染色体ＤＮＡに標的化されるオリゴマーによる遺伝子発現の調節
【課題】哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法を提供する。
【解決手段】オリゴマーが標的転写物の合成を選択的に増加する条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと細胞を接触させることによって、遺伝子の標的転写物の合成が、哺乳動物細胞中において選択的に増加される。
【解決手段】オリゴマーが標的転写物の合成を選択的に増加する条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと細胞を接触させることによって、遺伝子の標的転写物の合成が、哺乳動物細胞中において選択的に増加される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｃｏｒｅｙ、Ｄａｖｉｄ Ｓ． Ｓｈａｍｅｓ、Ｂｅｔｈａｎｙ Ａ． Ｊａｎｏｗｓｋｉ及びＪｏｈｎ Ｄ． Ｍｉｎｎａ
関連出願の相互参照：本願は、２００５年１１月１７日に出願された米国仮出願第６０／７３８，１０３号の優先権を主張する。
【０００２】
譲受人：Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ
本研究は、国立衛生研究所によって授与された補助金（ＮＩＧＭＳ６０６４２及び７３０４２；並びにＰ５０ＣＡ７０９０７）の下、連邦政府の支援を受けて為された。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野：発明の分野は、遺伝子のプロモーター領域を標的化するポリヌクレオチドオリゴマーを用いて、遺伝子転写物合成を調節することである。
【背景技術】
【０００４】
二重鎖ＲＮＡがｍＲＮＡを認識する能力及び転写後ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて遺伝子発現を発現停止させる能力は、広く理解されている（Ｔａｎｇ，２００４）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節するための一般的な研究ツールとなっており、内在性に発現されたミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、増え続ける細胞経路の多数に関与する。
【０００５】
ＲＮＡ誘導性のＤＮＡメチル化は、植物において最初に記載され（Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ ２００４）、ＲＮＡウイルス及びウイロイドがゲノムＤＮＡ配列中にメチル化を誘導できることが見出された（Ｍａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４）。メチル化された塩基は、ＲＮＡに相補的なＤＮＡの配列内に濃縮されており、認識のための配列特異的機序が推測される（Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ２０００）。
【０００６】
酵母では、セントロメア反復配列及び接合型座位を標的とする小さなＲＮＡが、ヘテロクロマチンの修飾を促進することによって遺伝子発現を発現停止させることができる（Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｍｏａｚｅｄ ２００３； Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ ２００５）。クロマチン修飾には、ヒストンＨ３のリジン９のメチル化が関与しており（Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ）、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ（Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ ２００５）及びＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｓｃｈｒａｍｋｅ ｅｔ ａｌ ２００５）を必要とする。修飾には、転写後発現停止にも関与しているタンパク質ファミリーのメンバーであるアルゴナウト１（Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ ２００４）などのＲＮＡ誘導性転写発現停止（ＲＩＴＳ；ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ 発現停止）経路（Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ ２００３）のタンパク質が関与している。
【０００７】
最近、染色体ＤＮＡを標的とする短いオリゴヌクレオチドであるアンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ；ａｎｔｉｇｅｎｅＲＮＡ）も哺乳動物細胞中の発現を発現停止させ得ることが、幾つかの報告によって示唆されている。Ｋａｗａｓａｋｉ及びＴａｉｒａは、ＣｐＧ二ヌクレオチドを含有するＥ−カドヘリンプロモーター内の配列に１０個の二重鎖ＲＮＡを標的化した（Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ， ２００４）。ＤＮＡのメチル化は、これらの部位の全てにおいて観察された。各ＲＮＡはＥ−カドヘリン発現の僅かな低下をもたらすに過ぎなかったが、１０個のＲＮＡ全てが合わされると、より完全な発現停止を達成することができた。メチル転移酵素遺伝子であるＤＭＮＴ１及びＤＭＮＴ３Ｂが発現停止された場合に、二重鎖ＲＮＡがＥ−カドヘリンの発現を阻害できなかったという観察によって、メチル化と発現停止の間の関連が裏付けられた。
【０００８】
同様の研究において、Ｍｏｒｒｉｓと共同研究者は、伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）のプロモーターを標的とする二重鎖ＲＮＡが発現を阻害し得ることを示した（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， ２００４）。Ｍｏｒｒｉｓと共同研究者は、標的配列においてＤＮＡのメチル化を観察し、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチン（ＴＳＡ）とともに、メチル化の阻害剤である５’−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）を添加することによって、発現停止が元に戻ることを観察した。Ｔａｉｒａ及びＭｏｒｒｉｓの研究室から得られた研究は、ＲＮＡが哺乳動物細胞中での発現停止のためにＤＮＡを標的とし得るという証拠を与え、ＲＮＡがＤＮＡのメチル化を誘導し得ることを示唆したので重要であった。Ｍｏｒｒｉｓの研究では、合成ａｇＲＮＡによる発現停止には、核取り込みを促進するように設計されたペプチドの使用が必要であったが、他の研究は、標準的な形質移入操作で十分であることを示唆している（Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ ２００４； Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ ２００５； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ ２００５； Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５）。
【０００９】
哺乳動物細胞中において、ＲＮＡによって誘導されたメチル化を達成するための他の試みは、これらに比べて成功を収めていない。Ｓｔｅｅｒ及び共同研究者は、ハンチントンをコードする遺伝子を標的とするＲＮＡを検査したが、メチル化は一切検出されなかった（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ ２００４）。マウス卵母細胞中で二本鎖ＲＮＡを安定的に発現させた場合に、ＲＮＡによって誘導されるメチル化は観察されなかった（Ｓｖｏｂｏｄａ， Ｐ． ｅｔ ａｌ ２００４）。Ｒｏｓｓｉ及び共同研究者は、腫瘍抑制因子ＲＡＳＳＦ１Ａに対するプロモーター内に存在する十分に性質決定されたＣＧ島を標的とするために、発現された短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用した（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ ２００５）。Ｒｏｓｓｉ及び共同研究者は、遺伝子発現の穏やかな阻害を報告した。メチル化特異的ＰＣＲアッセイはメチル化を示したが、より完全な亜硫酸水素塩配列決定アッセイはメチル化を示さなかった。
【００１０】
本発明者らの研究室は、染色体ＤＮＡの効率的なＲＮＡ媒介性発現停止が、ＤＮＡのメチル化とは独立に達成できることを発見した（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ ２００５； ＵＳ Ｐａｔ ａｐｐｌ ｎｏ． ６０／６６１，７６９）。本発明者らは、転写の開始を妨害することによって発現を遮断するために、転写開始部位を標的とした。転写開始部位を標的とする実際上の利点は、それらが全ての遺伝子中に存在すること、及び標的配列の一般的で、予測可能なクラスを提供することである。転写開始部位の標的化は、メチル化が起こっているかどうかにかかわらず、遺伝子発現を遮断することも予測される。
【００１１】
他の研究とは異なり、本発明者らは、メチル化特異的ＰＣＲ又は亜硫酸水素ナトリウム配列決定によってメチル化を全く観察しなかった。５−アザＣ又は抗メチル転写酵素ｓｉＲＮＡを用いたメチル転写酵素活性の阻害は、遺伝子発現停止に対して全く影響を及ぼさず、メチル化が発現停止に関与していないことが示唆された。本発明者らが観察した発現停止は、先行研究で報告されたものより強力であり、転写開始部位がａｇＲＮＡに対する特に感受性が高い標的であり得ることを示唆する。
【００１２】
Ｂａｙｌｉｎ及び共同研究者らは、Ｅ−カドヘリンの転写的発現停止を再び取り上げた（Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５）。Ｂａｙｌｉｎ及び共同研究者らは、プロモーターによって標的とされる２つの二重鎖ＲＮＡを直列で使用した場合には、遺伝子発現の効率的な発現停止を観察したが、ＲＮＡを個別的に使用した場合には、遺伝子発現の効率的な発現停止を観察しなかった。Ｂａｙｌｉｎは、ＤＮＡメチル化の証拠を観察しなかった。
【００１３】
Ｅ−カドヘリン遺伝子プロモーターを標的とするｓｉＲＮＡは、培養された乳癌細胞中で転写を活性化することができることが報告されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。同様に、プロモーターを標的とするｓｉＲＮＡによる、増加されたＥＦ１ＡｍＲＮＡ発現を示唆するデータが提示されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ ２００４；図３Ａ参照、最初の２つの棒）。核に局在化された、ＮＲＳＥ配列をコードする小さな調節性二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）は、成人海馬神経幹細胞中で、ＮＲＳＥ遺伝子の転写の活性化の引き金を引くことも報告されている（Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ， ２００４； ａｎｄ Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ， ２００５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第６０／６６１，７６９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｔａｎｇ （２００４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ３０：１０６−１１４．
【非特許文献２】Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １６７７，１２９−１４１．
【非特許文献３】Ｍａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｃｅｌｌ ７６：５６７−５７６．
【非特許文献４】Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ （２０００） ＲＮＡ ６：５５−６５．
【非特許文献５】Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｍｏａｚｅｄ （２００３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：７９８−８０２．
【非特許文献６】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ （２００５） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：１６３５−１６５５．
【非特許文献７】Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３３−１８３７．
【非特許文献８】Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：１５２−１５７．
【非特許文献９】Ｓｃｈｒａｍｋｅ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：１２７５−１２７９．
【非特許文献１０】Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １８：２３５９−２３６７．
【非特許文献１１】Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：６７２−６７６．
【非特許文献１２】Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ （２００４） Ｎａｔｕｒｅ ４３１：２１１−７．
【非特許文献１３】Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１２８９−９２．
【非特許文献１４】Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ （２００５） ＭｏＩ． Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１７９−１８３．
【非特許文献１５】Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １：２１６−２２２．
【非特許文献１６】Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ３７：９０６−１０．
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ３２３：２７５−２８０．
【非特許文献１８】Ｓｖｏｂｏｄａ， Ｐ． ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３２：３６０１−３６０６．
【非特許文献１９】Ｌｉ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４６：６１０５．
【非特許文献２０】Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｃｅｌｌ １ １６：７７９−７９３．
【非特許文献２１】Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒｉｅｓ ４９：８７−８８．
【発明の概要】
【００１６】
本発明の一態様において、哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法であり、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程、を含む。
【００１７】
一実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５、−３０から＋１７及び−１５から＋１０ヌクレオチドの間に位置している。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。
【００１８】
一実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターである。別の実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のイソフォームのプロモーターである。さらなる実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターであり、且つ標的転写物のイソフォームのプロモーターである。
【００１９】
一実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノからなる群から選択される。特定の実施形態において、オリゴマーは、１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである。
【００２０】
一実施形態において、オリゴマーは、２’化学修飾を有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴマーは、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基残基の取り込み及びロックされた核酸からなる群から選択される血清安定性増強化学修飾を含む。
【００２１】
一実施形態において、細胞は、インビトロでの培養された細胞である。別の実施形態において、細胞は、宿主内においてインサイチュである。
【００２２】
一実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まない。さらなる実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まず、及び細胞は、オリゴマーから実質的になる組成物と接触される。さらなる実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まず、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる。別の実施形態において、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、標的プロモーターの単一の領域が標的化され、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる。別の実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まず、及びオリゴマーは、核移行ペプチドに付着されていない。
【００２３】
一実施形態において、細胞は、オリゴマーの１から１００ｎＭ濃度と接触される。
【００２４】
一実施形態において、細胞は癌細胞であり、及び遺伝子はＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００２５】
本発明の別の態様は、遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させるための単離された又は合成ポリヌクレオチドオリゴマーであり、該オリゴマーは、遺伝子の標的プロモーター内の領域に対して相補的な１２から２８塩基のヌクレオチド配列を含み、遺伝子を含む細胞中に導入された場合に、オリゴマーは、標的転写物の転写を選択的に増加させる。
【００２６】
一実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５、−３０から＋１７及び−１５から＋１０ヌクレオチドの間に位置している。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。
【００２７】
一実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターである。別の実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のイソフォームのプロモーターである。さらなる実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターであり、且つ標的転写物のイソフォームのプロモーターである。
【００２８】
一実施形態において、オリゴマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノからなる群から選択される。
【００２９】
別の実施形態において、オリゴマーは、配列番号１から１１及び１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである。
【００３０】
特定の実施形態において、標的転写物は、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；主要ヴォールトタンパク質）、ヒトＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ヒトｐ５３及びヒトＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一実施形態において、細胞は癌細胞であり、及び遺伝子はＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００３１】
本発明を広告し、市販し、販売し又は実施許諾することを含む、事業を行う方法。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法及び組成物を提供し、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程を含む。
【００３３】
遺伝子の標的転写物は、定型的な方法を用いて、増加された合成を必要とすることが予定されている。例えば、所望のレベルと比べて低下した標的転写物／及び／又はタンパク質のレベルは、直接測定され得る。あるいは、標的転写物の増加された合成に対する必要性は、標的転写物の低下したレベルと関連する表現型から推測され得る。
【００３４】
一実施形態において、遺伝子のプロモーター内の領域は、部分的に一本鎖の構造、非Ｂ−ＤＮＡ構造、ＡＴが豊富な配列、十字型ループ、Ｇ四重鎖、ヌクレアーゼ高感受性要素（ＮＨＥ；ｎｕｃｌｅａｓｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）及び遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している領域から選択される。
【００３５】
好ましいＡＴが豊富な配列は、局所的な融解が生じているＤＮＡの伸長（タンパク質機構が、一本鎖領域に接近しなければならない、遺伝子のプロモーターなど）中に見出され、好ましくは、遺伝子のＴＡＴＡボックス及び／又は少なくとも６０％若しくは７０％のＡ＋Ｔを含む。
【００３６】
好ましい十字型構造は、各鎖上にヘパリン構造を形成しているパリンドローム性ゲノム配列から形成され、反復配列が非パリンドローム性ＤＮＡの伸長によって隔てられており、十字型のヘアピンの各々の末端に一本鎖ループを与える。
【００３７】
好ましい、Ｇ−四重鎖構造は、哺乳動物遺伝子のプロモーター領域中に同定されており、転写制御に関与していると推定されている。例えば、ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子プロモーターのヌクレアーゼ高感受性要素ＩＩＩは、転写の調節に関与しており、それぞれ、Ｉ−モチーフ及びＧ−四重鎖構造を採ることができる、ピリミジンが豊富な配列及びプリンが豊富な配列を、それぞれコード鎖及び非コード鎖上に含む。Ｇ−四重鎖構造の安定化は、ｃ−ＭＹＣの発現停止をもたらすことが示されている（例えば、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ−Ｊａｉｎ，２００２を参照されたい。）。
【００３８】
一実施形態において、標的とされる領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。前記方法のある種の好ましい実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−３０から＋１７ヌクレオチドの間のテンプレート鎖上に位置している。別の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１５から＋１０オリゴヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。ある種の好ましい実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。別の実施形態において、領域は、転写開始の下流に存在する配列（例えば、配列は、−１００から＋１ヌクレオチドの間に位置する。）を一切含まない。本発明において使用されるオリゴマーは、ゲノム配列を標的とし、ｍＲＮＡを標的としない。
【００３９】
ある種の実施形態において、遺伝子は、標的転写物の１つ又はそれ以上のイソフォームをコードし、及び／又は発現することが知られており、本発明の方法は、基礎発現レベル及び／又は対照条件レベルを超えて、標的転写物の合成を選択的に増加させるが、標的転写物のイソフォームの合成は、減少し、増加し、又は同じに留まり得る。標的転写物及びイソフォームは、同一のプロモーター及び／又は転写開始部位を共有し得、又は異なるプロモーター及び／又は転写開始部位を有し得る。従って、様々な実施形態において、標的プロモーターは、（１）標的転写物のプロモーター、（２）標的転写物のイソフォームのプロモーター、又は（３）標的転写物のプロモーター及び標的転写物のイソフォームのプロモーターの両方である。多くの遺伝子が、複数のイソフォームを発現することが公知であり、例には、ｐ５３（Ｂｏｕｒｄｏｎ， ２００５）、ＰＴＥＮ（Ｓｈａｒｒａｒｄ ａｎｄ Ｍａｉｔｌａｎｄ， ２０００）、Ｂｃｌ−２−関連遺伝子（Ａｋｇｕｌ， ２００４）及びサービビン（Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ， ２００５）が含まれる。例えば、前記方法は、オリゴマーを、イソフォームの転写開始部位に誘導することによって、ある標的転写物の発現を増加させるために使用することができる。標的転写物の合成が増加され、及びイソフォームの合成が阻害される場合には、前記方法は、宿主細胞中で相対的イソフォーム合成を効果的及び選択的に調節する。従って、所定の望ましいイソフォーム又は過少発現されたイソフォームの増加した合成は、所定の望ましくないイソフォーム又は過剰発現されたイソフォームの減少した合成と組み合わせることができる。以下で、ｐ５３β／ｐ５３を用いて例示されているように、本実施形態は、宿主細胞中の所定のイソフォームの切り替えを作動させるために使用することができる。
【００４０】
ポリヌクレオチドオリゴマーは、標的転写物の合成の必要な増加を実施するのに十分な配列及び長さを有するものである。本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味であることが明らかでなければ、単数及び複数の両方を表す。例えば、「オリゴマー」という用語は、単一又は複数のオリゴマーを含み、「少なくとも１つのオリゴマー」という用語と等しいと考えることができる。適切なオリゴマーは、典型的には、１２から２８塩基の長さであり、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的である（すなわち、ワトソン−クリック結合相補性）。オリゴマーは、あらゆる核酸、修飾された核酸又はワトソン−クリック対合によってＤＮＡを認識することができる核酸模倣物を含み得る。オリゴマーと標的とされるプロモーター領域との間のミスマッチ、特に、２以上のミスマッチは、しばしば、標的転写物合成を増加される効力を減弱させる。オリゴマーは、一本鎖又は二本鎖（すなわち、二重鎖）であり得る。二重鎖オリゴマーの場合には、第一の鎖は、標的とされるプロモーターの領域に対して相補的であり、第二の鎖は、第一の鎖に対して相補的である。オリゴマーは、ホモピリミジン配列、ホモピリミジン配列又は混合されたプリン／ピリミジン配列を標的とし得る。混合されたプリン／ピリミジン配列は、少なくとも１つのプリン（残りは、ピリミジンである。）又は少なくとも１つのピリミジン（残りは、プリンである。）を含有する。ワトソン−クリック塩基対合をすることができる様々なオリゴマーが、本分野において公知である。ある種の実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノから選択される。
【００４１】
二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、比較的合成が容易であり、ヒトの臨床試験で使用されてきたので、特に好ましいオリゴマーである。好ましいｄｓＲＮＡは、標的とされているプロモーターの領域に対して相補的な１８から２５個の塩基を有し、及び各鎖上に３’二又は三ヌクレオチド突出部を場合によって有する。ｄｓＲＮＡを調製し、細胞に送達する方法は、本分野において周知である（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ， ２００１；Ｔｕｓｃｈｌらに付与されたＷＯ／０１７１６４；及びＦｉｒｅらに付与されたＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５０６，５５９を参照されたい）。特注のｄｓＲＮＡも市販されている（例えば、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）。本発明の方法において使用されるｄｓＲＮＡは、分子の所望の特性を増強するために化学的に修飾され得る。標的転写物の合成を選択的に増加させるｄｓＲＮＡの能力に悪影響を与えることなく、幅広い化学的修飾を二重鎖ＲＮＡに施すことが可能である。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’修飾を有する１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含み、完全に２’置換され得る。様々な２’修飾が本分野において公知である（例えば、Ｃｏｏｋらに付与されたＵＳ Ｐａｔ Ｎｏ．５，８５９，２２１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与されたＵＳ Ｐａｔ Ｎｏ．６，６７３，６１１；及びＣｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。好ましい化学的修飾は、インビボで投与された場合に、ｄｓＲＮＡの血清安定性を増強し、ｄｓＲＮＡの半減期を増加させる。血清安定性増強化学修飾の例には、ホスホロチオアートホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド及び逆位デオキシ脱塩基残基の取り込みが含まれる（例えば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎらに付与されたＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５００３２７３３を参照されたい。）。ｄｓＲＮＡは、安定性を向上させ、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、ロックされた核酸（ＬＮＡ；ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を場合によって含有し得る（例えば、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００５；及びＢｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。修飾の別の種類は、宿主へ送達された際に、オリゴマーを追跡できるようにするために、又は、形質移入効率の測定を容易にするために、蛍光分子、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなどをオリゴマーに付着させることである。
【００４２】
ＣｐＧ島を標的とするアンチジーンｄｓＲＮＡを用いたメチラーゼ依存性の転写阻害が、記載されている（２，３）。しかしながら、本発明の方法は、メチラーゼ非依存性であり、標的転写物の合成は、効果的なメチル化とは独立に増加され、効果的なメチル化を必要とせずに増加される（例えば、メチラーゼ阻害剤の存在下で、細胞をオリゴマーと接触させた場合でも、転写合成がなお生じる。）。本発明の特定の実施形態において、標的プロモーター内の標的領域は、ＣｐＧ島内に含有されない。ゲノム配列中にＣｐＧ島を同定するためのアルゴリズムは公知である（例えば、Ｔａｋａｉ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， ２００２；及びＴａｋａｉ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ ２００３を参照されたい。）。本発明の別の実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡであり、及び標的プロモーター内の標的領域は、ＣＧ二ヌクレオチドを含まない。
【００４３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）も、本発明の方法において使用するための好ましいオリゴマーである。様々なＰＮＡ構成が、本分野において公知である。例えば、ＰＮＡオリゴマーは、場合によって、１つのＰＮＡオリゴマーが、ワトソン−クリック塩基対合を介して標的を結合し、第二のオリゴマーがフーグスティーン認識を介して結合するビスＰＮＡとして調製されるホモピリミジンであり得（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，２００４を参照されたい。）、１つ又はそれ以上のアデニンがジアミノプリンで場合によって置換されているホモプリンであり得（例えば、Ｈａａｉｍａ ｅｔ ａｌ， １９９７を参照されたい。）、又は、場合によって標的配列において尾部固定（ｔａｉｌ−ｃｌａｍｐ）を形成するように構成された混合プリン／ピリミジンであり得る（例えば、Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。好ましい実施形態において、ＰＮＡは、一本鎖の混合プリン／ピリミジンである。
【００４４】
本発明の方法では、ＤＮＡオリゴマーを使用することも可能である。しかしながら、修飾されていないオリゴデオキシヌクレオチドは、ヌクレアーゼによって素早く分解される。従って、ＤＮＡオリゴマーを使用する場合には、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、ＤＮＡオリゴマーは、好ましくは化学修飾を有する。ヌクレアーゼ耐性を増加させるための様々な化学修飾が、本分野において公知である。最も単純で、最も広く使用されている修飾は、硫黄原子がオリゴホスファート骨格中の非架橋酸素を置換するホスホロチオアート（ＰＳ）修飾である。ＤＮＡオリゴマーは、多数の業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）から市販されている。
【００４５】
使用可能なオリゴマーの他の種類には、モルホリノオリゴマー（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，１９９７を参照されたい。）及びＬＮＡ（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ，２０００を参照されたい。）が含まれる。オリゴマーと接触される哺乳動物細胞は、インビトロ（例えば、培養された細胞）又は宿主中におけるインサイチュとすることができる。培養細胞の例には、初代細胞、（例えば、細胞株由来の）癌細胞、成体又は胚性幹細胞、神経細胞、繊維芽細胞、筋細胞などが含まれる。細胞は、あらゆる動物から得ることが可能である。一実施形態において、細胞は、インビトロのヒト細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、乳癌細胞であり、及び遺伝子は、ヒトプロゲステロン受容体である。他の実施形態において、細胞は、がん細胞であり、並びに遺伝子は、Ｅ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００４６】
治療的効果（例えば、アポトーシスの誘導、癌細胞中での増殖の停止など）に対する遺伝子のプロモーター領域を標的とするオリゴマーをスクリーニングするために、ヒトの疾病又は疾患に対する治療薬の候補を検査するために一般的に使用される培養ヒト細胞を使用することができる。細胞がインサイチュである場合には、宿主はあらゆる哺乳動物であり得、ある種の好ましい実施形態は、ヒトであり、又はヒトの疾病若しくは疾患の研究において使用される動物モデル（例えば、げっ歯類、イヌ、ブタなどの動物モデル）である。
【００４７】
接触工程では、細胞にオリゴマーを送達するために使用される方法は、使用されるオリゴマーに、及び細胞がインビトロ又はインビトロであるかどうかに応じて変動し得る。インビトロの細胞の場合、細胞中への直接注入によって、送達を達成することができる。微少注入が選択肢でない場合、幾つかの事例では、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）などの疎水性又は陽イオン性担体を使用することによって、送達を強化することが可能である。本発明の一実施形態において、細胞は、インビトロで培養された細胞であり、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、並びに細胞は、オリゴマー及び陽イオン性脂質を含む組成物と接触される。ＰＮＡオリゴマーは、ＰＮＡオリゴマーを部分的に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド及び陽イオン性脂質（２１から２５）と複合体化させることによって、インビトロで細胞中に導入することができる。脂質は、ＤＮＡの内部移行を促進するのに対して、ＰＮＡは積荷として進入し、その後放出される。
細胞性取り込みを促進するために、ペネトラチン、トランスポータン、Ｔａｔペプチド、核移行シグナル（ＮＬＳ）及びその他のペプチドなどのペプチドをオリゴマーに付着させることが可能である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ， ２００４；Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｋａｉｈａｔｓｕ， ｅｔ ａｌ， ２００４；及び参考文献７を参照されたい。）。あるいは、リゾレシチンなどの透過剤を用いて細胞を透過化した後、オリゴマーと接触させることができる。インビトロでオリゴマーを細胞に送達させるために、ウイルス形質導入を使用することが可能である（例えば、レンチウイルス形質導入、例えば、参考文献７を参照されたい。）。しかしながら、本発明のある種の実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まないことが好ましい。さらなる好ましい実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まず、及びオリゴマーは、核移行ペプチドに付着されない。
【００４８】
インサイチュ細胞の場合、オリゴマーの送達を促進するために、陽イオン性脂質（例えば、Ｈａｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ， ２００４を参照されたい。）及びポリエチレンイミンなどのポリマー（例えば、Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ， ２００５を参照されたい。）が使用されてきた。（担体溶液中の）オリゴマーから実質的になる組成物は、宿主中へ直接注入することが可能である（例えば、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９９； ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ， ２００２を参照されたい。）。本発明の好ましい実施形態において、細胞は宿主中においてインサイチュであり、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、及び細胞は、オリゴマーから実質的になる組成物と接触される。二重鎖ＲＮＡのインビボ適用は、Ｐａｒｏｏ及びＣｏｒｅｙ（２００４）に概説されている。
【００４９】
典型的には、本発明の方法は、対照条件及び／又は基底発現レベルに比べて、標的転写物の合成を少なくとも１．２倍増加させる。他の実施形態において、少なくとも１．５、１．７、２．０、２．５、３．０、３．５又は４．０倍の増加が達成される。ウイルス形質導入なしに、標的転写物の効率的な増加された合成を達成することが可能であり、実際、好ましい実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まない。標的プロモーターの複数の領域を標的とすることが可能であるが、標的転写物の高度に効率的な増加した合成は、標的プロモーターの単一領域のみを標的とするｄｓＲＮＡを用いた場合に達成され得る。例えば、一実施形態において、オリゴマーは、１８から２５塩基のｄｓＲＮＡであり、対照条件及び／又は基底発現レベルに比べて、標的転写物の合成が少なくとも２倍増加し、標的プロモーターの単一領域が標的とされる。オリゴマーのｎＭ又はｐＭ（μＭ未満）濃度を用いて標的転写物の合成の顕著な増加を達成することが可能であり、典型的には、所望の増加された合成をもたらすために可能な限り最小の濃度を使用することが好ましく、例えば、１から１００ｎＭ範囲のオリゴマー濃度が好ましく、より好ましくは、濃度は、１から５０ｎＭ、１から２５ｎＭ、１から１０ｎＭ又はｐＭ範囲である。
【００５０】
本明細書に開示及び例示されているように、選択的な遺伝子活性化のためのこれまでのところ理解されていない内在性機序を活用することによって、本発明者らの方法は、一般に、多様な標的遺伝子、プロモーター領域、オリゴマー、哺乳動物細胞種及び送達条件にわたって適用可能である。所定のオリゴマーが所定の標的遺伝子の転写を選択的に活性化させる条件は、（例えば、本明細書に記載されているプロトコールに従って）必ず経験的に確認されているのに対して、本発明者らは、本発明者らが研究したあらゆる哺乳動物遺伝子に対するオリゴマーを活性化させることを一貫して見出しており、本発明者らのデータは、哺乳動物細胞が、これらの方法を用いて、遺伝子選択的活性化を標的化するのに一般的に好ましいことを示唆している。
【００５１】
本方法の検出工程において、細胞に接触しているオリゴマーから生じた標的転写物の選択的な増加された合成が検出される。これは、遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルの増加を測定することによって直接的に、又は対照と比べて、対応するコードされたタンパク質の増加されたレベルを検出することによって間接的に測定することが可能である。あるいは、標的転写物の生じた選択的な増加された合成は、標的転写物の増加した合成の指標である表現型の評価に基づいて、推測され得る。
【００５２】
本発明の別の態様において、遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させるためのポリヌクレオチドオリゴマーが提供され、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のヌクレオチド配列を含むオリゴマーは、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する。遺伝子を含む細胞中に導入されると、オリゴマーは、標的転写物の転写を選択的に増加させる。一実施形態において、標的転写物は、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；主要ヴォールトタンパク質）、ヒトＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ヒトｐ５３及びヒトＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、オリゴマーは、ＲＮＡ，ＤＮＡ、ペプチド核酸又はモルホリノである。一実施形態において、核酸オリゴマーは、１８から２５塩基のｄｓＲＮＡである。
【００５３】
転写物合成を選択的に増加させる特異的遺伝子標的及びｄｓＲＮＡ配列が、表１に列記されている。各ｄｓＲＮＡの１つの鎖のみ（５’から３’に示されている。）が示されている。さらに、ｄｓＲＮＡは、各鎖上に３’−ジチミジン突出部を有していた。
【００５４】
【表１】
【００５５】
本発明のさらなる態様において、本発明は、先述されている発明の何れかを広告し、市販し、販売し又は実施許諾することを含む、事業を行う方法を提供する。
【実施例１】
【００５６】
ａｇＲＮＡによって誘導された転写の増加
ＭＶＰ：以前に記載した方法（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５）を用いて、転写開始部位に対して−８２から−６４（−８２／−６４）に位置する主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ， ２０００）及びｐ５３部位（−５４／−３６）を標的とするｄｓＲＮＡは、それぞれ、ＲＮＡ及びタンパク質のレベルで、２．９倍及び３．８倍のＭＶＰ発現の増加を引き起こした。
【００５７】
Ｅ−カドヘリン：Ｅ−カドヘリンの−１０／＋９領域を標的とするＲＮＡ（ＥＣ９と称される。）は、ＲＮＡ及びタンパク質のレベルで、１．５から２．１倍のＥ−カドヘリン発現の増加を引き起こした。−９／＋１０、−１３／＋６及び−１４／＋５を標的とするＲＮＡは、発現及び遺伝子活性化の増加を引き起こさず、又は阻害した。ＥＣ９によるＥ−カドヘリン発現の活性化は、３つの独立した実験において観察された。
【００５８】
ｈ−ＰＲ：本発明者らは、プロゲステロン受容体（ＰＲ）に対して相補的な２１個のＲＮＡを検査してきた（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。これらの幾つかは、遺伝子発現を効率的に遮断したが、これらの実験中に、本発明者らは、幾つかのＲＮＡは、小さいが再現性のある発現の増加をもたらすことが認められることに驚いた。これらの観察を追跡するために、本発明者らは、血清の低下したレベルを有する培地中で細胞を増殖させることによって、ほぼ基底レベルまでＰＲの発現を低下させた。これらの条件下で増殖された細胞に、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）が形質移入されると、ｈＰＲ発現の顕著な増加が観察された。表２は、標的とされる領域を示しており、及び様々な実験から得られた増加された発現のレベルを示している。
【００５９】
【表２】
【００６０】
−９／＋１０を標的とするａｇＲＮＡは、血清中で増殖される細胞中のｈＰＲを阻害することが既に示されているのに対して、他のＲＮＡは全て、不活性であり、又は僅かな活性化を示した。これらの結果には再現性があり、通常の１０％血清（ｈＰＲを活性化させる条件）中で、及び２．５％血清（ｈＰＲ発現の低いレベルをもたらす、血清が除去された条件）中で観察される。
【００６１】
ｐ５３：ｐ５３に対するプロモーターにＲＮＡを標的化している間に、本発明者らは、転写調節の別の形態を発見した。主要なｐ５３イソフォームの発現は減少（喪失）したのに対して、より低い見かけの分子量を有するｐ５３イソフォームの発現は、以下の領域、すなわち、ｐ５３の主要なイソフォームの転写開始部位に対して−７／＋１２、−９／＋１０及び−１３／＋６を標的とした場合に増加した（表１、配列番号７から９参照）。このより低い分子量のｐ５３イソフォームは、他の研究者によっても最近記載された（Ｂｏｕｒｄｏｎ， ｅｔ ａｌ， ２００５； Ｒｏｈａｌｙ ｅｔ ａｌ， ２００５）。変化されたＲＮＡ発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
【００６２】
ｐ５３遺伝子プロモーターは、別の転写開始部位を含有する。表３は、標的転写物の合成を選択的に増加させるための典型的なｐ５３転写開始部位に近い標的領域／オリゴ対を開示している。各ｄｓＲＮＡの１つの鎖（５’から３’へと示されている。）のみが示されている。
【００６３】
【表３】
【００６４】
本発明者らは、ＰＴＥＮを標的とする二重鎖ＲＮＡで細胞を形質移入したときに、第二の遺伝子のイソフォーム発現の同様の上方制御も観察した（表１、配列番号１０から１２を参照。）。
【実施例２】
【００６５】
転写開始部位近くを標的とするアンチジーンＰＮＡ（ａｇＰＮＡ）オリゴマーによる、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の増加された発現。
【００６６】
細胞培養 １０％（ｖ／ｖ）熱不活化（５６℃、１時間）ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、０．５％非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４単位／ｍＬウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ）及び１００単位／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ）中に、３７℃及び５％ＣＯ２で、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞（アメリカン・タイプ・セル・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ）を維持した。
【００６７】
ＰＮＡの脂質媒介性形質移入 ＰＮＡは、記載されているとおりに取得する（Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００４）。形質移入の二日前に（第２日）、６ウェルプレート中に、８０，０００細胞／ウェルで、Ｔ４７Ｄ細胞を播種する（Ｃｏｓｔａｒ）。形質移入の当日に（第０日）、二重鎖（２００ｎＭ）及びオリゴフェクタミン（９μＬ／ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈する。２４時間後（第１日）に、培地を交換する。第３日目に、新しい６ウェルプレート中に、１：４で細胞を継代する。第５日目に、細胞に二度目の形質移入を行う。第８日目に、細胞を採取する。ｈＰＲタンパク質レベルは、抗ｈＰＲ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ分析によって評価する（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００６８】
ＲＮＡ分析。トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、処理されたＴ４７Ｄ細胞から得た全ＲＮＡを抽出する。きょう雑しているＤＮＡを除去するために、デオキシリボヌクレアーゼで、ＲＮＡを処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ランダムプライマーによって、４μｇを逆転写させる。
【００６９】
顕微鏡観察。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立光透過型光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ）を用いた共焦点顕微鏡によって、細胞を画像撮影する。自動化されたプログラムを用いて、Ｚ平面中の距離を追跡することによって、細胞の高さの概則を行う。観察のために、個別の細胞を選択し、次いで、個別の細胞の何れの部分も焦点に入らないようになるまで、顕微鏡を過少焦点の状態にする。Ｚ平面中の過少位置が認められ、次いで、細胞が完全に焦点から外れるまで、細胞を通じて、焦点平面を上方向に移動させる。過剰焦点位置が認められ、細胞の高さ（Ｚ次元）の大まかな推測を計算することができる。
【００７０】
生物学的に活性なＰＮＡの細胞性取り込み 部分的に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド及び陽イオン性脂質と細胞を複合体化することによって、ＰＮＡを細胞中に導入する。脂質は、ＤＮＡの内部移行を促進するのに対して、ＰＮＡは、積荷として進入し、続いて放出される。
【００７１】
ａｇＰＮＡによるｈＰＲ発現の活性化。ｈＰＲの転写開始部位（−１００から＋２５）付近を標的とし、Ｃ及びＮ末端リジンを含有する１９塩基のＰＮＡを調製し、２００ｎｍの濃度で細胞中に形質移入する。ａｇＰＮＡによって誘導されたｈＰＲタンパク質発現の増加を、ウェスタン分析によって測定する。
【実施例３】
【００７２】
ＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡは、血管新生化を増加させる
ヒトＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター領域は、性質が決定されている（例えば、Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９１を参照されたい。）。転写開始部位は、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ０９５７８５．１）中の２３６３位に位置する。テンプレート鎖に対して完全に相補的であり、及び遺伝子の転写開始部位付近（−５０から＋２５、転写開始は＋１である。）を標的とする１９マーのａｇＲＮＡを調製する。典型的なａｇＲＮＡは、表４に示されている（第二の鎖及び二ヌクレオチド突出部は示されていない。）。
【００７３】
【表４】
【００７４】
ＶＥＧＦ転写物の合成を選択的に増加させるａｇＲＮＡの効果は、初代ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）中で測定される。ＶＥＧＦ転写物の得られた選択的な増加された合成は、細胞増殖の増加から推測して検出され、及び／又は対照に対するＶＥＧＦ遺伝子転写物の増加を測定することによって直接検出される。以下に記載されているように、心筋虚血の治療のための動物モデル及び臨床試験において、ＶＥＧＦ遺伝子転写の少なくとも２倍の増加をもたらすａｇＲＮＡを評価する。
【００７５】
虚血性心臓モデル 公知の方法（例えば、Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００２；及びＳｕ ｅｔ ａｌ， ２００４を参照。）を用いて、虚血性心臓マウスモデルへＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡを送達するために、アデノウイルスベクターを構築する。腹腔内注射によって、２．５％Ａｖｅｒｔｉｎ１５から１６μＬ／ｇ体重で、ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に麻酔をかける。小動物用従量式換気装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ， ｍｏｄｅｌ ６８３， Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）によって、動物の呼吸を調節した後、第四肋間腔中に、開胸切開を施す。心臓を露出させるために、切開内に、手術用開創器を配置する。虚血を誘導するために、６−０非吸収性外科用縫合糸で、冠動脈前下降枝を永久的に結紮する。Ｈｅｐｅｓ生理的食塩水（ｐＨ７．４）の５０μＬ中のウイルスベクターの１×１０１１ゲノムを、虚血領域周囲の左心室壁上の心筋の複数部位へ注射する。対照マウスには、緩衝液の注射を与える。手術の４週後に、心機能を評価する。左心室拡張末期径（ＬＶＤｄ）及び収縮末期径（ＬＶＤｓ）を測定する。短縮化割合のパーセント（ＦＳ％）は、（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ×１００として計算される。
【００７６】
心エコー後に集められた心臓を切片化し、抗血小板内皮細胞接着分子１及び平滑筋α−アクチン抗体で染色する。血管は、６つの領域（３つは左心室の横断面中の前壁上、３つは後壁上）上でカウントする。領域１は、専ら筋肉組織から構成され、領域２は筋肉と瘢痕の両方を有し、領域３は瘢痕のみを有する。ベクターは、前壁の領域２中に注入される。従って、前中の注射された領域と対応する注射されていない後領域との比較は、ＶＥＧＦ発現に対するａｇＲＮＡの効果を示す。毛細血管密度は、領域１については、心筋細胞に対する毛細血管の比として表され、領域２及び３については、１ｍｍ２当りの毛細血管数として表される。α−アクチン陽性血管の密度は、１ｍｍ２当りの又は全領域の血管数として表される。ＶＥＧＦ発現の活性化は、同じ心臓中の後壁と比べた及び対照群の前壁と比べた前壁の３つの領域全てにおける毛細血管及びα−アクチン陽性血管の増加によって示される。
【００７７】
臨床試験：ヒトにおけるＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡ療法の安全性及び有効性は、Ｌｏｓｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ（２００２）によって記載された研究に倣って設計された臨床試験において評価される。適格性を有する患者には、最大の医学的治療に対して難治性のカナダ心臓血管協会（ＣＣＳ）クラスＩＩＩ又はＩＶ狭心症、バイパス手術又は血管形成術に適していない多枝冠動脈疾患及びストレスＳＰＥＣＴＴｃ９９ｍセスタミビ核影像法上での可逆的虚血が含まれる。被験者が、悪性腫瘍の既往歴又は現時点での兆候、活性な糖尿病性網膜症又は重度のＬＶ収縮不全の兆候（経胸壁２次元心エコーによって、ＬＶ駆出率［ＥＦ］＜２０％）を有していれば、被験者を除外した。
【００７８】
ＶＥＧＦ誘導性ａｇＲＮＡ発現ベクターを患者中に注射する。被験者は、虚血性心筋の中心部に注射を誘導するために、ベクターの注射の直前に、非経口透視ＬＶＥＭＭを受ける。注射から１２週目に、追跡ＥＭＭを実施する。予め指定された主な有効性パラメータは、１２週の追跡調査のための訪問時におけるＣＣＳ狭心症分類中のベースラインからの変化及び運動耐容性である。
【実施例４】
【００７９】
ａｇＲＮＡによって誘導された転写の増加
遺伝子活性化は、遺伝子発現の低い基底レベルに対してさらに容易に観察できると、本発明者らは推論した。従って、本発明者らの仮説に取り組むために、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中で観察されるより、ずっと低いＰＲタンパク質発現の基底レベルを有する乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞中に二重鎖ＲＮＡを導入した（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ａ） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １３：７８７−７９２； Ｊｅｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：７８７９−７８８４）。
【００８０】
本発明者らは、−１１から＋８のＰＲプロモーター配列に相補的な二重鎖であるＲＮＡＰＲ１１を用いた検査を開始した。ＰＲ１１は、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現を阻害しなかったが、強力な阻害剤であるａｇＲＮＡによって取り囲まれていたので、本発明者らは、ＰＲ１１を選択した。比較のために、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現の強力な阻害剤であることを本発明者らが以前に示したＲＮＡｐＲ９及びＰＲ２６も検査した。
【００８１】
本発明者らは、陽イオン性脂質を用いて、二重鎖ＲＮＡＰＲ１１をＭＣＦ−７細胞中に導入し（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ｂ） Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：４３６−４４３）、ウェスタン分析によって、ＰＲタンパク質のレベルの１８倍の増加を観察し、適切な細胞状況で検査された場合に、ａｇＲＮＡが遺伝子発現の大幅な上方制御を引き起こし得ることを示した。ＰＲ９の添加はＰＲ発現に影響を与えなかったのに対して、ＰＲ２６は、ＰＲレベルを２倍微増させた。ＰＲｍＲＮＡ内の下流コード配列に対して相補的である２つのｓｉＲＮＡは、ＰＲタンパク質の発現を阻害し、ＰＲレベルは、ＭＣＦ−７細胞中において、標準的な転写後発現停止によって低下され得ることを示している。
【００８２】
ＰＲ１１による遺伝子発現のＲＮＡ媒介性活性化を観察した後、本発明者らは、本現象の特異性及び効力についてアッセイを行った。本発明者らは、二重鎖の何れかの末端において相補性を保存するミスマッチなど、多数のミスマッチ及びスクランブルされた対照二重鎖を調べた。これらの対照二重鎖は、ＰＲの発現を増加させず、上方制御が配列特異的であることを示している。様々な濃度のＰＲ１１の添加によって、活性化が強力である（１２ｎＭの濃度で１７倍の活性化が達成された。）ことが示された。
【００８３】
次いで、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中において、二重鎖ＲＮＡによる遺伝子活性化を再度調べた。活性化の明瞭な観察を容易にするために、本発明者らは、活性炭処理された血清を含有する培地中で細胞を増殖させることによって、ＰＲ発現の基底レベルを低下させた（Ｈｕｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ）。予想通り、ホルモンを欠如する血清除去培地の使用は、ＰＲ発現を低下させた。ＲＮＡＰＲ１１の添加は、通常の培地中のＴ４７Ｄ細胞に対して観察されたレベルまでＰＲ発現を誘導した。これらの結果は、ＰＲ１１が、２つの異なる乳癌細胞種で同一の生理的効果を有すること、及びＰＲ１１は、ホルモン受容体発現を操作するための十分に確立された機序を相殺できることを示している。
【００８４】
ＰＲタンパク質は、生理的プロセスにおいて異なる役割を果たす２つのイソフォームＰＲ−Ａ及びＰＲ−Ｂとして発現される（Ｃｏｎｎｅｅｌｙ ｅｔ ａｌ，（２００３） Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：２０５−２１４）。ＰＲ−Ｂに対するプロモーターは、ＰＲ−Ａに対するプロモーターの上流に存在し、本研究で使用されるＲＮＡは、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とする。本発明者らは、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とする（ａｇＲＮＡ、アンチジーンＰＮＡ）又はＰＲ−ＢｍＲＮＡを標的とする（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＰＮＡ）ａｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＰＮＡ又はアンチジーンＰＮＡは、ＰＲ−Ａのレベルも低下させることを以前に観察しており（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００６ａ； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００６ｂ；及びＪａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ｃ） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ １：２１０−２１５）、ＰＲ−Ａの発現が、ＰＲ−Ｂの発現と関連していることを示唆している。本発明者らは、ここに、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とするＲＮＡが、ＰＲ−ＢとＰＲ−Ａの両タンパク質の発現を増強させ得ることも観察し、これらのイソフォームの発現が関連していることの補完的な証拠を与える。
【００８５】
活性を標的配列と相関させるために、本発明者らは、ＰＲプロモーター内の領域−５６から＋１７を通じて配列に標的化される一連の二重鎖ＲＮＡを検査した。これらの二重鎖ＲＮＡの幾つかは、ＰＲの発現を５倍又はそれ以上誘導した（表５）。標的配列の小さなシフトが、活性化に対して重大な帰結をもたらした。例えば、ＰＲ１１から上流（ＰＲ１２）又は下流（ＰＲ１０）への単一の塩基シフトは、活性化を大幅に低下させた。実験を数回繰り返したが、類似の結果が得られた。これらのデータは、プロモーター全体の配列が適切な標的であること、及びＲＮＡ媒介性遺伝子活性化のための要件は柔軟であることを示している。
【００８６】
【表５】
【００８７】
本発明者らは、活性化するＲＮＡＰＲ１１での形質移入前又は後の何れかに、非活性のＲＮＡＰＲ１０又はＰＲ１２が形質移入される添加順序実験を行った。
ＰＲ１０又はＰＲ１２を最初に細胞に添加した場合には、本発明者らは、その後のＰＲ１１の添加が活性化をもたらさないことを観察した。最初にＰＲ１１が細胞に添加された場合には、ＰＲ１０又はＰＲ１２は、遺伝子活性化を遮断しなかった。これらの競合アッセイは、非活性なＲＮＡＰＲ１０及びＰＲ１２がＰＲ１１と同一の標的配列に結合することを示している。認識は、ＰＲ１１の結合を遮断し、ＰＲ発現の活性化を妨げるのに十分である。ＰＲ１０及びＰＲ１２とのＰＲ１１の競合は、ＰＲのＲＮＡ媒介性活性化の標的及び配列特異性をさらに実証する。
【００８８】
【表６】
【００８９】
二重鎖ＲＮＡが他の遺伝子の発現を活性化することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ）（Ｈｕｆｆｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，（２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：２２５３−２２６１）に標的化された一連のＲＮＡを調べた。本発明者らは、以前に、ａｇＲＮＡでその発現を停止させたので、ＭＶＰを選択した。（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。ＭＶＰ６及びＭＶＰ９は、遺伝子発現を阻害したが、この結果は、本発明者らが以前に報告した結果である（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。これに対して、ＭＶＰ３５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２３８５０９、ＧＩ：５８３４８７のヌクレオチド１８１９から１８３７のヌクレオチドに対応する。）、ＭＶＰ５４及びＭＶＰ８２は、正常なレベルより２から４倍発現を増加させた。これらのデータは、二重鎖ＲＮＡが、発現の比較的高い基底レベルを有する遺伝子の発現を強化できることを示しており、本発明者らによる、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲのＲＮＡ媒介性上方制御の最初の観察と類似している。
【００９０】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によって、ＰＲ１１でのＭＣＦ−７細胞の処理が、様々な細胞培養条件下で、ＰＲｍＲＮＡの発現を増強することが明らかとなる。本発明者らは、以前に、ｓｉＲＮＡによるＴ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現の阻害を示しており（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ（２００６） Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， Ｅｐｕｂ、２００６年６月１３日の時点で出版されていない。）、又はインターロイキン１β（ＩＬ−１β）での誘導後に、ａｇＲＮＡがシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現を著しく増加させることを示した（非公開）。本発明者らは、ここに、ＲＮＡＰＲ１１での処理後におけるＭＣＦ−７細胞中でのＰＲ遺伝子発現の活性化が、ＩＬ−１βの存在下又は不存在下でＣＯＸ−２発現を低下させることを観察する。ＰＲ１１での細胞の処理は、ＰＲ発現の中心的制御物質であるエストロゲン受容体−α（ＥＲ−α）のレベルを変化させなかった。従って、本発明の特定の実施形態は、細胞中でのＣｏｘ−２発現を減少させる方法であり、オリゴマーがヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の合成を選択的に増加させる条件下で、ｈＰＲ遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及びＣｏｘ−２の減少された合成を検出する工程を含み、前記オリゴマーが好ましくは二本鎖ＲＮＡである、前記方法である。
【００９１】
本発明者らのデータは、予測可能な様式で、生理的に意味のある下流の標的遺伝子の発現を操作するために、ＲＮＡの活性化を使用できること、及び誘導されたＰＲは完全に機能的であることを示している。
【００９２】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｄａｖｉｄ Ｒ． Ｃｏｒｅｙ、Ｄａｖｉｄ Ｓ． Ｓｈａｍｅｓ、Ｂｅｔｈａｎｙ Ａ． Ｊａｎｏｗｓｋｉ及びＪｏｈｎ Ｄ． Ｍｉｎｎａ
関連出願の相互参照：本願は、２００５年１１月１７日に出願された米国仮出願第６０／７３８，１０３号の優先権を主張する。
【０００２】
譲受人：Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ
本研究は、国立衛生研究所によって授与された補助金（ＮＩＧＭＳ６０６４２及び７３０４２；並びにＰ５０ＣＡ７０９０７）の下、連邦政府の支援を受けて為された。連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野：発明の分野は、遺伝子のプロモーター領域を標的化するポリヌクレオチドオリゴマーを用いて、遺伝子転写物合成を調節することである。
【背景技術】
【０００４】
二重鎖ＲＮＡがｍＲＮＡを認識する能力及び転写後ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて遺伝子発現を発現停止させる能力は、広く理解されている（Ｔａｎｇ，２００４）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節するための一般的な研究ツールとなっており、内在性に発現されたミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、増え続ける細胞経路の多数に関与する。
【０００５】
ＲＮＡ誘導性のＤＮＡメチル化は、植物において最初に記載され（Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ ２００４）、ＲＮＡウイルス及びウイロイドがゲノムＤＮＡ配列中にメチル化を誘導できることが見出された（Ｍａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４）。メチル化された塩基は、ＲＮＡに相補的なＤＮＡの配列内に濃縮されており、認識のための配列特異的機序が推測される（Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ２０００）。
【０００６】
酵母では、セントロメア反復配列及び接合型座位を標的とする小さなＲＮＡが、ヘテロクロマチンの修飾を促進することによって遺伝子発現を発現停止させることができる（Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｍｏａｚｅｄ ２００３； Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ ２００５）。クロマチン修飾には、ヒストンＨ３のリジン９のメチル化が関与しており（Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ）、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ（Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ ２００５）及びＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｓｃｈｒａｍｋｅ ｅｔ ａｌ ２００５）を必要とする。修飾には、転写後発現停止にも関与しているタンパク質ファミリーのメンバーであるアルゴナウト１（Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ ２００４）などのＲＮＡ誘導性転写発現停止（ＲＩＴＳ；ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ 発現停止）経路（Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ ２００３）のタンパク質が関与している。
【０００７】
最近、染色体ＤＮＡを標的とする短いオリゴヌクレオチドであるアンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ；ａｎｔｉｇｅｎｅＲＮＡ）も哺乳動物細胞中の発現を発現停止させ得ることが、幾つかの報告によって示唆されている。Ｋａｗａｓａｋｉ及びＴａｉｒａは、ＣｐＧ二ヌクレオチドを含有するＥ−カドヘリンプロモーター内の配列に１０個の二重鎖ＲＮＡを標的化した（Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ， ２００４）。ＤＮＡのメチル化は、これらの部位の全てにおいて観察された。各ＲＮＡはＥ−カドヘリン発現の僅かな低下をもたらすに過ぎなかったが、１０個のＲＮＡ全てが合わされると、より完全な発現停止を達成することができた。メチル転移酵素遺伝子であるＤＭＮＴ１及びＤＭＮＴ３Ｂが発現停止された場合に、二重鎖ＲＮＡがＥ−カドヘリンの発現を阻害できなかったという観察によって、メチル化と発現停止の間の関連が裏付けられた。
【０００８】
同様の研究において、Ｍｏｒｒｉｓと共同研究者は、伸長因子１α（ＥＦ１Ａ）のプロモーターを標的とする二重鎖ＲＮＡが発現を阻害し得ることを示した（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， ２００４）。Ｍｏｒｒｉｓと共同研究者は、標的配列においてＤＮＡのメチル化を観察し、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチン（ＴＳＡ）とともに、メチル化の阻害剤である５’−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）を添加することによって、発現停止が元に戻ることを観察した。Ｔａｉｒａ及びＭｏｒｒｉｓの研究室から得られた研究は、ＲＮＡが哺乳動物細胞中での発現停止のためにＤＮＡを標的とし得るという証拠を与え、ＲＮＡがＤＮＡのメチル化を誘導し得ることを示唆したので重要であった。Ｍｏｒｒｉｓの研究では、合成ａｇＲＮＡによる発現停止には、核取り込みを促進するように設計されたペプチドの使用が必要であったが、他の研究は、標準的な形質移入操作で十分であることを示唆している（Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ ２００４； Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ ２００５； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ ２００５； Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５）。
【０００９】
哺乳動物細胞中において、ＲＮＡによって誘導されたメチル化を達成するための他の試みは、これらに比べて成功を収めていない。Ｓｔｅｅｒ及び共同研究者は、ハンチントンをコードする遺伝子を標的とするＲＮＡを検査したが、メチル化は一切検出されなかった（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ ２００４）。マウス卵母細胞中で二本鎖ＲＮＡを安定的に発現させた場合に、ＲＮＡによって誘導されるメチル化は観察されなかった（Ｓｖｏｂｏｄａ， Ｐ． ｅｔ ａｌ ２００４）。Ｒｏｓｓｉ及び共同研究者は、腫瘍抑制因子ＲＡＳＳＦ１Ａに対するプロモーター内に存在する十分に性質決定されたＣＧ島を標的とするために、発現された短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用した（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ ２００５）。Ｒｏｓｓｉ及び共同研究者は、遺伝子発現の穏やかな阻害を報告した。メチル化特異的ＰＣＲアッセイはメチル化を示したが、より完全な亜硫酸水素塩配列決定アッセイはメチル化を示さなかった。
【００１０】
本発明者らの研究室は、染色体ＤＮＡの効率的なＲＮＡ媒介性発現停止が、ＤＮＡのメチル化とは独立に達成できることを発見した（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ ２００５； ＵＳ Ｐａｔ ａｐｐｌ ｎｏ． ６０／６６１，７６９）。本発明者らは、転写の開始を妨害することによって発現を遮断するために、転写開始部位を標的とした。転写開始部位を標的とする実際上の利点は、それらが全ての遺伝子中に存在すること、及び標的配列の一般的で、予測可能なクラスを提供することである。転写開始部位の標的化は、メチル化が起こっているかどうかにかかわらず、遺伝子発現を遮断することも予測される。
【００１１】
他の研究とは異なり、本発明者らは、メチル化特異的ＰＣＲ又は亜硫酸水素ナトリウム配列決定によってメチル化を全く観察しなかった。５−アザＣ又は抗メチル転写酵素ｓｉＲＮＡを用いたメチル転写酵素活性の阻害は、遺伝子発現停止に対して全く影響を及ぼさず、メチル化が発現停止に関与していないことが示唆された。本発明者らが観察した発現停止は、先行研究で報告されたものより強力であり、転写開始部位がａｇＲＮＡに対する特に感受性が高い標的であり得ることを示唆する。
【００１２】
Ｂａｙｌｉｎ及び共同研究者らは、Ｅ−カドヘリンの転写的発現停止を再び取り上げた（Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５）。Ｂａｙｌｉｎ及び共同研究者らは、プロモーターによって標的とされる２つの二重鎖ＲＮＡを直列で使用した場合には、遺伝子発現の効率的な発現停止を観察したが、ＲＮＡを個別的に使用した場合には、遺伝子発現の効率的な発現停止を観察しなかった。Ｂａｙｌｉｎは、ＤＮＡメチル化の証拠を観察しなかった。
【００１３】
Ｅ−カドヘリン遺伝子プロモーターを標的とするｓｉＲＮＡは、培養された乳癌細胞中で転写を活性化することができることが報告されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。同様に、プロモーターを標的とするｓｉＲＮＡによる、増加されたＥＦ１ＡｍＲＮＡ発現を示唆するデータが提示されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ ２００４；図３Ａ参照、最初の２つの棒）。核に局在化された、ＮＲＳＥ配列をコードする小さな調節性二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）は、成人海馬神経幹細胞中で、ＮＲＳＥ遺伝子の転写の活性化の引き金を引くことも報告されている（Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ， ２００４； ａｎｄ Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ， ２００５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第６０／６６１，７６９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｔａｎｇ （２００４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ３０：１０６−１１４．
【非特許文献２】Ｍａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １６７７，１２９−１４１．
【非特許文献３】Ｍａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｃｅｌｌ ７６：５６７−５７６．
【非特許文献４】Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ａｎｄ Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ （２０００） ＲＮＡ ６：５５−６５．
【非特許文献５】Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｍｏａｚｅｄ （２００３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：７９８−８０２．
【非特許文献６】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ （２００５） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：１６３５−１６５５．
【非特許文献７】Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ （２００２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３３−１８３７．
【非特許文献８】Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：１５２−１５７．
【非特許文献９】Ｓｃｈｒａｍｋｅ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：１２７５−１２７９．
【非特許文献１０】Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １８：２３５９−２３６７．
【非特許文献１１】Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：６７２−６７６．
【非特許文献１２】Ｋａｗａｓａｋｉ ａｎｄ Ｔａｉｒａ （２００４） Ｎａｔｕｒｅ ４３１：２１１−７．
【非特許文献１３】Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：１２８９−９２．
【非特許文献１４】Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ （２００５） ＭｏＩ． Ｔｈｅｒａｐｙ １２：１７９−１８３．
【非特許文献１５】Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １：２１６−２２２．
【非特許文献１６】Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ３７：９０６−１０．
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ３２３：２７５−２８０．
【非特許文献１８】Ｓｖｏｂｏｄａ， Ｐ． ｅｔ ａｌ （２００４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ３２：３６０１−３６０６．
【非特許文献１９】Ｌｉ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４６：６１０５．
【非特許文献２０】Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｃｅｌｌ １ １６：７７９−７９３．
【非特許文献２１】Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒｉｅｓ ４９：８７−８８．
【発明の概要】
【００１６】
本発明の一態様において、哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法であり、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程、を含む。
【００１７】
一実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５、−３０から＋１７及び−１５から＋１０ヌクレオチドの間に位置している。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。
【００１８】
一実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターである。別の実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のイソフォームのプロモーターである。さらなる実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターであり、且つ標的転写物のイソフォームのプロモーターである。
【００１９】
一実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノからなる群から選択される。特定の実施形態において、オリゴマーは、１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである。
【００２０】
一実施形態において、オリゴマーは、２’化学修飾を有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴマーは、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基残基の取り込み及びロックされた核酸からなる群から選択される血清安定性増強化学修飾を含む。
【００２１】
一実施形態において、細胞は、インビトロでの培養された細胞である。別の実施形態において、細胞は、宿主内においてインサイチュである。
【００２２】
一実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まない。さらなる実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まず、及び細胞は、オリゴマーから実質的になる組成物と接触される。さらなる実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まず、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる。別の実施形態において、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、標的プロモーターの単一の領域が標的化され、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる。別の実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まず、及びオリゴマーは、核移行ペプチドに付着されていない。
【００２３】
一実施形態において、細胞は、オリゴマーの１から１００ｎＭ濃度と接触される。
【００２４】
一実施形態において、細胞は癌細胞であり、及び遺伝子はＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００２５】
本発明の別の態様は、遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させるための単離された又は合成ポリヌクレオチドオリゴマーであり、該オリゴマーは、遺伝子の標的プロモーター内の領域に対して相補的な１２から２８塩基のヌクレオチド配列を含み、遺伝子を含む細胞中に導入された場合に、オリゴマーは、標的転写物の転写を選択的に増加させる。
【００２６】
一実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５、−３０から＋１７及び−１５から＋１０ヌクレオチドの間に位置している。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。
【００２７】
一実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターである。別の実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のイソフォームのプロモーターである。さらなる実施形態において、標的プロモーターは、標的転写物のプロモーターであり、且つ標的転写物のイソフォームのプロモーターである。
【００２８】
一実施形態において、オリゴマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノからなる群から選択される。
【００２９】
別の実施形態において、オリゴマーは、配列番号１から１１及び１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである。
【００３０】
特定の実施形態において、標的転写物は、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；主要ヴォールトタンパク質）、ヒトＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ヒトｐ５３及びヒトＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一実施形態において、細胞は癌細胞であり、及び遺伝子はＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００３１】
本発明を広告し、市販し、販売し又は実施許諾することを含む、事業を行う方法。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法及び組成物を提供し、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程を含む。
【００３３】
遺伝子の標的転写物は、定型的な方法を用いて、増加された合成を必要とすることが予定されている。例えば、所望のレベルと比べて低下した標的転写物／及び／又はタンパク質のレベルは、直接測定され得る。あるいは、標的転写物の増加された合成に対する必要性は、標的転写物の低下したレベルと関連する表現型から推測され得る。
【００３４】
一実施形態において、遺伝子のプロモーター内の領域は、部分的に一本鎖の構造、非Ｂ−ＤＮＡ構造、ＡＴが豊富な配列、十字型ループ、Ｇ四重鎖、ヌクレアーゼ高感受性要素（ＮＨＥ；ｎｕｃｌｅａｓｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）及び遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している領域から選択される。
【００３５】
好ましいＡＴが豊富な配列は、局所的な融解が生じているＤＮＡの伸長（タンパク質機構が、一本鎖領域に接近しなければならない、遺伝子のプロモーターなど）中に見出され、好ましくは、遺伝子のＴＡＴＡボックス及び／又は少なくとも６０％若しくは７０％のＡ＋Ｔを含む。
【００３６】
好ましい十字型構造は、各鎖上にヘパリン構造を形成しているパリンドローム性ゲノム配列から形成され、反復配列が非パリンドローム性ＤＮＡの伸長によって隔てられており、十字型のヘアピンの各々の末端に一本鎖ループを与える。
【００３７】
好ましい、Ｇ−四重鎖構造は、哺乳動物遺伝子のプロモーター領域中に同定されており、転写制御に関与していると推定されている。例えば、ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子プロモーターのヌクレアーゼ高感受性要素ＩＩＩは、転写の調節に関与しており、それぞれ、Ｉ−モチーフ及びＧ−四重鎖構造を採ることができる、ピリミジンが豊富な配列及びプリンが豊富な配列を、それぞれコード鎖及び非コード鎖上に含む。Ｇ−四重鎖構造の安定化は、ｃ−ＭＹＣの発現停止をもたらすことが示されている（例えば、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ−Ｊａｉｎ，２００２を参照されたい。）。
【００３８】
一実施形態において、標的とされる領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している。前記方法のある種の好ましい実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−３０から＋１７ヌクレオチドの間のテンプレート鎖上に位置している。別の実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−１５から＋１０オリゴヌクレオチドの間に位置している。さらなる実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位に対して−９から＋２ヌクレオチドを含む。ある種の好ましい実施形態において、領域は、遺伝子の転写開始部位を含む。別の実施形態において、領域は、転写開始の下流に存在する配列（例えば、配列は、−１００から＋１ヌクレオチドの間に位置する。）を一切含まない。本発明において使用されるオリゴマーは、ゲノム配列を標的とし、ｍＲＮＡを標的としない。
【００３９】
ある種の実施形態において、遺伝子は、標的転写物の１つ又はそれ以上のイソフォームをコードし、及び／又は発現することが知られており、本発明の方法は、基礎発現レベル及び／又は対照条件レベルを超えて、標的転写物の合成を選択的に増加させるが、標的転写物のイソフォームの合成は、減少し、増加し、又は同じに留まり得る。標的転写物及びイソフォームは、同一のプロモーター及び／又は転写開始部位を共有し得、又は異なるプロモーター及び／又は転写開始部位を有し得る。従って、様々な実施形態において、標的プロモーターは、（１）標的転写物のプロモーター、（２）標的転写物のイソフォームのプロモーター、又は（３）標的転写物のプロモーター及び標的転写物のイソフォームのプロモーターの両方である。多くの遺伝子が、複数のイソフォームを発現することが公知であり、例には、ｐ５３（Ｂｏｕｒｄｏｎ， ２００５）、ＰＴＥＮ（Ｓｈａｒｒａｒｄ ａｎｄ Ｍａｉｔｌａｎｄ， ２０００）、Ｂｃｌ−２−関連遺伝子（Ａｋｇｕｌ， ２００４）及びサービビン（Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ， ２００５）が含まれる。例えば、前記方法は、オリゴマーを、イソフォームの転写開始部位に誘導することによって、ある標的転写物の発現を増加させるために使用することができる。標的転写物の合成が増加され、及びイソフォームの合成が阻害される場合には、前記方法は、宿主細胞中で相対的イソフォーム合成を効果的及び選択的に調節する。従って、所定の望ましいイソフォーム又は過少発現されたイソフォームの増加した合成は、所定の望ましくないイソフォーム又は過剰発現されたイソフォームの減少した合成と組み合わせることができる。以下で、ｐ５３β／ｐ５３を用いて例示されているように、本実施形態は、宿主細胞中の所定のイソフォームの切り替えを作動させるために使用することができる。
【００４０】
ポリヌクレオチドオリゴマーは、標的転写物の合成の必要な増加を実施するのに十分な配列及び長さを有するものである。本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味であることが明らかでなければ、単数及び複数の両方を表す。例えば、「オリゴマー」という用語は、単一又は複数のオリゴマーを含み、「少なくとも１つのオリゴマー」という用語と等しいと考えることができる。適切なオリゴマーは、典型的には、１２から２８塩基の長さであり、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的である（すなわち、ワトソン−クリック結合相補性）。オリゴマーは、あらゆる核酸、修飾された核酸又はワトソン−クリック対合によってＤＮＡを認識することができる核酸模倣物を含み得る。オリゴマーと標的とされるプロモーター領域との間のミスマッチ、特に、２以上のミスマッチは、しばしば、標的転写物合成を増加される効力を減弱させる。オリゴマーは、一本鎖又は二本鎖（すなわち、二重鎖）であり得る。二重鎖オリゴマーの場合には、第一の鎖は、標的とされるプロモーターの領域に対して相補的であり、第二の鎖は、第一の鎖に対して相補的である。オリゴマーは、ホモピリミジン配列、ホモピリミジン配列又は混合されたプリン／ピリミジン配列を標的とし得る。混合されたプリン／ピリミジン配列は、少なくとも１つのプリン（残りは、ピリミジンである。）又は少なくとも１つのピリミジン（残りは、プリンである。）を含有する。ワトソン−クリック塩基対合をすることができる様々なオリゴマーが、本分野において公知である。ある種の実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸及びモルホリノから選択される。
【００４１】
二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、比較的合成が容易であり、ヒトの臨床試験で使用されてきたので、特に好ましいオリゴマーである。好ましいｄｓＲＮＡは、標的とされているプロモーターの領域に対して相補的な１８から２５個の塩基を有し、及び各鎖上に３’二又は三ヌクレオチド突出部を場合によって有する。ｄｓＲＮＡを調製し、細胞に送達する方法は、本分野において周知である（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ， ２００１；Ｔｕｓｃｈｌらに付与されたＷＯ／０１７１６４；及びＦｉｒｅらに付与されたＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５０６，５５９を参照されたい）。特注のｄｓＲＮＡも市販されている（例えば、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）。本発明の方法において使用されるｄｓＲＮＡは、分子の所望の特性を増強するために化学的に修飾され得る。標的転写物の合成を選択的に増加させるｄｓＲＮＡの能力に悪影響を与えることなく、幅広い化学的修飾を二重鎖ＲＮＡに施すことが可能である。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’修飾を有する１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含み、完全に２’置換され得る。様々な２’修飾が本分野において公知である（例えば、Ｃｏｏｋらに付与されたＵＳ Ｐａｔ Ｎｏ．５，８５９，２２１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与されたＵＳ Ｐａｔ Ｎｏ．６，６７３，６１１；及びＣｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。好ましい化学的修飾は、インビボで投与された場合に、ｄｓＲＮＡの血清安定性を増強し、ｄｓＲＮＡの半減期を増加させる。血清安定性増強化学修飾の例には、ホスホロチオアートホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド及び逆位デオキシ脱塩基残基の取り込みが含まれる（例えば、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎらに付与されたＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５００３２７３３を参照されたい。）。ｄｓＲＮＡは、安定性を向上させ、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、ロックされた核酸（ＬＮＡ；ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を場合によって含有し得る（例えば、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ， ２００５；及びＢｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。修飾の別の種類は、宿主へ送達された際に、オリゴマーを追跡できるようにするために、又は、形質移入効率の測定を容易にするために、蛍光分子、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなどをオリゴマーに付着させることである。
【００４２】
ＣｐＧ島を標的とするアンチジーンｄｓＲＮＡを用いたメチラーゼ依存性の転写阻害が、記載されている（２，３）。しかしながら、本発明の方法は、メチラーゼ非依存性であり、標的転写物の合成は、効果的なメチル化とは独立に増加され、効果的なメチル化を必要とせずに増加される（例えば、メチラーゼ阻害剤の存在下で、細胞をオリゴマーと接触させた場合でも、転写合成がなお生じる。）。本発明の特定の実施形態において、標的プロモーター内の標的領域は、ＣｐＧ島内に含有されない。ゲノム配列中にＣｐＧ島を同定するためのアルゴリズムは公知である（例えば、Ｔａｋａｉ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， ２００２；及びＴａｋａｉ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ ２００３を参照されたい。）。本発明の別の実施形態において、オリゴマーは、二本鎖ＲＮＡであり、及び標的プロモーター内の標的領域は、ＣＧ二ヌクレオチドを含まない。
【００４３】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）も、本発明の方法において使用するための好ましいオリゴマーである。様々なＰＮＡ構成が、本分野において公知である。例えば、ＰＮＡオリゴマーは、場合によって、１つのＰＮＡオリゴマーが、ワトソン−クリック塩基対合を介して標的を結合し、第二のオリゴマーがフーグスティーン認識を介して結合するビスＰＮＡとして調製されるホモピリミジンであり得（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，２００４を参照されたい。）、１つ又はそれ以上のアデニンがジアミノプリンで場合によって置換されているホモプリンであり得（例えば、Ｈａａｉｍａ ｅｔ ａｌ， １９９７を参照されたい。）、又は、場合によって標的配列において尾部固定（ｔａｉｌ−ｃｌａｍｐ）を形成するように構成された混合プリン／ピリミジンであり得る（例えば、Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００３を参照されたい。）。好ましい実施形態において、ＰＮＡは、一本鎖の混合プリン／ピリミジンである。
【００４４】
本発明の方法では、ＤＮＡオリゴマーを使用することも可能である。しかしながら、修飾されていないオリゴデオキシヌクレオチドは、ヌクレアーゼによって素早く分解される。従って、ＤＮＡオリゴマーを使用する場合には、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、ＤＮＡオリゴマーは、好ましくは化学修飾を有する。ヌクレアーゼ耐性を増加させるための様々な化学修飾が、本分野において公知である。最も単純で、最も広く使用されている修飾は、硫黄原子がオリゴホスファート骨格中の非架橋酸素を置換するホスホロチオアート（ＰＳ）修飾である。ＤＮＡオリゴマーは、多数の業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）から市販されている。
【００４５】
使用可能なオリゴマーの他の種類には、モルホリノオリゴマー（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，１９９７を参照されたい。）及びＬＮＡ（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ，２０００を参照されたい。）が含まれる。オリゴマーと接触される哺乳動物細胞は、インビトロ（例えば、培養された細胞）又は宿主中におけるインサイチュとすることができる。培養細胞の例には、初代細胞、（例えば、細胞株由来の）癌細胞、成体又は胚性幹細胞、神経細胞、繊維芽細胞、筋細胞などが含まれる。細胞は、あらゆる動物から得ることが可能である。一実施形態において、細胞は、インビトロのヒト細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、乳癌細胞であり、及び遺伝子は、ヒトプロゲステロン受容体である。他の実施形態において、細胞は、がん細胞であり、並びに遺伝子は、Ｅ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【００４６】
治療的効果（例えば、アポトーシスの誘導、癌細胞中での増殖の停止など）に対する遺伝子のプロモーター領域を標的とするオリゴマーをスクリーニングするために、ヒトの疾病又は疾患に対する治療薬の候補を検査するために一般的に使用される培養ヒト細胞を使用することができる。細胞がインサイチュである場合には、宿主はあらゆる哺乳動物であり得、ある種の好ましい実施形態は、ヒトであり、又はヒトの疾病若しくは疾患の研究において使用される動物モデル（例えば、げっ歯類、イヌ、ブタなどの動物モデル）である。
【００４７】
接触工程では、細胞にオリゴマーを送達するために使用される方法は、使用されるオリゴマーに、及び細胞がインビトロ又はインビトロであるかどうかに応じて変動し得る。インビトロの細胞の場合、細胞中への直接注入によって、送達を達成することができる。微少注入が選択肢でない場合、幾つかの事例では、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）などの疎水性又は陽イオン性担体を使用することによって、送達を強化することが可能である。本発明の一実施形態において、細胞は、インビトロで培養された細胞であり、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、並びに細胞は、オリゴマー及び陽イオン性脂質を含む組成物と接触される。ＰＮＡオリゴマーは、ＰＮＡオリゴマーを部分的に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド及び陽イオン性脂質（２１から２５）と複合体化させることによって、インビトロで細胞中に導入することができる。脂質は、ＤＮＡの内部移行を促進するのに対して、ＰＮＡは積荷として進入し、その後放出される。
細胞性取り込みを促進するために、ペネトラチン、トランスポータン、Ｔａｔペプチド、核移行シグナル（ＮＬＳ）及びその他のペプチドなどのペプチドをオリゴマーに付着させることが可能である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ， ２００４；Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｋａｉｈａｔｓｕ， ｅｔ ａｌ， ２００４；及び参考文献７を参照されたい。）。あるいは、リゾレシチンなどの透過剤を用いて細胞を透過化した後、オリゴマーと接触させることができる。インビトロでオリゴマーを細胞に送達させるために、ウイルス形質導入を使用することが可能である（例えば、レンチウイルス形質導入、例えば、参考文献７を参照されたい。）。しかしながら、本発明のある種の実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まないことが好ましい。さらなる好ましい実施形態において、接触工程はウイルス形質導入を含まず、及びオリゴマーは、核移行ペプチドに付着されない。
【００４８】
インサイチュ細胞の場合、オリゴマーの送達を促進するために、陽イオン性脂質（例えば、Ｈａｓｓａｎｉ ｅｔ ａｌ， ２００４を参照されたい。）及びポリエチレンイミンなどのポリマー（例えば、Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ， ２００５を参照されたい。）が使用されてきた。（担体溶液中の）オリゴマーから実質的になる組成物は、宿主中へ直接注入することが可能である（例えば、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９９； ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ， ２００２を参照されたい。）。本発明の好ましい実施形態において、細胞は宿主中においてインサイチュであり、オリゴマーは１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、及び細胞は、オリゴマーから実質的になる組成物と接触される。二重鎖ＲＮＡのインビボ適用は、Ｐａｒｏｏ及びＣｏｒｅｙ（２００４）に概説されている。
【００４９】
典型的には、本発明の方法は、対照条件及び／又は基底発現レベルに比べて、標的転写物の合成を少なくとも１．２倍増加させる。他の実施形態において、少なくとも１．５、１．７、２．０、２．５、３．０、３．５又は４．０倍の増加が達成される。ウイルス形質導入なしに、標的転写物の効率的な増加された合成を達成することが可能であり、実際、好ましい実施形態において、接触工程は、ウイルス形質導入を含まない。標的プロモーターの複数の領域を標的とすることが可能であるが、標的転写物の高度に効率的な増加した合成は、標的プロモーターの単一領域のみを標的とするｄｓＲＮＡを用いた場合に達成され得る。例えば、一実施形態において、オリゴマーは、１８から２５塩基のｄｓＲＮＡであり、対照条件及び／又は基底発現レベルに比べて、標的転写物の合成が少なくとも２倍増加し、標的プロモーターの単一領域が標的とされる。オリゴマーのｎＭ又はｐＭ（μＭ未満）濃度を用いて標的転写物の合成の顕著な増加を達成することが可能であり、典型的には、所望の増加された合成をもたらすために可能な限り最小の濃度を使用することが好ましく、例えば、１から１００ｎＭ範囲のオリゴマー濃度が好ましく、より好ましくは、濃度は、１から５０ｎＭ、１から２５ｎＭ、１から１０ｎＭ又はｐＭ範囲である。
【００５０】
本明細書に開示及び例示されているように、選択的な遺伝子活性化のためのこれまでのところ理解されていない内在性機序を活用することによって、本発明者らの方法は、一般に、多様な標的遺伝子、プロモーター領域、オリゴマー、哺乳動物細胞種及び送達条件にわたって適用可能である。所定のオリゴマーが所定の標的遺伝子の転写を選択的に活性化させる条件は、（例えば、本明細書に記載されているプロトコールに従って）必ず経験的に確認されているのに対して、本発明者らは、本発明者らが研究したあらゆる哺乳動物遺伝子に対するオリゴマーを活性化させることを一貫して見出しており、本発明者らのデータは、哺乳動物細胞が、これらの方法を用いて、遺伝子選択的活性化を標的化するのに一般的に好ましいことを示唆している。
【００５１】
本方法の検出工程において、細胞に接触しているオリゴマーから生じた標的転写物の選択的な増加された合成が検出される。これは、遺伝子のｍＲＮＡ転写物のレベルの増加を測定することによって直接的に、又は対照と比べて、対応するコードされたタンパク質の増加されたレベルを検出することによって間接的に測定することが可能である。あるいは、標的転写物の生じた選択的な増加された合成は、標的転写物の増加した合成の指標である表現型の評価に基づいて、推測され得る。
【００５２】
本発明の別の態様において、遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させるためのポリヌクレオチドオリゴマーが提供され、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のヌクレオチド配列を含むオリゴマーは、遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する。遺伝子を含む細胞中に導入されると、オリゴマーは、標的転写物の転写を選択的に増加させる。一実施形態において、標的転写物は、ヒト主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；主要ヴォールトタンパク質）、ヒトＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ヒトｐ５３及びヒトＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、オリゴマーは、ＲＮＡ，ＤＮＡ、ペプチド核酸又はモルホリノである。一実施形態において、核酸オリゴマーは、１８から２５塩基のｄｓＲＮＡである。
【００５３】
転写物合成を選択的に増加させる特異的遺伝子標的及びｄｓＲＮＡ配列が、表１に列記されている。各ｄｓＲＮＡの１つの鎖のみ（５’から３’に示されている。）が示されている。さらに、ｄｓＲＮＡは、各鎖上に３’−ジチミジン突出部を有していた。
【００５４】
【表１】
【００５５】
本発明のさらなる態様において、本発明は、先述されている発明の何れかを広告し、市販し、販売し又は実施許諾することを含む、事業を行う方法を提供する。
【実施例１】
【００５６】
ａｇＲＮＡによって誘導された転写の増加
ＭＶＰ：以前に記載した方法（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５）を用いて、転写開始部位に対して−８２から−６４（−８２／−６４）に位置する主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ；Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ， ２０００）及びｐ５３部位（−５４／−３６）を標的とするｄｓＲＮＡは、それぞれ、ＲＮＡ及びタンパク質のレベルで、２．９倍及び３．８倍のＭＶＰ発現の増加を引き起こした。
【００５７】
Ｅ−カドヘリン：Ｅ−カドヘリンの−１０／＋９領域を標的とするＲＮＡ（ＥＣ９と称される。）は、ＲＮＡ及びタンパク質のレベルで、１．５から２．１倍のＥ−カドヘリン発現の増加を引き起こした。−９／＋１０、−１３／＋６及び−１４／＋５を標的とするＲＮＡは、発現及び遺伝子活性化の増加を引き起こさず、又は阻害した。ＥＣ９によるＥ−カドヘリン発現の活性化は、３つの独立した実験において観察された。
【００５８】
ｈ−ＰＲ：本発明者らは、プロゲステロン受容体（ＰＲ）に対して相補的な２１個のＲＮＡを検査してきた（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。これらの幾つかは、遺伝子発現を効率的に遮断したが、これらの実験中に、本発明者らは、幾つかのＲＮＡは、小さいが再現性のある発現の増加をもたらすことが認められることに驚いた。これらの観察を追跡するために、本発明者らは、血清の低下したレベルを有する培地中で細胞を増殖させることによって、ほぼ基底レベルまでＰＲの発現を低下させた。これらの条件下で増殖された細胞に、アンチジーンＲＮＡ（ａｇＲＮＡ）が形質移入されると、ｈＰＲ発現の顕著な増加が観察された。表２は、標的とされる領域を示しており、及び様々な実験から得られた増加された発現のレベルを示している。
【００５９】
【表２】
【００６０】
−９／＋１０を標的とするａｇＲＮＡは、血清中で増殖される細胞中のｈＰＲを阻害することが既に示されているのに対して、他のＲＮＡは全て、不活性であり、又は僅かな活性化を示した。これらの結果には再現性があり、通常の１０％血清（ｈＰＲを活性化させる条件）中で、及び２．５％血清（ｈＰＲ発現の低いレベルをもたらす、血清が除去された条件）中で観察される。
【００６１】
ｐ５３：ｐ５３に対するプロモーターにＲＮＡを標的化している間に、本発明者らは、転写調節の別の形態を発見した。主要なｐ５３イソフォームの発現は減少（喪失）したのに対して、より低い見かけの分子量を有するｐ５３イソフォームの発現は、以下の領域、すなわち、ｐ５３の主要なイソフォームの転写開始部位に対して−７／＋１２、−９／＋１０及び−１３／＋６を標的とした場合に増加した（表１、配列番号７から９参照）。このより低い分子量のｐ５３イソフォームは、他の研究者によっても最近記載された（Ｂｏｕｒｄｏｎ， ｅｔ ａｌ， ２００５； Ｒｏｈａｌｙ ｅｔ ａｌ， ２００５）。変化されたＲＮＡ発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
【００６２】
ｐ５３遺伝子プロモーターは、別の転写開始部位を含有する。表３は、標的転写物の合成を選択的に増加させるための典型的なｐ５３転写開始部位に近い標的領域／オリゴ対を開示している。各ｄｓＲＮＡの１つの鎖（５’から３’へと示されている。）のみが示されている。
【００６３】
【表３】
【００６４】
本発明者らは、ＰＴＥＮを標的とする二重鎖ＲＮＡで細胞を形質移入したときに、第二の遺伝子のイソフォーム発現の同様の上方制御も観察した（表１、配列番号１０から１２を参照。）。
【実施例２】
【００６５】
転写開始部位近くを標的とするアンチジーンＰＮＡ（ａｇＰＮＡ）オリゴマーによる、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の増加された発現。
【００６６】
細胞培養 １０％（ｖ／ｖ）熱不活化（５６℃、１時間）ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、０．５％非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４単位／ｍＬウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ）及び１００単位／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ）中に、３７℃及び５％ＣＯ２で、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞（アメリカン・タイプ・セル・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ）を維持した。
【００６７】
ＰＮＡの脂質媒介性形質移入 ＰＮＡは、記載されているとおりに取得する（Ｋａｉｈａｔｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００４）。形質移入の二日前に（第２日）、６ウェルプレート中に、８０，０００細胞／ウェルで、Ｔ４７Ｄ細胞を播種する（Ｃｏｓｔａｒ）。形質移入の当日に（第０日）、二重鎖（２００ｎＭ）及びオリゴフェクタミン（９μＬ／ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈する。２４時間後（第１日）に、培地を交換する。第３日目に、新しい６ウェルプレート中に、１：４で細胞を継代する。第５日目に、細胞に二度目の形質移入を行う。第８日目に、細胞を採取する。ｈＰＲタンパク質レベルは、抗ｈＰＲ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ分析によって評価する（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００６８】
ＲＮＡ分析。トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、処理されたＴ４７Ｄ細胞から得た全ＲＮＡを抽出する。きょう雑しているＤＮＡを除去するために、デオキシリボヌクレアーゼで、ＲＮＡを処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ランダムプライマーによって、４μｇを逆転写させる。
【００６９】
顕微鏡観察。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立光透過型光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ）を用いた共焦点顕微鏡によって、細胞を画像撮影する。自動化されたプログラムを用いて、Ｚ平面中の距離を追跡することによって、細胞の高さの概則を行う。観察のために、個別の細胞を選択し、次いで、個別の細胞の何れの部分も焦点に入らないようになるまで、顕微鏡を過少焦点の状態にする。Ｚ平面中の過少位置が認められ、次いで、細胞が完全に焦点から外れるまで、細胞を通じて、焦点平面を上方向に移動させる。過剰焦点位置が認められ、細胞の高さ（Ｚ次元）の大まかな推測を計算することができる。
【００７０】
生物学的に活性なＰＮＡの細胞性取り込み 部分的に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド及び陽イオン性脂質と細胞を複合体化することによって、ＰＮＡを細胞中に導入する。脂質は、ＤＮＡの内部移行を促進するのに対して、ＰＮＡは、積荷として進入し、続いて放出される。
【００７１】
ａｇＰＮＡによるｈＰＲ発現の活性化。ｈＰＲの転写開始部位（−１００から＋２５）付近を標的とし、Ｃ及びＮ末端リジンを含有する１９塩基のＰＮＡを調製し、２００ｎｍの濃度で細胞中に形質移入する。ａｇＰＮＡによって誘導されたｈＰＲタンパク質発現の増加を、ウェスタン分析によって測定する。
【実施例３】
【００７２】
ＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡは、血管新生化を増加させる
ヒトＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター領域は、性質が決定されている（例えば、Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９１を参照されたい。）。転写開始部位は、公開されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号ＡＦ０９５７８５．１）中の２３６３位に位置する。テンプレート鎖に対して完全に相補的であり、及び遺伝子の転写開始部位付近（−５０から＋２５、転写開始は＋１である。）を標的とする１９マーのａｇＲＮＡを調製する。典型的なａｇＲＮＡは、表４に示されている（第二の鎖及び二ヌクレオチド突出部は示されていない。）。
【００７３】
【表４】
【００７４】
ＶＥＧＦ転写物の合成を選択的に増加させるａｇＲＮＡの効果は、初代ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）中で測定される。ＶＥＧＦ転写物の得られた選択的な増加された合成は、細胞増殖の増加から推測して検出され、及び／又は対照に対するＶＥＧＦ遺伝子転写物の増加を測定することによって直接検出される。以下に記載されているように、心筋虚血の治療のための動物モデル及び臨床試験において、ＶＥＧＦ遺伝子転写の少なくとも２倍の増加をもたらすａｇＲＮＡを評価する。
【００７５】
虚血性心臓モデル 公知の方法（例えば、Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｓｕ ｅｔ ａｌ， ２００２；及びＳｕ ｅｔ ａｌ， ２００４を参照。）を用いて、虚血性心臓マウスモデルへＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡを送達するために、アデノウイルスベクターを構築する。腹腔内注射によって、２．５％Ａｖｅｒｔｉｎ１５から１６μＬ／ｇ体重で、ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に麻酔をかける。小動物用従量式換気装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ， ｍｏｄｅｌ ６８３， Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ）によって、動物の呼吸を調節した後、第四肋間腔中に、開胸切開を施す。心臓を露出させるために、切開内に、手術用開創器を配置する。虚血を誘導するために、６−０非吸収性外科用縫合糸で、冠動脈前下降枝を永久的に結紮する。Ｈｅｐｅｓ生理的食塩水（ｐＨ７．４）の５０μＬ中のウイルスベクターの１×１０１１ゲノムを、虚血領域周囲の左心室壁上の心筋の複数部位へ注射する。対照マウスには、緩衝液の注射を与える。手術の４週後に、心機能を評価する。左心室拡張末期径（ＬＶＤｄ）及び収縮末期径（ＬＶＤｓ）を測定する。短縮化割合のパーセント（ＦＳ％）は、（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ×１００として計算される。
【００７６】
心エコー後に集められた心臓を切片化し、抗血小板内皮細胞接着分子１及び平滑筋α−アクチン抗体で染色する。血管は、６つの領域（３つは左心室の横断面中の前壁上、３つは後壁上）上でカウントする。領域１は、専ら筋肉組織から構成され、領域２は筋肉と瘢痕の両方を有し、領域３は瘢痕のみを有する。ベクターは、前壁の領域２中に注入される。従って、前中の注射された領域と対応する注射されていない後領域との比較は、ＶＥＧＦ発現に対するａｇＲＮＡの効果を示す。毛細血管密度は、領域１については、心筋細胞に対する毛細血管の比として表され、領域２及び３については、１ｍｍ２当りの毛細血管数として表される。α−アクチン陽性血管の密度は、１ｍｍ２当りの又は全領域の血管数として表される。ＶＥＧＦ発現の活性化は、同じ心臓中の後壁と比べた及び対照群の前壁と比べた前壁の３つの領域全てにおける毛細血管及びα−アクチン陽性血管の増加によって示される。
【００７７】
臨床試験：ヒトにおけるＶＥＧＦ活性化ａｇＲＮＡ療法の安全性及び有効性は、Ｌｏｓｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ（２００２）によって記載された研究に倣って設計された臨床試験において評価される。適格性を有する患者には、最大の医学的治療に対して難治性のカナダ心臓血管協会（ＣＣＳ）クラスＩＩＩ又はＩＶ狭心症、バイパス手術又は血管形成術に適していない多枝冠動脈疾患及びストレスＳＰＥＣＴＴｃ９９ｍセスタミビ核影像法上での可逆的虚血が含まれる。被験者が、悪性腫瘍の既往歴又は現時点での兆候、活性な糖尿病性網膜症又は重度のＬＶ収縮不全の兆候（経胸壁２次元心エコーによって、ＬＶ駆出率［ＥＦ］＜２０％）を有していれば、被験者を除外した。
【００７８】
ＶＥＧＦ誘導性ａｇＲＮＡ発現ベクターを患者中に注射する。被験者は、虚血性心筋の中心部に注射を誘導するために、ベクターの注射の直前に、非経口透視ＬＶＥＭＭを受ける。注射から１２週目に、追跡ＥＭＭを実施する。予め指定された主な有効性パラメータは、１２週の追跡調査のための訪問時におけるＣＣＳ狭心症分類中のベースラインからの変化及び運動耐容性である。
【実施例４】
【００７９】
ａｇＲＮＡによって誘導された転写の増加
遺伝子活性化は、遺伝子発現の低い基底レベルに対してさらに容易に観察できると、本発明者らは推論した。従って、本発明者らの仮説に取り組むために、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中で観察されるより、ずっと低いＰＲタンパク質発現の基底レベルを有する乳癌細胞株であるＭＣＦ−７細胞中に二重鎖ＲＮＡを導入した（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ａ） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １３：７８７−７９２； Ｊｅｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：７８７９−７８８４）。
【００８０】
本発明者らは、−１１から＋８のＰＲプロモーター配列に相補的な二重鎖であるＲＮＡＰＲ１１を用いた検査を開始した。ＰＲ１１は、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現を阻害しなかったが、強力な阻害剤であるａｇＲＮＡによって取り囲まれていたので、本発明者らは、ＰＲ１１を選択した。比較のために、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現の強力な阻害剤であることを本発明者らが以前に示したＲＮＡｐＲ９及びＰＲ２６も検査した。
【００８１】
本発明者らは、陽イオン性脂質を用いて、二重鎖ＲＮＡＰＲ１１をＭＣＦ−７細胞中に導入し（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ｂ） Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：４３６−４４３）、ウェスタン分析によって、ＰＲタンパク質のレベルの１８倍の増加を観察し、適切な細胞状況で検査された場合に、ａｇＲＮＡが遺伝子発現の大幅な上方制御を引き起こし得ることを示した。ＰＲ９の添加はＰＲ発現に影響を与えなかったのに対して、ＰＲ２６は、ＰＲレベルを２倍微増させた。ＰＲｍＲＮＡ内の下流コード配列に対して相補的である２つのｓｉＲＮＡは、ＰＲタンパク質の発現を阻害し、ＰＲレベルは、ＭＣＦ−７細胞中において、標準的な転写後発現停止によって低下され得ることを示している。
【００８２】
ＰＲ１１による遺伝子発現のＲＮＡ媒介性活性化を観察した後、本発明者らは、本現象の特異性及び効力についてアッセイを行った。本発明者らは、二重鎖の何れかの末端において相補性を保存するミスマッチなど、多数のミスマッチ及びスクランブルされた対照二重鎖を調べた。これらの対照二重鎖は、ＰＲの発現を増加させず、上方制御が配列特異的であることを示している。様々な濃度のＰＲ１１の添加によって、活性化が強力である（１２ｎＭの濃度で１７倍の活性化が達成された。）ことが示された。
【００８３】
次いで、本発明者らは、Ｔ４７Ｄ細胞中において、二重鎖ＲＮＡによる遺伝子活性化を再度調べた。活性化の明瞭な観察を容易にするために、本発明者らは、活性炭処理された血清を含有する培地中で細胞を増殖させることによって、ＰＲ発現の基底レベルを低下させた（Ｈｕｒｄ ｅｔ ａｌ（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ）。予想通り、ホルモンを欠如する血清除去培地の使用は、ＰＲ発現を低下させた。ＲＮＡＰＲ１１の添加は、通常の培地中のＴ４７Ｄ細胞に対して観察されたレベルまでＰＲ発現を誘導した。これらの結果は、ＰＲ１１が、２つの異なる乳癌細胞種で同一の生理的効果を有すること、及びＰＲ１１は、ホルモン受容体発現を操作するための十分に確立された機序を相殺できることを示している。
【００８４】
ＰＲタンパク質は、生理的プロセスにおいて異なる役割を果たす２つのイソフォームＰＲ−Ａ及びＰＲ−Ｂとして発現される（Ｃｏｎｎｅｅｌｙ ｅｔ ａｌ，（２００３） Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：２０５−２１４）。ＰＲ−Ｂに対するプロモーターは、ＰＲ−Ａに対するプロモーターの上流に存在し、本研究で使用されるＲＮＡは、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とする。本発明者らは、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とする（ａｇＲＮＡ、アンチジーンＰＮＡ）又はＰＲ−ＢｍＲＮＡを標的とする（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＰＮＡ）ａｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＰＮＡ又はアンチジーンＰＮＡは、ＰＲ−Ａのレベルも低下させることを以前に観察しており（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００６ａ； Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００６ｂ；及びＪａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（２００６ｃ） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ １：２１０−２１５）、ＰＲ−Ａの発現が、ＰＲ−Ｂの発現と関連していることを示唆している。本発明者らは、ここに、ＰＲ−Ｂプロモーターを標的とするＲＮＡが、ＰＲ−ＢとＰＲ−Ａの両タンパク質の発現を増強させ得ることも観察し、これらのイソフォームの発現が関連していることの補完的な証拠を与える。
【００８５】
活性を標的配列と相関させるために、本発明者らは、ＰＲプロモーター内の領域−５６から＋１７を通じて配列に標的化される一連の二重鎖ＲＮＡを検査した。これらの二重鎖ＲＮＡの幾つかは、ＰＲの発現を５倍又はそれ以上誘導した（表５）。標的配列の小さなシフトが、活性化に対して重大な帰結をもたらした。例えば、ＰＲ１１から上流（ＰＲ１２）又は下流（ＰＲ１０）への単一の塩基シフトは、活性化を大幅に低下させた。実験を数回繰り返したが、類似の結果が得られた。これらのデータは、プロモーター全体の配列が適切な標的であること、及びＲＮＡ媒介性遺伝子活性化のための要件は柔軟であることを示している。
【００８６】
【表５】
【００８７】
本発明者らは、活性化するＲＮＡＰＲ１１での形質移入前又は後の何れかに、非活性のＲＮＡＰＲ１０又はＰＲ１２が形質移入される添加順序実験を行った。
ＰＲ１０又はＰＲ１２を最初に細胞に添加した場合には、本発明者らは、その後のＰＲ１１の添加が活性化をもたらさないことを観察した。最初にＰＲ１１が細胞に添加された場合には、ＰＲ１０又はＰＲ１２は、遺伝子活性化を遮断しなかった。これらの競合アッセイは、非活性なＲＮＡＰＲ１０及びＰＲ１２がＰＲ１１と同一の標的配列に結合することを示している。認識は、ＰＲ１１の結合を遮断し、ＰＲ発現の活性化を妨げるのに十分である。ＰＲ１０及びＰＲ１２とのＰＲ１１の競合は、ＰＲのＲＮＡ媒介性活性化の標的及び配列特異性をさらに実証する。
【００８８】
【表６】
【００８９】
二重鎖ＲＮＡが他の遺伝子の発現を活性化することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ）（Ｈｕｆｆｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，（２００４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：２２５３−２２６１）に標的化された一連のＲＮＡを調べた。本発明者らは、以前に、ａｇＲＮＡでその発現を停止させたので、ＭＶＰを選択した。（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。ＭＶＰ６及びＭＶＰ９は、遺伝子発現を阻害したが、この結果は、本発明者らが以前に報告した結果である（Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ２００５）。これに対して、ＭＶＰ３５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２３８５０９、ＧＩ：５８３４８７のヌクレオチド１８１９から１８３７のヌクレオチドに対応する。）、ＭＶＰ５４及びＭＶＰ８２は、正常なレベルより２から４倍発現を増加させた。これらのデータは、二重鎖ＲＮＡが、発現の比較的高い基底レベルを有する遺伝子の発現を強化できることを示しており、本発明者らによる、Ｔ４７Ｄ細胞中でのＰＲのＲＮＡ媒介性上方制御の最初の観察と類似している。
【００９０】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によって、ＰＲ１１でのＭＣＦ−７細胞の処理が、様々な細胞培養条件下で、ＰＲｍＲＮＡの発現を増強することが明らかとなる。本発明者らは、以前に、ｓｉＲＮＡによるＴ４７Ｄ細胞中でのＰＲ発現の阻害を示しており（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ（２００６） Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ， Ｅｐｕｂ、２００６年６月１３日の時点で出版されていない。）、又はインターロイキン１β（ＩＬ−１β）での誘導後に、ａｇＲＮＡがシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現を著しく増加させることを示した（非公開）。本発明者らは、ここに、ＲＮＡＰＲ１１での処理後におけるＭＣＦ−７細胞中でのＰＲ遺伝子発現の活性化が、ＩＬ−１βの存在下又は不存在下でＣＯＸ−２発現を低下させることを観察する。ＰＲ１１での細胞の処理は、ＰＲ発現の中心的制御物質であるエストロゲン受容体−α（ＥＲ−α）のレベルを変化させなかった。従って、本発明の特定の実施形態は、細胞中でのＣｏｘ−２発現を減少させる方法であり、オリゴマーがヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の合成を選択的に増加させる条件下で、ｈＰＲ遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及びＣｏｘ−２の減少された合成を検出する工程を含み、前記オリゴマーが好ましくは二本鎖ＲＮＡである、前記方法である。
【００９１】
本発明者らのデータは、予測可能な様式で、生理的に意味のある下流の標的遺伝子の発現を操作するために、ＲＮＡの活性化を使用できること、及び誘導されたＰＲは完全に機能的であることを示している。
【００９２】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法であり、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、
オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び
前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程、を含み、前記オリゴマーが二本鎖ＲＮＡであり、及び前記領域が前記遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している、前記方法。
【請求項２】
領域が、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５ヌクレオチドの間に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
領域が、遺伝子の転写開始部位に対して−３０から＋１７ヌクレオチドの間に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
領域が、前記遺伝子の転写開始部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的プロモーターが、標的転写物のプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的プロモーターが、標的転写物のイソフォームのプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的プロモーターが、標的転写物の予め定められたイソフォームのプロモーターであり、及び前記イソフォームの合成が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的プロモーターが、標的転写物のプロモーターであり、標的転写物のイソフォームのプロモーターでもある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オリゴマーが１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴマーが２’化学修飾を有するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴマーが、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基残基の取り込み及びロックされた核酸からなる群から選択される血清安定性増強化学修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、インビトロでの培養された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、宿主内においてインサイチュである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
接触工程がウイルス形質導入を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
接触工程がウイルス形質導入を含まず、及び細胞がオリゴマーから実質的になる組成物と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
接触工程がウイルス形質導入を含まず、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴマーが１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、標的プロモーターの単一の領域が標的化され、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、オリゴマーの１から１００ｎＭ濃度と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が癌細胞であり、及び遺伝子がＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞中でのＣｏｘ−２発現を減少させる方法であり、
オリゴマーがヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の合成を選択的に増加させる条件下で、ｈＰＲ遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び
Ｃｏｘ−２の減少された合成を検出する工程を含み、前記オリゴマーが二本鎖ＲＮＡである、前記方法。
【請求項１】
哺乳動物細胞中の遺伝子の標的転写物の合成を選択的に増加させる方法であり、前記標的転写物は、増加された合成を必要とすることが予定されており、前記方法は、
オリゴマーが前記標的転写物の合成を選択的に増加させる条件下で、遺伝子の標的プロモーター内の領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び
前記標的遺伝子の生じた選択的な増加された合成を検出する工程、を含み、前記オリゴマーが二本鎖ＲＮＡであり、及び前記領域が前記遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置している、前記方法。
【請求項２】
領域が、遺伝子の転写開始部位に対して−５０から＋２５ヌクレオチドの間に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
領域が、遺伝子の転写開始部位に対して−３０から＋１７ヌクレオチドの間に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
領域が、前記遺伝子の転写開始部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標的プロモーターが、標的転写物のプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的プロモーターが、標的転写物のイソフォームのプロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的プロモーターが、標的転写物の予め定められたイソフォームのプロモーターであり、及び前記イソフォームの合成が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標的プロモーターが、標的転写物のプロモーターであり、標的転写物のイソフォームのプロモーターでもある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オリゴマーが１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴマーが２’化学修飾を有するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴマーが、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基残基の取り込み及びロックされた核酸からなる群から選択される血清安定性増強化学修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、インビトロでの培養された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、宿主内においてインサイチュである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
接触工程がウイルス形質導入を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
接触工程がウイルス形質導入を含まず、及び細胞がオリゴマーから実質的になる組成物と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
接触工程がウイルス形質導入を含まず、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴマーが１８から２５塩基の二本鎖ＲＮＡであり、標的プロモーターの単一の領域が標的化され、及び標的転写物の少なくとも２倍の増加された合成が生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、オリゴマーの１から１００ｎＭ濃度と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が癌細胞であり、及び遺伝子がＥ−カドヘリン、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）、ｐ５３及びＰＴＥＮからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞中でのＣｏｘ−２発現を減少させる方法であり、
オリゴマーがヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の合成を選択的に増加させる条件下で、ｈＰＲ遺伝子の転写開始部位に対して−１００から＋２５ヌクレオチドの間に位置する領域に相補的な１２から２８塩基のポリヌクレオチドオリゴマーと前記細胞を接触させる工程、及び
Ｃｏｘ−２の減少された合成を検出する工程を含み、前記オリゴマーが二本鎖ＲＮＡである、前記方法。
【公開番号】特開２０１２−５０４４７（Ｐ２０１２−５０４４７Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２１４９０２（Ｐ２０１１−２１４９０２）
【出願日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【分割の表示】特願２００８−５４１２５５（Ｐ２００８−５４１２５５）の分割
【原出願日】平成１８年１１月１３日（２００６．１１．１３）
【出願人】（５０００３９４６３）ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１４９０２（Ｐ２０１１−２１４９０２）
【出願日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【分割の表示】特願２００８−５４１２５５（Ｐ２００８−５４１２５５）の分割
【原出願日】平成１８年１１月１３日（２００６．１１．１３）
【出願人】（５０００３９４６３）ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム (115)
【Ｆターム（参考）】
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