栄養剤として適用するためのクルミ抽出物
本発明は、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されているクルミ油抽出物を記載する。ＰＥ／ＰＣおよび／またはＰＩを組み合わせると相乗的な治療効果が存在することがわかった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「栄養剤として適用するためのクルミ抽出物（Ｗａｌｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」と題する２００９年７月２０日出願の米国仮特許出願第６１／２２６，７８０号にに基づく、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）にしたがう優先権の利益を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている、クルミ核抽出物に関する。ＰＥ／ＰＣおよび／またはＰＩを組み合わせると相乗的な治療効果が存在することがわかった。
【背景技術】
【０００３】
クルミ核は、一般に約６０％の油を含有するが、栽培品種、栽培立地、および潅漑速度（ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）に応じて、５２〜７０％で変動しうる。油の主な構成成分は、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、ステロール、およびステロールエステルである。ホスファチドなどの極性の構成成分は、軽微な量しか存在しない。クルミ油に見られる主な脂肪酸は、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびリノレン酸（１８：３）である。これらの互いに対する比率は、この堅果の経済学的および栄養学的価値にとって重要である。リノール酸およびリノレン酸含有量が少ない方が保存可能期間が長くなり、健康上の利益をもたらす可能性を有しているため、一価不飽和脂肪酸はより望ましい。
【０００４】
クルミおよびクルミ油は、健康全般、特に精神衛生に関して治療利益をもたらすと一般に考えられている。しかし、クルミ油のその（１種または複数の）有益な成分については、十分に理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、上で指摘した現在の欠点の１つまたは複数を克服する、（１種または複数の）活性物質のより深い理解が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などのリン脂質が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている脂質組成物をもたらすクルミ抽出物を提供する。組成物は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質をさらに含んでいてもよい。特定のＰＥ対ＰＣの比を利用することにより、認知機能の向上およびアルツハイマー病の治療等の、脳の健康への意外な利益を実現できることがわかった。
【０００７】
いくつもの実施形態を開示するが、本発明のさらに他の実施形態は、当業者には以下の詳細な説明から明らかとなろう。明らかとなるように、本発明は、様々な明白な態様において、すべて本発明の真意および範囲から逸脱することなく、変更が可能である。したがって、詳細な説明は、例示的な性質のものとみなされ、限定するものでなない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物が線維形成に及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【図２】本発明の２種のクルミリン脂質抽出物が線維形成に及ぼす阻害効果を、大豆由来のリン脂質と比較して示すグラフである。
【図３】大豆由来のリン脂質と本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物の脱線維化効力を比較して表すグラフである。
【図４】本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を示すグラフである。
【図５】大豆由来リン脂質によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を、本発明の２種のリン脂質含有クルミ抽出物と比較して示すグラフである。
【図６】ＥＳ２０１０−２００７のポジティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。大きいピークは、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる。
【図７】ＥＳ２０１０−２００８のポジティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。大きいピークは、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる。
【図８】ＥＳ２０１０−２００７のネガティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。ピークは主にＰＩおよびＰＥである。
【図９】ＥＳ２０１０−２００８のネガティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。ピークは主にＰＩおよびＰＥである。
【図１０】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１１】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１２】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１３】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１４】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトル（ネガティブモード）を示すグラフである。
【図１５】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトル（ネガティブモード）を示すグラフである。
【図１６】クルミ抽出物による線維形成の阻害を示すグラフである。
【図１７】クルミ抽出物による脱線維化の百分率を示すグラフである。
【図１８】本発明のクルミ抽出物によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的な用語であり、「その限りでないが、・・・・を含めて」という意味に解釈すべきである。これらの用語は、より限定的な用語である「本質的に・・・・からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含する。
【００１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないと明らかに規定されない限り、複数のものも含むことに留意しなければならない。なお、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用されることがある。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が互換的に使用される場合があることにも留意されたい。
【００１１】
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で特に言及する刊行物および特許はすべて、刊行物において報告されている、本発明と関連して使用されることもあるであろう化学物質、機器、統計分析、および方法を記載および開示することを含むすべての目的で、その全体が参照により援用される。本明細書で引用する参考文献はすべて、当業界における技量のレベルを示すものとして利用する。本明細書では、先行発明によって本発明にそうした開示に先立つ権利が与えられないと認めるものと解釈されることはない。
【００１２】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などのリン脂質が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている脂質組成物をもたらすクルミ抽出物を提供する。
【００１３】
全体を通して記載するクルミ抽出物およびその組成物は、クルミから単離、分離、または精製された抽出物を含むことを理解されたい。したがって、クルミ抽出物または組成物は、天然のものではなく、クルミの物理的／化学的構造内の構成成分のいくつかが増加するように処理されている。クルミの物理的／化学的構造の天然に存在する構成成分のいくつかは、単離、分離、または精製の過程によって除去され、または減少していてもよい。すなわち、抽出物は、有用な利点をもたらす所望の成分が、自然に存在するクルミより富化されている。そうした所望の成分として、たとえば、ＰＥ、ＰＣ、およびＰＩが挙げられる。
【００１４】
本発明の抽出物および組成物は、クルミ油と異なる。クルミ油では一般に、冷圧して堅果を単純に砕き、得られる油および油中に浮遊したままである任意の構成成分を収集する。
【００１５】
一態様では、本発明のリン脂質組成物は、ＰＩ／ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、より格段には約１より大きい、さらに格段には約１．５より大きく、さらには約２よりも大きい。
【００１６】
別の態様では、本発明のリン脂質組成物は、ＰＩ／ＰＥの重量比が約０．４０より大きい、より格段には約０．５より大きい、さらに格段には約１より大きく、さらには約１．５よりも大きい。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明の組成物では、ＰＣ：ＰＥ：ＰＩ：ＰＳの比は、おおよそ３０：２０：４０：１０である。ホスファチジル脂質／スフィンゴシン脂質の重量比は、約７０／３０である。
【００１８】
別の態様では、本発明のリン脂質組成物は、組成物の不飽和脂肪酸の百分率が約８０％より高い。たとえば、不飽和脂肪酸は、１４：１、１６：１、１８：１、１８：２、１８：３、および／または２２：１の不飽和脂肪酸であることができる。飽和脂肪酸には、１２：０、１４：０、１６：０、１８：０、２０：０、および／または２２：０の飽和脂肪酸を含めることができる。通常、脂肪酸対不飽和脂肪酸の範囲は、不飽和脂肪酸の方が多く、重量で約１５〜約２０％／８０〜約８５％である。
【００１９】
一態様では、本発明の抽出物中のリン脂質の総量は、約８０〜約８５重量％である。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、１種または複数のリン脂質と１種または複数のスフィンゴ脂質を含み、リン脂質にはＰＥおよびＰＣが含まれる組成物を提供する。そのような実施形態では、ＰＥ対ＰＣの重量比が約１：１〜約２：１、特に約１．６：１〜約１．７：１である。組成物は、ＰＩをさらに含むことができ、ＰＥ対ＰＩの重量比は、約２：１〜約３：１、特に約２．３：１〜約２．７：１である。特定の実施形態では、ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの重量比は、約３：２：５である。例となる一実施形態では、組成物は、０．５重量％より多い、特に１．５重量％より多いリン脂質を含む。詳細には、組成物は、不飽和脂肪酸対飽和脂肪酸の重量比が約２：１〜約２．５：１であることができる。組成物は、約０．０５重量％より多いスフィンゴ脂質をさらに含むことができる。
【００２１】
特定の実施形態では、成分ＰＣ／ＰＩ／ＰＥの比は、約３：（２〜４）：（２〜５）である。また別の実施形態では、成分ＰＣ／ＰＩ／ＰＥ／ＰＳの比は、約３：（２〜４）：（２〜５）：（０．１〜１）である。
【００２２】
さらに別の実施形態では、約（２０〜５０）：３０：（２０〜４０）であるＰＥ：ＰＣ：ＰＩの比が、本発明の範囲内にある。
【００２３】
本発明の脂質組成物は、認知に関する健康に有益である。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害によって、脂質組成物がアルツハイマー病の治療または改善に役立つことが実証される。
【００２４】
さらに、クルミ抽出物（リン脂質組成物）は、用途が多彩であるので、本発明によるクルミ抽出物によって、心臓病、がん、卒中、動脈硬化などを治療または改善することが可能である。
【００２５】
本発明はさらに、イチョウ抽出物と上述の脂質組成物の組合せを提供する。この複合製品は、生物学的利用能の向上など、イチョウ抽出物の栄養レベルを向上させることができる。
【００２６】
リポソーム製剤は、活性原材料を移送する媒質または担体として広く使用されている。独特な本発明のクルミ抽出物組成物は、担体として働くことができ、たとえば、リポソーム製剤として製剤されて、薬物などの活性物質を送達することができる。
【００２７】
本明細書に記載の組成物は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の組成物は、食材にする、栄養剤にする、薬物と一緒にするなど、様々な形態で提供し、また様々な製品に組み入れることができる。
【００２９】
本発明の組成物は、様々な食物、飲料、スナックなどに組み入れることができる。一態様では、組成物は、消費する前に食品に振りかけることができる。食品に振りかける場合、デンプン、スクロース、ラクトースなどの適切な担体を使用して、組成物の濃度の分配を助け、より食品に適用しやすくすることができる。
【００３０】
本発明の組成物は、様々な調理加工食品中にサプリメントとして提供することもできる。この適用の目的では、調理加工食品とは、本発明の組成物が加えられている任意の自然食品、加工食品、ダイエット食品、または非ダイエット食品を意味する。本発明の組成物は、その限りでないが、ダイエット飲料、ダイエットバー、および調理済み冷凍食を含む多くの調理加工ダイエット食品にそのまま組み入れることができる。さらに、本発明の組成物は、その限りでないが、キャンディー、チップスなどのスナック製品、調理済み食肉製品、乳、チーズ、ヨーグルト、固形スポーツ食、スポーツ飲料、マヨネーズ、サラダドレッシング、パン、および他の任意の油脂含有食物を含む多くの調理加工非ダイエット製品に組み入れることもできる。本明細書では、用語「食品」とは、ヒトまたは動物による消費にかなった任意の物質を指す。
【００３１】
本発明の組成物は、果汁、ミルクセーキ、乳などの様々な飲料に加えることができる。
【００３２】
好ましい投与方法は、経口である。本発明の組成物は、デンプン、スクロース、ラクトースなどの適切な担体を用い、錠剤、カプセル剤、溶液、シロップ、および乳濁液に製剤することができる。本発明の錠剤またはカプセル剤は、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する腸溶剤皮でコーティングすることができる。小腸で溶解するが胃では溶解しない適切な腸溶剤皮は、酢酸フタル酸セルロースである。
【００３３】
本発明の組成物をソフトゲルカプセル剤にする製剤は、当業界で知られている多くの方法によって実現することができる。この製剤はしばしば、油または他の懸濁化剤もしくは乳化剤などの許容される担体を含む。
【００３４】
取捨選択可能な適切な担体としては、その限りでないが、たとえば、脂肪酸、そのエステルおよび塩が挙げられ、これらは、天然または合成の油、脂、蝋、またはこれらの組合せを含めるが限定はしない、任意の供給源に由来するものであってよい。さらに、脂肪酸は、限定はしないが、非水素添加油、部分的水素添加油、完全水素添加油、またはこれらの組合せに由来するものであってよい。非限定的な脂肪酸（そのエステルおよび塩）の供給源として、種実油、魚油もしくは海産物油、カノーラ油、植物油、ベニバナ油、ヒマワリ油、ナスタチウム油、カラシ種子油、オリーブ油、ゴマ油、大豆油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、米ぬか油、ババスー油、パーム油、低エルカ酸菜種油、パーム核油、ルピナス油（ｌｕｐｉｎ ｏｉｌ）、ヤシ油、亜麻仁油、オオマツヨイグサ油、ホホバ、小麦胚芽油、獣脂、牛脂、バター、鶏脂、豚脂、乳脂肪（ｄａｉｒｙ ｂｕｔｔｅｒｆａｔ）、シアバター、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３５】
非限定的な特定の魚油または海産物油供給源の例には、貝類の油、マグロ油、サバ油、サケ油、メンハーデン、カタクチイワシ、ニシン、マス、サーディン、またはこれらの組合せが含まれる。特に、脂肪酸の供給源は、魚油もしくは海産物油（ＤＨＡまたはＥＰＡ）、大豆油、または亜麻仁油である。別法として、または上で明らかにした担体の１つと組み合わせて、蜜蝋、ならびにシリカ（二酸化ケイ素）などの懸濁化剤を適切な担体として使用することができる。
【００３６】
本発明の組成物は、機能性成分（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）を含むことができる。用語「機能性成分」は当業界で認知されており、疾患を予防し、または望ましくない状態を改善することのできる、食物中に見出される特定の化学化合物について述べるものである。
【００３７】
本発明の組成物は、本発明の有益な組成物の安定化、もしくはその成分の生物学的利用能の促進を助け、または個人の食生活への付加的な栄養素として役立つ、様々な原材料をさらに含むことができる。適切な添加剤には、ビタミンおよび生物学的に許容されるミネラルを含めることができる。ビタミンの非限定的な例として、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および葉酸が挙げられる。ミネラルの非限定的な例として、鉄、カルシウム、マグネシウム、カリウム、銅、クロム、亜鉛、モリブデン、ヨウ素、ホウ素、セレン、マンガン、これらの誘導体、またはこれらの組合せが挙げられる。これらのビタミンおよびミネラルは、任意の供給源または供給源の組合せに由来するものでよく、限定はしない。非限定的なビタミンＢ群の例として、限定はしないが、チアミン、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、シアノコバラミン、ビオチン、パントテン酸、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３８】
様々な添加剤を本組成物に組み入れることができる。本組成物の取捨選択可能な添加剤には、限定はしないが、ヒアルロン酸、リン脂質、デンプン、糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク質、着香剤、着色剤、加水分解デンプン、およびこれらの誘導体またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３９】
本明細書では、用語「抗酸化剤」は、当業界で認知されており、化合物の酸化による劣化を防ぐまたは遅らせる合成または天然の物質を指す。例となる抗酸化剤には、トコフェロール、フラボノイド、カテキン、スーパーオキシドジスムターゼ、レシチン、γ−オリザノール；ビタミン類、たとえば、ビタミンＡ、Ｃ（アスコルビン酸）、およびＥ、β−カロチン；天然成分、たとえば、ローズマリーおよびサンザシ抽出物中に見られるカルノソール、カルノシン酸、およびロスマノール、ブドウ種子または松樹皮抽出物中に見られるものなどのプロアントシアニジン、ならびに緑茶抽出物が含まれる。
【００４０】
本発明の組成物を含む組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣丸作製、磨砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、閉じ込め、または凍結乾燥プロセスの方法によって製造することができる。組成物は、組成物が、使用することのできる製剤へと円滑に加工処理されるようにする、生理的に許容される１種または複数の担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を使用して、従来のようにして製剤することができる。
【００４１】
本発明の組成物は、たとえば、経口、頬側、全身、注射、経皮、直腸、膣内などを含む、事実上任意の投与方式に適する形態、または吸入もしくは通気による投与に適する形態をとることができる。
【００４２】
全身製剤には、注射、たとえば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、または腹腔内注射による投与向けに設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口、または経肺投与向けに設計されたものが含まれる。
【００４３】
有用な注射用製剤としては、水性または油性媒体中の組成物の滅菌懸濁液、溶液、または乳濁液が挙げられる。組成物は、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤用薬剤も含有してよい。注射用の製剤は、単位剤形、たとえばアンプル、または多用量容器の体裁にすることができ、追加の保存剤も含有してよい。
【００４４】
あるいは、注射用製剤は、発熱物質を含まない滅菌水、緩衝液、デキストロース溶液などが含まれるがこの限りでない適切な媒体で使用前に再形成するための粉末形態にして提供することができる。このためには、組成物は、凍結乾燥などの当業界で知られている任意の技術によって乾燥させ、使用する前に再形成することができる。
【００４５】
経粘膜投与では、透過させる障壁に相応しい浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当業界で知られている。
【００４６】
経口投与では、本発明の組成物は、結合剤（たとえば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（たとえば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製される、たとえば、ロゼンジ、錠剤、またはカプセル剤の形をとることができる。錠剤は、当業界でよく知られている方法によって、たとえば、糖、フィルム、または腸溶剤皮でコーティングしてもよい。
【００４７】
経口投与用の液体製剤は、たとえば、エリキシル、溶液、シロップ、または懸濁液の形をとることもでき、または水もしくは他の適切な媒体で使用前に構成するための乾燥製品の体裁にすることもできる。このような液体製剤は、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加された食用脂）、乳化剤（たとえば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（たとえば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油）、保存剤（たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用い、従来の手段によって調製することができる。この製剤は、緩衝塩、保存剤、着香剤、着色剤、および甘味剤も適宜含有してよい。
【００４８】
経口投与用の製剤は、よく知られているように、組成物の制御放出を実現するように適切に製剤することができる。
【００４９】
頬側投与では、組成物は、従来のようにして製剤された錠剤またはロゼンジの形をとることができる。
【００５０】
直腸および膣の投与経路では、組成物は、カカオ脂や他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する（滞留浣腸用の）溶液、坐剤、または軟膏として製剤することができる。
【００５１】
経鼻投与または吸入もしくは通気による投与では、組成物は、適切な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素、または他の適切な気体を使用し、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合では、計量された量を送達する弁を設けることにより、投与量単位を決定することができる。吸入器または注入器に入れて使用する、化合物とラクトースやデンプンなどの適切な粉末基剤からなる粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジ（たとえば、ゼラチンからなるカプセルおよびカートリッジ）を製剤することができる。
【００５２】
長期送達では、組成物は、埋め込みまたは筋肉内注射によって投与するためのデポー製剤として製剤することができる。この組成物は、（たとえば、許容される油中乳濁液として）適切な重合体材料または疎水性材料と共に、またはイオン交換樹脂と共に、または溶解性の弱い誘導体、たとえば、溶解性の弱い塩として製剤することができる。あるいは、組成物をゆっくりと放出して経皮的に吸収させる、粘着性の盤またはパッチとして製造された経皮送達系を使用することもできる。このためには、透過促進剤（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）を使用して、組成物の経皮的な浸入を促進することができる。適切な経皮パッチは、たとえば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、および米国特許第４，９２１，４７５号に記載されている。
【００５３】
あるいは、他の送達系を利用することもできる。リポソームおよび乳濁液は、本発明の組成物の送達に使用することのできる送達媒体のよく知られた例である。通常は毒性がより高いという犠牲を払うが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの特定の有機溶媒を利用することもできる。
【００５４】
組成物は、所望であれば、本発明の組成物を含有する１個または複数の単位剤形を収容することのできるパックまたはディスペンサー装置の体裁にすることができる。パックは、たとえば、ブリスターパックなど、金属またはプラスチックのホイルを含むものであることができる。パックまたはディスペンサー装置には、投与の説明書を添付することができる。
【００５５】
１から３０まで連続して列挙する以下の項は、本発明の様々な態様を示すものである。一実施形態では、最初のパラグラフ（１）において、本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きいクルミ抽出物組成物を提供する。
【００５６】
２．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）をさらに含む。パラグラフ１のクルミ抽出物組成物。
【００５７】
３．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きいクルミ抽出物組成物。
【００５８】
４．ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）をさらに含む、パラグラフ３のクルミ抽出物組成物。
【００５９】
５．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とを含み、ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きいクルミ抽出物組成物。
【００６０】
６．ホスファチジルコリン（ＰＣ）をさらに含む、パラグラフ５のクルミ抽出物組成物。
【００６１】
７．スフィンゴ脂質をさらに含む、パラグラフ１から６のいずれかのクルミ抽出物組成物脂質組成物。
【００６２】
８．スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、パラグラフ７のクルミ抽出物。
【００６３】
９．リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、パラグラフ７のクルミ抽出物。
【００６４】
１０．不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、前述のパラグラフのいずれかによるクルミ抽出物。
【００６５】
１１．少なくとも約１０重量％のリン脂質を含む、クルミ抽出物由来の脂質組成物。
【００６６】
１２．クルミ抽出物のリン脂質の重量百分率が少なくとも約２０％以上である、パラグラフ１１の脂質組成物。
【００６７】
１３．リン脂質が（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、パラグラフ１２の脂質組成物。
【００６８】
１４．ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００６９】
１５．ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００７０】
１６．ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００７１】
１７．イチョウ抽出物をさらに含む、パラグラフ１から１６のいずれかのクルミ抽出物。
【００７２】
１８．前述のパラグラフのいずれかによるクルミ抽出物を食品と組み合わせて含む組成物。
【００７３】
１９．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を飲料と組み合わせて含む組成物。
【００７４】
２０．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を機能性成分と組み合わせて含む組成物。
【００７５】
２１．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を薬物と組み合わせて含む組成物。
【００７６】
２２．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、β−アミロイドの凝集に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７７】
２３．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、アルツハイマー病に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７８】
２４．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、卒中に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７９】
２５．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、血液脳関門機能を改善する方法。
【００８０】
２６．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善する方法。
【００８１】
２７．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、認知の健康を改善または維持する方法。
【００８２】
２８．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、神経保護をもたらす方法。
【００８３】
２９．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、神経の発達を促進する方法。
【００８４】
３０．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、脳における代謝を促進する方法。
【００８５】
本発明について、以下の非限定的な実施例に即してさらに説明する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、記載する実施形態に多くの変更を加えてよいことがわかるであろう。したがって、本発明の範囲は、本出願に記載の実施形態に限定されず、特許請求の範囲の言葉によって述べられる実施形態およびそれら実施形態の同等物によってのみ限定されるべきである。別段指摘しない限り、百分率はすべて重量である。
【実施例１】
【００８６】
１０００ｇの新鮮なクルミ核（モルドヴァ産）を砕き、次いで、ソックスレー抽出器において、３０００ｍＬのクロロホルム／エタノール（９０：１０ｖ／ｖ）と混合して、４５℃で３時間抽出した。反応生成物を濾過し、ケーキを、たとえば抽出の体積を２〜１０倍として同じ抽出溶媒で２回抽出した。３回の抽出からの濾液を合わせ、５０℃未満で真空乾燥させて溶媒を除去し、脂質を得た。全脂質の酸価を決定した。酸化を避けるために全脂質を１％のビタミンＥと混合した。
【００８７】
脂質を２Ｌのアセトンと混合し、１Ｏ℃で６０分間撹拌した後、濾過した。得られたケーキを、１０℃に冷やした約５ｇのアセトンで洗浄した。残渣を真空乾燥させて、極性の脂質固体を得た。このサンプルをＥＳ２００８−０２１と称した。
【００８８】
上記手順に従い、５種の別の脂質サンプルを調製した。違いは、抽出溶媒の比率が様々であることに基づく。すべてのサンプルを種々の溶媒比率と共に以下のとおり一覧にする。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
【表３】
【００９２】
不飽和：飽和の比＝８５：１５％（約６：１）
【００９３】
ホスファチジル脂質重量測定：
ＥＳ２００８−０２１ 総脂質画分の３．５％
ＥＳ２００８−０２２ 総脂質画分の１．５％
【００９４】
ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの比＝３０％：２０％：５０％
【００９５】
スフィンゴ脂質重量測定：
ＥＳ２００８−０２１ 総脂質画分の５．２％
ＥＳ２００８−０２２ 総脂質画分の３．６％
【００９６】
ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ質量分析によるリン脂質
ＥＳ２００８−０２１ ホスファチジルコリン（ＰＣ）２２．２％（ｍ／ｍ）
ＰＣと表される他のホスファチジル脂質１３．９％（ｍ／ｍ）
ＥＳ２００８−０２２ ホスファチジルコリン（ＰＣ）５．４％（ｍ／ｍ）
ＰＣと表される他のホスファチジル脂質１５．２％（ｍ／ｍ）
【００９７】
ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤによるホスファチジルセリン含有量
ＥＳ２００８−０２１ １．３％（ｍ／ｍ）
ＥＳ２００８−０２２ ０．５％（ｍ／ｍ）
【実施例２】
【００９８】
以下には、本発明のクルミ抽出物によるアミロイドβ凝集の阻害についての試験を記載する。４種のサンプルは、アミロイドβ凝集を阻害する同様の能力を有する。
【００９９】
サンプル調製：
クルミ抽出物、ならびに大豆由来のＰＣおよびＰＳをエタノールに溶解させ、アッセイ緩衝液で希釈して、最終試験アッセイ濃度とした。
【０１００】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β１−４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させた。サンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１０１】
各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを用意した。
【０１０２】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭのグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合した。蛍光を励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで測定した。
【０１０３】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を、対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較した。対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集の阻害％を算出した。
【０１０４】
アルツハイマー病患者に見られる斑の徴候であるアミロイドβ凝集を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験アッセイ系において引き起こした。クルミ抽出物、または大豆由来の純粋なＰＳおよびＰＣと共にインキュベートすることにより、アミロイドβ凝集の阻害を誘発した。
【０１０５】
サンプル濃度を等しい量のＰＣを含有するように調節したとき、すべてのクルミ抽出物が、同様の阻害特性を示した。
【０１０６】
ＨＰＬＣ／ＭＳによって決定したＰＣの含有量に基づき、以下の希釈度の４種のサンプルを選択して、ＰＣ１５ｍｇ／ｍｌの保存液を得た。試験アッセイ緩衝液を使用して、ＰＣ１ｍｇ／ｍｌまでのさらなる希釈物を調製した。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
図１に、抽出物のＰＣ濃度に基づく、本発明のクルミ抽出物による線維形成阻害の効率を示す。
【実施例３】
【０１０９】
図２に、大豆由来のＰＣおよびＰＳ（ｘ軸に示す濃度に希釈した純粋な化合物）によるアミロイド凝集の阻害についてのデータを示す。
【０１１０】
図２から確認できるように、試験結果は、アミロイド凝集の阻害において、クルミ抽出物サンプルが、比較可能な条件下で、大豆由来のＰＳまたはＰＣよりかなり強力であることを示している。
【実施例４】
【０１１１】
この実施例では、すでに生成しているアミロイドβ凝集物を後退させる能力について、最高濃度のクルミ抽出物（クルミ抽出物についてはＰＣ １２ｍｇ／ｍｌの試験アッセイ、大豆ＰＣまたは大豆ＰＳ １２ｍｇ／ｍｌ）を評価した。
【０１１２】
脱線維化（ｄｅｆｉｂｒｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ）効力は、アルツハイマー病の治療を示唆するものである。
【０１１３】
図３に見られるように、大豆由来ＰＳまたはＰＣは、クルミ抽出物サンプルと比べて、脱線維化が強力でない。
【実施例５】
【０１１４】
この実施例は、クルミ抽出物サンプルの一般組成についてである。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
結果の考察
乾燥質量、強熱残分、およびＨＰＬＣ／ＥＬＳＤによって決定した含有量は、一貫している。
【０１１７】
Ｎ含有リン脂質の指標である窒素含有量は、サンプル間で異なっている。これは、Ｎ含有リン脂質の含有量が異なる、またはサンプルＥＳ２００９−０２３およびＥＳ２００９−０２５において、一部のタンパク質が共に抽出されたこと（この可能性の方が高いと思われる）を意味する可能性がある。
【実施例６】
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
ＨＰＬＣ条件
粒径３μｍの１５０×３．２ｍｍ Ｐｒｅｖａｉｌシリカカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。充填物および内径が同じ予備カラムを使用した。溶離プログラムは、ｔ＝０分で８７．５：１２：０．５（ｖ／ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノール：トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ３、１Ｍギ酸）からｔ＝２０分で２８：６０：１２（ｖ／ｖ／ｖ）の線形勾配とした。移動相は、ｔ＝２１分で初期条件に戻し、ｔ＝３０分の次の注入までカラムが平衡に達するようにした。流量は０．５ｍＬ／分で維持し、これによって背圧が５５〜９０バールとなった。注入体積は２５μＬとした。サンプルおよびカラムを４０℃で平衡化した。
【０１２０】
検出：
ＰＬクラスの定量分析のためのＥＬＳＤ（Ｎ2 １．５Ｌ／分、噴霧温度８５℃）
ＰＬ構造の定性分析およびＰＬクラスの確認のためのＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブモード、ｍ／ｚ １００〜１２００、ＧＡＩＮ ２、停止時間 １００ミリ秒、フラグメンター 可変、乾燥ガス １２ＬのＮ2／分、ネブライザー圧力 ５０ｐｓｉ、温度は３００℃、毛管圧力 ３５００Ｖ）
【０１２１】
サンプル調製：
サンプルをクロロホルム／メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）に溶解／懸濁させた。サンプルを希釈して校正範囲（サンプル１〜１０ｍｇ／溶媒ｍｌ）にした。
【０１２２】
較正：
利用可能な基準化合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をクロロホルム／メタノール＝２：ｌ（ｖ／ｖ）に２０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。ＥＬＳＤでは、主なＰＬクラスの反応は幾分似ているので、基準化合物がない場合、Ｌ−ホスファチジルコリン（Ｐ３８４１）が外部標準物質として役立つ。その場合、結果は、「ホスファチジルコリンとしてのリン脂質」と表示する。Ｌ−ホスファチジルコリン（Ｐ３８４１）は、ほぼ完全に、同時に溶出される２種の化合物からしか構成されないので、最も信頼できる較正手順であるとみなされる。
【０１２３】
他の基準化合物からも直線性を得ることができるが、他の大部分の標準物質は、ＨＰＬＣ系に注入されると、少なくとも２つのピークに分裂する。
【０１２４】
Ｐ３８４１−２５ＭＧ：Ｓｉｇｍａ Ｌ−α−ホスファチジルコリン約９９％、ウシ脳由来、凍結乾燥粉末
【０１２５】
【表７】
スフィンゴミエリンは、全リン脂質の２〜１０％の間である。
ＰＳは、総リン脂質の１〜１０％の間である。
【実施例７】
【０１２６】
サンプルＥＳ２０１０−００７およびＥＳ２０１０−００８を、それぞれ上記サンプルＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００９−０２５のように調製した。図６から１５を参照されたい。
【０１２７】
【表８】
図６から９を参照されたい。
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
［実施例７］
この実施例では、クルミ抽出物サンプルによるヒト血中（アセチル）コリンエステラーゼの阻害（エルマン法：５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ、エルマン試薬）を色原体として使用し、コリンエステラーゼ活性のレベルを４１２ｎｍでの吸光度の増大として記録）を実証する。
【０１３０】
潜在的に阻害性である化合物の存在下／非存在下で、アセチルコリンエステラーゼ活性の分光学的評価を明らかにした。試験では、酵素アッセイの間に遊離したコリンがエルマン試薬と結合して、着色された化合物が生成する。４１２ｎｍでの吸光度の増大を経時的に測定して、酵素の活性を推定する（すなわち、吸光度が高く、急勾配である程、酵素の活性が強い）。
【０１３１】
サンプルをエタノールに溶解させた。エタノール／水性緩衝液＝１：１（ｖ／ｖ）を用いて、最終試験濃度を実現する希釈物を調製した。酵素と共にインキュベートする間、４１２ｎｍで吸光度を継続的に測定した。
【０１３２】
サンプルの濃度を、ＨＰＬＣ／ＭＳによって測定したとき試験溶液１ｍｌあたりホスファチジルコリン１ｍｇに調整した。以下の希釈物を同じようにして調製した。
【０１３３】
【表１０】
これをＭＳ分析で確認した。
【０１３４】
図４で認められるように、クルミ抽出物サンプルによって実現した阻害は、試験したすべてのサンプルでほとんど同等である。
【実施例８】
【０１３５】
この実施例では、クルミ抽出物（Ｅ２００９−０２３およびＥＳ２００９−０２４）を大豆由来のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）と比較する。
【０１３６】
２種のサンプルの濃度は、１ｍｇ／試験溶液ｍｌとした。
【０１３７】
以下の表に、５分間のインキュベーションで残存する活性を示す。
【０１３８】
【表１１】
【０１３９】
したがって、大豆由来のＰＳおよびＰＣは、アセチルコリンエステラーゼの阻害においてほとんど不活性であったことがわかる。同等の濃度で、クルミ抽出物サンプル中のＰＣは、大豆ＰＣに優る有意な阻害効果を示した。
【実施例９】
【０１４０】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるアミロイドＡβ凝集の阻害−線維形成アッセイ
アルツハイマー病患者に見られる斑の徴候であるアミロイドβ凝集を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験アッセイ系において引き起こした。
【０１４１】
クルミ抽出物と共にインキュベートすることにより、線維形成の阻害を誘発した。クルミ抽出物の各濃度（０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌのＥＳ２００８−０２２、または１２５ｍｇ／ｍｌのＥＳ２００８−０２１を含有する保存液から０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌ）で、３つのサンプルをインキュベートし、評価した。
【０１４２】
図１６で認められるように、２．５μｌのＥＳ２００８−０２２（液体形態）または２．５μｌのＥＳ２００８−０２１溶液（３１２μｇの試験物品に相当する）によって、凝集をおよそ９０％阻害することができる。
【０１４３】
実験−線維形成アッセイ
クルミ抽出物：
得られたサンプルは、濾過後（シリンジフィルター０．４５μｍ）直接試験に導入し（ＥＳ２００８−０２２）、または可溶化後に導入した（１２５ｍｇのＥＳ２００８−０２１／ｍｌ）。抽出物を以下の実験に使用した。
【０１４４】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β1-40（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させる。
【０１４５】
以下のサンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートする。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１４６】
上述のサンプルを２．５、５．０および７．５μｌの体積で導入した。各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを導入した。
【０１４７】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合する。励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで蛍光を測定する。
【０１４８】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集の阻害％を算出した。
【０１４９】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるアミロイドＡβ凝集の分解−脱線維化アッセイ
試験系をさらに拡大して、すでに生成しているアミロイドβ凝集を後退させる能力について、上記サンプルを評価した。脱線維化効力は、アルツハイマー病の治癒を示唆するものである。
【０１５０】
クルミ抽出物と共にインキュベートすることにより、アミロイドＡβ凝集の分解を誘発した。クルミ抽出物の各濃度（０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌのＥＳ２００８−０２２、または１２５ｍｇ／ｍｌのＥＳ２００８−０２１を含有する保存液から０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌ）で、３つのサンプルをインキュベートし、評価した。
【０１５１】
図１７で認められるように、１．２５μｌのＥＳ２００８−０２２（液体形態）または１．２５μｌのＥＳ２００８−０２１溶液（１５６μｇの試験物品に相当する）によって、凝集物をほぼ９０％分解することができる。
【０１５２】
実験−脱線維化アッセイ
クルミ抽出物：
得られたサンプルは、濾過後（シリンジフィルター０．４５μｍ）直接試験に導入し（ＥＳ２００８−０２２）、または可溶化後に導入した（１２５ｍｇのＥＳ２００８−０２１／ｍｌ）。抽出物を以下の実験に使用した。
【０１５３】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β1-40（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させる。
【０１５４】
サンプルを絶えず振盪しながら２４時間３７℃に保って、凝集を生じさせる。
【０１５５】
以下のサンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートする。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１５６】
上述のものを２．５、５．０および７．５μｌの体積で導入した。各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを導入した。
【０１５７】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合する。励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで蛍光を測定する。
【０１５８】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。
【０１５９】
対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集（脱線維化）の分解％を算出した。
【０１６０】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるヒト血中（アセチル）コリンエステラーゼの阻害−エルマンアッセイ
潜在的に阻害性である化合物の存在下／非存在下でのアセチルコリンエステラーゼ活性の分光学的評価。試験の原理は、酵素アッセイの間に遊離したコリンがエルマン試薬と結合することである。
【０１６１】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２をメタノールで希釈／溶解させた。濃度は、サンプル１０ｍｇ／メタノールｍｌとした。インキュベーションアッセイに加える量は、各サンプルについて３０μｌとした。
【０１６２】
４１２ｎｍでの吸光度の増大を経時的に測定した。図１８で認められるように、ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によって実現される阻害は異なっていた。
【０１６３】
ほぼ等しい濃度で、ＥＳ２００８−０２１（３００μｇの試験物品に対応する）ではヒトアセチルコリンエステラーゼが７０％阻害されたが、ＥＳ２００８−０２２では１３％しか阻害されなかった。
【０１６４】
実験−コリンエステラーゼアッセイ
阻害剤溶液：
対応するサンプル（ＥＳ２００８−０２１、ＥＳ２００８−２２）１０ｍｇを秤量し、１ｍｌのメタノールを加える。
【０１６５】
色原体溶液：
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８、ＮａＯＨ）を溶液Ａと３０：１の比で混合する。
【０１６６】
溶液Ａ：
５，５’−ジチオ−ビス［２−ニトロ安息香酸］３９．６ｍｇおよびＮａＨＣＯ3 １５．０ｍｇを１０ｍｌのフラスコに量り入れ、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７、ＮａＯＨ）でメスアップする。
【０１６７】
酵素溶液：
７０ＩＵ／Ｈ2Ｏｍｌの酵素活性を含むヒトアセチルコリンエステラーゼの溶液を調製する。
【０１６８】
基質溶液：ヨウ化アセチルチオコリン１１５．７ｍｇを１０ｍｌのフラスコに量り入れ、Ｈ2Ｏでメスアップする。
【０１６９】
１０μｌの阻害剤溶液を１８５μｌの色原体溶液および１０μｌの酵素溶液と混合する。振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。５μｌの基質溶液を加え、４１２ｎｍでの吸収の増加を、それ以上の増加が認められなくなるまで（３〜５分）記録する。
【０１７０】
本発明について、好ましい実施形態に即して述べてきたが、当業者なら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および細部を変更してもよいことがわかるであろう。背景にある参考文献を含めて、本明細書全体で引用したすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。当業者なら、せいぜい常法どおりの実験を使用すれば、本明細書で詳細に記載した本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認知するであろうし、またはつきとめることができる。そのような同等物も、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「栄養剤として適用するためのクルミ抽出物（Ｗａｌｎｕｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」と題する２００９年７月２０日出願の米国仮特許出願第６１／２２６，７８０号にに基づく、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）にしたがう優先権の利益を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている、クルミ核抽出物に関する。ＰＥ／ＰＣおよび／またはＰＩを組み合わせると相乗的な治療効果が存在することがわかった。
【背景技術】
【０００３】
クルミ核は、一般に約６０％の油を含有するが、栽培品種、栽培立地、および潅漑速度（ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）に応じて、５２〜７０％で変動しうる。油の主な構成成分は、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、ステロール、およびステロールエステルである。ホスファチドなどの極性の構成成分は、軽微な量しか存在しない。クルミ油に見られる主な脂肪酸は、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびリノレン酸（１８：３）である。これらの互いに対する比率は、この堅果の経済学的および栄養学的価値にとって重要である。リノール酸およびリノレン酸含有量が少ない方が保存可能期間が長くなり、健康上の利益をもたらす可能性を有しているため、一価不飽和脂肪酸はより望ましい。
【０００４】
クルミおよびクルミ油は、健康全般、特に精神衛生に関して治療利益をもたらすと一般に考えられている。しかし、クルミ油のその（１種または複数の）有益な成分については、十分に理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、上で指摘した現在の欠点の１つまたは複数を克服する、（１種または複数の）活性物質のより深い理解が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などのリン脂質が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている脂質組成物をもたらすクルミ抽出物を提供する。組成物は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質をさらに含んでいてもよい。特定のＰＥ対ＰＣの比を利用することにより、認知機能の向上およびアルツハイマー病の治療等の、脳の健康への意外な利益を実現できることがわかった。
【０００７】
いくつもの実施形態を開示するが、本発明のさらに他の実施形態は、当業者には以下の詳細な説明から明らかとなろう。明らかとなるように、本発明は、様々な明白な態様において、すべて本発明の真意および範囲から逸脱することなく、変更が可能である。したがって、詳細な説明は、例示的な性質のものとみなされ、限定するものでなない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物が線維形成に及ぼす阻害効果を示すグラフである。
【図２】本発明の２種のクルミリン脂質抽出物が線維形成に及ぼす阻害効果を、大豆由来のリン脂質と比較して示すグラフである。
【図３】大豆由来のリン脂質と本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物の脱線維化効力を比較して表すグラフである。
【図４】本発明の４種のリン脂質含有クルミ抽出物によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を示すグラフである。
【図５】大豆由来リン脂質によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を、本発明の２種のリン脂質含有クルミ抽出物と比較して示すグラフである。
【図６】ＥＳ２０１０−２００７のポジティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。大きいピークは、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる。
【図７】ＥＳ２０１０−２００８のポジティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。大きいピークは、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる。
【図８】ＥＳ２０１０−２００７のネガティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。ピークは主にＰＩおよびＰＥである。
【図９】ＥＳ２０１０−２００８のネガティブモードでの質量スペクトルを示すグラフである。ピークは主にＰＩおよびＰＥである。
【図１０】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１１】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１２】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１３】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトルを示すグラフである。
【図１４】ＥＳ２０１０−００７の質量スペクトル（ネガティブモード）を示すグラフである。
【図１５】ＥＳ２０１０−００８の質量スペクトル（ネガティブモード）を示すグラフである。
【図１６】クルミ抽出物による線維形成の阻害を示すグラフである。
【図１７】クルミ抽出物による脱線維化の百分率を示すグラフである。
【図１８】本発明のクルミ抽出物によるアセチルコリンエステラーゼの阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的な用語であり、「その限りでないが、・・・・を含めて」という意味に解釈すべきである。これらの用語は、より限定的な用語である「本質的に・・・・からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含する。
【００１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないと明らかに規定されない限り、複数のものも含むことに留意しなければならない。なお、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書では互換的に使用されることがある。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が互換的に使用される場合があることにも留意されたい。
【００１１】
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で特に言及する刊行物および特許はすべて、刊行物において報告されている、本発明と関連して使用されることもあるであろう化学物質、機器、統計分析、および方法を記載および開示することを含むすべての目的で、その全体が参照により援用される。本明細書で引用する参考文献はすべて、当業界における技量のレベルを示すものとして利用する。本明細書では、先行発明によって本発明にそうした開示に先立つ権利が与えられないと認めるものと解釈されることはない。
【００１２】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などのリン脂質が、自然に存在するクルミに見られるクルミ油と比べて富化されている脂質組成物をもたらすクルミ抽出物を提供する。
【００１３】
全体を通して記載するクルミ抽出物およびその組成物は、クルミから単離、分離、または精製された抽出物を含むことを理解されたい。したがって、クルミ抽出物または組成物は、天然のものではなく、クルミの物理的／化学的構造内の構成成分のいくつかが増加するように処理されている。クルミの物理的／化学的構造の天然に存在する構成成分のいくつかは、単離、分離、または精製の過程によって除去され、または減少していてもよい。すなわち、抽出物は、有用な利点をもたらす所望の成分が、自然に存在するクルミより富化されている。そうした所望の成分として、たとえば、ＰＥ、ＰＣ、およびＰＩが挙げられる。
【００１４】
本発明の抽出物および組成物は、クルミ油と異なる。クルミ油では一般に、冷圧して堅果を単純に砕き、得られる油および油中に浮遊したままである任意の構成成分を収集する。
【００１５】
一態様では、本発明のリン脂質組成物は、ＰＩ／ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、より格段には約１より大きい、さらに格段には約１．５より大きく、さらには約２よりも大きい。
【００１６】
別の態様では、本発明のリン脂質組成物は、ＰＩ／ＰＥの重量比が約０．４０より大きい、より格段には約０．５より大きい、さらに格段には約１より大きく、さらには約１．５よりも大きい。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明の組成物では、ＰＣ：ＰＥ：ＰＩ：ＰＳの比は、おおよそ３０：２０：４０：１０である。ホスファチジル脂質／スフィンゴシン脂質の重量比は、約７０／３０である。
【００１８】
別の態様では、本発明のリン脂質組成物は、組成物の不飽和脂肪酸の百分率が約８０％より高い。たとえば、不飽和脂肪酸は、１４：１、１６：１、１８：１、１８：２、１８：３、および／または２２：１の不飽和脂肪酸であることができる。飽和脂肪酸には、１２：０、１４：０、１６：０、１８：０、２０：０、および／または２２：０の飽和脂肪酸を含めることができる。通常、脂肪酸対不飽和脂肪酸の範囲は、不飽和脂肪酸の方が多く、重量で約１５〜約２０％／８０〜約８５％である。
【００１９】
一態様では、本発明の抽出物中のリン脂質の総量は、約８０〜約８５重量％である。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、１種または複数のリン脂質と１種または複数のスフィンゴ脂質を含み、リン脂質にはＰＥおよびＰＣが含まれる組成物を提供する。そのような実施形態では、ＰＥ対ＰＣの重量比が約１：１〜約２：１、特に約１．６：１〜約１．７：１である。組成物は、ＰＩをさらに含むことができ、ＰＥ対ＰＩの重量比は、約２：１〜約３：１、特に約２．３：１〜約２．７：１である。特定の実施形態では、ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの重量比は、約３：２：５である。例となる一実施形態では、組成物は、０．５重量％より多い、特に１．５重量％より多いリン脂質を含む。詳細には、組成物は、不飽和脂肪酸対飽和脂肪酸の重量比が約２：１〜約２．５：１であることができる。組成物は、約０．０５重量％より多いスフィンゴ脂質をさらに含むことができる。
【００２１】
特定の実施形態では、成分ＰＣ／ＰＩ／ＰＥの比は、約３：（２〜４）：（２〜５）である。また別の実施形態では、成分ＰＣ／ＰＩ／ＰＥ／ＰＳの比は、約３：（２〜４）：（２〜５）：（０．１〜１）である。
【００２２】
さらに別の実施形態では、約（２０〜５０）：３０：（２０〜４０）であるＰＥ：ＰＣ：ＰＩの比が、本発明の範囲内にある。
【００２３】
本発明の脂質組成物は、認知に関する健康に有益である。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害によって、脂質組成物がアルツハイマー病の治療または改善に役立つことが実証される。
【００２４】
さらに、クルミ抽出物（リン脂質組成物）は、用途が多彩であるので、本発明によるクルミ抽出物によって、心臓病、がん、卒中、動脈硬化などを治療または改善することが可能である。
【００２５】
本発明はさらに、イチョウ抽出物と上述の脂質組成物の組合せを提供する。この複合製品は、生物学的利用能の向上など、イチョウ抽出物の栄養レベルを向上させることができる。
【００２６】
リポソーム製剤は、活性原材料を移送する媒質または担体として広く使用されている。独特な本発明のクルミ抽出物組成物は、担体として働くことができ、たとえば、リポソーム製剤として製剤されて、薬物などの活性物質を送達することができる。
【００２７】
本明細書に記載の組成物は、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質をさらに含んでいてもよい。
【００２８】
本発明の組成物は、食材にする、栄養剤にする、薬物と一緒にするなど、様々な形態で提供し、また様々な製品に組み入れることができる。
【００２９】
本発明の組成物は、様々な食物、飲料、スナックなどに組み入れることができる。一態様では、組成物は、消費する前に食品に振りかけることができる。食品に振りかける場合、デンプン、スクロース、ラクトースなどの適切な担体を使用して、組成物の濃度の分配を助け、より食品に適用しやすくすることができる。
【００３０】
本発明の組成物は、様々な調理加工食品中にサプリメントとして提供することもできる。この適用の目的では、調理加工食品とは、本発明の組成物が加えられている任意の自然食品、加工食品、ダイエット食品、または非ダイエット食品を意味する。本発明の組成物は、その限りでないが、ダイエット飲料、ダイエットバー、および調理済み冷凍食を含む多くの調理加工ダイエット食品にそのまま組み入れることができる。さらに、本発明の組成物は、その限りでないが、キャンディー、チップスなどのスナック製品、調理済み食肉製品、乳、チーズ、ヨーグルト、固形スポーツ食、スポーツ飲料、マヨネーズ、サラダドレッシング、パン、および他の任意の油脂含有食物を含む多くの調理加工非ダイエット製品に組み入れることもできる。本明細書では、用語「食品」とは、ヒトまたは動物による消費にかなった任意の物質を指す。
【００３１】
本発明の組成物は、果汁、ミルクセーキ、乳などの様々な飲料に加えることができる。
【００３２】
好ましい投与方法は、経口である。本発明の組成物は、デンプン、スクロース、ラクトースなどの適切な担体を用い、錠剤、カプセル剤、溶液、シロップ、および乳濁液に製剤することができる。本発明の錠剤またはカプセル剤は、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する腸溶剤皮でコーティングすることができる。小腸で溶解するが胃では溶解しない適切な腸溶剤皮は、酢酸フタル酸セルロースである。
【００３３】
本発明の組成物をソフトゲルカプセル剤にする製剤は、当業界で知られている多くの方法によって実現することができる。この製剤はしばしば、油または他の懸濁化剤もしくは乳化剤などの許容される担体を含む。
【００３４】
取捨選択可能な適切な担体としては、その限りでないが、たとえば、脂肪酸、そのエステルおよび塩が挙げられ、これらは、天然または合成の油、脂、蝋、またはこれらの組合せを含めるが限定はしない、任意の供給源に由来するものであってよい。さらに、脂肪酸は、限定はしないが、非水素添加油、部分的水素添加油、完全水素添加油、またはこれらの組合せに由来するものであってよい。非限定的な脂肪酸（そのエステルおよび塩）の供給源として、種実油、魚油もしくは海産物油、カノーラ油、植物油、ベニバナ油、ヒマワリ油、ナスタチウム油、カラシ種子油、オリーブ油、ゴマ油、大豆油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、米ぬか油、ババスー油、パーム油、低エルカ酸菜種油、パーム核油、ルピナス油（ｌｕｐｉｎ ｏｉｌ）、ヤシ油、亜麻仁油、オオマツヨイグサ油、ホホバ、小麦胚芽油、獣脂、牛脂、バター、鶏脂、豚脂、乳脂肪（ｄａｉｒｙ ｂｕｔｔｅｒｆａｔ）、シアバター、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３５】
非限定的な特定の魚油または海産物油供給源の例には、貝類の油、マグロ油、サバ油、サケ油、メンハーデン、カタクチイワシ、ニシン、マス、サーディン、またはこれらの組合せが含まれる。特に、脂肪酸の供給源は、魚油もしくは海産物油（ＤＨＡまたはＥＰＡ）、大豆油、または亜麻仁油である。別法として、または上で明らかにした担体の１つと組み合わせて、蜜蝋、ならびにシリカ（二酸化ケイ素）などの懸濁化剤を適切な担体として使用することができる。
【００３６】
本発明の組成物は、機能性成分（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）を含むことができる。用語「機能性成分」は当業界で認知されており、疾患を予防し、または望ましくない状態を改善することのできる、食物中に見出される特定の化学化合物について述べるものである。
【００３７】
本発明の組成物は、本発明の有益な組成物の安定化、もしくはその成分の生物学的利用能の促進を助け、または個人の食生活への付加的な栄養素として役立つ、様々な原材料をさらに含むことができる。適切な添加剤には、ビタミンおよび生物学的に許容されるミネラルを含めることができる。ビタミンの非限定的な例として、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および葉酸が挙げられる。ミネラルの非限定的な例として、鉄、カルシウム、マグネシウム、カリウム、銅、クロム、亜鉛、モリブデン、ヨウ素、ホウ素、セレン、マンガン、これらの誘導体、またはこれらの組合せが挙げられる。これらのビタミンおよびミネラルは、任意の供給源または供給源の組合せに由来するものでよく、限定はしない。非限定的なビタミンＢ群の例として、限定はしないが、チアミン、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、シアノコバラミン、ビオチン、パントテン酸、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３８】
様々な添加剤を本組成物に組み入れることができる。本組成物の取捨選択可能な添加剤には、限定はしないが、ヒアルロン酸、リン脂質、デンプン、糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク質、着香剤、着色剤、加水分解デンプン、およびこれらの誘導体またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３９】
本明細書では、用語「抗酸化剤」は、当業界で認知されており、化合物の酸化による劣化を防ぐまたは遅らせる合成または天然の物質を指す。例となる抗酸化剤には、トコフェロール、フラボノイド、カテキン、スーパーオキシドジスムターゼ、レシチン、γ−オリザノール；ビタミン類、たとえば、ビタミンＡ、Ｃ（アスコルビン酸）、およびＥ、β−カロチン；天然成分、たとえば、ローズマリーおよびサンザシ抽出物中に見られるカルノソール、カルノシン酸、およびロスマノール、ブドウ種子または松樹皮抽出物中に見られるものなどのプロアントシアニジン、ならびに緑茶抽出物が含まれる。
【００４０】
本発明の組成物を含む組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣丸作製、磨砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、閉じ込め、または凍結乾燥プロセスの方法によって製造することができる。組成物は、組成物が、使用することのできる製剤へと円滑に加工処理されるようにする、生理的に許容される１種または複数の担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を使用して、従来のようにして製剤することができる。
【００４１】
本発明の組成物は、たとえば、経口、頬側、全身、注射、経皮、直腸、膣内などを含む、事実上任意の投与方式に適する形態、または吸入もしくは通気による投与に適する形態をとることができる。
【００４２】
全身製剤には、注射、たとえば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、または腹腔内注射による投与向けに設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口、または経肺投与向けに設計されたものが含まれる。
【００４３】
有用な注射用製剤としては、水性または油性媒体中の組成物の滅菌懸濁液、溶液、または乳濁液が挙げられる。組成物は、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤用薬剤も含有してよい。注射用の製剤は、単位剤形、たとえばアンプル、または多用量容器の体裁にすることができ、追加の保存剤も含有してよい。
【００４４】
あるいは、注射用製剤は、発熱物質を含まない滅菌水、緩衝液、デキストロース溶液などが含まれるがこの限りでない適切な媒体で使用前に再形成するための粉末形態にして提供することができる。このためには、組成物は、凍結乾燥などの当業界で知られている任意の技術によって乾燥させ、使用する前に再形成することができる。
【００４５】
経粘膜投与では、透過させる障壁に相応しい浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当業界で知られている。
【００４６】
経口投与では、本発明の組成物は、結合剤（たとえば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（たとえば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製される、たとえば、ロゼンジ、錠剤、またはカプセル剤の形をとることができる。錠剤は、当業界でよく知られている方法によって、たとえば、糖、フィルム、または腸溶剤皮でコーティングしてもよい。
【００４７】
経口投与用の液体製剤は、たとえば、エリキシル、溶液、シロップ、または懸濁液の形をとることもでき、または水もしくは他の適切な媒体で使用前に構成するための乾燥製品の体裁にすることもできる。このような液体製剤は、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素添加された食用脂）、乳化剤（たとえば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（たとえば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留された植物油）、保存剤（たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用い、従来の手段によって調製することができる。この製剤は、緩衝塩、保存剤、着香剤、着色剤、および甘味剤も適宜含有してよい。
【００４８】
経口投与用の製剤は、よく知られているように、組成物の制御放出を実現するように適切に製剤することができる。
【００４９】
頬側投与では、組成物は、従来のようにして製剤された錠剤またはロゼンジの形をとることができる。
【００５０】
直腸および膣の投与経路では、組成物は、カカオ脂や他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する（滞留浣腸用の）溶液、坐剤、または軟膏として製剤することができる。
【００５１】
経鼻投与または吸入もしくは通気による投与では、組成物は、適切な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素、または他の適切な気体を使用し、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合では、計量された量を送達する弁を設けることにより、投与量単位を決定することができる。吸入器または注入器に入れて使用する、化合物とラクトースやデンプンなどの適切な粉末基剤からなる粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジ（たとえば、ゼラチンからなるカプセルおよびカートリッジ）を製剤することができる。
【００５２】
長期送達では、組成物は、埋め込みまたは筋肉内注射によって投与するためのデポー製剤として製剤することができる。この組成物は、（たとえば、許容される油中乳濁液として）適切な重合体材料または疎水性材料と共に、またはイオン交換樹脂と共に、または溶解性の弱い誘導体、たとえば、溶解性の弱い塩として製剤することができる。あるいは、組成物をゆっくりと放出して経皮的に吸収させる、粘着性の盤またはパッチとして製造された経皮送達系を使用することもできる。このためには、透過促進剤（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）を使用して、組成物の経皮的な浸入を促進することができる。適切な経皮パッチは、たとえば、米国特許第５，４０７，７１３号、米国特許第５，３５２，４５６号、米国特許第５，３３２，２１３号、米国特許第５，３３６，１６８号、米国特許第５，２９０，５６１号、米国特許第５，２５４，３４６号、米国特許第５，１６４，１８９号、米国特許第５，１６３，８９９号、米国特許第５，０８８，９７７号、米国特許第５，０８７，２４０号、米国特許第５，００８，１１０号、および米国特許第４，９２１，４７５号に記載されている。
【００５３】
あるいは、他の送達系を利用することもできる。リポソームおよび乳濁液は、本発明の組成物の送達に使用することのできる送達媒体のよく知られた例である。通常は毒性がより高いという犠牲を払うが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの特定の有機溶媒を利用することもできる。
【００５４】
組成物は、所望であれば、本発明の組成物を含有する１個または複数の単位剤形を収容することのできるパックまたはディスペンサー装置の体裁にすることができる。パックは、たとえば、ブリスターパックなど、金属またはプラスチックのホイルを含むものであることができる。パックまたはディスペンサー装置には、投与の説明書を添付することができる。
【００５５】
１から３０まで連続して列挙する以下の項は、本発明の様々な態様を示すものである。一実施形態では、最初のパラグラフ（１）において、本発明は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きいクルミ抽出物組成物を提供する。
【００５６】
２．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）をさらに含む。パラグラフ１のクルミ抽出物組成物。
【００５７】
３．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きいクルミ抽出物組成物。
【００５８】
４．ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）をさらに含む、パラグラフ３のクルミ抽出物組成物。
【００５９】
５．ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とを含み、ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きいクルミ抽出物組成物。
【００６０】
６．ホスファチジルコリン（ＰＣ）をさらに含む、パラグラフ５のクルミ抽出物組成物。
【００６１】
７．スフィンゴ脂質をさらに含む、パラグラフ１から６のいずれかのクルミ抽出物組成物脂質組成物。
【００６２】
８．スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、パラグラフ７のクルミ抽出物。
【００６３】
９．リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、パラグラフ７のクルミ抽出物。
【００６４】
１０．不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、前述のパラグラフのいずれかによるクルミ抽出物。
【００６５】
１１．少なくとも約１０重量％のリン脂質を含む、クルミ抽出物由来の脂質組成物。
【００６６】
１２．クルミ抽出物のリン脂質の重量百分率が少なくとも約２０％以上である、パラグラフ１１の脂質組成物。
【００６７】
１３．リン脂質が（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、パラグラフ１２の脂質組成物。
【００６８】
１４．ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００６９】
１５．ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００７０】
１６．ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きい、パラグラフ１３の脂質組成物。
【００７１】
１７．イチョウ抽出物をさらに含む、パラグラフ１から１６のいずれかのクルミ抽出物。
【００７２】
１８．前述のパラグラフのいずれかによるクルミ抽出物を食品と組み合わせて含む組成物。
【００７３】
１９．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を飲料と組み合わせて含む組成物。
【００７４】
２０．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を機能性成分と組み合わせて含む組成物。
【００７５】
２１．前述のパラグラフ１から１７のいずれかによるクルミ抽出物を薬物と組み合わせて含む組成物。
【００７６】
２２．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、β−アミロイドの凝集に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７７】
２３．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、アルツハイマー病に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７８】
２４．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、卒中に関連する疾患または状態の治療方法。
【００７９】
２５．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、血液脳関門機能を改善する方法。
【００８０】
２６．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善する方法。
【００８１】
２７．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、認知の健康を改善または維持する方法。
【００８２】
２８．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、神経保護をもたらす方法。
【００８３】
２９．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、神経の発達を促進する方法。
【００８４】
３０．パラグラフ１から２１のいずれかのクルミ抽出物または組成物を提供することを含む、脳における代謝を促進する方法。
【００８５】
本発明について、以下の非限定的な実施例に即してさらに説明する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、記載する実施形態に多くの変更を加えてよいことがわかるであろう。したがって、本発明の範囲は、本出願に記載の実施形態に限定されず、特許請求の範囲の言葉によって述べられる実施形態およびそれら実施形態の同等物によってのみ限定されるべきである。別段指摘しない限り、百分率はすべて重量である。
【実施例１】
【００８６】
１０００ｇの新鮮なクルミ核（モルドヴァ産）を砕き、次いで、ソックスレー抽出器において、３０００ｍＬのクロロホルム／エタノール（９０：１０ｖ／ｖ）と混合して、４５℃で３時間抽出した。反応生成物を濾過し、ケーキを、たとえば抽出の体積を２〜１０倍として同じ抽出溶媒で２回抽出した。３回の抽出からの濾液を合わせ、５０℃未満で真空乾燥させて溶媒を除去し、脂質を得た。全脂質の酸価を決定した。酸化を避けるために全脂質を１％のビタミンＥと混合した。
【００８７】
脂質を２Ｌのアセトンと混合し、１Ｏ℃で６０分間撹拌した後、濾過した。得られたケーキを、１０℃に冷やした約５ｇのアセトンで洗浄した。残渣を真空乾燥させて、極性の脂質固体を得た。このサンプルをＥＳ２００８−０２１と称した。
【００８８】
上記手順に従い、５種の別の脂質サンプルを調製した。違いは、抽出溶媒の比率が様々であることに基づく。すべてのサンプルを種々の溶媒比率と共に以下のとおり一覧にする。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
【表３】
【００９２】
不飽和：飽和の比＝８５：１５％（約６：１）
【００９３】
ホスファチジル脂質重量測定：
ＥＳ２００８−０２１ 総脂質画分の３．５％
ＥＳ２００８−０２２ 総脂質画分の１．５％
【００９４】
ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの比＝３０％：２０％：５０％
【００９５】
スフィンゴ脂質重量測定：
ＥＳ２００８−０２１ 総脂質画分の５．２％
ＥＳ２００８−０２２ 総脂質画分の３．６％
【００９６】
ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ質量分析によるリン脂質
ＥＳ２００８−０２１ ホスファチジルコリン（ＰＣ）２２．２％（ｍ／ｍ）
ＰＣと表される他のホスファチジル脂質１３．９％（ｍ／ｍ）
ＥＳ２００８−０２２ ホスファチジルコリン（ＰＣ）５．４％（ｍ／ｍ）
ＰＣと表される他のホスファチジル脂質１５．２％（ｍ／ｍ）
【００９７】
ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤによるホスファチジルセリン含有量
ＥＳ２００８−０２１ １．３％（ｍ／ｍ）
ＥＳ２００８−０２２ ０．５％（ｍ／ｍ）
【実施例２】
【００９８】
以下には、本発明のクルミ抽出物によるアミロイドβ凝集の阻害についての試験を記載する。４種のサンプルは、アミロイドβ凝集を阻害する同様の能力を有する。
【００９９】
サンプル調製：
クルミ抽出物、ならびに大豆由来のＰＣおよびＰＳをエタノールに溶解させ、アッセイ緩衝液で希釈して、最終試験アッセイ濃度とした。
【０１００】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β１−４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させた。サンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートした。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１０１】
各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを用意した。
【０１０２】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭのグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合した。蛍光を励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで測定した。
【０１０３】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を、対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較した。対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集の阻害％を算出した。
【０１０４】
アルツハイマー病患者に見られる斑の徴候であるアミロイドβ凝集を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験アッセイ系において引き起こした。クルミ抽出物、または大豆由来の純粋なＰＳおよびＰＣと共にインキュベートすることにより、アミロイドβ凝集の阻害を誘発した。
【０１０５】
サンプル濃度を等しい量のＰＣを含有するように調節したとき、すべてのクルミ抽出物が、同様の阻害特性を示した。
【０１０６】
ＨＰＬＣ／ＭＳによって決定したＰＣの含有量に基づき、以下の希釈度の４種のサンプルを選択して、ＰＣ１５ｍｇ／ｍｌの保存液を得た。試験アッセイ緩衝液を使用して、ＰＣ１ｍｇ／ｍｌまでのさらなる希釈物を調製した。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
図１に、抽出物のＰＣ濃度に基づく、本発明のクルミ抽出物による線維形成阻害の効率を示す。
【実施例３】
【０１０９】
図２に、大豆由来のＰＣおよびＰＳ（ｘ軸に示す濃度に希釈した純粋な化合物）によるアミロイド凝集の阻害についてのデータを示す。
【０１１０】
図２から確認できるように、試験結果は、アミロイド凝集の阻害において、クルミ抽出物サンプルが、比較可能な条件下で、大豆由来のＰＳまたはＰＣよりかなり強力であることを示している。
【実施例４】
【０１１１】
この実施例では、すでに生成しているアミロイドβ凝集物を後退させる能力について、最高濃度のクルミ抽出物（クルミ抽出物についてはＰＣ １２ｍｇ／ｍｌの試験アッセイ、大豆ＰＣまたは大豆ＰＳ １２ｍｇ／ｍｌ）を評価した。
【０１１２】
脱線維化（ｄｅｆｉｂｒｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ）効力は、アルツハイマー病の治療を示唆するものである。
【０１１３】
図３に見られるように、大豆由来ＰＳまたはＰＣは、クルミ抽出物サンプルと比べて、脱線維化が強力でない。
【実施例５】
【０１１４】
この実施例は、クルミ抽出物サンプルの一般組成についてである。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
結果の考察
乾燥質量、強熱残分、およびＨＰＬＣ／ＥＬＳＤによって決定した含有量は、一貫している。
【０１１７】
Ｎ含有リン脂質の指標である窒素含有量は、サンプル間で異なっている。これは、Ｎ含有リン脂質の含有量が異なる、またはサンプルＥＳ２００９−０２３およびＥＳ２００９−０２５において、一部のタンパク質が共に抽出されたこと（この可能性の方が高いと思われる）を意味する可能性がある。
【実施例６】
【０１１８】
【表６】
【０１１９】
ＨＰＬＣ条件
粒径３μｍの１５０×３．２ｍｍ Ｐｒｅｖａｉｌシリカカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。充填物および内径が同じ予備カラムを使用した。溶離プログラムは、ｔ＝０分で８７．５：１２：０．５（ｖ／ｖ／ｖ）のクロロホルム：メタノール：トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ３、１Ｍギ酸）からｔ＝２０分で２８：６０：１２（ｖ／ｖ／ｖ）の線形勾配とした。移動相は、ｔ＝２１分で初期条件に戻し、ｔ＝３０分の次の注入までカラムが平衡に達するようにした。流量は０．５ｍＬ／分で維持し、これによって背圧が５５〜９０バールとなった。注入体積は２５μＬとした。サンプルおよびカラムを４０℃で平衡化した。
【０１２０】
検出：
ＰＬクラスの定量分析のためのＥＬＳＤ（Ｎ2 １．５Ｌ／分、噴霧温度８５℃）
ＰＬ構造の定性分析およびＰＬクラスの確認のためのＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブモード、ｍ／ｚ １００〜１２００、ＧＡＩＮ ２、停止時間 １００ミリ秒、フラグメンター 可変、乾燥ガス １２ＬのＮ2／分、ネブライザー圧力 ５０ｐｓｉ、温度は３００℃、毛管圧力 ３５００Ｖ）
【０１２１】
サンプル調製：
サンプルをクロロホルム／メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）に溶解／懸濁させた。サンプルを希釈して校正範囲（サンプル１〜１０ｍｇ／溶媒ｍｌ）にした。
【０１２２】
較正：
利用可能な基準化合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をクロロホルム／メタノール＝２：ｌ（ｖ／ｖ）に２０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。ＥＬＳＤでは、主なＰＬクラスの反応は幾分似ているので、基準化合物がない場合、Ｌ−ホスファチジルコリン（Ｐ３８４１）が外部標準物質として役立つ。その場合、結果は、「ホスファチジルコリンとしてのリン脂質」と表示する。Ｌ−ホスファチジルコリン（Ｐ３８４１）は、ほぼ完全に、同時に溶出される２種の化合物からしか構成されないので、最も信頼できる較正手順であるとみなされる。
【０１２３】
他の基準化合物からも直線性を得ることができるが、他の大部分の標準物質は、ＨＰＬＣ系に注入されると、少なくとも２つのピークに分裂する。
【０１２４】
Ｐ３８４１−２５ＭＧ：Ｓｉｇｍａ Ｌ−α−ホスファチジルコリン約９９％、ウシ脳由来、凍結乾燥粉末
【０１２５】
【表７】
スフィンゴミエリンは、全リン脂質の２〜１０％の間である。
ＰＳは、総リン脂質の１〜１０％の間である。
【実施例７】
【０１２６】
サンプルＥＳ２０１０−００７およびＥＳ２０１０−００８を、それぞれ上記サンプルＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００９−０２５のように調製した。図６から１５を参照されたい。
【０１２７】
【表８】
図６から９を参照されたい。
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
［実施例７］
この実施例では、クルミ抽出物サンプルによるヒト血中（アセチル）コリンエステラーゼの阻害（エルマン法：５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ、エルマン試薬）を色原体として使用し、コリンエステラーゼ活性のレベルを４１２ｎｍでの吸光度の増大として記録）を実証する。
【０１３０】
潜在的に阻害性である化合物の存在下／非存在下で、アセチルコリンエステラーゼ活性の分光学的評価を明らかにした。試験では、酵素アッセイの間に遊離したコリンがエルマン試薬と結合して、着色された化合物が生成する。４１２ｎｍでの吸光度の増大を経時的に測定して、酵素の活性を推定する（すなわち、吸光度が高く、急勾配である程、酵素の活性が強い）。
【０１３１】
サンプルをエタノールに溶解させた。エタノール／水性緩衝液＝１：１（ｖ／ｖ）を用いて、最終試験濃度を実現する希釈物を調製した。酵素と共にインキュベートする間、４１２ｎｍで吸光度を継続的に測定した。
【０１３２】
サンプルの濃度を、ＨＰＬＣ／ＭＳによって測定したとき試験溶液１ｍｌあたりホスファチジルコリン１ｍｇに調整した。以下の希釈物を同じようにして調製した。
【０１３３】
【表１０】
これをＭＳ分析で確認した。
【０１３４】
図４で認められるように、クルミ抽出物サンプルによって実現した阻害は、試験したすべてのサンプルでほとんど同等である。
【実施例８】
【０１３５】
この実施例では、クルミ抽出物（Ｅ２００９−０２３およびＥＳ２００９−０２４）を大豆由来のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルセリン（ＰＳ）と比較する。
【０１３６】
２種のサンプルの濃度は、１ｍｇ／試験溶液ｍｌとした。
【０１３７】
以下の表に、５分間のインキュベーションで残存する活性を示す。
【０１３８】
【表１１】
【０１３９】
したがって、大豆由来のＰＳおよびＰＣは、アセチルコリンエステラーゼの阻害においてほとんど不活性であったことがわかる。同等の濃度で、クルミ抽出物サンプル中のＰＣは、大豆ＰＣに優る有意な阻害効果を示した。
【実施例９】
【０１４０】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるアミロイドＡβ凝集の阻害−線維形成アッセイ
アルツハイマー病患者に見られる斑の徴候であるアミロイドβ凝集を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験アッセイ系において引き起こした。
【０１４１】
クルミ抽出物と共にインキュベートすることにより、線維形成の阻害を誘発した。クルミ抽出物の各濃度（０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌのＥＳ２００８−０２２、または１２５ｍｇ／ｍｌのＥＳ２００８−０２１を含有する保存液から０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌ）で、３つのサンプルをインキュベートし、評価した。
【０１４２】
図１６で認められるように、２．５μｌのＥＳ２００８−０２２（液体形態）または２．５μｌのＥＳ２００８−０２１溶液（３１２μｇの試験物品に相当する）によって、凝集をおよそ９０％阻害することができる。
【０１４３】
実験−線維形成アッセイ
クルミ抽出物：
得られたサンプルは、濾過後（シリンジフィルター０．４５μｍ）直接試験に導入し（ＥＳ２００８−０２２）、または可溶化後に導入した（１２５ｍｇのＥＳ２００８−０２１／ｍｌ）。抽出物を以下の実験に使用した。
【０１４４】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β1-40（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させる。
【０１４５】
以下のサンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートする。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１４６】
上述のサンプルを２．５、５．０および７．５μｌの体積で導入した。各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを導入した。
【０１４７】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合する。励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで蛍光を測定する。
【０１４８】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集の阻害％を算出した。
【０１４９】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるアミロイドＡβ凝集の分解−脱線維化アッセイ
試験系をさらに拡大して、すでに生成しているアミロイドβ凝集を後退させる能力について、上記サンプルを評価した。脱線維化効力は、アルツハイマー病の治癒を示唆するものである。
【０１５０】
クルミ抽出物と共にインキュベートすることにより、アミロイドＡβ凝集の分解を誘発した。クルミ抽出物の各濃度（０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌのＥＳ２００８−０２２、または１２５ｍｇ／ｍｌのＥＳ２００８−０２１を含有する保存液から０．６２５、１．２５、２．５、５．０もしくは７．５μｌ）で、３つのサンプルをインキュベートし、評価した。
【０１５１】
図１７で認められるように、１．２５μｌのＥＳ２００８−０２２（液体形態）または１．２５μｌのＥＳ２００８−０２１溶液（１５６μｇの試験物品に相当する）によって、凝集物をほぼ９０％分解することができる。
【０１５２】
実験−脱線維化アッセイ
クルミ抽出物：
得られたサンプルは、濾過後（シリンジフィルター０．４５μｍ）直接試験に導入し（ＥＳ２００８−０２２）、または可溶化後に導入した（１２５ｍｇのＥＳ２００８−０２１／ｍｌ）。抽出物を以下の実験に使用した。
【０１５３】
サンプルインキュベーション：
１００μｇのアミロイド［Ａ］β1-40（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０７５）を２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液に溶解させる。
【０１５４】
サンプルを絶えず振盪しながら２４時間３７℃に保って、凝集を生じさせる。
【０１５５】
以下のサンプルを絶えず振盪しながら３７℃で３日間インキュベートする。
活性サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
空試薬サンプル：阻害剤（ＴＲＩＳ緩衝液に溶解させることが好ましい）を含むＴＲＩＳ緩衝液５０μｌ
対照サンプル：アミロイドβ溶液１０μｌ＋ＴＲＩＳ緩衝液４０μｌ
【０１５６】
上述のものを２．５、５．０および７．５μｌの体積で導入した。各活性サンプルについて、対応する空試薬サンプルを導入した。
【０１５７】
試験アッセイ：
３日後、各サンプルを２μＭ（６３６．８μｇ）のチオフラビンＴおよび９５０μｌのグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ＝９．０）と混合する。励起４３５ｎｍ／発光４８５ｎｍで蛍光を測定する。
【０１５８】
データ評価：
各「活性サンプル」から対応する「空試薬サンプル」の蛍光強度を差し引く。得られる蛍光強度を対照サンプルについて測定した蛍光強度と比較する。
【０１５９】
対照からみた蛍光強度の減少を％として示すことにより、凝集（脱線維化）の分解％を算出した。
【０１６０】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によるヒト血中（アセチル）コリンエステラーゼの阻害−エルマンアッセイ
潜在的に阻害性である化合物の存在下／非存在下でのアセチルコリンエステラーゼ活性の分光学的評価。試験の原理は、酵素アッセイの間に遊離したコリンがエルマン試薬と結合することである。
【０１６１】
ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２をメタノールで希釈／溶解させた。濃度は、サンプル１０ｍｇ／メタノールｍｌとした。インキュベーションアッセイに加える量は、各サンプルについて３０μｌとした。
【０１６２】
４１２ｎｍでの吸光度の増大を経時的に測定した。図１８で認められるように、ＥＳ２００８−０２１およびＥＳ２００８−０２２によって実現される阻害は異なっていた。
【０１６３】
ほぼ等しい濃度で、ＥＳ２００８−０２１（３００μｇの試験物品に対応する）ではヒトアセチルコリンエステラーゼが７０％阻害されたが、ＥＳ２００８−０２２では１３％しか阻害されなかった。
【０１６４】
実験−コリンエステラーゼアッセイ
阻害剤溶液：
対応するサンプル（ＥＳ２００８−０２１、ＥＳ２００８−２２）１０ｍｇを秤量し、１ｍｌのメタノールを加える。
【０１６５】
色原体溶液：
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８、ＮａＯＨ）を溶液Ａと３０：１の比で混合する。
【０１６６】
溶液Ａ：
５，５’−ジチオ−ビス［２−ニトロ安息香酸］３９．６ｍｇおよびＮａＨＣＯ3 １５．０ｍｇを１０ｍｌのフラスコに量り入れ、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７、ＮａＯＨ）でメスアップする。
【０１６７】
酵素溶液：
７０ＩＵ／Ｈ2Ｏｍｌの酵素活性を含むヒトアセチルコリンエステラーゼの溶液を調製する。
【０１６８】
基質溶液：ヨウ化アセチルチオコリン１１５．７ｍｇを１０ｍｌのフラスコに量り入れ、Ｈ2Ｏでメスアップする。
【０１６９】
１０μｌの阻害剤溶液を１８５μｌの色原体溶液および１０μｌの酵素溶液と混合する。振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。５μｌの基質溶液を加え、４１２ｎｍでの吸収の増加を、それ以上の増加が認められなくなるまで（３〜５分）記録する。
【０１７０】
本発明について、好ましい実施形態に即して述べてきたが、当業者なら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および細部を変更してもよいことがわかるであろう。背景にある参考文献を含めて、本明細書全体で引用したすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。当業者なら、せいぜい常法どおりの実験を使用すれば、本明細書で詳細に記載した本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認知するであろうし、またはつきとめることができる。そのような同等物も、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）をさらに含む、請求項１に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項３】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項２に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項４】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項３に記載のクルミ抽出物。
【請求項５】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項３に記載のクルミ抽出物。
【請求項６】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項１に記載のクルミ抽出物。
【請求項７】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項８】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）をさらに含む、請求項７に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項９】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項８に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１０】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項９に記載のクルミ抽出物。
【請求項１１】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項９に記載のクルミ抽出物。
【請求項１２】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項７に記載のクルミ抽出物。
【請求項１３】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とを含み、ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項１４】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）をさらに含む、請求項１３に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１５】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項１４に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１６】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項１５に記載のクルミ抽出物。
【請求項１７】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項１５に記載のクルミ抽出物。
【請求項１８】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項１３に記載のクルミ抽出物。
【請求項１９】
少なくとも約１０重量％のリン脂質を含む、クルミ抽出物由来の脂質組成物。
【請求項２０】
クルミ抽出物のリン脂質の重量百分率が少なくとも約２０％以上である、請求項１９に記載の脂質組成物。
【請求項２１】
リン脂質が（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、請求項２０に記載の脂質組成物。
【請求項２２】
ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２３】
ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２４】
ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２５】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２６】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項７に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２７】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１３に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２８】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１９に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２９】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含む組成物。
【請求項３０】
ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの重量比が約３：２：５である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
不飽和脂肪酸対飽和脂肪酸の重量比が約２：１〜約２．５：１である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項２９に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項１】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）をさらに含む、請求項１に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項３】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項２に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項４】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項３に記載のクルミ抽出物。
【請求項５】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項３に記載のクルミ抽出物。
【請求項６】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項１に記載のクルミ抽出物。
【請求項７】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルコリン（ＰＣ）とを含み、ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項８】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）をさらに含む、請求項７に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項９】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項８に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１０】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項９に記載のクルミ抽出物。
【請求項１１】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項９に記載のクルミ抽出物。
【請求項１２】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項７に記載のクルミ抽出物。
【請求項１３】
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とを含み、ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きいクルミ抽出物組成物。
【請求項１４】
ホスファチジルコリン（ＰＣ）をさらに含む、請求項１３に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１５】
スフィンゴ脂質をさらに含む、請求項１４に記載のクルミ抽出物組成物。
【請求項１６】
スフィンゴ脂質がスフィンゴミエリンである、請求項１５に記載のクルミ抽出物。
【請求項１７】
リン脂質／スフィンゴ脂質の重量比が５：１を上回る、請求項１５に記載のクルミ抽出物。
【請求項１８】
不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸の重量比が約１：１より大きい、請求項１３に記載のクルミ抽出物。
【請求項１９】
少なくとも約１０重量％のリン脂質を含む、クルミ抽出物由来の脂質組成物。
【請求項２０】
クルミ抽出物のリン脂質の重量百分率が少なくとも約２０％以上である、請求項１９に記載の脂質組成物。
【請求項２１】
リン脂質が（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、請求項２０に記載の脂質組成物。
【請求項２２】
ＰＥ対ＰＣの重量比が約０．４３より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２３】
ＰＩ対ＰＣの重量比が約０．８８より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２４】
ＰＩ対ＰＥの重量比が約０．４より大きい、請求項２１に記載の脂質組成物。
【請求項２５】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２６】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項７に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２７】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１３に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２８】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項１９に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【請求項２９】
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含む組成物。
【請求項３０】
ＰＣ：ＰＩ：ＰＥの重量比が約３：２：５である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
不飽和脂肪酸対飽和脂肪酸の重量比が約２：１〜約２．５：１である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
βアミロイドの凝集、アルツハイマー病、卒中に関連する疾患もしくは状態を治療し、血液脳関門機能を改善し、血液脳関門を介した活性物質の血液脳関門輸送を改善し、認知の健康を改善もしくは維持し、神経保護をもたらし、神経の発達を促進し、かつ／または脳における代謝を促進する方法であって、状態の１つまたは複数を治療、改善、または促進するように、有効量の請求項２９に記載のクルミ抽出物を個体に提供することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５３３５９７（Ｐ２０１２−５３３５９７Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１０１５（Ｐ２０１２−５２１０１５）
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０４６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９８５１
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０７１２８３４４）オムニカ ゲーエムベーハー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２０日（２０１０．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６０４６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００９８５１
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０７１２８３４４）オムニカ ゲーエムベーハー (10)
【Ｆターム（参考）】
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