる。該組成物またはＡＰＩは、例えば、従来の医薬として許容できる担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位製剤で、経口的に、粘膜に、局所的に、直腸に、吸入スプレーなどによって肺に、または血管内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、胸骨内および注入技術を含めて腸管外に、投与することができる。
【０１２１】
経口投与のため、該医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形態であってよい。該医薬組成物は、好ましくは、特定の量の活性成分を含有する投与単位の形態で作製される。こうした投与単位の例は、錠剤またはカプセルである。例えば、これらは、約１ｍｇから２０００ｍｇ、および通常約１ｍｇから５００ｍｇの活性成分量を含有することができる。ヒトまたは他の哺乳動物のための適当な日用量は、患者の状態および他の因子に依存して広範に変動してよいが、また、日常的方法および慣例を使用して決定することができる。
【０１２２】
投与されるＡＰＩ（ＡＭＧ９００）の量および難治性癌状態を治療するための投与計画は、対象の年齢、重量、性別および病状、疾患の型、癌の重症度、投与の経路および頻度、ならびにＡＭＧ９００または特異的塩形態を含めたこの特定の形態の物性および化学的性質を含めて、様々な因子に依存する。したがって、投与計画は変動してよい。体重につき約０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、有利には約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間、より有利には約０．１ｍｇ／ｋｇおよび約３０ｍｇ／ｋｇ、ならびにまたさらに有利には約０．１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの間の日用量が適切であり得る。一実施形態において、本発明は対象における癌を治療する方法を提供し、該方法は、ＡＭＧ９００また医薬として許容できるこの塩を約０．５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの範囲における有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は有糸分裂阻害剤を用いる治療に難治性である。別の実施形態において、本発明は、対象における癌を治療する方法を提供し、該方法は、ＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩を約１．０ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲における有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は、有糸分裂阻害剤を含めて標準治療化学療法剤を用いる治療に難治性である。また別の実施形態において、本発明は、対象における癌を治療する方法を提供し、該方法はＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩を約３．０ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は有糸分裂阻害剤を用いる治療に難治性である。日用量は、１日当たり１回から４回の用量で投与することができる。
【０１２３】
治療的目的で、ＡＭＧ９００は、指示される投与経路に適切な１種または複数のアジュバントまたは「賦形剤」と併用できる。用量ごとに投与される場合、ＡＭＧ９００は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンならびに／またはポリビニルアルコールと添加混合することで、最終製剤を形成することができる。例えば、ＡＭＧ９００および賦形剤は、簡便な投与のための既知および容認されている方法によって錠剤またはカプセル化することができる。適当な製剤の例として、限定することなく、丸薬、錠剤、軟および硬（シェル）ゲルカプセル、トローチ、経口的に溶解可能な形態、ならびにこれらの遅延または制御放出製剤が挙げられる。特に、カプセルまたは錠剤製剤は、ＡＰＩとの分散液として、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの１種または複数の制御放出薬剤を含有することができる。
【０１２４】
乾癬および他の皮膚状態の場合、ＡＭＧ９００の局所調製物を患部に１日２回から４回適用することが好ましいことがある。局所投与に適当な製剤として、皮膚を介する浸透に適当な液状または半液状製剤（例えば、リニメント剤、ローション、軟膏剤、クリーム、ペースト剤および懸濁液など）、および眼、耳または鼻への投与に適当な点滴剤が挙げられる。該活性成分の適当な局所用量は、１日１回から４回、好ましくは１回または２回で投与される０．１ｍｇから１５０ｍｇである。局所投与のため、ＡＰＩは、０．００１％ｗ／ｗから１０％ｗ／ｗ、例えば１重量％から２重量％の該製剤を含むことができるが、１０％ｗ／ｗもの量、しかし好ましくは５％ｗ／ｗ未満、およびより好ましくは０．１％から１％の該製剤を含むことができる。
【０１２５】
軟膏中に製剤化される場合、ＡＭＧ９００は、パラフィン系または水混和性のいずれかの軟膏基剤とともに用いることができる。別法として、水中油型クリーム基剤とともにクリーム中に製剤化することもできる。所望であれば、クリーム基剤の水性相は、例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物などの多価アルコールを少なくとも３０％ｗ／ｗ含めることができる。局所製剤は、望ましくは、皮膚または他の患部を介する活性成分の吸収または浸透を増強する化合物を含めることができる。こうした皮膚透過増強剤の例として、ＤＭＳＯおよび関連類似体が挙げられる。
【０１２６】
ＡＭＧ９００は、経皮的装置によって投与することもできる。好ましくは、経皮投与は、リザーバーおよび多孔質膜型、または固体マトリックス種のいずれかのパッチを使用して達成される。いずれの場合においても、ＡＭＧ９００は、リザーバーまたはマイクロカプセルから膜を介して、レシピエントの皮膚または粘膜と接触する活性薬剤透過性接着剤に連続的に送達される。ＡＭＧ９００が皮膚を介して吸収される場合、制御および所定の流量のＡＭＧ９００がレシピエントに投与される。マイクロカプセルの場合、カプセル化剤は膜として機能することもできる。
【０１２７】
エマルジョンの油性相は、既知の方法において既知成分から構成することができる。該相が単に乳化剤を含むことができる一方、少なくとも１種の乳化剤と、脂肪もしくは油または脂肪および油の両方との混合物を含むことができる。好ましくは、親水性の乳化剤は、安定剤として作用する親油性の乳化剤と一緒に含まれる。油および脂肪の両方を含めるのも好ましい。一緒になって、乳化剤は安定剤の有無にかかわらず、いわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは油および脂肪と一緒になって、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を形成する。該製剤における使用に適当な乳化剤およびエマルジョン安定剤として、例えば、ツイーン６０、スパン８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ジステアリン酸グリセリルを単独もしくはワックスとともに、または他の当技術分野においてよく知られている材料が挙げられる。
【０１２８】
製剤のための適当な油または脂肪の選択は、医薬エマルジョン製剤に使用される可能性がある大部分の油におけるＡＰＩの溶解性が非常に低いので、所望の化粧品特性を達成することに基づいている。したがって、クリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏れを回避するための適当な粘稠性を持つ非油脂性、非染色性および洗浄可能な生成物であるべきである。ジ−イソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、２−エチルヘキシルパルミテートなどの直鎖もしくは分岐鎖の一塩基性もしくは二塩基性アルキルエステル、または分岐鎖エステルのブレンドを使用することができる。これらは、必要な特性に依存して単独または併用できる。別法として、白色軟パラフィンおよび／もしくは流動パラフィンまたは他の鉱油などの高融点脂質を使用することができる。
【０１２９】
眼への局所投与に適当な製剤として、活性成分が適当な担体、特にＡＭＧ９００のための水性溶媒中に溶解または懸濁されている点眼薬も挙げられる。ＡＭＧ９００は、好ましくは、こうした製剤中に０．５％から２０％、有利には０．５％から１０％、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【０１３０】
非経口投与の製剤は、水性または非水性の等張滅菌注入溶液または懸濁液の形態であってよい。これらの溶液および懸濁液は、経口投与用製剤における使用のために記述した１種もしくは複数の担体もしくは希釈剤を使用して、または他の適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を使用することによって、滅菌粉末または顆粒から調製することができる。例えばＡＭＧ９００は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、トラガカントガム、および／または様々な緩衝剤中に溶解することができる。他のアジュバントおよび投与方法は、製薬技術においてよくおよび広範に知られている。ＡＭＧ９００は、生理食塩水、デキストロースまたは水を含めて適当な担体、またはシクロデキストリン（すなわち、Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、共溶媒可溶化物（すなわち、プロピレングリコール）またはミセル可溶化物（すなわち、ツイーン８０）との組成物として注入することによって投与することもできる。
【０１３１】
滅菌の注入可能製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。用いてよい許容できるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、従来より、滅菌固定油は溶媒または懸濁媒体として用いられている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含めて、任意の無刺激性固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注入可能物の調製に使用される。
【０１３２】
肺投与のため、該医薬組成物は、エアゾールの形態または乾燥粉末エアゾールを含めた吸入器で投与することができる。
【０１３３】
該薬物の直腸投与用坐剤は、常温では固体であるが直腸温では液体であるために直腸において融解し、薬物を放出するカカオ脂およびポリエチレングリコールなどの適当な非刺激性賦形剤と該薬物とを混合することによって調製することができる。
【０１３４】
該医薬組成物は、滅菌などの従来の製薬作業を行うことができ、および／または保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などの従来のアジュバントを含有することができる。錠剤および丸薬は、追加として、腸溶コーティング剤で調製することができる。こうした組成物は、湿潤、甘味料、香料および芳香剤などのアジュバントを含むこともできる。
【０１３５】
併用
ＡＭＧ９００が唯一の活性医薬品として投薬または投与することができる一方、１種または複数の化学療法剤および／または有糸分裂阻害剤と併用することもできる。併用投与される場合、ＡＭＧ９００は、同時または逐次に異なる時間で投与される分離した組成物として製剤化することができ、またはＡＭＧ９００は単一組成物として生成することができる。
【０１３６】
「同時療法」（または「併用療法」）という成句は、本発明のＡＭＧ９００および別の化学療法剤の使用を定義する際、薬剤併用の有益な効果をもたらすレジメンにおいて逐次的にそれぞれの薬剤の投与を包含することが意図され、これらの活性薬剤の固定比率を有する単一カプセル、またはそれぞれの薬剤の複数の分離したカプセルなどにおける、実質的に同時のこれらの薬剤の同時投与を包含することが同様に意図される。
【０１３７】
詳細には、ＡＭＧ９００の投与は、癌の予防または治療において当業者に知られている抗有糸分裂の治療法を含めて、追加の化学療法剤と併用し得る。本発明は投与の順序において限定されず、すなわち、ＡＭＧ９００は、既知の抗癌剤または有糸分裂阻害剤の投与前、同時または投与後のいずれかで投与することができる。
【０１３８】
前述は本発明の例証に過ぎず、開示されている使用に本発明を限定することを意図するものではない。当業者にとって常法である変形形態および変化形態は、添付の請求項において定義されている本発明の範囲および性質の範囲内であることが意図される。全ての記述されている文献、特許、出願および公開は、本明細書に書かれている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年９月１１日に出願された米国仮出願第６１／２４１，５２７号の利益を主張し、その明細書をこれによって本明細書に参照によりその全体を組み込む。
【０００２】
本発明は、有糸分裂阻害剤および／または他の化学療法剤に治療耐性になった、固形腫瘍を含めた癌を治療するためのＮ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は人類に影響する最も広汎な疾患の１種であり、世界中で死亡の主要な原因である。合衆国だけでも、癌は死亡の第二の主要な原因であり、心疾患だけがこれを上回る。癌はしばしば、正常な細胞プロセスの調節解除または調節されない細胞増殖を特徴とする。癌性細胞に形質転換した細胞は、制御されずにおよび調節されずに増殖する傾向があり、一部の場合において癌の転移または広がりにつながる。細胞増殖の調節解除は、細胞周期の進行を制御する細胞経路に関与する１種または複数の遺伝子の改変に起因し得る。または調節解除は、細胞が細胞周期の１つの期から別の未チェック期に移行するのを可能にする１つまたは複数の細胞周期チェックポイント調節因子におけるＤＮＡ改変（これらに限定しないが、突然変異、増幅、再構成、欠失、およびエピジェネティックな遺伝子サイレンシングを含める。）に起因し得る。他には、細胞機構自体における改変が、適切に検出または修復されない有糸分裂のエラーをもたらす可能性もあり、細胞を未チェックの細胞周期に進ませる可能性もある。
【０００４】
有糸分裂は、真核細胞が複製染色体を２つの同一の娘核に分離するプロセスである。一般に、その後直ちに、核、細胞質、小器官および細胞膜を、これらの細胞成分をおよそ均等に含有する２個の娘細胞に分割する細胞質分裂が続く。有糸分裂および細胞質分裂はともに、互いに対しておよびそれらの親細胞に対して遺伝学的に同一な２個の娘細胞に母細胞を分割する、細胞周期の有糸分裂（Ｍ）期を規定する。
【０００５】
有糸分裂のプロセスは複雑であり、高度に調節されている。事象の順序は、一連の活動の完了および次の活動の開始に対応する異なる期に分かれている。これらの段階は、分裂前期、分裂前中期、分裂中期、分裂後期および分裂終期である。有糸分裂のプロセス中、複製染色体は凝縮し、姉妹染色分体を細胞の両極に引っ張る線維に付着する。次いで細胞は細胞質分裂において分割して、２個の同一の娘細胞を生じる。有糸分裂におけるエラーは、アポトーシスを介して細胞を死滅させる可能性があり、または癌に至り得る染色体の誤分離を引き起こす可能性がある。
【０００６】
通常、ＤＮＡエラー（例えば、ＤＮＡ損傷）が検出されると、細胞周期チェックポイントが活性化される。ゲノムに対するこれらのエラーを修復することができなければ、細胞は通常アポトーシスを起こす。しかし、細胞がその細胞周期を進み、未チェックで進行することが可能であれば、その後、より多くの突然変異が時間とともに蓄積し得る。これらの遺伝子改変は自然に生じる可能性があり、最終的に、適応を介して前悪性または悪性の腫瘍特徴（例えば、制御されない増殖）を持つ細胞子孫をもたらす。
【０００７】
有糸分裂阻害剤は、微小管の機能を阻害する抗癌剤である。微小管は、紡錘体装置の形成および有糸分裂の終わりの細胞質分裂において重要な役割を果たすα−チューブリンおよびβ−チューブリンヘテロ二量体によって形成されるタンパク質ポリマーである。微小管を標的とする抗癌剤は、癌細胞の増殖に干渉するための証明された手法の代表である。
【０００８】
有糸分裂阻害剤のいくつかの部類が抗癌剤として開発された。タキサンは、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）を含める有糸分裂阻害剤の最も有名な部類である。ビンカアルカロイドは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含める微小管不安定化剤の部類である。他の新たな部類として、エポシロン（イクサベピロン）が挙げられる。これらの有糸分裂阻害剤は、微小管の安定化または不安定化のいずれかによって癌細胞の増殖を防止する働きをする。微小管のこの直接阻害は、アポトーシスを介する細胞静止および細胞死、または分裂期細胞死をもたらす。パクリタキセルは、見出されたタキサン系の最初の化合物であった。パクリタキセルの構造類似体であるドセタキセルが後に見出された。パクリタキセルおよびドセタキセルは、一般に、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、食道癌、前立腺癌およびＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を含めて、様々なヒト悪性腫瘍を治療するために使用される。タキサンの主な副作用は骨髄抑制、主に好中球減少であり、一方他の副作用として、末梢性浮腫および神経毒性（末梢神経障害）が挙げられる。
【０００９】
タキサンに対する耐性は、癌治療の成功の複雑な因子であり、しばしば、ｍｄｒ−１コード遺伝子およびその産物であるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現増加を伴う。タキサンに対する耐性獲得の他の実証された機序として、チューブリン突然変異、過剰発現、増幅およびアイソタイプスイッチ）が挙げられる。α−またはβ−チューブリンにおける突然変異は、タキサンが微小管上の正確な場所に結合することを阻害し、これは、薬物の効果を無効にする。さらに、一部の耐性細胞はまた、有糸分裂の完了を促進する酵素であるオーロラキナーゼの増加も示す。
【００１０】
ビンカアルカロイド（ビンカ（Ｖｉｎｃａｓ）；植物アルカロイドとも称される）は、微小管のβ−チューブリンサブユニットに結合し、α−チューブリンサブユニットと重合するそれらの能力を遮断することで、完全な微小管を形成することができる。このことは、無傷の紡錘体の非存在下において複製染色体が分裂プレートに沿って整列することができないため、細胞周期を分裂中期において静止させ、アポトーシス細胞死をもたらす。研究は、二量体の非対称ビンカアルカロイドであるビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを同定した。これらのそれぞれが膀胱および精巣癌、カポジ肉腫、神経芽細胞腫およびホジキン病、ならびに肺癌および乳癌を含めた癌の治療に有用である。ビンカアルカロイドの主要な副作用は、患者において神経毒性および骨髄抑制を引き起こす可能性があることである。
【００１１】
ビンカアルカロイドに対する耐性は、実験モデルにおいて速やかに生じることができる。ビンカアルカロイドの抗腫瘍効果は、Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰ１などＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター媒介薬物流出トランスポーターを過剰発現する多剤耐性細胞系において遮断することができる。耐性の他の形態は、阻害剤のこれらの標的への結合を防止するβ−チューブリンにおける突然変異に由来する。
【００１２】
他の化学療法剤として、イリノテカンおよびトポテカン（Ｉ型阻害剤）ならびにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテノポシド（ＩＩ型阻害剤）などのトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡ合成に影響し、特に、ＤＮＡの転写および複製を防止することによって作用する。
【００１３】
化学療法剤のまた別の部類は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびミトキサントロンを含めて、アントラサイクリン抗生物質の部類である。現在、アントラサイクリンは、リンパ腫、白血病、ならびに子宮癌、卵巣癌、肺癌および乳癌を含めて、多数の癌を治療するために使用される。アントラサイクリンは、ＤＮＡ鎖を切断する遊離酸素ラジカルを形成し、それによってＤＮＡの合成および機能を阻害することによって作用する。アントラサイクリンの主な副作用の１つは、心筋の細胞を損傷し、心毒性に至る可能性があることである。
【００１４】
限定することなく化学療法剤および有糸分裂阻害剤を含めた抗癌剤の耐性は、癌の治療における主要な欠点となっている。こうした耐性は、多くの異なる薬物の効果に対して交差耐性になった患者をもたらした。さらに特に、多剤耐性が問題である。さらに、抗癌剤治療に対するこうした耐性は、必然的に、患者の死亡につながる。その結果として、薬剤耐性の発生は、依然として全ての抗癌剤治療法に関連する問題であり、すなわち、タキサンおよびビンカアルカロイドなどの化学療法剤ならびに規制認可のための臨床試験を受けている抗癌剤を用いる伝統的な治療を含めた癌治療に対してすでに応答しない、またはわずかな効果しかない癌の治療を特定する必要が依然としてある。
【００１５】
［図面の簡単な説明］
［図１］ＭＥＳ−ＳＡおよびＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、ｐ−ヒストンＨ３ ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図２］ＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞系およびＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール耐性細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、細胞周期ＤＮＡ含量ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図３］ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１タキソール耐性細胞系に対するＡＭＧ９００およびタキソールの効果、細胞周期ＤＮＡ含量ＥＣ５０値を示すグラフである。
［図４］ＡＭＧ９００が確立したＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５異種移植片腫瘍の成長をどれほど阻害するかを例示するグラフである。
［図５］確立したＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール耐性異種移植片の成長に対するＡＭＧ９００およびタキソール治療の効果を示すグラフである。
［図６］ＨＣＴ１１６親細胞系、ＡＺＤ１１５２耐性ＨＣＴ１１６細胞系およびパクリタキセル耐性細胞系に対するＡＭＧ９００の効果を示すグラフである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、パクリタキセルおよびドセタキセルを含めたタキサン、ならびにドキソルビシンおよび癌の治療のための臨床試験において投与される他の薬剤を含めた他の化学療法剤など、標準治療である政府により認可された有糸分裂阻害剤に難治性である固形腫瘍および癌細胞を含めて、進行癌を治療するための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン（本明細書において「ＡＭＧ９００」または「該化合物」とも称する。）およびその医薬として許容できる塩の形態の使用を提供する。ＡＭＧ９００は、以下の化学構造を有する。
【００１７】
【化１】
【００１８】
本発明は、有糸分裂阻害剤を含めた化学療法剤で以前に治療された患者における癌および癌細胞の治療的、予防的、急性または慢性治療のための、この化合物またはこの医薬として許容できる塩の形態を含む医薬組成物の使用をさらに提供する。一実施形態において、本発明は、紡錘体阻害剤および抗微小管剤を含めた有糸分裂阻害剤、またはドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシドおよびミトキサントロンを含めて、癌化学療法（本明細書において化学療法剤とも称する。）に使用される他の薬物で以前に治療された対象における癌の治療方法のための医薬および医薬組成物の製造におけるＡＭＧ９００の使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、対象における非小細胞肺癌、乳癌およびホルモン難治性前立腺癌を含めたタキサン耐性腫瘍型を治療する方法を提供し、該方法は、タキサン耐性腫瘍を治療するためのＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩の有効投与量を対象に投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
オーロラキナーゼ阻害剤であるＡＭＧ９００は、ヒト臨床試験において、ＡＺＤ１１５２を含めてチューブリン（パクリタキセル、イクサベピロン、およびビンカアルカロイドなど）および他の化学療法剤（ドキソルビシンなど）を標的とする現在の標準治療癌治療剤に勝る驚くべき予想外の利点を提供することが見出された。特に、ＡＭＧ９００は、例えばα−またはβ−チューブリンタンパク質におけるＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター媒介薬物流出、チューブリン遺伝子の増幅もしくは改変、または構造変化を介することを含めて様々な提唱されている機序を介して、交差耐性になった腫瘍の進行または成長の阻害または緩徐化における効力を有糸分裂阻害剤にもたらす。さらに、ＡＭＧ９００は、細胞周期のＧ２Ｍ期において増殖細胞を標的とし、したがって、微小管を標的とする抗有糸分裂薬に見られる末梢神経障害を引き起こすおそれがないものと考えられる。
【００２０】
定義
以下の定義は、さらに、本明細書に記載されている本発明の範囲を理解するのに役立つはずである。
【００２１】
「癌」および「癌性」という用語は、本明細書において使用される場合、調節されない細胞成長を通常特徴とする対象における生理学的条件を指すまたは表す。癌の例として、限定することなく、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病が挙げられる。こうした癌のより特定の例として、扁平上皮癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌腫および頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の任意の一具体的形態に限定されないが、本発明の方法は、対象において、限定することなく化学療法剤、有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンなどを含めた抗癌剤を用いる治療にある程度耐性になった癌、ならびにこうした抗癌剤を用いる治療後に再発した癌に特に有効であると思われる。
【００２２】
「化学療法剤」という用語は、本明細書において使用される場合、癌性細胞を死滅させることによる癌の治療を指す。この用語はさらに、癌を治療するために使用される抗悪性腫瘍薬、または標準化治療計画に使用されるこれらの薬物の併用を指す。化学療法剤の例として、限定することなく、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどのアルキル化試薬；ビンカアルカロイド（例として、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンが挙げられる。）およびタキサンを含めたアルカロイド（例として、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセルが挙げられる。）；イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびにダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンおよび他などの様々な抗悪性腫瘍薬が挙げられる。
【００２３】
「含む」という用語は、制限が無いことを意味し、示されている構成成分を含めるが他の成分を排除しない。
【００２４】
「多剤耐性」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる化学構造の複数の薬物に耐性、および／または異なる標的を対象とする薬物に耐性の癌細胞を指す。
【００２５】
「難治性」という用語は、本明細書で使用される場合、複数の治療治癒剤に対する耐性を含めて、治療、刺激（治療法）または療法に対する非服従、耐性または非応答性を指すと意図される。癌または腫瘍を特徴づける文脈における「難治性」は、本明細書において使用される場合、非応答性であるまたは１種もしくは複数の抗癌剤を用いる治療に対する耐性もしくは減少した応答を有する癌または腫瘍を指すと意図される。該治療は通常、長期にわたって連続的、持続的および／または反復性であり、耐性を発生させたまたは全く同じ治療に対して難治性になった癌または腫瘍をもたらす。
【００２６】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトならびに雌ウシ、ウマ、イヌおよびネコなどの動物を含めて、任意の哺乳動物を指す。したがって、本発明は、ヒト患者ならびに獣医的対象および患者に使用することができる。本発明の一実施形態において、対象はヒトである。
【００２７】
「治療効果のある」という成句は、従来の抗有糸分裂癌治療法による癌の治療を終えた癌または腫瘍の大きさもしくは重症度における低減を達成する一方、従来の抗有糸分裂癌治療法に通常伴う有害な副作用を低減または回避する化合物（ＡＭＧ９００）の量を定量化すると意図される。
【００２８】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、限定することなく、治癒療法、予防療法および防止療法を含めた治療法を指す。予防的治療は、一般に、個体において、障害の発現を一斉に防止することまたは障害の前臨床的に明らかな段階の発現を遅延させることのいずれかから構成される。
【００２９】
「医薬として許容できる塩」という用語は、アルカリ金属塩を形成するため、および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を包含する。塩の性質は、医薬として許容できれば重要ではない。該化合物の適当な医薬として許容できる酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製することができる。こうした無機酸の例として、限定することなく、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸が挙げられる。有機酸の例として、限定することなく、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、複素環式、カルボンおよびスルホンの部類が挙げられ、これらの例は、ギ酸、酢酸、アジピン酸、酪酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル、エンボン酸（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、ジグルコン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ドデシルスルホン酸、グルコヘプタン酸、グリセロホスホン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パルモン酸、ペクチン酸、過硫酸、２−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、メシル酸、ウンデカン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸である。
【００３０】
該化合物の適当な医薬として許容できる塩基付加塩として、限定することなく、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛から作製される塩などの金属塩、または第１級、第２級、第３級アミン、およびカフェイン、アルギニン、ジエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、アイスチジン、グルカミン、イソプロピルアミン、リシン、モルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミンなどの環状アミンを含めた置換アミンを含めて、有機塩基から作製される塩が挙げられる。本明細書において企図される塩の全ては、例えば適切な酸または塩基と該化合物とを反応させることによって、対応する化合物から常法により調製することができる。
【００３１】
ＡＭＧ９００であるＮ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンは、ＰＣＴ公報ＷＯ２００７０８７２７６、実施例方法Ａ１またはＡ２の７０頁に記載されている手順と類似した手順であるが、１−クロロ−４−（４−メチル−２−チエニル）フタラジンを出発原料として使用し、実施例１５（５０頁）、２５（５５頁）および３０（５９頁）と併せて調製することができる。これらの手順は米国特許第７，５６０，５５１号にも記載されており、この明細書を本明細書によって全体を参照により本明細書に組み込む。具体的には、ＡＭＧ９００は下記の実施例１に記載されている通りに調製することができる。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
【化２】
【００３３】
Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン（ＡＭＧ９００）の合成
【００３４】
ステップ１：４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン
イソプロパノール浴に置いたアルゴンパージした５００ｍＬ丸底フラスコ中で、ナトリウム金属（３．４０ｇ、１４８ｍｍｏｌ）をゆっくりメタノール（１８０ｍＬ）に添加した。混合物を室温で（ＲＴ）約３０分間撹拌した。これに、グアニジン塩酸塩（１２．０ｍＬ、１８２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＲＴで３０分間撹拌し、続いて（Ｅ）−１−（２−クロロピリジン−３−イル）−３−（ジメチルアミノ）プロパ−２−エン−１−オン（１２．０ｇ、５７．０ｍｍｏｌ）を添加し、空気冷却器を取り付け、反応物を油浴に移動し、ここで約５０℃に２４時間加熱した。メタノールのおよそ半分を減圧下で蒸発させ、固体を真空下で濾過し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）およびＨ２Ｏで洗浄し、空気乾燥させることで、４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンをオフホワイトの固体として得た。ＭＳｍ／ｚ＝２０７［Ｍ＋１］１。Ｃ９Ｈ７ＣｌＮ４の算出：２０６．６３。
【００３５】
ステップ２：４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン
再密封可能なチューブに、４−アミノフェノール（１．３ｇ、１２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（７．８ｇ、２４ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１６ｍｌ、０．７５Ｍ）を添加した。混合物を１００℃に５分間加熱し、次いで、４−（２−クロロピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン（２．５ｇ、１２ｍｍｏｌ）添加し、反応混合物を１３０℃に終夜加熱した。ＬＣＭＳによって判断された完了時に、反応混合物をＲＴに冷却させ、水で希釈した。生じた沈殿物を濾過し、固体を水およびジエチルエーテルで洗浄した。固体を次いで９：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨに溶かし、溶出液として９：１のＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨを用いてシリカゲルのパッドに通過させた。溶媒を真空中で濃縮することで、所望の生成物である４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンを生成した。ＭＳｍ／ｚ＝２８０［Ｍ＋１］＋。Ｃ１５Ｈ１３Ｎ５Ｏの算出：２７９．３０。
【００３６】
ステップ３：１−クロロ−４−（４−メチルチオフェン−２−イル）フタラジン
１，４−ジクロロフタラジン（１．４０ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）、４−メチルチオフェン−２−イルボロン酸（９９９ｍｇ、７．０３ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）（７２１ｍｇ、９８５μｍｏｌ）を、密封チューブ中に添加した。チューブをアルゴンでパージした。次いで炭酸ナトリウム（水中２．０Ｍ）（７．７４ｍｌ、１５．５ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（３５．２ｍｌ、７．０３ｍｍｏｌ）添加した。チューブを密封し、ＲＴで５分間撹拌し、予熱した油浴中に１１０℃で置いた。１時間後、ＬＣ−ＭＳは、生成物および副生成物（二重カップリング）、ならびに出発原料ジクロロフタラジンを示した。反応物をＲＴに冷却し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）の助剤を用いてセライトのパッドに通して濾過し、濃縮し、カラム上に充填した。Ｈｅｘを使用するカラムクロマトグラフィーによって生成物を精製することでトップスポットを除去し、次いで８０：２０のヘキサン：ＥｔＯＡｃで生成物を回収した。生成物１−クロロ−４−（４−メチルチオフェン−２−イル）フタラジンを黄色固体として得た。ＬＣ−ＭＳは、生成物に少量のジクロロフタラジンおよびビスカップリング副生成物が混入していることを示した。ＭＳｍ／ｚ＝２６１［Ｍ＋１］＋。Ｃ１３Ｈ９ＣｌＮ２Ｓの算出：２６０．１２。
【００３７】
ステップ４：Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミン
４−（２−（４−アミノフェノキシ）ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミンおよび１−クロロ−４−（４−メチル−２−チエニル）フタラジンに、ｔＢｕＯＨを添加した。生じた混合物を１００℃で密封チューブ中にて１６時間加熱した。反応物をジエチルエーテルおよび飽和炭酸ナトリウムで希釈し、激しく振盪した。生じた固体を濾過し、水、ジエチルエーテルで洗浄し、空気乾燥させることで、Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンをオフホワイトの固体として得た。ＭＳｍ／ｚ＝５０４［Ｍ＋Ｈ］＋。Ｃ２８Ｎ２１Ｎ７ＯＳの算出：５０３．５８。
【００３８】
ＬＣ−ＭＳ方法：
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＸＤＢ−Ｃ８（３．５μ）逆相カラム（４．６×７５ｍｍ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔモデル１１００ＬＣ−ＭＳＤシステム上にて３０℃で試料を分析した。流量は一定で、約０．７５ｍＬ／分から約１．０ｍＬ／分の範囲であった。
【００３９】
移動相は、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＯＡｃ）および溶媒Ｂ（ＡｃＣＮ／０．１％ＨＯＡｃ）の混合物を使用し、勾配１０％から９０％の溶媒Ｂは９分の時間周期であった。この勾配に続き、０．５分の時間で１０％溶媒Ｂに戻り、２．５分の１０％溶媒Ｂでカラムを再平衡化（フラッシュ）した。
【００４０】
他の方法を使用することでＡＭＧ９００を合成することもできる。ＡＭＧ９００を合成するのに有用な多くの合成化学転換、ならびに保護基方法論は、当技術分野において知られている。有用な有機化学的転換の文献として、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；Ａ．ＫａｔｒｉｔｚｋｙおよびＡ．Ｐｏｚｈａｒｓｋｉ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（２００１）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（１９８４）；Ｊ．Ｓｅｙｄｅｎ−Ｐｅｎｎｅ、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｌｕｍｉｎｏ− ａｎｄ Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、（１９９７）；ならびにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ、編集、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）が挙げられる。
【００４１】
一部が以前にタキサンおよびビンカアルカロイドを含めて標準治療の有糸分裂阻害剤ならびに他の化学療法剤に暴露され、耐性を発生させた様々な細胞系（インビトロ）および多発性固形腫瘍型（インビボ）における腫瘍進行を低減または阻害する能力に関して、ＡＭＧ９００を試験した。以下の実施例および得られたデータは、パクリタキセルなどの有糸分裂阻害剤、およびドキソルビシンなど化学療法と併せて使用される他の薬物を含めて、現在の標準治療の療法に耐性の癌を含めた癌を治療するためのＡＭＧ９００の能力を例証する。特段の表示がない限り、ＡＭＧ９００の遊離塩基形態が以下の実施例で使用された。
【００４２】
［実施例２］
オーロラキナーゼＡおよびＢ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗増殖効果をインビトロにおいて３２種のヒト腫瘍細胞系を使用して評価した。表１および表２に示されている通り、ＡＭＧ９００は、固体および血液腫瘍細胞系の両方にわたって抗増殖活性を呈した。この抗増殖活性は、低ナノモル範囲（１ｎＭから５ｎＭのＥＣ５０値）におけるＡＭＧ９００の濃度で見られた。重要なことに、これらのＡＭＧ９００感受性固形腫瘍細胞系（ＨＣＴ１５、ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５、７６９ＰおよびＳＮＵ４４９）の４種は、パクリタキセルおよび他の化学療法剤に耐性である。異なる化学構造の複数の薬物に耐性および／または異なる標的を対象とした薬物に耐性の癌細胞は、「多剤耐性」と呼ばれる。癌細胞によって利用される多剤耐性（ＭＤＲ）の１つの顕著な機序は、ｍｄｒ−１遺伝子産物であるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）などのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのファミリーによって媒介される薬物流出である。例えば、ドキソルビシン耐性ヒト子宮細胞系ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５はＰ−ｇｐを発現し、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、エトポシドおよびミトキサントロンを含めて多くの化学療法剤に耐性（親系統の３０倍から１２００倍）である。ＭＤＲ発現細胞におけるＡＭＧ９００の活性をさらに調査するため、３種のタキソール耐性腫瘍細胞系を試験し、それぞれの親細胞系と比較した。図１−３および表３に示されている通り、全３種におけるＡＭＧ９００保持効力は、ＥＣ５０値が＜２ｎＭであるタキソール耐性および感受性腫瘍細胞系に匹敵した。タキソールは、親系統と比較してＰ−ｇｐ発現腫瘍亜系における効力の有意な減少（１０倍から１００倍）を示した。ともにこれらのデータは、ＡＭＧ９００がリン酸化ヒストンＨ３（オーロラキナーゼＢの基部基質）を阻害し、パクリタキセルおよび他の化学療法剤に耐性の腫瘍細胞系の細胞分裂を阻止することを表している。
【００４３】
材料および方法
試験材料
試験物質：ＡＭＧ９００
製剤：ＤＭＳＯ
供給源：Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
方法
インビトロにおける子宮、乳房および肺の組織から得られた親細胞系および薬剤耐性腫瘍細胞系に対するＡＭＧ９００の活性を評価した。細胞周期およびｐ−ヒストンＨ３評価項目をフローサイトメトリーおよびハイコンテント細胞画像化によって、それぞれ評価した。
【００４８】
ヒト細胞および細胞培養
ヒト腫瘍細胞系は、特段の表示がない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。全ての細胞は、摂氏３７度にて５％ＣＯ２の雰囲気中で保持される。乳腺腫瘍由来のＣＡＬ５１（ＡＣＣ３０２）細胞系をＤＳＭＺ（ＧｍｂＨ）から得た。大腸腫瘍由来のＨＣＴ−１１６＿ＪＨ（遺伝子型ｐ２１＋／＋）およびＨＣＴ−１１６＿ＪＨ（遺伝子型ｐ２１−／−）の細胞系を、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから許可を受けて得た。
【００４９】
【表４】
【００５０】
ＡＭＧ９００で処理された固形腫瘍細胞系のパネル：抗増殖性アッセイ（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ）
Ｐａｃｋａｒｄ Ｖｉｅｗ９６ウェルプレートにおいて１００μＬの適切な完全培地中に３０００細胞または５０００細胞／ウェルの密度で、細胞系成長速度（遅い対早いとして広く定義されている。）に応じて腫瘍細胞を播種した。全ての希釈をＢｉｏｍｅｋ ＦＸワークステーションを使用して行った。翌日、ＡＭＧ９００（１１点用量範囲０．１５６μΜから０．０００３μΜ）を用いて培地中最終ＤＭＳＯ濃度０．１２％で細胞を処理した。２４時間後、化合物を含有する培地を除去し、細胞を完全培地で洗浄した。細胞を次いで、新鮮な完全培地（化合物なし）１００μＬ中で４８時間インキュベートした。４８時間後、固定緩衝液１００μＬを完全培地１００μＬに添加することによって細胞を固定化した。細胞を室温で１０分間インキュベートした。固定緩衝液を吸引し、細胞を次いで洗浄緩衝液１００μＬ中にて３０分間室温で透過性にし、続いてＤＮＡ染色緩衝液１００μＬを添加し、室温にて３０分間暗所でインキュベートした。次に、細胞を洗浄緩衝液１００μＬで洗浄し、分析まで１００μＬ １×ＰＢＳ中に摂氏４度で貯蔵した。９６ウェルプレートをＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ画像化システム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）上でスキャンすることによって、細胞データを染色した。個々の細胞の核領域および強度の定量化をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＤＮＡ染料蛍光に基づいて行った。ＤＭＳＯ処理対照ウェルに基づく核領域上の閾値を、核デブリおよび倍数性細胞由来の正常な大きさの核の数を定量化するために設定した。この閾値の値を適用することで、１０×の倍率を使用して６画像視野／ウェル中の正常核の数を数え上げた。４パラメータ式を使用して用量濃度曲線およびＥＣ５０値を算出した。
【００５１】
ＡＭＧ９００で処理された血液細胞系のパネル：多パラメータ細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
３００μＬの深い９６ウェルプレートにおいて適切な完全培地１５０μＬ中に１００，０００細胞／ウェルの密度で腫瘍細胞を播種した。ＡＭＧ９００（１０点用量範囲０．１５６μΜから０．０００３μΜ）を用いて培地中０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。収集時間の２時間前、ＢｒｄＵを用いて培地中１：１００の最終濃度で細胞をパルス標識した。４８時間後、培地１００μＬを各ウェルからマルチウェルピペッターで除去した。次いで、細胞を培地２００μＬ中のＰＣＲチューブストリップに移した。細胞を２０００ｒｐｍにて１８℃で４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を次いで氷冷９０％メタノール２００μＬ中に固定化し、少なくとも２４時間−２０℃で貯蔵した後、抗体およびＤＮＡ染色した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液２００μＬで洗浄し、次いで、１００μＬの酸緩衝液を用いて室温で１時間、暗所で処理した。細胞を２回２００μＬの洗浄緩衝液で（ｐＨ試験紙で確認してｐＨが７．０まで）洗浄した。抗ＢｒｄＵ−Ａｌｅｘａ６４７（３μｇ／ｍＬ）および抗カスパーゼ３−ＦＩＴＣ（２０μＬ／ウェル）の抗体カクテルを用いて洗浄緩衝液中で２時間、室温にて暗所で細胞をインキュベートした。染色細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液２００μＬで洗浄した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて終夜４℃にて暗所で細胞を対比染色した。データを取得し、フローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ対照および低／高薬物処理群に基づき、ＤＮＡ含量、ＢｒｄＵ、およびカスパーゼ３陽性／陰性集団に従って閾値ゲートを適用した。データは、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量、４Ｎ＋ＤＮＡ含量、ＢｒｄＵ、およびカスパーゼ３切断陽性集団の百分率として表した。４パラメータ式を使用して濃度応答曲線およびＥＣ５０値を算出した。
【００５２】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理されたＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５細胞系およびＭＥＳ−ＳＡ細胞系：ｐ−ヒストンＨ３アッセイ（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ）
ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５およびＭＥＳ−ＳＡ細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度にて９６ウェルプレート上において完全培地中に平板培養し、２４時間培養した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点濃度範囲（１．２５μΜから０．００２４μΜ）にわたり２４時間、培地中０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。細胞を洗浄し、２×ホルムアルデヒド固定緩衝液１００μＬを１０分間および室温で添加することによって固定化した。細胞を洗浄し、洗浄緩衝液１００μＬで１５分間透過性にした。細胞をｐ−ヒストンＨ３抗体（５μｇ／ｍＬ）で免疫染色し、室温で２時間インキュベートした。細胞を洗浄緩衝液１００μＬで洗浄した。次に、ヤギ抗ウサギアレキサ４８８コンジュゲート抗体（１．５μｇ／ｍＬ）を用いて、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ＤＮＡ染料（１μｇ／ｍＬ）を補充した洗浄緩衝液中で細胞をインキュベートし、室温にて暗所で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄緩衝液１００μＬで洗浄した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）にて生物学的応用アルゴリズム（Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｖ２）を使用して９６ウェルプレートを分析した。ｐ−ヒストンＨ３＋対象物（６画像視野／ウェルと１０×目的物との総和）の百分率を使用することで、４パラメータ式を使用して濃度応答曲線およびＥＣ５０値を作成した。
【００５３】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理されたＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞系およびタキソール耐性細胞系：細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
ＮＣＩ−Ｈ４６０親細胞およびＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール抵抗性細胞を、５００，０００細胞／ウェルの密度にて６ウェルプレートにおいて適切な完全培地２ｍＬ中に播種した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて６点濃度範囲にわたり培地中０．０５％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞を処理した。２４時間後、細胞をＢｒｄＵ（１：１００の希釈）でパルス標識し、収集した。細胞を１６００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、氷冷９０％メタノール９００μＬ中に固定化し、−２０℃で貯蔵した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液２００μＬで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて終夜４℃にて暗所で染色した。データを取得し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ処理対照および低／高薬物処理群に基づき、＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量およびＳｕｂＧ１陽性集団に従って閾値ゲートを適用した。データは、＋４Ｎ ＤＮＡおよびＳｕｂＧ１陽性亜集団の百分率として表した。＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量またはＳｕｂＧ１細胞ＥＣ５０値を、４パラメータ式を使用して算出した。
【００５４】
ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｆ１１）−ｌｕｃ親細胞系およびタキソール耐性細胞系：細胞周期ＤＮＡ含量アッセイ（フローサイトメトリー）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｆ１１）−ｌｕｃ親細胞およびタキソール−抵抗性細胞を、２５０，０００細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートにおいて適切な培地１ｍＬ中に、２連で播種した。翌日、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点濃度範囲にわたり０．１％の最終ＤＭＳＯ濃度にてタキソールフリー培地中で細胞を処理した。２４時間後、１×トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を収集し、ＰＣＲチューブに移した。細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を氷冷９０％メタノール２００μＬ中に固定化し、−２０℃で少なくとも２４時間貯蔵した。固定化細胞を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離することで、９０％メタノールを除去した。細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）２００μＬを用いて３０分間４℃にて暗所で染色した。データ取得の前に追加のＰＩ４００μＬを添加した。データを取得し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩ）によって分析した。ＤＭＳＯ対照および低／高薬物処理群に基づき、＋４Ｎ（≧４Ｎと同じ）ＤＮＡ含量に従って閾値ゲートを適用した。データは、＋４Ｎ ＤＮＡ含量陽性集団に対する対照の百分率として表した。＋４Ｎ ＤＮＡ含量細胞ＥＣ５０値を、４パラメータ式を使用して定めた。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
【表７】
【００５８】
【表８】
【００５９】
子宮腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはパクリタキセル（タキソール）を用いて１０点用量範囲（０．００２４μΜから１．２５μΜ）にわたり２４時間処理した。細胞を次いで固定化し、ｐ−ヒストンＨ３抗体で染色し、ＤＮＡ染料（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ）で対比染色した。画像化ベースの分析（Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎ ＶＴｉ）を行うことで、ｐ−ヒストンＨ３陽性細胞の百分率を測定した。用量応答曲線は、ｐ−ヒストンＨ３陽性細胞に対してＤＭＳＯ処理対照（ＰＯＣ）の百分率としてプロットしたＡＭＧ９００濃度またはタキソール濃度のいずれかを表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６０】
【表９】
【００６１】
肺腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて６点用量範囲にわたり２４時間処理した。フローサイトメトリーベースの細胞周期分析を行うことで、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞またはＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率を測定した。ＡＭＧ９００に関する用量応答曲線は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。タキソールに関する用量応答曲線は、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６２】
【表１０】
【００６３】
乳腺腫瘍細胞系を、対照（ＤＭＳＯ）、ＡＭＧ９００またはタキソールを用いて１０点用量範囲にわたり２４時間処理した。フローサイトメトリーベースの細胞周期分析を行うことで、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞またはＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率を測定した。ＡＭＧ９００に関する用量応答曲線は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。タキソールに関する用量応答曲線は、ＳｕｂＧ１ ＤＮＡ含量陽性細胞の百分率に対してプロットした薬物濃度を表す。ＥＣ５０値を４パラメータフィットモデルによって算出した。
【００６４】
［実施例３］
オーロラキナーゼ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗増殖効力を、胸腺欠損ヌードマウスにおいて成長させた乳癌、大腸癌、白血病、肺癌、膵臓癌および子宮癌のモデルを含めて、複数のヒト癌異種移植片モデルにおいてインビボで評価した。ＡＭＧ９００を経口的に、１週当たり連続して２日間３．７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、または毎日３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、腫瘍が確立した時に開始した研究の持続期間中マウスに投与した。試薬、溶液、装置、ＡＭＧ９００の製剤化、腫瘍体積測定および算出は、一般に、下記の実施例４に記載されている通りである。ＡＭＧ９００は、溶媒対照群と比較して試験した全ての異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害することが判明した（表４）。
【００６５】
【表１１】
【００６６】
ＡＭＧ９００の効果を、腫瘍異種移植片としてインビボで成長させた多剤耐性細胞系ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５で試験した。ＡＭＧ９００を経口的に、１週当たり２日間連続して１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、または毎日３．０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで、研究の持続期間中マウスに投与した。投薬は、腫瘍が確立した時（腫瘍を埋込み後１０日）に開始した。ＡＭＧ９００処理は、溶媒対照群と比較して、ＡＭＧ９００の用量およびスケジュールの両方を使用して統計的に有意な腫瘍成長阻害をもたらした（図４；ｐ＜０．０００１、Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定）。匹敵する腫瘍成長阻害が、驚くべきことに、同様の処理スケジュールを使用する２つの他の薬剤耐性モデル（ＨＣＴ１５およびＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール−ｒ［耐性］）においても達成された（表４を参照のこと。）。
【００６７】
【表１２】
【００６８】
ＭＥＳ−ＳＡ Ｄｘ５多剤耐性細胞（２×１０６）を雌性胸腺欠損ヌードマウスの右側腹部における皮下に注入した。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を１０日目に開始し、この時腫瘍は約１００ｍｍ３であった。ＡＭＧ９００（ＢＩＤ）を間欠的または連続的のいずれかでマウスにＰＯ投薬した。全ての群に研究の間中、毎日栄養補給剤を供給することで、体重を維持した。データは各群に対する平均値±ＳＥＭを表している（１群当たりｎ＝１０）。Ｐ値は、ＲＭＡＮＯＶＡ、続いてＤｕｎｎｅｔｔ事後検定によって決定されたビヒクルおよびＡＭＧ９００で治療された群間の統計的差異に対応している。矢印は投薬の開始を示す。
【００６９】
［実施例４］
オーロラキナーゼ活性のＡＭＧ９００誘発抑制が細胞増殖を阻害するか調査するため、ＡＭＧ９００の抗腫瘍効果を、胸腺欠損ヌードマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４６０−タキソール耐性腫瘍異種移植片に対してインビボで評価した。マウスにＡＭＧ９００（ＢＩＤ）を間欠的または連続的のいずれかでＰＯ投薬した。マウスにパクリタキセル（タキソール）を５日／週、ＩＰ投薬した。内部Ａｍｇｅｎ化合物をこの研究における陽性対照として使用した（データ非表示）。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を１２日目に開始し、この時腫瘍は確立した。全ての群に研究の間中、毎日栄養補給剤を供給することで、体重を維持した。
【００７０】
動物および組織
種／系統：胸腺欠損ヌード
数／性別：１２５／雌性
平均重量：ランダム化当日２０−３０グラム
組織型：ＮＣＩ−Ｈ４６０タキソール耐性
供給源：Ａｍｇｅｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ
対象の疾患状態：担腫瘍マウス
動物ケア：ＡＭＡＬＡＲ施設
【００７１】
試験材料
被験物質：ＡＭＧ９００
製造者：Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．
被験物質：タキソール
製造者：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ
【００７２】
重要な試薬調合
試験化合物：ＡＭＧ９００
ストック濃度：１．５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ
製剤：毎週、７日以内に使用
ビヒクル：２％ＨＰＭＣ／１％ＴＷ８０ ｐＨ２．２
用量（個々の体重で１０ｍＬ／ｋｇ）：用量範囲：０．２０−０．３０ｍＬ
投与の経路：ＰＯ
試験化合物：タキソール
ストック濃度：６ｍｇ／ｍＬ
製剤：Ｂｕｒｔ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｙから購入
製造者：Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ’ｓ Ｓｑｕｉｂｂ
ビヒクル：生理食塩水
用量（個々の体重で１０ｍＬ／ｋｇ）：用量範囲：０．２０−０．３０ｍＬ
投与の経路：ＩＰ
【００７３】
製剤
ＡＭＧ９００（遊離塩基）を１．５ｍｇ／ｍＬおよび０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の懸濁液に製剤化した。投薬容量は１０ｍＬ／ｋｇに相当する。タキソール（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）をＢｕｒｔ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｎｅｗｂｕｒｙ Ｐａｒｋ、ＣＡ）から市販で購入し、６ｍｇ／ｍＬのストック濃度から１．２５ｍｇ／ｍＬの希釈標準溶液に毎日希釈した。
【００７４】
【表１３】
【００７５】
ＡＭＧ９００に関する投薬期の持続期間は３週であり、タキソール群に関しては２週であった。腫瘍をデジタルノギスで測定し、マウスを１週当たり２回秤量した。腫瘍体積を以下の通りに算出した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝［（Ｗ２×Ｌ）／２］、ここで、幅（Ｗ）は２回測定の小さい方と定義し、長さ（Ｌ）は２回測定の大きい方と定義する。腫瘍阻害を以下の通りに算出した。最初、対照および全ての治療群に関する［初期腫瘍体積マイナス最終腫瘍体積］を得る；次に、対照腫瘍体積で除して１を減じ、次いで１００を乗じた治療腫瘍体積における変化を得る。以下の表５および図５は、腫瘍体積および腫瘍成長阻害の結果を示している。
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【００７８】
図５は、確立したＨ４６０−タキソール耐性腫瘍の成長に対するＡＭＧ９００およびタキソール治療の効果を例証している。細胞（１動物当たり２×１０６）を雌性ヌードマウスの右側腹部における皮下に注入した（１群当たりｎ＝１０）。腫瘍を１週当たり２回測定した。治療を腫瘍埋込み（矢印）後１２日目に開始し、この時腫瘍はおよそ１７０ｍｍ３であった。マウスに３週間毎日１回または２回、ＰＯまたはＩＰで投薬した。データは各群に関する平均値±ＳＥを表している。＊Ｐ値（非表示）は、反復測定ＳｈｅｆｆｅのＡＮＯＶＡで時間をかけてＳＴＡＴ ｖｉｅｗを使用して分析した、ビヒクルおよびＡＭＧ９００またはタキソールで治療した群間の統計的差異に対応する。凡例に列挙されているスケジュール日数は、日／週を表す。全ての群に研究の間中栄養補給剤を供給した。
【００７９】
上記の図５が例証している通り、ＡＭＧ９００を用いる担腫瘍マウスの治療は、連続的（７日間３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（６０％阻害、ｐ＝０．０００３））または間欠的（２日オン／５日オフ／週の間１５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ（６６％阻害、ｐ＜０．０００１））のいずれかで投与した場合、腫瘍成長を有意に阻害した。タキソールは、この実験において２回の投薬サイクル中５日／週の間ＩＰで１２．５ｍｇ／ｋｇを投薬した場合、腫瘍成長を有意に阻害することができなかった（２０％阻害、ｐ＝０．５３９９）。
【００８０】
３種のよく特徴づけられたオーロラキナーゼ阻害剤ＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０（ＭＫ−０４５７とも一般に称される。）およびＰＨＡ−７３９３５８（Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ）に耐性である腫瘍細胞系においてＡＭＧ９００が依然として活性であると見出したことは驚くべきであり予想外であった。これらの実験に使用された阻害剤は、文献において公表され、特徴づけられている化合物である。例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ（２００９）１８（４）３７９−３９８頁；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ、（２００９）１９（３）、３２１−３５６頁を参照されたい。進行性または転移性固形腫瘍を有する患者のＩ期におけるＤａｎｕｓｅｒｔｉｂ（ＰＨＡ−７３９３５８）の、化学構造を含める詳細な安全性、耐容性およびｐＫプロファイルは、Ｓｔｅｅｇｈｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２７、２００９で入手可能である。
【００８１】
下記に提示されているデータは、３種の上述の周知のオーロラキナーゼ阻害剤が、同じタキソール抵抗性細胞においてヒストンＨ３のリン酸化を阻害する能力と比較して、タキソール耐性細胞系におけるＡＭＧ９００の活性を示している。
【００８２】
［実施例５］
３種のオーロラキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７およびＰＨＡ−７３９３５８）を、Ｐ−ｇｐまたはＢＣＲＰ薬物流出トランスポーターのいずれかを発現するＭＤＲ腫瘍細胞系のサブセットにおいて評価した。予想外にも、ＡＭＧ９００は、Ｐ−ｇｐまたはＢＣＲＰの状態にかかわりなく、試験した全ての細胞系にわたって均一のＩＣ５０値またはＥＣ５０値（２ｎｍｏｌ／Ｌから３ｎｍｏｌ／Ｌ）で、ｐ−ヒストンＨ３を阻害し、または倍数性を誘導した。対照的に、他のオーロラキナーゼ阻害剤は、下記の表６で示されている通り、対応する感受性腫瘍細胞系と比較して、１つまたは複数のＭＤＲ細胞系において強力ではなかった。
【００８３】
材料および方法
化合物材料：以下の化合物に関する分子構造は、パブリックドメインにおいて入手可能である。パクリタキセルおよびドセタキセル、ＭＬＮ８０５４、ＭＫ−０４５７、ＡＺＤ１１５２ならびにＰＨＡ−７３９３５８。該材料は、タキサンが適用可能であるような市販供給源から購入した。
【００８４】
細胞系：腫瘍細胞系は、別段の指定がない限り、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＰＴＸおよびＮＣＩ−Ｈ４６０−ＰＴＸの細胞系は、増加する濃度のパクリタキセルの存在下で６カ月の期間をかけて細胞を成長させることによって確立した。ＨＣＴ１１６ ＡＺＤ１１５２耐性細胞系は、ＡＺＤ１１５２の存在下８０ｎｍｏｌ／Ｌで、細胞を成長させることによって確立した。
【００８５】
動物：全ての実験手順は、動物実験委員会および米国農務省の規則に従って行われた。第４週から第６週の雌性胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｉａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）は滅菌ケージ内に収容し、無菌条件下で保持した。動物を収容する実験室は、交互明暗サイクル（それぞれ１２時間）を提供し、実験動物管理公認協会規定の基準を満たした。飼料、水および栄養補給剤は、無制限に提供された。全ての薬物は、各マウスの個々の体重に基づいて投与された。
【００８６】
蛍光ベースの細胞画像化アッセイ：全てのハイコンテント細胞アッセイは、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）上で行った。腫瘍細胞系は、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７またはＰＨＡ−７３９３５８（濃度範囲は効力に基づいて変動。）で処理した。該細胞は、すでに記載した（１）の通り、抗ｐ−ヒストンＨ３ Ｓｅｒ１０抗体で細胞内染色をするために調製した。検出は、抗ウサギＩｇＧ−アレキサ−５６８抗体およびＤＡＰＩで行った。ｐ−ヒストンＨ３の細胞レベルは、陽性細胞の百分率を決定するため、Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ２アルゴリズム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用して分析した。画像化アッセイに関し、濃度応答曲線ならびに対応するＩＣ５０値およびＥＣ５０値は、患部細胞対ＤＭＳＯ対照の百分率を使用して算出した。
【００８７】
コロニー形成アッセイ：腫瘍細胞は、ＡＭＧ９００、パクリタキセルまたはＡＺＤ１１５２（０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ）で４８時間処理し、完全培地で２回洗浄し、細胞を１ウェル当たり５０００細胞の密度で薬物フリーの完全培地において再平板培養した。細胞は、ＤＭＳＯ対照ウェルがコンフルエントになるまで成長させた。細胞をクリスタルバイオレット染料（Ｓｉｇｍａ）で染色し、蒸留水で洗浄し、デジタルスキャナー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して画像化した。
【００８８】
４Ｎ以上のＤＮＡ含量アッセイ：腫瘍細胞は、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２、ＭＫ−０４５７またはＰＨＡ−７３９３５８（範囲濃度は効力に基づいて変動する。）で２４時間処理し、すでに記載した（１）の通りに細胞周期分析（ＤＮＡ染色のみ）用に加工した。細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。濃度応答曲線および対応するＥＣ５０値は、４Ｎ以上のＤＮＡ含量の細胞対ＤＭＳＯ対照の百分率を使用して算出した。
【００８９】
Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰの細胞表面染色：Ｐ−ｇｐ（ＡＢＣＢ１）およびＢＣＲＰ（ＡＢＣＧ２）の細胞表面発現は、氷上にて３０分間ＦＩＴＣ−コンジュゲートＰ−ｇｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＡＰＣ−コンジュゲートＢＣＲＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗体で生体細胞を染色することによって決定した。一致するアイソタイプ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を対照として、ならびに生存能染色７−アミノアクチノマイシンＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することで、死細胞を除外した。細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーター上でＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。
【００９０】
オーロラキナーゼ遺伝子分析：全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡは、凍結ＨＣＴ１１６細胞ペレット（３種のＡＺＤ１１５２−抵抗性細胞サブクローンおよび１種の親細胞対照）から、標準的核酸抽出方法を使用して単離した。全ＲＮＡは、ｃＤＮＡを生成するのに使用した（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。全長のオーロラＡおよびＢの遺伝子転写物のＰＣＲ増幅は、Ｅｘｐａｎｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｌｏｎｇ−ｔｅｍｐｌａｔｅキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。ＰＣＲプライマー対は以下のものを含める。オーロラＡ（ＧＣＴＴＧＴＴＡＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＴＧおよびＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＣ）、オーロラＢ（ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧおよびＡＣＣＣＧＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＡＴＣ）。オーロラＣの７つのエクソンは、上記したのと同じＰＣＲキットを使用してゲノムＤＮＡから、５’および３’隣接イントロン（（ＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＧおよびＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣ）、（ＡＡＧＧＧＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣおよびＧＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＣ）、（ＡＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧおよびＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣ）、（ＧＧＴＡＡＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＧおよびＣＡＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＧ）、（ＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣおよびＡＧＡＧＧＣＡＴＴＧＡＴＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣＡＴＣ）、および（ＡＣＡＧＴＧＡＧＡＣＴＴＡＣＡＧＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧおよびＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧ））に基づく７つのプライマーセットを使用して増幅した。ＰＣＲ ＤＮＡ生成物は、製造者の推奨プロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした。該オーロラＡ、ＢおよびＣの遺伝子生成物を含有する精製プラスミドは、隣接するベクタープライマーを使用してジデオキシサイクル配列決定にかけた。配列決定反応物は３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析し、出力配列はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して分析した。
【００９１】
表６は、ＡＭＧ９００が多剤耐性腫瘍細胞系全体にわたる均一な効力を呈することを例証している。
【００９２】
【表１６】
【００９３】
同様の実験を、下記表６−Ｂに示されている追加の細胞系で行った。
【００９４】
【表１７】
【００９５】
［実施例６］
さらに、ＡＭＧ９００を、オーロラキナーゼＢの選択的阻害剤であるＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させたＨＣＴ−１１６細胞に関してインビボで評価した。この実験は、オーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性の可能な代替機序も一部明らかにした。したがって、ＨＣＴ１１６細胞をＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させた。ＡＭＧ９００の活性を次いで、ＨＣＴ１１６親細胞系およびＡＺＤ１１５２耐性細胞系において評価した。
【００９６】
ＡＭＧ９００は、驚くべきことに、倍数性を誘発し、ＡＺＤ１１５２の存在下で成長するように適応させたＨＣＴ１１６亜系のコロニー形成を阻害することが見出された。ＡＭＧ９００に関する細胞４Ｎ以上のＤＮＡ含量ＥＣ５０値は、それぞれ、ＡＺＤ１１５２の３４ｎｍｏｌ／Ｌおよび６７２ｎｍｏｌ／Ｌと比較して、２ｎｍｏｌ／Ｌおよび５ｎｍｏｌ／Ｌであった（図６−Ａ）。ＡＭＧ９００は両方のＨＣＴ１１６細胞系において濃度≧５ｎｍｏｌ／Ｌでコロニー形成を阻害したが、一方変異亜系はＡＺＤ１１５２に対して５０ｎｍｏｌ／Ｌで非感受性であった（図６−Ｂ）。ＨＣＴ１１６細胞系の両方がパクリタキセルに対して同等に感受性であり、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現に陰性であった（図６−Ｃ）。興味深いことに、ＨＣＴ１１６変異亜系はオーロラＢ遺伝子（ＴＧＧ→ＴＴＧ；Ｗ２２１Ｌ）の１つの対立遺伝子においてミスセンス変異を有しているが、一方突然変異はオーロラＡおよびＣ遺伝子において全く検出されなかった。これらの結果は、ＡＭＧ９００が、ＡＺＤ１１５２に耐性である腫瘍細胞、およびさらに特に、ＡＺＤ１１５２に耐性の原因であり得るオーロラＢにおけるヘテロ接合変異を保有する腫瘍細胞において活性を維持することを示唆している。したがって、予想外に肯定的データが、ＡＺＤ１１５２に耐性であった腫瘍細胞を処理するのに依然として効果的であるというＭＡＧ９００の驚くべき能力を示している。
【００９７】
【表１８】
【００９８】
方法
図６−Ａ：ＨＣＴ１１６細胞系は、増加する濃度のＡＭＧ９００またはＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。フローサイトメトリーを使用することで、ＤＭＳＯ処理対照（ＰＯＣ）の百分率として表された４Ｎ以上のＤＮＡ含量で細胞の蓄積を査定した。濃度応答曲線および算出ＥＣ５０値は、２つの独立した実験から決定した（棒線、±ＳＤ）。
【００９９】
図６−Ｂ：コロニー形成アッセイは、ＨＣＴ１１６細胞系（親およびＡＺＤ１１５２耐性）で行った。細胞は、ＤＭＳＯ、ＡＭＧ９００、ＡＺＤ１１５２またはパクリタキセルで表示濃度にて４８時間処理し、阻害剤のない完全培地において再平板培養した。ＤＭＳＯ処理細胞がコンフルエンスに達した後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、画像化した（二通りのウェル）。
【０１００】
図６−Ｃ：フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＰ−ｇｐおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＢＣＲＰの抗体で共染色したＨＣＴ１１６細胞系（親およびＡＺＤ１１５２耐性）の細胞表面におけるＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現の程度は、フローサイトメトリーによって評価および分析した。アイソタイプ対照を各細胞系に使用することで、バックグラウンドの蛍光を確立した。ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５およびＲＰＭＩ８２２６の細胞系を、それぞれＰ−ｇｐおよびＢＣＲＰの発現の陽性対照として使用した。
【０１０１】
動物：
５−６週齢の雌性胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を入手し、滅菌ケージに入れて収容した。逆浸透水およびオートクレーブした飼料を無制限に供給した。全ての動物研究は、国際ＩＡＣＵＣプロトコル下で行い、全てのＡＡＡＬＡＣ規定を満たした。
【０１０２】
薬力学アッセイ（ホスホ−ヒストンＨ３の検出）：
確立したヒトＨＣＴ１１６またはＣｏｌｏ２０５の異種移植片腫瘍を持つマウスに、単一経口用量の対照（ビヒクル単独）またはＡＭＧ９００を表示投与量で投与した（１群当たりｎ＝３匹の動物）。３時間または６時間で、腫瘍、骨髄または皮膚組織を薬力学評価（ｐ−ヒストンＨ３レベル）用に回収した。血漿も薬物動態分析用に回収した。
【０１０３】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）：腫瘍を単一細胞懸濁液中に分離し、９０％メタノール中に−２０℃で少なくとも２４時間固定化した。細胞を次いで抗ｐ−ヒストンＨ３（ｓｅｒ−１０）および抗サイトケラチンの抗体で染色し、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。データは、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＬＳＲＩＩフローサイトメーターで取得した。細胞周期のＧ２Ｍ期における骨髄およびサイトケラチン陽性腫瘍の細胞は、ｐ−ヒストンＨ３に関して評価した。腫瘍および骨髄の細胞を、ｐ−ヒストンＨ３ベースライン対照として役立たせるため、ビヒクル処理マウスから回収した。統計的有意性は、一方向ＡＮＯＶＡ分析によって決定した。
【０１０４】
レーザー走査型サイトメトリー（ＬＳＣ）：ＦＦＰＥ組織試料（皮膚および腫瘍）由来の三通りの切片に、抗ｐ−ヒストンＨ３抗体、続いてアレキサ６３３コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して染色した。ＤＮＡ染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含めて、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止剤をスライドに乗せた。４０×対物（０．５μの画素分解能）を使用するＬＳＣに画像を取り込んだ。ｐ−ヒストンＨ３の事象数は、定義されている赤色蛍光閾値に基づいて決定した。２０μｍ２より大きい事象のみを計数した。輪郭事象を画像ギャラリーに再配置することで、分割の精度を検証した。データは、Ｄｕｎｎｅｔｔ補正を適用するＳＡＳ Ｖ９．３を使用して分析した。全ての統計試験は、アルファ＝０．０５の有意水準で評価した。
【０１０５】
細針吸引液（ＦＮＡ）：腫瘍吸引液は、所定および一貫したパターン（３×）の腫瘍を囲む皮膚における小さい切込みを介して２５規格針を挿入することによって回収し、次いで、２％パラホルムアルデヒド中に排出した。細胞を顕微鏡スライド上でサイトスピンし、ＥｐＣＡＭ（上皮性腫瘍マーカー、アレキサフルオル４８８）およびｐＨＨ３（有糸分裂マーカー、アレキサフルオル６４７）に特異的な抗体で染色し、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ含量）で対比染色した。ｉＣｙｔｅＬＳＣ（レーザー４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６３３ｎｍ、ＰＭＴフィルター：４５０／４０、５３０／３０、６５０／ＬＰ）を使用することで、４０ｘ倍率視野画像を取り込み、ＥｐＣＡＭ、ｐＨＨ３およびＤＮＡ含量を定量化した。集団の統合性は、細胞の画像をギャラリーに再配置することによって検証した。Ｇ２ＭにおけるＥｐＣＡＭ、ｐＨＨ３陽性細胞の数が報告された。データは、平均値＋／−平均値（ＳＥＭ）の標準誤差として表した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ Ｄｕｎｎｅｔｔ事後分析によって決定した。
【０１０６】
血漿におけるＡＭＧ９００濃度（薬物動態アッセイ）：
血漿試料（５０μＬ）を溶媒混合物（９０％メタノール、０．０１％トリフルオロ酢酸との１０％水）の添加によって抽出することで、分析物および沈殿物の血漿タンパク質を単離した。抽出試料におけるＡＭＧ９００濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、逆相液体クロマトグラフィーを使用してバリアンＰｕｒｓｕｉｔ ＰＦＰ分析用カラム（２．０×３０ｍｍ、５ミクロン）上にて、水中０．１％ギ酸（移動相Ａ）および０．１％ギ酸とのアセトニトリル（移動相Ｂ）で決定した。
【０１０７】
異種移植片モデル：
２×１０６ヒトＨＣＴ１１６大腸腫瘍細胞をマウスに皮下注入した。腫瘍が確立した時（およそ２００ｍｍ３）、マウスを実験治療群にランダム化し（ｎ＝１０）、実験の持続期間中、毎日１．５ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇ、または間欠的に３．７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ９００で経口的に治療した。マウスに栄養補給剤を連日供給した。腫瘍体積および体重は、それぞれノギスおよび分析用デジタルスケールを使用して１週当たり２回報告した。腫瘍データは平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭによって表した。腫瘍成長阻害の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（ＲＭＡＮＯＶＡ）、続いてＳｃｈｅｆｆｅ事後分析の反復測定によって決定した。
【０１０８】
［実施例７］
腫瘍成長に対するＡＭＧ９００のインビボ効果を、３種のＭＤＲ異種移植片モデルを含めて、５種の異なる腫瘍型（乳房、大腸、肺、膵臓および子宮）由来のヒト異種移植片のパネルにおいて評価した。確立腫瘍を有するマウスにＡＭＧ９００を１５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｄ．にて１週当たり２連続日で３週間、または３ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｉ．ｄ．にて毎日３週間、経口的に投与した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）の最大百分率を下記の表７において、各異種移植片モデルに関して報告する。ＴＧＩの百分率は、研究期間中の、ビヒクル処理対照およびＡＭＧ９００処理の腫瘍体積における変化の間の差異として算出した。ビヒクル処理対照と比較した統計的に有意な腫瘍成長阻害をＲＭＡＮＯＶＡ、続いてＳｃｈｅｆｆｅまたはＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって決定し、アスタリスクによって示す（＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０００５）。
【０１０９】
ＡＭＧ９００は、ビヒクル処理対照群と比較して全ての９異種移植片モデルにおいて有意な抗腫瘍活性（５０％から９７％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を呈した。重要なことに、ＡＭＧ９００は、それぞれの最大耐量で投与されたドセタキセルまたはパクリタキセルのいずれかに耐性であったＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５（８４％ＴＧＩ、Ｐ＜０．０００１）およびＮＣＩ−Ｈ４６０−ＰＴＸ（６６％ＴＧＩ、Ｐ＜０．０００１）の異種移植片モデルにおいて活性であった。
【０１１０】
したがって、ＡＭＧ９００は、多剤耐性モデルおよび標準治療有糸分裂阻害剤を含めて、インビボにおける複数のヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害する。具体的に、データは、ＡＭＧ９００が驚くべきことにＨＣＴ１１６腫瘍におけるオーロラＢの活性を阻害し、多様な腫瘍型を代表する複数の異種移植片の成長を抑制することを示している。
【０１１１】
【表１９】
【０１１２】
適応
腫瘍がオーロラキナーゼ阻害剤に対する耐性を発生させる機序は、異なる薬剤に対して異なる可能性がある。癌表現型を促進する分子力の明快な理解が、所与の治療法に対する特定可能な遺伝子的または後成的感受性を活用できる分子標的の医薬または治療法の基礎をもたらす一方で、治療法に対する耐性の遺伝的基礎を理解することも重要である。この遺伝的理解は、予期される患者集団を層別化する追加のフィルターをもたらすことができる。例えば、公表されている遺伝的証拠は、臨床評価を現在受けているオーロラキナーゼ阻害剤ＡＺＤ１１５２、および潜在的に別の臨床化合物ＶＸ−６８０が、ＭＤＲ１またはＢＣＲＰを過剰発現する腫瘍細胞において比較的効果がない可能性があると示唆している。ＤＮＡ修復欠陥結腸癌系ＨＣＴ１１６の選択中に出現するオーロラＢキナーゼドメイン変異は、耐性をもたらす可能性がある。これらの触媒ドメイン変異は、細胞をＡＺＤ１１５２およびＶＸ−６８０に耐性の状態にするのに十分であることも判明し、これらの薬剤に対する耐性がＭＤＲから独立して生じ得ることを示した。Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ、（２００９）９、９０−１０２頁。
【０１１３】
本発明は、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）およびビンカアルカロイドなどの有糸分裂阻害剤を含めた伝統的標準治療化学療法剤に難治性であった癌を治療するための能力を保有する、オーロラキナーゼ阻害剤である化合物ＡＭＧ９００を提供する。さらに、ＡＭＧ９００は、限定しないがＡＺＤ１１５２、ＶＸ−６８０およびＰＨＡ−７３９３５８を含めた薬剤を阻害する他のオーロラキナーゼに耐性である癌を治療するための能力を有する。一般に、こうした腫瘍は、抗癌剤を用いる以前の治療および／または延長した治療の結果として耐性を発生させる。すなわち、本発明の一実施形態において、対象における癌を治療する方法が提供され、該方法は、癌を抗癌剤で以前に治療された対象に、有効投与量の化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンを投与することを含む。別の実施形態において、抗癌剤は化学療法剤である。別の実施形態において、化学療法剤は有糸分裂阻害剤またはアントラサイクリンである。また別の実施形態において、化学療法剤は、タキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびミトキサントロンからなる群から選択される薬剤である。また別の実施形態において、抗癌剤は、ＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である。
【０１１４】
このように、ＡＭＧ９００は、タキサン標準治療の療法で以前に治療された制御されない細胞成長および異常細胞周期の調節を含めて、細胞増殖障害を治療するのに使用することができる。
【０１１５】
この目的のため、ＡＭＧ９００は、再発したまたは難治性になった、限定しないが、例えば様々な固体および血液由来の腫瘍を含めた癌、限定することなく膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含める。）、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮癌および皮膚癌（扁平上皮癌腫を含める。）を含めた癌腫；リンパ系の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含める。）；骨髄系の造血器腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬおよびＣＭＬ）、脊髄形成異常性症候群および前骨髄球性白血病を含める。）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫および横紋筋肉腫、ならびに他の肉腫を含める、例えば軟組織および骨）；中枢および末梢神経系の腫瘍（星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫を含める。）；ならびに他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌およびカポジ肉腫を含める。）などの予防または治療に有用である。ホルモンなどでの抗癌治療に難治性になった前立腺癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、胆管腺癌または他の癌型などの癌も、ＡＭＧ９００で治療することができる。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、対象における子宮癌、乳癌、非小細胞肺癌を含めた肺癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌、腎臓癌、肝臓癌、前骨髄球性白血病を含めた白血病、慢性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌ならびに骨髄癌からなる群から選択される１種または複数の癌を治療する方法を提供し、該方法は、対象に有効投与量のＡＭＧ９００を投与することを含み、ここで、対象の癌は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシドおよびミトキサントロンからなる群から選択される１種または複数の化学療法剤で以前に治療され、これらに難治性になったものである。別の実施形態において、本発明は、膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌および前立腺癌、またはリンパ腫もしくは白血病からなる群から選択される１種または複数の癌を治療する方法を提供する。ＡＭＧ９００は、限定することなく膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、非小細胞肺、頭頸部、食道、胃、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および前立腺の腫瘍を含めて、進行性固形腫瘍を治療するのにも有用である。
【０１１７】
本発明は、固形腫瘍、肉腫（特にユーイング肉腫および骨肉腫）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、白血病およびリンパ腫を含めた造血器悪性腫瘍、腫瘍誘発胸膜または心膜液貯留、ならびに悪性腹水の治療のための方法も提供する。
【０１１８】
ヒト治療に有用である上に、該化合物は、コンパニオンアニマル、哺乳動物を含めた外来動物および家畜、ならびにげっ歯類などの獣医治療にも有用である。例えば、ウマ、イヌおよびネコを含めて動物は、標準治療癌化学療法の治療に難治性の癌のためにＡＭＧ９００で同様に治療することができる。
【０１１９】
製剤
ＡＭＧ９００は、１種または複数の無毒性の医薬として許容できる担体、希釈剤および／またはアジュバント（本明細書において「賦形剤」材料として集合的に称される。）を伴って、化合物（本発明の医薬活性成分またはＡＰＩである。）Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンを含む医薬組成物として癌対象に投与することができる。ＡＭＧ９００またはこの医薬として許容できる塩形態は、製薬の従来の方法に従って加工することで、ヒトおよび他の哺乳動物を含めて患者に投与するための薬用組成物および医薬組成物を生成することができる。
【０１２０】
該医薬組成物は、任意の適当な経路によって、こうした経路に適合し、目的とする難治性癌治療に有効な用量で対象に投与することができる。該組成物またはＡＰＩは、例えば、従来の医薬として許容できる担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位製剤で、経口的に、粘膜に、局所的に、直腸に、吸入スプレーなどによって肺に、または血管内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、胸骨内および注入技術を含めて腸管外に、投与することができる。
【０１２１】
経口投与のため、該医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形態であってよい。該医薬組成物は、好ましくは、特定の量の活性成分を含有する投与単位の形態で作製される。こうした投与単位の例は、錠剤またはカプセルである。例えば、これらは、約１ｍｇから２０００ｍｇ、および通常約１ｍｇから５００ｍｇの活性成分量を含有することができる。ヒトまたは他の哺乳動物のための適当な日用量は、患者の状態および他の因子に依存して広範に変動してよいが、また、日常的方法および慣例を使用して決定することができる。
【０１２２】
投与されるＡＰＩ（ＡＭＧ９００）の量および難治性癌状態を治療するための投与計画は、対象の年齢、重量、性別および病状、疾患の型、癌の重症度、投与の経路および頻度、ならびにＡＭＧ９００または特異的塩形態を含めたこの特定の形態の物性および化学的性質を含めて、様々な因子に依存する。したがって、投与計画は変動してよい。体重につき約０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、有利には約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間、より有利には約０．１ｍｇ／ｋｇおよび約３０ｍｇ／ｋｇ、ならびにまたさらに有利には約０．１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの間の日用量が適切であり得る。一実施形態において、本発明は対象における癌を治療する方法を提供し、該方法は、ＡＭＧ９００また医薬として許容できるこの塩を約０．５ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの範囲における有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は有糸分裂阻害剤を用いる治療に難治性である。別の実施形態において、本発明は、対象における癌を治療する方法を提供し、該方法は、ＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩を約１．０ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲における有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は、有糸分裂阻害剤を含めて標準治療化学療法剤を用いる治療に難治性である。また別の実施形態において、本発明は、対象における癌を治療する方法を提供し、該方法はＡＭＧ９００または医薬として許容できるこの塩を約３．０ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の有効投与量で対象に投与することを含み、ここで、対象の癌は有糸分裂阻害剤を用いる治療に難治性である。日用量は、１日当たり１回から４回の用量で投与することができる。
【０１２３】
治療的目的で、ＡＭＧ９００は、指示される投与経路に適切な１種または複数のアジュバントまたは「賦形剤」と併用できる。用量ごとに投与される場合、ＡＭＧ９００は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンならびに／またはポリビニルアルコールと添加混合することで、最終製剤を形成することができる。例えば、ＡＭＧ９００および賦形剤は、簡便な投与のための既知および容認されている方法によって錠剤またはカプセル化することができる。適当な製剤の例として、限定することなく、丸薬、錠剤、軟および硬（シェル）ゲルカプセル、トローチ、経口的に溶解可能な形態、ならびにこれらの遅延または制御放出製剤が挙げられる。特に、カプセルまたは錠剤製剤は、ＡＰＩとの分散液として、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの１種または複数の制御放出薬剤を含有することができる。
【０１２４】
乾癬および他の皮膚状態の場合、ＡＭＧ９００の局所調製物を患部に１日２回から４回適用することが好ましいことがある。局所投与に適当な製剤として、皮膚を介する浸透に適当な液状または半液状製剤（例えば、リニメント剤、ローション、軟膏剤、クリーム、ペースト剤および懸濁液など）、および眼、耳または鼻への投与に適当な点滴剤が挙げられる。該活性成分の適当な局所用量は、１日１回から４回、好ましくは１回または２回で投与される０．１ｍｇから１５０ｍｇである。局所投与のため、ＡＰＩは、０．００１％ｗ／ｗから１０％ｗ／ｗ、例えば１重量％から２重量％の該製剤を含むことができるが、１０％ｗ／ｗもの量、しかし好ましくは５％ｗ／ｗ未満、およびより好ましくは０．１％から１％の該製剤を含むことができる。
【０１２５】
軟膏中に製剤化される場合、ＡＭＧ９００は、パラフィン系または水混和性のいずれかの軟膏基剤とともに用いることができる。別法として、水中油型クリーム基剤とともにクリーム中に製剤化することもできる。所望であれば、クリーム基剤の水性相は、例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物などの多価アルコールを少なくとも３０％ｗ／ｗ含めることができる。局所製剤は、望ましくは、皮膚または他の患部を介する活性成分の吸収または浸透を増強する化合物を含めることができる。こうした皮膚透過増強剤の例として、ＤＭＳＯおよび関連類似体が挙げられる。
【０１２６】
ＡＭＧ９００は、経皮的装置によって投与することもできる。好ましくは、経皮投与は、リザーバーおよび多孔質膜型、または固体マトリックス種のいずれかのパッチを使用して達成される。いずれの場合においても、ＡＭＧ９００は、リザーバーまたはマイクロカプセルから膜を介して、レシピエントの皮膚または粘膜と接触する活性薬剤透過性接着剤に連続的に送達される。ＡＭＧ９００が皮膚を介して吸収される場合、制御および所定の流量のＡＭＧ９００がレシピエントに投与される。マイクロカプセルの場合、カプセル化剤は膜として機能することもできる。
【０１２７】
エマルジョンの油性相は、既知の方法において既知成分から構成することができる。該相が単に乳化剤を含むことができる一方、少なくとも１種の乳化剤と、脂肪もしくは油または脂肪および油の両方との混合物を含むことができる。好ましくは、親水性の乳化剤は、安定剤として作用する親油性の乳化剤と一緒に含まれる。油および脂肪の両方を含めるのも好ましい。一緒になって、乳化剤は安定剤の有無にかかわらず、いわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは油および脂肪と一緒になって、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を形成する。該製剤における使用に適当な乳化剤およびエマルジョン安定剤として、例えば、ツイーン６０、スパン８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ジステアリン酸グリセリルを単独もしくはワックスとともに、または他の当技術分野においてよく知られている材料が挙げられる。
【０１２８】
製剤のための適当な油または脂肪の選択は、医薬エマルジョン製剤に使用される可能性がある大部分の油におけるＡＰＩの溶解性が非常に低いので、所望の化粧品特性を達成することに基づいている。したがって、クリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏れを回避するための適当な粘稠性を持つ非油脂性、非染色性および洗浄可能な生成物であるべきである。ジ−イソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、２−エチルヘキシルパルミテートなどの直鎖もしくは分岐鎖の一塩基性もしくは二塩基性アルキルエステル、または分岐鎖エステルのブレンドを使用することができる。これらは、必要な特性に依存して単独または併用できる。別法として、白色軟パラフィンおよび／もしくは流動パラフィンまたは他の鉱油などの高融点脂質を使用することができる。
【０１２９】
眼への局所投与に適当な製剤として、活性成分が適当な担体、特にＡＭＧ９００のための水性溶媒中に溶解または懸濁されている点眼薬も挙げられる。ＡＭＧ９００は、好ましくは、こうした製剤中に０．５％から２０％、有利には０．５％から１０％、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【０１３０】
非経口投与の製剤は、水性または非水性の等張滅菌注入溶液または懸濁液の形態であってよい。これらの溶液および懸濁液は、経口投与用製剤における使用のために記述した１種もしくは複数の担体もしくは希釈剤を使用して、または他の適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を使用することによって、滅菌粉末または顆粒から調製することができる。例えばＡＭＧ９００は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、トラガカントガム、および／または様々な緩衝剤中に溶解することができる。他のアジュバントおよび投与方法は、製薬技術においてよくおよび広範に知られている。ＡＭＧ９００は、生理食塩水、デキストロースまたは水を含めて適当な担体、またはシクロデキストリン（すなわち、Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、共溶媒可溶化物（すなわち、プロピレングリコール）またはミセル可溶化物（すなわち、ツイーン８０）との組成物として注入することによって投与することもできる。
【０１３１】
滅菌の注入可能製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌の注入可能な溶液または懸濁液であってもよい。用いてよい許容できるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、従来より、滅菌固定油は溶媒または懸濁媒体として用いられている。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含めて、任意の無刺激性固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注入可能物の調製に使用される。
【０１３２】
肺投与のため、該医薬組成物は、エアゾールの形態または乾燥粉末エアゾールを含めた吸入器で投与することができる。
【０１３３】
該薬物の直腸投与用坐剤は、常温では固体であるが直腸温では液体であるために直腸において融解し、薬物を放出するカカオ脂およびポリエチレングリコールなどの適当な非刺激性賦形剤と該薬物とを混合することによって調製することができる。
【０１３４】
該医薬組成物は、滅菌などの従来の製薬作業を行うことができ、および／または保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などの従来のアジュバントを含有することができる。錠剤および丸薬は、追加として、腸溶コーティング剤で調製することができる。こうした組成物は、湿潤、甘味料、香料および芳香剤などのアジュバントを含むこともできる。
【０１３５】
併用
ＡＭＧ９００が唯一の活性医薬品として投薬または投与することができる一方、１種または複数の化学療法剤および／または有糸分裂阻害剤と併用することもできる。併用投与される場合、ＡＭＧ９００は、同時または逐次に異なる時間で投与される分離した組成物として製剤化することができ、またはＡＭＧ９００は単一組成物として生成することができる。
【０１３６】
「同時療法」（または「併用療法」）という成句は、本発明のＡＭＧ９００および別の化学療法剤の使用を定義する際、薬剤併用の有益な効果をもたらすレジメンにおいて逐次的にそれぞれの薬剤の投与を包含することが意図され、これらの活性薬剤の固定比率を有する単一カプセル、またはそれぞれの薬剤の複数の分離したカプセルなどにおける、実質的に同時のこれらの薬剤の同時投与を包含することが同様に意図される。
【０１３７】
詳細には、ＡＭＧ９００の投与は、癌の予防または治療において当業者に知られている抗有糸分裂の治療法を含めて、追加の化学療法剤と併用し得る。本発明は投与の順序において限定されず、すなわち、ＡＭＧ９００は、既知の抗癌剤または有糸分裂阻害剤の投与前、同時または投与後のいずれかで投与することができる。
【０１３８】
前述は本発明の例証に過ぎず、開示されている使用に本発明を限定することを意図するものではない。当業者にとって常法である変形形態および変化形態は、添付の請求項において定義されている本発明の範囲および性質の範囲内であることが意図される。全ての記述されている文献、特許、出願および公開は、本明細書に書かれている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の癌が抗癌剤での治療に難治性である対象における癌の治療のための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンまたは医薬として許容できるこの塩の使用。
【請求項２】
抗癌剤が化学療法剤である、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
化学療法剤が有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンからなる群から選択される薬剤である、請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項４】
化学療法剤がタキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される薬剤である、請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項５】
抗癌剤がＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項６】
癌が（ａ）膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌および皮膚癌から選択される固体または血液由来の腫瘍、（ｂ）白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫から選択されるリンパ系の造血器腫瘍、（ｃ）急性および慢性骨髄性白血病、脊髄形成異常性症候群および前骨髄球性白血病から選択される骨髄系の造血器腫瘍、（ｄ）線維肉腫および横紋筋肉腫から選択される間葉起源の腫瘍、（ｅ）星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫から選択される中枢および末梢神経系の腫瘍、または（ｆ）黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌もしくはカポジ肉腫の１種または複数である、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
癌が膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌および前立腺癌、またはリンパ腫もしくは白血病から選択される固形腫瘍の１種または複数である、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
癌が前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胆管腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病またはこれらの組合せである、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抗癌剤での治療に難治性の癌の治療用医薬の調製のための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンまたは医薬として許容できるこの塩の使用。
【請求項１０】
抗癌剤での治療に難治性である膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫またはこれらの組合せから選択される癌の治療用医薬の調製のための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
対象の腫瘍がパクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシンおよびビンカアルカロイドからなる群から選択される化学療法剤で以前に治療された対象における固形腫瘍の大きさを低減するための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
抗癌剤が有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンからなる群から選択される化学療法剤である、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
抗癌剤がタキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される化学療法剤である、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
抗癌剤がＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１】
対象の癌が抗癌剤での治療に難治性である対象における癌の治療のための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンまたは医薬として許容できるこの塩の使用。
【請求項２】
抗癌剤が化学療法剤である、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
化学療法剤が有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンからなる群から選択される薬剤である、請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項４】
化学療法剤がタキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される薬剤である、請求項２に記載の化合物の使用。
【請求項５】
抗癌剤がＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項６】
癌が（ａ）膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌および皮膚癌から選択される固体または血液由来の腫瘍、（ｂ）白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫から選択されるリンパ系の造血器腫瘍、（ｃ）急性および慢性骨髄性白血病、脊髄形成異常性症候群および前骨髄球性白血病から選択される骨髄系の造血器腫瘍、（ｄ）線維肉腫および横紋筋肉腫から選択される間葉起源の腫瘍、（ｅ）星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫から選択される中枢および末梢神経系の腫瘍、または（ｆ）黒色腫、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌もしくはカポジ肉腫の１種または複数である、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
癌が膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌および前立腺癌、またはリンパ腫もしくは白血病から選択される固形腫瘍の１種または複数である、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
癌が前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胆管腺癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病またはこれらの組合せである、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抗癌剤での治療に難治性の癌の治療用医薬の調製のための、化合物Ｎ−（４−（（３−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−ピリジニル）オキシ）フェニル）−４−（４−メチル−２−チエニル）−１−フタラジンアミンまたは医薬として許容できるこの塩の使用。
【請求項１０】
抗癌剤での治療に難治性である膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、食道癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、卵巣癌、膵臓癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫またはこれらの組合せから選択される癌の治療用医薬の調製のための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
対象の腫瘍がパクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシンおよびビンカアルカロイドからなる群から選択される化学療法剤で以前に治療された対象における固形腫瘍の大きさを低減するための、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
抗癌剤が有糸分裂阻害剤およびアントラサイクリンからなる群から選択される化学療法剤である、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
抗癌剤がタキソール、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロンからなる群から選択される化学療法剤である、請求項９に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
抗癌剤がＡＺＤ１１５２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＭＫ−０４５７またはこれらの併用である、請求項９に記載の化合物の使用。
【公表番号】特表２０１３−５０４５８２（Ｐ２０１３−５０４５８２Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８８９１（Ｐ２０１２−５２８８９１）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８２４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１８４２
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８２４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３１８４２
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]