【課題】核酸を標識するための方法および組成物の提供。
【解決手段】本発明は、インビトロおよびインビボにおける核酸ポリマーの標識のための方法に関する。核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識に結合された試薬との間の［３＋２］環化付加を含む特定の方法が提供される。核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識に結合された置換トリアリールホスフィンを含む試薬との間のシュタウディンガー・ライゲーション（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を含む他の方法が提供される。このような方法は、固定および変性は必要とせず、従って、生きている細胞におけるおよび生物体における、核酸ポリマーの標識に適用され得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、仮特許出願第６０／７３０，７４５号（２００５年１０月２７日出願、発明の名称「Ｍａｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」）に対する優先権を主張する。この仮特許出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（政府支援）
本明細書中に記載される研究の一部は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（助成金番号ＧＭ０２９５６５）による資金援助を受けた。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞分裂および細胞死は、多細胞生物体の適切な発達において、および組織の恒常性維持において中心的な役割を果たす。なかでも細胞増殖能力の損失または低下、および細胞死の調節不全は、加齢のプロセスを特徴付ける最も重要な現象である。（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。細胞増殖および細胞死の正常な制御の破壊はまた、以下を包含する多くの病理的な状態の背景である：ガン；感染性疾患、例えば、後天性免疫不全症候群（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）；血管障害、例えば、アテローム性動脈硬化症および高血圧（非特許文献８；非特許文献９）；ならびに神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００４】
細胞分裂の最も特徴的な生化学的な特徴は、細胞周期のＳ期の間にのみ本質的に生じるＤＮＡ合成である（非特許文献１３）。従って、細胞周期、ＤＮＡ合成および細胞増殖の研究のために最も一般に用いられる方法は、増殖している細胞の新規に合成されたＤＮＡへの標識された生合成前駆体の組み込みに依存する（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。これらの方法では、標識されたＤＮＡ前駆体（例えば、［^３Ｈ］−チミジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ））を複製の間に細胞に添加して、ゲノムＤＮＡへのそれらの組み込みを、インキュベーションおよびサンプル調製後に定量する。組み込まれた［^３Ｈ］−チミジンは一般に、オートラジオグラフィーによって検出される。組み込まれたＢｒｄＵの検出は、モノクローナル抗体のアクセスを可能にするサンプル変性後に免疫学的に行なわれ、次いで、得られたＢｒｄＵ標識細胞をフローサイトメトリーまたは顕微鏡によって分析する。特定の組織の細胞増殖を研究するために、動物に標識したＤＮＡ前駆体を投与（例えば、注射）して、屠殺して、その組織を取り出して、顕微鏡分析のために固定する。
【０００５】
［^３Ｈ］−チミジンおよびＢｒｄＵ組み込み標識方法は、細胞周期の動態学、ＤＮＡ合成および姉妹染色分体交換を研究するために、ならびに種々の条件下での正常または病理的な細胞または組織の細胞増殖を評価するために有用であることが証明されているが、これらの方法はいくつかの限界を示している。［^３Ｈ］−チミジン取り込みの最も注目すべき不利な点は、放射性活性を用いる合併症およびリスクから生じる。さらに、オートラジオグラフィーは労働集約的であって、時間浪費的である。さらに、両方の方法ともサンプル破壊的であるので、定量は所定の１時点でしか行うことができず、単一のサンプルを連続してモニタリングすることは不可能である。さらに、［^３Ｈ］−チミジンオートラジオグラフィーとは対照的に、ＢｒｄＵ免疫組織化学は、化学量論的ではない（非特許文献１７；非特許文献１８）。従って、標識の強度または程度は、検出のために用いられる条件に高度に依存し、そしてＤＮＡ複製の大きさを反映する必要は無い。この理由のために、ＢｒｄＵ標識は、細胞分裂の指標として特に脆弱であり誤訳を行う（非特許文献１９）。
【０００６】
さらに最近では、［^３Ｈ］−チミジンおよびＢｒｄＵ取り込み方法に関連するいくつかの問題を解決する、安定な同位体質量分光測定技術が開発されている（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。この技術では、ＤＮＡ複製におけるヌクレオチドのデオキシリボース部分は、安定な同位体^２Ｈ−または^１３Ｃ−標識グルコースを用いることによるデノボ（新生）ヌクレオチド合成経路を通じて、内因的に標識される。次いで、ＤＮＡの同位体富化は、ゲノムＤＮＡの単離、変性および加水分解、ならびに得られたデオキシリボヌクレオシドのＴＭＳ（トリメチルシリル）誘導体化後にガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって検出されかつ定量される。この方法は、ヒトでの使用に安全であることを含むいくつかの利点を有するが、これは、検出前のサンプルの長期かつ破壊的な処理に関与することを含む不利な点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄ．Ｍｏｎｔｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，１９９２，５５（補遺６）：１２０８Ｓ〜１２１４Ｓ
【非特許文献２】Ｈ．Ｒ．Ｗａｒｎｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ，１９９７，４５：１１４０〜１１４６
【非特許文献３】Ｌ．Ｇｉｎａｌｄｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０００，２１：３１〜３８
【非特許文献４】Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｔｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８９，９：１５９〜１６８
【非特許文献５】Ｒ．Ａ．Ｇｒｕｔｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，２０：１０３９〜１０４４
【非特許文献６】Ｌ．Ｍｅｙａａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：２１７〜１１９
【非特許文献７】Ａ．Ｃａｙｏｔａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２，８８：４７８〜４８３
【非特許文献８】Ｓ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１９８６，５８：４２７〜４４４
【非特許文献９】Ａ．ＲｉｖａｒｄおよびＶ．Ａｎｄｒｅｓ，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，２０００，１５：５５７〜５７１
【非特許文献１０】Ｚ．Ｎａｇｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ．補遺，１９９９，５７：２３３〜２４５
【非特許文献１１】Ａ．Ｋ．Ｒａｉｎａら、Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．，２０００，４：２３５〜２４２
【非特許文献１２】Ｉ．Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．，２００３，５：３１〜４１
【非特許文献１３】Ｓ．Ｓａｗａｄａら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，１９９５，３４４：１０９〜１１６
【非特許文献１４】Ｍ．ＢｉｃｋおよびＲ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７４，７１：２０８２〜２０８６
【非特許文献１５】Ｈ．Ｇ．Ｇｒａｔｚｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１８：４７４〜４７５
【非特許文献１６】Ｆ．Ｍ．Ｗａｌｄｍａｎら、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ，１９９１，４：７１８〜７２２
【非特許文献１７】Ｒ．Ｓ．Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，１９８９，１８：３１１〜３１８
【非特許文献１８】Ｒ．Ｓ．ＮｏｗａｋｏｗｓｋｉおよびＮ．Ｌ．Ｈａｙｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８：７７１
【非特許文献１９】Ｐ．Ｒａｋｉｃ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，３：５６〜７１
【非特許文献２０】Ｄ．Ｃ．Ｍａｃａｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：７０８〜７１３
【非特許文献２１】Ｍ．Ｋ．Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９９，２０：４３８〜４４１
【非特許文献２２】Ｍ．Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，１９９９，５：８３〜８９
【非特許文献２３】Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｕｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０５：Ｒ１−８
【非特許文献２４】Ｈ．Ｍｏｈｒｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，９４：１２７７〜１２８８
【非特許文献２５】Ｒ．Ｍ．Ｒｉｂｅｉｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９：１５５７２〜１５５７７
【非特許文献２６】Ｒ．Ｍ．Ｒｉｂｅｉｒｏら、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏｌ，２００２，６４：３８５〜４０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
明らかに、細胞周期の動態、ＤＮＡ合成および細胞増殖のインビトロおよびインビボにおける研究には、改良された核酸標識技術が依然として必要である。詳細には、簡易、迅速かつ鋭敏であり、過剰なサンプル調製を必要とせず、そして／またはサンプルの破壊を生じない技術の開発がやはり極めて望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、細胞分裂を研究するための改良されたシステムおよびストラテジーに関する。さらに詳細には、本発明は、核酸分子を標識するために、そして細胞増殖を測定するためにインビトロおよびインビボで有用な方法および組成物を提供する。詳細には、本発明の方法は、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと、標識を含む試薬との間の化学反応を包含し、このヌクレオチドアナログが第一の反応性基を含み、そしてこの試薬が第二の反応性基を含み、この第一の反応性基と第二の反応性基との間のこのような反応が核酸ポリマーの標識を生じる。このような方法は、標識されたサンプルの過剰な処理を必要としない。詳細には、多くの発明方法はサンプルの変性を必要としない。詳細には、本発明は、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識を含む試薬との間の［３＋２］環化付加を含む核酸ポリマーを標識する方法、および核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識を含む試薬との間のシュタウディンガー・ライゲーション（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を包含する、核酸ポリマーを標識する方法を提供する。
【００１０】
より詳細には、１局面では、本発明は、核酸ポリマーを標識する方法を提供し、この方法は、以下の工程：第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する工程と；核酸ポリマーと、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果、第一の不飽和基と第二の不飽和基との間で［３＋２］環化付加が生じる工程と；を包含する。
【００１１】
特定の実施形態では、上記第一の反応性不飽和基が１，３−双極子（ｄｉｐｏｌｅ）を含み、かつ第二の反応性不飽和基が、親双極子（ダイポーラロフィル）（ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ）を含む。他の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、親双極子を含み、かつこの第二の反応性不飽和基が、１，３−双極子を含む。ある実施形態では、この１，３−双極子はアジド基を含んでもよく、そしてこの親双極子はエチニル基を含んでもよい。
【００１２】
特定の実施形態では、この標識は直接検出可能である。例えば、この標識は、蛍光剤を含む。他の実施形態では、この標識は間接的に検出可能である。例えば、この標識はハプテンを含む。
【００１３】
標識されるべき核酸ポリマーは、細胞の内側にあっても、組織または生物体の中にあってもよい。
【００１４】
特定の実施形態では、上記少なくとも１つのヌクレオチドアナログが、ＤＮＡ複製またはＤＮＡ転写の間に核酸ポリマーに組み込まれる。
【００１５】
特定の実施形態では、核酸ポリマーと試薬との接触の工程は、水性条件下で行われる。この接触は、Ｃｕ（Ｉ）の存在下で行われてもよい。あるいは、この接触は、Ｃｕ（Ｉ）の非存在下でＣｕキレート部分をさらに含む試薬と行われてもよい。
【００１６】
別の局面では、本発明は、核酸ポリマーを二重に標識するための方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログと、第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログとを含む核酸ポリマーを提供する工程と；核酸ポリマーと、第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬とを接触させて、その結果、この第一の不飽和基と第三の不飽和基との間で［３＋２］環化付加が生じる工程と；この核酸ポリマーと、第二の標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第二および第四の不飽和基の間で生じる工程と；を包含する。
【００１７】
特定の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、第一の１，３−双極子を含み、かつ第三の反応性不飽和基が、第一の親双極子を含む；この第二の反応性不飽和基は、第二の親双極子を含み、かつこの第四の反応性不飽和基が、第二の１，３−双極子を含む。
【００１８】
他の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、第一の親双極子を含み、かつこの第三の反応性不飽和基は、第一の１，３−双極子を含む；この第二の反応性不飽和基は、第二の１，３−双極子を含み、かつ第四の反応性不飽和基が、第二の親双極子を含む。上記のとおり、１，３−双極子はアジド基を含んでもよく、そして親双極子はエチニル基を含んでもよい。
【００１９】
特定の実施形態では、この第一の標識および第二の標識は直接検出可能である。いくつかのこのような実施形態では、この第一の標識は、第一の蛍光剤を含み、この第二の標識は、第二の蛍光剤を含み、そしてこの第一の蛍光剤および第二の蛍光剤は、励起の際に二重の色の蛍光を生じる。
【００２０】
他の実施形態では、この第一の標識および第二の標識は間接的に検出可能である。例えば、この第一の標識は第一のハプテンを含み、そしてこの第二の標識は第二のハプテンを含む。
【００２１】
上述されるとおり、二重に標識されるべき核酸ポリマーは、細胞の内側にあっても、組織または生物体の中にあってもよい；そしてこの第一のヌクレオチドアナログおよび第二のヌクレオチドアナログは、ＤＮＡ複製またはＤＮＡ転写の間に核酸ポリマーに組み込まれてもよい。
【００２２】
これらの発明の方法では、接触工程は、同時に行われてもまたは連続して行われてもよい。好ましくはこの接触工程は、水性条件下で行われる。
【００２３】
別の局面では、本発明は、核酸ポリマーを示差的に標識するための方法を提供する。これらの発明の方法は、以下の工程：第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログを含む第一の核酸ポリマーを提供する工程と；第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二ヌクレオチドアナログを含む第二の核酸ポリマーを提供する工程と；この第一の核酸ポリマーと、第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬とを接触させて、その結果、この第一の不飽和基と第三の不飽和基との間で［３＋２］環化付加が生じる工程と；この第二の核酸ポリマーと、第二の標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第二および第四の不飽和基の間で生じる工程と；を包含する。
【００２４】
この第一の反応性の不飽和基および第二の反応性の不飽和基ならびに第一の標識および第二の標識は上記されるとおりであり得る。上記のとおり、接触の工程は同時であってもよいし、または連続であってもよい。
【００２５】
特定の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは第一の細胞の内側にあり、そしてこの第二のポリマーは第二の細胞の内側にある。他の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは、第一の組織の内側にあり、そしてこの第二の核酸ポリマーは第二の組織の内側にある。さらに他の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは、第一の生物体の内側にあり、そしてこの第二のポリマーは第二の生物体の内側にある。
【００２６】
別の局面では、本発明は、標識に結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する。好ましくは、この核酸ポリマーは、本明細書に開示される標識方法の１つによって調製される。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明の核酸ポリマーに組み込まれるヌクレオチドアナログは、環付加物、例えば、エチニル基とアジド基との間の［３＋２］環化付加から生じる環付加物を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、この標識は、ヌクレオチドアナログに共有結合される。
【００２９】
特定の実施形態では、この標識は直接検出可能である。例えば、この標識は、蛍光剤である。他の実施形態では、この標識は間接的に検出される。例えば、この標識はハプテンを含む。
【００３０】
本発明はまた、二重に標識された核酸ポリマーを提供する。より詳細には、本発明は、第一の標識に対して結合された少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログおよび第二の標識に対して結合された少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する。好ましくは、このような核酸ポリマーは、本明細書に記載の二重標識方法によって調製される。
【００３１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログは、第一のエチニル基と第一アジド基との間の［３＋２］環化付加から生じる第一の環付加物を含み、そして少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログは、第二のエチニル基と第二のアジド基との間の［３＋２］環化付加から生じる第二の環付加物を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、この第一の標識は、第一の蛍光剤を含み、この第二の標識は、第二の蛍光剤を含み、そしてこの第一の蛍光剤および第二の蛍光剤が、励起の際に二重蛍光を生じる。
【００３３】
別の局面では、本発明は、１つ以上の本発明の標識されるかまたは二重標識される核酸ポリマーを含む細胞を提供する。
【００３４】
さらに別の局面では、本発明は、以下を備える核酸ポリマーを標識するためのキットを提供する：第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つのヌクレオシドアナログ；および標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬。
【００３５】
特定の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、１，３−双極子を含み、第二の反応性不飽和基は、親双極子を含み、そしてこの第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る。他の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、親双極子を含み、この第二の反応性不飽和基は、１，３−双極子を含み、そしてこの第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る。
【００３６】
本発明はまた、核酸ポリマーを二重に標識するためのキットを提供し、このキットは以下を備える：第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオシドアナログ；第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオシドアナログ；第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬；および第二の試薬に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬。
【００３７】
特定の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、第一の１，３−双極子を含み、この第三の反応性不飽和基は、第一の親双極子を含み、そしてこの第一の反応性不飽和基および第三の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る；第二の反応性不飽和基は、親双極子を含み、この第四の反応性不飽和基は、第二の１，３−双極子を含み、そしてこの第二および第四の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る。
【００３８】
他の実施形態では、この第一の反応性不飽和基は、第一の親双極子を含み、この第三の反応性不飽和基は、第一の１，３−双極子を含み、そしてこの第一の反応性不飽和基および第三の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る；この第二の反応性不飽和基は、親双極子を含み、この第四の反応性不飽和基は、第二の１，３−双極子を含み、そしてこの第二および第四の反応性不飽和基は、［３＋２］環化付加を介して反応し得る。本発明のキットはさらに、水性媒体および／またはＣｕ（Ｉ）を含んでもよい。
【００３９】
さらに別の局面では、本発明は、細胞において、または生物体において、細胞増殖を測定するための方法を提供する。
【００４０】
特定の本発明の方法は、以下の工程：細胞と、第一の反応性不飽和基を含むヌクレオシドアナログの有効量とを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログがこの細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程と；を包含する。この細胞は、マルチウェル・アッセイ・プレート中にあってもよい。
【００４１】
本発明の他の方法は、以下の工程：生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与する工程であって、その結果このヌクレオシドアナログがこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、この生物体における細胞増殖を測定する工程と；を包含する。
【００４２】
この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基；これらの方法における標識および接触工程は上記のとおりであり得る。
【００４３】
さらに別の局面では、本発明は、細胞において、または生物体において細胞増殖を混乱させる（ｐｅｒｔｕｒｂ）因子を特定するための方法を提供する。
【００４４】
本発明の特定の方法は、以下の工程：（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程と；（ｂ）この細胞と、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログをこの細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；（ｄ）このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が、細胞増殖の程度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、細胞が試験因子に接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子を細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含する。工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われてもよい。
【００４５】
本発明の他の方法は以下の工程：（ａ）生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；（ｂ）この生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果このヌクレオシドアナログをこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基と第二の反応性不飽和基との間で生じる工程と；（ｄ）ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、生物体が試験因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子をこの生物体における細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含する。工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われてもよい。この接触工程はインビボで行われても、またはエキソビボで行われてもよい。
【００４６】
細胞増殖を混乱させる因子を特定するための本発明の方法はさらに以下の工程：工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも多い場合、この試験因子を、細胞増殖を混乱させる因子として特定する工程；および／または工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも少ない場合、この試験因子を、細胞増殖を阻害する因子として特定する工程を包含してもよい。
【００４７】
さらに、別の局面では、本発明は、核酸ポリマーを標識するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する工程と；核酸ポリマーと、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；を包含する。
【００４８】
特定の実施形態では、トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つは、求電子性トラップとして作用する官能基、例えば、アルキルエステル（例えば、メチルエステル）で置換される。好ましくは、トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つは、リン原子に対してオルトであるアルキルエステルで誘導体化される。
【００４９】
特定の実施形態では、この標識は直接検出可能である。例えば、この標識は、蛍光剤を含む。他の実施形態では、この標識は間接的に検出可能である。例えば、この標識はハプテンを含む。
【００５０】
標識されるべき核酸ポリマーは、単離された核酸ポリマーであってもよいし、または細胞の内側にあっても、組織または生物体の中にあってもよい。
【００５１】
特定の実施形態では（例えば、核酸ポリマーが細胞の内側にあるか、または生物体の中にある場合）、この少なくとも１つのヌクレオチドアナログは、ＤＮＡ複製またはＤＮＡ転写の間に核酸ポリマーに組み込まれる。
【００５２】
別の局面では、本発明は、核酸ポリマーを示差的に標識するための方法を提供する。これらの本発明の方法は以下の工程：第一のアジド基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログを含む第一の核酸ポリマーを提供する工程と；第二のアジド基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む第二の核酸ポリマーを提供する工程と；この第一の核酸ポリマーと、第一の置換トリアリールホスフィンに結合された第一の標識を含む第一の試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがこの第一のアジドと第一の置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；この第二の核酸ポリマーと、第二の置換トリアリールホスフィンに結合された第二の標識を含む第二の試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがこの第二のアジドと第二の置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；を包含する。
【００５３】
特定の実施形態では、第一のトリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つおよび第二のトリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つは各々、求電子性トラップとして作用する官能基、例えば、アルキルエステル（例えば、メチルエステル）で置換される。好ましくは、第一のトリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つおよび第二のトリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つは各々、リン原子に対してオルトであるアルキルエステルで誘導体化される。
【００５４】
特定の実施形態では、この第一の標識および第二の標識は直接検出可能である。このようないくつかの実施形態では、この第一の標識は、第一の蛍光剤を含み、この第二の標識は、第二の蛍光剤を含み、そしてこの第一の蛍光剤および第二の蛍光剤は、励起の際に二重蛍光を生じる。
【００５５】
他の実施形態では、この第一の標識および第二の標識は間接的に検出可能である。例えば、この第一の標識は第一のハプテンを含み、そしてこの第二の標識は第二のハプテンを含む。
【００５６】
これらの方法では、この接触工程は好ましくは、連続して行われる。
【００５７】
特定の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは、第一の細胞の内側にあり、そしてこの第二の核酸ポリマーは、第二の細胞の内側にある。他の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは、第一の組織中にあり、そしてこの第二の核酸ポリマーは、第二の組織中にある。さらに他の実施形態では、この第一の核酸ポリマーは、第一の生物体中にあり、そしてこの第二のポリマーは第二の生物体中にある。
【００５８】
別の局面では、本発明は、標識に結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する。好ましくは、本発明の核酸ポリマーは、シュタウディンガー・ライゲーションを含む本明細書に開示される標識方法のうちの１つによって調製される。
【００５９】
特定の実施形態では、この核酸ポリマーは、シュタウディンガー・ライゲーション反応から生じる、アミドおよびトリアリールホスフィンオキシドを通じて標識に結合されたヌクレオチドアナログを含む。
【００６０】
特定の実施形態では、この標識は直接検出可能である。例えば、この標識は、蛍光剤を含む。他の実施形態では、この標識は間接的に検出可能である。例えば、この標識はハプテンを含む。
【００６１】
さらに別の局面では、本発明は、核酸ポリマーを標識するためのキットを提供し、このキットは以下：アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオシドアナログと、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを備える。
【００６２】
特定の実施形態では、このトリアリールホスフィンのアリール基の１つは、求電子性トラップとして作用する官能基、例えば、アルキルエステルで置換される。好ましくは、このアリール基のうちの１つは、リン原子に対してオルトであるアルキルエステルで誘導体化される。この標識は、直接検出可能であってもよいし（例えば、この標識が、蛍光剤を含む）、または間接的に検出可能であってもよい（例えば、この標識がハプテンを含む）。
【００６３】
さらに別の局面では、本発明は、細胞において、または生物体において、細胞増殖を測定するための方法を提供する。
【００６４】
特定の本発明の方法は、以下の工程：細胞と、アジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログをこの細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；この細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果、このアジドとトリアリールホスフィンとの間でシュタウディンガー・ライゲーションが生じる工程と；ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程とを包含する。この細胞は、マルチ−ウェルアッセイプレート中にあってもよい。
【００６５】
他の本発明の方法は、以下の工程：生物体に対して、アジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果このヌクレオシドアナログをこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果このアジドとトリアリールホスフィンとの間でシュタウディンガー・ライゲーションを生じる工程と；このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、この生物体における細胞増殖を測定する工程とを包含する。この接触工程は、インビボで行われてもまたはエキソビボで行われてもよい。
【００６６】
これらの方法の特定の実施形態では、トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つが、求電子性トラップとして作用する官能基、例えば、アルキルエステルで置換される。好ましくは、このアリール基のうちの１つは、リン原子に対してオルトであるアルキルエステルで誘導体化される。この標識は、直接検出可能であってもよいし（例えば、この標識が、蛍光剤を含む）、または間接的に検出可能であってもよい（例えば、この標識がハプテンを含む）。
【００６７】
さらに別の局面では、本発明は、細胞において、または生物体において、細胞増殖を混乱させる因子を特定するための方法を提供する。
【００６８】
特定の本発明の方法は、以下の工程：（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程と；（ｂ）この細胞と、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログをこの細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがアジドとトリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；（ｄ）ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、細胞が試験因子と接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子を細胞増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含する。特定の実施形態では、工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われる。
【００６９】
他の本発明の方法は以下の工程：（ａ）ある生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；（ｂ）この生物体に対して、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果このヌクレオシドアナログをこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この生物体の少なくとも１つの細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがこのアジドとトリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；（ｄ）このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、生物体が試験因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子をこの生物体において細胞増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含する。本発明の特定の実施形態では、工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われる。この接触工程はインビボで行われてもまたはエキソビボで行われてもよい。
【００７０】
細胞増殖を混乱させる試験因子を特定するための本発明の方法はさらに、工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも多い場合、この試験因子を、細胞増殖を誘導させる因子として特定する工程；および／または工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも少ない場合、この試験因子を、細胞増殖を阻害させる因子として特定する工程を包含し得る。
【００７１】
本発明のこれらのおよび他の目的、利点および特徴は、以下の詳細な説明を読めば当業者に理解される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
核酸ポリマーを標識する方法であって、以下の工程：
第一の反応性基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する工程と；
該核酸ポリマーと、標識および第二の反応性基を含む試薬とを接触させて、その結果反応が該第一の反応性基と該第二の反応性基との間で生じて、該核酸ポリマーの標識が生じる工程と；
を包含する、方法。
（項目２）
核酸ポリマーを標識する方法であって、以下の工程：
アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する工程と；
該核酸ポリマーと、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該アジドと該置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
を包含する、方法。
（項目３）
前記トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つがアルキルエステルで置換される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記アルキルエステルが、前記トリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つがメチルエステルで置換される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記標識が直接検出可能である、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記標識が蛍光剤である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標識が間接的に検出可能である、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記標識がハプテンを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記核酸ポリマーが細胞の内側にあるか、または生物体の中にある、項目３に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つのヌクレオチドアナログが、ＤＮＡ複製の間に前記核酸ポリマーに組み込まれる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
核酸ポリマーを示差的に標識する方法であって、以下の工程：
第一のアジド基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログを含む第一の核酸ポリマーを提供する工程と；
第二のアジド基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む第二の核酸ポリマーを提供する工程と；
該第一の核酸ポリマーと、第一の置換されたトリアリールホスフィンに結合された第一の標識を含む第一の試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該第一のアジドと該第一の置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
該第二の核酸ポリマーと、第二の置換されたトリアリールホスフィンに結合された第二の標識を含む第二の試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該第二のアジドと該第二の置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
を包含する、方法。
（項目１３）
前記第一のトリアリールホスフィンのアリール基の１つが、アルキルエステルで置換され、そして前記第二のトリアリールホスフィンのアリール基の１つがアルキルエステルで置換される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第一のトリアリールホスフィン上の前記アルキルエステルが、前記第一のトリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトであり、かつ前記第二のトリアリールホスフィン上の前記アルキルエステルが、前記第二のトリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第一の標識および前記第二の標識が直接検出可能である、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記第一の標識が、第一の蛍光剤を含み、前記第二の標識が第二の蛍光剤を含み、かつ該第一の蛍光剤および該第二の蛍光剤が励起の際に二重色蛍光を生じる、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記第一の標識および前記第二の標識が間接的に検出可能である、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記第一の標識が第一のハプテンを含み、かつ前記第二の標識が第二のハプテンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第一の核酸ポリマーが第一の細胞の内側にあり、かつ前記第二の核酸ポリマーが第二の細胞の内側にある、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記第一の核酸ポリマーが第一の生物体の内側にあり、かつ前記第二の核酸ポリマーが第二の生物体の内側にある、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログが、ＤＮＡ複製の間に前記第一の核酸ポリマーに組み込まれ、かつ前記少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログが、ＤＮＡ複製の間に前記第二の核酸ポリマーに組み込まれる、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
標識に結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーであって、該核酸ポリマーが項目２に記載の方法によって調製される、核酸ポリマー。
（項目２３）
項目２２に記載の核酸ポリマーを含む細胞。
（項目２４）
核酸ポリマーを標識するためのキットであって：
アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオシドアナログと；
第一の置換されたトリアリールホスフィンに結合された第一の標識を含む第一の試薬と、を備える、キット。
（項目２５）
前記第一のトリアリールホスフィンのアリール基の１つがアルキルエステルで置換される、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記アルキルエステルが、前記第一のトリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
前記第一の標識が直接検出可能である、項目２４に記載のキット。
（項目２８）
前記第一の標識が蛍光剤である、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
前記第一の標識が間接的に検出可能である、項目２４に記載のキット。
（項目３０）
前記第一の標識がハプテンを含む、項目２９に記載のキット。
（項目３１）
第二の置換されたトリアリールホスフィンに結合された第二の標識を含む第二の試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目３２）
前記第二のトリアリールホスフィンのアリール基の１つがアルキルエステルで置換される、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
前記アルキルエステルが、前記第二のトリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目３２に記載のキット。
（項目３４）
前記第一の標識および前記第二の標識が直接検出可能である、項目３１に記載のキット。
（項目３５）
前記第一の標識が、第一の蛍光剤を含み、前記第二の標識が第二の蛍光剤を含み、かつ該第一の蛍光剤および該第二の蛍光剤が励起の際に二重色蛍光を生じる、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
前記第一の標識および前記第二の標識が間接的に検出可能である、項目３１に記載のキット。
（項目３７）
前記第一の標識が第一のハプテンを含み、かつ前記第二の標識が第二のハプテンを含む、項目３６に記載のキット。
（項目３８）
細胞増殖を測定する方法であって、以下の工程：
細胞と第一のアジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果該ヌクレオシドアナログが該細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；
該細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該アジドと該置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目３９）
細胞増殖を測定する方法であって、以下の工程：
生物体に対して、アジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果該ヌクレオシドアナログが該生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；
該生物体の少なくとも１つの細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該アジドと該置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
該少なくとも１つの細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、該生物体における細胞増殖を測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目４０）
前記トリアリールホスフィンのアリール基のうちの１つがアルキルエステルで置換される、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
前記アルキルエステルが、前記トリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記標識が直接検出可能である、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４３）
前記標識が蛍光剤を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記標識が間接的に検出可能である、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４５）
前記標識がハプテンを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞が、マルチ−ウェルプレート中にある、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
細胞増殖を混乱させる因子を特定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程と；
（ｂ）該細胞と、アジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果該ヌクレオシドアナログを該細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；
（ｃ）該細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該アジドと該置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
（ｄ）該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、該標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、該細胞が該試験因子と接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、該試験因子を細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；
を包含する、方法。
（項目４８）
前記工程（ｂ）が工程（ａ）の前に行われる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
項目４７に記載の方法であって、工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも大きい場合、該試験因子を細胞増殖を誘導する因子として特定する工程をさらに包含する、方法。
（項目５０）
項目４７に記載の方法であって、工程（ｄ）で測定される標識の量が、コントロールの適用において測定される標識の量よりも小さい場合、該試験因子を細胞増殖を阻害する因子として特定する工程をさらに包含する、方法。
（項目５１）
前記トリアリールホスフィンのアリール基の１つがアルキルエステルで置換される、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記アルキルエステルが、前記トリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記標識が直接検出可能である、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記標識が蛍光剤を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記標識が間接的に検出可能である、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
前記標識がハプテンを含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記細胞が、マルチ−ウェルプレート中にある、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
生物体中で細胞増殖を混乱させる因子を特定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；
（ｂ）該生物体に対して、アジド基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果該ヌクレオシドアナログを該生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；
（ｃ）該生物体の少なくとも１つの細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが該アジドと該置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；
（ｄ）該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、該標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；
（ｅ）前記工程（ｄ）で測定される標識の量が、該生物体が候補因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、前記試験因子を前記生物体における細胞増殖を混乱させる因子として特定する工程と；
を包含する、方法。
（項目５９）
前記工程（ｂ）が工程（ａ）の前に行われる、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
項目５８に記載の方法であって、前記工程（ｄ）で測定される標識の量が、前記コントロールの適用において測定される標識の量よりも大きい場合、前記試験因子を生物体中において細胞増殖を誘導する因子として特定する工程をさらに包含する、方法。
（項目６１）
項目５８に記載の方法であって、前記工程（ｄ）で測定される標識の量が、前記コントロールの適用において測定される標識の量よりも小さい場合、前記試験因子を前記生物体における細胞増殖を阻害する因子として特定する工程をさらに包含する、方法。
（項目６２）
前記トリアリールホスフィンのアリール基がアルキルエステルで置換される、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記アルキルエステルが、前記トリアリールホスフィンのリン原子に対してオルトである、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記標識が直接検出可能である、項目５８に記載の方法。
（項目６５）
前記標識が蛍光剤を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記標識が間接的に検出可能である、項目５８に記載の方法。
（項目６７）
前記標識がハプテンを含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
試薬と接触する前記工程が、インビトロまたはエキソビボで行なわれる、項目５８に記載の方法。
（項目６９）
核酸ポリマーを標識する方法であって、以下の工程：
第一の反応性の不飽和基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーを提供する工程と；
該核酸ポリマーと標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の不飽和基および該第二の不飽和基の間で生じる工程と；
を包含する、方法。
（項目７０）
前記第一の反応性不飽和基が１，３−双極子を含み、かつ前記第二の反応性不飽和基が、親双極子を含むか、または該第一の反応性不飽和基が親双極子を含み、かつ該第二の反応性不飽和基が、１，３−双極子を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記１，３−双極子がアジド基を含み、かつ前記親双極子がエチニル結合を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記標識が直接検出可能である、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
前記標識が蛍光剤を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記標識が間接的に検出可能である、項目６９に記載の方法。
（項目７５）
前記標識がハプテンを含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記核酸ポリマーが細胞の内側にあるか、または生物体の内側にある、項目６９に記載の方法。
（項目７７）
前記少なくとも１つのヌクレオチドアナログが、ＤＮＡ複製の間に前記核酸ポリマーに組み込まれる、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記接触工程が、Ｃｕ（Ｉ）の存在下における水性条件下で行われる、項目６９に記載の方法。
（項目７９）
前記接触工程が、Ｃｕ（Ｉ）の非存在下における水性条件下で行われ、かつ前記試薬がＣｕキレート部分をさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
核酸ポリマーを標識する方法であって、以下の工程：
第一の反応性の不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログを含む第一の核酸ポリマーを提供する工程と；
第二の反応性の不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む第二の核酸ポリマーを提供する工程と；
該第一の核酸ポリマーと、第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の不飽和基および第三の不飽和基の間で生じる工程と；
該第二の核酸ポリマーと第二の標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第二および第四の不飽和基の間で生じる工程と；
を包含する、方法。
（項目８１）
前記第一の核酸ポリマーおよび前記第二の核酸ポリマーが同じ分子であり、かつ該第一の標識が、第一の蛍光剤を含み、該第二の標識が、第二の蛍光剤を含み、かつ該第一の蛍光剤および該第二の蛍光剤が、励起の際に二重色蛍光を生じる、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
標識に対して結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーであって、該核酸ポリマーが項目６９に記載の方法によって調製される、核酸ポリマー。
（項目８３）
第一の標識に対して結合された少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログと、第二の標識に対して結合された少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログとを含む核酸ポリマーであって、該核酸ポリマーが項目８１に記載の方法によって調製される、核酸ポリマー。
（項目８４）
項目８２または８３に記載の核酸ポリマーを含む細胞。
（項目８５）
核酸ポリマーを標識するためのキットであって：
第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオシドアナログと；
標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一試薬であって、その結果該第一の反応性不飽和基および該第二の反応性不飽和基が［３＋２］環化付加を介して反応し得る、少なくとも１つの第一試薬と；
をさらに備える、キット。
（項目８６）
項目８４に記載のキットであって：
第三の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオシドアナログと；
標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二試薬であって、その結果該第三および第四の反応性不飽和基が［３＋２］環化付加を介して反応し得る、少なくとも１つの第二試薬と；
を備える、キット。
（項目８７）
細胞増殖を測定する方法であって、以下の工程：
細胞と第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果該ヌクレオシドアナログが該細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；
該細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の反応性不飽和基および該第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；
該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目８８）
生物体中の細胞増殖を測定する方法であって、以下の工程：
生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与する工程であって、その結果該ヌクレオシドアナログが該生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；
該生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の反応性不飽和基および該第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；
該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、該生物体における細胞増殖を測定する工程と；
を包含する、方法。
（項目８９）
細胞増殖を混乱させる因子を特定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程と；
（ｂ）該細胞と、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果該ヌクレオシドアナログを該細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；
（ｃ）該細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の反応性不飽和基と該第二の反応性不飽和基との間で生じる工程と；
（ｄ）該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、該標識量が、細胞増殖の程度を示す工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、該細胞が該試験因子に接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、該試験因子を細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；
を包含する、方法。
（項目９０）
生物体中で細胞増殖を混乱させる因子を特定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；
（ｂ）該生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果該ヌクレオシドアナログを該生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；
（ｃ）該生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、該第一の反応性不飽和基と該第二の反応性不飽和基との間で生じる工程と；
（ｄ）該ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、該標識量が細胞増殖の程度を示す工程と；
（ｅ）該工程（ｄ）で測定される標識の量が、該生物体が候補因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、該試験因子を該生物体における細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、（Ａ）当該分野で公知のＢｒｄＵを用いるＤＮＡ標識、および（Ｂ）本発明の方法を用いるＤＮＡ標識であって、ＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログＥｄＵ（すなわち、エチニル−ｄＵ）のＤＮＡへの組み込み、続いてＣｕ（Ｉ）の存在下におけるエチニル基とアジド試薬との間の［３＋２］環化付加を含むＤＮＡ標識を示す２つのスキームを示している。
【図２】図２は、本発明に従う２色ＤＮＡ標識の例を示すスキームを示す。
【図３】図３は、本発明に従うＤＡＢフォトコンバージョン（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の例を示すスキームを示す。
【図４】図４は、未反応染色試薬（すなわち、発蛍光団−アジド（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｚｉｄｅ））からの非特異的な（すなわち、バックグラウンドの）シグナルをクエンチするための本発明の方法を例示するスキームを示す。
【図５】図５は、実施例２に記載のとおり、（Ａ）ＸＲｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色したＥｄＵ未標識ＨｅＬａ細胞、および（Ｂ）ＸＲｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色したＥｄＵ標識細胞、の蛍光顕微鏡によって得られた２つの画像を示す。
【図６】図６は、経時的蛍光顕微鏡画像のセットを示しており、これは生きた細胞上の染色反応を時間の関数として示す。ＥｄＵ標識された細胞の染色は、実施例３に記載されるように、細胞透過性ＴＭＲ−アジドを用いて行った。画像上の時間の表示は分：秒で示す。
【図７】図７は、図６に示される画像で測定されたとおり経時的にプロットされたＤＮＡ染色強度を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例４に記載されるとおり標識されたマウスの腸を通る切片の蛍光顕微鏡画像（高倍率）を示す。赤い核を有する細胞は、ＥｄＵを組み込む細胞およびそれらの子孫である。ＤＮＡは青でみられる（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。
【図９】図９は、実施例４に記載されるように標識されたマウス腸を通る切片の蛍光顕微鏡画像（低倍率）を示す。ＤＮＡは緑でみられる。赤は、ＥｄＵを組み込む細胞およびそれらの子孫を示す。この図で示される対象物は、腸を通る全体的な斜め断面−約５ミリメートル長である。
【図１０】図１０は、実施例４に記載されるように標識されたマウス脳を通る切片の蛍光顕微鏡画像を示す。単独のＥｄＵ標識細胞が、この脳切片で容易に同定され得る（脳の細胞は、極めて増殖性である腸の細胞とは異なりほとんど決して分裂しない）。
【図１１】ＥｄＵで標識された２つの細胞の高解像画像の２セットを示す。左側の画像（Ａ）および（Ｂ）は、全ての細胞性ＤＮＡを染色する色素であるＯｌｉＧｒｅｅｎで染色されたＥｄＵ標識細胞を示す。右側の画像（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色されたＥｄＵ標識細胞を示す。上の画像は静止期の細胞を示すが、下の画像は分裂後期の細胞を示す。
【図１２】図１２は、染色体を形成する２つのＤＮＡ分子のうちの１つのＤＮＡ分子のみを標識するのに従った手順を示しているスキームである。
【図１３】図１３は、実施例５に記載されるようにＡｌｅｘａ５６８−アジドで染色されたＥｄＵ標識細胞のＤＮＡの画像のセットである。画像の第一列は、最初の有糸分裂後のＤＮＡ、アジド染色および２つのオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）を示す。画像の第二列は、第二の有糸分裂後のＤＮＡ、アジド染色および２つのオーバーレイを示す。
【図１４】図１４は、ＥＵ（エチニル−ウリジン）の細胞ＲＮＡのための標識としての使用を実証する３つの画像のセットである。ＨｅＬａ細胞を、１０μＭのＥＵで一晩標識して、固定して、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色した。左側の画像は、ＥＵで標識されていない、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色された細胞を示す（陰性コントロール）。中央および右側の画像は、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色されたＥＵ標識細胞の画像である。
【図１５】図１５は、本発明による［３＋２］環化付加を用いるリボソーム提示を示すスキームである。
【図１６】図１６は、ＡｄＵで標識され、かつＡｌｅｘａ５６８−アルキンで染色されたＨｅＬａ細胞の視野の２つの画像のセットである（詳細については実施例７を参照のこと）。ＡｄＵは、（Ａ）標識された静止期細胞の核において、そして（Ｂ）有糸分裂細胞の凝縮した染色体において、明確に検出される。
【図１７】図１７は、細胞核から蛍光シグナルを効果的に除去するための本明細書に記載のストラテジーを図示する４つの画像のセットである。ＨｅＬａ細胞は、未染色のまま（第一列、左側）か；ＥｄＵで標識され、かつＡｌｅｘａ５６８−アジドで染色される（第一列、右側）か；ＥｄＵで標識され、かつＡｌｅｘａ５６８−アジドで染色され、かつ２０ｍＭのＤＴＴ（第二列、左側）か、または１００ｍＭのＤＴＴ（第二列、右側）で処理される（詳細は実施例８を参照のこと）。
【図１８】図１８は、（Ａ）当該分野で公知のとおりＢｒｄＵを用いるＤＮＡ標識、および（Ｂ）本発明の方法を用いるＤＮＡ標識であって、ＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログＡｄＵ（すなわち、アジド−ｄＵ）のＤＮＡへの組み込み、続いてアジド基と標識試薬のトリアリールホスフィンとの間のシュタウディンガー・ライゲーションを含むＤＮＡ標識、を示す２つのスキームを示している。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
（定義）
簡便の目的のために、本明細書全体にわたって用いられる種々の用語の定義を以下に示す。
【００７４】
「核酸ポリマー（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、これは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、そして他に言及しない限り、合成骨格を有する核酸様構造および増幅生成物を包含する。本発明の状況では、核酸ポリマーは、単離された分子であってもよいし、あるいは核酸ポリマーは、細胞の内側または生物体の中に位置してもよい。
【００７５】
「単離された、単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、核酸ポリマーに関して本明細書において用いられる場合、核酸ポリマーであってその起源または操作のおかげで、それが天然に会合しているか、またはそれが最初に得られるときに会合している成分のうちの少なくともいくつかから分離されている核酸ポリマーを意味する。「単離された、単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは代替的にまたはさらに、目的の核酸ポリマーが人の手によって生成されるかまたは合成されるということを、意味する。
【００７６】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチドアナログ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）」という用語は、天然のヌクレオチドと構造的に類似であり、そして天然に存在するヌクレオチドと同じ方式で機能し得る分子（例えば、天然に存在する塩基のうちの１つと塩基対合する同様の能力を示す）をいう。本明細書において用いる場合、「ヌクレオシドアナログ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）」という用語は、天然のヌクレオシドと構造的に類似であり、天然に存在するヌクレオシドと同様の方式で機能し得る分子（例えば、ＤＮＡ複製によってＤＮＡに組み込まれる同様の能力を示す）をいう。「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は、糖部分（ペントース）、リン酸塩および窒素性複素環塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位をいう。この塩基は、グリコシドの炭素（すなわち、五炭糖の１’炭素）を介して糖部分に連結され、そして塩基および糖のその組み合わせが「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」と呼ばれる。この塩基は、アデニン（すなわちＡ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）であるＤＮＡの４つの塩基、ならびにアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル（Ｕ）であるＲＮＡの４つの塩基でヌクレオチド（またはヌクレオシド）を特徴づける。本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチドアナログ（またはヌクレオシドアナログ）は、反応性不飽和基を含む。
【００７７】
本明細書において用いる場合、「反応性不飽和基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）」という用語は、２つ以上の原子価結合を共有している原子を含む官能基であって、そしてさらなる反応、詳細には環化付加を受け得る官能基をいう。反応性の不飽和基は代表的には、少なくとも１つの二重または三重結合を保有する。
【００７８】
「１，３−双極子（ｄｉｐｏｌｅ）」という用語は、本明細書において、当該分野で理解される意味を有し、そしてアリルアニオンと等電性であり、かつ４つの電子を１，３−双極子を含むπ系に有する分子または官能基をいう。１，３−双極子は一般に、特徴的な１，３−双極子を示す１つ以上の共鳴構造を有する。１，３−双極子の例としては、ニトリルオキシド、アジド、ジアゾメタン、ニトロンおよびニトリルイミンが挙げられる。
【００７９】
本明細書において用いる場合、「親双極子（ダイポーラロフィル）（ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ）」という用語は、当該分野で理解される意味を有し、そしてπ結合を含み、１，３−双極子に対する反応性を示す分子または官能基をいう。親双極子の反応性は、π結合に存在する置換基に、そしてこの反応に関与する１，３−双極子の性質にその両方に依存する。親双極子は代表的には、アルケンまたはアルキンである。
【００８０】
本明細書において用いる場合、「環化付加（ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）」という用語は、化学反応であって、ここでは２つ以上のπ電子系（例えば、不飽和分子または同じ分子の不飽和部分）が合わさって環状生成物を形成し、ここで結合多重度の正味の減少が存在する化学反応をいう。環化付加では、π電子を用いて新規なσ結合が形成される。環化付加の生成物は、「付加物（ａｄｄｕｃｔ）」または「環付加物（ｃｙｃｌｏａｄｄｕｃｔ）」と呼ばれる。異なるタイプの環化付加が当該分野で公知であって、これには、限定はしないが、［３＋２］環化付加およびＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ（ディールス−アルダー）反応が挙げられる。［３＋２］環化付加はまた、１，３−双極子性環化付加とも呼ばれ、１，３−双極子と親双極子との間で生じ、そして代表的には、５員の複素環の構築に用いられる。「［３＋２］環化付加（ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）」という用語はまた、Ｂｅｒｔｏｚｚｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００４，１２６：１５０４６〜１５０４７によって記載される、アジドとシクロオクチンとジフルオロシクロオクチンとの間の「銅なし（ｃｏｐｐｅｒｌｅｓｓ）」［３＋２］環化付加を包含する。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「シュタウディンガー・ライゲーション（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ）」という用語は、古典的なシュタウディンガー反応の改変であるＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ（Ｅ．ＳａｘｏｎおよびＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７：２００７〜２０１０）によって開発された化学反応をいう。この古典的なシュタウディンガー反応は、アジドとホスフィンまたは亜リン酸塩との組み合わせがアザ−イリド中間体を生じ、加水分解の際にホスフィン・オキシドおよびアミンを生じる化学反応である。シュタウディンガー反応は、アジドをアミンに還元する温和な方法であり；そしてトリフェニルホスフィンは一般には還元剤として用いられる。シュタウディンガー・ライゲーションでは、求電子性トラップ（通常はアルキルエステル）が適切にトリアリールホスフィンに置かれ（通常は、リン原子に対してオルトに）、そしてアジドと反応されて、アザ−イリド中間体が生じ、これが水性媒体中に再配置されて、アミド基およびホスフィン・オキシド官能基との化合物を生じる。シュタウディンガー・ライゲーションは、それが２つの出発分子を一緒に連結する（結合／共有結合する）のでそのように命名されるが、古典的なシュタウディンガー反応では、２つの生成物は加水分解の後に共有結合されない。「シュタウディンガー・ライゲーション」という用語はまた、Ｒａｉｎｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００６，１２８：８８２０〜８８２８に記載されるとおり、ジアリールホスフィオエステルまたはジアリールホスフィノチオエステルが用いられる、「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」シュタウディンガー・ライゲーション反応を包含する。
【００８２】
「標識された（ｌａｂｅｌｅｄ）」、「検出因子（検出可能剤）で標識された（ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ａｇｅｎｔ）」、および「検出可能部分で標識された（ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は本明細書において、交換可能に用いられる。核酸ポリマーに関して用いられる場合、これらの用語は、この核酸ポリマーが検出可能であるかまたは可視であるということを特定する。好ましくは、標識は、測定可能なシグナルであって、その強度が標識された核酸ポリマーの量（例えばサンプル中）に関係するシグナルを生成するように、選択される。本発明のアレイベースの検出方法では、この標識は望ましくは、それが局所シグナルを生成して、それによってアレイ上の各々のスポットからシグナルの空間的な分解が可能になるように選択され得る。標識は直接検出可能であってもよいし（すなわち、検出可能になるために、なんらさらなる反応も操作も必要とせず、例えば、発蛍光団が直接検出可能である）、または間接的に検出可能であってもよい（すなわち、検出可能である別の部分との反応または結合を通じて検出可能になる、例えば、ハプテンは、発蛍光団のようなレポーターを含む適切な抗体との反応後に免疫染色によって検出可能である）。本発明における使用に適切な標識は、任意の種々の手段によって検出可能であり得、これには限定はしないが、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段が挙げられる。適切な標識としては限定はしないが、種々のリガンド、放射性核種、蛍光色素、化学発光剤、微小粒子、酵素、比色標識、磁気標識およびハプテンが挙げられる。
【００８３】
「発蛍光団、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）」、「蛍光部分（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）」および「蛍光色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）」という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。それらは、分子であって、溶液中でおよび適切な波長の光での励起の際に、一般にはより長い波長で発光し返す分子をいう。広範な種々の構造および特徴の多くの蛍光色素が本発明の実施における使用に適切である。発蛍光団を選択するには、分子が光を吸収して高い効率で蛍光を発し（すなわち、蛍光分子は、それぞれ、励起波長で高モル消衰係数および高蛍光量子収量を有する）、そして光安定性である（すなわち、蛍光分子は、検出を行うのに必要な時間内の光励起の際に有意な分解を受けない）ことがしばしば所望される。
【００８４】
本明細書において用いる場合、「二重標識（する）（ｄｕａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」という用語は、標識プロセスであって、核酸ポリマーが、識別可能なシグナルを生じる２つの検出可能な因子で標識される標識プロセスをいう。このような標識プロセスから生じる核酸ポリマーとは、二重に標識されるといわれる。本明細書において用いる場合、「示差的標識（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ）」とは、標識プロセスであって、２つの核酸ポリマーが、識別可能なシグナルを生じる２つの検出可能因子で標識される標識プロセス（すなわち、第一の核酸ポリマーが、第一の検出可能因子で標識され、第二の核酸ポリマーが第二の検出可能因子で標識され、そしてこの第一の検出可能因子および第二の検出可能因子が識別可能なシグナルを生じる）をいう。この検出可能因子は、同じタイプのもの（例えば、励起の際に二重色蛍光を生じる２つの蛍光色素）であっても、または異なるタイプのもの（例えば、蛍光色素およびハプテン）であってもよい。
【００８５】
「細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」および「細胞性（の）増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において交換可能に用いられて、単一の細胞の娘細胞への分裂による細胞の集団の増殖、または単一の細胞の娘細胞への分裂をいう
本明細書において用いる場合、「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、細胞、組織または生物体における関連の応答を惹起する物質、化合物、分子、因子または組成物の量をいう。例えば、生物体に投与されるヌクレオシドの場合、有効量のヌクレオシドとは、生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれるヌクレオシドの量である。
【００８６】
本明細書において用いる場合、「生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、独立して作用するかもしくは機能する能力を有するかまたは発達させ得る、生きている系をいう。生物体は、単細胞であってもまたは多細胞であってもよい。生物体としては、ヒト、動物、植物、細菌、原生動物および真菌が挙げられる。
【００８７】
「細胞増殖の混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において用いる場合、ある因子が、その因子の非存在下で観察される細胞増殖に比較して、細胞増殖を誘導（すなわち、増大、増強そうでなければ悪化する）か、または阻害する（すなわち、減少させ、遅らせそうでなければ抑制させる）能力をいう。
【００８８】
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
上記で言及されるとおり、本発明は、インビトロおよびインビボの両方で、核酸ポリマーを標識するため、そして細胞増殖を測定するための方法および組成物を提供する。本発明の方法は一般に、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識を含む試薬との間の化学的反応を包含し、このヌクレオチドアナログは、第一の反応性基を含み、そしてこの試薬は第二の反応性基を含み、その結果この第一の反応性基と第二の反応性基との間の反応が核酸ポリマーの標識を生じる。ヌクレオチドアナログに対して標識を共有結合させる任意のタイプの反応を、本発明の実施において用いてもよい。好ましい反応は生体分子（例えば、天然の細胞成分）に対して化学的に不活性であり、生化学的に関連する状態（例えば、細胞培養条件）のもとで効率的に生じ得、そして天然に存在する生体分子にまれに見出される反性応基を包含する。
【００８９】
詳細には、本発明は、［３＋２］環化付加、または核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログと標識を含む試薬との間のシュタウディンガー・ライゲーションを包含する核酸ポリマーを標識する方法を提供する。
【００９０】
（Ｉ．［３＋２］環化付加を介する核酸ポリマーの標識）
本発明のいくつかの標識方法は一般には、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチド上の第一の反応性不飽和基と、標識に結合された第二の反応性不飽和基との間の［３＋２］環化付加を包含する。このような標識方法の例は図１に模式的に提示され、そして従来のＢｒｄＵ標識方法と比較される。
【００９１】
（１．ヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ）
本発明の方法の実施における使用に適切なヌクレオシドアナログ（またはヌクレオチドアナログ）としては、［３＋２］環化付加（ｃｙｃｌｏ−ａｄｄｉｔｉｏｎ）を受け得る反応性不飽和基を含む、本明細書に規定されるような、任意のヌクレオシドアナログ（またはヌクレオチドアナログ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、反応性不飽和基は、ヌクレオシド（またはヌクレオチド）の塩基によって担持される。反応性不飽和基を担っている塩基は、プリン（例えば、アデニンまたはグアニン）であっても、またはピリミジン（例えば、シトシン、ウラシルまたはチミン）であってもよい。特定の実施形態では、この塩基はウラシルであり；このようないくつかの実施形態では、ウラシルは、５位置に反応性不飽和基を担持する。この不飽和基は、この塩基に対して直接結合されても、または間接的に結合されてもよい。好ましくは、この不飽和基はこの塩基に直接共有結合される。
【００９２】
この反応性不飽和基は、１，３−双極子、例えば、ニトリルオキシド、アジド、ジアゾメタン、ニトロンまたはニトリルイミンであってもよい。特定の実施形態では、１，３−双極子はアジドである。あるいは、この反応性不飽和基は、親双極子、例えば、アルケン（例えば、ビニル、プロピルエニルなど）またはアルキン（例えば、エチニル、プロピニルなど）であってもよい。特定の実施形態では、この親双極子はアルキン、例えば、エチニル基などである。
【００９３】
ヌクレオシドアナログおよびヌクレオシド三リン酸塩アナログの調製のための方法は当該分野で公知である。例えば、ヌクレオシドおよびヌクレオシド三リン酸塩における５置換塩基の調製のための手順は、開発されておりかつ報告されている（例えば、Ａ．Ｓ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７４，１：１０５〜１０７；Ｒ．Ｃ．Ｂｌｅａｃｋｌｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７５，２：６８３〜６９０；Ｄ．Ｅ．ＢｅｒｇｓｔｒｏｍおよびＪ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９７６，９８：１５８７〜１５８９；Ｙ．Ｆ．Ｓｈｅａｌｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８３，２６：１５６〜１６１；Ｋ．Ｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９９，８：１７８８〜１７９８；Ｈ．Ａ．ＨｅｌｄおよびＳ．Ａ．Ｂｅｎｎｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００２，３０：３８５７〜３８６９を参照のこと）。
【００９４】
本発明の実施において用いられ得る例示的なヌクレオシドのアナログとしては、５−エチニル−２’デオキシウラシル（本明細書においてはエチニルウラシルまたはＥｄＵとも呼ばれる）および５−アジド−２’−デオキシウラシル（本明細書においては、アジドウラシルまたはＡｄＵとも呼ばれる）ならびにそれらの三リン酸塩およびホスホラミダイト型が挙げられる。本出願では、Ｃ−Ｓ．ＹｕおよびＦ．Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ，Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０００，１：８６〜８８に本質的に記載されるとおりＥｄＵを合成し；そしてアジド−ｄＵＭＰを合成するためにＰ．Ｓｕｎｔｈａｎｋａｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，２５８：１９５〜２０１に記載されるものと同様の方法を用いてＡｄＵを調製した。ＥｄＵはまた、Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｘｔｅｒ，ＭＩ）から市販されている。
【００９５】
（２．核酸ポリマー）
本発明の方法に従って生成されるか、または本発明の方法で利用される核酸ポリマーは、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーである。当業者によって理解されるとおり、核酸ポリマーは、少なくとも約８ヌクレオチドを含む短いオリゴヌクレオチドを含む任意の広範なサイズのポリヌクレオチドおよび全長ゲノムＤＮＡ分子であってもよい。
【００９６】
少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む核酸ポリマーは、合成および酵素方法を含む当該分野で周知の任意の種々の方法によって調製されてもよい（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（パートＩおよびＩＩ）」，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびに「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），第５版．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪ）。
【００９７】
例えば、本発明の核酸ポリマーは、ホスホラミダイトのアプローチに基づく、自動的な固相手順を用いて調製され得る。このような方法では、各々のヌクレオチド（ヌクレオチドアナログを含む）が、成長しているポリヌクレオチド鎖の５’末端に個々に付加され、これが固体支持体に対して３’末端に結合される。この付加されたヌクレオチドは、５’位置でジメトキシトリル（すなわちＤＭＴ）基によって重合化から保護される三価の３’ホスホラミダイトの形態である。塩基誘導性のホスホラミダイトカップリングの後、温和な酸化によって、五価のホスホトリエステル中間体が得られ、ＤＭＴ除去によって、ポリヌクレオチド伸長の新規な部位が得られる。次いで、この核酸ポリマーは、固体支持体から切断されて、ホスホジエステルおよび環外のアミノ基が水酸化アンモニウムで脱保護される。これらの合成は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入可能なオリゴシンセサイザーで行われてもよい。
【００９８】
本発明の核酸ポリマーはあるいは、例えば、インビトロの伸長および／または増幅方法を用いて調製され得る。標準的な核酸増幅方法としては以下が挙げられる：ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ（「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０；および「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５）；リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）すなわちＬＣＲ（Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４１：１０７７〜１０８０；およびＤ．Ｌ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８９：１１７〜１２２）；転写増幅（Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：１１７３〜１１７７）；自己維持性配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：１８７４〜１８４８）；Ｑ−βレプリカーゼ増幅（Ｊ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７，３５：１４７７〜１４９１）；自動化Ｑ−βレプリカーゼ増幅アッセイ（Ｊ．Ｌ．Ｂｕｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９６，１０：２５７−２７１）および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技術、例えば、核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）すなわちＮＡＳＢＡなど（Ａ．Ｅ．Ｇｒｅｉｊｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，９６：１３３−１４７）。
【００９９】
当業者によって理解されるとおり、本発明の核酸ポリマーは、事前合成改変方法（すなわち、核酸分子への核酸アナログの組み込み）、または合成後改変方法（すなわち、核酸分子における天然に存在するヌクレオチドからヌクレオチドアナログへの改変）によって、調製され得る。
【０１００】
あるいは、ヌクレオチドアナログは、下に記載されるように、ＤＮＡ複製によって細胞のＤＮＡもしくは生きている系へ組み込まれても、または反応によってＲＮＡへ組み込まれてもよい。
【０１０１】
本発明の核酸ポリマーの単離または精製は必要な場合、当該分野で周知の任意の種々の方法によって行われ得る。核酸ポリマーの精製は代表的には、天然のアクリルアミドゲル電気泳動によって、例えば、Ｊ．Ｄ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＦ．Ｅ．Ｒｅｇｎｉｅｒ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，１９８３，２５５：１３７−１４９）によって記載されるような陰イオン交換ＨＰＬＣ、または逆相ＨＰＬＣ（Ｇ．Ｄ．ＭｃＦａｒｌａｎｄおよびＰ．Ｎ．Ｂｏｒｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７９，７：１０６７〜１０８０）のいずれかによって、行われる。
【０１０２】
所望の場合、合成核酸ポリマーの配列は、限定はしないが、化学的変性（Ａ．Ｍ．ＭａｘａｍおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５：４９９〜５６０）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（Ｕ．Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１：３１９１〜３１９６）、アルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ消化後の質量分析法（Ｈ．ＷｕおよびＨ．Ａｂｏｌｅｎｅｅｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９０：３４７〜３５２）、などを含む任意の適切な配列決定方法を用いて改変され得る。
【０１０３】
（３．［３＋２］環化付加）
本明細書において提供される方法は一般には、［３＋２］環化付加を包含する。これらの方法では、［３＋２］環化付加は、核酸ポリマーへ組み込まれたヌクレオチドアナログ上の第一の反応性不飽和基と、標識を含む試薬（本明細書では染色試薬とも呼ばれる）上の第二の反応性不飽和基との間で生じる。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態では、染色試薬は、第二の反応性不飽和基が［３＋２］環化付加を介してヌクレオチドアナログ上の第一の反応性不飽和基と反応し得るように選択される。より詳細には、第一の不飽和基が１，３−双極子である場合、この第二の不飽和基は、１，３−双極子と反応し得る親双極子である。あるいは、この第一の不飽和基は、親双極子であり、この第二の不飽和基は、親双極子と反応し得る１，３−双極子である。
【０１０５】
［３＋２］環化付加反応条件の最適化は当該分野の技術の範囲内である。特定の好ましい実施形態では、この［３＋２］環化付加は水性条件下で行われる。
【０１０６】
１，３−双極子がアジドであり、かつ親双極子がアルキン（例えば、エチニル基）である実施形態では、［３＋２］環化付加は、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓおよび共同研究者によって記載されるように（Ｖ．Ｖ．Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００２，４１：１５９６〜１５９９；Ｗ．Ｇ．Ｌｅｗｉｓら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２００２，４１：１０５３〜１０５７；Ｑ．Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００３，１２５：３１９２〜３１９３）、生理学的な温度で、水性条件下で、そして環化付加を触媒する銅（Ｉ）（すなわちＣｕ（Ｉ））の存在下で行われてもよい。［３＋２］環化付加の触媒されたバージョンは、「クリック（ｃｌｉｃｋ）」化学と名付けられる。
【０１０７】
他の実施形態では、例えば、内因性のＣｕ（Ｉ）の存在が所望されない場合（例えば、Ｃｕ（Ｉ）が生きている系に毒性である場合）、アジドとアルキンとの間の［３＋２］環化付加は、Ｃｕ（Ｉ）の存在についてを除いて、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓおよび共同研究者によって記載されるとおり行われ得る。これらの状況では、環化付加で用いられる染色試薬は、反応性不飽和基および標識に加えて、Ｃｕキレート化部分を含む。本明細書において用いる場合、「Ｃｕキレート部分（Ｃｕ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、銅（Ｉ）イオンとの複合体（２つ以上の配位結合を含む）の形成に関与し得る２つ以上の極性基の存在によって特徴づけられる任意の物体をいう。Ｃｕキレート部分は、［３＋２］環化付加の近傍で生物系（例えば、細胞）に天然に存在する銅（Ｉ）イオンを動員し得る。特定のＣｕ（Ｉ）キレーターは当該分野で公知であり、そしてこれには限定はしないが、ネオクプロイン（ｎｅｏｃｕｐｒｏｉｎｅ）（Ｈ．Ｈ．Ａｌ−Ｓａ’ｄｏｎｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，１２１：１０４７〜１０５０；Ｊ．Ｇ．Ｄｅ Ｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９，３８１：１５１〜１５９；Ｃ．Ｇｏｃｍｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０００，４０６：２９３〜３００）およびバトクプロイン・ジスルホネート（ｂａｔｈｏｃｕｐｒｏｉｎｅ ｄｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）（Ｍ．Ｂａｇｎａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，２５３：２３５〜２４０）が挙げられる。
【０１０８】
（４．標識された核酸ポリマーの標識および検出）
本発明の方法は、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログ上の第一の反応性不飽和基と標識に結合された第二の反応性不飽和基との間の［３＋２］環化付加を包含する。この［３＋２］環化付加反応は、核酸ポリマーの標識を生じる。
【０１０９】
（Ａ．標識）
既に上述されているとおり、標識の役割は、標識後に、核酸ポリマー、例えば細胞中のＤＮＡの可視化または検出を可能にすることである。好ましくは、標識（または検出可能な因子または部分）は、測定可能なシグナルであって、その強度が、例えば分析されているサンプル中にある、標識された核酸ポリマーの量に関係する（例えば、比例的である）シグナルを生成するように選択される。本発明のアレイベースの検出方法（下を参照のこと）では、この検出可能因子は好ましくは、それが局所シグナルを生成して、それによってアレイ上の各々のスポットについてシグナルの空間的な分解を可能にするように選択される。
【０１１０】
標識と第二の反応性不飽和基を含む染色試薬との間の会合は好ましくは共有結合である。標識は染色試薬上の不飽和基に直接結合されてもよいし、またはリンカーを通じて間接的に結合されてもよい。
【０１１１】
化学的分子に対して検出可能な部分を結合させるための方法は、当該分野で周知である。特定の実施形態では、この標識および不飽和基はお互いに直接共有結合される。この直接の共有結合は、アミド結合、エステル結合、炭素間結合、ジスルフィド結合、カルバメート結合、エーテル結合、チオエーテル結合、尿素結合、アミン結合またはカーボネート結合を通じてであってもよい。共有結合は、不飽和基および検出可能部分の上に存在する官能基を利用することによって達成され得る。２つの化学物質を一緒に結合させるために用いられ得る適切な官能基としては、限定はしないが、アミン、無水物、ヒドロキシ基、カルボキシ基およびチオールが挙げられる。直接結合はまた、カルボジイミドのような活性化剤を用いて形成され得る。広範な活性化剤が当該分野で公知であり、そして標識および不飽和基を結合するために適切である。
【０１１２】
他の実施形態では、染色試薬の不飽和基および標識を、リンカー基を介してお互いに間接的に共有結合させる。これは、同種機能（ｈｏｍｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーおよび異種機能（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーを含む、当該分野で周知の多数の安定な二機能性の因子を用いることによって達成され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照のこと）。二機能性のリンカーの使用は、活性化因子の使用とは、前者が連結部分を生じこれが反応生成物に存在しているが、後者が反応に関与する２つの部分の間の直接カップリングを生じるという点で異なる。二機能性リンカーの役割は、２つのそうでなければ不活性な部分の間の反応を可能にすることであり得る。あるいは、またはさらに、二機能的なリンカーは、反応生成物の一部となり、この反応生成物に対してある程度の構造的な可塑性を、または他の有用なもしくは所望される特性を付与するように選択され得る。特定の実施形態では、このリンカーは切断可能である（例えば、化学的に切断可能または光化学的に切断可能）。標識とヌクレオチドアナログとの間の切断可能なリンカーの存在によって、核酸ポリマーの一時的な標識が可能になる。このようなシステムを考えれば、所望されればいつでも（例えば、核酸ポリマーの検出後）、この標識は、それが結合されているヌクレオチドアナログを切り落とされてもよい。切断可能なリンカーは当該分野で公知である。例えば、リンカーは、シスタミンリンカーであってもよく、そのジスルフィド結合は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて還元され得る（実施例８を参照のこと）。
【０１１３】
任意の広範な種々の標識／検出可能因子が本発明の実施で用いられ得る。適切な検出可能因子としては、限定はしないが、種々のリガンド、放射性核種（例えば、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉなど）；蛍光色素（特定の例示的蛍光色素については、以下を参照のこと）；化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；空間的に分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅およびプラチナ）またはナノクラスター；酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで用いられるもの、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；比色標識（例えば、色素、コロイド金など）；磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）；ならびにビオチン、ジオキシゲニン、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体に利用可能であるタンパク質が挙げられる。
【０１１４】
特定の実施形態では、この標識は蛍光部分を含む。広範な種々の化学的構造および物理的特徴の多数の公知の蛍光標識部分が本発明の実施において使用に適切である。適切な蛍光色素としては限定はしないが、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭ）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン・グリーン、ローダミン・レッド、テトラメチルローダミンすなわちＴＭＲ）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリンおよびアミノメチルクマリンまたはＡＭＣＡ）、オレゴン・グリーン色素（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅｓ）（例えば、オレゴン・グリーン４８８、オレゴン・グリーン５００、オレゴン・グリーン５１４）、テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、テキサス・レッド−Ｘ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ^ＴＭ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ、シアニン色素（例えば、Ｃｙ−３^ＴＭ、Ｃｙ−５^ＴＭ、Ｃｙ−３．５^ＴＭ、Ｃｙ−５．５^ＴＭ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ４０，ＩＲＤ ７００，ＩＲＤ ８００）などが挙げられる。適切な蛍光色素および他の化学物質へ蛍光色素をカップリングするための方法のさらなる例については、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」，第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲを参照のこと。
【０１１５】
本発明の実施に用いられるべき蛍光標識剤の有利な特性としては、高モル吸収係数、高蛍光量子収量、および光安定性が挙げられる。特定の実施形態では、標識発蛍光団は望ましくは、紫外範囲のスペクトル（すなわち４００ｎｍより下）ではなく可視の吸収および発光波長（すなわち、４００〜７５０ｎｍ）を示す。蛍光部分の他の所望の特性としては例えば、核酸ポリマーの標識が細胞または生物体（例えば、生きた動物）で行われるべき場合、細胞透過性および低い毒性を挙げてもよい。
【０１１６】
実施例に報告されるとおり、種々の蛍光染色試薬が、本出願によって用いられており、これには、細胞非透過性である、ＸＲｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドおよびＡｌｅｘａ５６８−アジド、ならびに細胞透過性であるテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）−アジドが挙げられる。
【０１１７】
本発明はまた、核酸ポリマーの二色標識を提供する（図２を参照のこと）。例えば、本発明によれば、２つ以上の異なる標識が単一の核酸ポリマーに組み込まれてもよい。ある実施形態では、このような組み込みは、２つの［３＋２］環化付加反応を介して達成される：第一の環化付加は、第一の核酸ポリマーに組み込まれるヌクレオチドアナログ上の第一の反応性不飽和基と、第一の標識に結合された第一の試薬上の第二の反応性不飽和基との間で生じ；第二の環化付加は、第二の核酸ポリマーに組み込まれるヌクレオチドアナログ上の第三の反応性不飽和基と、第二の標識に結合された第二の試薬上の第四の反応性不飽和基との間で生じる。この第一の核酸ポリマーおよび第二の核酸ポリマーは、同じ分子（例えば、細胞中のＤＮＡの二重標識）であってもよいし、または異なる／個々の分子（例えば、２つの異なる細胞、細胞集団または細胞サンプル由来のＤＮＡの示差的な標識）であってもよい。この第一のおよび第二の標識は好ましくは、それらが識別可能な検出可能なシグナルを生成するように選択される。
【０１１８】
特定の２つの標識の実施形態では、この第一のおよび第二の検出可能な因子または標識は蛍光色素である。２色の検出を可能にするために、この第一の蛍光標識および第二の蛍光標識は、望ましくは、用いられるべき検出システムと適合するマッチした対を構成し得る。蛍光標識色素のマッチした対は代表的には、空間的に識別可能なシグナルを生成する。例えば、いくつかの実施形態では、マッチした対における蛍光色素は、同じスペクトル範囲の光を有意に吸収しない（すなわち、それらは、異なる吸収最大波長を示す）、そして２つの異なる波長を用いて励起され得る（例えば、連続的に）。あるいは、蛍光色素はマッチした対で、異なるスペクトルの範囲で光を放射し得る（すなわち、それらは、励起の際に二色蛍光を生じる）。
【０１１９】
蛍光標識の対は当該分野で公知である（例えば、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９２−１９９４」，第５版，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。蛍光色素の例示的な対としては、限定はしないが、ローダミンおよびフルオレセイン（例えば、Ｊ．ＤｅＲｉｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．，１９９６，１４：４５８〜４６０を参照のこと）；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ^ＴＭおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬから市販されている）；およびＣｙ−３^ＴＭおよびＣｙ−５^Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬから市販されている）が挙げられる。
【０１２０】
特定の標識（または標識のセット）の選択は、行われる標識化の目的に依存し、そしていくつかの要因、例えば、標識方法の容易さおよび費用、望まれるサンプル標識の質、細胞または組織に対する検出可能部分の影響、検出システムの性質、検出可能部分によって生じるシグナルの性質および強度などによって、支配される。
【０１２１】
（Ｂ．標識された核酸ポリマーの検出）
当業者によって理解されるとおり、本明細書に開示される方法に従って標識される核酸ポリマーの検出は、任意の広範な種々の方法によって、および任意の広範な種々の技術を用いて行われ得る。標識の性質に基づく適切な検出方法および／または検出技術の選択（例えば、放射性核種、発蛍光団、化学発光因子、量子ドット、酵素、磁気標識、ハプテンなど）は当該分野の技術の範囲内である。
【０１２２】
例えば、蛍光標識された核酸ポリマーは、限定はしないが、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を含む蛍光検出技術を用いて検出され得る。特定の蛍光検出技術の選択は、標識実験の目的（例えば、染色体超構造の研究、細胞増殖決定または毒性アッセイ）、ならびに検出されるべき標識された核酸ポリマーの位置（すなわち、生きている細胞の内側または組織の内側など）を含む多くの要因によって支配される。
【０１２３】
フローサイトメトリーは、粒子の光学特徴に基づいて液体培地中の粒子（例えば、細胞）を分析する、鋭敏かつ定量的な技術である（Ｈ．Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏ，「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」，第３版、１９９５，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；ならびに「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」，Ｍｅｌａｍｅｄら、（編），１９９０，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。フローサイトメトリーは水力学的に、１つ以上の発蛍光団を含む粒子の液体懸濁物を細いストリームに収束させて、その結果その粒子が実質的に単一のファイルでストリームを流下して、検査または分析のゾーンを通過する。収束した光ビーム、例えば、レーザービームは、それらが検査ゾーンを通じて流れるにつれて粒子を照射し、そして光学検出器が光の特定の特徴を、それが粒子と相互作用する場合に測定する（例えば、１つ以上の波長での光散乱および粒子蛍光）。
【０１２４】
あるいは、またはさらに、細胞、組織または器官中の蛍光標識された核酸ポリマーは、種々の画像化技術を用いて蛍光顕微鏡によって可視化および検出され得る。従来の蛍光顕微鏡に加えて、蛍光標識された核酸ポリマーは、例えば、経時的蛍光顕微鏡検査法、共焦点蛍光顕微鏡、または二光子蛍光顕微鏡によって分析され得る。経時的顕微鏡技術（Ｄ．Ｊ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＶ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３００：８２〜８６）は、経時的に三次元で生じる複雑な細胞プロセスの完全な写真を提供し得る。これらの方法によって獲得される情報によって、細胞増殖、細胞の動きおよび細胞核分裂のような動的な現象をモニターして定量的に分析することが可能になる。共焦点顕微鏡（Ｌ．Ｈａｒｖａｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，１１５：１４９〜１５８；Ｚ．Ｆｏｌｄｅｓ−Ｐａｐｐら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００３，３：１７１５〜１７２９）は、制御可能な視野深度、画像の劣化する焦点外の情報の排除、および厚い標本（例えば、組織または動物）から連続的な光学的切片を収集する能力を含む、従来の光学顕微鏡を超えるいくつかの利点をもたらす。顕微鏡の焦点での発蛍光団による２つの光子の同時の吸収を含む、二光子蛍光顕微鏡（Ｐ．Ｔ．Ｓｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，２０００，２；３９９〜４２９）によって、光退色および光損傷が最小である、高度に局在的な容積での（例えば、細胞の核での）三次元画像化が可能になる。
【０１２５】
マイクロアレイに結合されるかまたはマルチウェルのプレートにおける細胞の内側に位置する蛍光標識された核酸ポリマーからのシグナルを、蛍光マルチ−ウェル・プレート・リーダー、蛍光標示式細胞分取器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒｓ）（ＦＡＣＳ）およびシグナルの空間的解像をもたらす自動化細胞ベース画像化システムを含む任意の種々の自動化および／または高出力の装置システムによって検出および定量してもよい。複数の蛍光標識の同時の検出および複合蛍光画像の作成のための方法は当該分野で周知であって、これには、「アレイ読み取り（ａｒｒａｙ
ｒｅａｄｉｎｇ）」または「スキャニング、走査（ｓｃａｎｎｉｎｇ）」システムの使用、例えば、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ）（すなわち、ＣＣＤ）（例えば、Ｙ．Ｈｉｒａｏｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：３６〜４１；Ｒ．Ｓ．Ａｉｋｅｎｓら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９，２９：２９１〜３１３；Ａ．Ｄｉｖａｎｅら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１９９４，１４：１０６１〜１０６９；Ｓ．Ｍ．Ｊａｌａｌら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．１９９８，７３：１３２〜１３７；Ｖ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１９９９，２１：１５〜１９を参照のこと；また。例えば、米国特許第５，５３９，５１７号；同第５，７９０，７２７号；同第５，８４６，７０８号；同第５，８８０，４７３号；同第５，９２２，６１７号；同第５，９４３，１２９号；同第６，０４９，３８０号；同第６，０５４，２７９号；同第６，０５５，３２５号；同第６，０６６，４５９号；同第６，１４０，０４４号；同第６，１４３，４９５号；同第６，１９１，４２５号；同第６，２５２，６６４号；同第６，２６１，７７６号；同第および同第６，２９４，３３１号も参照のこと）が挙げられる。種々の装置システムがこのような分析を自動化するために開発されており、これには、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ Ｌｔｄ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ３ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｑ３ＤＭ）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｅｖｏｔｅｃ ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発された自動蛍光画像化および自動顕微鏡システムが挙げられる。
【０１２６】
細胞または組織内の標識された核酸ポリマー由来の蛍光シグナルがまた、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）フォトコンバージョン（図３に示されるとおり）後に可視化され得る。フォトコンバージョン（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は、蛍光プローブ（例えば、細胞内）が電子密度プローブに変換されるプロセスであって、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルでの研究のために目的の領域または構造を標識する。不溶性の光および電子密度ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）反応性生物へ蛍光色素をフォトコンバーティング（ｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）する原理は、最初にＡ．Ｒ．Ｍａｒａｎｔｏ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１７：９５３〜９５５）によって実証された。ＤＡＢフォトコンバージョンは一般に、細胞または組織を発蛍光団を最大励起する周波数の光に曝露しながら、蛍光標識された細胞をＤＡＢ溶液中で蛍光標識された組織とともにインキュベートすることまたは浸すことによって達成される。
【０１２７】
ジアミノベンジジン染色はそのより大きい安定性およびより大きい密度に起因して、蛍光染色よりもいくつかの利点を有し得る。ジアミノベンジジン染色はまた、ＤＡＢ処理後に、四酸化オスミウムおよびフェロシアン化カリウムを使用することによって強化され得る（Ｈ．Ｃ．Ｍｕｔａｓａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，１９９５，７０：１９４〜２０１）。効率的なＤＡＢコンバージョンを受けることが報告されている発蛍光団の例としては、限定はしないが、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ファスト・ブルー（Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ）、ルシファー・イエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、ジアミジノ・イエロー（Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ Ｙｅｌｌｏｗ）、エバンス・ブルー（Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ）、アクリジン・オレンジ（ａｃｒｉｄｉｎｅ
ｏｒａｎｇｅ）、臭化エチジウム、５，７−ジヒドロキシトリプタミン、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドールカルボシアニンパーコレート、３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン（ＤｉＩ）、ローダミン−１２３およびヨウ化プロピジウムが挙げられる。
【０１２８】
ＤＡＢフォトコンバージョンの前に、細胞または組織中の蛍光標識された核酸ポリマーは、蛍光顕微鏡によって検出され、そして局在化され得る。ＤＡＢコンバージョン後、この核酸ポリマーは、透過電子顕微鏡によって可視化され得る。
【０１２９】
（Ｃ．シグナル対ノイズ比の改善）
別の局面では、本発明は、本明細書に開示される標識プロセスを用いて蛍光部分で標識された核酸ポリマーの検出におけるシグナル対ノイズ比を改善するためのシステムを提供する。
【０１３０】
［３＋２］環化付加標識反応によって消費されない染色試薬の任意の分子がバックグラウンド（すなわち、非特異的な）シグナルに寄与し得る。本発明は、このバックグラウンドシグナルを軽減または排除するためのストラテジーを提供し、このストラテジーは、クエンチャー部分を含む分子との反応による未反応の染色試薬上の標識の蛍光シグナルをクエンチする工程を包含する。例えば、ある実施形態では、この試薬とクエンチャー部分を含む分子との間の反応は［３＋２］環化付加である（図４に示されるとおり）。
【０１３１】
従って、本明細書に記載されるように調製される蛍光標識された核酸ポリマーの検出におけるシグナル対ノイズ比を改善する特定の本発明の方法は、第二の反応性不飽和基および蛍光標識（および必要に応じてＣｕキレート化部分）を含む未反応試薬と、クエンチング部分に結合された反応性不飽和基を含むクエンチング分子とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、染色試薬の反応性不飽和基とクエンチング分子との間で生じる工程と包含する。反応後、この蛍光標識とクエンチング部分との間の物理的な近接によって、蛍光標識からの蛍光シグナルの検出が妨げられる。
【０１３２】
クエンチング部分の例としては限定はしないが、ＤＡＢＣＹＬ（すなわち、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）−安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−７）、および４’５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−３３）（全て、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）、クエンチャー１（ｑｕｅｎｃｈｅｒ １）（Ｑ１；Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手可能）、または「ブラックホール・クエンチャー（Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ
ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡから入手可能）が挙げられる。
【０１３３】
（５．細胞中の核酸ポリマーの標識）
本発明はまた、細胞中で核酸ポリマーを標識するための方法を提供する。このような方法は以下を包含する：細胞と、第一の反応性不飽和基を含む有効な量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果ヌクレオシドアナログが細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が第一の反応性不飽和基と第二の反応性不飽和基との間で生じる工程。
【０１３４】
他に言及しない限り、これらの方法で用いられる染色試薬および［３＋２］環化付加の条件は、核酸ポリマーを標識する方法について上記されるものと同様である。既に上記されているとおり、本発明の標識方法は、生きている細胞において核酸ポリマーを染色する能力を含む現在利用される標識プロトコールを上回るいくつかの利点を示す。「生きている細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）」および「生細胞（ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ）」という用語は本明細書において交換可能に用いられ、そしてその特定のタイプの細胞についての標準的な基準、例えば、正常な膜電位の維持、エネルギー代謝または増殖能力に従って、生きているとみなされる細胞を指す。詳細には、本発明の方法は、細胞の固定および／または変性を必要としない。
【０１３５】
（Ａ．細胞）
いくつかの実施形態では、本発明は、培養物中の細胞における核酸ポリマーへの標識の組み込みに関する。特定の実施形態では、この細胞は標準的な組織培養プラスチック製品中で増殖される。このような細胞としては、正常細胞および誘導された形質転換細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物（ヒトまたは動物、例えば、げっ歯類またはサル）由来の細胞である。哺乳動物細胞は、任意の液体、器官または組織由来のもの（例えば、血液、脳、肝臓、肺、心臓、骨など）および任意の細胞タイプのもの（例えば、基底細胞、上皮細胞、血小板、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、腫瘍細胞など）であってもよい。
【０１３６】
本発明の方法における使用に適切な細胞は、初代細胞、二次細胞または不死化細胞（すなわち樹立された細胞株）であってもよい。それらは当該分野で周知の技術によって調製されていてもよく（例えば、細胞は、患者または健常なドナーから血液を採取することによって得ることができる）、または免疫学的なおよび微生物学的な市販の供給源から（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから）購入されてもよい。あるいは、またはさらに、細胞は、例えば、増殖因子またはレセプターを発現する遺伝子のような目的の遺伝子を含むように遺伝子操作されてもよい。
【０１３７】
本発明の方法で用いられるべき細胞は、標準的な培養技術に従って培養され得る。例えば、細胞はしばしば、加湿された９５％空気−５％ＣＯ_２の雰囲気を含むインキュベーター中で３７℃で滅菌環境において適切な容器中で増殖される。容器は、撹拌培養または静止培養物を含んでもよい。ウシ胎仔血清のような未規定の生物学的液体を含有する培地を含む、種々の細胞培養培地が用いられてもよい。細胞培養技術は当該分野で周知であり、そして確立されたプロトコールは多様な細胞タイプの培養に利用可能である（例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，第２版，１９８７，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【０１３８】
（Ｂ．ＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログの組み込み）
ＤＮＡ複製によるＤＮＡへのヌクレオシドアナログの組み込みは、当該分野で周知のプロセスである。一般には、ヌクレオシドアナログは、ヌクレオシド・トランスポーターによって細胞膜を横切って輸送されて、キナーゼによって細胞中でそれらの三リン酸エステル型にリン酸化される。次いでこのヌクレオシドアナログ三リン酸エステルは、細胞ＤＮＡポリメラーゼの基質として、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドと競合する。このようなプロセスは、標識目的のための^３Ｈ−チミジンおよび５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のＤＮＡへの組み込みのために、そしてガンの治療において（Ｄ．Ｋｕｆｅら、Ｂｌｏｏｄ，１９８４，６４：５４〜５８；Ｅ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ，１９９２，３４０：９５２〜９５６；Ｙ．Ｆ．ＨｕｉおよびＪ．Ｒｅｉｔｚ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．，１９９７，５４：１６２〜１７０；Ｈ．Ｉｗａｓａｋｉら、Ｂｌｏｏｄ，１９９７，９０：２７０〜２７８）そして、ヒト免疫不全ウイルス感染の処置において（Ｊ．Ｂａｌｚａｒｉｎｉ，Ｐｈａｒｍ．Ｗｏｒｌｄ
Ｓｃｉ．，１９９４，１６：１１３〜１２６）用いられる。
【０１３９】
ヌクレオシドアナログが細胞のＤＮＡに組み込まれるような、インビトロでの細胞と有効量のヌクレオシドアナログとの接触は、任意の適切なプロトコールを用いて行われ得る。特定の好ましい実施形態では、このヌクレオシドアナログは、指数関数的に増殖する細胞または細胞周期のＳ期（すなわち、合成期）にある細胞を用いてＤＮＡに組み込まれる。所望の場合、細胞は、標識（ラベリング）−パルス（ｌａｂｅｌｉｎｇ−ｐｕｌｓｅ）手順の前に血清枯渇によって早期Ｓ期で同調され得る。
【０１４０】
細胞と有効量のヌクレオシドアナログとを接触させる工程は、例えば、適切なインキュベーション条件下で（例えば、実施例１で記載されるような３７℃での培養培地中）細胞とヌクレオシドアナログとをインキュベートすることによって行われてもよい。特定の状況では、細胞の正常な細胞周期パターンを混乱し得る、細胞を混乱させることを何としても回避することが所望され得る（例えば、遠心分離工程または温度変化による）。このインキュベーション時間は、細胞周期の入力および進行の細胞集団の率に依存する。インキュベーション時間および条件の最適化は当業者の技術の範囲内である。
【０１４１】
（Ｃ．細胞における［３＋２］環化付加）
インビトロの細胞のＤＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込み後、この細胞と、第二の反応性不飽和基および標識を含む染色試薬とを接触させる工程を任意の適切な方法によって行ってもよい。ある実施形態では、この細胞を適切なインキュベーション培地（例えば、培養培地）中で染色試薬の存在下において、３７℃でかつこの試薬が細胞に浸透するのに十分な時間の間インキュベートして、細胞のＤＮＡに組み込まれる任意のヌクレオチドアナログと反応させる。染色試薬の濃度、環化付加反応時間および条件の最適化は当該分野の技術の範囲内である。
【０１４２】
既に上述されているとおり、外因性Ｃｕ（Ｉ）の存在が所望されない実施形態では、第二の反応性不飽和基、標識およびＣｕ（Ｉ）キレート部分を含む染色試薬を用いて、［３＋２］環化付加を行ってもよい。
【０１４３】
染色試薬が高い細胞透過性を示さない実施形態では、透過は、細胞の細胞質、または細胞内成分もしくは細胞の構造への染色試薬のアクセスを容易にするように行われてもよい。詳細には、透過化処理は、試薬が細胞に進入することを可能にし、このような透過処理の非存在下で細胞へ正常に浸透する濃度よりも大きい細胞内濃度に達することを可能にし得る。
【０１４４】
細胞の透過化処理は任意の適切な方法によって行われてもよい（例えば、ＣＡ．Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０００，２５：８８５〜８９４を参照のこと）。このような方法としては限定はしないが、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ラウリル硫酸、グリコデオキシコール酸、ｎ−ラウロイルサルコシン、サポニン、およびｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に対する、または有機アルコール（例えば、メタノールおよびエタノール）に対する曝露が挙げられる。他の透過化方法は、膜透過能を付与する特定のペプチドまたは毒素の使用を包含する（例えば、Ｏ．Ａｇｕｉｌｅｒａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９，４６２：２７３〜２７７；Ａ．Ｂｕｓｓｉｎｇら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９９，３７：１３３〜１３９）。適切な透過化剤の選択ならびにインキュベーションの条件および時間の最適化は、当業者によって容易に行われ得る。
【０１４５】
実施例２に記載のとおり、本出願人は、ＨｅＬａ細胞をＥｄＵの有無においてインキュベートして、この細胞を透過化して、それをＸｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色した。２つの細胞集団の蛍光画像は図５に示す。この図は、インビトロにおける本発明の標識方法の有効性を図示する。さらに、このような方法を用いる生きた細胞での標識ＤＮＡの検出は、数分内に完了することが見出された（図６および図７を参照のこと）。出願人らはまた、ＡｄＵの存在下でＨｅＬａ細胞をインキュベートして、Ａｌｅｘａ５６８−アルキンで染色している（実施例７を参照のこと）。このように処置した細胞集団の蛍光画像は図１６上に示される。
【０１４６】
（６．組織または器官における核酸ポリマーの標識）
本発明はまた、生物体（すなわち、生きている生物学的な系）において核酸ポリマーを標識するための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログをある生物体に投与して、その結果このヌクレオシドアナログがこの生物体の細胞におけるＤＮＡ中に組み込まれる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加がこの第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程。
【０１４７】
他に言及しない限り、これらの方法で用いられる染色試薬および［３＋２］環化付加条件は、細胞の核酸ポリマーを標識する方法について上記されたものと同様であって、そして当業者によって容易に決定／最適化され得る。
【０１４８】
（Ａ．生物体）
本発明の標識方法は、独立して作用するかまたは機能する能力を有するかまたは発達し得る任意の生物系を用いて行われてもよい。従って、本発明の標識方法は、単細胞系でまたは多細胞系で用いられてもよく、このような系としては、ヒト、動物、植物、細菌、原生動物および真菌が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、本発明の標識方法は、ヒトまたは別の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）で行われる。
【０１４９】
（Ｂ．生物系におけるＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログの組み込み）
生物体に対するヌクレオシドアナログの投与は、生物体の細胞のＤＮＡへのヌクレオシドアナログの組み込みを生じる任意の適切な方法を用いて達成され得る。
【０１５０】
例えば、ヌクレオシドアナログは、生理学的にかつ臨床的に受容可能な溶液を用いて、当該分野における従来の方法に従って処方され得る。適切な溶液は、選択される投与経路に依存する。投与の適切な経路としては例えば、経口、直腸、経粘膜、経皮的、または腸内投与；非経口送達であって筋肉内、皮下、髄内の注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内の注射を含む非経口送達を挙げることができる。あるいは、このヌクレオシドアナログ調製は、全身的な方式ではなく局所に、例えば、特定の組織への注射を介して、しばしばデポ処方物または徐放性処方物において投与されてもよい。
【０１５１】
（Ｃ．［３＋２］環化付加）
生物体の細胞のＤＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込み後、生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させる工程は、［３＋２］環化付加が生じることを可能にする任意の適切な方法によって行われ得る。
【０１５２】
特定の実施形態では、細胞は、（例えば、生物体から血液を採取することによって）収集されるか、生検によって得られた組織から単離されるか（例えば、針生検、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションまたは切開生検）、または生物体からもしくは生物体の一部から単離される（例えば、剖検で回収される）。次いで、細胞は、上記のような［３＋２］環化付加染色に供されてもよい。
【０１５３】
１実施形態では、生検によって得られた組織、または剖検で回収された器官もしくは器官の一部は、当該分野で公知のように染色のために調製されて（例えば、パラフィン中で固定または、包埋され、そして切片にされる）、そして［３＋２］環化付加試薬の存在下でインキュベートされてもよい（例えば、脱ろう後）。
【０１５４】
実施例４は、本発明の出願人によって行われる実験を記載しており、ここではマウスに、ＥｄＵを腹腔内に注射し、そしてその器官を注射の３日後に回収し、染色のために調製して、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドを用いて、およびＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ染色に特異的な蛍光色素）を用いて染色した。これらのマウスの腸の蛍光画像および脳の蛍光画像は、それぞれ図８および９、ならびに図１０に示される。
【０１５５】
（７．単離された標識された核酸ポリマー）
別の局面では、本発明は、例えば、本明細書に記載される方法の１つによって調製される、単離された検出可能な核酸ポリマーを提供する。より詳細には、本発明は、［３＋２］環化付加反応後に検出可能である核酸ポリマー、および［３＋２］環化付加を介して組み込まれている少なくとも１つの検出可能部分を含む単離された核酸ポリマーを提供する。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、反応性不飽和基を含む少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。好ましくは、この反応性不飽和基は、標識に結合された異なる反応性不飽和基を含む試薬の存在下で［３＋２］環化付加を受け得る。
【０１５７】
他の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、標識に結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。例えば、ヌクレオチドアナログは、［３＋２］環化付加から生じる環付加物を含んでもよい。
【０１５８】
さらに他の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、第一の不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログおよび第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む。この第一の反応性不飽和基は一般に、第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬の存在下で［３＋２］環化付加を受け得、そしてこの第二の反応性不飽和基は一般に、第二の標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬の存在下で［３＋２］環化付加を受け得る。
【０１５９】
さらに他の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、第一の標識に結合された少なくとも１つの第一のヌクレオチドアナログ、および第二の標識に結合された少なくとも１つの第二のヌクレオチドアナログを含む。好ましくは、この第一のヌクレオチドアナログは、第一の［３＋２］環化付加から生じる環化付加物を含み、そしてこの第二のヌクレオチドアナログは、第二の［３＋２］環化付加から生じる環付加物を含む。
【０１６０】
本発明の検出可能な核酸ポリマーは、合成方法および酵素的な方法（例えば、総ＲＮＡの逆転写による）を含む、本明細書に記載されるような、任意の適切な方法によって調製され得る。
【０１６１】
当業者によって理解されるとおり、本発明の単離された検出可能な核酸ポリマーは、広範な種々の適用で用いられ得る。
【０１６２】
例えば、それらは、マイクロアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイを含む、ハイブリダイゼーションアッセイで検出プローブとして用いられ得る。このような適用では、検出可能な核酸ポリマーは好ましくはオリゴヌクレオチド（すなわち、核酸配列の短いストレッチ）である。ハイブリダイゼーションアッセイで用いられるオリゴヌクレオチドは一般に、約５〜約１５０ヌクレオチド、例えば、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約１５〜約５０ヌクレオチドを含む。本発明によって提供されるこの検出可能な核酸ポリマーは、ハイブリダイゼーションアッセイ中のアレイまたはマイクロアレイに接触するように用いられ得る。このような実施形態では、この検出可能な核酸プローブは、適切な染色試薬とともに提供され得る。あるいは、検出可能な核酸ポリマーは、ハイブリダイゼーションアッセイのためにアレイまたはマイクロアレイに対して結合される。
【０１６３】
本発明によるアレイは、基板表面上の分散したスポットに固定された複数の検出可能な核酸ポリマーを含む。基板表面は、基板表面に対して検出可能な核酸ポリマーの直接的または間接的な結合（すなわち、固定）を可能にする、任意の剛直な、半剛体のまたは可塑性の物質を形成し得る。適切な物質としては、限定はしないが、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ガラス、クオーツ以外の結晶基板、例えば、シリコーン、および種々のプラスチックおよびプラスチックコポリマーが挙げられる。蛍光が検出されるべき場合、シクロオレフィンポリマーを含むアレイが好ましくは用いられ得る。
【０１６４】
物質上の反応性の官能化学基の存在は、基板表面に対して検出可能な核酸ポリマーを直接または間接的に結合するように開発され得る。アレイを形成するために基板表面へオリゴヌクレオチドを固定する方法は当該分野で周知である。
【０１６５】
（８．検出可能な核酸ポリマーを含む細胞）
別の局面では、本発明は、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって調製される、検出可能な核酸ポリマーを含む細胞を提供する。より詳細には、本発明は、［３＋２］環化付加反応後に検出可能である核酸ポリマーを含む細胞、ならびに［３＋２］環化付加を介して組み込まれている少なくとも１つの検出可能部分を含む核酸ポリマーを含む細胞を提供する。当業者によって理解されるとおり、本発明の細胞は、本明細書に記載される任意の検出可能な核酸ポリマーを含んでもよい。
【０１６６】
（ＩＩ．シュタウディンガー・ライゲーションを介する核酸ポリマーの標識）
本発明のいくつかの標識方法は一般に、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチド上のアジド基と標識に結合された置換トリアリールホスフィンとの間のシュタウディンガー・ライゲーションを包含する。このような標識方法の例は図１８に概要的に示されており、かつ従来のＢｒｄＵ標識方法と比較される。
【０１６７】
（１．ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ）
これらの方法の実施における使用に適切なヌクレオシドアナログ（またはヌクレオチドアナログ）としては、アジド基を含む、本明細書に規定されるような任意のヌクレオシドアナログ（またはヌクレオチドアナログ）が挙げられる。ある実施形態では、このアジド基は、ヌクレオシド（またはヌクレオチド）の塩基によって担持される。アジド基を担持する塩基は、プリン（例えば、アデニンまたはグアニン）であっても、またはピリミジン（例えば、シトシン、ウラシルまたはチミン）であってもよい。特定の実施形態では、この塩基はウラシルである；このようないくつかの実施形態では、ウラシルは、５位置にアジド基を担持し得る。アジド基はこの塩基に直接または間接的に共有結合されてもよい。好ましくは、アジド基はこの塩基に直接共有結合される。
【０１６８】
本発明の実施において用いられ得る例示的なヌクレオシドアナログとしては、５−アジド−２’−デオキシウラシル（本明細書においてはまたアジドウラシルとも呼ばれる）、ならびにその三リン酸塩およびホスホラミダイト型が挙げられる。本出願人は、アジド−ｄＵＭＰを合成するためのＰ．Ｓｕｎｔｈａｎｋａｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，２５８：１９５〜２０１に記載の方法と類似の方法を用いて５−アジド−２’−デオキシウリジン（ＡｄＵ）を調製した。
【０１６９】
これらの方法によって生成され、かつこれらの方法で利用される核酸ポリマーは、上記のように調製、精製および／または配列決定され得る、任意の広範なサイズの一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーであってもよい。
【０１７０】
（２．シュタウディンガー・ライゲーション）
既に上述されているとおり、本明細書に提供される方法のいくつかは一般には、シュタウディンガー・ライゲーション反応を包含する。これらの方法では、シュタウディンガー・ライゲーションは、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログ上のアジド基と、標識に結合された置換されたトリアリールホスフィンを含む染色試薬との間で生じる。
【０１７１】
シュタウディンガーについての反応条件の最適化は、当該分野の技術の範囲内である。特定の好ましい実施形態では、このシュタウディンガー・ライゲーションは、水性条件下で行われる。反応条件の例は、例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７：２００７〜２０１０；Ｅ．Ｓａｘｏｎら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２：２１４１〜２１４３；Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９：１９〜２４；Ｇ．Ａ．Ｌｅｍｉｅｕｘら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，，２００３，１２５：４７０８〜４７０９；Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｓｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３０：８７３〜８７７に記載されている。
【０１７２】
（３．標識された核酸ポリマーの標識および検出）
本発明の方法のいくつかでは、このシュタウディンガー・ライゲーション反応は、核酸ポリマーの標識を生じる。
【０１７３】
（Ａ．染色試薬）
これらの方法では、標識は、置換されたトリアリールホスフィンに結合される。特定の好ましい実施形態では、トリアリールホスフィンのアリール基の１つは、求電子性トラップ（例えば、アルキルエステル基）で置換される。好ましくは、この求電子トラップは、リン原子に対してオルトに位置する。標識と置換トリアリールホスフィンとの間の結合は好ましくは共有結合である。標識は置換トリアリールホスフィンに対して直接結合されても、またはリンカーを通じて間接的に結合されてもよい。
【０１７４】
化学分子に対して検出可能な部分を結合するための方法は当該分野で周知である。特定の実施形態では、この標識および置換トリアリールホスフィンは、お互いに直接共有結合される。直接の共有結合は、アミド結合、エステル結合、炭素間結合、ジスルフィド結合、カルバメート結合、エーテル結合、チオエーテル結合、尿素結合、アミン結合またはカルボネート結合を通じてであってもよい。この共有結合は、置換トリアリールホスフィンおよび検出可能部分に存在する官能基を利用することによって達成され得る。２つの化学部分を一緒に結合するために用いられ得る適切な官能基としては、限定はしないが、アミン、無水物、ヒドロキシ基、カルボキシ基およびチオールが挙げられる。直接結合はまた、活性化剤、例えば、カルボジイミドを用いて形成されてもよい。広範な活性化剤が当該分野で公知であり、そして標識および置換トリアリールホスフィンを連結するために適切である。
【０１７５】
他の実施形態では、この標識および置換されたトリアリールホスフィンはリンカー基を介してお互いに対して間接的に共有結合される。これは、上記のように、同種官能性および異種官能性のリンカーを含む（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照のこと）、当該分野で周知の多数の安定な二官能性物質を用いることによって達成され得る。上記のとおり、リンカーを切断して、核酸ポリマーの一時的な標識を可能にしてもよい。
【０１７６】
本発明のシュタウディンガー・ライゲーションベースの方法の実施で用いられ得る検出可能な因子は、上記の［３＋２］環化付加方法の実施で用いられ得る因子と同じである。
【０１７７】
本発明はまた、核酸ポリマーの２色（またはそれ以上）の色の標識を提供する。例えば、本発明によれば、２つの異なる標識が２つの異なる核酸ポリマーに組み込まれてもよい。ある実施形態では、このような組み込みは、２つのシュタウディンガー・ライゲーションを介して達成される：第一のシュタウディンガー・ライゲーションは、第一の核酸ポリマーに組み込まれた第一のヌクレオチドアナログ上の第一のアジド基と、第一の置換トリアリールホスフィンに結合された第一の標識を含む第一の染色試薬との間で生じ；そして第二のシュタウディンガー・ライゲーションは、第二の核酸ポリマーに組み込まれた第二のヌクレオチドアナログ上の第二のアジド基と、第二の置換トリアリールホスフィンに結合された第二の標識を含む第二の染色試薬との間で生じる。例えば、この第一の核酸ポリマーおよび第二の核酸ポリマーは、２つの異なる細胞、細胞集団、細胞サンプルまたは組織由来であってもよい。この第一の標識および第二の標識は好ましくは、それらが識別可能な検出可能シグナルを生じるように選択される。適切な蛍光の第一の標識および第二の標識の例は上記されている。
【０１７８】
（Ｂ．標識された核酸ポリマーの検出）
シュタウディンガー・ライゲーションを介して標識された核酸ポリマーの検出は、［３＋２］環化付加を介して標識された核酸ポリマーの検出について上記されたのと同じ方法で、かつ同じ技術を用いて行われてもよい。
【０１７９】
（Ｃ．シグナル対ノイズ比の改善）
別の局面では、本発明は、本明細書に開示される標識プロセスを用いて蛍光部分で標識された核酸ポリマーの検出においてシグナル対ノイズ比を改善するためのシステムを提供する。シュタウディンガー・ライゲーション標識反応によって消費されていない任意の分子の染色試薬が、バックグラウンド（すなわち、非特異的な）シグナルに寄与し得る。本発明は、クエンチング部分を含む分子との反応により試薬上の標識の蛍光シグナルをクエンチすることによってこのバックグラクンドシグナルを軽減または排除するためのストラテジーを提供する。例えば、ある実施形態では、未消費の試薬とクエンチャー部分を含む分子との間の反応は、シュタウディンガー・ライゲーションである（例えば、クエンチャー部分は、未反応の染色試薬のトリアリールホスフィンと反応するアジド基に結合される）。
【０１８０】
従って、本明細書に記載のように調製された蛍光標識された核酸ポリマーの検出におけるシグナル対ノイズ比を改善するための特定の本発明の方法は、置換されたトリアリールホスフィンに結合された蛍光標識を含む未反応試薬と、アジド基に結合されたクエンチング部分を含む分子とを接触させる工程であって、その結果このアジド基と置換されたトリアリールホスフィンとの間でシュタウディンガー・ライゲーションが生じる工程を包含する。反応後、蛍光標識とクエンチング部分との間の物理的な近接が、蛍光標識からの蛍光シグナルの検出を妨げる。クエンチング部分の例は上記されている。
【０１８１】
（４．細胞における核酸ポリマーの標識）
本発明はまた、シュタウディンガー・ライゲーションを用いて細胞中で核酸ポリマーを標識するための方法を提供する。このような方法は以下を包含する：細胞と、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、結果としてこのヌクレオシドアナログが細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この細胞と、置換されたトリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させて、結果としてシュタウディンガー・ライゲーションがアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程。
【０１８２】
他に言及しない限り、これらの方法で用いるのに適切な染色試薬およびシュタウディンガー・ライゲーション条件は、核酸ポリマーを標識する方法について上記された条件と類似である。同様に、細胞、細胞増殖条件および本発明の方法に適切であるＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログの組み込みのための条件は、［３＋２］環化付加に基づく方法について上記された条件と同一である。
【０１８３】
インビトロ細胞のＤＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込み後、この細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させる工程は、任意の適切な方法によって行われ得る。ある実施形態では、この細胞は、適切なインキュベーション培地（例えば、培養培地）中で染色試薬の存在下で３７℃で、かつ細胞へのこの試薬が浸透して、この細胞のＤＮＡ中に組み込まれた任意のヌクレオチドアナログと反応するのに十分な時間インキュベートされる。染色試薬の濃度、シュタウディンガー・ライゲーション反応時間および条件の最適化は、当該分野の技術の範囲内である。
【０１８４】
（５．組織または器官における核酸ポリマーの標識）
本発明はまた、シュタウディンガー・ライゲーション反応を用いて生物体（すなわち、生きている生物学的な系）において核酸ポリマーを標識するための方法を提供する。このような方法は以下を包含する：ある生物体に対して、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、結果としてこのヌクレオシドアナログがこの生物体の細胞におけるＤＮＡに組み込まれる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞を、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させ、結果としてシュタウディンガー・ライゲーションがこのアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程。
【０１８５】
他に言及しない限り、これらの方法で用いられる染色試薬およびシュタウディンガー・ライゲーション条件は、細胞における核酸ポリマーを標識する方法について上記されるものと同様である。同様に、本発明の方法に適切である生物系におけるＤＮＡ複製によるヌクレオシドアナログの組み込みのための生物体および条件は、［３＋２］環化付加ベースの方法について上記されるものと同一である。
【０１８６】
生物体の細胞のＤＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込み後、生物体の少なくとも１つの細胞と、置換されたトリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色剤とを接触させる工程は、シュタウディンガー・ライゲーションが生じることを可能にする任意の適切な方法によって行われ得る。
【０１８７】
（６．単離された標識核酸ポリマー）
別の局面では、本発明は、例えば、本明細書に記載の方法の１つによって調製された、単離された検出可能な核酸ポリマーを提供する。より詳細には、本発明は、シュタウディンガー・ライゲーション反応後に検出可能である核酸ポリマー、およびシュタウディンガー・ライゲーションを介して組み込まれている少なくとも１つの検出可能な部分を含む単離された核酸ポリマーを提供する。
【０１８８】
特定の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本発明の核酸ポリマーは、標識に結合された少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。好ましくはこの標識は、シュタウディンガー・ライゲーションを通じて結合されており、そしてアミド基およびホスフィン・オキシド官能基を含む。
【０１８９】
本発明の検出可能な核酸ポリマーは、合成方法および酵素的な方法（例えば、総ＲＮＡの逆転写による）を含む、本明細書に記載されるような任意の適切な方法によって調製され得る。このような標識された核酸ポリマーは、上記されるような広範な種々の適用で用いられ得る。
【０１９０】
（７．検出可能な核酸ポリマーを含む細胞）
別の局面では、本発明は、例えば、本明細書に記載される方法の１つ以上によって調製される、検出可能な核酸ポリマーを含む細胞を提供する。より詳細には、本発明は、シュタウディンガー・ライゲーション後に検出可能である核酸ポリマーを含む細胞、およびシュタウディンガー・ライゲーションを介して組み込まれている少なくとも１つの検出可能部分を含む核酸ポリマーを含む細胞を提供する。
【０１９１】
（ＩＩＩ．ＤＮＡ複製／細胞増殖の決定）
別の局面では、本発明は、細胞または生物体において細胞増殖および／または細胞増殖速度を測定するための方法を提供する。
【０１９２】
このような方法は、以下の工程を包含し得る：細胞と、第一の反応性不飽和基を含むヌクレオシドアナログの有効な量とを接触させて、結果としてこのヌクレオシドアナログが細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、結果として［３＋２］環化付加が、第一の反応性不飽和基と第二の反応性不飽和基との間で生じる工程と；このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程。特定の実施形態では、標識の量によって、細胞増殖の程度についての情報が得られる。他の実施形態では、標識の量によって、細胞増殖の速度についての情報が得られる。
【０１９３】
他の方法は、以下の工程を包含し得る：細胞と、アジドを含むヌクレオシドアナログの有効量とを接触させ、結果としてこのヌクレオシドアナログが細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させ、結果としてシュタウディンガー・ライゲーションがこのアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、細胞増殖を測定する工程。ある実施形態では、標識の量によって、細胞における細胞増殖の程度についての情報が得られる。ある実施形態では、標識の量によって細胞増殖の速度についての情報が得られる。
【０１９４】
さらに他の方法は、以下の工程を包含する：生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含むヌクレオシドアナログの有効量を投与して、結果としてこのヌクレオシドアナログがこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させ、結果として［３＋２］環化付加が第一の反応性不飽和基と第二の反応性不飽和基との間で生じる工程と；ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、この生物体における細胞増殖を測定する工程。特定の実施形態では、標識の量によって、生物体における細胞増殖の程度についての情報が得られる。他の実施形態では、標識の量によって、生物体における細胞増殖の速度についての情報が得られる。
【０１９５】
さらに他の方法は、以下の工程を包含する：生物体に対して、アジドを含むヌクレオシドアナログの有効量を投与して、結果としてこのヌクレオシドアナログがこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込まれる工程と；この生物体の少なくとも１つの細胞と、置換されたトリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させ、結果としてシュタウディンガー・ライゲーションがこのアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定して、生物体における細胞増殖を測定する工程。特定の実施形態では、標識の量によって、生物体における細胞増殖の程度についての情報が得られる。他の実施形態では、標識の量によって生物体における細胞増殖の速度についての情報が得られる。
【０１９６】
これらの方法は、細胞および生物体において核酸ポリマーを標識する方法について、本明細書に記載されるような技術および手順を用いて行われ得る。このような方法では、接触工程および／または投与工程を行う方式、染色試薬のタイプ、標識のタイプおよびこのような標識の検出のための技術は、細胞または生物体において核酸ポリマーを標識する工程に関する、本発明の他の方法について記載されたものと同様である。
【０１９７】
本発明に従って、細胞増殖または細胞増殖速度を測定するための方法は、広範な種々の適用で用いられ得、この適用としては、限定はしないが、細胞株の特徴づけ、細胞培養条件の最適化、細胞増殖の正常な特徴づけ、疾患および損傷した組織、ならびに細胞増殖が関与する種々の疾患および障害の診断が挙げられる。
【０１９８】
多数の疾患および障害は、変更された細胞増殖速度によって特徴付けられることが公知であり、従って、本発明の方法によって言及され得る。このような疾患および障害としては限定はしないが、任意のタイプの悪性腫瘍（例えば、乳房、肺、結腸、皮膚、リンパ腫、白血病など）；前ガン状態（例えば、腺腫、ポリープ、前立腺肥大、潰瘍性大腸炎など）；免疫障害、例えば、ＡＩＤＳ、自己免疫障害および原発性免疫不全；血液学的状態、例えば、白血球欠乏（例えば、顆粒球減少症）、任意のタイプの貧血、骨髄増殖症候群、リンパ増殖症候群など；器官不全、例えば、アルコール性肝炎およびウイルス性肝炎、糖尿病性腎症、筋栄養状態、早発性腺機能不全など；骨および筋に影響する状態、例えば、骨粗鬆症；内分泌状態、例えば、糖尿病、甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、多嚢胞性卵巣など；感染性疾患、例えば、結核、細菌感染、膿瘍および他の局在する組織感染、ウイルス感染など；ならびに血管障害、例えば、アテローム発生、心筋症などが挙げられる。
【０１９９】
（ＩＶ．使用の方法）
本明細書に開示されるような、核酸ポリマーを標識するため、および細胞増殖または細胞増殖速度を測定するための方法は、下にいくつか記載される広範な種々の適用で用いられ得る。
【０２００】
（１．スクリーニングアッセイ）
別の局面では、本発明は、細胞増殖を混乱させる因子の特定のための方法を提供する。これらの方法は、因子が細胞増殖を誘導（すなわち、増大、増強そうでなければ増悪）するか、または阻害（すなわち、減少、遅らせるかそうでなければ抑制）する能力についてスクリーニングするために用いられ得る。
【０２０１】
例えば、このような方法は、以下の工程：（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程；（ｂ）この細胞と、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログをこの細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；（ｄ）このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が、細胞増殖の程度または速度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、細胞が試験因子に接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子を細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含し得る。
【０２０２】
他の方法は以下の工程：（ａ）細胞と試験因子とを接触させる工程と；（ｂ）この細胞と、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログとを接触させて、その結果このヌクレオシドアナログをこの細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションがアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；（ｄ）ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度または速度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、細胞が試験因子と接触されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子を細胞増殖を混乱させる因子として特定する工程と；を包含し得る。
【０２０３】
これらの方法の特定の実施形態では、細胞は、その細胞がヌクレオシドアナログと接触させられた後に、試験因子と接触させられる（すなわち、工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われる）。
【０２０４】
細胞を接触させる工程を行う方式；染色試薬；標識タイプ；および標識された核酸ポリマーを検出する方法は、細胞増殖および細胞増殖速度を細胞中でインビトロにおいて測定することに関する本発明の他の方法について記載されるものと同様である。
【０２０５】
当業者によって理解されるとおり、本発明のスクリーニング方法はまた、細胞集団を調節する化合物または因子（すなわち、過剰増殖性の細胞の増殖を低減、減速もしくは抑制し得るか、または過少増殖性の細胞の増殖を増大、増強もしくは増幅し得る化合物もしくは因子）を特定するために用いられ得る。
【０２０６】
（Ａ．スクリーニングアッセイのための細胞）
本発明のスクリーニングアッセイは、標準的な組織培養プラスチック製品中で増殖され得る、任意の正常なまたは形質転換細胞を用いて行われてもよい。細胞は、初代細胞、二次細胞または固定された細胞であってもよい。好ましくは、本発明のスクリーニング方法で用いられるべき細胞は、哺乳動物（ヒトまたは動物）由来の細胞である。細胞は、上記のように、任意の器官または組織由来、そして任意の細胞タイプの細胞であってもよい。
【０２０７】
本発明によるスクリーニングアッセイを行うための特定の細胞タイプおよび／または細胞株の選択は、試験されるべき因子の性質、およびアッセイの意図される目的のようないくつかの要因によって管理される。例えば、一次薬物スクリーニング（すなわち、初回のスクリーニング）のために開発された毒性アッセイは好ましくは、市販されており、かつ増殖することが通常比較的容易である樹立された細胞株を用いておこなわれてもよいが、薬物開発プロセスで後に用いられるべき毒性アッセイは好ましくは、不死化細胞よりも入手、維持および／または増殖がしばしば困難であるが、インビトロの状況ではより優れた実験モデルを示す、初代または二次細胞を用いて行われてもよい。
【０２０８】
特定の実施形態では、このスクリーニング方法は、マルチウェル・アッセイ・プレートの複数のウェルに含まれる細胞を用いて行われる。このようなアッセイプレートは例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＣｏｒｎｉｎｇ
Ｉｎｃ．（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）から市販されており、そしてこれには、例えば、４８−ウェル、９６−ウェル、３８４−ウェルおよび１５３６−ウェルのプレートが挙げられる。
【０２０９】
（Ｂ．試験因子）
当業者によって理解されるとおり、任意の種類の化合物または因子が、本発明の方法を用いて試験され得る。試験化合物は、合成化合物であっても天然化合物であってもよい；これは、単一の分子であっても、異なる分子の混合物であっても、または異なる分子の複合体であってもよい。特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の化合物を試験するために用いられる。他の実施形態では、本発明の方法は、化合物のコレクションまたはライブラリーをスクリーニングするために用いられる。
【０２１０】
細胞増殖を混乱（すなわち、誘導または阻害する）かまたは調節する可能性または能力について試験され得る化合物は、任意の種々のクラスの分子に属してもよく、これには限定はしないが、低分子、ペプチド、糖類、ステロイド、抗体（そのフラグメントまたは改変体を含む）、融合タンパク質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ペプチド模倣物などが挙げられる。
【０２１１】
本発明の方法に従って試験されるべき化合物または因子は、細胞増殖を混乱または調節することが公知であるかまたは疑われ得る。あるいは、このアッセイは、細胞増殖に対する影響が未知である化合物または因子を用いて行われてもよい。
【０２１２】
細胞増殖に影響し得る、そして本発明の方法によって試験され得る化合物の例としては、限定はしないが、発癌性物質；毒性因子；化合物、例えば、溶媒；突然変異誘発物質；薬物；煙（タバコ、葉巻および産業プロセスからの煙を含む）のなかの微粒子、ガスおよび有害化合物；食品添加物；生化学的物質；ホルモン；殺虫剤；地下水の毒素；および環境汚染物質が挙げられる。細胞増殖に影響し得る、そして本発明の方法によって試験され得る因子の例としては、限定はしないが、マイクロ波放射、電磁放射、放射線照射、電離放射線、熱、および、産業環境または職業環境によって生じるかまたはそこに存在する他の危険な状態が挙げられる。
【０２１３】
（Ｃ．細胞増殖を誘導または阻害する因子の特定）
本発明のスクリーニング方法に従って、試験因子が細胞増殖を混乱または調節する能力の決定は、試験因子と接触されている細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量と、試験因子と接触されていない細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量との比較を包含する。
【０２１４】
試験因子は、試験因子と接触させられている細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量が、コントロール細胞で測定される標識の量よりも小さいかまたは大きい場合に、細胞増殖を混乱させる因子として特定される。より詳細には、試験因子と接触させられている細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量が、コントロール細胞で測定される標識の量よりも小さい場合に、この試験因子は、細胞増殖を阻害する因子として特定される。試験因子と接触させられている細胞のＤＮＡに組み込まれた標識の量が、コントロール細胞で測定される標識の量よりも大きい場合に、この試験因子は、細胞増殖を誘導する因子として特定される。
【０２１５】
結果の再現性は、同じ濃度の試験因子を用いて２回以上分析を行うことによって（例えば、アッセイプレートの２ウェル以上で細胞をインキュベートすることによって）試験され得る。さらに、試験因子は、因子の性質およびその作用機序の性質に依存して種々の濃度で有効であり得るので、種々の濃度の試験因子が、試験され得る（例えば、細胞を含む異なるウェルに添加される）。一般には、１ｆＭ〜約１０ｍＭの試験因子濃度を、スクリーニングに用いる。好ましいスクリーニング濃度は、約１０ｐＭ〜約１００μＭである。
【０２１６】
特定の実施形態では、本発明の方法はさらに、１つ以上の陰性または陽性のコントロール化合物の使用を包含する。陽性のコントロール化合物とは、細胞増殖を混乱する（すなわち、誘導または阻害する）かまたは調節することが公知である任意の分子または因子であり得る。陰性のコントロール化合物とは、細胞増殖に対して検出可能な影響を有さないことが公知である任意の分子または因子であってもよい。これらの実施形態では、本発明の方法はさらに、この因子の影響を、陽性または陰性コントロール化合物の影響（またはその非存在）に比較する工程を包含する。
【０２１７】
当業者によって理解されるとおり一般には、細胞増殖を混乱させる因子か、または調節する因子として本発明のスクリーニング方法によって特定される因子を、さらに特徴付けることが望ましい。例えば、試験化合物が、所定の細胞系（例えば、樹立された細胞株）を用いて細胞増殖を混乱する（または調節する）因子として特定されている場合、種々の細胞培養系（例えば、初代細胞または二次細胞）においてこの能力を試験することが所望され得る。
【０２１８】
本発明のスクリーニング方法によって特定される試験因子はまた、インビボで因子の特性の決定を可能にするアッセイでさらに試験されてもよい。
【０２１９】
従って、本発明は、細胞増殖または細胞増殖速度をインビボで混乱させる因子を特定するための方法を提供する。このような方法は以下の工程を包含する：（ａ）生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；（ｂ）この生物体に対して、第一の反応性不飽和基を含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果このヌクレオシドアナログをこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この生物体の少なくとも１つの細胞と、標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬とを接触させて、その結果［３＋２］環化付加が、この第一の反応性不飽和基および第二の反応性不飽和基の間で生じる工程と；（ｄ）ＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度または細胞増殖の速度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、生物体が試験因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子をこの生物体における細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程。
【０２２０】
本発明はまた、細胞増殖また細胞増殖速度をインビボで混乱させる因子を特定するための方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）生物体を試験因子に対して曝露させる工程と；（ｂ）この生物体に対して、アジドを含む有効量のヌクレオシドアナログを投与して、その結果このヌクレオシドアナログをこの生物体の細胞のＤＮＡに組み込ませる工程と；（ｃ）この生物体の少なくとも１つの細胞と、置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む染色試薬とを接触させて、その結果シュタウディンガー・ライゲーションが、このアジドと置換トリアリールホスフィンとの間で生じる工程と；（ｄ）このＤＮＡに組み込まれた標識の量を決定する工程であって、この標識量が細胞増殖の程度または細胞増殖の速度を示す工程と；（ｅ）工程（ｄ）で測定される標識の量が、生物体が試験因子に曝露されないコントロールの適用において測定される標識の量よりも少ないかまたは多い場合、この試験因子をこの生物体における細胞の増殖を混乱させる因子として特定する工程。
【０２２１】
特定の実施形態では、この試験因子は、この生物体がヌクレオシドアナログと接触させられた後に、投与される（すなわち、工程（ｂ）は工程（ａ）の前に行われる）。
【０２２２】
当業者によって理解されるとおり、これらの方法は、インビボで細胞増殖を調節する因子を特定するために用いられ得る。
【０２２３】
投与の方式、染色試薬、標識のタイプ、および標識された核酸ポリマーの検出方法は、生きている系において細胞増殖を測定することに関する本発明の他の方法について本明細書において記載される方法と類似である。
【０２２４】
（２．細胞周期の研究）
本発明の標識方法は、固定および変性を必要とせず、従って生きている細胞における適用に適切であって、細胞周期の複雑な時空間的機構の研究に用いられ得る。種々の混乱の有無における細胞周期の機構の明確な理解によって、ガンのようなヒト疾患を制御または処置するための新規な治療的アプローチの開発への道が開かれ得る。最近まで、核の構造のほとんどの研究は、固定された細胞で行なわれた（Ａ．Ｉ．ＬａｍｏｎｄおよびＷ．Ｃ．Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０：４５７〜５５３）。しかし、経時的蛍光顕微鏡画像化法はこれまで、生きた細胞核が観察され、かつ動的な方式で研究されること、そして従来の固定された細胞顕微鏡技術よりもかなり豊富な情報内容を与えることを可能にすることが実証されている（Ｙ．ＨｉｒａｏｋａおよびＴ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９６，４：１７３〜１７６；Ｔ．Ｋａｎｄａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，８：３７７〜３８５）。
【０２２５】
図１１に示されるとおり、本発明の方法によって、複製を受けているＤＮＡの特異的な標識、および細胞の特徴づけが、有糸分裂（例えば、分裂後期）または静止期として可能になる。従って、本明細書に開示される標識方法および画像化技術、例えば、経時的蛍光顕微鏡画像化法またはフローサイトメトリーは、種々の混乱条件下で種々の細胞タイプの細胞周期について基礎的な知識を獲得することを補助し、かつ細胞周期に影響する新規な薬物の開発を可能にし得る。
【０２２６】
従って、本発明の方法は、広範な種々の病的条件の研究に適用され得る。例えば、ガンは次第に細胞周期疾患としてとらえられている。この観点は、大部分の腫瘍が、細胞増殖の増大をもたらす細胞周期機構を狂わせる欠陥を被っているという証拠を反映する。このような欠陥は、細胞周期自体の成分、または細胞周期事象を誘発するように最終的に集る上流のシグナル伝達カスケードの要素のいずれかを標的とし得る。ガンは細胞周期調節不全に関連すると考えられる唯一の臨床状態ではない（Ｍ．Ｄ．Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．２００１，８１：５１５〜５２２）。例えば、ニューロンがヒト神経変性疾患で死ぬ機構は、今日まで謎のままである（Ｉ．Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．，２００３，５：３１〜４１）。正常な脳の最終的に分化したニューロンは、細胞分裂できない。しかし、蓄積している証拠によって、特定の神経変性疾患における細胞周期の異常な活性化はそれらの死滅をもたらすということが示唆されている。この細胞周期媒介性の変性カスケードの詳細を解明することによって、特定の神経変性性疾患の発現および進行を抑制するための新規なストラテジーがもたらされ得る。同様に、細胞分裂の操作は、心血管系の機能に対して有益または病理的な結果を有し得るということが公知である（Ｍ．ＢｏｅｈｍおよびＥ．Ｇ．Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｇ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ．，２００３，５：１９〜３０）。損傷後の心筋細胞が増殖して再生できないことによって、身体的障害に関連する心機能の障害が生じ、そして死亡がもたらされ得る。心筋細胞が増殖および再生できないことにつながる、心筋細胞における遺伝子プログラムは理解されていないが、同定されれば、このプログラムは、細胞周期を再開始することおよび心筋細胞の増殖を目的とする治療につながり得る。
【０２２７】
（３．染色体構造）
本発明の標識方法はまた、染色体の超構造の研究のために用いられ得る。
【０２２８】
例えば、本発明の標識方法は、姉妹染色分体交換（ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｃ
ｅｘｃｈａｎｇｅ）（ＳＣＥ）を研究するために用いられ得る。ＳＣＥは、天然のプロセスであって、２つの姉妹染色分体が壊れて、染色体上の１つの別の物理的に切り換わる位置で再結合する（Ｓ．Ｗｏｌｆ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７７，１１：１８３〜２０１；Ｓ．Ａ．Ｌａｔｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８１，１５：１１〜５３）。このような交換は、細胞複製の間に生じ、ここでは約１０のＳＣＥが、正常に周期しているヒト細胞で自然に生じる（Ｐ．Ｅ Ｃｒｏｓｓｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，１９７７，３５：３４５〜３５２；Ｓ．Ｍ．ＧａｌｌｏｗａｙおよびＨ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，１９７５，１５：１７〜２９）。ＳＣＥはまた、種々の遺伝子毒性処理によって誘導され得（Ｌ．Ｈａｇｍａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：４１１７〜４１２１）、このことは、ＳＣＥがＤＮＡ修復プロセスを反映することを示唆している。ＳＣＥの検出は、姉妹染色分体を示差的に標識するといういくつかの手段を要し、そしてこれは２つの完全な細胞周期の継続期間のためにＢｒｄＵを含有する培地中で細胞を培養することによって伝統的に行われている。本発明の標識方法は、ＢｒｄＵの代わりに用いられ得る（図１２を参照のこと）。図１３に示されるとおり、本明細書に開示される標識方法によって、染色体を形成する２つのＤＮＡ分子のうちの１つだけを染色することが可能になる。
【０２２９】
本発明の標識方法はまた、動原体−微小管相互作用および動原体性の粘着を研究するための新規なツールとして用いられ得る。細胞分裂の間の染色体の適切な分離は、遺伝子の安定性の維持に必須である。このプロセスの間、染色体は、動原体性の異質クロマチンの表面上に位置する特定のタンパク質構造である動原体を通じて微小管との安定な機能的な相互作用を確立しなければならない。多数の微小管に対する動原体の安定な結合は、染色体の動きを媒介する動原体線維の形成を生じる。染色体分離の忠実度は、動原体と微小管との間の正確な相互作用に依存するが、この相互作用が媒介され、そして調節される方法は依然として明らかではない（Ｍ．Ｂ．Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００１，１５２：４２５〜４３４；Ａ．Ａ．Ｖａｎ ＨｏｏｓｅｒおよびＲ．Ｈｅａｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１１：Ｒ８５５〜８５７；Ｓ．ＢｉｇｇｉｎｓおよびＣ．Ｅ．Ｗａｌｃｚａｋ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ，２００３，１３：Ｒ４４９〜４６０；Ｈ．Ｍａｉａｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，２００４，１１７：５４６１〜５４７７；Ｈ．ＭａｉａｔｏおよびＣ．Ｅ．Ｓｕｎｋｅｌ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００４，１２：５８５〜５９７）。動原体は、細胞分裂の間の染色体の適切な分離に必須である染色体の特定の領域である。これは動原体がアセンブルされる部位である。有糸分裂の間、複製された姉妹染色体は、紡錘体に結合するように粘着を維持しなければならない。分裂後期には、粘着は染色体全体にそって同時に失われ、姉妹は互いに離れて、これらが反対の極に分離することが可能になる。有糸分裂の間の染色体の粘着を担う分子機構は、不明瞭なままである（Ｋ．Ｊ．ＤｅｊおよびＴ．Ｌ．Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１０：３９２〜３９９；Ｔ．Ｆｕｋａｇａｗａ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００４，１２：５５７〜５６７；Ｓ．Ｓａｌｉｃら、Ｃｅｌｌ，２００４，１１８：５６７〜５７８）。
【０２３０】
（４．ＲＮＡの標識およびＲＮＡ局在化の研究）
本発明の標識方法は、ＲＮＡを標識するために用いられ得る。
【０２３１】
本発明の特定の方法は、リボヌクレオチドポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログ上の第一の反応性の不飽和基と、標識に結合された第二の反応性不飽和基との間の［３＋２］環化付加を包含する。この［３＋２］環化付加反応によって、リボヌクレオチドポリマーの標識が生じる。
【０２３２】
本発明の他の方法は、リボヌクレオチドポリマーに組み込まれたヌクレオチドアナログ上のアジド基と、標識に結合された置換トリアリールホスフィンとの間のシュタウディンガー・ライゲーションを包含する。このシュタウディンガー・ライゲーションによって、リボヌクレオチドポリマーの標識が生じる。
【０２３３】
このような方法では、ヌクレオチドアナログを含むリボヌクレオチドポリマーは、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、このリボヌクレオチドポリマーは、基質としてヌクレオチド三リン酸（ヌクレオチドアナログ三リン酸を含む）の存在下でＴ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターの下流でクローニングされた、ＤＮＡのインビトロ転写によって合成されてもよい。あるいは、リボヌクレオチドポリマーは、増幅方法を用いて調製されてもよい。
【０２３４】
本発明の標識方法は、多くの遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルを平行して測定するマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション・アッセイで用いられてもよい。
【０２３５】
本発明の標識方法はまた、タンパク質およびペプチドのインビトロ選択のための無細胞系である、リボソームディスプレイに適用を見出し得る（Ｃ．ＴｕｅｒｋおよびＬ．Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４９：５０５〜５１０；Ｇ．Ｆ．Ｊｏｙｃｅ，Ｇｅｎｅ １９８９，８２：８３〜８７；Ｊ．Ｗ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７：８９〜９３；Ｄ．Ｅ．Ｔｓａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：８８６４〜８８６８；Ｊ．Ａ．Ｄｏｕｄｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２：２３５５〜２３５９；Ｃ．Ｓｈａｆｆｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，２３１：１１９〜１３５；Ｄ．ＬｉｐｏｖｓｅｌおよびＡ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２９０：５１〜６７；Ａ．Ｍ．Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｒｅｏｍｉｃ，２００４，２：３０８〜３１９）。これらの選択アッセイは一般に、目的のタンパク質または分子へＲＮＡライブラリーを加える工程、未結合のＲＮＡを洗い去る工程、およびタンパク質に結合したＲＮＡを特異的に溶出させる工程を包含する。次いで、ＲＮＡを逆転写して、ＰＣＲによって増幅する。次いで、得られたｃＤＮＡを検出目的のためにヌクレオチドアナログの存在下で転写する。タンパク質または目的の他の分子に結合することが見出されるこれらの分子を、クローニングして、配列決定して、共通の配列を探す。次いで、この共通の配列を用いて、治療用オリゴヌクレオチドを開発する。
【０２３６】
本発明のＲＮＡ標識方法はまた、生きている細胞においてｍＲＮＡの動き（輸送および局在化）を可視化するために用いられ得る。ｍＲＮＡの局在化は、タンパク質をその作用部位に標的する遺伝子発現の転写後調節の一般的な方式である（Ｉ．Ｍ．ＰａｌａｃｉｏｓおよびＤ．Ｓｔ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１７：５６９〜６１４；Ｒ．Ｐ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００１，２：２４７〜２５６；Ｍ．Ｋｌｏｃら、Ｃｅｌｌ，２００２，１０８：５３３〜５４４）。最も特徴付けられた局在するｍＲＮＡの多くは卵母細胞および早期の胚で見出され、ここでそれらは、軸の形成および生殖系列の発達を制御する局在性決定要因として機能する。ｍＲＮＡの局在化はまた、ニューロンのような体細胞において重要な役割を果たし、ここでは学習および記憶に関与し得ることが示されている。種々のｍＲＮＡの可視化方法が、ｍＲＮＡ輸送および局在化に関与する機構および機序を特定するために開発されており、これは、ＲＮＡへのアミノアライ（ａｍｉｎｏａｌｌｙ）−ウリジン三リン酸組み込み、続いてフルオレセインまたはローダミンカップリングおよびＲＮＡへのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−ウリジン三リン酸の直接組み込みを包含する（Ｖ．Ｖａｎ ｄｅ ＢｏｒおよびＩ．Ｄａｖｉｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００４，１６：３００〜３０７）。本発明に従ってインビトロで蛍光標識されるｍＲＮＡ分子は、生きている細胞に導入されて、それらの動きがリアルタイムでモニターされ得る。
【０２３７】
（Ｖ．キット）
別の局面では、本発明は、本発明の方法の１つ以上を行うために有用な物質を含むキットを提供する。本発明のキットは、診断検査室、臨床研究室、実験室または施術者によって用いられ得る。本発明は、これらの種々の設定で用いられ得るキットを提供する。
【０２３８】
本発明に従う核酸ポリマーを標識するための基礎的な物質および試薬は、キット中に一緒にまとめられてもよい。核酸ポリマーを標識するための本発明のキットは、第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つのヌクレオシドアナログ；および標識に結合された第二の反応性不飽和基を含む試薬を備えてもよい。核酸ポリマーの二重標識のための本発明のキットは、第一の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオシドアナログ；第二の反応性不飽和基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオシドアナログ；第一の標識に結合された第三の反応性不飽和基を含む第一の試薬；および第二の標識に結合された第四の反応性不飽和基を含む第二の試薬を備える。あるいは、またはさらに、核酸ポリマーを標識するための本発明のキットは、アジド基を含む少なくとも１つのヌクレオシドアナログと；置換トリアリールホスフィンに結合された標識を含む試薬とを備えてもよい。２つの核酸ポリマーの示差的な標識のための本発明のキットは、アジド基を含む少なくとも１つの第一のヌクレオシドアナログと；アジド基を含む少なくとも１つの第二のヌクレオシドアナログと；置換トリアリールホスフィンに結合された第一の標識を含む第一の染色試薬と、置換トリアリールホスフィンに結合された第二の標識を含む第二の染色試薬と、を備えてもよい。
【０２３９】
各々のキットは好ましくは、特異的な手順を付与する試薬を備える。従って、検出可能な因子がハプテンである場合、このキットは好ましくは、対応する適切な抗体を含む。同様に、生きている生物体において核酸ポリマーを標識するために用いることを意図するキットは、生きている生物体に投与できるように処方されたヌクレオシドを含む。細胞増殖を誘導または阻害する能力について化合物をスクリーニングするために用いられることを意図するキットは、本発明の標識された核酸ポリマーを含む細胞を備えてもよい。
【０２４０】
特定の本発明のキットはさらに、［３＋２］環化付加反応を行うために有用な緩衝液および／または試薬、例えば、水性媒体およびｃｕ（Ｉ）を含んでもよい。他の本発明のキットはさらに、シュタウディンガー・ライゲーション反応を行うために有用な緩衝液および／または試薬を含んでもよい。
【０２４１】
本発明のキットはさらに、以下の１つ以上を含んでもよい：洗浄緩衝液および／または試薬、細胞固定緩衝液および／または試薬、免疫組織化学緩衝液および／または試薬、ＤＡＢフォトコンバージョン緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段。この緩衝液および／または試薬は好ましくは、キットが意図する特定の標識／検出技術について最適化される。この手順の種々の段階を行うためにこれらの緩衝液および試薬を用いるためのプロトコールも、このキットに包含されてもよい。
【０２４２】
キットはまた、生物体からの細胞の単離のための装置（例えば、針生検シリンジ）および／または試薬を備えてもよい。
【０２４３】
この試薬は、固体（例えば、凍結乾燥）または液体型で供給されてもよい。本発明のキットは必要に応じて、各々の個々の緩衝液および／または試薬について異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたはボトル）を備える。各々の成分は一般に、そのそれぞれの容器中でアリコートとして適切であるか、または濃縮型で提供される。標識／検出アッセイの特定の段階を行うために適切な他の容器もまた提供され得る。このキットの個々の容器は好ましくは、商業的用途のために厳重に封じ込めて維持される。
【０２４４】
本発明の１つ以上の方法に従うキットを用いるための説明書は、核酸ポリマーを標識するための説明、細胞増殖を測定するための説明、得られた結果を解釈するための説明、および医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関（例えば、ＦＤＡ）の規定する形態の注意書きを備えてもよい。
【実施例】
【０２４５】
以下の実施例は、本発明を作成および実施する好ましい態様のいくつかを記載する。しかし、これらの例は、例示的な目的でしかなく、本発明の範囲を限定することは意味しないことが理解されるべきである。さらに、実施例の記載が過去形で示されない限り、本文章は、本明細書の残りと同様に、実験が現実に行なわれたか、またはデータが実際に得られたということを示唆することは意図しない。
【０２４６】
（実施例１：エチニル−ｄＵを用いる細胞の標識のための一般的プロトコール）
エチニル−ｄＵ（ＥｄＵ）を、標識パルスの長さに依存して１０ｎＭ〜１μＭの範囲におよぶ組織培養培地（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭ）中で用いた。例えば、標識される細胞が、Ｓ期で同調された場合、１００ｎＭ〜１μＭのＥｄＵを１〜２時間用いた。標識後、この細胞をＰＢＳを用いて３または４回洗浄し、次いで、組織培養培地を添加した。
【０２４７】
（生きている細胞の染色：）
染色溶液：１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５（水に含まれる２Ｍのストックより）、０．５〜１ｍＭのＣｕＳＯ_４（水に含まれる１Ｍのストックより）、０．５〜１μＭのＴＭＲ−プロピル−アジド（ＤＭＦ中に含まれる約１００ｍＭのストックより）、および水（必要に応じて）を、一緒に混合した。次いで、アスコルビン酸（水中に含まれる０．５ｍＭのストックより）をこの溶液に、最終濃度５０ｍＭまで添加して、得られた染色溶液を徹底的に混合する。
【０２４８】
透過化処理（例えば、染色試薬が、細胞透過性であるＴＭＲ−プロピル−アジドである場合）なしに、生きた細胞を染色するために、組織培養培地を取り出して、上記の染色溶液で置き換えた。細胞を染色溶液の存在下で少なくとも３０分間インキュベートしたが、染色は一般には、インキュベーションの１０分後に完了する。染色後、未反応のＴＭＲ−プロピル−アジドを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（または類似の界面活性剤）を含有する緩衝液（例えば、ＰＢＳまたはＴＢＳ）で洗浄することによって取り除いた。バックグラウンドを低くするために、メタノールまたはエタノールでの洗浄を行ってもよい。
【０２４９】
所望の場合、細胞固定は、洗浄緩衝液に３％のホルムアルデヒド（またはグルタルアルデヒド）を添加することによって同時におこなわれてもよい。この場合、細胞を、室温で少なくとも１０分間洗浄緩衝液中でインキュベートした。
【０２５０】
（固定された細胞の染色：）
染色溶液：１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５（水の中に含まれる、２Ｍのストックから）、０．５〜１ｍＭのＣｕＳＯ_４（水の中に含まれる１Ｍのストックから）、０．５〜１μＭの発蛍光団−アジド（ＤＭＳＯ中に含まれる約１０〜１００ｍＭのストックから）、および水（必要に応じて）を一緒に混合した。次いで、アスコルビン酸（水の中に含まれる０．５ｍＭのストックから）を、この溶液に、最終濃度５０〜１００ｍＭまで添加し、得られた染色溶液をボルテックスを用いて徹底的に混合する。
【０２５１】
細胞を、任意の適切な方法によって固定してもよく、例えば、細胞は、透過化処理の有無で、アルデヒド（ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）固定によって固定してもよい。固定後に、この細胞を、非イオン性界面活性剤（０．２〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００）の有無において緩衝液中で洗浄した。染色前に、細胞を、界面活性剤（ＰＢＳまたはＴＢＳ）なしで緩衝液を用いてリンスした。次いで、この細胞を、少なくとも３０分間染色溶液の存在下でインキュベートした。一晩の染色は好ましくは低温室で行う。
【０２５２】
染色後、細胞を０．５％の界面活性剤を含有する緩衝液を用いて数回洗浄した。必要に応じてバックグラウンドを有意に減少させるためにメタノールおよびエタノールを用いた洗浄を行ってもよい。
【０２５３】
（染色された細胞の画像化：）
次いで、染色された細胞を標準的なプロトコールを用いて免疫染色してもよい。次いで、細胞を標準的なマウンティング培地でマウントして、画像化した。マウントしてもしなくても、この染色は、４℃で永続的に極めて安定であることが見出された。
【０２５４】
（実施例２：エチニル−ｄＵを用いるＨｅＬａ細胞の染色）
ＨｅＬａ細胞は、実施例１に記載されるような１μＭのＥｄＵで標識するか、またはしなかった。次いで、それらを、固定／透過化処理して、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジド試薬（これは細胞透過性でなく、従ってクリック化学を行うために透過化処理を要する）で染色した。
【０２５５】
細胞の両方の集団（すなわち、ＥｄＵで標識されるかまたはされない）の画像を図５に示す。これらの細胞のより高い解像度を、図１１（右側）に示しており、これには、ＯｌｉＧｒｅｅｎで染色したＥｄＵ−標識ＨｅＬａ細胞から得た画像を添えている（図１１、左側）。分裂後期を受けている底の細胞におけるＥｄＵ染色のまだらな出現に注意のこと。このまだらは、ＥｄＵの標識パルスが細胞のＤＮＡを複製するために細胞に必要な時間より短いという事実に起因する；従って、このパルスの間に複製するＤＮＡのみが標識された。
【０２５６】
（実施例３：標識された生きている細胞の経時的蛍光画像化）
できるだけ天然の状態に近い条件下でＤＮＡを染色するために、細胞透過性のＴＭＲ−アジド試薬を開発した。ＴＭＲ−プロピル−アジドは、ブロモ−プロピル−ＴＭＲを形成するためにＴＭＲ−カルボキシ−ＮＨＳエステルと３−ブロモ−プロピルアミンとを最初に反応させることによって合成された。次いで、この後者の化合物を、アジ化ナトリウムと反応させて、細胞透過性であることが見出されており、従って、透過化処理および／または固定の必要なしに細胞を標識するために適切である、ＴＭＲ−プロピル−アジドを形成した。
【０２５７】
ＴＭＲ−プロピル−アジドを用いて細胞の染色を実証するために、ＨｅＬａ細胞を最初にＥｄＵで標識した。生きた顕微鏡画像化を容易にするために、ＥｄＵ−標識された細胞を、カバースリップチャンバ中において、これを、広視野の蛍光顕微鏡およびスピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＹｏｋｏｇａｍａスピニングディスク共焦点ヘッド）のために装備された倒立Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２００）Ｕ顕微鏡の加熱ステージ（３７℃）にマウントした。細胞を覆っている培地を取り除いて、生理学的な生理食塩水緩衝液に溶解された２００ｎＭのＴＭＲ−プロピル−アジド、２５ｍＭのアスコルビン酸塩および１ｍＭの硫酸銅（ＩＩ）を含有する染色溶液で置き換えた。この細胞を、経時的蛍光顕微鏡（１５秒ごとに１フレーム）によって、画像化して、ＥｄＵ標識細胞の核に蓄積しているＴＭＲシグナルを検出した。
【０２５８】
図６上に示される（経時的蛍光顕微鏡によって得られる画像を示す）とおり、クリック反応は、この細胞透過性試薬を用いて生きた細胞上で極めてよく機能することが見出された。図７に示されるとおり、ＥｄＵ検出は数分内で終了した。
【０２５９】
（実施例４：インビボ標識）
ＢＬＡＢ／Ｃマウスに、腹腔内に２００μｇのＥｄＵを注射した。３日後、器官を回収して、固定して、パラフィンに包埋して、切片にした。次いで、その切片を脱ろうして、Ｘｒｈａｄｏｍｉｎｅ−アジドを用いて５分間染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、洗浄し次いでマウントした。
【０２６０】
図８は、腸を通る高倍率（４４０×）の切片を示す。核の赤い細胞は、ＥｄＵを組み込んでいる細胞およびそれらの子孫である。ＤＮＡは青で現われる。図９は、マウスの腸切片の大きい断片の画像を形成するために一緒にとじられた多くの４００×画像という画像の複合物である（ＤＮＡは緑で現われる）。この対象物は、腸を通じた全体的な傾斜切片である（約５ミリメートルの長さ）。
【０２６１】
図１０は、細胞がほぼ決して分裂しない器官である（極めて増殖性である腸とは異なる）マウス脳を通じた切片である。単一のＥｄＵ標識細胞が、この脳切片上で容易に特定され得る。
【０２６２】
（実施例５：動原体での単一の姉妹染色分体のトレース）
本明細書に報告される実験の目的は、染色体を形成する２つのＤＮＡ分子のうちの１つのみを標識することであった。それは、図１２に示されるように、ＤＮＡ合成の間にＥｄＵを用いてＨｅＬａ細胞をパルスすること、続いて持続する２つの細胞周期追跡によって達成された。
【０２６３】
標識後の最初の有糸分裂では、両方のＤＮＡ分子を標識したが、第二の有糸分裂では、ＤＮＡ分子の１つのみを標識した。ＥｄＵによって、図１３に示されるような細胞における染色体の極めて優れた解像画像が可能になった。これらの実験では、Ａｌｅｘａ５６８−アジドを、透過化処理に関与する染色および染色プロセスのために用いた。
【０２６４】
（実施例６．細胞でのＲＮＡの標識）
ＥＵ（エチニル−ウリジン）を細胞ＲＮＡの標識として合成した。ＨｅＬａ細胞を、１０μＭのＥＵを用いて一晩標識して、固定して、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色した。図１４に示されるとおり、ＥＵで標識されていない、Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色した細胞（陰性コントロール）は、予想どおり、極めてわずかな染色しか示さなかった。Ｘｒｈｏｄａｍｉｎｅ−アジドで染色された、ＥＵ標識された細胞は、細胞ＲＮＡに組み込まれているＥＵの指標である強力な細胞質染色を示した。
【０２６５】
（実施例７：ＨｅＬａ細胞を染色するためにアジド−ｄＵ（ＡｄＵ）を用いる）
２’−デオキシウリジン（ＡｄＵ）およびウリジン（ＡＵ）の両方の５−アジド誘導体を合成した。
【０２６６】
ＡｄＵは、２つの異なる色でＤＮＡを染色するためにＥｄＵと一緒に用いられ得るデオキシヌクレオシドアナログである（ＥｄＵおよびＡｄＵが、２つの別々のパルスとして細胞に投与されるならば、検出はそれぞれ、発蛍光団１−アジドおよび発蛍光団２−末端アルキンを用いて行われる）。
【０２６７】
同様に、ＡＵは、細胞ＲＮＡを標識するために用いられ得る。細胞ＲＮＡは、それぞれ、エチニル−ウリジンおよびアジド−ウリジンを用いて２つの異なる色で標識され得る。
【０２６８】
ここでＨｅＬａ細胞を１０μＭのＡｄＵ中で一晩標識し、次いでＥｄＵで標識された細胞を染色するために本明細書で記載された条件を用いて、１０μＭのＡｌｅｘａ５６８−アルキンで染色した。図１６は、染色されたＨｅＬａ細胞の視野の２つの写真を示す。図１６に示されるとおり、ＡｄＵは標識された静止期細胞の核で、そして有糸分裂細胞の凝縮した染色体で明確に検出される。
【０２６９】
（実施例８：穏やかな条件下でＤＮＡ染色を消去）
ある場合には、ＥｄＵ標識ＤＮＡの蛍光染色を消去することが望ましい。その目的を達成するためのストラテジーは本明細書に記載される。
【０２７０】
ＨｅＬａ細胞を、１μＭのＥｄＵで一晩標識して、翌日固定した。染色は、シスタミンリンカー（Ｈ_２Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）を介して発蛍光団にアジド基が結合された、本出願人らによって合成された、１０μＭのＡｌｅｘａ５６８−アジド（Ａｌｅｘａ５６８−ＳＳ−アジドの省略）を用いて行った。リンカー中のジスルフィド結合は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のような還元剤を用いて容易に還元され得、これによってＤＮＡ鎖からの発蛍光団の解離が生じる。
【０２７１】
図１７の第二列は、ＨｅＬａ細胞の写真を示しており、この細胞は、上記のように、Ａｌｅｘａ５６８−ＳＳ−アジド染色後に、２０ｍＭ（左側）および１００ｍＭ（右側）のＤＴＴとともにインキュベートされた。ＤＴＴインキュベーションは、３７℃で３０分間行った。図１７の最初の１列は、上記のようにインキュベートされた（すなわち、引き続くＤＴＴインキュベーションなし）ＨｅＬａ細胞（右パネル）、ならびにＥｄＵおよびＡｌｅｘａ５６８−アジドの存在下でインキュベートされなかったＨｅＬａ細胞（左パネル）の写真を示す。図１７の写真によって示されるとおり、ＤＴＴインキュベーションは細胞核から蛍光シグナルを効率的に取り除く。
【０２７２】
（実施例９：シュタウディンガー・ライゲーションを介するアジド−ｄＵでの細胞の標識のための一般的プロトコール）
アジド−ｄＵ（ＡｄＵ）は、標識パルスの長さに依存して１０ｎＭ〜１μＭの範囲におよぶ組織培養培地（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭ）中で用いた。例えば、標識される細胞が、Ｓ期で同調された場合、１００ｎＭ〜１μＭのＡｄＵを１〜２時間用いた。標識後、この細胞をＰＢＳを用いて３または４回洗浄し、次いで組織培養培地を添加する。
【０２７３】
（生きている細胞の染色：）
染色溶液：１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５（水のなかで２Ｍのストック）、０．５〜１μＭのシュタウディンガー・ライゲーション試薬（すなわち、置換トリアリールホスフィンに結合された蛍光部分を含む分子）（ＤＭＦ中に含まれる約１００ｍＭのストックより）、および水（必要に応じて）を、一緒に混合する。
【０２７４】
透過化処理なしに生きた細胞を染色するために、組織培養培地を取り出して、上記の染色溶液で置き換える。細胞を染色溶液の存在下で少なくとも３０分間インキュベートするが、染色は一般には、インキュベーションの１０分後に完了する。染色後、未反応の染色試薬を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（または類似の界面活性剤）を含有する緩衝液（例えば、ＰＢＳまたはＴＢＳ）で洗浄することによって取り除く。バックグラウンドを低くするために、メタノールまたはエタノールでの洗浄を行ってもよい。
【０２７５】
所望の場合、細胞固定は、洗浄緩衝液に３％のホルムアルデヒド（またはグルタルアルデヒド）を添加することによって同時におこなわれてもよい。この場合、細胞を、室温で少なくとも１０分間洗浄緩衝液中でインキュベートする。
【０２７６】
（固定された細胞の染色：）
細胞を、任意の適切な方法によって固定してもよく、例えば、細胞は、透過化処理の有無で、アルデヒド（ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）固定によって固定してもよい。
【０２７７】
固定後に、この細胞を、非イオン性界面活性剤（０．２〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００）の有無において緩衝液中で洗浄する。染色前に、細胞を、界面活性剤（ＰＢＳまたはＴＢＳ）なしで緩衝液を用いてリンスする。次いで、この細胞を、少なくとも３０分間染色溶液の存在下でインキュベートする。一晩の染色は好ましくは冷蔵室で行う。
【０２７８】
染色後、細胞を０．５％の界面活性剤を含有する緩衝液を用いて数回洗浄した。必要に応じてバックグラウンドを有意に減少させるためにメタノールおよびエタノールを用いた洗浄を行ってもよい。
【０２７９】
（染色された細胞の画像化：）
次いで、染色された細胞を標準的なプロトコールを用いて免疫染色してもよい。次いで、細胞を標準的なマウンティング培地中でマウントして、画像化する。
【０２８０】
（実施例１０：インビボ標識）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、腹腔内に２００μｇのＡｄＵを注射した。３日後、器官を回収して、固定して、パラフィンに包埋して、切片にする。次いで、その切片を脱ろうして、シュタウディンガー・ライゲーション染色試薬（すなわち、置換トリアリールホスフィンに結合された蛍光部分を含む分子）を用いて５分間染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、洗浄し、次いでマウントした。
【０２８１】
（実施例１１：細胞におけるＲＮＡの標識）
ＡＵ（エチニル−ウリジン）を細胞ＲＮＡの標識として合成した。ＲＮＡ染色実験では、ＨｅＬａ細胞は、１０μＭのＡＵで一晩標識して、固定し、そしてシュタウディンガー・ライゲーション−染色試薬（すなわち、置換トリアリールホスフィンに結合された蛍光部分を含む分子）で染色した。
【０２８２】
（他の実施形態）
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮または本明細書に開示される本発明の実施から当業者に明白である。本明細書および実施例は例示目的としてだけみなされ、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって示されているということを意図する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図７】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１７】

【図１８】

【図５】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１６】

【公開番号】特開２０１３−２７４０６（Ｐ２０１３−２７４０６Ａ）
【公開日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２３９８７６（Ｐ２０１２−２３９８７６）
【出願日】平成２４年１０月３１日（２０１２．１０．３１）
【分割の表示】特願２００８−５３７９５９（Ｐ２００８−５３７９５９）の分割
【原出願日】平成１８年１０月２７日（２００６．１０．２７）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント　アンド　フェロウズ　オブ　ハーバード　カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ　ａｎｄ　Ｆｅｌｌｏｗｓ　ｏｆ　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｃｏｌｌｅｇｅ
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ　テクノロジーズ　コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】