核酸パッケージングシステム
本発明は、ファージパッケージング機構を使用した、標的核酸のクローニングに関する。パッケージング開始部位を、標的ＤＮＡの中に導入することができる。ファージパッケージングシステムの構成要素を標的ＤＮＡと組み合わせて、ファージカプシドの中にＤＮＡをパッケージすることができる。パッケージＤＮＡを使用して、標的核酸のライブラリーを作り出すこともでき、またはそのＤＮＡを配列決定することもできる。例えば、本発明の一実施形態において、核酸を配列決定するための方法が提供され、この方法は、核酸を含むカプシドを提供するステップと、核酸を単離するステップと、核酸を配列決定するステップとを含み得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸分子のクローニングおよび核酸ライブラリーの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム学は、生物医学研究の中心的で統合的な学問になった。ゲノム配列決定プロジェクトは、事実上すべての生命過程の研究を変えた、安定した一連のさらに大きく、より複雑なゲノムデータセットを生成する。遺伝学および比較ゲノム学の進歩は、疾患が、分子の細部についての、前例がないレベルで分析され、かつ理解されることを可能にする。
【０００３】
ゲノム研究は、高品質で、大きな挿入断片のゲノムライブラリーの有用性を必要とする。高品質ゲノムライブラリーは、狭いサイズ範囲のＤＮＡ断片を必要とする。ＤＮＡ断片のサイズ選択は、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用して、典型的に行なわれるが、これは、いくつかの制限を有する。ＰＦＧＥは、非常に時間がかかり、再現不可能である。さらに、ＰＦＧＥからの断片ＤＮＡの収量は、非常に乏しい。
【０００４】
高品質ゲノムライブラリーはまた、全ゲノムが、最小限のバイアスを伴って表わされることをも必要とする。ゲノムライブラリーのＤＮＡ断片は、ゲノムを部分的に消化するための制限酵素を使用して、産生されることが多いが、これは、いくつかの制限を有する。ゲノムの部分的な消化は、制限部位の間の距離が、適用されるサイズ選択限界未満であり、またはそれを超えるゲノムの領域に対してバイアスをもたらす。部分的な消化と関連するクローニングバイアスに対する代案として、ＤＮＡ断片は、ゲノムをランダムに剪断することによって産生することができる。しかしながら、クローニング効率は、ランダムに剪断されたＤＮＡを使用すると、著しく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当技術分野が必要とするのは、全ゲノムを正確に表わすことができる高品質ゲノムライブラリーである。ゲノムライブラリーは、効率的に、かつ高収量を伴って産生されるべきである。ゲノムライブラリーはまた、容易に増殖され、かつ分析されるべきでもある。本発明は、これらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸をクローニングし配列決定するため、および複数の核酸をクローニングし配列決定するためのパッケージングシステムの使用に関する。パッケージングシステムは、たとえば、ファージベースのパッケージングメカニズムであってもよい。核酸をカプシドの中にパッケージすることができ、このカプシドはバクテリオファージカプシドであってもよい。クローニングされた核酸は、たとえば、核酸ライブラリーの産生において使用することができる。
【０００７】
核酸を配列決定するための方法であって、核酸を含むカプシドを提供するステップと、核酸を単離するステップと、核酸を配列決定するステップとを含み得る方法が本明細書において提供される。複数の核酸を配列決定するための方法であって、それぞれが核酸を含む複数のカプシドを提供するステップと、核酸を単離するステップと、核酸を配列決定するステップとを含み得る方法もまた本明細書において提供される。
【０００８】
配列決定は、（ａ）水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で水性マイクロリアクターの中に核酸を送達するステップと、（ｂ）マイクロリアクター中で核酸を増幅して核酸の増幅コピーを形成し、マイクロリアクター中で増幅コピーをビーズに結合させるステップと、（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイにビーズを送達するステップであって、複数の反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、（ｄ）複数の反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップとを含んでもよい。
【０００９】
配列決定はまた、（ａ）複数の水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で水性マイクロリアクターの中に複数の核酸を送達するステップと、（ｂ）マイクロリアクター中で核酸を増幅して核酸の増幅コピーを形成し、マイクロリアクター中で増幅コピーをビーズに結合させるステップと、（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイにビーズを送達するステップであって、複数の反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップとを含んでもよい。
【００１０】
ビーズは、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合してもよい。核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって成し遂げることができる。配列決定反応は、ピロリン酸ベースの配列決定反応であってもよい。配列決定反応は、（ａ）有効量の配列決定プライマーを核酸の増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および所定のヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、（ｂ）配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で核酸の配列を決定するステップとを含んでもよい。
【００１１】
核酸または複数の核酸の単離は、（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を少なくとも１つの核酸にライゲーションするステップであって、第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、少なくとも１つの核酸の５’末端にライゲーションし、第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、少なくとも１つの核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に少なくとも１つの核酸を固定するための手段を有するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の少なくとも１つの核酸を、固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で固体支持体にコロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の５’末端が、固体支持体に固定され、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の上述の５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、上述の固体支持体に固定されるステップと、（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、固定された少なくとも１つの核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップとを含んでもよい。コロニープライマーは、縮重プライマーであってもよい。
【００１２】
オリゴヌクレオチド配列Ｚは、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であってもよく、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列であってもよい。核酸にアダプター末端をライゲーションする場合、２つの異なるコロニープライマーＸは、少なくとも１つの核酸と混合してもよく、オリゴヌクレオチド配列Ｚは、コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズしてもよく、オリゴヌクレオチドＹは、コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じであってもよい。
【００１３】
少なくとも１つの核酸は、１つまたは複数の核酸コロニーにおいて配列決定することができる。配列決定は、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含んでもよく、さらに、核酸コロニーを視覚化することを含んでもよい。視覚化は、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含んでもよい。
【００１４】
少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に固定するための手段は、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを支持体に共有結合で固定するための手段を含んでもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に共有結合で固定するための手段は、化学的に修飾された基であってもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に固定するための手段は、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを支持体に共有結合で固定するための手段を含んでもよい。化学的に修飾可能な官能基は、アミノ基であってもよい。
【００１５】
少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の上述の５’末端が固定される固体支持体は、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択することができる。固体支持体上の核酸コロニーの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。固体支持体に付着したコロニープライマーＸの密度は、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２であってもよい。少なくとも１つの核酸の密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の５’末端は、共有結合を介して上述の固体支持体に固定することができる。
【００１６】
核酸をクローニングするための方法もまた本明細書において提供される。パッケージング開始部位（ＰＩＳ）を標的核酸の中に導入することができ、これは、標的核酸からクローニングされる核酸の上流末端を確立する。ＰＩＳは、λ、Ｐ１、Ｐ７、またはＴ４を含むが、これらに限定されないファージパッケージング開始部位であってもよい。標的核酸は、ベクター、染色体ＤＮＡ、または全ゲノムを含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。標的核酸としての全ゲノムの使用により、ゲノムライブラリーの産生が可能となる可能性がある。
【００１７】
ＰＩＳは、標的核酸にランダムに導入することができ、これは、ゲノムの範囲を増加させる可能性がある。ＰＩＳは、転位およびライゲーションを含むが、これらに限定されない任意の方式において標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳは、第１の核酸の転位によって導入することができる。第１の核酸は、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒを含むが、これらに限定されない転位性末端を含んでもよい。
【００１８】
次いで、パッケージングは、ＰＩＳで開始することができ、これは、標的核酸に及ぶ、ＰＩＳから下流の核酸のクローニングをもたらす。パッケージングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じてもよい。クローニングされた核酸は、カプシド中にパッケージすることができ、これは、クローンを実質的に一定の長さにする可能性がある。
【００１９】
第１の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。ベクターエレメントは、ＰＩＳの下流にあってもよく、クローニングされた核酸中に存在してもよい。ベクターエレメントは、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含むが、これらに限定されない複製開始点であってもよい。ベクターエレメントはまた、高コピー複製開始点および低コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、複製誘発剤に応答性であってもよい。第１の核酸は、複製誘発剤をコードする核酸を含んでもよい。複製誘発剤は、ＴｒｆＡであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】λｄｏｃ粒子を使用する、トランスポゾン媒介クローニングの手法を示す図である。ステップ１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応は、転位性末端（外向きの矢印）を介して、ゲノムＤＮＡ（長い直線）の全体にわたる多数の部位に、トランスポゾンを含有するＰＡＣ／ｏｒｉＶをランダムに挿入する。ステップ２：ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされ、ｃｏｓ部位で始まり、頭部がいっぱいになるまで続く。次いで、はみ出たＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａを用いて消化されるが、頭部内のＤＮＡは、保護される。ステップ３：次いで、ファージ頭部は、精製され、溶解され、Ｓａｕ３Ａ突出を有するゲノムＤＮＡに融合された、一定の長さの、一般的な組成のｃｏｓ−ＰＡＣ／ｏｒｉＶ（太い矢印）の断片がもたらされる。次いで、Ｓａｕ３Ａ突出およびｃｏｓ突出を有するオリゴは、断片にライゲーションされる。ステップ４：断片は、再度パッケージされ、入ってくるＤＮＡがｃｏｓ末端を通して環状になる、ＤＨ１０Ｂなどの宿主を感染させるために使用される。クローンは、ＣａｍＲコロニーとして単離される。
【図２】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位およびファージパッケージングを介してクローニングするためのさらなる模式図を示す図である。
【図３】Ｓａｕ３Ａ突出を有するＤＮＡ断片にｃｏｓ部位を追加するための、２つの核酸（配列番号１および２）を含むリンカーを示す図である。
【図４】トランスポゾン媒介クローニングの使用に基づくｉｎ ｖｉｖｏ組換えのための手順を示す図である。ステップ１：図１におけるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応は、転位性末端（外向きの矢印）を介して、ゲノムＤＮＡ（長い直線）の全体にわたる多数の部位に、トランスポゾンをランダムに挿入する。しかしながら、この場合、トランスポゾンは、複製開始点を有してないｃｏｓ−ａｔｔＢ−ＫａｎＲを含有する。ステップ２：ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされ、ｃｏｓ部位で始まり、頭部がいっぱいになるまで続く。次いで、はみ出たＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａを用いて消化されるが、頭部内のＤＮＡは、保護される。ステップ３：次いで、ファージ頭部は、精製され、溶解され、Ｓａｕ３Ａ突出を有するゲノムＤＮＡに融合された、一定の長さの、一般的な組成のｃｏｓ−ＰＡＣ／ｏｒｉＶ（太い矢印）の断片がもたらされる。次いで、Ｓａｕ３Ａ突出およびｃｏｓ突出を有するオリゴが、断片にライゲーションされる。ステップ４：断片は、再度パッケージされ、新しいｐＰＡＣ／ｏｒｉＶ／ａｔｔＰベクターを含有し、Ｉｎｔを発現するように誘発された、ＤＨ１０Ｂなどの宿主を感染させるために使用される。ｃｏｓ末端を介しての次に続く環化は、ＣａｍＲ付与プラスミドをもたらす。
【図５】転位性の／パッケージすることができるベクターを示す図である。ベクターのＰｖｕＩＩ切断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転位を可能にするＴｎ５モザイク末端（ＭＥ）が側面に位置する線状の断片をもたらす。次いで、ｐａｃ部位およびｃｏｓ部位は、転位産物がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされることを可能にする。
【図６】ファージカプシドのアフィニティー精製およびパッケージＤＮＡの単離が後に続くλファージベースのパッケージングシステムを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを生成するための戦略を示す図である。
【図７】Ｐ２２ＨＴ「ヘッドフル（ｈｅａｄｆｕｌ）」パッケージングシステムを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを生成するための戦略を示す図である。
【図８】ウイルスカプシドパッケージＤＮＡの末端の配列をクローニングし、かつ特徴づけるための戦略を示す図である。
【図９】ファージパッケージＤＮＡの中へのクラスＩＩＩ制限酵素部位およびリーチングプライマー対結合部位のクローニングが、ＤＮＡの末端の配列を特徴づけるためにどのように使用することができるかを示す図である。
【図１０】ＤＮＡの中にリーチングプライマー対挿入断片をクローニングした後に、ファージパッケージＤＮＡの末端をどのようにしてＰＣＲ増幅することができるかを示す図である。
【図１１】ＤＮＡの中にリーチングプライマー対挿入断片をクローニングした後に、ファージパッケージＤＮＡの末端をどのように配列決定することができるかを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明者らは、より正確に表わす、標的ＤＮＡを単離し、パッケージするために使用することができるファージパッケージングシステムを開発した。使用されるファージパッケージングシステムに依存して、システムは、特定の、より一定のサイズのＤＮＡ断片を生成する。さらに、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡを、扱いやすく、クローニングすることができるサイズに低下させるために剪断ステップまたは制限消化ステップを必要とする方法と比較して、よりライゲーション可能である。したがって、標的ＤＮＡを得るための効率は、他の方法と比較して高い。標的ＤＮＡのパッケージングに続いて、ＤＮＡは、ライブラリーの生成などの多数の目的のために使用することができ、それを抽出することができ、それを増幅することができ、またはパッケージＤＮＡ断片の末端のクローニングおよび配列決定などによってＤＮＡを配列決定することができる。
【００２２】
ＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡの中にパッケージング開始部位（ＰＩＳ）を導入することによって生成することができる。ＰＩＳは、標的核酸からクローニングされる核酸の上流末端を確立する。パッケージングシステムによるＰＩＳの認識は、ＰＩＳでのパッケージングの開始をもたらしてもよく、これは、標的核酸に及ぶ、ＰＩＳから下流の核酸のクローニングをもたらす。核酸のライブラリーは、標的核酸から複数の核酸をクローニングすることによって産生することができる。ゲノムライブラリーは、ゲノムから複数の核酸をクローニングすることによって産生することができる。
【００２３】
１．パッケージングシステム
核酸は、パッケージング開始部位（ＰＩＳ）でのパッケージングを開始することによって、標的核酸からクローニングすることができる。ＰＩＳは、ターミナーゼによって認識されてもよく、これは、部位特異的にまたはランダムに標的核酸に切れ目を入れてもよく、これは、カプシドの中に核酸を挿入してもよい。したがって、クローニングされた核酸は、カプシド中にパッケージすることができる。ターミナーゼは、２つのタンパク質を含んでもよく、これらは、パッケージングシステムが機能することを可能にするＡＴＰアーゼ活性を有していてもよい。
【００２４】
カプシドは、５〜１６０ｋｂのサイズであってもよい核酸をパッケージすることができてもよい。複数のカプシドは、それぞれ、核酸をパッケージすることができてもよく、カプシドによってパッケージされる核酸は、ほぼ同じサイズであってもよい。サイズ選択のそのような形態は、ＰＦＧＥ電気泳動と関連する非効率に対する主な改善である。さらに、カプシドの感染特性は、後の操作において、エレクトロポレーションよりも高い率で、パッケージされた核酸の導入を可能にすることができる。
【００２５】
使用されるパッケージングシステムは、真核生物または原核生物のものであってもよい。たとえば、システムは、表１に挙げられるバクテリオファージから選択することができる。
【００２６】
【表１】
パッケージングシステムはまた、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、またはエプスタイン−バーウイルスから選択することができる。
【００２７】
ａ．パッケージング開始部位
ＰＩＳは、パッケージング開始部位であってもよい。パッケージング開始部位の代表的な例は、バクテリオファージλ、Ｐ１、Ｐ７、Ｔ４、Ｔ７、Φ２９、またはＰ２２パッケージング開始部位を含むが、これらに限定されない。ＰＩＳは、ｐａｃ部位またはｃｏｓ部位であってもよい。ＰＩＳはまた、長末端反復などの真核生物ウイルスＰＩＳであってもよい。
【００２８】
ＰＩＳは、標的核酸の中に、ＰＩＳを含む第１の核酸を導入することによって、標的核酸の中に導入することができる。第１の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。第１の核酸はまた、転位性エレメントを含んでもよい。転位性エレメントは、ＰＩＳを含む核酸セグメントの側面に位置する１対の転位性末端を含んでもよい。転位性エレメントは、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｉｎｏｓ、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒを含むが、これらに限定されない、システムからの転位性末端を含んでもよい。核酸セグメントはまた、ベクターエレメントを含んでもよい。
【００２９】
第１の核酸は、ランダム方式または非ランダム方式のいずれかにおいて標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳを含む第１の核酸はまた、突然変異誘発を含むが、これに限定されない多くの標準的な分子生物学手法のいずれかによって、標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳを含む第１の核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、転位によって標的核酸の中に導入することができる。第１の核酸は、標的ＤＮＡの中への転位性エレメントの転位を可能にする任意の形態をしていてもよい。第１の核酸は、線状ＤＮＡまたは環状ＤＮＡの形態をしていてもよく、これは、スーパーコイル核酸またはリラックス核酸であってもよい。第１の核酸は、プラスミドの一部であってもよい。第１の核酸はまた、バクテリオファージを含むが、これに限定されない複製可能な遺伝子パッケージであってもよい。
【００３０】
トランスポサーゼは、標的核酸の中への第１の核酸の転位を触媒するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用することができる。転位は、ランダムに生じてもよく、その程度は、特定のトランスポゾンシステムに依存して異なっていてもよい。
【００３１】
転位は、たとえば、市販で入手可能な転位システムを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じてもよい。転位はまた、米国特許第５，９６５，４４３号、第５，９４８，６２２号、または第５，９２５，５４５号において開示される方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位については、標的核酸は、染色体ＤＮＡ、消化ＤＮＡ、剪断ＤＮＡ、サイズ特異的ＤＮＡ、および全ゲノムを含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。
【００３２】
転位はまた、トランスポサーゼを発現する宿主細胞の中に第１の核酸を導入することによってｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じてもよい。第１の核酸は、エレクトロポレーションおよび感染を含むが、これらに限定されない方法によって宿主細胞の中に導入することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ転位については、標的核酸は、レプリコンを含む、核酸の任意の形態であってもよい。レプリコンは、ベクターまたは染色体であってもよい。
【００３３】
ＰＩＳを含む第１の核酸はまた、標的核酸に第１の核酸をライゲーションすることによって、標的核酸の中に導入することができる。ライゲーションされた産物は、線状または環状であってもよい。標的核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位について上記に説明される核酸の形態を含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。標的核酸は、ランダム剪断および制限消化を含むが、これらに限定されない方法によって生成することができる。第１の核酸および標的核酸は、適合性の末端を有していてもよい。その代わりに、リンカーが使用することができる。
【００３４】
標的核酸は、ＨｉｎｄＩＩＩなどの第１の制限酵素を用いて消化されてもよく、これは、部分的であってもよい。標的核酸はまた、第２の制限酵素を用いて消化することができる。第１の核酸は、消化された標的核酸と適合性の末端を有していてもよい。第１の核酸および標的核酸をライゲーションした後に、ＰＩＳを含む、結果として生じる標的核酸は、ファージパッケージングのための基質としてもよい。
【００３５】
ＰＩＳは、標的核酸に固有のものであってもよく、または標的ＤＮＡ中に先在していてもよい。ＰＩＳはまた、ＤＮＡ切断によって標的核酸の中に導入することができる。切断は、ターミナーゼと標的核酸を接触させることによって行なわれてもよく、これは、ランダムな位置で標的核酸を切断してもよい。ターミナーゼは、ファージＰ２２からのなどのように、ファージターミナーゼであってもよく、これは、高形質導入Ｐ２２であってもよい。ターミナーゼは、ファージＰ２２のポリペプチドＧｐ３およびＧｐ２を含んでもよい。
【００３６】
ｂ．ベクターエレメント
ＰＩＳは、ベクターエレメントと共に標的核酸の中に導入することができる。ベクターエレメントは、ＰＩＳの下流または上流にあってもよい。下流ＰＩＳは、クローニングされた核酸中に含まれていてもよい。クローニングされた核酸中のベクターエレメントは、クローニングＤＮＡの、後の操作および増殖のために使用することができる。
【００３７】
（１）複製開始点
ベクターエレメントは、複製開始点であってもよい。複製開始点は、低コピー複製開始点であってもよい。低コピー複製開始点はまた、再編成を最小限にしながら、宿主細胞中のクローニングＤＮＡを維持するために使用することができる。低コピー複製開始点の代表的な例は、ｏｒｉＳである。
【００３８】
複製開始点はまた、高コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、より多量のクローニングＤＮＡを産生するために使用することができる。低コピー複製開始点の代表的な例は、ｏｒｉＶである。
【００３９】
ベクターエレメントはまた、高コピー複製開始点および低コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、誘発性プロモーターのコントロール下としてもよい。クローニングされた核酸は、低コピー複製開始点を使用して維持できるが、高コピー複製開始点の誘発によって多量に産生することができる。そのようなシステムは、Hradecnaら１９９８年およびWildら１９９８年によって記載され、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００４０】
（２）マーカー
ベクターエレメントはまた、選択可能マーカーまたは可視マーカーであってもよい。選択可能マーカーまたは可視マーカーは、クローニングＤＮＡを維持し、かつ操作するために使用することができる。マーカーの代表的な例は、ＡｍｐＲ、ＣａｍＲ、ＫａｎＲ、ｌａｃＺ、およびＧＦＰを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
（３）組み込み部位
ベクターエレメントはまた、組み込み部位であってもよい。組み込み部位は、相補的な組み込み部位を含む第２の核酸の中にクローニングされた核酸を組み込むことを可能にすることができる。第２の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。総合システムの使用は、いくつかの重要な利点を有する。クローニングされた核酸の、後の操作に必要とされる多くの配列が、第１の核酸の代わりに複製プラスミドベクター上に配置することができる。このことから、クローニングされた核酸をパッケージするためにカプシドを使用する場合に、より多くの標的核酸をクローニングすることが可能となる可能性がある。
【００４２】
組み込み部位および相補的な組み込み部位の例は、λシステムおよびＣｒｅ−ｌｏｘシステムを含むが、これらに限定されない。λファージが、Ｅ．ｃｏｌｉに感染する場合、それは、細胞を溶解して発達する可能性があり、または細菌染色体中の特異的なポイント、ａｔｔＢにおいて組み込むことによって、溶原菌を確立する可能性がある。組み込みは、λ上のａｔｔＰおよびａｔｔＢの間の部位特異的組換えによって媒介され、連続した染色体の中へのλの線状の挿入をもたらす。ａｔｔＰは、約２５０ｂｐ長であるが、ａｔｔＢは、わずか約２０ｂｐである。ファージｉｎｔ遺伝子の産物は、宿主因子ＩＨＦと共に、ａｔｔＰおよびａｔｔＢの間のクロスオーバー反応を触媒し、それによって組み込みを引き起こす。
【００４３】
第１の核酸は、ＰＩＳの下流にａｔｔＢを含んでもよく、第２の核酸は、複製可能であり、ａｔｔＰを含む。パッケージングを開始した後に、クローニングされたものは、複製可能な第２の核酸の中に組み込むことができる。同様の手法を用いて、ＤＮＡ断片は、Ｊａｎｕｓベクターの中に挿入された（Burlandら１９９３年）、これは、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００４４】
ｃ．λパッケージング
パッケージングシステムは、パッケージングを開始し終了するための特異的な部位を使用してもよい。正常なファージの発達において、ビリオン当たりのＤＮＡの長さは、頭部の容量によって直接決定されないので、λは「ヘッドフル」タイプのファージではない。代わりに、λは、パッケージングを開始し、かつ終了するために高度に特異的なｃｏｓ部位を使用する。これらの部位は、ターミナーゼによって切断されて、パッケージＤＮＡの末端に１２塩基突出（ｃｏｓＬおよびｃｏｓＲ）を残す。λの自然のローリングサークルパッケージング基質中で、ｃｏｓ部位は、頭部サイズによって決定されるフルパッケージングリミットよりも、共に近くに、間隔をおいて配置される。その結果として、頭部容量ではなくｃｏｓ部位間隔が、通常、ビリオンＤＮＡの長さを決定する。
【００４５】
ｄ．ヘッドフルパッケージング
「ヘッドフル」パッケージングシステムもまた使用することができる。ヘッドフルパッケージングシステムは、線状の連続移動方式において、ファージプロヘッドの空洞の中にクローニングされた核酸を供給し、それが、内部のＤＮＡが、進行を停止するのに十分な、内壁に対する圧力をかける限界に達するまで、頭部を拡張させてもよい。これは、頭部における立体構造変化を誘発してもよく、これは、入ってくるＤＮＡのエンドヌクレアーゼによる切断を活性化し、感染粒子を作製するためのファージ尾部の付着を可能にする。いっぱいの頭部は、狭いサイズ範囲内のＤＮＡ分子を含有してもよい。カプシドの容量は、パッケージＤＮＡに対する最大サイズの制限を設定してもよい。代表的なヘッドフルパッケージングシステムは、Ｐ１、Ｐ７、Ｔ４、ＫＶＰ４０、Ｐ２２、φ２９、およびＴ７を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
（１）Ｐ１
バクテリオファージＰ１およびＰ７は、１１０〜１１５ｋｂのヘッドフル容量を有する。パッケージング開始は、ｐａｃ部位で生じ、頭部がいっぱいになり、非特異的末端の切断が成されるまで続く。市販で入手可能な段階１ Ｐ１パッケージング抽出物またはｐａｃａｓｅ抽出物は、λのｃｏｓ部位に類似のｐａｃ部位でパッケージされるようにＤＮＡを切断してもよい。それは、ａｍ１０．１突然変異、Ｐ１遺伝子１０中のナンセンス突然変異を含有してもよい。それは、頭部および尾部のタンパク質を含むすべての後期ファージタンパク質合成を欠く。段階２抽出物は、頭部の中にＤＮＡをカプシド形成するファージパッケージングタンパク質を含有し、尾部を追加してもよい。それは、ｐａｃ−切断活性を欠く、遺伝子９のａｍ９．１６ナンセンス突然変異を含有してもよい。
【００４７】
パッケージング株はまた、２段階パッケージング反応のために構築することができる。パッケージング株構築のために、ナンセンス突然変異は、主な尾管タンパク質をコードするＴｕｂまたは主な尾鞘タンパク質をコードする遺伝子２２を含むが、これに限定されない主な尾部遺伝子のうち１つにおいて作り出すことができる。これにより、ｐａｃａｓｅ−頭部成熟／尾部欠乏段階１パッケージング抽出物をもたらしてもよい。段階２ｐａｃａｓｅ−頭部欠乏／尾部成熟株は、Ｐ１の主な頭部タンパク質をコードする遺伝子２３中にナンセンス突然変異を導入することによって、構築することができる。Ｐ１ゲノム内にＣａｍｒマーカーを置換することもまた望ましい可能性がある。
【００４８】
ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換えシステムは、Ｐ１パッケージクローニングされた核酸を環状にするために使用することができる。第１の核酸は、ｐａｃパッケージング開始配列の下流にｌｏｘＰ部位を含んでもよい。クローニングされた核酸の転位およびパッケージングの後に、Ｐ１頭部からはみ出たＤＮＡは、切り取られてもよく、第２のｌｏｘＰ組換え部位を含有する、λについて提唱されるようなリンカーは、この時、追加することができる。段階２パッケージング反応の間の尾部の追加に続いて、パッケージＤＮＡはＣｒｅ＋宿主の中に注入することができる。宿主細胞の中への注入に続いて、ＤＮＡは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる２つのファージｌｏｘＰ部位の間の組換えによって環状にすることができる。これは、環状のクローニングされた核酸が複製され、安定して維持されることを可能にすることができる。
【００４９】
（２）Ｔ４
バクテリオファージＴ４は、１６９ｋｂのゲノムサイズを有する、最大の、十分に特徴づけられたファージのうち１つである。Ｐ１およびＰ７のように、Ｔ４は、ヘッドフル方式においてそのＤＮＡをパッケージし、パッケージングメカニズムの構成要素は、徹底的に研究されてきた。λ、Ｐ１、およびＰ７と異なり、Ｔ４ ＤＮＡのパッケージングは、特異的な部位で開始しない。Ｔ４のためのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムが開発されてきた。Ｔ４ ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムは、外来ＤＮＡを、効率的にパッケージすることができ、１６０ｋｂの長さまでの大きなＤＮＡ断片をクローニングするのに適応させることができる。
【００５０】
Ｐ１およびＰ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングについて上記に記載される同様の方法は、Ｔ４パッケージクローンを環状にするために使用されるｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換えシステムを使用して、利用することができる。Ｔ４システムの１つの利点は、より大きな変異体およびより小さな変異体の両方の多くの頭部長変異体の同定であり、パッケージされるＤＮＡの量は、適宜、変えられる。特定の頭部長突然変異と組み合わせてパッケージング株を使用することは、クローニングされた核酸の可能なサイズ範囲を拡張するのに有益であると分かる可能性がある。
【００５１】
（３）ＫＶＰ４０
ＫＶＰ４０は、Ｔ４関連のものであると比較ゲノム学によって示された広い宿主範囲のビブリオファージである。それは、２４５ｋｂのゲノムサイズを有する、大きく、尾がある、二本鎖ＤＮＡファージである。このファージの遺伝的性質および生化学的活性に関して現在、ほとんど知られていないが、ＫＶＰ４０のゲノム配列および構成は、Ｔ４との広範囲な保存の領域を示す。最大の保存領域のうち１つは、ビリオン構造遺伝子を構成する遺伝子クラスター中にあり、それらのＤＮＡパッケージングメカニズムにおける類似性を同様に示唆する。これは、ＫＶＰ４０を、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングシステムの候補にする。
【００５２】
ＫＶＰ４０ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムの開発はこの拡張のために必要とされるだろう。主な構成要素が十分に特徴づけられているＴ４ ＤＮＡパッケージングについての知識の増加と共に、類似の株は、ＫＶＰ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング抽出物のために開発される可能性がある。推定上のターミナーゼ、頭部、および尾部に関連する遺伝子は既に同定されており、株構築のための可能な突然変異誘発標的を確実に提供するであろう。
【００５３】
ＫＶＰ４０の宿主範囲は、少なくとも８つのビブリオ種および１つのフォトバクテリウム種を含むが、それは、より望ましい宿主であるＥ．ｃｏｌｉに感染しない。Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのｏｍｐＫ遺伝子は、ＫＶＰ４０の宿主受容体として同定された外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードする。ＪＭ１０９などのＥ．ｃｏｌｉ株におけるｏｍｐＫ遺伝子の発現は、ＫＶＰ４０による感染を可能にする。
【００５４】
（４）Ｐ２２
バクテリオファージＰ２２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株に感染する可能性があるポドウイルスである。Ｐ２２は、大サブユニット（Ｇｐ２）および小サブユニット（Ｇｐ３）を含むターミナーゼを用いるヘッドフルメカニズムを使用して、約４２ｋｂと同じくらいのＤＮＡをパッケージする。ターミナーゼは、ｐａｃ部位またはｐａｃ様部位でＤＮＡに結合し、切断してもよく、次いで、ウイルスプロカプシドの中へのＤＮＡのＡＴＰ加水分解ベースの転座に関与してもよい。プロカプシドがいっぱいになるまで、ＤＮＡは、プロカプシドの中にパッケージすることができる。パッケージングの間に、カプシドシェルは広がり、立体構造変化を受けてもよい。パッケージングに続いて、ターミナーゼは、再び、パッケージＤＮＡの末端を切断してもよく、次いで、放出され、なお、切断された、非パッケージＤＮＡに付着してもよい。次いで、ターミナーゼは、新しいプロカプシドの中に挿入され、連続サイクルにおいて隣接標的核酸断片をパッケージするプロセスを続けてもよい。
【００５５】
（ａ）Ｐ２２突然変異体
Ｐ２２は、高形質導入Ｐ２２（Ｐ２２ＨＴ）などのＰ２２突然変異体であってもよい。Ｐ２２ＨＴ突然変異は、遺伝子３において生じてもよく、これは、突然変異体Ｇｐ３タンパク質をもたらしてもよい。Ｐ２２ＨＴは、ＨＴ１０５／１突然変異を持っていてもよい。Ｐ２２ＨＴターミナーゼによるパッケージングの開始は、明らかな配列特異性をほとんどまたはまったく有していなくてもよく、したがって、より低い特異性でＤＮＡを認識してもよい。ターミナーゼは、ランダムな位置でＤＮＡに結合し、切断してもよく、次いで、ウイルスプロカプシドの中へのＤＮＡのＡＴＰ加水分解ベースの転座に関与してもよい（図７）。Ｐ２２ＨＴによってパッケージされる標的核酸は、４６ｋｂであってもよい。
【００５６】
Ｐ２２突然変異体は、また所与の標的核酸に沿っての処理能力が増加していてもよい。突然変異体は、標的核酸から１０までのカプシドをパッケージすることができる可能性がある。Ｐ２２突然変異体もまた、Ｅ．ｃｏｌｉに感染することができる可能性がある。
【００５７】
（５）φ２９
φ２９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの株に感染できるバクテリオファージである。ファージは、扁長２０面体カプシドの内部に約３０ｋｂと同じくらいのＤＮＡを詰めてもよい。ＤＮＡは、頭部−尾部コネクター（Ｇｐ１０）、パッケージングＡＴＰアーゼ（Ｇｐ１６）、およびＲＮＡ分子の環（ｐＲＮＡ）を含むＡＴＰ依存性モーターによってプロカプシドの中に転座することができる。
【００５８】
（６）λパッケージングおよびＤｏｃ粒子
パッケージされる核酸は、まれに、間隔をおいて配置されるｃｏｓ部位を含有してもよい。パッケージングは、ｃｏｓ部位、ｃｏｓＬで始まってもよく、これは、切断されて、頭部の中に挿入される１２塩基突出を残す。ｃｏｓ部位は、標的核酸の末端にライゲーションされた第１の核酸によって、標的核酸の末端に存在していてもよい。パッケージングは、頭部がいっぱいになるまで、一方向に進んでもよい。ターミナーゼが、切断するための第２のｃｏｓ部位を見つけない場合、プロセスは、ＤＮＡが頭部から外にはみ出すと共に止まってもよい。はみ出たＤＮＡは、ＤＮアーゼＩなどのヌクレアーゼまたはＳａｕ３Ａなどの頻繁に切断する制限酵素によって非特異的に除去することができる。ヌクレアーゼがはみ出たＤＮＡを切断する位置は、ランダムであってもよい。
【００５９】
次いで、ファージ尾部を付着させて、λｄｏｃＬと呼ばれる、たった１つのｃｏｓ部位を有する粒子を産生してもよい。これらの粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉの中にそれらのＤＮＡを効率的に注入する可能性があるが、それらは、λ分子の右の末端に通常、見つけられる付着末端であるｃｏｓＲを欠くので、それは、細胞に入る際、効率的に環化しなくてもよい。λｄｏｃＬ粒子は、組み込みによって宿主細胞の中に核酸を導入するために使用することができる。尾部追加の代案として、第２のパッケージングが行なわれてもよい。ヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ抽出の後に、リンカーをライゲーションし、後の産物を再度パッケージし、形質移入し、クローンを選択することができる。
【００６０】
ｌｏｘＰシステムは、尾部追加の代案としてクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ環状化のために使用することができる。ｌｏｘＰ部位は、第１の核酸上のＰＩＳの下流に追加することができる。クローニングされた核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングによってサイズ選択され、抽出され、ｌｏｘＰ部位を含有するリンカーは、ライゲーションすることができる。クローンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏＣｒｅリコンビナーゼによって環状にされ、プラスミドとして安定して維持されるように、宿主細胞の中にエレクトロポレーションすることができる。
【００６１】
２．パッケージＤＮＡの単離
カプシド形成後に、パッケージＤＮＡは、カプシドを単離することによって回収することができる。カプシドは、等密度遠心分離もしくは速度遠心分離または差次的沈降を含むが、これらに限定されない方法によって単離することができる。カプシドはまた、アフィニティー精製によって単離することができ、これは、拡張されたカプシドの表面上に含有されるタンパク質のエピトープに特異的に結合することができる抗体を使用することによって行なわれてもよい。たとえば、カプシドタンパク質は、λファージのＤタンパク質であってもよい。
【００６２】
抗カプシドタンパク質抗体は、固体支持体に付着することができる。固体支持体は、ビーズ、微粒子、カラム、試験ストリップ、カートリッジ、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライドガラス、またはナイロン、ニトロセルロース、もしくは他の適した材料などの膜であってもよい。微粒子は、０．２μｍ〜７．０μｍのサイズであってもよい。微粒子はまた、ハプテン化することができる。微粒子はまた、少なくとも１つまたは２つの蛍光標識によって含浸させてもよい。微粒子はまた、約０．１μｍ未満のサイズの強磁性流体または磁性粒子を形成することができてもよい。微粒子はまた、ろ過によって収集可能、または除去可能である可能性がある。
【００６３】
パッケージＤＮＡは、フェノール抽出などによってカプシドから単離することができる。抽出に先立って、ＤＮアーゼＩなどのヌクレアーゼは、非パッケージＤＮＡまたは非標的ＤＮＡを消化するために使用することができる。フェノールは、カプシドを含む溶液に追加することができる。この混合物を遠心分離した後に、水相は、有機相から分離されてもよく、クロロホルムが追加することができる。この混合物を遠心分離した後に、水相は、有機相から分離することができる。単離ＤＮＡは、水相に冷エタノールを追加することによって、水相から濃縮され、その後、遠心分離が続けられてもよい。ＤＮＡは、１回または複数回、エタノールを用いて洗浄してもよく、水または緩衝液中に再懸濁することができる。フェノール−クロロホルム抽出は、少なくとも１回、繰り返することができる。
【００６４】
パッケージＤＮＡはまた、ＤＮＡ結合カラムを使用して、カプシドから単離することができる。たとえば、ＱＩＡＧＥＮラムダ手順（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａ）が使用することができる。非パッケージＤＮＡまたは非標的ＤＮＡは、ヌクレアーゼを用いて消化することができる。カプシドは、沈澱され、次いで、溶解することができる。単離ＤＮＡは、カラムに結合させ、洗浄してもよい。ＤＮＡは、カラムから溶出され、イソプロパノールなどのアルコールを用いて溶液から沈澱することができる。ＤＮＡは、水または緩衝液中に再懸濁することができる。
【００６５】
カプシドが、カプシドタンパク質アフィニティーカラムを使用して単離される場合、カプシドは、溶出され、溶解することができる。パッケージＤＮＡは、上記に記載されるように、カラムベースのシステムを使用して、フェノール抽出することができ、または単離することができる。
【００６６】
単離ＤＮＡの末端は、フィルインされてもよく、これは、ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって行なわれてもよい。アダプター挿入断片は、ＤＮＡの末端にライゲーションされてもよく、これは、環状ＤＮＡをもたらしてもよい。ライゲーション反応は、アダプター挿入断片のそれぞれの末端が、単離ＤＮＡ分子の末端にライゲーションするのに十分な濃度のアダプター挿入断片を含んでもよい。アダプター挿入断片の末端は、リン酸化されなくてもよく、これは、アダプター挿入断片がモノマー環を形成するのを予防してもよい。ライゲーション反応は、油中水型エマルション中で行なわれてもよい。エマルションの水性液滴は、環状にされる約１つの単離ＤＮＡ分子を含有してもよい。
【００６７】
アダプター挿入断片は、２つのアダプタープライマー結合部位を含んでもよく、これは、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌなどのように、反対の向きを有していてもよい。結合部位は、１０〜５０または１６〜２５塩基対長であってもよい。アダプタープライマー挿入断片はまた、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を支援することができるプライミング領域を含んでもよい。それらの部位に結合してもよいプライマーは、国際公開第２００７／１４５６１２ Ａ１号または米国特許第７，１１５，４００号もしくは第７，３２３，３０５号において記載されるような配列を有していてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。たとえば、リーチングプライマー（ｒｅａｃｈｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）は、プライマーＡおよびプライマーＢであってもよい。アダプター挿入断片はまた、４５４配列決定システム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）上でうまく見つけるために使用することができる、短い（たとえば４ヌクレオチド）「配列決定キー」配列を含んでもよい。アダプター挿入断片はまた、セパレーターエレメントを含んでもよく、これは、知られている配列を有していてもよい。配列は、ローリングサークル増幅のためのプライミング部位を含んでもよい。配列はまた、単離ＤＮＡの２つの末端を同定するために使用することができる。単離ＤＮＡの、後の配列決定の間に、セパレーターエレメントの配列は、全単離ＤＮＡが配列決定されたことを示してもよい。アダプター挿入断片は、複製開始点を含んでもよく、かつさらにマーカーを含んでもよい。
【００６８】
アダプター挿入断片はまた、平滑末端切断制限酵素などの制限酵素のための認識配列を含んでもよく、この配列は、２つのアダプタープライマー結合部位の間に位置してもよい。単離ＤＮＡにアダプター挿入断片をライゲーションする際に、結果として生じるＤＮＡは、アダプタープライマー結合部位の間でＤＮＡを切断することができる制限酵素を用いて消化することができる。次いで、アダプター末端は、結果として生じる線状ＤＮＡの末端にライゲーションすることができる。
【００６９】
アダプター挿入断片はまた、「リーチング」制限酵素認識部位を含んでもよい。認識部位は、プライマー結合部位に隣接していてもよい。アダプター挿入断片はまた、２つのアダプタープライマー結合部位の側面に位置するリーチング制限酵素認識部位を含んでもよく、認識部位は、制限酵素認識部位から離れて、逆方向に向けられてもよい。リーチング制限酵素は、クラスＩＩＳ酵素であってもよく、これは、Ｆｏｋ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、Ｅａｒ Ｉ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、ＳｆａＮ Ｉ、またはＴｔｈ１１１ Ｉであってもよい。リーチング制限酵素はまた、クラスＩＩＩ制限酵素であってもよく、これは、ＥｃｏＰ１５ Ｉ、ＥｃｏＰ Ｉ、Ｈｉｎｆ ＩＩＩ、またはＳｔｙＬＴ Ｉであってもよい。単離ＤＮＡにアダプター挿入断片をライゲーションする際に、リーチング制限酵素は、単離ＤＮＡ内の位置でなどのように、認識部位から離れた位置でＤＮＡを切断してもよい。アダプター挿入断片はまた、特異的な結合メンバーを含んでもよく、これは、ビオチンであってもよい。
【００７０】
単離ＤＮＡに挿入断片をライゲーションした後に、結果として生じる環状ＤＮＡは、リーチング制限酵素を用いて消化されてもよく、これは、線状ＤＮＡ断片をもたらしてもよく、これは、それぞれの末端上に、単離ＤＮＡの末端に対応し得る配列を含んでもよい。ＤＮＡ断片は、環状にされてもよく、これは、ＤＮＡ断片の末端をフィルインし、次いで、ライゲーションを行なうことによって行なわれてもよい。
【００７１】
アダプタープライマー結合部位を含むアダプター末端はまた、単離ＤＮＡの末端にライゲーションすることができる。アダプター断片は、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を支援することができるプライミング領域を含んでもよく、４５４配列決定システム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）上でうまく見つけるために使用することができる、短い（たとえば４ヌクレオチド）「配列決定キー」配列を含んでもよい。部位に結合することができるプライマーは、プライマーＡまたはプライマーＢであってもよい。アダプター末端は、オリゴヌクレオチド配列Ｙを有する第１のアダプター末端であってもよい。アダプター末端はまた、オリゴヌクレオチド配列Ｚを有する第２のアダプター末端であってもよい。アダプター末端は、固体支持体に核酸を固定するための手段を含んでもよい。
【００７２】
アダプター末端は、縮重２塩基一本鎖３’突出を有していてもよい。縮重は、２つの突出塩基が、ランダムであってもよいこと（つまり、それらは、それぞれ、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣであってもよいこと）を意味し得る。アダプター末端は、単離ＤＮＡのリーチング制限酵素切断末端へのアダプターの、方向性をもつライゲーションを強く促進するために設計することができる。アダプター末端は、多量のモル過剰のアダプター末端（１５：１アダプター末端：単離ＤＮＡ比）を含有してもよいライゲーション反応において単離ＤＮＡ末端と組み合わせられてもよく、これは、単離ＤＮＡ末端の利用を最大限にしてもよく、単離ＤＮＡコンカテマーを形成する可能性を最小限にしてもよい。アダプター末端は、リン酸化されなくてもよく、これはアダプター末端ダイマーの形成を最小限にしてもよい。ライゲーションに続いて、ライゲーション産物は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの使用などによって、フィルイン反応の使用によって修復することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、またはＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【００７３】
アダプター末端は、米国特許第７，３２３，３０５号において記載されるように設計されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。アダプター末端は、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネート結合を含んでもよい。アダプター末端はまた、特異的な結合メンバーを含んでもよく、これは、ビオチンであってもよい。特異的な結合メンバーは、第１のアダプター末端に追加されてもよく、これは、５’末端であってもよく、特異的な結合メンバーは、第２のアダプター末端に追加されなくてもよい。第１および第２のアダプター末端の単離ＤＮＡへのライゲーションに続いて、単離ＤＮＡは、２つの第１のアダプター末端、１つの第１のアダプター末端および１つの第２のアダプター末端、ならびに２つの第２のアダプター末端を含んでもよい。アダプター末端ライゲーション単離ＤＮＡは、ストレプトアビジンなどの第１のアダプター末端の特異的な結合メンバーのための特異的な結合パートナーに結合された固体基質と接触させてもよい。固体基質は磁性ビーズであってもよい。
【００７４】
固体基質とアダプター末端ライゲーション単離ＤＮＡを接触させる際に、少なくとも１つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡのみが結合するであろう。１つの第１のアダプター末端のみを含む単離ＤＮＡは、単離ＤＮＡの一方の末端で結合するであろうが、２つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡは、２つの末端で結合するであろう。非結合単離ＤＮＡは、固体基質から洗い流することができる。固体基質は、低塩類（「融解」または変性）溶液にさらされてもよく、これは、１つの第１のアダプター末端のみを含む単離ＤＮＡのみを放出してもよい。２つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡは、固体基質に結合したままであろう。固体基質から放出される単離一本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅および配列決定においてなどのように、さらなる使用のために収集することができる。
【００７５】
３．パッケージＤＮＡの増殖
カプシド形成後に、クローニングされた核酸はまた、適切な宿主細胞に感染させるために使用することができる。宿主細胞において、クローニングされた核酸は、環状にされ、増殖することができる。次いで、クローニングされた核酸は、ＤＮＡの単離のために標準的な手法を使用して単離することができる。クローニングされた核酸のＩＳ混入を予防するために、宿主株は、ＩＳエレメントを含んでいなくてもよい。
【００７６】
クローニングされた核酸が環状ではない場合、それは、カプシドから単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて環状にすることができる。環状化は、線状ＤＮＡの末端と適合性の１つもしくは複数のリンカーのライゲーションまたは組換えを含むが、これらに限定されない方法によって行なわれてもよい。
【００７７】
環状核酸は、ｏｒｉおよび選択可能マーカーまたは可視マーカーを含んでもよい。環状核酸は、細菌などの宿主細胞中で増殖させることができる核酸であってもよく、細菌人工染色体（ＢＡＣ）であってもよい。環状核酸は、宿主細胞の中に形質転換することができる。
【００７８】
４．単離ＤＮＡの増幅
単離ＤＮＡは、ＰＣＲなどによって増幅することができる。単離ＤＮＡが環状にされている場合、それは、アダプタープライマー結合部位の間に位置する部位で、ＤＮＡを切断することができる制限酵素を用いてそれを消化することによって線状にすることができる。
【００７９】
ａ．エマルションＰＣＲ
アダプタープライマー結合部位を含む単離ＤＮＡは、ビーズエマルションＰＣＲ増幅（ｅｍＰＣＲ）の使用などによってＰＣＲ増幅することができる。ｅｍＰＣＲは、米国特許第７，３２３，３０５号および国際公開第２００７／１４５６１２号において記載されるように行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。単離ＤＮＡは、一本鎖であってもよく、アダプタープライマーにアニールすることができる。アダプタープライマーは、固体支持体に付着させてもよく、これは、球状ビーズであってもよい。固体支持体は、複数の結合アダプタープライマーを含んでもよい。固体支持体は、水性反応混合物中に懸濁され、次いで、油中水型エマルション中にカプセル化することができる。エマルションは、分散した水相微小滴を含んでもよく、これは、６０〜１００μｍの直径であってもよく、耐熱性の油相によって包まれてもよい。それぞれの微小滴は、増幅反応溶液（つまり核酸増幅のために必要な試薬）を含有してもよい。増幅は、ＰＣＲ反応ミックス（ポリメラーゼ、塩類、ｄＮＴＰｓ）ならびに１対のアダプタープライマー（プライマーＡおよびプライマーＢ）を含んでもよい。微小滴集団のサブセットはまた、ＤＮＡ鋳型を含むＤＮＡビーズを含有してもよい。微小滴のこのサブセットは、増幅のための基本となってもよい。このサブセット内にないマイクロカプセルは、鋳型ＤＮＡを有していなくてもよく、増幅に参加しなくてもよい。増幅技術は、ＰＣＲであってもよく、ＰＣＲプライマーは、非対称ＰＣＲを行なうために８：１または１６：１の比で存在する（つまり、１つの第２のプライマーに対して８または１６の第１のプライマー）。
【００８０】
単離ＤＮＡは、ビーズに固定することができるオリゴヌクレオチド（プライマーＢ）にアニールすることができる。サーモサイクリングの間に、一本鎖ＤＮＡ鋳型およびビーズ上の固定Ｂプライマーの間の結合は切断される可能性があり、これは、周囲のマイクロカプセル化溶液の中に鋳型を放出する可能性がある。増幅溶液は、追加の溶液相プライマーＡおよびプライマーＢを含有してもよい。結合反応速度が、固定プライマーよりも溶液相プライマーについてより速いので、溶液相Ｂプライマーは、鋳型の相補的ｂ’領域に容易に結合してもよい。初期ＰＣＲにおいて、Ａ鎖およびＢ鎖の両方は、等しく十分に増幅することができる。
【００８１】
中期増幅（つまり、サイクル１０および３０の間）によって、Ｂプライマーは、消耗されてもよく、これは、指数関数的増幅を停止させてもよい。次いで、反応は、非対称増幅に入ってもよく、単位複製配列集団は、Ａ鎖が優位を占めるようになってもよい。後期相増幅において、３０〜４０のサイクル後に、非対称増幅は、溶液中でＡ鎖の濃度を増加させてもよい。過剰Ａ鎖は、ビーズ固定Ｂプライマーにアニールし始める。次いで、耐熱性ポリメラーゼは、単位複製配列の固定ビーズ結合Ｂ鎖を合成するために、鋳型としてＡ鎖を用いる。
【００８２】
終期増幅において、熱サイクリングを続けると、ビーズ結合プライマーへのさらなるアニーリングが強いられる可能性がある。溶液相増幅はこの段階で最小限となる可能性があるが、固定Ｂ鎖の濃度は増加する可能性がある。次いで、エマルションは、破壊されてもよく、固定産物は、変性によって（熱、ｐＨなどによって）一本鎖にされてもよく、これは、相補的Ａ鎖を取り出してもよい。Ａプライマーは、固定鎖のＡ’領域にアニールされてもよく、固定鎖に、配列決定酵素および任意の必要な補助タンパク質が載せられてもよい。次いで、ビーズは、米国特許第６，２７４，３２０号、第６２５８，５６８号、および第６，２１０，８９１号において記載されるものなどのように、認識されるピロリン酸技術を使用して配列決定されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００８３】
（１）捕捉ビーズへのアダプタープライマーの結合
アダプタープライマーは、捕捉ビーズに付着することができる。プライマーは、当技術分野において知られている任意の方式において固体支持体捕捉ビーズに付着することができる。多数の方法は、微視的ビーズなどの固体支持体にＤＮＡを付着させるために当技術分野において存在する。ビーズへのＤＮＡの共有化学結合は、ホスホアミデート結合を通してＤＮＡ上の５’−リン酸をアミノコート捕捉ビーズに結合するために、水溶性カルボジイミドなどの標準的なカップリング剤の使用によって成し遂げることができる。他の代案は、同様の化学作用を使用して、第１に特異的なオリゴヌクレオチドリンカーをビーズにカップルし、次いで、ＤＮＡをビーズ上のリンカーに結合するためにＤＮＡリガーゼを使用することである。ビーズにオリゴヌクレオチドをつなぐための他の結合化学作用は、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）およびその誘導体の使用を含む。そのような方法において、オリゴヌクレオチドの一方の末端は、固体支持体と共有結合を形成する反応基（アミド基など）を含有してもよく、リンカーの他方の末端は、固定されるオリゴヌクレオチドと結合することができる第２の反応基を含有する。オリゴヌクレオチドは、共有結合によってＤＮＡ捕捉ビーズに結合することができる。しかしながら、キレート化または抗原抗体複合体などの非共有結合もまた、ビーズにオリゴヌクレオチドをつなぐために使用することができる。
【００８４】
制限酵素部位からのオーバーラップ末端またはバクテリオファージラムダベースのクローニングベクターの「付着末端」などのように、ＤＮＡ断片の末端でユニークな配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーが、利用することができるが、平滑末端ライゲーションもまた有益に使用することができる。これらの方法は、米国特許第５，６７４，７４３号において詳細に記載される。ビーズを固定するために使用される方法は、本発明の方法におけるステップの全体にわたって、固定オリゴヌクレオチドを結合させるために続けてもよい。
【００８５】
それぞれの捕捉ビーズは、単離ＤＮＡの一部を認識する（つまり、相補的である）複数のプライマーを有するように設計されてもよく、単離ＤＮＡは、したがって、捕捉ビーズにハイブリダイズされる。単離ＤＮＡのクローン増幅を成し遂げるために、１つのユニークな単離ＤＮＡのみがいずれか１つの捕捉ビーズに付着してもよい。
【００８６】
本明細書において使用されるビーズは、任意の好都合なサイズであってもよく、任意の数の知られている材料から製造することができる。そのような材料の例は、無機物、天然ポリマー、および合成ポリマーを含む。これらの材料の特定の例は、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、グラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニールおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンと架橋されたポリスチレン、またはその他同種のもの（たとえばMerrifield、Biochemistry １９６４年、３巻、１３８５〜１３９０頁において記載される）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御孔ガラス、金属、架橋デキストラン（たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ（商標））アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、および当業者らに知られている固相支持体を含む。捕捉ビーズは、約２５〜４０μｍの直径のＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズであってもよい。
【００８７】
（２）乳化
付着した一本鎖鋳型核酸を有する捕捉ビーズは、熱安定性の油中水型エマルションとして乳化することができる。エマルションは、当技術分野において知られている任意の適した方法によって形成することができる。エマルションを作り出すための１つの方法が下記に記載されるが、エマルションを作製するための任意の方法が使用することができる。これらの方法は、当技術分野において知られており、補助剤法、向流法、逆流法、回転ドラム法、および膜法を含む。そのうえ、マイクロカプセルのサイズは、構成要素の流量および速度を変動させることによって調整することができる。たとえば、液滴追加において、滴のサイズおよび送達の総時間は変動させてもよい。エマルションは、マイクロリットル当たり約３，０００ビーズの密度で、ある程度の密度のビーズ「マイクロリアクター」を含有してもよい。
【００８８】
エマルションは、増幅溶液中で鋳型付着ビーズを懸濁することによって生成することができる。本明細書において使用されるように、「増幅溶液」という用語は、鋳型ＤＮＡの増幅を行なうのに必要な、試薬の十分な混合物を意味し得る。
【００８９】
ビーズ／増幅溶液混合物は、液滴に追加して、生物学的適合油（たとえば軽鉱物油、Ｓｉｇｍａ）の回転混合物にし、乳化させてもよい。使用される油は、１つまたは複数の生物学的適合乳化安定剤で補足することができる。これらの乳化安定剤はＡｔｌｏｘ ４９１２、Ｓｐａｎ ８０、および他の認識され、市販で入手可能な適した安定剤を含んでもよい。形成される液滴は、５ミクロン〜５００ミクロン、約５０〜３００ミクロン、または１００〜１５０ミクロンのサイズに及んでもよい。
【００９０】
マイクロリアクターのサイズの制限はない。マイクロリアクターは、必要とされる増幅の程度にとって十分な増幅試薬を包含するのに十分に大きいものであってもよい。マイクロリアクターはまた、それぞれが、ＤＮＡライブラリーのメンバーを含有するマイクロリアクターの集団が、従来の実験装置（たとえばＰＣＲサーモサイクリング装置、試験管、インキュベーター、およびその他同種のもの）によって増幅することができるように、十分に小さいものであってもよい。
【００９１】
マイクロリアクターの最適サイズは、１００〜２００ミクロンの直径としてもよい。このサイズのマイクロリアクターは、１０ｍｌ未満の容量のマイクロリアクターの懸濁液中で、約６００，０００メンバーを含むＤＮＡライブラリーの増幅を可能にすることができる。たとえば、ＰＣＲが選ばれた増幅方法である場合、１０ｍｌは、９６本の管の容量を有する一般的なサーモサイクラーの９６本の管に一致するであろう。６００，０００マイクロリアクターの懸濁液は、１ｍｌ未満の容量を有していてもよい。１ｍｌ未満の懸濁液は、従来のＰＣＲサーモサイクラーの約１０本の管において増幅することができる。６００，０００マイクロリアクターの懸濁液はまた、０．５ｍｌ未満の容量を有していてもよい。
【００９２】
（３）増幅
カプセル化後に、鋳型核酸は、転写ベースの増幅システム（Kwoh D.ら、Proc.Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８６巻：１１７３頁（１９８９年）；Gingeras T. R.ら、ＰＣＴ特許出願国際公開第８８／１０３１５号；Davey,C.ら、欧州特許出願公開第３２９，８２２号；Miller, H. I.ら、ＰＣＴ特許出願国際公開第８９／０６７００号および「ｒａｃｅ」（Frohman, M.A.、In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press、NY（１９９０年））および「片側ＰＣＲ」（Ohara,O.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８６巻、５６７３〜５６７７頁（１９８９年））を含むＤＮＡ増幅の任意の適した方法によって増幅することができる。なお、「ジオリゴヌクレオチド」増幅、等温増幅（Walker,G. T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年））、およびローリングサークル増幅（米国特許第５，７１４，３２０号において考察される）などのそれほど一般的ではない方法が、本発明において使用することができる。
【００９３】
ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲによって行なわれてもよい。ＰＣＲは、ＰＣＲに必要な試薬をすべて含むＰＣＲ溶液を用いて、ビーズに結合された単離ＤＮＡをカプセル化することによって行なわれてもよい。次いで、ＰＣＲは、当技術分野において知られている任意の適したサーモサイクリングレジメンにエマルションをさらすことによって成し遂げることができる。３０および５０サイクルの間のまたは約４０サイクルの増幅が行なわれてもよい。増幅手順に続いて、１つまたは複数のハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルが増幅サイクルに続いてあってもよい。１０および３０サイクルの間のまたは約２５サイクルのハイブリダイゼーションおよび伸長が行なわれてもよい。鋳型ＤＮＡは、典型的に、鋳型ＤＮＡの少なくとも２００万〜５０００万のコピーまたは約１０００万〜３０００万のコピーがビーズ当たりに固定されるまで増幅することができる。
【００９４】
（４）エマルションの破壊およびビーズ回収
単離ＤＮＡの増幅に続いて、エマルションは、「破壊」することができる（「解乳化」とも呼ばれる）。米国特許第５，９８９，８９２号においてなどのように、エマルションを破壊するための多くの方法があり、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。エマルションは、さらなる油を追加して、エマルションを２つの相に分離することによって破壊することができる。次いで、油相は、除去されてもよく、適した有機溶媒（たとえばヘキサン）が追加することができる。混合後に、油／有機溶媒相は除去される。このステップは数回繰り返することができる。最後に、ビーズ上の水層は除去することができる。次いで、ビーズは、有機溶媒／アニーリング緩衝混合液を用いて洗浄してもよく、次いで、アニーリング緩衝液中で再び洗浄してもよい。適した有機溶媒は、メタノール、エタノール、およびその他同種のものなどのアルコールを含む。
【００９５】
次いで、増幅された単離ＤＮＡ含有ビーズは、たとえば知られている技術による配列決定反応における使用のために水溶液中に再懸濁することができる（Sanger, F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.７５巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７年）；Maxam,A. M. & Gilbert、W. Proc Natl Acad Sci USA７４巻、５６０〜５６４頁（１９７７年）；Ronaghi, M.ら、Science２８１巻、３６３巻、３６５巻（１９９８年）；Lysov,I.ら、Dokl Akad Nauk SSSR３０３巻、１５０８〜１５１１頁（１９８８年）；Bains W. & Smith G. C. J.TheorBiol１３５巻、３０３〜３０７頁（１９８８年）；Drnanac, R.ら、Genomics４巻、１１４〜１２８頁（１９８９年）；Khrapko,K. R.ら、FEBS Lett２５６巻、１１８〜１２２頁（１９８９年）；Pevzner P. A. J Biomol Struct Dyn７巻、６３〜７３頁（１９８９年）；Southern,E. M.ら、Genomics１３巻、１００８〜１０１７頁（１９９２年）を参照されたい）。ビーズは、ピロリン酸ベースの配列決定反応において使用されてもよく（たとえば米国特許第６，２７４，３２０号、第６２５８，５６８号、および第６，２１０，８９１号において記載される、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる）、ＰＣＲ産物の第２の鎖は除去されてもよく、配列決定プライマーは、ビーズに結合された一本鎖単離ＤＮＡにアニールすることができる。
【００９６】
第２の鎖は、ＮａＯＨ、低イオン（たとえば塩）強度、または熱処理などの一般的に知られている任意の数の方法を使用して融解することができる。この融解ステップに続いて、ビーズはペレットにされてもよく、上清は捨てられてもよい。ビーズは、アニーリング緩衝液中に再懸濁されてもよく、配列決定プライマーは、追加されてもよく、標準的なアニーリングサイクルを使用して、ビーズ付着一本鎖鋳型にアニールすることができる。
【００９７】
（５）ビーズの精製
ビーズ上の増幅ＤＮＡはまた、直接ビーズ上でまたは異なる反応槽中で配列決定することができる。ＤＮＡは、反応槽にビーズを移し、ＤＮＡを配列決定反応にかけることによって、直接ビーズ上で配列決定することができる（たとえばピロリン酸配列決定またはＳａｎｇｅｒ配列決定）。その代わりに、ビーズは、単離することができ、ＤＮＡは、それぞれの各ビーズから取り出され、配列決定することができる。いずれの場合においても、配列決定ステップは、それぞれの個々のビーズについて行なわれてもよい。ビーズはまた、米国特許第７，３２３，３０５号において記載される方法によって精製されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００９８】
ｂ．ブリッジングＰＣＲ
環状であってもよく、アダプター挿入断片を含んでもよい単離ＤＮＡは、「ブリッジング」ＰＣＲを使用してＰＣＲ増幅することができる。ブリッジングＰＣＲは、米国特許第７，１１５，４００号において記載される方法によって行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。増幅に先立って、単離ＤＮＡは、２つのプライマー結合部位の間の部位を切断する制限酵素を用いてそれを消化することによって線状にすることができる。単離ＤＮＡの一方の末端（５’末端）の配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｙを有していてもよく、「コロニー」プライマーＸの配列と同一の配列を含んでもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、知られている配列であってもよく、可変長であってもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、少なくとも５ヌクレオチド長、５〜１００ヌクレオチド長、または約２０ヌクレオチド長であってもよい。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列Ｙ中に存在してもよい。
【００９９】
配列Ｙの反対側の単離ＤＮＡの末端（３’末端）に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｚを有していてもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、知られている配列であってもよく、可変長であってもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、少なくとも５ヌクレオチド長、５〜１００ヌクレオチド長、または約２０ヌクレオチド長であってもよい。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列Ｚ中に存在してもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、それがコロニープライマーＸとハイブリダイズするように設計されてもよく、それが、本明細書においてＹ’と呼ばれるオリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的となるように設計することができる。核酸鋳型のそれぞれ５’および３’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、鋳型の末端の先端に位置する必要はない。たとえば、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、核酸鋳型のそれぞれ５’および３’末端（もしくは末端）にまたはその近くに位置してもよいが（たとえば、５’および３’末端の０〜１００ヌクレオチド以内）、それらは、核酸鋳型の５’または３’末端からさらに離れて（たとえば１００ヌクレオチドを超えて）位置してもよい。したがって、配列ＹおよびＺが、どちらかの側にある、つまり、増幅される核酸配列の側面に位置するという条件で、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは核酸鋳型内の任意の位置に位置してもよい。
【０１００】
本明細書において使用されるような「核酸鋳型」はまた、二本鎖形態の、増幅され、配列決定される核酸を含む実体を含む。核酸鋳型が二本鎖形態をしている場合、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、鎖のうち１つのそれぞれ５’および３’末端に含有される。他の鎖は、ＤＮＡの塩基対合則により、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺを含有する鎖に相補的であり、したがって、５’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚ’および３’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ’を含有する。
【０１０１】
本明細書において使用されるような「コロニープライマー」は、相補的配列にハイブリダイズし、特異的なポリメラーゼ反応を開始することができるオリゴヌクレオチド配列を含む実体を指し得る。コロニープライマーを含む配列は、それが、その相補的配列との最大のハイブリダイズ活性およびあらゆる他の配列への非常に低い非特異的ハイブリダイズ活性を有するように選ばれる。コロニープライマーとして使用される配列は、任意の配列を含むことができるが、5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG（配列番号１）または5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC（配列番号２）を含んでもよい。コロニープライマーは、５〜１００塩基長または１５〜２５塩基長とすることができる。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドがプライマー中に存在してもよい。１つまたは２つの異なるコロニープライマーは、本発明の方法において核酸コロニーを生成するために使用することができる。
【０１０２】
本明細書において使用されるような「縮重プライマー配列」は、上述の核酸断片の配列と無関係の任意の核酸断片にハイブリダイズすることができる、短いオリゴヌクレオチド配列を指し得る。したがって、そのような縮重プライマーは、鋳型へのハイブリダイゼーションが生じるのに（１つまたは複数の）核酸鋳型におけるオリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺの存在を必要としないが、オリゴヌクレオチド配列ＸまたはＹを含有する鋳型にハイブリダイズするための縮重プライマーの使用は除外されない。しかしながら、明白に、本発明の増幅方法における使用のために、縮重プライマーは、どちらかの側のまたは増幅される核酸配列の側面に位置する部位で鋳型中の核酸配列にハイブリダイズしなければならない。
【０１０３】
本明細書において使用されるような「固体支持体」は、たとえばラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、およびシリコンウェーハなどの、核酸が共有結合することができる任意の固体表面を指し得る。
【０１０４】
本明細書において使用されるような「固体支持体に核酸を付着させるための手段」は、化学的に修飾可能な官能基を含む任意の化学的または非化学的な付着方法を指し得る。「付着」は、共有結合によるまたは不可逆的受動的吸着を介してのまたは分子の間のアフィニティーを介しての、固体支持体上の核酸の固定に関する（たとえばビオチン化分子によるアビジンコート表面上の固定）。付着は、それが、ＤＮＡ変性条件下で水または水性緩衝液を用いて洗浄することによって除去され得ない十分な強度のものでなければならない。
【０１０５】
本明細書において使用されるような「化学的に修飾可能な官能基」は、たとえばリン酸基、カルボキシ部分もしくはアルデヒド部分、チオール基、またはアミノ基などの基を指し得る。
【０１０６】
本明細書において使用されるような「核酸コロニー」は、核酸鎖の多数のコピーを含む分散したエリアを指し得る。核酸鎖に対する相補鎖の多数のコピーもまた、同じコロニー中に存在してもよい。コロニーを構成する核酸鎖の多数のコピーは、固体支持体上に一般に固定され、一本鎖または二本鎖の形態をしていてもよい。本発明の核酸コロニーは、使用される条件に依存して異なるサイズおよび密度で生成することができる。コロニーのサイズは、０．２μｍ〜６μｍまたは０．３μｍ〜４μｍであってもよい。本発明の方法における使用のための核酸コロニーの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。より高い密度、たとえば、１００，０００／ｍｍ２〜１，０００，０００／ｍｍ２および１，０００，０００／ｍｍ２〜１０，０００，０００／ｍｍ２が達成することができると考えられる。
【０１０７】
核酸コロニーは、単離ＤＮＡから生成することができる。それぞれが複数の異なる単離ＤＮＡのうち１つを表わす複数のコロニーもまた生成することができる。
【０１０８】
増幅される核酸を含む複数の単離ＤＮＡが生成することができ、核酸はそれらの５’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙおよび３’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚを含有し、さらに、（１つまたは複数の）核酸は、５’末端に、固体支持体に（１つまたは複数の）核酸を付着させるための手段を有する。複数の単離ＤＮＡは、オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズし、５’末端に、固体支持体にコロニープライマーを付着させるための手段を持っていてもよい複数のコロニープライマーＸと混合される。複数の単離ＤＮＡおよびコロニープライマーは、固体支持体に共有結合してもよい。
【０１０９】
多数の２つの異なるコロニープライマーＸは、複数の核酸鋳型と混合することができる。コロニープライマーＸの配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｚが、コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、オリゴヌクレオチド配列Ｙが、コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じであるようなものであってもよい。
【０１１０】
オリゴヌクレオチド配列Ｚはまた、オリゴヌクレオチド配列Ｙ（Ｙ’）に相補的であってもよく、複数のコロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列であってもよい。
【０１１１】
複数のコロニープライマーＸは、縮重プライマー配列を含んでもよく、複数の単離ＤＮＡは、増幅される核酸を含んでもよく、それぞれ５’および３’末端にオリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺを含有していなくてもよい。
【０１１２】
単離核酸の５’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、任意の配列および任意の長さであってもよく、配列Ｙとして本明細書において示される。オリゴヌクレオチドの適した長さおよび配列は、十分に知られている方法を使用して、選択することができ、当技術分野をにおいて立証されている。たとえば、増幅される核酸のそれぞれの末端に付着されるオリゴヌクレオチド配列は、５および１００ヌクレオチドの間の長さの通常、比較的短いヌクレオチド配列である。核酸の３’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、任意の配列および任意の長さとすることができ、配列Ｚとして本明細書において示される。オリゴヌクレオチドの適した長さおよび配列は、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法を使用して、選択することができる。たとえば、増幅される核酸のそれぞれの末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、５および１００ヌクレオチドの間の長さの通常、比較的短いヌクレオチド配列である。
【０１１３】
オリゴヌクレオチド配列Ｚの配列は、それがコロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができるようなものである。オリゴヌクレオチド配列Ｙの配列は、それがコロニープライマーＸのうち１つと同じであるようなものとしてもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、オリゴヌクレオチド配列Ｙ（Ｙ’）に相補的であってもよく、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である。
【０１１４】
オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、当技術分野において標準的もしくは従来のものである技術を使用して調製されてもよく、または商業的供給源から購入することができる。
【０１１５】
本発明の単離ＤＮＡを産生する場合、さらなる望ましい配列は、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法によって導入することができる。そのようなさらなる配列は、たとえば、制限酵素部位またはある核酸タグを含み、所与の核酸鋳型配列の増幅産物を同定することを可能にする。他の望ましい配列は、フォールドバックＤＮＡ配列（一本鎖にされた場合にヘアピンループまたは他の第２の構造を形成する）、たとえば、核酸ポリメラーゼによって認識されるプロモーターＤＮＡ配列などの、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を指示する「コントロール」ＤＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるオペレーターＤＮＡ配列を含む。
【０１１６】
増幅される複数の核酸配列がある場合、オリゴヌクレオチドＹおよびＺの付着は、同じまたは異なる反応において実行することができる。
【０１１７】
単離ＤＮＡが一度調製されたら、それは、本明細書において記載される方法において使用される前に増幅することができる。そのような増幅は、たとえば、発現ベクターの中に鋳型核酸を挿入し、かつ適した生物学的宿主においてそれを増幅するまたはＰＣＲによってそれを増幅することによって、十分に知られており、当技術分野をにおいて立証されている方法を使用して実行することができる。しかしながら、本発明の方法は、核酸鋳型の多数のコピーが、核酸鋳型の単一コピーから生成される核酸コロニーにおいて産生されるのを可能にするので、この増幅ステップは、必須ではない。
【０１１８】
単離ＤＮＡの５’末端は、固体支持体に核酸鋳型を共有結合させるための手段を有するように修飾することができる。そのような手段は、たとえば、たとえばリン酸基、カルボキシ部分もしくはアルデヒド部分、チオール基、またはアミノ基などの化学的に修飾可能な官能基とすることができる。チオール基、リン酸基、またはアミノ基は、核酸の５’−修飾のために使用することができる。
【０１１９】
コロニープライマーは、当技術分野において標準的なまたは従来のものである技術を使用して調製することができる。一般に、本発明のコロニープライマーは、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法によって生成される合成オリゴヌクレオチドであり、または商業的供給源から購入することができる。
【０１２０】
１つまたは２つの異なるコロニープライマーＸは、任意の核酸配列を増幅するために使用することができる。コロニープライマーＸの５’末端は、固体支持体にコロニープライマーを共有結合させるための手段を有するように修飾することができる。共有結合は、上記に記載されるように、化学的に修飾可能な官能基であってもよい。コロニープライマーは、たとえば制限エンドヌクレアーゼ部位またはそれぞれリボザイム切断部位のような他のタイプの切断部位などのさらなる所望の配列を含むように設計することができる。さらなる配列は、フォールドバックＤＮＡ配列（一本鎖にされた場合にヘアピンループまたは他の第２の構造を形成する）、たとえば、核酸ポリメラーゼによって認識されるプロモーターＤＮＡ配列などの、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を指示する「コントロール」ＤＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるオペレーターＤＮＡ配列を含む。
【０１２１】
５’末端による支持体へのコロニープライマーＸの固定は、単離ＤＮＡの３’末端に含有される相補的なオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが一度起こったら、コロニープライマーがポリメラーゼによる鎖伸長のために利用可能となるように、その３’末端を支持体から遠くにしてもよい。
【０１２２】
一度、本発明の単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの両方が合成されたら、それらは、それらが、固体支持体に付着している場合に、付着された単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの適切な密度が得られるように、適切な割合で共に混合される。混合物中のコロニープライマーの割合は、単離ＤＮＡの割合よりも高くてもよい。単離ＤＮＡに対するコロニープライマーの比は、コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが固体支持体に固定される場合に、固体支持体の全体または明示されるエリアにほぼ一定の密度で位置する複数のコロニープライマーを含むコロニープライマーの「ローン（ｌａｗｎ）」が、コロニープライマーのローン内に間隔を置いて個々に固定される１つまたは複数の単離ＤＮＡと共に、形成されるようなものであってもよい。
【０１２３】
単離ＤＮＡは、一本鎖形態で提供することができる。しかしながら、それはまた、全体としてまたは部分的に、支持体への付着を可能にするように一方の５’末端または両方の５’末端が修飾された二本鎖形態で提供することができる。その場合、付着プロセスが完了した後に、たとえば放出される鎖を洗浄する前に９４℃まで加熱することによって、当技術分野において知られている手段によって鎖を分離することが望まれる。二本鎖分子の両方の鎖が表面と反応し、両方とも付着する場合、結果は、一方の鎖のみが付着し、１回の増幅ステップが行なわれる場合と同じである可能性がある。言いかえれば、二本鎖単離ＤＮＡの両方の鎖が付着した場合において、両方の鎖は、必然的に、互いに近くに付着し、一方の鎖のみを付着させ、１回の増幅ステップを行なう結果と区別不能である。したがって、一本鎖および二本鎖単離ＤＮＡは、表面に付着され、コロニー生成のために適した鋳型核酸を提供するために使用することができる。
【０１２４】
個々のコロニープライマーおよび個々の単離ＤＮＡの間の距離（したがって、コロニープライマーおよび単離ＤＮＡの密度）は、コロニープライマーおよび支持体に固定される単離ＤＮＡの濃度を変えることによってコントロールすることができる。コロニープライマーの密度は、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２、少なくとも１０ｆｍｏｌ／ｍｍ２、３０〜６０ｆｍｏｌ／ｍｍ２としてもよい。単離ＤＮＡの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。１００，０００／ｍｍ２〜１，０００，０００／ｍｍ２および１，０００，０００／ｍｍ２〜１０，０００，０００／ｍｍ２のより高い密度が達成することができる。
【０１２５】
付着した単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの密度のコントロールは、支持体の表面上の核酸コロニーの最終密度をコントロールすることを可能にすることができる。これは、本発明の方法によれば、１つの核酸コロニーが、コロニープライマーが、固体支持体上の適した位置に存在するという条件で、１つの単離ＤＮＡの付着の結果として生じ得るといった事実によるものである。単一コロニー内の単離ＤＮＡの密度もまた、付着したコロニープライマーの密度をコントロールすることによってコントロールすることができる。
【０１２６】
コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが一度、適切な密度で固体支持体上に固定されたら、核酸コロニーは、それぞれのコロニーが、もとの固定された単離ＤＮＡおよびその相補的配列の多数のコピーを含むように、共有結合した単離ＤＮＡ上で適切な数の増幅のサイクルを実行することによって生成することができる。増幅の１回のサイクルは、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のステップからなり、これらのステップは、ＰＣＲについて当技術分野において十分に知られている試薬および条件を使用して、一般に行なわれる。
【０１２７】
典型的な増幅反応は、固体支持体、付着した単離ＤＮＡ、およびコロニープライマーをプライマーハイブリダイゼーションを誘発する条件にかけること、たとえば、それらを約６５℃の温度にかけることを含む。これらの条件下で、単離ＤＮＡの３’末端のオリゴヌクレオチド配列Ｚは、固定されたコロニープライマーＸにハイブリダイズするであろう、またヌクレオシド三リン酸分子または任意の他のヌクレオチド前駆体、たとえば修飾ヌクレオシド三リン酸分子の供給を加えての、プライマー伸長を支援するための条件および試薬、たとえば、約７２℃の温度、核酸ポリメラーゼ、たとえばＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ分子もしくは逆転写酵素分子（つまりＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）またはＲＮＡポリメラーゼの存在下において、コロニープライマーは、単離ＤＮＡに相補的なヌクレオチドの追加によって伸長するであろう。
【０１２８】
核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、耐熱性細菌からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ、ＶＥＮＴ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼなど）、またはその遺伝子改変誘導体（ＴａｑＧｏｌｄ、ＶＥＮＴｅｘｏ、Ｐｆｕ ｅｘｏ）であってもよい。ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の組み合わせを使用して、ＤＮＡコロニーの増幅を生じさせることもできる。コロニープライマー伸長のために使用される核酸ポリメラーゼは、ＰＣＲ反応条件、つまり、加熱および冷却のサイクルの繰り返し下で安定性である可能性があり、使用される変性温度、普通、約９４℃で安定性である可能性がある。
【０１２９】
ヌクレオシド三リン酸分子は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、たとえばＤＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰであってもよく、またはリボヌクレオシド三リン酸、たとえばｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰであってもよい。ヌクレオシド三リン酸分子は、自然発生または非自然発生のものであってもよい。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションおよび伸長のステップの後に、支持体および付着した核酸を変性条件にさらす上で、２つの固定された核酸が存在するであろう、第１は、最初の固定された単離ＤＮＡであり、第２は、それに相補的な核酸であり、固定されたコロニープライマーＸのうち１つから伸長する。もとの固定された単離ＤＮＡおよび形成された固定された伸長コロニープライマーの両方は、次いで、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなるサイクルに支持体をかける上で、さらなる回の増幅を開始することができる。そのようなさらなる回の増幅は、単離ＤＮＡの多数の固定されたコピーおよびその相補的配列を含む核酸コロニーをもたらすであろう。
【０１３１】
単離ＤＮＡの最初の固定は、鋳型核酸が、全長の単離ＤＮＡ内で離れて位置するコロニープライマーとハイブリダイズすることができるのみであることを意味する。したがって、形成される核酸コロニーの境界は、最初の単離ＤＮＡが固定されるエリアに対して、比較的局所的なエリアに制限されている。明らかに、単離ＤＮＡおよびその相補体のより多くのコピーが、増幅のさらなる回、つまりハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなる回を実行することによって、一度、合成されたら、次いで、形成されるコロニーの境界が、最初の単離ＤＮＡが固定されるエリアに対して、なお、比較的局所的なエリアに制限される可能性があるが、生成されている核酸コロニーの境界は、さらに拡張することができるであろう。
【０１３２】
単一の固定された単離ＤＮＡからの核酸コロニーを生成することができ、これらのコロニーのサイズは、単離ＤＮＡがかけられる増幅の回数を変えることによってコントロールすることができる。したがって、それぞれの固定された単離ＤＮＡの場所内に十分な数の固定されたコロニープライマーがあるという条件で、固体支持体の表面上に形成される核酸コロニーの数は、支持体に最初に固定される単離ＤＮＡの数に依存する。コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが固定された固体支持体が、プライマーのローン内に間隔を置いて固定された単離ＤＮＡと共に適切な密度で、固定されたコロニープライマーのローンを含んでいる可能性があるのは、この理由のためである。
【０１３３】
核酸コロニーのそのようないわゆる「オートパターニング」は、単離ＤＮＡがもともと固定される密度を調節することによって密度をコントロールすることができるという事実によりより高い密度の核酸コロニーが得ることができるという点において、他の方法に対して利点を有している可能性がある。そのような方法は、したがって、たとえば、支持体の特定の局所的なエリア上に特異的なプライマーを特異的に整列させ、次いで、プライマーの同じ局所的なエリア上に単離ＤＮＡを含有する特定のサンプルを配置することによってコロニー形成を開始することによって制限されない。先行技術方法を使用して整列することができるコロニーの数、たとえば国際公開第９６／０４４０４号（Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において開示されるものは、したがって、特異的なプライマーエリアが最初のステップにおいて整列され得る密度／間隔によって制限される。
【０１３４】
単離ＤＮＡの最初の密度、したがって、単離ＤＮＡから結果として生じる核酸コロニーの密度をコントロールすることができることによって、形成される核酸コロニーのサイズ、さらに個々のコロニー内の単離ＤＮＡの密度をコントロールすることができることと共に、高密度の個々の核酸コロニーを十分に大きなサイズの、十分に多くの増幅配列を含有する固体支持体上で産生することができ、核酸コロニーについて行なわれる後の分析またはモニタリングを可能にする、最適の状況に達することができる。
【０１３５】
一度、核酸コロニーが生成されたら、たとえばコロニー視覚化または配列決定などの、さらなるステップを行なうことが望ましい可能性がある。たとえば、特定の核酸断片の一部または全部の存在または不在について、生成されるコロニーをスクリーニングすることが必要である場合、たとえば、コロニー視覚化は、必要とされる可能性がある。この場合、特定の核酸断片を含有する１つまたは複数のコロニーは、対象とする核酸断片に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを設計することによって検出することができる。
【０１３６】
そのような核酸プローブは、蛍光基、ビオチンを含有する実体（たとえば、蛍光基を用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションによって検出することができる）、放射標識（当技術分野において十分に知られており、立証されている方法によって核酸プローブの中に取り込むことができ、たとえばシンチレーション液とのインキュベーションによって放射活性を検出することによって検出することができる）、もしくは染料または他の染色剤などの検出可能な実体を用いて標識してもよい。
【０１３７】
核酸プローブはまた、非標識であってもよく、核酸ポリメラーゼを用いる多くの標識ヌクレオチドの取り込みのためのプライマーとして作用するように設計することができる。次いで、取り込まれた標識、したがって核酸コロニーの検出を実行することができる。
【０１３８】
次いで、核酸コロニーは、ハイブリダイゼーションのために調製することができる。そのような調製は、コロニーを構成する核酸鋳型のすべてまたは一部分が、一本鎖形態で存在するように、コロニーの処理を含んでもよい。これは、たとえば、コロニー中の任意の二本鎖ＤＮＡの熱変性によって達成することができる。その代わりに、コロニーは、鋳型核酸中の配列の二本鎖形態に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて処理することができる。したがって、エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺ中に含有される配列または単離ＤＮＡ中に存在する他の配列に特異的であってもよい。消化後に、コロニーは、二本鎖ＤＮＡ分子が分離されるように、加熱され、コロニーは、固定されていない鎖を除去するために洗浄されて、したがって、コロニー中に付着した一本鎖ＤＮＡを残す。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションのためのコロニーの調製の後に、標識プローブまたは非標識プローブは、次いで、その特異的なＤＮＡ配列とのプローブのハイブリダイゼーションのための適切な条件下でコロニーに追加してもよい。
【０１４０】
次いで、プローブは、熱変性によって除去されてもよく、所望の場合、第２の核酸のための特異的なプローブが、ハイブリダイズされ、検出することができる。これらのステップは、所望されるだけ繰り返することができる。
【０１４１】
次いで、核酸コロニーにハイブリダイズされる標識プローブは、適切な検出デバイスを含む機器を使用して検出することができる。蛍光標識のための検出システムは、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラであってもよく、これは、拡大デバイス、たとえば顕微鏡に任意選択で連結することができる。そのような技術を使用して、並行して、多くのコロニーを同時にモニターすることが可能である。たとえばＣＣＤカメラおよび１０×または２０×対物レンズを有する顕微鏡を使用すると、１ｍｍ２および４ｍｍ２の間の表面に対してコロニーを観察することが可能であり、これは、１００００および２０００００コロニーの間のコロニーを並行してモニターすることに対応する。
【０１４２】
生成されるコロニーをモニターするための代替方法は、コロニーで覆われる表面をスキャンすることである。たとえば、１００００００００個までのコロニーを同時に整列することができ、全表面に対してＣＣＤカメラを用いて写真を撮ることによってモニターすることができるシステムを使用することができる。このように、１００００００００個までのコロニーを短時間でモニターすることができることを理解することができる。
【０１４３】
表面上の蛍光の検出および定量化を可能にする任意の他のデバイスもまた、本発明の核酸コロニーをモニターするために使用することができる。たとえば、蛍光画像装置または共焦点顕微鏡を使用することができる。標識が放射性である場合、放射活性検出システムが必要とすることができる。
【０１４４】
単離ＤＮＡの配列は、任意の適切な固相配列決定技術を使用することによって決定することができる。たとえば、本発明において使用することができる配列決定の１つの技術は、「配列決定プライマー」と本明細書において時に呼ばれる適切なプライマーを、配列決定される核酸鋳型とハイブリダイズすること、プライマーを伸長させること、およびプライマーを伸長させるために使用されるヌクレオチドを検出することを含む。プライマーを伸長させるために使用される核酸は、さらなるヌクレオチドが、成長している核酸鎖に追加される前に、検出されてもよく、したがって、１塩基ずつのｉｎ ｓｉｔｕ核酸配列決定を可能にする。
【０１４５】
取り込まれるヌクレオチドの検出は、プライマー伸長反応において１つまたは複数の標識ヌクレオチドを含むことによって容易にすることができる。任意の適切な検出可能な標識、たとえば蛍光体、放射標識などが使用することができる。蛍光標識が使用することができる。同じまたは異なる標識が、それぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用することができる。標識は蛍光体であり、同じ標識が、それぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用される場合、それぞれのヌクレオチド取り込みは、特定の波長で検出されるシグナルの累積的な増加を提供してもよい。異なる標識が使用される場合、これらのシグナルは、異なる適切な波長で検出することができる。所望の場合、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドの混合物が提供される。
【０１４６】
配列決定される単離ＤＮＡへの適切な配列決定プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、核酸鋳型は、一本鎖形態をしていてもよい。核酸コロニーを構成する核酸鋳型が二本鎖形態で存在する場合、これらは、当技術分野において十分に知られている方法を使用して、たとえば変性、切断などによって、一本鎖単離ＤＮＡを提供するために処理することができる。
【０１４７】
単離ＤＮＡにハイブリダイズされ、プライマー伸長に使用される配列決定プライマーは、たとえば１５〜２５ヌクレオチド長の短いオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマーの配列は、それらが、配列決定される単離ＤＮＡの一部にハイブリダイズするように設計されてもよく、ストリンジェントな条件下であってもよい。配列決定のために使用されるプライマーの配列は、核酸コロニーを生成するために使用されるコロニープライマーの配列と同じまたは同様の配列を有していてもよい。配列決定プライマーは、溶液または固定された形態で提供することができる。
【０１４８】
一度、配列決定プライマーが、単離ＤＮＡおよび配列決定プライマーを、当技術分野において十分に知られている方法によって決定される適切な条件にかけることによって、配列決定される単離ＤＮＡにアニールされたら、プライマー伸長は、たとえば、核酸ポリメラーゼおよび少なくともいくつかが、標識形態で提供されるヌクレオチドの供給および適したヌクレオチドが提供される場合に、プライマー伸長に適した条件を使用して、行なわれてもよい。
【０１４９】
それぞれのプライマー伸長ステップ後に、後のステップに干渉する可能性がある、取り込まれていないヌクレオチドを除去するために、洗浄ステップが含まれていてもよい。一度、プライマー伸長ステップが行なわれたら、核酸コロニーは、標識ヌクレオチドが伸長プライマーの中に取り込まれたかどうかを決定するために、モニターすることができる。次いで、プライマー伸長ステップは、伸長プライマーの中に取り込まれる次のおよび後のヌクレオチドを決定するために、繰り返することができる。
【０１５０】
適切な標識、たとえば蛍光または放射活性の検出および定量化を可能にする任意のデバイスが配列決定に使用することができる。標識が蛍光である場合、拡大デバイスに任意選択で付着されたＣＣＤカメラが使用することができる。実際に、配列決定のために使用されるデバイスは、増幅核酸コロニーをモニターするための、上記に記載されるデバイスと同じであってもよい。
【０１５１】
検出システムは、プライマー伸長のそれぞれのステップの後にそれぞれのコロニーに取り込まれるヌクレオチドの数および性質を決定するために、分析システムと組み合わせて使用することができる。この分析は、それぞれのプライマー伸長ステップ直後に実行されてもよくまたは記録されたデータを使用して後に実行されてもよく、所与のコロニー内の核酸鋳型の配列を決定することを可能にする。
【０１５２】
決定されている配列が未知の場合、所与のコロニーに適用されるヌクレオチドは、次いで、分析の全体にわたって繰り返される選ばれた順、たとえばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰで適用することができる。しかしながら、決定されている配列が知られており、たとえば、知られている配列からの配列中に小さな差異が存在するかどうかを分析するために、再度配列決定されている場合、配列決定プロセスは、知られている配列に従って選ばれる適切な順で、それぞれのステップで、ヌクレオチドを追加することによって、より速く成することができる。所与の配列との差異は、したがって、プライマー伸長の特定の段階での、あるヌクレオチドの取り込みの欠如によって検出される。
【０１５３】
固体支持体へのコロニープライマーおよび核酸鋳型の付着は、支持体が、核酸増幅反応の間にかけられてもよい温度、たとえば、約１００℃までの温度、たとえば約９４℃で耐熱性であってもよい。付着は、共有結合であってもよく、米国特許第７，１１５，４００号において記載されるように成し遂げることができ、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１５４】
５．単離ＤＮＡの配列決定
配列決定は、国際公開第２００７／１４５６１２号もしくは国際公開第０５００３３７５または米国特許第７，３２３，３０５号もしくは第７，１１５，４００号において記載される方法によって行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。機械は、Ｒｏｃｈｅ（４５４）ＧＳ ＦＬＸ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析機器配列決定プライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であってもよい。
【０１５５】
たとえば、ピロリン酸配列決定が使用することができる。この技術は、Hyman、１９８８年Anew method of sequencing DNA. Anal Biochem.１７４巻：４２３〜３６頁およびRonaghi、２００１年Pyrosequencingsheds light on DNA sequencing. Genome Res１１巻：３〜１１頁において記載されるように、ＤＮＡ合成の間に放出されるピロリン酸（Ｐｐｉ）の検出に基づく。
【０１５６】
酵素反応のカスケードにおいて、可視光は、取り込まれるヌクレオチドの数に比例して生成し得る。カスケードは、無機Ｐｐｉが、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みと共に放出することができる核酸重合反応を用いて始まってもよい。放出されるＰｐｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換されてもよく、これは、ルシフェラーゼにエネルギーを提供して、ルシフェリンを酸化してもよく、光を生成してもよい。追加されるヌクレオチドが知られているので、鋳型の配列は決定される可能性がある。固相ピロリン酸配列決定は、３つの酵素システムにおいて固定されたＤＮＡを用いる。シグナル対ノイズ比を増加させるために、自然ｄＡＴＰは、ｄＡＴＰαＳと交換することができる。ｄＡＴＰαＳは、２つの異性体（ＳｐおよびＲｐ）の混合物であってもよい。ピロリン酸中の純粋２’−デオキシアデノシン−５’−Ｏ’−（１−チオ三リン酸）Ｓｐ−異性体は、読み取り長の２倍まで、実質的により長い読み取りを可能にするために、配列決定において使用することができる。
【０１５７】
ピロリン酸ベースの配列決定は、ヌクレオチド三リン酸の存在下において、単離ＤＮＡおよび伸長プライマーをポリメラーゼ反応にかけることによって行なわれてもよく、それによって、ヌクレオチド三リン酸は、それが、標的位置における塩基に相補的である場合、取り込まれるようになり、ピロリン酸（ＰＰｉ）を放出するにすぎないであろう。ヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々の一定分量にまたは同じサンプル−プライマー混合物に引き続いて追加される。ＰＰｉの放出は、次いで、どのヌクレオチドが取り込まれるかを示すために検出される。
【０１５８】
配列産物の領域は、単離ＤＮＡの領域に配列決定プライマーをアニールすることおよびＤＮＡポリメラーゼおよび知られているヌクレオチド三リン酸、つまり、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはこれらのヌクレオチドのうち１つの類似体と配列決定プライマーを接触させることによって、決定することができる。配列は、下記に記載されるように、配列反応副産物を検出することによって決定することができる。
【０１５９】
配列プライマーは、それが、増幅核酸鋳型の領域に特異的にアニールすることができる限り、任意の長さまたは塩基組成とすることができる。配列決定プライマーのための特定の構造は、それが、増幅鋳型核酸上の領域に特異的にプライムすることができる限り、必要とされない。配列決定プライマーは、特徴づけられる配列およびアンカープライマーにハイブリダイズすることができる配列の間にある鋳型の領域に相補的であってもよい。配列決定プライマーは、配列産物を形成するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長される。伸長は、１つまたは複数のタイプのヌクレオチド三リン酸および所望の場合、補助結合タンパク質の存在下において行なわれる。
【０１６０】
ｄＮＴＰの取り込みは、配列決定副産物の存在についてアッセイすることによって決定することができる。配列決定産物のヌクレオチド配列はまた、ｄＮＭＰが、伸長配列プライマーの中に取り込まれる時に、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から放たれる無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を測定することによって決定することができる。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）技術（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と称される配列決定のこの方法は、溶液（液相）中でまたは固相技術として行なわれてもよい。ＰＰｉベースの配列決定方法は、たとえば国際公開第ＷＯ９８１３５２３Ａ１号，Ronaghiら、１９９６年Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁、Ronaghiら、１９９８年Science２８１巻：３６３〜３６５頁（１９９８年）、および米国特許出願第２００１／００２４７９０号において一般に記載され、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。たとえば米国特許第６，２１０，８９１号および第６，２５８，５６８号もまた参照されたい。これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１６１】
これらの条件下で放出されるピロリン酸は、酵素で（たとえばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の生成によって）検出することができる。そのような方法は、電気泳動の必要性および可能性として危険な放射標識の使用を回避しながら、ヌクレオチドを所与の標的位置において同定することおよびＤＮＡを簡単にかつ急速に配列決定することを可能にする。
【０１６２】
ＰＰｉは、多くの異なる手法によって検出されてもよく、様々な酵素法は、以前に記載されている（たとえばReevesら、１９６９年Anal. Biochem.２８巻：２８２〜２８７頁；Guilloryら、１９７１年Anal. Biochem.３９巻：１７０〜１８０頁；Johnsonら、１９６８年Anal.Biochem. 15:２７３頁；Cookら、１９７８年Anal. Biochem. 91：５５７〜５６５頁、およびDrakeら、１９７９年Anal.Biochem. 94：１１７〜１２０頁を参照されたい）。
【０１６３】
ポリメラーゼによるｄＮＴＰの取り込みの結果として放たれるＰＰｉは、たとえばＡＴＰスルフリラーゼを使用して、ＡＴＰに変換することができる。この酵素は、硫黄代謝に関与するとして同定された。硫黄は、還元形態および酸化形態の両方において、植物および動物の成長のための、必須の無機栄養素である（たとえば、SchmidtおよびJager、１９９２年Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.４３巻：３２５〜３４９頁を参照されたい）。植物および微生物の両方において、硫酸の活発な取り込みの後に硫化物への還元が続く。硫酸は、利用可能な細胞の還元剤に比べて非常に低い酸化／還元電位を有するので、同化における最初のステップは、ＡＴＰ依存性反応を介してのその活性化を必要とする（たとえばLeyh、１９９３年Crit.Rev. Biochem. Mol. Biol. 28：５１５〜５４２頁を参照されたい）。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；ＥＣ ２．７．７．４）は、無機硫酸（ＳＯ４−２）の代謝における最初の反応を触媒する。たとえば、RobbinsおよびLipmann、１９５８年J.Biol. Chem.２３３巻：６８６〜６９０頁；HawesおよびNicholas、１９７３年Biochem. J.１３３巻：５４１〜５５０頁を参照されたい）。この反応において、ＳＯ４−２は、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）に活性化される。
【０１６４】
ＡＴＰスルフリラーゼは、Saccharomyces cerevisiae（たとえばHawesおよびNicholas、１９７３年Biochem.J.１３３巻：５４１〜５５０頁を参照されたい）、Penicillium chrysogenum（たとえばRenostoら、１９９０年J. Biol.Chem.２６５巻：１０３００〜１０３０８頁を参照されたい）、ラット肝臓（たとえばYuら、１９８９年Arch. Biochem. Biophys.２６９巻：１６５〜１７４頁を参照されたい）、および植物（たとえばShawおよびAnderson、１９７２年Biochem.J.１２７巻：２３７〜２４７頁；Osslundら、１９８２年Plant Physiol.７０巻：３９〜４５頁を参照されたい）などのいくつかの供給源から高度に精製されてきた。そのうえ、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物（たとえばLeyhら、１９９２年J.Biol. Chem.２６７巻：１０４０５〜１０４１０頁；SchwedockおよびLong、１９８９年Mol. Plant Microbe Interaction２巻：１８１〜１９４頁；LaueおよびNelson、１９９４年J.Bacteriol.１７６巻：３７２３〜３７２９頁を参照されたい）、真核生物（たとえばCherestら、１９８７年Mol. Gen. Genet.２１０巻：３０７〜３１３頁；MountainおよびKorch、１９９１年Yeast７巻：８７３〜８８０頁；Fosterら、１９９４年J.Biol. Chem.２６９巻：１９７７７〜１９７８６頁を参照されたい）、植物（たとえばLeustekら、１９９４年Plant Physiol.１０５巻：８９７〜９０２１６頁を参照されたい）、および動物（たとえばLiら、１９９５年J.Biol. Chem.２７０巻：２９４５３〜２９４５９頁を参照されたい）からクローニングされてきた。酵素は、特定の供給源に依存して、ホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである（たとえばLeyhおよびSuo、１９９２年J.Biol. Chem.２６７巻：５４２〜５４５頁を参照されたい）。
【０１６５】
耐熱性スルフリラーゼを使用することができる。耐熱性スルフリラーゼは、たとえばArchaeoglobus種またはPyrococcus種から得られてもよく、耐熱性スルフリラーゼの配列は、データベース受入番号０２８６０６、受入番号Ｑ９ＹＣＲ４、および受入番号Ｐ５６８６３で入手可能である。
【０１６６】
ＡＴＰスルフリラーゼは、多くの異なる適用、たとえば高濃度のＡＴＰでのＡＤＰのバイオルミノメトリック検出（たとえばSchultzら、１９９３年Anal. Biochem.２１５巻：３０２〜３０４頁を参照されたい）、ＤＮＡポリメラーゼ活性の継続的なモニタリング（たとえばNyrbn、１９８７年Anal.Biochem.１６７巻：２３５〜２３８頁を参照されたい）、およびＤＮＡ配列決定（たとえばRonaghiら、１９９６年Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁；Ronaghiら、１９９８年Science２８１巻：３６３〜３６５頁；Ronaghiら、１９９８年Anal.Biochem.２６７巻：６５〜７１頁を参照されたい）に使用されてきた。
【０１６７】
いくつかのアッセイが、前のＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために開発されてきた。比色モリブドリシスアッセイは、リン酸検出に基づくものであってもよいのに対して（たとえばWilsonおよびBandurski、１９５８年J. Biol. Chem.２３３巻：９７５〜９８１頁を参照されたい）、継続的な分光光度モリブドリシスアッセイは、ＮＡＤＨ酸化の検出に基づくものであってもよい（たとえばSeubertら、１９８３年Arch.Biochem. Biophys.２２５巻：６７９〜６９１頁；Seubertら、１９８５年Arch. Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）。後のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要としてもよい。さらに、いくつかの放射性アッセイもまた文献において記載されている（たとえばDaleyら、１９８６年Anal.Biochem.１５７巻：３８５〜３９５頁を参照されたい）。たとえば、あるアッセイは、３２Ｐ標識ＡＴＰから放出される３２ＰＰｉの検出に基づくものであり（たとえばSeubertら、１９８５年Arch.Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）、他のアッセイは、［３５Ｓ］標識ＡＰＳへの３５Ｓの取り込みに基づき（このアッセイはまた、カップリング酵素として、精製ＡＰＳキナーゼをも必要とする；たとえばSeubertら、１９８３年Arch.Biochem. Biophys.２２５巻：６７９〜６９１頁を参照されたい）、第３の反応は、３５標識ＡＰＳからの３５ＳＯ４−２の放出に依存する（たとえばDaleyら、１９８６年Anal.Biochem.１５７巻：３８５〜３９５頁を参照されたい）。
【０１６８】
逆ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出については、継続的な分光光度アッセイ（たとえばSegelら、１９８７年MethodsEnzymol.１４３巻：３３４〜３４９頁を参照されたい）、バイオルミノメトリックアッセイ（たとえばBalharryおよびNicholas、１９７１年Anal.Biochem.４０巻：１〜１７頁を参照されたい）、３５ＳＯ４−２放出アッセイ（たとえばSeubertら、１９８５年Arch.Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）、または３２ＰＰｉ取り込みアッセイ（たとえばOsslundら、１９８２年PlantPhysiol.７０巻：３９〜４５頁を参照されたい）が使用することができる。
【０１６９】
ＡＴＰスルフリラーゼによって産生されるＡＴＰは、光を生成するために、酵素反応を使用して加水分解することができる。光放出化学反応（つまり化学発光）および生物学的反応（つまり生物発光）は、様々な代謝物質の高感度測定のために分析生化学において広く使用される。生物発光反応において、光の放出をもたらす化学反応は、酵素触媒することができる。たとえば、ルシフェリン−ルシフェラーゼシステムは、ＡＴＰの特異的なアッセイを可能にし、細菌ルシフェラーゼ−オキシドリダクターゼシステムは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをモニタリングするために使用することができる。両システムは、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの産生または利用を含むカップル反応の手段によって、多数の物質の分析まで拡張されてきた（たとえばKricka、１９９１年Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin.Chem.３７巻：１４７２〜１２８１頁を参照されたい）。
【０１７０】
新しい試薬の開発は、ＡＴＰ（たとえばLundin、１９８２年Applicationsof firefly luciferase In; Luminescent Assays（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（たとえばLovgrenら、Continuousmonitoring of NADH-converting reactions by bacterial luminescence. J. Appl.Biochem.４巻：１０３〜１１１頁を参照されたい）の濃度に比例した、安定性の光放出を得ることを可能にしてきた。そのような安定性の光放出試薬を用いると、知られている量のＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの追加によって終点アッセイをし、個々のアッセイを較正することが可能である。さらに、安定性の光放出システムはまたＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ変換システムの継続的なモニタリングを可能にする。
【０１７１】
ＡＴＰを光に変換するための適した酵素は、ルシフェラーゼ、たとえば昆虫ルシフェラーゼを含む。ルシフェラーゼは、触媒作用の最終産物として光を産生する。最もよく知られている光放出酵素は、ホタル、Photinus pyralis（甲虫目）の酵素である。対応する遺伝子は、クローニングされ、細菌（たとえばde Wetら、１９８５年Proc.Natl. Acad. Sci. USA８０巻：７８７０〜７８７３頁を参照されたい）および植物において（たとえばOwら、１９８６年Science２３４巻：８５６〜８５９頁を参照されたい）ならびに昆虫（たとえばJhaら、１９９０年FEBSLett.２７４巻：２４〜２６頁）および哺乳動物細胞において（たとえばde Wetら、１９８７年Mol. Cell. Biol.７巻：７２５〜７３７３頁；Kellerら、１９８７年Proc.Natl. Acad. Sci. USA８２巻：３２６４〜３２６８頁を参照されたい）発現されてきた。さらに、ジャマイカコメツキムシ、Pyroplorusplagiophihalamus（甲虫目）からの多くのルシフェラーゼ遺伝子は、最近、クローニングされ、部分的に特徴づけられてきた（たとえばWoodら、１９８９年J.Biolumin. Chemilumin.４巻：２８９〜３０１頁；Woodら、１９８９年Science２４４巻：７００〜７０２頁を参照されたい）。別のルシフェラーゼは、時に、異なる波長の光を産生することができ、これにより、異なる波長での光放出の同時のモニタリングが可能となる可能性がある。したがって、これらの前述の特徴は、ユニークであり、現在のレポーターシステムの利用に関して新しい特質を追加する。
【０１７２】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン５’−３リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン、および酸素の存在下において生物発光を触媒し、０．８８の量子収量をもたらしてもよい（たとえばMcElroyおよびSelinger、１９６０年Arch. Biochem. Biophys.８８巻：１３６〜１４５頁を参照されたい）。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応は、約１×１０−１３Ｍの検出限界で、ＡＴＰの検出のためのアッセイとして用いることができる（たとえばLeach、１９８１年J.Appl. Biochem.３巻：４７３〜５１７頁を参照されたい）。さらに、ルシフェラーゼ媒介検出システムの感度の全体的な程度および利便性は、ホタルルシフェラーゼベースのバイオセンサーの開発への相当な関心を引き起こした（たとえばGreenおよびKricka、１９８４年Talanta３１巻：１７３〜１７６頁；Blumら、１９８９年J.Biolumin. Chemilumin.４巻：５４３〜５５０頁を参照されたい）。
【０１７３】
上記の酵素を使用して、配列プライマーを、ポリメラーゼおよび知られているｄＮＴＰにさらすことができる。ｄＮＴＰが、プライマー配列の３’末端上に取り込まれる場合、ｄＮＴＰが切断されてもよく、ＰＰｉ分子が放たれてもよい。次いで、ＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換することができる。ＡＴＰスルフリラーゼは、ＰＰｉの変換がＰＰｉに関しての一次速度式で進む十分に高い濃度で存在してもよい。ルシフェラーゼの存在下において、ＡＴＰは、加水分解されて、光子を生成する。反応は、反応、ＡＴＰ−−＞ＤＰ＋ＰＯ４３−＋光子（光）が、ＡＴＰに関しての一次速度式で進むように、反応混合物内に存在する十分な濃度のルシフェラーゼを有していてもよい。光子は、下記に記載される方法および器具を使用して測定することができる。ＰＰｉおよびカップルスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応は、検出のための光を生成するために使用することができる。スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのどちらかまたは両方は、それぞれの反応部位に配置される１つまたは複数の可動性固体支持体上に固定することができる。
【０１７４】
ＰＰｉは、リアルタイムシグナルを発するポリメラーゼ反応の間に検出されるように放出することができる。配列決定反応は、リアルタイムで継続的にモニターすることができる。反応は、２秒未満で起こってもよい（NyrenおよびLundin、前掲）。律速段階は、ＡＴＰスルフリラーゼによるＡＴＰへのＰＰｉの変換であってもよいが、ルシフェラーゼ反応は速く、０．２秒未満を要すると推測された。ポリメラーゼの取り込み速度もまた、様々な方法によって推測され、たとえば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼの場合において、１つの塩基の完全な取り込みは、０．５秒未満を要する可能性があることが分かった。したがって、１つの塩基の取り込みおよびこの酵素アッセイによる検出のための推測される総時間は、約３秒である。そのため、非常に速い反応時間が可能であり、リアルタイム検出を可能にすることが分かるであろう。反応時間は、より耐熱性のルシフェラーゼを使用することによってさらに減少し得る。
【０１７５】
ほとんどの適用については、ＡＴＰおよびＰＰｉのような混入物がない試薬が使用することができる。これらの混入物は、樹脂に結合されたアピラーゼおよび／またはピロホスファターゼを含有するプレカラムに試薬を流すことによって除去することができる。その代わりに、アピラーゼまたはピロホスファターゼは、磁性ビーズに結合されてもよく、試薬中に存在する混入しているＡＴＰおよびＰＰｉを除去するために使用することができる。さらに、拡散性の配列決定試薬、たとえば取り込まれていないｄＮＴＰｓは、洗浄緩衝液を用いて洗い流することができる。ピロリン酸配列決定において使用される任意の洗浄緩衝液が使用することができる。
【０１７６】
配列決定反応における反応物の濃度は、０．２ｍｌ緩衝液中に１ｐｍｏｌ ＤＮＡ、３ｐｍｏｌポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰを含んでもよい。Ronaghiら、Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁（１９９６年）を参照されたい。
【０１７７】
所望の場合、配列決定反応は、それぞれの４つの所定のヌクレオチドを用いて行なわれてもよい。「完全」サイクルは、所定の順において、ヌクレオチドＤＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）のそれぞれについての配列決定試薬を順次、与えることを含んでもよい。取り込まれていないｄＮＴＰｓは、それぞれのヌクレオチド追加の間に洗い流することができる。その代わりに、取り込まれていないｄＮＴＰｓは、アピラーゼによって分解することができる。サイクルは、配列産物の所望の量の配列が得られるまで、所望されるように繰り返することができる。約１０〜１０００、１０〜１００、１０〜７５、２０〜５０、または約３０ヌクレオチドの配列情報が、１つのアニールされた配列決定プライマーの伸長から得られてもよい。
【０１７８】
ヌクレオチドは、ビオチンなどのハプテンのジスルフィド誘導体を含有するように修飾することができる。アンカー基質にアニールした新生プライマーへの修飾ヌクレオチドの追加は、ｉ）修飾がビオチンである例において、酵素分子に結合されたアビジンコンジュゲート部分またはストレプトアビジンコンジュゲート部分の順次結合、ｉｉ）過剰なアビジン結合酵素またはストレプトアビジン結合酵素の洗い流し、ｉｉｉ）酵素活性に適用可能な条件下での適した酵素基質の流入、およびｉｖ）１つまたは複数の酵素基質反応産物の検出を含む重合後ステップによって分析することができる。ハプテンは還元剤の追加を通じて除去することができる。そのような方法は、電気泳動の必要性および可能性として危険な放射標識の使用を回避しながら、ヌクレオチドを所与の標的位置において同定することおよびＤＮＡを簡単にかつ急速に配列決定することを可能にする。
【０１７９】
ハプテンを検出するための酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼであってもよい。洗浄緩衝液は、本明細書において、様々な反応物の追加の間に使用することができる。アピラーゼは、配列決定プライマーを伸長させるために使用される、未反応ｄＮＴＰを除去するために使用することができる。洗浄緩衝液は、アピラーゼを含んでもよい。
【０１８０】
例としてのハプテン、たとえばビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料分子ｃｙ３およびｃｙ５、ならびにフルオレスセインは、伸長ＤＮＡ分子の中に様々な効率で取り込まれてもよい。ハプテンの付着は、糖、塩基を介しての、およびヌクレオチド上のリン酸部分を介しての結合を通して生じてもよい。シグナル増幅のための例としての手段は、蛍光手段、電気化学手段、および酵素手段を含む。酵素増幅が使用される場合、酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼは、光生成基質が知られているものを含んでもよく、光生成（化学発光）基質の検出のための手段はＣＣＤカメラを含んでもよい。
【０１８１】
修飾塩基は、追加されてもよく、検出が生じてもよく、ハプテンコンジュゲート部分は、除去されてもよく、または切断剤もしくは不活性化剤の使用によって不活性化することができる。たとえば、切断可能なリンカーがジスルフィドである場合、切断剤は、還元剤、たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノールなどであってもよい。不活性化はまた、熱、冷却、化学的変性剤、界面活性剤、疎水性試薬、または自殺型阻害剤によって成し遂げることができる。
【０１８２】
ルシフェラーゼは、光子の同時に起こる放出を伴ってｄＡＴＰを直接、加水分解する可能性がある。加水分解は、伸長配列決定プライマーの中へのｄＡＴＰの取り込みと無関係に生じるので、これは、偽陽性シグナルをもたらす可能性がある。この問題を回避するために、ＤＮＡの中に取り込まれるｄＡＴＰ類似体が使用することができる、つまり、それは、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない。１つのそのような類似体は、α−チオ−ｄＡＴＰである。したがって、α−チオ−ｄＡＴＰの使用により、成長している核酸鎖の中に取り込まれることなく、ｄＡＴＰが加水分解される場合に生じ得る偽性の光子生成を回避してもよい。
【０１８３】
ＰＰｉベースの検出は、配列決定プライマーの追加直後の、配列決定反応混合物へのコントロールヌクレオチドの追加に続いて放出される光の測定によって較正することができる。これにより、反応条件の標準化を可能にすることができる。２つ以上の連続した同一のヌクレオチドの取り込みは、放出される光の量における対応する増加によって明らかにすることができる。したがって、コントロールヌクレオチドと比較した、放出される光の２倍の増加により、伸長プライマーの中への２つの連続のｄＮＴＰｓの取り込みを明らかにしてもよい。
【０１８４】
アピラーゼは、配列決定反応混合物内で、あらゆる残りの取り込まれなかったｄＮＴＰｓの分解を容易にするために、固体支持体の表面に「薄く塗られてもよい」または「流することができる」。アピラーゼはまた、生成されるＡＴＰをも分解し、したがって、反応から生成される光を「消す」。アピラーゼを用いる処理の際に、あらゆる残りの反応物は、次に続くｄＮＴＰインキュベーションおよび光子検出のステップの調製中に洗い流することができる。その代わりに、アピラーゼは、固体支持体または可動性固体支持体に結合することができる。
【０１８５】
ａ．配列決定反応の検出
固体支持体は、画像システム２３０に光学的に結合されてもよく、これは、従来の光学機械または光ファイバー束と連携してＣＣＤシステムを含んでもよい。灌流チャンバー基質は、水性インターフェースの近くで生成される光が、基質またはチャンバーの外部に光ファイバーを通して直接伝達することができるように、光ファイバーアレイウェーハを含んでもよい。ＣＣＤシステムが光ファイバーコネクターを含む場合、画像化は、灌流チャンバー基質をコネクターと直接接触させて配置することによって成し遂げることができる。その代わりに、従来の光学機械は、たとえば、光ファイバー基質の外部から直接、ＣＣＤセンサー上への１−１倍率高開口数レンズシステムを使用することによって、光を画像化するために使用することができる。基質が、光ファイバーカップリングを提供しない場合、レンズシステムはまた、上記に記載されるように使用されてもよく、この場合において、基質または灌流チャンバーカバーは光学的に透明である。
【０１８６】
画像システム２３０は、基質表面上で反応器から光を収集するために使用することができる。光は、たとえば、当技術分野において知られている高感度低ノイズ器具を使用してＣＣＤ上に画像化することができる。光ファイバーベースの画像化については、光ファイバーは、カバースリップの中に直接またはＦＯＲＡについては、同様に、検出器に光を伝える光ファイバーであるマイクロウェルを形成する光ファイバーを有するように取り込まれてもよい。
【０１８７】
画像システムは、コンピューター制御およびデータ収集システム２４０に結合することができる。任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが使用することができる。コンピューター制御およびデータ収集システムはまた、試薬送達をコントロールするためにコンジット２００に結合することができる。
【０１８８】
ピロリン酸配列決定反応によって生成される光子は、それらが焦点調整デバイス（たとえば光学用レンズまたは光ファイバー）を通過し、ＣＣＤエレメント上に集中する場合のみ、ＣＣＤによって捕捉することができる。しかしながら、放出される光子は、全方向に等しく流出する可能性がある。平面状のアレイ（たとえばＤＮＡチップ）を用いる場合に、それらの、後の「捕捉」および定量化を最大限にするために、光子は、それらが生成されるポイントにできるだけ近くに、たとえば、平面状の固体支持体の直近に収集することができる。これは、（ｉ）カバースリップおよび従来の光学用レンズもしくは光ファイバー束の間に光学用液浸油を用いることまたは（ｉｉ）カバースリップ自体の中に光ファイバーを直接、取り込むことによって成し遂げることができる。同様に、薄く、光学的に透明な平面状の表面が使用される場合、光ファイバー束はまた、その背面に対して配置され、全反応／灌流チャンバーの奥行きを通して「画像化する」必要性を排除してもよい。
【０１８９】
反応イベント、たとえば、ルシフェラーゼによって生成される光子は、多種多様の検出器具、たとえば、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、吸光度光度計、ルミノメーター、電荷注入デバイス（ＣＩＤ）、または他の固体検出器および本明細書において記載される器具を使用して検出され、定量化することができる。放出される光子の定量化は、溶融光ファイバー束が取り付けられたＣＣＤカメラの使用によって成し遂げることができる。放出される光子の定量化はまた、マイクロチャネルプレート増幅装置が取り付けられたＣＣＤカメラの使用によって成し遂げることができる。背面薄化ＣＣＤは、感度を増加させるために使用することができる。ＣＣＤ検出器は、たとえばBronksら、１９９５年Anal. Chem.６５巻：２７５０〜２７５７頁において記載される。
【０１９０】
ＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ ＬＭ４８５ ＣＣＤチップおよび６−８μｍの個々のファイバー直径を有する１−１光ファイバーコネクター（束）を有するＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚ．）シリーズ６００ ４ポートカメラであってもよい。このシステムは、４０９６×４０９６または１６００万超のピクセルを有していてもよく、１０％〜＞４０％に及ぶ量子効率を有する。したがって、波長に依存して、ＣＣＤセンサー上に画像化された４０％もの光子は、検出可能な電子に変換される可能性がある。
【０１９１】
蛍光部分は、標識として使用されてもよく、反応イベントの検出は、レーザーを用いてアレイの表面をスキャンするために、共焦点走査型顕微鏡を使用して実行されてもよく、またはより小さな光学解像度が可能な走査型近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの他の技術が入手可能であり、それによって、「より密な」アレイの使用を可能にする。たとえば、ＳＮＯＭを使用して、個々のポリヌクレオチドは、１００ｎｍ、たとえば１０ｎｍ×１０ｎｍ未満の距離、離れている場合、識別される可能性がある。さらに、走査トンネル顕微鏡（Binningら、Helvetica Physica Acta、５５巻：７２６〜７３５頁、１９８２年）および原子間力顕微鏡（Hanswaら、AnnuRev Biophys Biomol Struct、２３巻：１１５〜１３９頁、１９９４年）が使用することができる。
【０１９２】
本発明は、次に続く非限定的な実施例によって示される、多数の態様を有する。
【実施例】
【０１９３】
（実施例１）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子の使用
Ｔｎ７ドナープラスミドｐＧＰＳ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＰＡＣ／ｏｒｉＶベクターの完全なコピーを加えた、λｃｏｓ部位を含有する転位性カセットを構築する（図１−１）。次いで、転位性カセットは、標的ＤＮＡの中に転位する（図１−１）。転位は、サザンブロッティングによって確認することができる。
【０１９４】
標的ＤＮＡの中への転位性エレメントの転位後に、それは、λ抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージする（図１−２）。プロヘッドは満たされるであろうが、パッケージングは、第２のｃｏｓ部位の欠如により完了しなくてもよい。欠けているｃｏｓ部位を提供するために、頭部からはみ出たあらゆるＤＮＡを除去するために、調製物は、Ｓａｕ３Ａを用いて消化する。次に、ファージ尾部を追加して、ヘッドフルＤＮＡを含有するλｄｏｃＬビリオンを産生する。ビリオンＤＮＡの一方の末端は、ｃｏｓＬで終了し、他方は、Ｓａｕ３Ａ突出で終了する。
【０１９５】
パッケージＤＮＡ分子を環状にし、安定性のプラスミドを形成するために、第２のｃｏｓ部位を、図３において示されるように、リンカーをアニールすることによってＳａｕ３Ａに追加する。リンカーによって追加したｃｏｓ部位は、ＤＮＡが環状になるまたはコンカテマーを形成することを可能にする。次いで、第２回のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングは、それぞれの末端にｃｏｓ突出を有するＤＮＡ分子を産生する。ＤＮＡ分子は、環状になり、両端にλｃｏｓ部位を有するカプシド形成ＤＮＡを有する完全に感染性の形態で再度パッケージされる。これらの調製物は、次いで、高効率でかつ好都合に、細胞の中にＰＡＣを導入するために使用される。
【０１９６】
（実施例２）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子のさらなる使用
誘発性複製開始点を含むベクター構築物と一致する、ファージベースのサイズ選択およびランダムクローニングのためのバクテリオファージλ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングシステムを設計した。このクローニングシステムは、バクテリオファージＰ１またはＰ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングおよびより大きな（ヘッドフル容量）バクテリオファージを取り込むように拡張することができる。バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するためのそのような手法を図２において示す。
【０１９７】
ファージパッケージング開始認識部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位によって標的ＤＮＡの中に導入する。トランスポゾンは、ファージ特異的パッケージング開始部位、転位のための１９ｂｐ Ｔｎ５モザイク末端、クローニングＤＮＡの増幅のためのｏｒｉＶ、およびプラスミド選択のための抗生物質抵抗性を付与する遺伝子を含む。転位に続いて、バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムは、クローニングＤＮＡをパッケージするために使用される。パッケージングは、ファージ特異的パッケージング部位で開始され、ファージカプシドのヘッドフル容量に達するまで続く。この容量、およびしたがってクローン挿入断片サイズは、使用する特異的なファージに基づくものであってもよい。
【０１９８】
ファージ頭部からはみ出たＤＮＡおよびあらゆる非パッケージＤＮＡは、ＤＮアーゼＩまたは４塩基認識制限エンドヌクレアーゼによって消化する。パッケージＤＮＡは、ヌクレアーゼ消化から保護される。次いで、クローンの、後の環状化を可能にするＤＮＡリンカーを、パッケージＤＮＡの末端の末端にライゲーションする。その代わりに、パッケージＤＮＡは、ファージ頭部から抽出し、その後、リンカーライゲーションおよび再度パッケージングを続けてもよい。次いで、ファージ尾部を追加し、クローニングＤＮＡを含有するビリオンは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質移入し、その後、抗生物質抵抗性の選択を続けるために使用する。
【０１９９】
（実施例３）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子の代替の使用
実施例１の手順を、プロヘッドがＤＮＡで満たされるポイントまで行ない、次いで、Ｓａｕ３Ａを用いて切断する。ファージ尾部を直接、追加する代わりに、図３のリンカーを使用して、ＤＮＡがカプシドからはみ出ている一方で、ｃｏｓＲ部位をλｄｏｃ粒子にライゲーションする。リンカーをライゲーションした後に、実施例１におけるように、尾部を追加する。正常なｃｏｓＲおよびｃｏｓＬ末端を有するファージ粒子は、カプシドを破壊して開け、ＤＮＡを環状にし、再度パッケージすることが必要ではなく、細胞の中にＰＡＣを導入するために直接、使用されるので、これは、全体的なプロセスを単純化する。
【０２００】
（実施例４）
ｉｎ ｖｉｖｏトランスポゾン組換えクローニング
実施例１および３において、かなりの量のクローニング容量がベクターによって取られる。これは、ＰＡＣベクターが、相当な長さを有し、したがって、そうでなければクローニングＤＮＡに当てることができる、カプシドにおける空間を占めるという事実によって引き起こされる。この制限について検討するために、ｃｏｓ部位の側面に位置する修飾Ｔｎ５転位性末端、組換えのためのａｔｔＰ部位、および選択可能マーカーとしてのＫａｎＲを含む転位カセットを調製する。トランスポゾンは、ゲノムＤＮＡの中にランダムにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて導入し、ｃｏｓ部位からパッケージし、Ｓａｕ３Ａ消化し、ｃｏｓＲリンカーを追加し、結果として生じた断片を精製し、再度パッケージする。次いで、挿入断片は、ａｔｔＰ部位を含有する修飾ＰＡＣベクターを含む株の中に導入する。これは、ａｔｔＢに対する同起源の組換え部位である。株は、ＩＰＴＧ誘発性Ｐｔａｃプロモーター下でｐＨＳ３−１プラスミドからＩｎｔタンパク質を発現する（Leeら１９９０年）。宿主はまた、組換えがプラスミドとのみ生じることを確実にするためにＩＳ−ともする。一度、細胞において、挿入断片がｃｏｓ突出を介して環化したら、それらは、Ｉｎｔ媒介性の組換えを通してＰＡＣの中に組換えられる。組換え体は、ベクター（ＣａｍＲ）および挿入断片（ＫａｎＲ）の両方に対する抗生物質を含有する培地上で平板培養することによって選択する。
【０２０１】
（実施例５）
転位性クローニングベクター
一連の転位性クローニングベクターは、バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングのための形質を含むように構築した。これらの形質は、１）バクテリオファージλのファージ特異的パッケージング開始部位（ｃｏｓ）および１６２ｂｐ Ｐ１パッケージング開始部位（ｐａｃ）、２）誘発性複製開始点、ｏｒｉＶ、ならびに３）転位のための１９ｂｐモザイク末端配列が側面に位置するカナマイシン抵抗性遺伝子を含む。この構築物におけるモザイク末端は、高活性Ｔｎ５ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位システムに基づくものであり、トランスポゾンの発生を可能にするように設計し、パッケージ部位、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｏｒｉＶ、およびＰｖｕＩＩ制限酵素を用いる消化後のモザイク末端を含む。標的ＤＮＡの中へのトランスポゾンの組み込みは、クロラムフェニコール（Ｃａｍｒ）についての選択によって確認することができ、カナマイシン（Ｋａｎｓ）に対する感度についてさらにスクリーニングすることができる。ｃｏｓファージパッケージング開始部位およびｐａｃファージパッケージング開始部位の位置は、組み込みに続いて、パッケージングが、これらの部位で始まり、最終的に隣接標的ＤＮＡまで、ベクターを通して時計回りに続く（図４を参照）ように設計する。これは、クローンが、安定して選択され、パッケージング、形質移入、および環状化に続いてプラスミドとして維持されることを可能にする。
【０２０２】
ｃｏｓ、ｐａｃ、ならびにｃｏｓおよびｐａｃの両方を含有する一連の３つのプラスミドを構築した。最後に、Ｋａｎｒ遺伝子の側面に位置する１９ｂｐモザイク末端配列を、最終産物の３つのベクターに追加した。ベクターシリーズのそれぞれの構成要素を個々に試験し、予想通りに機能することを示した。３つのベクターはすべて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて効率的に転位し、ＤＨ１０Ｂゲノムの中に組み込まれることが示された。転位に続いて分析した形質転換体の約９８％が、Ｃａｍｒ Ｋａｎｓであり、組み込みが確認された。候補からのゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにより、ゲノムの中へのランダムな組み込みを確認した。
【０２０３】
ｃｏｓ機能性を２つの実験によって確認した。精製λターミナーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いる単純な消化により、ベクターのｃｏｓ切断を確認した。さらに、プラスミドマルチマーから構成されるコンカテマーが、λプロファージによってｉｎ ｖｉｖｏにおいてパッケージされ得るかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｖｏコスミドパッケージングアッセイを行なった。ｃｏｓを含有する２つのベクターから産生されるコンカテマーは、Ｃａｍｒ形質導入粒子の数によって測定されるように、効率的にパッケージされたが、ｐａｃのみを有するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてλによってパッケージすることができなかった。
【０２０４】
（実施例６）
ファージパッケージング部位のライゲーション
パッケージ部位は、線状転位性クローニングベクターを、部分的に消化したゲノムＤＮＡに直接、ライゲーションすることによって、標的ＤＮＡの中に導入する。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（または全多重クローニング部位）を、ｔＬ３ターミネーターおよびモザイク末端の間に位置するユニークなＰｍｅＩ部位で、転位性クローニングベクターの中に導入する。ＥｃｏＲＩ部分的消化物を使用する場合、転位性クローニングベクターは、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩによって消化し、精製し、一方の末端に平滑末端化ＰｖｕＩＩおよびｐａｃ／ｃｏｓ部位ならびに反対の末端にＥｃｏＲＩ付着末端を有する線状転位性クローニングベクターがもたらされる。ＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ二重消化物は、ベクターエレメントを含有するクローンを用いる一方向のパッケージングをもたらす。
【０２０５】
線状転位性クローニングベクターを、部分的に消化したゲノムＤＮＡにライゲーションする。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング反応を行ない、転位性クローニングベクターの構成要素を通して、転位性クローニングベクター上のパッケージ部位でパッケージングを開始し、ファージ頭部のヘッドフル容量に達するまで、ライゲーションゲノムＤＮＡまで続ける。転位によるパッケージング開始部位の導入と同様に、はみ出たＤＮＡは消化し、適切なリンカーは、ＤＮＡの環状化のためにライゲーションし、ファージ尾部を追加し、使用したクローニングＤＮＡを含有するビリオンをＥ．ｃｏｌｉに形質移入する。
【０２０６】
（実施例７）
λまたはＰ１を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
市販で入手可能なλ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング抽出物は、シングルチューブシステムとして、段階１および段階２のパッケージング抽出物を組み合わせたものである。クローニングシステムは、順次、２つのパッケージ段階を順次使用してもよい。２つの従来の相補的な溶原性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＨＢ２６９０（段階１）およびＢＨＢ２６８８（段階２）からの抽出物を生成し、試験した。２段階パッケージングシステムの効率は、市販で入手可能なシングルチューブシステムに匹敵した。さらに、発明者らは、段階１抽出物を使用して、パッケージベクターのｃｏｓ切断を示し、実施例５において記載されるベクターの機能性を確認することができた。バクテリオファージＰ１のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムについては、発明者らは、それぞれ、株ＮＳ３２０８およびＮＳ３２１０から、Ｐ１溶原菌の段階１および段階２の抽出物を生成した（Corenら、J Mol Biol、２４９巻：１７６〜８４頁、１９９５）。発明者らはまた、段階１（ｐａｃａｓｅ）抽出物を使用して、パッケージベクターのｐａｃ部位の切断をも示した。
【０２０７】
（実施例８）
λファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニングおよびファージカプシドのアフィニティー精製
本実施例は、λファージパッケージングを使用するＤＮＡのクローニングおよびファージカプシドのアフィニティー精製について記載する。ｃｏｓ部位、複製開始点、および薬剤抵抗性マーカーを含有する核酸は、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ転位によって、ゲノムＤＮＡの中にランダムに挿入する。λターミナーゼ（Ｎｕ１およびＡの遺伝子の産物を含有する）は、ｃｏｓ部位におよびλプロヘッドに結合し、次いで、ｃｏｓ部位でＤＮＡを切断する（図６）。次いで、ＡＴＰ駆動モーターは、プロヘッドの中にＤＮＡを詰め込む。ウイルスカプシドは、カプシドへのＤタンパク質の追加によって、ＤＮＡがその中に挿入されるとともに拡張する。約５０ｋｂのＤＮＡがカプシドを満たすまで、このプロセスは続く。カプシドからぶら下がったままのＤＮＡは、頻繁に切断する制限部位を用いて切断することができる。カプシドの内部にあるＤＮＡは保護されるので、カプシドの外部にあるＤＮＡのみを制限酵素によって切断することができる。
【０２０８】
ＤＮＡの制限に続いて、ファージカプシドは、カラムに結合した抗Ｄタンパク質抗体を使用してアフィニティー精製する。精製カプシドからのＤＮＡは、フェノール抽出によって単離することができる。次いで、ＤＮＡは環状にし、細菌の中に形質転換する。
【０２０９】
（実施例９）
Ｐ２２ＨＴファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニング
本実施例は、Ｐ２２ＨＴファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニングについて記載する。Ｇｐ２およびＧｐ３のタンパク質を含有するＰ２２ＨＴターミナーゼは、ランダムな部位でゲノムＤＮＡに結合し、それを切断する（図７）。ターミナーゼは、ＤＮＡに結合したままであり、プロヘッドがいっぱいになるまで、Ｐ２２プロヘッドの中にそれを詰め込む。カプシドが拡張するとともに、それは、広がり、破壊されたＤＮＡになお付着しているターミナーゼを放出する立体構造変化を受ける。次いで、ターミナーゼは、新しいプロヘッドの中にＤＮＡを挿入し、ＤＮＡパッケージングの新しいサイクルを始めることができる。ターミナーゼは、隣接ゲノムＤＮＡセグメントの連続パッケージングの多くのサイクルを続けることができる。
【０２１０】
パッケージＤＮＡをクローニングするために、ファージカプシドは、拡張されたカプシドの外部に存在するエピトープに結合することができる抗体を含有するカラムを使用してアフィニティー精製することができる。カプシドはまた、差次的沈降または等密度遠心分離によって単離することもできる。これらの方法は、ＤＮアーゼ消化が伴い得る。ＤＮＡは、上記に記載されるように、さらにそれを抽出し、環状にし、細菌の中に形質転換することによってクローニングすることができる。
【０２１１】
（実施例１０）
ファージパッケージングによってクローニングされたゲノムＤＮＡの末端の配列の特徴づけ
本実施例は、ファージベースのシステムを使用してパッケージされたゲノムＤＮＡの末端の配列をどのように特徴づけることができるかについて記載する。ゲノムＤＮＡは、ファージカプシドから最初に単離される。次に、ＥｃｏＰ１５Ｉ部位が側面に位置する２つの外向きリーチングプライマー配列を含有する核酸を、単離ＤＮＡ断片の末端にライゲーションする（図８）。図９Ｂは、リーチングプライマー対核酸の構造を示す。リーチングプライマー対断片は、２つの異なるゲノムＤＮＡ分子へのリーチングプライマー対断片のライゲーションを回避するのに十分に低い稀釈度で単離ＤＮＡにライゲーションする。リーチングプライマー対断片の末端は、それとモノマー環を形成することを回避するためにリン酸化されなくてもよい。
【０２１２】
ライゲーションに続いて、ＤＮＡをＥｃｏＰ１５Ｉを用いて消化し、これにより、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位から２７ｂｐ離れたところでＤＮＡを切断する。この制限酵素を用いるＥｃｏＲ消化は、２つのリーチングプライマー配列、側面に位置するＥｃｏＰ１５Ｉ部位、およびそれぞれの末端に２７ｂｐのゲノムＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を放出する。放出断片におけるゲノムＤＮＡは、パッケージゲノムＤＮＡのそれぞれの末端を表わす。放出断片は、フィルインすることができる。図９Ａは、平滑末端を作り出すために、放出断片のＥｃｏＰ１５Ｉ切断末端をどのようにフィルインすることができるかを示す。次いで、放出平滑断片は、ライゲーションして、対になった末端環ＤＮＡを作り出すことができる。次いで、このＤＮＡは、２つのリーチングプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅することができ（図１０）、次いで、増幅産物は、配列決定することができる。リーチングプライマー対部位の間に制限部位がある場合、対になった末端環は、ＰＣＲ増幅の前に適切な制限酵素を用いて切断することによって線状にしてもよい。ＤＮＡはまた、固相核酸増幅を使用して増幅を行なうことによって、ＰＣＲ増幅し、直接配列決定してもよい。上記に記載されるアプローチはまた、ビーズエマルションＰＣＲ増幅および配列決定における使用のために、磁性ビーズに結合させたリーチングプライマーのうち１つに適応することができる（図１１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸分子のクローニングおよび核酸ライブラリーの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム学は、生物医学研究の中心的で統合的な学問になった。ゲノム配列決定プロジェクトは、事実上すべての生命過程の研究を変えた、安定した一連のさらに大きく、より複雑なゲノムデータセットを生成する。遺伝学および比較ゲノム学の進歩は、疾患が、分子の細部についての、前例がないレベルで分析され、かつ理解されることを可能にする。
【０００３】
ゲノム研究は、高品質で、大きな挿入断片のゲノムライブラリーの有用性を必要とする。高品質ゲノムライブラリーは、狭いサイズ範囲のＤＮＡ断片を必要とする。ＤＮＡ断片のサイズ選択は、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用して、典型的に行なわれるが、これは、いくつかの制限を有する。ＰＦＧＥは、非常に時間がかかり、再現不可能である。さらに、ＰＦＧＥからの断片ＤＮＡの収量は、非常に乏しい。
【０００４】
高品質ゲノムライブラリーはまた、全ゲノムが、最小限のバイアスを伴って表わされることをも必要とする。ゲノムライブラリーのＤＮＡ断片は、ゲノムを部分的に消化するための制限酵素を使用して、産生されることが多いが、これは、いくつかの制限を有する。ゲノムの部分的な消化は、制限部位の間の距離が、適用されるサイズ選択限界未満であり、またはそれを超えるゲノムの領域に対してバイアスをもたらす。部分的な消化と関連するクローニングバイアスに対する代案として、ＤＮＡ断片は、ゲノムをランダムに剪断することによって産生することができる。しかしながら、クローニング効率は、ランダムに剪断されたＤＮＡを使用すると、著しく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当技術分野が必要とするのは、全ゲノムを正確に表わすことができる高品質ゲノムライブラリーである。ゲノムライブラリーは、効率的に、かつ高収量を伴って産生されるべきである。ゲノムライブラリーはまた、容易に増殖され、かつ分析されるべきでもある。本発明は、これらの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核酸をクローニングし配列決定するため、および複数の核酸をクローニングし配列決定するためのパッケージングシステムの使用に関する。パッケージングシステムは、たとえば、ファージベースのパッケージングメカニズムであってもよい。核酸をカプシドの中にパッケージすることができ、このカプシドはバクテリオファージカプシドであってもよい。クローニングされた核酸は、たとえば、核酸ライブラリーの産生において使用することができる。
【０００７】
核酸を配列決定するための方法であって、核酸を含むカプシドを提供するステップと、核酸を単離するステップと、核酸を配列決定するステップとを含み得る方法が本明細書において提供される。複数の核酸を配列決定するための方法であって、それぞれが核酸を含む複数のカプシドを提供するステップと、核酸を単離するステップと、核酸を配列決定するステップとを含み得る方法もまた本明細書において提供される。
【０００８】
配列決定は、（ａ）水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で水性マイクロリアクターの中に核酸を送達するステップと、（ｂ）マイクロリアクター中で核酸を増幅して核酸の増幅コピーを形成し、マイクロリアクター中で増幅コピーをビーズに結合させるステップと、（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイにビーズを送達するステップであって、複数の反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、（ｄ）複数の反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップとを含んでもよい。
【０００９】
配列決定はまた、（ａ）複数の水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で水性マイクロリアクターの中に複数の核酸を送達するステップと、（ｂ）マイクロリアクター中で核酸を増幅して核酸の増幅コピーを形成し、マイクロリアクター中で増幅コピーをビーズに結合させるステップと、（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイにビーズを送達するステップであって、複数の反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップとを含んでもよい。
【００１０】
ビーズは、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合してもよい。核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって成し遂げることができる。配列決定反応は、ピロリン酸ベースの配列決定反応であってもよい。配列決定反応は、（ａ）有効量の配列決定プライマーを核酸の増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および所定のヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、（ｂ）配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で核酸の配列を決定するステップとを含んでもよい。
【００１１】
核酸または複数の核酸の単離は、（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を少なくとも１つの核酸にライゲーションするステップであって、第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、少なくとも１つの核酸の５’末端にライゲーションし、第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、少なくとも１つの核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に少なくとも１つの核酸を固定するための手段を有するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の少なくとも１つの核酸を、固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で固体支持体にコロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の５’末端が、固体支持体に固定され、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の上述の５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、上述の固体支持体に固定されるステップと、（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、固定された少なくとも１つの核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップとを含んでもよい。コロニープライマーは、縮重プライマーであってもよい。
【００１２】
オリゴヌクレオチド配列Ｚは、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であってもよく、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列であってもよい。核酸にアダプター末端をライゲーションする場合、２つの異なるコロニープライマーＸは、少なくとも１つの核酸と混合してもよく、オリゴヌクレオチド配列Ｚは、コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズしてもよく、オリゴヌクレオチドＹは、コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じであってもよい。
【００１３】
少なくとも１つの核酸は、１つまたは複数の核酸コロニーにおいて配列決定することができる。配列決定は、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含んでもよく、さらに、核酸コロニーを視覚化することを含んでもよい。視覚化は、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含んでもよい。
【００１４】
少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に固定するための手段は、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを支持体に共有結合で固定するための手段を含んでもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に共有結合で固定するための手段は、化学的に修飾された基であってもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを固体支持体に固定するための手段は、少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーを支持体に共有結合で固定するための手段を含んでもよい。化学的に修飾可能な官能基は、アミノ基であってもよい。
【００１５】
少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の上述の５’末端が固定される固体支持体は、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択することができる。固体支持体上の核酸コロニーの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。固体支持体に付着したコロニープライマーＸの密度は、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２であってもよい。少なくとも１つの核酸の密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。少なくとも１つの核酸およびコロニープライマーの両方の５’末端は、共有結合を介して上述の固体支持体に固定することができる。
【００１６】
核酸をクローニングするための方法もまた本明細書において提供される。パッケージング開始部位（ＰＩＳ）を標的核酸の中に導入することができ、これは、標的核酸からクローニングされる核酸の上流末端を確立する。ＰＩＳは、λ、Ｐ１、Ｐ７、またはＴ４を含むが、これらに限定されないファージパッケージング開始部位であってもよい。標的核酸は、ベクター、染色体ＤＮＡ、または全ゲノムを含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。標的核酸としての全ゲノムの使用により、ゲノムライブラリーの産生が可能となる可能性がある。
【００１７】
ＰＩＳは、標的核酸にランダムに導入することができ、これは、ゲノムの範囲を増加させる可能性がある。ＰＩＳは、転位およびライゲーションを含むが、これらに限定されない任意の方式において標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳは、第１の核酸の転位によって導入することができる。第１の核酸は、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒを含むが、これらに限定されない転位性末端を含んでもよい。
【００１８】
次いで、パッケージングは、ＰＩＳで開始することができ、これは、標的核酸に及ぶ、ＰＩＳから下流の核酸のクローニングをもたらす。パッケージングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じてもよい。クローニングされた核酸は、カプシド中にパッケージすることができ、これは、クローンを実質的に一定の長さにする可能性がある。
【００１９】
第１の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。ベクターエレメントは、ＰＩＳの下流にあってもよく、クローニングされた核酸中に存在してもよい。ベクターエレメントは、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含むが、これらに限定されない複製開始点であってもよい。ベクターエレメントはまた、高コピー複製開始点および低コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、複製誘発剤に応答性であってもよい。第１の核酸は、複製誘発剤をコードする核酸を含んでもよい。複製誘発剤は、ＴｒｆＡであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】λｄｏｃ粒子を使用する、トランスポゾン媒介クローニングの手法を示す図である。ステップ１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応は、転位性末端（外向きの矢印）を介して、ゲノムＤＮＡ（長い直線）の全体にわたる多数の部位に、トランスポゾンを含有するＰＡＣ／ｏｒｉＶをランダムに挿入する。ステップ２：ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされ、ｃｏｓ部位で始まり、頭部がいっぱいになるまで続く。次いで、はみ出たＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａを用いて消化されるが、頭部内のＤＮＡは、保護される。ステップ３：次いで、ファージ頭部は、精製され、溶解され、Ｓａｕ３Ａ突出を有するゲノムＤＮＡに融合された、一定の長さの、一般的な組成のｃｏｓ−ＰＡＣ／ｏｒｉＶ（太い矢印）の断片がもたらされる。次いで、Ｓａｕ３Ａ突出およびｃｏｓ突出を有するオリゴは、断片にライゲーションされる。ステップ４：断片は、再度パッケージされ、入ってくるＤＮＡがｃｏｓ末端を通して環状になる、ＤＨ１０Ｂなどの宿主を感染させるために使用される。クローンは、ＣａｍＲコロニーとして単離される。
【図２】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位およびファージパッケージングを介してクローニングするためのさらなる模式図を示す図である。
【図３】Ｓａｕ３Ａ突出を有するＤＮＡ断片にｃｏｓ部位を追加するための、２つの核酸（配列番号１および２）を含むリンカーを示す図である。
【図４】トランスポゾン媒介クローニングの使用に基づくｉｎ ｖｉｖｏ組換えのための手順を示す図である。ステップ１：図１におけるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位反応は、転位性末端（外向きの矢印）を介して、ゲノムＤＮＡ（長い直線）の全体にわたる多数の部位に、トランスポゾンをランダムに挿入する。しかしながら、この場合、トランスポゾンは、複製開始点を有してないｃｏｓ−ａｔｔＢ−ＫａｎＲを含有する。ステップ２：ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされ、ｃｏｓ部位で始まり、頭部がいっぱいになるまで続く。次いで、はみ出たＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａを用いて消化されるが、頭部内のＤＮＡは、保護される。ステップ３：次いで、ファージ頭部は、精製され、溶解され、Ｓａｕ３Ａ突出を有するゲノムＤＮＡに融合された、一定の長さの、一般的な組成のｃｏｓ−ＰＡＣ／ｏｒｉＶ（太い矢印）の断片がもたらされる。次いで、Ｓａｕ３Ａ突出およびｃｏｓ突出を有するオリゴが、断片にライゲーションされる。ステップ４：断片は、再度パッケージされ、新しいｐＰＡＣ／ｏｒｉＶ／ａｔｔＰベクターを含有し、Ｉｎｔを発現するように誘発された、ＤＨ１０Ｂなどの宿主を感染させるために使用される。ｃｏｓ末端を介しての次に続く環化は、ＣａｍＲ付与プラスミドをもたらす。
【図５】転位性の／パッケージすることができるベクターを示す図である。ベクターのＰｖｕＩＩ切断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転位を可能にするＴｎ５モザイク末端（ＭＥ）が側面に位置する線状の断片をもたらす。次いで、ｐａｃ部位およびｃｏｓ部位は、転位産物がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージされることを可能にする。
【図６】ファージカプシドのアフィニティー精製およびパッケージＤＮＡの単離が後に続くλファージベースのパッケージングシステムを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを生成するための戦略を示す図である。
【図７】Ｐ２２ＨＴ「ヘッドフル（ｈｅａｄｆｕｌ）」パッケージングシステムを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを生成するための戦略を示す図である。
【図８】ウイルスカプシドパッケージＤＮＡの末端の配列をクローニングし、かつ特徴づけるための戦略を示す図である。
【図９】ファージパッケージＤＮＡの中へのクラスＩＩＩ制限酵素部位およびリーチングプライマー対結合部位のクローニングが、ＤＮＡの末端の配列を特徴づけるためにどのように使用することができるかを示す図である。
【図１０】ＤＮＡの中にリーチングプライマー対挿入断片をクローニングした後に、ファージパッケージＤＮＡの末端をどのようにしてＰＣＲ増幅することができるかを示す図である。
【図１１】ＤＮＡの中にリーチングプライマー対挿入断片をクローニングした後に、ファージパッケージＤＮＡの末端をどのように配列決定することができるかを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明者らは、より正確に表わす、標的ＤＮＡを単離し、パッケージするために使用することができるファージパッケージングシステムを開発した。使用されるファージパッケージングシステムに依存して、システムは、特定の、より一定のサイズのＤＮＡ断片を生成する。さらに、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡを、扱いやすく、クローニングすることができるサイズに低下させるために剪断ステップまたは制限消化ステップを必要とする方法と比較して、よりライゲーション可能である。したがって、標的ＤＮＡを得るための効率は、他の方法と比較して高い。標的ＤＮＡのパッケージングに続いて、ＤＮＡは、ライブラリーの生成などの多数の目的のために使用することができ、それを抽出することができ、それを増幅することができ、またはパッケージＤＮＡ断片の末端のクローニングおよび配列決定などによってＤＮＡを配列決定することができる。
【００２２】
ＤＮＡ断片は、標的ＤＮＡの中にパッケージング開始部位（ＰＩＳ）を導入することによって生成することができる。ＰＩＳは、標的核酸からクローニングされる核酸の上流末端を確立する。パッケージングシステムによるＰＩＳの認識は、ＰＩＳでのパッケージングの開始をもたらしてもよく、これは、標的核酸に及ぶ、ＰＩＳから下流の核酸のクローニングをもたらす。核酸のライブラリーは、標的核酸から複数の核酸をクローニングすることによって産生することができる。ゲノムライブラリーは、ゲノムから複数の核酸をクローニングすることによって産生することができる。
【００２３】
１．パッケージングシステム
核酸は、パッケージング開始部位（ＰＩＳ）でのパッケージングを開始することによって、標的核酸からクローニングすることができる。ＰＩＳは、ターミナーゼによって認識されてもよく、これは、部位特異的にまたはランダムに標的核酸に切れ目を入れてもよく、これは、カプシドの中に核酸を挿入してもよい。したがって、クローニングされた核酸は、カプシド中にパッケージすることができる。ターミナーゼは、２つのタンパク質を含んでもよく、これらは、パッケージングシステムが機能することを可能にするＡＴＰアーゼ活性を有していてもよい。
【００２４】
カプシドは、５〜１６０ｋｂのサイズであってもよい核酸をパッケージすることができてもよい。複数のカプシドは、それぞれ、核酸をパッケージすることができてもよく、カプシドによってパッケージされる核酸は、ほぼ同じサイズであってもよい。サイズ選択のそのような形態は、ＰＦＧＥ電気泳動と関連する非効率に対する主な改善である。さらに、カプシドの感染特性は、後の操作において、エレクトロポレーションよりも高い率で、パッケージされた核酸の導入を可能にすることができる。
【００２５】
使用されるパッケージングシステムは、真核生物または原核生物のものであってもよい。たとえば、システムは、表１に挙げられるバクテリオファージから選択することができる。
【００２６】
【表１】
パッケージングシステムはまた、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、またはエプスタイン−バーウイルスから選択することができる。
【００２７】
ａ．パッケージング開始部位
ＰＩＳは、パッケージング開始部位であってもよい。パッケージング開始部位の代表的な例は、バクテリオファージλ、Ｐ１、Ｐ７、Ｔ４、Ｔ７、Φ２９、またはＰ２２パッケージング開始部位を含むが、これらに限定されない。ＰＩＳは、ｐａｃ部位またはｃｏｓ部位であってもよい。ＰＩＳはまた、長末端反復などの真核生物ウイルスＰＩＳであってもよい。
【００２８】
ＰＩＳは、標的核酸の中に、ＰＩＳを含む第１の核酸を導入することによって、標的核酸の中に導入することができる。第１の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。第１の核酸はまた、転位性エレメントを含んでもよい。転位性エレメントは、ＰＩＳを含む核酸セグメントの側面に位置する１対の転位性末端を含んでもよい。転位性エレメントは、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｉｎｏｓ、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒを含むが、これらに限定されない、システムからの転位性末端を含んでもよい。核酸セグメントはまた、ベクターエレメントを含んでもよい。
【００２９】
第１の核酸は、ランダム方式または非ランダム方式のいずれかにおいて標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳを含む第１の核酸はまた、突然変異誘発を含むが、これに限定されない多くの標準的な分子生物学手法のいずれかによって、標的核酸の中に導入することができる。ＰＩＳを含む第１の核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、転位によって標的核酸の中に導入することができる。第１の核酸は、標的ＤＮＡの中への転位性エレメントの転位を可能にする任意の形態をしていてもよい。第１の核酸は、線状ＤＮＡまたは環状ＤＮＡの形態をしていてもよく、これは、スーパーコイル核酸またはリラックス核酸であってもよい。第１の核酸は、プラスミドの一部であってもよい。第１の核酸はまた、バクテリオファージを含むが、これに限定されない複製可能な遺伝子パッケージであってもよい。
【００３０】
トランスポサーゼは、標的核酸の中への第１の核酸の転位を触媒するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用することができる。転位は、ランダムに生じてもよく、その程度は、特定のトランスポゾンシステムに依存して異なっていてもよい。
【００３１】
転位は、たとえば、市販で入手可能な転位システムを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じてもよい。転位はまた、米国特許第５，９６５，４４３号、第５，９４８，６２２号、または第５，９２５，５４５号において開示される方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位については、標的核酸は、染色体ＤＮＡ、消化ＤＮＡ、剪断ＤＮＡ、サイズ特異的ＤＮＡ、および全ゲノムを含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。
【００３２】
転位はまた、トランスポサーゼを発現する宿主細胞の中に第１の核酸を導入することによってｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じてもよい。第１の核酸は、エレクトロポレーションおよび感染を含むが、これらに限定されない方法によって宿主細胞の中に導入することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ転位については、標的核酸は、レプリコンを含む、核酸の任意の形態であってもよい。レプリコンは、ベクターまたは染色体であってもよい。
【００３３】
ＰＩＳを含む第１の核酸はまた、標的核酸に第１の核酸をライゲーションすることによって、標的核酸の中に導入することができる。ライゲーションされた産物は、線状または環状であってもよい。標的核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位について上記に説明される核酸の形態を含むが、これらに限定されない、核酸の任意の形態であってもよい。標的核酸は、ランダム剪断および制限消化を含むが、これらに限定されない方法によって生成することができる。第１の核酸および標的核酸は、適合性の末端を有していてもよい。その代わりに、リンカーが使用することができる。
【００３４】
標的核酸は、ＨｉｎｄＩＩＩなどの第１の制限酵素を用いて消化されてもよく、これは、部分的であってもよい。標的核酸はまた、第２の制限酵素を用いて消化することができる。第１の核酸は、消化された標的核酸と適合性の末端を有していてもよい。第１の核酸および標的核酸をライゲーションした後に、ＰＩＳを含む、結果として生じる標的核酸は、ファージパッケージングのための基質としてもよい。
【００３５】
ＰＩＳは、標的核酸に固有のものであってもよく、または標的ＤＮＡ中に先在していてもよい。ＰＩＳはまた、ＤＮＡ切断によって標的核酸の中に導入することができる。切断は、ターミナーゼと標的核酸を接触させることによって行なわれてもよく、これは、ランダムな位置で標的核酸を切断してもよい。ターミナーゼは、ファージＰ２２からのなどのように、ファージターミナーゼであってもよく、これは、高形質導入Ｐ２２であってもよい。ターミナーゼは、ファージＰ２２のポリペプチドＧｐ３およびＧｐ２を含んでもよい。
【００３６】
ｂ．ベクターエレメント
ＰＩＳは、ベクターエレメントと共に標的核酸の中に導入することができる。ベクターエレメントは、ＰＩＳの下流または上流にあってもよい。下流ＰＩＳは、クローニングされた核酸中に含まれていてもよい。クローニングされた核酸中のベクターエレメントは、クローニングＤＮＡの、後の操作および増殖のために使用することができる。
【００３７】
（１）複製開始点
ベクターエレメントは、複製開始点であってもよい。複製開始点は、低コピー複製開始点であってもよい。低コピー複製開始点はまた、再編成を最小限にしながら、宿主細胞中のクローニングＤＮＡを維持するために使用することができる。低コピー複製開始点の代表的な例は、ｏｒｉＳである。
【００３８】
複製開始点はまた、高コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、より多量のクローニングＤＮＡを産生するために使用することができる。低コピー複製開始点の代表的な例は、ｏｒｉＶである。
【００３９】
ベクターエレメントはまた、高コピー複製開始点および低コピー複製開始点であってもよい。高コピー複製開始点は、誘発性プロモーターのコントロール下としてもよい。クローニングされた核酸は、低コピー複製開始点を使用して維持できるが、高コピー複製開始点の誘発によって多量に産生することができる。そのようなシステムは、Hradecnaら１９９８年およびWildら１９９８年によって記載され、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００４０】
（２）マーカー
ベクターエレメントはまた、選択可能マーカーまたは可視マーカーであってもよい。選択可能マーカーまたは可視マーカーは、クローニングＤＮＡを維持し、かつ操作するために使用することができる。マーカーの代表的な例は、ＡｍｐＲ、ＣａｍＲ、ＫａｎＲ、ｌａｃＺ、およびＧＦＰを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
（３）組み込み部位
ベクターエレメントはまた、組み込み部位であってもよい。組み込み部位は、相補的な組み込み部位を含む第２の核酸の中にクローニングされた核酸を組み込むことを可能にすることができる。第２の核酸はまた、ベクターエレメントを含んでもよい。総合システムの使用は、いくつかの重要な利点を有する。クローニングされた核酸の、後の操作に必要とされる多くの配列が、第１の核酸の代わりに複製プラスミドベクター上に配置することができる。このことから、クローニングされた核酸をパッケージするためにカプシドを使用する場合に、より多くの標的核酸をクローニングすることが可能となる可能性がある。
【００４２】
組み込み部位および相補的な組み込み部位の例は、λシステムおよびＣｒｅ−ｌｏｘシステムを含むが、これらに限定されない。λファージが、Ｅ．ｃｏｌｉに感染する場合、それは、細胞を溶解して発達する可能性があり、または細菌染色体中の特異的なポイント、ａｔｔＢにおいて組み込むことによって、溶原菌を確立する可能性がある。組み込みは、λ上のａｔｔＰおよびａｔｔＢの間の部位特異的組換えによって媒介され、連続した染色体の中へのλの線状の挿入をもたらす。ａｔｔＰは、約２５０ｂｐ長であるが、ａｔｔＢは、わずか約２０ｂｐである。ファージｉｎｔ遺伝子の産物は、宿主因子ＩＨＦと共に、ａｔｔＰおよびａｔｔＢの間のクロスオーバー反応を触媒し、それによって組み込みを引き起こす。
【００４３】
第１の核酸は、ＰＩＳの下流にａｔｔＢを含んでもよく、第２の核酸は、複製可能であり、ａｔｔＰを含む。パッケージングを開始した後に、クローニングされたものは、複製可能な第２の核酸の中に組み込むことができる。同様の手法を用いて、ＤＮＡ断片は、Ｊａｎｕｓベクターの中に挿入された（Burlandら１９９３年）、これは、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００４４】
ｃ．λパッケージング
パッケージングシステムは、パッケージングを開始し終了するための特異的な部位を使用してもよい。正常なファージの発達において、ビリオン当たりのＤＮＡの長さは、頭部の容量によって直接決定されないので、λは「ヘッドフル」タイプのファージではない。代わりに、λは、パッケージングを開始し、かつ終了するために高度に特異的なｃｏｓ部位を使用する。これらの部位は、ターミナーゼによって切断されて、パッケージＤＮＡの末端に１２塩基突出（ｃｏｓＬおよびｃｏｓＲ）を残す。λの自然のローリングサークルパッケージング基質中で、ｃｏｓ部位は、頭部サイズによって決定されるフルパッケージングリミットよりも、共に近くに、間隔をおいて配置される。その結果として、頭部容量ではなくｃｏｓ部位間隔が、通常、ビリオンＤＮＡの長さを決定する。
【００４５】
ｄ．ヘッドフルパッケージング
「ヘッドフル」パッケージングシステムもまた使用することができる。ヘッドフルパッケージングシステムは、線状の連続移動方式において、ファージプロヘッドの空洞の中にクローニングされた核酸を供給し、それが、内部のＤＮＡが、進行を停止するのに十分な、内壁に対する圧力をかける限界に達するまで、頭部を拡張させてもよい。これは、頭部における立体構造変化を誘発してもよく、これは、入ってくるＤＮＡのエンドヌクレアーゼによる切断を活性化し、感染粒子を作製するためのファージ尾部の付着を可能にする。いっぱいの頭部は、狭いサイズ範囲内のＤＮＡ分子を含有してもよい。カプシドの容量は、パッケージＤＮＡに対する最大サイズの制限を設定してもよい。代表的なヘッドフルパッケージングシステムは、Ｐ１、Ｐ７、Ｔ４、ＫＶＰ４０、Ｐ２２、φ２９、およびＴ７を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
（１）Ｐ１
バクテリオファージＰ１およびＰ７は、１１０〜１１５ｋｂのヘッドフル容量を有する。パッケージング開始は、ｐａｃ部位で生じ、頭部がいっぱいになり、非特異的末端の切断が成されるまで続く。市販で入手可能な段階１ Ｐ１パッケージング抽出物またはｐａｃａｓｅ抽出物は、λのｃｏｓ部位に類似のｐａｃ部位でパッケージされるようにＤＮＡを切断してもよい。それは、ａｍ１０．１突然変異、Ｐ１遺伝子１０中のナンセンス突然変異を含有してもよい。それは、頭部および尾部のタンパク質を含むすべての後期ファージタンパク質合成を欠く。段階２抽出物は、頭部の中にＤＮＡをカプシド形成するファージパッケージングタンパク質を含有し、尾部を追加してもよい。それは、ｐａｃ−切断活性を欠く、遺伝子９のａｍ９．１６ナンセンス突然変異を含有してもよい。
【００４７】
パッケージング株はまた、２段階パッケージング反応のために構築することができる。パッケージング株構築のために、ナンセンス突然変異は、主な尾管タンパク質をコードするＴｕｂまたは主な尾鞘タンパク質をコードする遺伝子２２を含むが、これに限定されない主な尾部遺伝子のうち１つにおいて作り出すことができる。これにより、ｐａｃａｓｅ−頭部成熟／尾部欠乏段階１パッケージング抽出物をもたらしてもよい。段階２ｐａｃａｓｅ−頭部欠乏／尾部成熟株は、Ｐ１の主な頭部タンパク質をコードする遺伝子２３中にナンセンス突然変異を導入することによって、構築することができる。Ｐ１ゲノム内にＣａｍｒマーカーを置換することもまた望ましい可能性がある。
【００４８】
ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換えシステムは、Ｐ１パッケージクローニングされた核酸を環状にするために使用することができる。第１の核酸は、ｐａｃパッケージング開始配列の下流にｌｏｘＰ部位を含んでもよい。クローニングされた核酸の転位およびパッケージングの後に、Ｐ１頭部からはみ出たＤＮＡは、切り取られてもよく、第２のｌｏｘＰ組換え部位を含有する、λについて提唱されるようなリンカーは、この時、追加することができる。段階２パッケージング反応の間の尾部の追加に続いて、パッケージＤＮＡはＣｒｅ＋宿主の中に注入することができる。宿主細胞の中への注入に続いて、ＤＮＡは、Ｃｒｅリコンビナーゼによる２つのファージｌｏｘＰ部位の間の組換えによって環状にすることができる。これは、環状のクローニングされた核酸が複製され、安定して維持されることを可能にすることができる。
【００４９】
（２）Ｔ４
バクテリオファージＴ４は、１６９ｋｂのゲノムサイズを有する、最大の、十分に特徴づけられたファージのうち１つである。Ｐ１およびＰ７のように、Ｔ４は、ヘッドフル方式においてそのＤＮＡをパッケージし、パッケージングメカニズムの構成要素は、徹底的に研究されてきた。λ、Ｐ１、およびＰ７と異なり、Ｔ４ ＤＮＡのパッケージングは、特異的な部位で開始しない。Ｔ４のためのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムが開発されてきた。Ｔ４ ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムは、外来ＤＮＡを、効率的にパッケージすることができ、１６０ｋｂの長さまでの大きなＤＮＡ断片をクローニングするのに適応させることができる。
【００５０】
Ｐ１およびＰ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングについて上記に記載される同様の方法は、Ｔ４パッケージクローンを環状にするために使用されるｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換えシステムを使用して、利用することができる。Ｔ４システムの１つの利点は、より大きな変異体およびより小さな変異体の両方の多くの頭部長変異体の同定であり、パッケージされるＤＮＡの量は、適宜、変えられる。特定の頭部長突然変異と組み合わせてパッケージング株を使用することは、クローニングされた核酸の可能なサイズ範囲を拡張するのに有益であると分かる可能性がある。
【００５１】
（３）ＫＶＰ４０
ＫＶＰ４０は、Ｔ４関連のものであると比較ゲノム学によって示された広い宿主範囲のビブリオファージである。それは、２４５ｋｂのゲノムサイズを有する、大きく、尾がある、二本鎖ＤＮＡファージである。このファージの遺伝的性質および生化学的活性に関して現在、ほとんど知られていないが、ＫＶＰ４０のゲノム配列および構成は、Ｔ４との広範囲な保存の領域を示す。最大の保存領域のうち１つは、ビリオン構造遺伝子を構成する遺伝子クラスター中にあり、それらのＤＮＡパッケージングメカニズムにおける類似性を同様に示唆する。これは、ＫＶＰ４０を、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングシステムの候補にする。
【００５２】
ＫＶＰ４０ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムの開発はこの拡張のために必要とされるだろう。主な構成要素が十分に特徴づけられているＴ４ ＤＮＡパッケージングについての知識の増加と共に、類似の株は、ＫＶＰ４０のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング抽出物のために開発される可能性がある。推定上のターミナーゼ、頭部、および尾部に関連する遺伝子は既に同定されており、株構築のための可能な突然変異誘発標的を確実に提供するであろう。
【００５３】
ＫＶＰ４０の宿主範囲は、少なくとも８つのビブリオ種および１つのフォトバクテリウム種を含むが、それは、より望ましい宿主であるＥ．ｃｏｌｉに感染しない。Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのｏｍｐＫ遺伝子は、ＫＶＰ４０の宿主受容体として同定された外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードする。ＪＭ１０９などのＥ．ｃｏｌｉ株におけるｏｍｐＫ遺伝子の発現は、ＫＶＰ４０による感染を可能にする。
【００５４】
（４）Ｐ２２
バクテリオファージＰ２２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの株に感染する可能性があるポドウイルスである。Ｐ２２は、大サブユニット（Ｇｐ２）および小サブユニット（Ｇｐ３）を含むターミナーゼを用いるヘッドフルメカニズムを使用して、約４２ｋｂと同じくらいのＤＮＡをパッケージする。ターミナーゼは、ｐａｃ部位またはｐａｃ様部位でＤＮＡに結合し、切断してもよく、次いで、ウイルスプロカプシドの中へのＤＮＡのＡＴＰ加水分解ベースの転座に関与してもよい。プロカプシドがいっぱいになるまで、ＤＮＡは、プロカプシドの中にパッケージすることができる。パッケージングの間に、カプシドシェルは広がり、立体構造変化を受けてもよい。パッケージングに続いて、ターミナーゼは、再び、パッケージＤＮＡの末端を切断してもよく、次いで、放出され、なお、切断された、非パッケージＤＮＡに付着してもよい。次いで、ターミナーゼは、新しいプロカプシドの中に挿入され、連続サイクルにおいて隣接標的核酸断片をパッケージするプロセスを続けてもよい。
【００５５】
（ａ）Ｐ２２突然変異体
Ｐ２２は、高形質導入Ｐ２２（Ｐ２２ＨＴ）などのＰ２２突然変異体であってもよい。Ｐ２２ＨＴ突然変異は、遺伝子３において生じてもよく、これは、突然変異体Ｇｐ３タンパク質をもたらしてもよい。Ｐ２２ＨＴは、ＨＴ１０５／１突然変異を持っていてもよい。Ｐ２２ＨＴターミナーゼによるパッケージングの開始は、明らかな配列特異性をほとんどまたはまったく有していなくてもよく、したがって、より低い特異性でＤＮＡを認識してもよい。ターミナーゼは、ランダムな位置でＤＮＡに結合し、切断してもよく、次いで、ウイルスプロカプシドの中へのＤＮＡのＡＴＰ加水分解ベースの転座に関与してもよい（図７）。Ｐ２２ＨＴによってパッケージされる標的核酸は、４６ｋｂであってもよい。
【００５６】
Ｐ２２突然変異体は、また所与の標的核酸に沿っての処理能力が増加していてもよい。突然変異体は、標的核酸から１０までのカプシドをパッケージすることができる可能性がある。Ｐ２２突然変異体もまた、Ｅ．ｃｏｌｉに感染することができる可能性がある。
【００５７】
（５）φ２９
φ２９は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの株に感染できるバクテリオファージである。ファージは、扁長２０面体カプシドの内部に約３０ｋｂと同じくらいのＤＮＡを詰めてもよい。ＤＮＡは、頭部−尾部コネクター（Ｇｐ１０）、パッケージングＡＴＰアーゼ（Ｇｐ１６）、およびＲＮＡ分子の環（ｐＲＮＡ）を含むＡＴＰ依存性モーターによってプロカプシドの中に転座することができる。
【００５８】
（６）λパッケージングおよびＤｏｃ粒子
パッケージされる核酸は、まれに、間隔をおいて配置されるｃｏｓ部位を含有してもよい。パッケージングは、ｃｏｓ部位、ｃｏｓＬで始まってもよく、これは、切断されて、頭部の中に挿入される１２塩基突出を残す。ｃｏｓ部位は、標的核酸の末端にライゲーションされた第１の核酸によって、標的核酸の末端に存在していてもよい。パッケージングは、頭部がいっぱいになるまで、一方向に進んでもよい。ターミナーゼが、切断するための第２のｃｏｓ部位を見つけない場合、プロセスは、ＤＮＡが頭部から外にはみ出すと共に止まってもよい。はみ出たＤＮＡは、ＤＮアーゼＩなどのヌクレアーゼまたはＳａｕ３Ａなどの頻繁に切断する制限酵素によって非特異的に除去することができる。ヌクレアーゼがはみ出たＤＮＡを切断する位置は、ランダムであってもよい。
【００５９】
次いで、ファージ尾部を付着させて、λｄｏｃＬと呼ばれる、たった１つのｃｏｓ部位を有する粒子を産生してもよい。これらの粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉの中にそれらのＤＮＡを効率的に注入する可能性があるが、それらは、λ分子の右の末端に通常、見つけられる付着末端であるｃｏｓＲを欠くので、それは、細胞に入る際、効率的に環化しなくてもよい。λｄｏｃＬ粒子は、組み込みによって宿主細胞の中に核酸を導入するために使用することができる。尾部追加の代案として、第２のパッケージングが行なわれてもよい。ヌクレアーゼ消化およびＤＮＡ抽出の後に、リンカーをライゲーションし、後の産物を再度パッケージし、形質移入し、クローンを選択することができる。
【００６０】
ｌｏｘＰシステムは、尾部追加の代案としてクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ環状化のために使用することができる。ｌｏｘＰ部位は、第１の核酸上のＰＩＳの下流に追加することができる。クローニングされた核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングによってサイズ選択され、抽出され、ｌｏｘＰ部位を含有するリンカーは、ライゲーションすることができる。クローンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏＣｒｅリコンビナーゼによって環状にされ、プラスミドとして安定して維持されるように、宿主細胞の中にエレクトロポレーションすることができる。
【００６１】
２．パッケージＤＮＡの単離
カプシド形成後に、パッケージＤＮＡは、カプシドを単離することによって回収することができる。カプシドは、等密度遠心分離もしくは速度遠心分離または差次的沈降を含むが、これらに限定されない方法によって単離することができる。カプシドはまた、アフィニティー精製によって単離することができ、これは、拡張されたカプシドの表面上に含有されるタンパク質のエピトープに特異的に結合することができる抗体を使用することによって行なわれてもよい。たとえば、カプシドタンパク質は、λファージのＤタンパク質であってもよい。
【００６２】
抗カプシドタンパク質抗体は、固体支持体に付着することができる。固体支持体は、ビーズ、微粒子、カラム、試験ストリップ、カートリッジ、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライドガラス、またはナイロン、ニトロセルロース、もしくは他の適した材料などの膜であってもよい。微粒子は、０．２μｍ〜７．０μｍのサイズであってもよい。微粒子はまた、ハプテン化することができる。微粒子はまた、少なくとも１つまたは２つの蛍光標識によって含浸させてもよい。微粒子はまた、約０．１μｍ未満のサイズの強磁性流体または磁性粒子を形成することができてもよい。微粒子はまた、ろ過によって収集可能、または除去可能である可能性がある。
【００６３】
パッケージＤＮＡは、フェノール抽出などによってカプシドから単離することができる。抽出に先立って、ＤＮアーゼＩなどのヌクレアーゼは、非パッケージＤＮＡまたは非標的ＤＮＡを消化するために使用することができる。フェノールは、カプシドを含む溶液に追加することができる。この混合物を遠心分離した後に、水相は、有機相から分離されてもよく、クロロホルムが追加することができる。この混合物を遠心分離した後に、水相は、有機相から分離することができる。単離ＤＮＡは、水相に冷エタノールを追加することによって、水相から濃縮され、その後、遠心分離が続けられてもよい。ＤＮＡは、１回または複数回、エタノールを用いて洗浄してもよく、水または緩衝液中に再懸濁することができる。フェノール−クロロホルム抽出は、少なくとも１回、繰り返することができる。
【００６４】
パッケージＤＮＡはまた、ＤＮＡ結合カラムを使用して、カプシドから単離することができる。たとえば、ＱＩＡＧＥＮラムダ手順（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａ）が使用することができる。非パッケージＤＮＡまたは非標的ＤＮＡは、ヌクレアーゼを用いて消化することができる。カプシドは、沈澱され、次いで、溶解することができる。単離ＤＮＡは、カラムに結合させ、洗浄してもよい。ＤＮＡは、カラムから溶出され、イソプロパノールなどのアルコールを用いて溶液から沈澱することができる。ＤＮＡは、水または緩衝液中に再懸濁することができる。
【００６５】
カプシドが、カプシドタンパク質アフィニティーカラムを使用して単離される場合、カプシドは、溶出され、溶解することができる。パッケージＤＮＡは、上記に記載されるように、カラムベースのシステムを使用して、フェノール抽出することができ、または単離することができる。
【００６６】
単離ＤＮＡの末端は、フィルインされてもよく、これは、ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって行なわれてもよい。アダプター挿入断片は、ＤＮＡの末端にライゲーションされてもよく、これは、環状ＤＮＡをもたらしてもよい。ライゲーション反応は、アダプター挿入断片のそれぞれの末端が、単離ＤＮＡ分子の末端にライゲーションするのに十分な濃度のアダプター挿入断片を含んでもよい。アダプター挿入断片の末端は、リン酸化されなくてもよく、これは、アダプター挿入断片がモノマー環を形成するのを予防してもよい。ライゲーション反応は、油中水型エマルション中で行なわれてもよい。エマルションの水性液滴は、環状にされる約１つの単離ＤＮＡ分子を含有してもよい。
【００６７】
アダプター挿入断片は、２つのアダプタープライマー結合部位を含んでもよく、これは、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌなどのように、反対の向きを有していてもよい。結合部位は、１０〜５０または１６〜２５塩基対長であってもよい。アダプタープライマー挿入断片はまた、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を支援することができるプライミング領域を含んでもよい。それらの部位に結合してもよいプライマーは、国際公開第２００７／１４５６１２ Ａ１号または米国特許第７，１１５，４００号もしくは第７，３２３，３０５号において記載されるような配列を有していてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。たとえば、リーチングプライマー（ｒｅａｃｈｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）は、プライマーＡおよびプライマーＢであってもよい。アダプター挿入断片はまた、４５４配列決定システム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）上でうまく見つけるために使用することができる、短い（たとえば４ヌクレオチド）「配列決定キー」配列を含んでもよい。アダプター挿入断片はまた、セパレーターエレメントを含んでもよく、これは、知られている配列を有していてもよい。配列は、ローリングサークル増幅のためのプライミング部位を含んでもよい。配列はまた、単離ＤＮＡの２つの末端を同定するために使用することができる。単離ＤＮＡの、後の配列決定の間に、セパレーターエレメントの配列は、全単離ＤＮＡが配列決定されたことを示してもよい。アダプター挿入断片は、複製開始点を含んでもよく、かつさらにマーカーを含んでもよい。
【００６８】
アダプター挿入断片はまた、平滑末端切断制限酵素などの制限酵素のための認識配列を含んでもよく、この配列は、２つのアダプタープライマー結合部位の間に位置してもよい。単離ＤＮＡにアダプター挿入断片をライゲーションする際に、結果として生じるＤＮＡは、アダプタープライマー結合部位の間でＤＮＡを切断することができる制限酵素を用いて消化することができる。次いで、アダプター末端は、結果として生じる線状ＤＮＡの末端にライゲーションすることができる。
【００６９】
アダプター挿入断片はまた、「リーチング」制限酵素認識部位を含んでもよい。認識部位は、プライマー結合部位に隣接していてもよい。アダプター挿入断片はまた、２つのアダプタープライマー結合部位の側面に位置するリーチング制限酵素認識部位を含んでもよく、認識部位は、制限酵素認識部位から離れて、逆方向に向けられてもよい。リーチング制限酵素は、クラスＩＩＳ酵素であってもよく、これは、Ｆｏｋ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、Ｅａｒ Ｉ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、ＳｆａＮ Ｉ、またはＴｔｈ１１１ Ｉであってもよい。リーチング制限酵素はまた、クラスＩＩＩ制限酵素であってもよく、これは、ＥｃｏＰ１５ Ｉ、ＥｃｏＰ Ｉ、Ｈｉｎｆ ＩＩＩ、またはＳｔｙＬＴ Ｉであってもよい。単離ＤＮＡにアダプター挿入断片をライゲーションする際に、リーチング制限酵素は、単離ＤＮＡ内の位置でなどのように、認識部位から離れた位置でＤＮＡを切断してもよい。アダプター挿入断片はまた、特異的な結合メンバーを含んでもよく、これは、ビオチンであってもよい。
【００７０】
単離ＤＮＡに挿入断片をライゲーションした後に、結果として生じる環状ＤＮＡは、リーチング制限酵素を用いて消化されてもよく、これは、線状ＤＮＡ断片をもたらしてもよく、これは、それぞれの末端上に、単離ＤＮＡの末端に対応し得る配列を含んでもよい。ＤＮＡ断片は、環状にされてもよく、これは、ＤＮＡ断片の末端をフィルインし、次いで、ライゲーションを行なうことによって行なわれてもよい。
【００７１】
アダプタープライマー結合部位を含むアダプター末端はまた、単離ＤＮＡの末端にライゲーションすることができる。アダプター断片は、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を支援することができるプライミング領域を含んでもよく、４５４配列決定システム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）上でうまく見つけるために使用することができる、短い（たとえば４ヌクレオチド）「配列決定キー」配列を含んでもよい。部位に結合することができるプライマーは、プライマーＡまたはプライマーＢであってもよい。アダプター末端は、オリゴヌクレオチド配列Ｙを有する第１のアダプター末端であってもよい。アダプター末端はまた、オリゴヌクレオチド配列Ｚを有する第２のアダプター末端であってもよい。アダプター末端は、固体支持体に核酸を固定するための手段を含んでもよい。
【００７２】
アダプター末端は、縮重２塩基一本鎖３’突出を有していてもよい。縮重は、２つの突出塩基が、ランダムであってもよいこと（つまり、それらは、それぞれ、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣであってもよいこと）を意味し得る。アダプター末端は、単離ＤＮＡのリーチング制限酵素切断末端へのアダプターの、方向性をもつライゲーションを強く促進するために設計することができる。アダプター末端は、多量のモル過剰のアダプター末端（１５：１アダプター末端：単離ＤＮＡ比）を含有してもよいライゲーション反応において単離ＤＮＡ末端と組み合わせられてもよく、これは、単離ＤＮＡ末端の利用を最大限にしてもよく、単離ＤＮＡコンカテマーを形成する可能性を最小限にしてもよい。アダプター末端は、リン酸化されなくてもよく、これはアダプター末端ダイマーの形成を最小限にしてもよい。ライゲーションに続いて、ライゲーション産物は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの使用などによって、フィルイン反応の使用によって修復することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、またはＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【００７３】
アダプター末端は、米国特許第７，３２３，３０５号において記載されるように設計されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。アダプター末端は、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネート結合を含んでもよい。アダプター末端はまた、特異的な結合メンバーを含んでもよく、これは、ビオチンであってもよい。特異的な結合メンバーは、第１のアダプター末端に追加されてもよく、これは、５’末端であってもよく、特異的な結合メンバーは、第２のアダプター末端に追加されなくてもよい。第１および第２のアダプター末端の単離ＤＮＡへのライゲーションに続いて、単離ＤＮＡは、２つの第１のアダプター末端、１つの第１のアダプター末端および１つの第２のアダプター末端、ならびに２つの第２のアダプター末端を含んでもよい。アダプター末端ライゲーション単離ＤＮＡは、ストレプトアビジンなどの第１のアダプター末端の特異的な結合メンバーのための特異的な結合パートナーに結合された固体基質と接触させてもよい。固体基質は磁性ビーズであってもよい。
【００７４】
固体基質とアダプター末端ライゲーション単離ＤＮＡを接触させる際に、少なくとも１つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡのみが結合するであろう。１つの第１のアダプター末端のみを含む単離ＤＮＡは、単離ＤＮＡの一方の末端で結合するであろうが、２つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡは、２つの末端で結合するであろう。非結合単離ＤＮＡは、固体基質から洗い流することができる。固体基質は、低塩類（「融解」または変性）溶液にさらされてもよく、これは、１つの第１のアダプター末端のみを含む単離ＤＮＡのみを放出してもよい。２つの第１のアダプター末端を含む単離ＤＮＡは、固体基質に結合したままであろう。固体基質から放出される単離一本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅および配列決定においてなどのように、さらなる使用のために収集することができる。
【００７５】
３．パッケージＤＮＡの増殖
カプシド形成後に、クローニングされた核酸はまた、適切な宿主細胞に感染させるために使用することができる。宿主細胞において、クローニングされた核酸は、環状にされ、増殖することができる。次いで、クローニングされた核酸は、ＤＮＡの単離のために標準的な手法を使用して単離することができる。クローニングされた核酸のＩＳ混入を予防するために、宿主株は、ＩＳエレメントを含んでいなくてもよい。
【００７６】
クローニングされた核酸が環状ではない場合、それは、カプシドから単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて環状にすることができる。環状化は、線状ＤＮＡの末端と適合性の１つもしくは複数のリンカーのライゲーションまたは組換えを含むが、これらに限定されない方法によって行なわれてもよい。
【００７７】
環状核酸は、ｏｒｉおよび選択可能マーカーまたは可視マーカーを含んでもよい。環状核酸は、細菌などの宿主細胞中で増殖させることができる核酸であってもよく、細菌人工染色体（ＢＡＣ）であってもよい。環状核酸は、宿主細胞の中に形質転換することができる。
【００７８】
４．単離ＤＮＡの増幅
単離ＤＮＡは、ＰＣＲなどによって増幅することができる。単離ＤＮＡが環状にされている場合、それは、アダプタープライマー結合部位の間に位置する部位で、ＤＮＡを切断することができる制限酵素を用いてそれを消化することによって線状にすることができる。
【００７９】
ａ．エマルションＰＣＲ
アダプタープライマー結合部位を含む単離ＤＮＡは、ビーズエマルションＰＣＲ増幅（ｅｍＰＣＲ）の使用などによってＰＣＲ増幅することができる。ｅｍＰＣＲは、米国特許第７，３２３，３０５号および国際公開第２００７／１４５６１２号において記載されるように行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。単離ＤＮＡは、一本鎖であってもよく、アダプタープライマーにアニールすることができる。アダプタープライマーは、固体支持体に付着させてもよく、これは、球状ビーズであってもよい。固体支持体は、複数の結合アダプタープライマーを含んでもよい。固体支持体は、水性反応混合物中に懸濁され、次いで、油中水型エマルション中にカプセル化することができる。エマルションは、分散した水相微小滴を含んでもよく、これは、６０〜１００μｍの直径であってもよく、耐熱性の油相によって包まれてもよい。それぞれの微小滴は、増幅反応溶液（つまり核酸増幅のために必要な試薬）を含有してもよい。増幅は、ＰＣＲ反応ミックス（ポリメラーゼ、塩類、ｄＮＴＰｓ）ならびに１対のアダプタープライマー（プライマーＡおよびプライマーＢ）を含んでもよい。微小滴集団のサブセットはまた、ＤＮＡ鋳型を含むＤＮＡビーズを含有してもよい。微小滴のこのサブセットは、増幅のための基本となってもよい。このサブセット内にないマイクロカプセルは、鋳型ＤＮＡを有していなくてもよく、増幅に参加しなくてもよい。増幅技術は、ＰＣＲであってもよく、ＰＣＲプライマーは、非対称ＰＣＲを行なうために８：１または１６：１の比で存在する（つまり、１つの第２のプライマーに対して８または１６の第１のプライマー）。
【００８０】
単離ＤＮＡは、ビーズに固定することができるオリゴヌクレオチド（プライマーＢ）にアニールすることができる。サーモサイクリングの間に、一本鎖ＤＮＡ鋳型およびビーズ上の固定Ｂプライマーの間の結合は切断される可能性があり、これは、周囲のマイクロカプセル化溶液の中に鋳型を放出する可能性がある。増幅溶液は、追加の溶液相プライマーＡおよびプライマーＢを含有してもよい。結合反応速度が、固定プライマーよりも溶液相プライマーについてより速いので、溶液相Ｂプライマーは、鋳型の相補的ｂ’領域に容易に結合してもよい。初期ＰＣＲにおいて、Ａ鎖およびＢ鎖の両方は、等しく十分に増幅することができる。
【００８１】
中期増幅（つまり、サイクル１０および３０の間）によって、Ｂプライマーは、消耗されてもよく、これは、指数関数的増幅を停止させてもよい。次いで、反応は、非対称増幅に入ってもよく、単位複製配列集団は、Ａ鎖が優位を占めるようになってもよい。後期相増幅において、３０〜４０のサイクル後に、非対称増幅は、溶液中でＡ鎖の濃度を増加させてもよい。過剰Ａ鎖は、ビーズ固定Ｂプライマーにアニールし始める。次いで、耐熱性ポリメラーゼは、単位複製配列の固定ビーズ結合Ｂ鎖を合成するために、鋳型としてＡ鎖を用いる。
【００８２】
終期増幅において、熱サイクリングを続けると、ビーズ結合プライマーへのさらなるアニーリングが強いられる可能性がある。溶液相増幅はこの段階で最小限となる可能性があるが、固定Ｂ鎖の濃度は増加する可能性がある。次いで、エマルションは、破壊されてもよく、固定産物は、変性によって（熱、ｐＨなどによって）一本鎖にされてもよく、これは、相補的Ａ鎖を取り出してもよい。Ａプライマーは、固定鎖のＡ’領域にアニールされてもよく、固定鎖に、配列決定酵素および任意の必要な補助タンパク質が載せられてもよい。次いで、ビーズは、米国特許第６，２７４，３２０号、第６２５８，５６８号、および第６，２１０，８９１号において記載されるものなどのように、認識されるピロリン酸技術を使用して配列決定されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００８３】
（１）捕捉ビーズへのアダプタープライマーの結合
アダプタープライマーは、捕捉ビーズに付着することができる。プライマーは、当技術分野において知られている任意の方式において固体支持体捕捉ビーズに付着することができる。多数の方法は、微視的ビーズなどの固体支持体にＤＮＡを付着させるために当技術分野において存在する。ビーズへのＤＮＡの共有化学結合は、ホスホアミデート結合を通してＤＮＡ上の５’−リン酸をアミノコート捕捉ビーズに結合するために、水溶性カルボジイミドなどの標準的なカップリング剤の使用によって成し遂げることができる。他の代案は、同様の化学作用を使用して、第１に特異的なオリゴヌクレオチドリンカーをビーズにカップルし、次いで、ＤＮＡをビーズ上のリンカーに結合するためにＤＮＡリガーゼを使用することである。ビーズにオリゴヌクレオチドをつなぐための他の結合化学作用は、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）およびその誘導体の使用を含む。そのような方法において、オリゴヌクレオチドの一方の末端は、固体支持体と共有結合を形成する反応基（アミド基など）を含有してもよく、リンカーの他方の末端は、固定されるオリゴヌクレオチドと結合することができる第２の反応基を含有する。オリゴヌクレオチドは、共有結合によってＤＮＡ捕捉ビーズに結合することができる。しかしながら、キレート化または抗原抗体複合体などの非共有結合もまた、ビーズにオリゴヌクレオチドをつなぐために使用することができる。
【００８４】
制限酵素部位からのオーバーラップ末端またはバクテリオファージラムダベースのクローニングベクターの「付着末端」などのように、ＤＮＡ断片の末端でユニークな配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーが、利用することができるが、平滑末端ライゲーションもまた有益に使用することができる。これらの方法は、米国特許第５，６７４，７４３号において詳細に記載される。ビーズを固定するために使用される方法は、本発明の方法におけるステップの全体にわたって、固定オリゴヌクレオチドを結合させるために続けてもよい。
【００８５】
それぞれの捕捉ビーズは、単離ＤＮＡの一部を認識する（つまり、相補的である）複数のプライマーを有するように設計されてもよく、単離ＤＮＡは、したがって、捕捉ビーズにハイブリダイズされる。単離ＤＮＡのクローン増幅を成し遂げるために、１つのユニークな単離ＤＮＡのみがいずれか１つの捕捉ビーズに付着してもよい。
【００８６】
本明細書において使用されるビーズは、任意の好都合なサイズであってもよく、任意の数の知られている材料から製造することができる。そのような材料の例は、無機物、天然ポリマー、および合成ポリマーを含む。これらの材料の特定の例は、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、グラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニールおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンと架橋されたポリスチレン、またはその他同種のもの（たとえばMerrifield、Biochemistry １９６４年、３巻、１３８５〜１３９０頁において記載される）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御孔ガラス、金属、架橋デキストラン（たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ（商標））アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、および当業者らに知られている固相支持体を含む。捕捉ビーズは、約２５〜４０μｍの直径のＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズであってもよい。
【００８７】
（２）乳化
付着した一本鎖鋳型核酸を有する捕捉ビーズは、熱安定性の油中水型エマルションとして乳化することができる。エマルションは、当技術分野において知られている任意の適した方法によって形成することができる。エマルションを作り出すための１つの方法が下記に記載されるが、エマルションを作製するための任意の方法が使用することができる。これらの方法は、当技術分野において知られており、補助剤法、向流法、逆流法、回転ドラム法、および膜法を含む。そのうえ、マイクロカプセルのサイズは、構成要素の流量および速度を変動させることによって調整することができる。たとえば、液滴追加において、滴のサイズおよび送達の総時間は変動させてもよい。エマルションは、マイクロリットル当たり約３，０００ビーズの密度で、ある程度の密度のビーズ「マイクロリアクター」を含有してもよい。
【００８８】
エマルションは、増幅溶液中で鋳型付着ビーズを懸濁することによって生成することができる。本明細書において使用されるように、「増幅溶液」という用語は、鋳型ＤＮＡの増幅を行なうのに必要な、試薬の十分な混合物を意味し得る。
【００８９】
ビーズ／増幅溶液混合物は、液滴に追加して、生物学的適合油（たとえば軽鉱物油、Ｓｉｇｍａ）の回転混合物にし、乳化させてもよい。使用される油は、１つまたは複数の生物学的適合乳化安定剤で補足することができる。これらの乳化安定剤はＡｔｌｏｘ ４９１２、Ｓｐａｎ ８０、および他の認識され、市販で入手可能な適した安定剤を含んでもよい。形成される液滴は、５ミクロン〜５００ミクロン、約５０〜３００ミクロン、または１００〜１５０ミクロンのサイズに及んでもよい。
【００９０】
マイクロリアクターのサイズの制限はない。マイクロリアクターは、必要とされる増幅の程度にとって十分な増幅試薬を包含するのに十分に大きいものであってもよい。マイクロリアクターはまた、それぞれが、ＤＮＡライブラリーのメンバーを含有するマイクロリアクターの集団が、従来の実験装置（たとえばＰＣＲサーモサイクリング装置、試験管、インキュベーター、およびその他同種のもの）によって増幅することができるように、十分に小さいものであってもよい。
【００９１】
マイクロリアクターの最適サイズは、１００〜２００ミクロンの直径としてもよい。このサイズのマイクロリアクターは、１０ｍｌ未満の容量のマイクロリアクターの懸濁液中で、約６００，０００メンバーを含むＤＮＡライブラリーの増幅を可能にすることができる。たとえば、ＰＣＲが選ばれた増幅方法である場合、１０ｍｌは、９６本の管の容量を有する一般的なサーモサイクラーの９６本の管に一致するであろう。６００，０００マイクロリアクターの懸濁液は、１ｍｌ未満の容量を有していてもよい。１ｍｌ未満の懸濁液は、従来のＰＣＲサーモサイクラーの約１０本の管において増幅することができる。６００，０００マイクロリアクターの懸濁液はまた、０．５ｍｌ未満の容量を有していてもよい。
【００９２】
（３）増幅
カプセル化後に、鋳型核酸は、転写ベースの増幅システム（Kwoh D.ら、Proc.Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８６巻：１１７３頁（１９８９年）；Gingeras T. R.ら、ＰＣＴ特許出願国際公開第８８／１０３１５号；Davey,C.ら、欧州特許出願公開第３２９，８２２号；Miller, H. I.ら、ＰＣＴ特許出願国際公開第８９／０６７００号および「ｒａｃｅ」（Frohman, M.A.、In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press、NY（１９９０年））および「片側ＰＣＲ」（Ohara,O.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８６巻、５６７３〜５６７７頁（１９８９年））を含むＤＮＡ増幅の任意の適した方法によって増幅することができる。なお、「ジオリゴヌクレオチド」増幅、等温増幅（Walker,G. T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年））、およびローリングサークル増幅（米国特許第５，７１４，３２０号において考察される）などのそれほど一般的ではない方法が、本発明において使用することができる。
【００９３】
ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲによって行なわれてもよい。ＰＣＲは、ＰＣＲに必要な試薬をすべて含むＰＣＲ溶液を用いて、ビーズに結合された単離ＤＮＡをカプセル化することによって行なわれてもよい。次いで、ＰＣＲは、当技術分野において知られている任意の適したサーモサイクリングレジメンにエマルションをさらすことによって成し遂げることができる。３０および５０サイクルの間のまたは約４０サイクルの増幅が行なわれてもよい。増幅手順に続いて、１つまたは複数のハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルが増幅サイクルに続いてあってもよい。１０および３０サイクルの間のまたは約２５サイクルのハイブリダイゼーションおよび伸長が行なわれてもよい。鋳型ＤＮＡは、典型的に、鋳型ＤＮＡの少なくとも２００万〜５０００万のコピーまたは約１０００万〜３０００万のコピーがビーズ当たりに固定されるまで増幅することができる。
【００９４】
（４）エマルションの破壊およびビーズ回収
単離ＤＮＡの増幅に続いて、エマルションは、「破壊」することができる（「解乳化」とも呼ばれる）。米国特許第５，９８９，８９２号においてなどのように、エマルションを破壊するための多くの方法があり、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。エマルションは、さらなる油を追加して、エマルションを２つの相に分離することによって破壊することができる。次いで、油相は、除去されてもよく、適した有機溶媒（たとえばヘキサン）が追加することができる。混合後に、油／有機溶媒相は除去される。このステップは数回繰り返することができる。最後に、ビーズ上の水層は除去することができる。次いで、ビーズは、有機溶媒／アニーリング緩衝混合液を用いて洗浄してもよく、次いで、アニーリング緩衝液中で再び洗浄してもよい。適した有機溶媒は、メタノール、エタノール、およびその他同種のものなどのアルコールを含む。
【００９５】
次いで、増幅された単離ＤＮＡ含有ビーズは、たとえば知られている技術による配列決定反応における使用のために水溶液中に再懸濁することができる（Sanger, F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.７５巻、５４６３〜５４６７頁（１９７７年）；Maxam,A. M. & Gilbert、W. Proc Natl Acad Sci USA７４巻、５６０〜５６４頁（１９７７年）；Ronaghi, M.ら、Science２８１巻、３６３巻、３６５巻（１９９８年）；Lysov,I.ら、Dokl Akad Nauk SSSR３０３巻、１５０８〜１５１１頁（１９８８年）；Bains W. & Smith G. C. J.TheorBiol１３５巻、３０３〜３０７頁（１９８８年）；Drnanac, R.ら、Genomics４巻、１１４〜１２８頁（１９８９年）；Khrapko,K. R.ら、FEBS Lett２５６巻、１１８〜１２２頁（１９８９年）；Pevzner P. A. J Biomol Struct Dyn７巻、６３〜７３頁（１９８９年）；Southern,E. M.ら、Genomics１３巻、１００８〜１０１７頁（１９９２年）を参照されたい）。ビーズは、ピロリン酸ベースの配列決定反応において使用されてもよく（たとえば米国特許第６，２７４，３２０号、第６２５８，５６８号、および第６，２１０，８９１号において記載される、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる）、ＰＣＲ産物の第２の鎖は除去されてもよく、配列決定プライマーは、ビーズに結合された一本鎖単離ＤＮＡにアニールすることができる。
【００９６】
第２の鎖は、ＮａＯＨ、低イオン（たとえば塩）強度、または熱処理などの一般的に知られている任意の数の方法を使用して融解することができる。この融解ステップに続いて、ビーズはペレットにされてもよく、上清は捨てられてもよい。ビーズは、アニーリング緩衝液中に再懸濁されてもよく、配列決定プライマーは、追加されてもよく、標準的なアニーリングサイクルを使用して、ビーズ付着一本鎖鋳型にアニールすることができる。
【００９７】
（５）ビーズの精製
ビーズ上の増幅ＤＮＡはまた、直接ビーズ上でまたは異なる反応槽中で配列決定することができる。ＤＮＡは、反応槽にビーズを移し、ＤＮＡを配列決定反応にかけることによって、直接ビーズ上で配列決定することができる（たとえばピロリン酸配列決定またはＳａｎｇｅｒ配列決定）。その代わりに、ビーズは、単離することができ、ＤＮＡは、それぞれの各ビーズから取り出され、配列決定することができる。いずれの場合においても、配列決定ステップは、それぞれの個々のビーズについて行なわれてもよい。ビーズはまた、米国特許第７，３２３，３０５号において記載される方法によって精製されてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【００９８】
ｂ．ブリッジングＰＣＲ
環状であってもよく、アダプター挿入断片を含んでもよい単離ＤＮＡは、「ブリッジング」ＰＣＲを使用してＰＣＲ増幅することができる。ブリッジングＰＣＲは、米国特許第７，１１５，４００号において記載される方法によって行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。増幅に先立って、単離ＤＮＡは、２つのプライマー結合部位の間の部位を切断する制限酵素を用いてそれを消化することによって線状にすることができる。単離ＤＮＡの一方の末端（５’末端）の配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｙを有していてもよく、「コロニー」プライマーＸの配列と同一の配列を含んでもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、知られている配列であってもよく、可変長であってもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、少なくとも５ヌクレオチド長、５〜１００ヌクレオチド長、または約２０ヌクレオチド長であってもよい。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列Ｙ中に存在してもよい。
【００９９】
配列Ｙの反対側の単離ＤＮＡの末端（３’末端）に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｚを有していてもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、知られている配列であってもよく、可変長であってもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、少なくとも５ヌクレオチド長、５〜１００ヌクレオチド長、または約２０ヌクレオチド長であってもよい。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列Ｚ中に存在してもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、それがコロニープライマーＸとハイブリダイズするように設計されてもよく、それが、本明細書においてＹ’と呼ばれるオリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的となるように設計することができる。核酸鋳型のそれぞれ５’および３’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、鋳型の末端の先端に位置する必要はない。たとえば、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、核酸鋳型のそれぞれ５’および３’末端（もしくは末端）にまたはその近くに位置してもよいが（たとえば、５’および３’末端の０〜１００ヌクレオチド以内）、それらは、核酸鋳型の５’または３’末端からさらに離れて（たとえば１００ヌクレオチドを超えて）位置してもよい。したがって、配列ＹおよびＺが、どちらかの側にある、つまり、増幅される核酸配列の側面に位置するという条件で、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは核酸鋳型内の任意の位置に位置してもよい。
【０１００】
本明細書において使用されるような「核酸鋳型」はまた、二本鎖形態の、増幅され、配列決定される核酸を含む実体を含む。核酸鋳型が二本鎖形態をしている場合、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、鎖のうち１つのそれぞれ５’および３’末端に含有される。他の鎖は、ＤＮＡの塩基対合則により、オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺを含有する鎖に相補的であり、したがって、５’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚ’および３’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ’を含有する。
【０１０１】
本明細書において使用されるような「コロニープライマー」は、相補的配列にハイブリダイズし、特異的なポリメラーゼ反応を開始することができるオリゴヌクレオチド配列を含む実体を指し得る。コロニープライマーを含む配列は、それが、その相補的配列との最大のハイブリダイズ活性およびあらゆる他の配列への非常に低い非特異的ハイブリダイズ活性を有するように選ばれる。コロニープライマーとして使用される配列は、任意の配列を含むことができるが、5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG（配列番号１）または5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC（配列番号２）を含んでもよい。コロニープライマーは、５〜１００塩基長または１５〜２５塩基長とすることができる。自然発生ヌクレオチドまたは非自然発生ヌクレオチドがプライマー中に存在してもよい。１つまたは２つの異なるコロニープライマーは、本発明の方法において核酸コロニーを生成するために使用することができる。
【０１０２】
本明細書において使用されるような「縮重プライマー配列」は、上述の核酸断片の配列と無関係の任意の核酸断片にハイブリダイズすることができる、短いオリゴヌクレオチド配列を指し得る。したがって、そのような縮重プライマーは、鋳型へのハイブリダイゼーションが生じるのに（１つまたは複数の）核酸鋳型におけるオリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺの存在を必要としないが、オリゴヌクレオチド配列ＸまたはＹを含有する鋳型にハイブリダイズするための縮重プライマーの使用は除外されない。しかしながら、明白に、本発明の増幅方法における使用のために、縮重プライマーは、どちらかの側のまたは増幅される核酸配列の側面に位置する部位で鋳型中の核酸配列にハイブリダイズしなければならない。
【０１０３】
本明細書において使用されるような「固体支持体」は、たとえばラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、およびシリコンウェーハなどの、核酸が共有結合することができる任意の固体表面を指し得る。
【０１０４】
本明細書において使用されるような「固体支持体に核酸を付着させるための手段」は、化学的に修飾可能な官能基を含む任意の化学的または非化学的な付着方法を指し得る。「付着」は、共有結合によるまたは不可逆的受動的吸着を介してのまたは分子の間のアフィニティーを介しての、固体支持体上の核酸の固定に関する（たとえばビオチン化分子によるアビジンコート表面上の固定）。付着は、それが、ＤＮＡ変性条件下で水または水性緩衝液を用いて洗浄することによって除去され得ない十分な強度のものでなければならない。
【０１０５】
本明細書において使用されるような「化学的に修飾可能な官能基」は、たとえばリン酸基、カルボキシ部分もしくはアルデヒド部分、チオール基、またはアミノ基などの基を指し得る。
【０１０６】
本明細書において使用されるような「核酸コロニー」は、核酸鎖の多数のコピーを含む分散したエリアを指し得る。核酸鎖に対する相補鎖の多数のコピーもまた、同じコロニー中に存在してもよい。コロニーを構成する核酸鎖の多数のコピーは、固体支持体上に一般に固定され、一本鎖または二本鎖の形態をしていてもよい。本発明の核酸コロニーは、使用される条件に依存して異なるサイズおよび密度で生成することができる。コロニーのサイズは、０．２μｍ〜６μｍまたは０．３μｍ〜４μｍであってもよい。本発明の方法における使用のための核酸コロニーの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。より高い密度、たとえば、１００，０００／ｍｍ２〜１，０００，０００／ｍｍ２および１，０００，０００／ｍｍ２〜１０，０００，０００／ｍｍ２が達成することができると考えられる。
【０１０７】
核酸コロニーは、単離ＤＮＡから生成することができる。それぞれが複数の異なる単離ＤＮＡのうち１つを表わす複数のコロニーもまた生成することができる。
【０１０８】
増幅される核酸を含む複数の単離ＤＮＡが生成することができ、核酸はそれらの５’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙおよび３’末端にオリゴヌクレオチド配列Ｚを含有し、さらに、（１つまたは複数の）核酸は、５’末端に、固体支持体に（１つまたは複数の）核酸を付着させるための手段を有する。複数の単離ＤＮＡは、オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズし、５’末端に、固体支持体にコロニープライマーを付着させるための手段を持っていてもよい複数のコロニープライマーＸと混合される。複数の単離ＤＮＡおよびコロニープライマーは、固体支持体に共有結合してもよい。
【０１０９】
多数の２つの異なるコロニープライマーＸは、複数の核酸鋳型と混合することができる。コロニープライマーＸの配列は、オリゴヌクレオチド配列Ｚが、コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、オリゴヌクレオチド配列Ｙが、コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じであるようなものであってもよい。
【０１１０】
オリゴヌクレオチド配列Ｚはまた、オリゴヌクレオチド配列Ｙ（Ｙ’）に相補的であってもよく、複数のコロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列であってもよい。
【０１１１】
複数のコロニープライマーＸは、縮重プライマー配列を含んでもよく、複数の単離ＤＮＡは、増幅される核酸を含んでもよく、それぞれ５’および３’末端にオリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺを含有していなくてもよい。
【０１１２】
単離核酸の５’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、任意の配列および任意の長さであってもよく、配列Ｙとして本明細書において示される。オリゴヌクレオチドの適した長さおよび配列は、十分に知られている方法を使用して、選択することができ、当技術分野をにおいて立証されている。たとえば、増幅される核酸のそれぞれの末端に付着されるオリゴヌクレオチド配列は、５および１００ヌクレオチドの間の長さの通常、比較的短いヌクレオチド配列である。核酸の３’末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、任意の配列および任意の長さとすることができ、配列Ｚとして本明細書において示される。オリゴヌクレオチドの適した長さおよび配列は、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法を使用して、選択することができる。たとえば、増幅される核酸のそれぞれの末端に含有されるオリゴヌクレオチド配列は、５および１００ヌクレオチドの間の長さの通常、比較的短いヌクレオチド配列である。
【０１１３】
オリゴヌクレオチド配列Ｚの配列は、それがコロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができるようなものである。オリゴヌクレオチド配列Ｙの配列は、それがコロニープライマーＸのうち１つと同じであるようなものとしてもよい。オリゴヌクレオチド配列Ｚは、オリゴヌクレオチド配列Ｙ（Ｙ’）に相補的であってもよく、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である。
【０１１４】
オリゴヌクレオチド配列ＹおよびＺは、当技術分野において標準的もしくは従来のものである技術を使用して調製されてもよく、または商業的供給源から購入することができる。
【０１１５】
本発明の単離ＤＮＡを産生する場合、さらなる望ましい配列は、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法によって導入することができる。そのようなさらなる配列は、たとえば、制限酵素部位またはある核酸タグを含み、所与の核酸鋳型配列の増幅産物を同定することを可能にする。他の望ましい配列は、フォールドバックＤＮＡ配列（一本鎖にされた場合にヘアピンループまたは他の第２の構造を形成する）、たとえば、核酸ポリメラーゼによって認識されるプロモーターＤＮＡ配列などの、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を指示する「コントロール」ＤＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるオペレーターＤＮＡ配列を含む。
【０１１６】
増幅される複数の核酸配列がある場合、オリゴヌクレオチドＹおよびＺの付着は、同じまたは異なる反応において実行することができる。
【０１１７】
単離ＤＮＡが一度調製されたら、それは、本明細書において記載される方法において使用される前に増幅することができる。そのような増幅は、たとえば、発現ベクターの中に鋳型核酸を挿入し、かつ適した生物学的宿主においてそれを増幅するまたはＰＣＲによってそれを増幅することによって、十分に知られており、当技術分野をにおいて立証されている方法を使用して実行することができる。しかしながら、本発明の方法は、核酸鋳型の多数のコピーが、核酸鋳型の単一コピーから生成される核酸コロニーにおいて産生されるのを可能にするので、この増幅ステップは、必須ではない。
【０１１８】
単離ＤＮＡの５’末端は、固体支持体に核酸鋳型を共有結合させるための手段を有するように修飾することができる。そのような手段は、たとえば、たとえばリン酸基、カルボキシ部分もしくはアルデヒド部分、チオール基、またはアミノ基などの化学的に修飾可能な官能基とすることができる。チオール基、リン酸基、またはアミノ基は、核酸の５’−修飾のために使用することができる。
【０１１９】
コロニープライマーは、当技術分野において標準的なまたは従来のものである技術を使用して調製することができる。一般に、本発明のコロニープライマーは、十分に知られており、当技術分野において立証されている方法によって生成される合成オリゴヌクレオチドであり、または商業的供給源から購入することができる。
【０１２０】
１つまたは２つの異なるコロニープライマーＸは、任意の核酸配列を増幅するために使用することができる。コロニープライマーＸの５’末端は、固体支持体にコロニープライマーを共有結合させるための手段を有するように修飾することができる。共有結合は、上記に記載されるように、化学的に修飾可能な官能基であってもよい。コロニープライマーは、たとえば制限エンドヌクレアーゼ部位またはそれぞれリボザイム切断部位のような他のタイプの切断部位などのさらなる所望の配列を含むように設計することができる。さらなる配列は、フォールドバックＤＮＡ配列（一本鎖にされた場合にヘアピンループまたは他の第２の構造を形成する）、たとえば、核酸ポリメラーゼによって認識されるプロモーターＤＮＡ配列などの、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を指示する「コントロール」ＤＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるオペレーターＤＮＡ配列を含む。
【０１２１】
５’末端による支持体へのコロニープライマーＸの固定は、単離ＤＮＡの３’末端に含有される相補的なオリゴヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが一度起こったら、コロニープライマーがポリメラーゼによる鎖伸長のために利用可能となるように、その３’末端を支持体から遠くにしてもよい。
【０１２２】
一度、本発明の単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの両方が合成されたら、それらは、それらが、固体支持体に付着している場合に、付着された単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの適切な密度が得られるように、適切な割合で共に混合される。混合物中のコロニープライマーの割合は、単離ＤＮＡの割合よりも高くてもよい。単離ＤＮＡに対するコロニープライマーの比は、コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが固体支持体に固定される場合に、固体支持体の全体または明示されるエリアにほぼ一定の密度で位置する複数のコロニープライマーを含むコロニープライマーの「ローン（ｌａｗｎ）」が、コロニープライマーのローン内に間隔を置いて個々に固定される１つまたは複数の単離ＤＮＡと共に、形成されるようなものであってもよい。
【０１２３】
単離ＤＮＡは、一本鎖形態で提供することができる。しかしながら、それはまた、全体としてまたは部分的に、支持体への付着を可能にするように一方の５’末端または両方の５’末端が修飾された二本鎖形態で提供することができる。その場合、付着プロセスが完了した後に、たとえば放出される鎖を洗浄する前に９４℃まで加熱することによって、当技術分野において知られている手段によって鎖を分離することが望まれる。二本鎖分子の両方の鎖が表面と反応し、両方とも付着する場合、結果は、一方の鎖のみが付着し、１回の増幅ステップが行なわれる場合と同じである可能性がある。言いかえれば、二本鎖単離ＤＮＡの両方の鎖が付着した場合において、両方の鎖は、必然的に、互いに近くに付着し、一方の鎖のみを付着させ、１回の増幅ステップを行なう結果と区別不能である。したがって、一本鎖および二本鎖単離ＤＮＡは、表面に付着され、コロニー生成のために適した鋳型核酸を提供するために使用することができる。
【０１２４】
個々のコロニープライマーおよび個々の単離ＤＮＡの間の距離（したがって、コロニープライマーおよび単離ＤＮＡの密度）は、コロニープライマーおよび支持体に固定される単離ＤＮＡの濃度を変えることによってコントロールすることができる。コロニープライマーの密度は、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２、少なくとも１０ｆｍｏｌ／ｍｍ２、３０〜６０ｆｍｏｌ／ｍｍ２としてもよい。単離ＤＮＡの密度は、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２であってもよい。１００，０００／ｍｍ２〜１，０００，０００／ｍｍ２および１，０００，０００／ｍｍ２〜１０，０００，０００／ｍｍ２のより高い密度が達成することができる。
【０１２５】
付着した単離ＤＮＡおよびコロニープライマーの密度のコントロールは、支持体の表面上の核酸コロニーの最終密度をコントロールすることを可能にすることができる。これは、本発明の方法によれば、１つの核酸コロニーが、コロニープライマーが、固体支持体上の適した位置に存在するという条件で、１つの単離ＤＮＡの付着の結果として生じ得るといった事実によるものである。単一コロニー内の単離ＤＮＡの密度もまた、付着したコロニープライマーの密度をコントロールすることによってコントロールすることができる。
【０１２６】
コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが一度、適切な密度で固体支持体上に固定されたら、核酸コロニーは、それぞれのコロニーが、もとの固定された単離ＤＮＡおよびその相補的配列の多数のコピーを含むように、共有結合した単離ＤＮＡ上で適切な数の増幅のサイクルを実行することによって生成することができる。増幅の１回のサイクルは、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のステップからなり、これらのステップは、ＰＣＲについて当技術分野において十分に知られている試薬および条件を使用して、一般に行なわれる。
【０１２７】
典型的な増幅反応は、固体支持体、付着した単離ＤＮＡ、およびコロニープライマーをプライマーハイブリダイゼーションを誘発する条件にかけること、たとえば、それらを約６５℃の温度にかけることを含む。これらの条件下で、単離ＤＮＡの３’末端のオリゴヌクレオチド配列Ｚは、固定されたコロニープライマーＸにハイブリダイズするであろう、またヌクレオシド三リン酸分子または任意の他のヌクレオチド前駆体、たとえば修飾ヌクレオシド三リン酸分子の供給を加えての、プライマー伸長を支援するための条件および試薬、たとえば、約７２℃の温度、核酸ポリメラーゼ、たとえばＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ分子もしくは逆転写酵素分子（つまりＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）またはＲＮＡポリメラーゼの存在下において、コロニープライマーは、単離ＤＮＡに相補的なヌクレオチドの追加によって伸長するであろう。
【０１２８】
核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）、耐熱性細菌からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ、ＶＥＮＴ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼなど）、またはその遺伝子改変誘導体（ＴａｑＧｏｌｄ、ＶＥＮＴｅｘｏ、Ｐｆｕ ｅｘｏ）であってもよい。ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の組み合わせを使用して、ＤＮＡコロニーの増幅を生じさせることもできる。コロニープライマー伸長のために使用される核酸ポリメラーゼは、ＰＣＲ反応条件、つまり、加熱および冷却のサイクルの繰り返し下で安定性である可能性があり、使用される変性温度、普通、約９４℃で安定性である可能性がある。
【０１２９】
ヌクレオシド三リン酸分子は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、たとえばＤＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰであってもよく、またはリボヌクレオシド三リン酸、たとえばｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰであってもよい。ヌクレオシド三リン酸分子は、自然発生または非自然発生のものであってもよい。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションおよび伸長のステップの後に、支持体および付着した核酸を変性条件にさらす上で、２つの固定された核酸が存在するであろう、第１は、最初の固定された単離ＤＮＡであり、第２は、それに相補的な核酸であり、固定されたコロニープライマーＸのうち１つから伸長する。もとの固定された単離ＤＮＡおよび形成された固定された伸長コロニープライマーの両方は、次いで、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなるサイクルに支持体をかける上で、さらなる回の増幅を開始することができる。そのようなさらなる回の増幅は、単離ＤＮＡの多数の固定されたコピーおよびその相補的配列を含む核酸コロニーをもたらすであろう。
【０１３１】
単離ＤＮＡの最初の固定は、鋳型核酸が、全長の単離ＤＮＡ内で離れて位置するコロニープライマーとハイブリダイズすることができるのみであることを意味する。したがって、形成される核酸コロニーの境界は、最初の単離ＤＮＡが固定されるエリアに対して、比較的局所的なエリアに制限されている。明らかに、単離ＤＮＡおよびその相補体のより多くのコピーが、増幅のさらなる回、つまりハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなる回を実行することによって、一度、合成されたら、次いで、形成されるコロニーの境界が、最初の単離ＤＮＡが固定されるエリアに対して、なお、比較的局所的なエリアに制限される可能性があるが、生成されている核酸コロニーの境界は、さらに拡張することができるであろう。
【０１３２】
単一の固定された単離ＤＮＡからの核酸コロニーを生成することができ、これらのコロニーのサイズは、単離ＤＮＡがかけられる増幅の回数を変えることによってコントロールすることができる。したがって、それぞれの固定された単離ＤＮＡの場所内に十分な数の固定されたコロニープライマーがあるという条件で、固体支持体の表面上に形成される核酸コロニーの数は、支持体に最初に固定される単離ＤＮＡの数に依存する。コロニープライマーおよび単離ＤＮＡが固定された固体支持体が、プライマーのローン内に間隔を置いて固定された単離ＤＮＡと共に適切な密度で、固定されたコロニープライマーのローンを含んでいる可能性があるのは、この理由のためである。
【０１３３】
核酸コロニーのそのようないわゆる「オートパターニング」は、単離ＤＮＡがもともと固定される密度を調節することによって密度をコントロールすることができるという事実によりより高い密度の核酸コロニーが得ることができるという点において、他の方法に対して利点を有している可能性がある。そのような方法は、したがって、たとえば、支持体の特定の局所的なエリア上に特異的なプライマーを特異的に整列させ、次いで、プライマーの同じ局所的なエリア上に単離ＤＮＡを含有する特定のサンプルを配置することによってコロニー形成を開始することによって制限されない。先行技術方法を使用して整列することができるコロニーの数、たとえば国際公開第９６／０４４０４号（Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において開示されるものは、したがって、特異的なプライマーエリアが最初のステップにおいて整列され得る密度／間隔によって制限される。
【０１３４】
単離ＤＮＡの最初の密度、したがって、単離ＤＮＡから結果として生じる核酸コロニーの密度をコントロールすることができることによって、形成される核酸コロニーのサイズ、さらに個々のコロニー内の単離ＤＮＡの密度をコントロールすることができることと共に、高密度の個々の核酸コロニーを十分に大きなサイズの、十分に多くの増幅配列を含有する固体支持体上で産生することができ、核酸コロニーについて行なわれる後の分析またはモニタリングを可能にする、最適の状況に達することができる。
【０１３５】
一度、核酸コロニーが生成されたら、たとえばコロニー視覚化または配列決定などの、さらなるステップを行なうことが望ましい可能性がある。たとえば、特定の核酸断片の一部または全部の存在または不在について、生成されるコロニーをスクリーニングすることが必要である場合、たとえば、コロニー視覚化は、必要とされる可能性がある。この場合、特定の核酸断片を含有する１つまたは複数のコロニーは、対象とする核酸断片に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを設計することによって検出することができる。
【０１３６】
そのような核酸プローブは、蛍光基、ビオチンを含有する実体（たとえば、蛍光基を用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションによって検出することができる）、放射標識（当技術分野において十分に知られており、立証されている方法によって核酸プローブの中に取り込むことができ、たとえばシンチレーション液とのインキュベーションによって放射活性を検出することによって検出することができる）、もしくは染料または他の染色剤などの検出可能な実体を用いて標識してもよい。
【０１３７】
核酸プローブはまた、非標識であってもよく、核酸ポリメラーゼを用いる多くの標識ヌクレオチドの取り込みのためのプライマーとして作用するように設計することができる。次いで、取り込まれた標識、したがって核酸コロニーの検出を実行することができる。
【０１３８】
次いで、核酸コロニーは、ハイブリダイゼーションのために調製することができる。そのような調製は、コロニーを構成する核酸鋳型のすべてまたは一部分が、一本鎖形態で存在するように、コロニーの処理を含んでもよい。これは、たとえば、コロニー中の任意の二本鎖ＤＮＡの熱変性によって達成することができる。その代わりに、コロニーは、鋳型核酸中の配列の二本鎖形態に特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて処理することができる。したがって、エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド配列ＹまたはＺ中に含有される配列または単離ＤＮＡ中に存在する他の配列に特異的であってもよい。消化後に、コロニーは、二本鎖ＤＮＡ分子が分離されるように、加熱され、コロニーは、固定されていない鎖を除去するために洗浄されて、したがって、コロニー中に付着した一本鎖ＤＮＡを残す。
【０１３９】
ハイブリダイゼーションのためのコロニーの調製の後に、標識プローブまたは非標識プローブは、次いで、その特異的なＤＮＡ配列とのプローブのハイブリダイゼーションのための適切な条件下でコロニーに追加してもよい。
【０１４０】
次いで、プローブは、熱変性によって除去されてもよく、所望の場合、第２の核酸のための特異的なプローブが、ハイブリダイズされ、検出することができる。これらのステップは、所望されるだけ繰り返することができる。
【０１４１】
次いで、核酸コロニーにハイブリダイズされる標識プローブは、適切な検出デバイスを含む機器を使用して検出することができる。蛍光標識のための検出システムは、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラであってもよく、これは、拡大デバイス、たとえば顕微鏡に任意選択で連結することができる。そのような技術を使用して、並行して、多くのコロニーを同時にモニターすることが可能である。たとえばＣＣＤカメラおよび１０×または２０×対物レンズを有する顕微鏡を使用すると、１ｍｍ２および４ｍｍ２の間の表面に対してコロニーを観察することが可能であり、これは、１００００および２０００００コロニーの間のコロニーを並行してモニターすることに対応する。
【０１４２】
生成されるコロニーをモニターするための代替方法は、コロニーで覆われる表面をスキャンすることである。たとえば、１００００００００個までのコロニーを同時に整列することができ、全表面に対してＣＣＤカメラを用いて写真を撮ることによってモニターすることができるシステムを使用することができる。このように、１００００００００個までのコロニーを短時間でモニターすることができることを理解することができる。
【０１４３】
表面上の蛍光の検出および定量化を可能にする任意の他のデバイスもまた、本発明の核酸コロニーをモニターするために使用することができる。たとえば、蛍光画像装置または共焦点顕微鏡を使用することができる。標識が放射性である場合、放射活性検出システムが必要とすることができる。
【０１４４】
単離ＤＮＡの配列は、任意の適切な固相配列決定技術を使用することによって決定することができる。たとえば、本発明において使用することができる配列決定の１つの技術は、「配列決定プライマー」と本明細書において時に呼ばれる適切なプライマーを、配列決定される核酸鋳型とハイブリダイズすること、プライマーを伸長させること、およびプライマーを伸長させるために使用されるヌクレオチドを検出することを含む。プライマーを伸長させるために使用される核酸は、さらなるヌクレオチドが、成長している核酸鎖に追加される前に、検出されてもよく、したがって、１塩基ずつのｉｎ ｓｉｔｕ核酸配列決定を可能にする。
【０１４５】
取り込まれるヌクレオチドの検出は、プライマー伸長反応において１つまたは複数の標識ヌクレオチドを含むことによって容易にすることができる。任意の適切な検出可能な標識、たとえば蛍光体、放射標識などが使用することができる。蛍光標識が使用することができる。同じまたは異なる標識が、それぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用することができる。標識は蛍光体であり、同じ標識が、それぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用される場合、それぞれのヌクレオチド取り込みは、特定の波長で検出されるシグナルの累積的な増加を提供してもよい。異なる標識が使用される場合、これらのシグナルは、異なる適切な波長で検出することができる。所望の場合、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドの混合物が提供される。
【０１４６】
配列決定される単離ＤＮＡへの適切な配列決定プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、核酸鋳型は、一本鎖形態をしていてもよい。核酸コロニーを構成する核酸鋳型が二本鎖形態で存在する場合、これらは、当技術分野において十分に知られている方法を使用して、たとえば変性、切断などによって、一本鎖単離ＤＮＡを提供するために処理することができる。
【０１４７】
単離ＤＮＡにハイブリダイズされ、プライマー伸長に使用される配列決定プライマーは、たとえば１５〜２５ヌクレオチド長の短いオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマーの配列は、それらが、配列決定される単離ＤＮＡの一部にハイブリダイズするように設計されてもよく、ストリンジェントな条件下であってもよい。配列決定のために使用されるプライマーの配列は、核酸コロニーを生成するために使用されるコロニープライマーの配列と同じまたは同様の配列を有していてもよい。配列決定プライマーは、溶液または固定された形態で提供することができる。
【０１４８】
一度、配列決定プライマーが、単離ＤＮＡおよび配列決定プライマーを、当技術分野において十分に知られている方法によって決定される適切な条件にかけることによって、配列決定される単離ＤＮＡにアニールされたら、プライマー伸長は、たとえば、核酸ポリメラーゼおよび少なくともいくつかが、標識形態で提供されるヌクレオチドの供給および適したヌクレオチドが提供される場合に、プライマー伸長に適した条件を使用して、行なわれてもよい。
【０１４９】
それぞれのプライマー伸長ステップ後に、後のステップに干渉する可能性がある、取り込まれていないヌクレオチドを除去するために、洗浄ステップが含まれていてもよい。一度、プライマー伸長ステップが行なわれたら、核酸コロニーは、標識ヌクレオチドが伸長プライマーの中に取り込まれたかどうかを決定するために、モニターすることができる。次いで、プライマー伸長ステップは、伸長プライマーの中に取り込まれる次のおよび後のヌクレオチドを決定するために、繰り返することができる。
【０１５０】
適切な標識、たとえば蛍光または放射活性の検出および定量化を可能にする任意のデバイスが配列決定に使用することができる。標識が蛍光である場合、拡大デバイスに任意選択で付着されたＣＣＤカメラが使用することができる。実際に、配列決定のために使用されるデバイスは、増幅核酸コロニーをモニターするための、上記に記載されるデバイスと同じであってもよい。
【０１５１】
検出システムは、プライマー伸長のそれぞれのステップの後にそれぞれのコロニーに取り込まれるヌクレオチドの数および性質を決定するために、分析システムと組み合わせて使用することができる。この分析は、それぞれのプライマー伸長ステップ直後に実行されてもよくまたは記録されたデータを使用して後に実行されてもよく、所与のコロニー内の核酸鋳型の配列を決定することを可能にする。
【０１５２】
決定されている配列が未知の場合、所与のコロニーに適用されるヌクレオチドは、次いで、分析の全体にわたって繰り返される選ばれた順、たとえばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰで適用することができる。しかしながら、決定されている配列が知られており、たとえば、知られている配列からの配列中に小さな差異が存在するかどうかを分析するために、再度配列決定されている場合、配列決定プロセスは、知られている配列に従って選ばれる適切な順で、それぞれのステップで、ヌクレオチドを追加することによって、より速く成することができる。所与の配列との差異は、したがって、プライマー伸長の特定の段階での、あるヌクレオチドの取り込みの欠如によって検出される。
【０１５３】
固体支持体へのコロニープライマーおよび核酸鋳型の付着は、支持体が、核酸増幅反応の間にかけられてもよい温度、たとえば、約１００℃までの温度、たとえば約９４℃で耐熱性であってもよい。付着は、共有結合であってもよく、米国特許第７，１１５，４００号において記載されるように成し遂げることができ、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１５４】
５．単離ＤＮＡの配列決定
配列決定は、国際公開第２００７／１４５６１２号もしくは国際公開第０５００３３７５または米国特許第７，３２３，３０５号もしくは第７，１１５，４００号において記載される方法によって行なわれてもよく、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。機械は、Ｒｏｃｈｅ（４５４）ＧＳ ＦＬＸ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析機器配列決定プライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であってもよい。
【０１５５】
たとえば、ピロリン酸配列決定が使用することができる。この技術は、Hyman、１９８８年Anew method of sequencing DNA. Anal Biochem.１７４巻：４２３〜３６頁およびRonaghi、２００１年Pyrosequencingsheds light on DNA sequencing. Genome Res１１巻：３〜１１頁において記載されるように、ＤＮＡ合成の間に放出されるピロリン酸（Ｐｐｉ）の検出に基づく。
【０１５６】
酵素反応のカスケードにおいて、可視光は、取り込まれるヌクレオチドの数に比例して生成し得る。カスケードは、無機Ｐｐｉが、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みと共に放出することができる核酸重合反応を用いて始まってもよい。放出されるＰｐｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換されてもよく、これは、ルシフェラーゼにエネルギーを提供して、ルシフェリンを酸化してもよく、光を生成してもよい。追加されるヌクレオチドが知られているので、鋳型の配列は決定される可能性がある。固相ピロリン酸配列決定は、３つの酵素システムにおいて固定されたＤＮＡを用いる。シグナル対ノイズ比を増加させるために、自然ｄＡＴＰは、ｄＡＴＰαＳと交換することができる。ｄＡＴＰαＳは、２つの異性体（ＳｐおよびＲｐ）の混合物であってもよい。ピロリン酸中の純粋２’−デオキシアデノシン−５’−Ｏ’−（１−チオ三リン酸）Ｓｐ−異性体は、読み取り長の２倍まで、実質的により長い読み取りを可能にするために、配列決定において使用することができる。
【０１５７】
ピロリン酸ベースの配列決定は、ヌクレオチド三リン酸の存在下において、単離ＤＮＡおよび伸長プライマーをポリメラーゼ反応にかけることによって行なわれてもよく、それによって、ヌクレオチド三リン酸は、それが、標的位置における塩基に相補的である場合、取り込まれるようになり、ピロリン酸（ＰＰｉ）を放出するにすぎないであろう。ヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別々の一定分量にまたは同じサンプル−プライマー混合物に引き続いて追加される。ＰＰｉの放出は、次いで、どのヌクレオチドが取り込まれるかを示すために検出される。
【０１５８】
配列産物の領域は、単離ＤＮＡの領域に配列決定プライマーをアニールすることおよびＤＮＡポリメラーゼおよび知られているヌクレオチド三リン酸、つまり、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはこれらのヌクレオチドのうち１つの類似体と配列決定プライマーを接触させることによって、決定することができる。配列は、下記に記載されるように、配列反応副産物を検出することによって決定することができる。
【０１５９】
配列プライマーは、それが、増幅核酸鋳型の領域に特異的にアニールすることができる限り、任意の長さまたは塩基組成とすることができる。配列決定プライマーのための特定の構造は、それが、増幅鋳型核酸上の領域に特異的にプライムすることができる限り、必要とされない。配列決定プライマーは、特徴づけられる配列およびアンカープライマーにハイブリダイズすることができる配列の間にある鋳型の領域に相補的であってもよい。配列決定プライマーは、配列産物を形成するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長される。伸長は、１つまたは複数のタイプのヌクレオチド三リン酸および所望の場合、補助結合タンパク質の存在下において行なわれる。
【０１６０】
ｄＮＴＰの取り込みは、配列決定副産物の存在についてアッセイすることによって決定することができる。配列決定産物のヌクレオチド配列はまた、ｄＮＭＰが、伸長配列プライマーの中に取り込まれる時に、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から放たれる無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を測定することによって決定することができる。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）技術（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と称される配列決定のこの方法は、溶液（液相）中でまたは固相技術として行なわれてもよい。ＰＰｉベースの配列決定方法は、たとえば国際公開第ＷＯ９８１３５２３Ａ１号，Ronaghiら、１９９６年Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁、Ronaghiら、１９９８年Science２８１巻：３６３〜３６５頁（１９９８年）、および米国特許出願第２００１／００２４７９０号において一般に記載され、これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。たとえば米国特許第６，２１０，８９１号および第６，２５８，５６８号もまた参照されたい。これらの内容は、参照によって本明細書において組み込まれる。
【０１６１】
これらの条件下で放出されるピロリン酸は、酵素で（たとえばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における光の生成によって）検出することができる。そのような方法は、電気泳動の必要性および可能性として危険な放射標識の使用を回避しながら、ヌクレオチドを所与の標的位置において同定することおよびＤＮＡを簡単にかつ急速に配列決定することを可能にする。
【０１６２】
ＰＰｉは、多くの異なる手法によって検出されてもよく、様々な酵素法は、以前に記載されている（たとえばReevesら、１９６９年Anal. Biochem.２８巻：２８２〜２８７頁；Guilloryら、１９７１年Anal. Biochem.３９巻：１７０〜１８０頁；Johnsonら、１９６８年Anal.Biochem. 15:２７３頁；Cookら、１９７８年Anal. Biochem. 91：５５７〜５６５頁、およびDrakeら、１９７９年Anal.Biochem. 94：１１７〜１２０頁を参照されたい）。
【０１６３】
ポリメラーゼによるｄＮＴＰの取り込みの結果として放たれるＰＰｉは、たとえばＡＴＰスルフリラーゼを使用して、ＡＴＰに変換することができる。この酵素は、硫黄代謝に関与するとして同定された。硫黄は、還元形態および酸化形態の両方において、植物および動物の成長のための、必須の無機栄養素である（たとえば、SchmidtおよびJager、１９９２年Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.４３巻：３２５〜３４９頁を参照されたい）。植物および微生物の両方において、硫酸の活発な取り込みの後に硫化物への還元が続く。硫酸は、利用可能な細胞の還元剤に比べて非常に低い酸化／還元電位を有するので、同化における最初のステップは、ＡＴＰ依存性反応を介してのその活性化を必要とする（たとえばLeyh、１９９３年Crit.Rev. Biochem. Mol. Biol. 28：５１５〜５４２頁を参照されたい）。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニリルトランスフェラーゼ；ＥＣ ２．７．７．４）は、無機硫酸（ＳＯ４−２）の代謝における最初の反応を触媒する。たとえば、RobbinsおよびLipmann、１９５８年J.Biol. Chem.２３３巻：６８６〜６９０頁；HawesおよびNicholas、１９７３年Biochem. J.１３３巻：５４１〜５５０頁を参照されたい）。この反応において、ＳＯ４−２は、アデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）に活性化される。
【０１６４】
ＡＴＰスルフリラーゼは、Saccharomyces cerevisiae（たとえばHawesおよびNicholas、１９７３年Biochem.J.１３３巻：５４１〜５５０頁を参照されたい）、Penicillium chrysogenum（たとえばRenostoら、１９９０年J. Biol.Chem.２６５巻：１０３００〜１０３０８頁を参照されたい）、ラット肝臓（たとえばYuら、１９８９年Arch. Biochem. Biophys.２６９巻：１６５〜１７４頁を参照されたい）、および植物（たとえばShawおよびAnderson、１９７２年Biochem.J.１２７巻：２３７〜２４７頁；Osslundら、１９８２年Plant Physiol.７０巻：３９〜４５頁を参照されたい）などのいくつかの供給源から高度に精製されてきた。そのうえ、ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子は、原核生物（たとえばLeyhら、１９９２年J.Biol. Chem.２６７巻：１０４０５〜１０４１０頁；SchwedockおよびLong、１９８９年Mol. Plant Microbe Interaction２巻：１８１〜１９４頁；LaueおよびNelson、１９９４年J.Bacteriol.１７６巻：３７２３〜３７２９頁を参照されたい）、真核生物（たとえばCherestら、１９８７年Mol. Gen. Genet.２１０巻：３０７〜３１３頁；MountainおよびKorch、１９９１年Yeast７巻：８７３〜８８０頁；Fosterら、１９９４年J.Biol. Chem.２６９巻：１９７７７〜１９７８６頁を参照されたい）、植物（たとえばLeustekら、１９９４年Plant Physiol.１０５巻：８９７〜９０２１６頁を参照されたい）、および動物（たとえばLiら、１９９５年J.Biol. Chem.２７０巻：２９４５３〜２９４５９頁を参照されたい）からクローニングされてきた。酵素は、特定の供給源に依存して、ホモオリゴマーまたはヘテロダイマーである（たとえばLeyhおよびSuo、１９９２年J.Biol. Chem.２６７巻：５４２〜５４５頁を参照されたい）。
【０１６５】
耐熱性スルフリラーゼを使用することができる。耐熱性スルフリラーゼは、たとえばArchaeoglobus種またはPyrococcus種から得られてもよく、耐熱性スルフリラーゼの配列は、データベース受入番号０２８６０６、受入番号Ｑ９ＹＣＲ４、および受入番号Ｐ５６８６３で入手可能である。
【０１６６】
ＡＴＰスルフリラーゼは、多くの異なる適用、たとえば高濃度のＡＴＰでのＡＤＰのバイオルミノメトリック検出（たとえばSchultzら、１９９３年Anal. Biochem.２１５巻：３０２〜３０４頁を参照されたい）、ＤＮＡポリメラーゼ活性の継続的なモニタリング（たとえばNyrbn、１９８７年Anal.Biochem.１６７巻：２３５〜２３８頁を参照されたい）、およびＤＮＡ配列決定（たとえばRonaghiら、１９９６年Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁；Ronaghiら、１９９８年Science２８１巻：３６３〜３６５頁；Ronaghiら、１９９８年Anal.Biochem.２６７巻：６５〜７１頁を参照されたい）に使用されてきた。
【０１６７】
いくつかのアッセイが、前のＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のために開発されてきた。比色モリブドリシスアッセイは、リン酸検出に基づくものであってもよいのに対して（たとえばWilsonおよびBandurski、１９５８年J. Biol. Chem.２３３巻：９７５〜９８１頁を参照されたい）、継続的な分光光度モリブドリシスアッセイは、ＮＡＤＨ酸化の検出に基づくものであってもよい（たとえばSeubertら、１９８３年Arch.Biochem. Biophys.２２５巻：６７９〜６９１頁；Seubertら、１９８５年Arch. Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）。後のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要としてもよい。さらに、いくつかの放射性アッセイもまた文献において記載されている（たとえばDaleyら、１９８６年Anal.Biochem.１５７巻：３８５〜３９５頁を参照されたい）。たとえば、あるアッセイは、３２Ｐ標識ＡＴＰから放出される３２ＰＰｉの検出に基づくものであり（たとえばSeubertら、１９８５年Arch.Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）、他のアッセイは、［３５Ｓ］標識ＡＰＳへの３５Ｓの取り込みに基づき（このアッセイはまた、カップリング酵素として、精製ＡＰＳキナーゼをも必要とする；たとえばSeubertら、１９８３年Arch.Biochem. Biophys.２２５巻：６７９〜６９１頁を参照されたい）、第３の反応は、３５標識ＡＰＳからの３５ＳＯ４−２の放出に依存する（たとえばDaleyら、１９８６年Anal.Biochem.１５７巻：３８５〜３９５頁を参照されたい）。
【０１６８】
逆ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出については、継続的な分光光度アッセイ（たとえばSegelら、１９８７年MethodsEnzymol.１４３巻：３３４〜３４９頁を参照されたい）、バイオルミノメトリックアッセイ（たとえばBalharryおよびNicholas、１９７１年Anal.Biochem.４０巻：１〜１７頁を参照されたい）、３５ＳＯ４−２放出アッセイ（たとえばSeubertら、１９８５年Arch.Biochem. Biophys.２４０巻：５０９〜５２３頁を参照されたい）、または３２ＰＰｉ取り込みアッセイ（たとえばOsslundら、１９８２年PlantPhysiol.７０巻：３９〜４５頁を参照されたい）が使用することができる。
【０１６９】
ＡＴＰスルフリラーゼによって産生されるＡＴＰは、光を生成するために、酵素反応を使用して加水分解することができる。光放出化学反応（つまり化学発光）および生物学的反応（つまり生物発光）は、様々な代謝物質の高感度測定のために分析生化学において広く使用される。生物発光反応において、光の放出をもたらす化学反応は、酵素触媒することができる。たとえば、ルシフェリン−ルシフェラーゼシステムは、ＡＴＰの特異的なアッセイを可能にし、細菌ルシフェラーゼ−オキシドリダクターゼシステムは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをモニタリングするために使用することができる。両システムは、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの産生または利用を含むカップル反応の手段によって、多数の物質の分析まで拡張されてきた（たとえばKricka、１９９１年Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin.Chem.３７巻：１４７２〜１２８１頁を参照されたい）。
【０１７０】
新しい試薬の開発は、ＡＴＰ（たとえばLundin、１９８２年Applicationsof firefly luciferase In; Luminescent Assays（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（たとえばLovgrenら、Continuousmonitoring of NADH-converting reactions by bacterial luminescence. J. Appl.Biochem.４巻：１０３〜１１１頁を参照されたい）の濃度に比例した、安定性の光放出を得ることを可能にしてきた。そのような安定性の光放出試薬を用いると、知られている量のＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの追加によって終点アッセイをし、個々のアッセイを較正することが可能である。さらに、安定性の光放出システムはまたＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ変換システムの継続的なモニタリングを可能にする。
【０１７１】
ＡＴＰを光に変換するための適した酵素は、ルシフェラーゼ、たとえば昆虫ルシフェラーゼを含む。ルシフェラーゼは、触媒作用の最終産物として光を産生する。最もよく知られている光放出酵素は、ホタル、Photinus pyralis（甲虫目）の酵素である。対応する遺伝子は、クローニングされ、細菌（たとえばde Wetら、１９８５年Proc.Natl. Acad. Sci. USA８０巻：７８７０〜７８７３頁を参照されたい）および植物において（たとえばOwら、１９８６年Science２３４巻：８５６〜８５９頁を参照されたい）ならびに昆虫（たとえばJhaら、１９９０年FEBSLett.２７４巻：２４〜２６頁）および哺乳動物細胞において（たとえばde Wetら、１９８７年Mol. Cell. Biol.７巻：７２５〜７３７３頁；Kellerら、１９８７年Proc.Natl. Acad. Sci. USA８２巻：３２６４〜３２６８頁を参照されたい）発現されてきた。さらに、ジャマイカコメツキムシ、Pyroplorusplagiophihalamus（甲虫目）からの多くのルシフェラーゼ遺伝子は、最近、クローニングされ、部分的に特徴づけられてきた（たとえばWoodら、１９８９年J.Biolumin. Chemilumin.４巻：２８９〜３０１頁；Woodら、１９８９年Science２４４巻：７００〜７０２頁を参照されたい）。別のルシフェラーゼは、時に、異なる波長の光を産生することができ、これにより、異なる波長での光放出の同時のモニタリングが可能となる可能性がある。したがって、これらの前述の特徴は、ユニークであり、現在のレポーターシステムの利用に関して新しい特質を追加する。
【０１７２】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン５’−３リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン、および酸素の存在下において生物発光を触媒し、０．８８の量子収量をもたらしてもよい（たとえばMcElroyおよびSelinger、１９６０年Arch. Biochem. Biophys.８８巻：１３６〜１４５頁を参照されたい）。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応は、約１×１０−１３Ｍの検出限界で、ＡＴＰの検出のためのアッセイとして用いることができる（たとえばLeach、１９８１年J.Appl. Biochem.３巻：４７３〜５１７頁を参照されたい）。さらに、ルシフェラーゼ媒介検出システムの感度の全体的な程度および利便性は、ホタルルシフェラーゼベースのバイオセンサーの開発への相当な関心を引き起こした（たとえばGreenおよびKricka、１９８４年Talanta３１巻：１７３〜１７６頁；Blumら、１９８９年J.Biolumin. Chemilumin.４巻：５４３〜５５０頁を参照されたい）。
【０１７３】
上記の酵素を使用して、配列プライマーを、ポリメラーゼおよび知られているｄＮＴＰにさらすことができる。ｄＮＴＰが、プライマー配列の３’末端上に取り込まれる場合、ｄＮＴＰが切断されてもよく、ＰＰｉ分子が放たれてもよい。次いで、ＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼを用いてＡＴＰに変換することができる。ＡＴＰスルフリラーゼは、ＰＰｉの変換がＰＰｉに関しての一次速度式で進む十分に高い濃度で存在してもよい。ルシフェラーゼの存在下において、ＡＴＰは、加水分解されて、光子を生成する。反応は、反応、ＡＴＰ−−＞ＤＰ＋ＰＯ４３−＋光子（光）が、ＡＴＰに関しての一次速度式で進むように、反応混合物内に存在する十分な濃度のルシフェラーゼを有していてもよい。光子は、下記に記載される方法および器具を使用して測定することができる。ＰＰｉおよびカップルスルフリラーゼ／ルシフェラーゼ反応は、検出のための光を生成するために使用することができる。スルフリラーゼおよびルシフェラーゼのどちらかまたは両方は、それぞれの反応部位に配置される１つまたは複数の可動性固体支持体上に固定することができる。
【０１７４】
ＰＰｉは、リアルタイムシグナルを発するポリメラーゼ反応の間に検出されるように放出することができる。配列決定反応は、リアルタイムで継続的にモニターすることができる。反応は、２秒未満で起こってもよい（NyrenおよびLundin、前掲）。律速段階は、ＡＴＰスルフリラーゼによるＡＴＰへのＰＰｉの変換であってもよいが、ルシフェラーゼ反応は速く、０．２秒未満を要すると推測された。ポリメラーゼの取り込み速度もまた、様々な方法によって推測され、たとえば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼの場合において、１つの塩基の完全な取り込みは、０．５秒未満を要する可能性があることが分かった。したがって、１つの塩基の取り込みおよびこの酵素アッセイによる検出のための推測される総時間は、約３秒である。そのため、非常に速い反応時間が可能であり、リアルタイム検出を可能にすることが分かるであろう。反応時間は、より耐熱性のルシフェラーゼを使用することによってさらに減少し得る。
【０１７５】
ほとんどの適用については、ＡＴＰおよびＰＰｉのような混入物がない試薬が使用することができる。これらの混入物は、樹脂に結合されたアピラーゼおよび／またはピロホスファターゼを含有するプレカラムに試薬を流すことによって除去することができる。その代わりに、アピラーゼまたはピロホスファターゼは、磁性ビーズに結合されてもよく、試薬中に存在する混入しているＡＴＰおよびＰＰｉを除去するために使用することができる。さらに、拡散性の配列決定試薬、たとえば取り込まれていないｄＮＴＰｓは、洗浄緩衝液を用いて洗い流することができる。ピロリン酸配列決定において使用される任意の洗浄緩衝液が使用することができる。
【０１７６】
配列決定反応における反応物の濃度は、０．２ｍｌ緩衝液中に１ｐｍｏｌ ＤＮＡ、３ｐｍｏｌポリメラーゼ、４０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰを含んでもよい。Ronaghiら、Anal. Biochem.２４２巻：８４〜８９頁（１９９６年）を参照されたい。
【０１７７】
所望の場合、配列決定反応は、それぞれの４つの所定のヌクレオチドを用いて行なわれてもよい。「完全」サイクルは、所定の順において、ヌクレオチドＤＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）のそれぞれについての配列決定試薬を順次、与えることを含んでもよい。取り込まれていないｄＮＴＰｓは、それぞれのヌクレオチド追加の間に洗い流することができる。その代わりに、取り込まれていないｄＮＴＰｓは、アピラーゼによって分解することができる。サイクルは、配列産物の所望の量の配列が得られるまで、所望されるように繰り返することができる。約１０〜１０００、１０〜１００、１０〜７５、２０〜５０、または約３０ヌクレオチドの配列情報が、１つのアニールされた配列決定プライマーの伸長から得られてもよい。
【０１７８】
ヌクレオチドは、ビオチンなどのハプテンのジスルフィド誘導体を含有するように修飾することができる。アンカー基質にアニールした新生プライマーへの修飾ヌクレオチドの追加は、ｉ）修飾がビオチンである例において、酵素分子に結合されたアビジンコンジュゲート部分またはストレプトアビジンコンジュゲート部分の順次結合、ｉｉ）過剰なアビジン結合酵素またはストレプトアビジン結合酵素の洗い流し、ｉｉｉ）酵素活性に適用可能な条件下での適した酵素基質の流入、およびｉｖ）１つまたは複数の酵素基質反応産物の検出を含む重合後ステップによって分析することができる。ハプテンは還元剤の追加を通じて除去することができる。そのような方法は、電気泳動の必要性および可能性として危険な放射標識の使用を回避しながら、ヌクレオチドを所与の標的位置において同定することおよびＤＮＡを簡単にかつ急速に配列決定することを可能にする。
【０１７９】
ハプテンを検出するための酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼであってもよい。洗浄緩衝液は、本明細書において、様々な反応物の追加の間に使用することができる。アピラーゼは、配列決定プライマーを伸長させるために使用される、未反応ｄＮＴＰを除去するために使用することができる。洗浄緩衝液は、アピラーゼを含んでもよい。
【０１８０】
例としてのハプテン、たとえばビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料分子ｃｙ３およびｃｙ５、ならびにフルオレスセインは、伸長ＤＮＡ分子の中に様々な効率で取り込まれてもよい。ハプテンの付着は、糖、塩基を介しての、およびヌクレオチド上のリン酸部分を介しての結合を通して生じてもよい。シグナル増幅のための例としての手段は、蛍光手段、電気化学手段、および酵素手段を含む。酵素増幅が使用される場合、酵素、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼは、光生成基質が知られているものを含んでもよく、光生成（化学発光）基質の検出のための手段はＣＣＤカメラを含んでもよい。
【０１８１】
修飾塩基は、追加されてもよく、検出が生じてもよく、ハプテンコンジュゲート部分は、除去されてもよく、または切断剤もしくは不活性化剤の使用によって不活性化することができる。たとえば、切断可能なリンカーがジスルフィドである場合、切断剤は、還元剤、たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノールなどであってもよい。不活性化はまた、熱、冷却、化学的変性剤、界面活性剤、疎水性試薬、または自殺型阻害剤によって成し遂げることができる。
【０１８２】
ルシフェラーゼは、光子の同時に起こる放出を伴ってｄＡＴＰを直接、加水分解する可能性がある。加水分解は、伸長配列決定プライマーの中へのｄＡＴＰの取り込みと無関係に生じるので、これは、偽陽性シグナルをもたらす可能性がある。この問題を回避するために、ＤＮＡの中に取り込まれるｄＡＴＰ類似体が使用することができる、つまり、それは、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるが、ルシフェラーゼの基質ではない。１つのそのような類似体は、α−チオ−ｄＡＴＰである。したがって、α−チオ−ｄＡＴＰの使用により、成長している核酸鎖の中に取り込まれることなく、ｄＡＴＰが加水分解される場合に生じ得る偽性の光子生成を回避してもよい。
【０１８３】
ＰＰｉベースの検出は、配列決定プライマーの追加直後の、配列決定反応混合物へのコントロールヌクレオチドの追加に続いて放出される光の測定によって較正することができる。これにより、反応条件の標準化を可能にすることができる。２つ以上の連続した同一のヌクレオチドの取り込みは、放出される光の量における対応する増加によって明らかにすることができる。したがって、コントロールヌクレオチドと比較した、放出される光の２倍の増加により、伸長プライマーの中への２つの連続のｄＮＴＰｓの取り込みを明らかにしてもよい。
【０１８４】
アピラーゼは、配列決定反応混合物内で、あらゆる残りの取り込まれなかったｄＮＴＰｓの分解を容易にするために、固体支持体の表面に「薄く塗られてもよい」または「流することができる」。アピラーゼはまた、生成されるＡＴＰをも分解し、したがって、反応から生成される光を「消す」。アピラーゼを用いる処理の際に、あらゆる残りの反応物は、次に続くｄＮＴＰインキュベーションおよび光子検出のステップの調製中に洗い流することができる。その代わりに、アピラーゼは、固体支持体または可動性固体支持体に結合することができる。
【０１８５】
ａ．配列決定反応の検出
固体支持体は、画像システム２３０に光学的に結合されてもよく、これは、従来の光学機械または光ファイバー束と連携してＣＣＤシステムを含んでもよい。灌流チャンバー基質は、水性インターフェースの近くで生成される光が、基質またはチャンバーの外部に光ファイバーを通して直接伝達することができるように、光ファイバーアレイウェーハを含んでもよい。ＣＣＤシステムが光ファイバーコネクターを含む場合、画像化は、灌流チャンバー基質をコネクターと直接接触させて配置することによって成し遂げることができる。その代わりに、従来の光学機械は、たとえば、光ファイバー基質の外部から直接、ＣＣＤセンサー上への１−１倍率高開口数レンズシステムを使用することによって、光を画像化するために使用することができる。基質が、光ファイバーカップリングを提供しない場合、レンズシステムはまた、上記に記載されるように使用されてもよく、この場合において、基質または灌流チャンバーカバーは光学的に透明である。
【０１８６】
画像システム２３０は、基質表面上で反応器から光を収集するために使用することができる。光は、たとえば、当技術分野において知られている高感度低ノイズ器具を使用してＣＣＤ上に画像化することができる。光ファイバーベースの画像化については、光ファイバーは、カバースリップの中に直接またはＦＯＲＡについては、同様に、検出器に光を伝える光ファイバーであるマイクロウェルを形成する光ファイバーを有するように取り込まれてもよい。
【０１８７】
画像システムは、コンピューター制御およびデータ収集システム２４０に結合することができる。任意の一般的に入手可能なハードウェアおよびソフトウェアパッケージが使用することができる。コンピューター制御およびデータ収集システムはまた、試薬送達をコントロールするためにコンジット２００に結合することができる。
【０１８８】
ピロリン酸配列決定反応によって生成される光子は、それらが焦点調整デバイス（たとえば光学用レンズまたは光ファイバー）を通過し、ＣＣＤエレメント上に集中する場合のみ、ＣＣＤによって捕捉することができる。しかしながら、放出される光子は、全方向に等しく流出する可能性がある。平面状のアレイ（たとえばＤＮＡチップ）を用いる場合に、それらの、後の「捕捉」および定量化を最大限にするために、光子は、それらが生成されるポイントにできるだけ近くに、たとえば、平面状の固体支持体の直近に収集することができる。これは、（ｉ）カバースリップおよび従来の光学用レンズもしくは光ファイバー束の間に光学用液浸油を用いることまたは（ｉｉ）カバースリップ自体の中に光ファイバーを直接、取り込むことによって成し遂げることができる。同様に、薄く、光学的に透明な平面状の表面が使用される場合、光ファイバー束はまた、その背面に対して配置され、全反応／灌流チャンバーの奥行きを通して「画像化する」必要性を排除してもよい。
【０１８９】
反応イベント、たとえば、ルシフェラーゼによって生成される光子は、多種多様の検出器具、たとえば、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、吸光度光度計、ルミノメーター、電荷注入デバイス（ＣＩＤ）、または他の固体検出器および本明細書において記載される器具を使用して検出され、定量化することができる。放出される光子の定量化は、溶融光ファイバー束が取り付けられたＣＣＤカメラの使用によって成し遂げることができる。放出される光子の定量化はまた、マイクロチャネルプレート増幅装置が取り付けられたＣＣＤカメラの使用によって成し遂げることができる。背面薄化ＣＣＤは、感度を増加させるために使用することができる。ＣＣＤ検出器は、たとえばBronksら、１９９５年Anal. Chem.６５巻：２７５０〜２７５７頁において記載される。
【０１９０】
ＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ ＬＭ４８５ ＣＣＤチップおよび６−８μｍの個々のファイバー直径を有する１−１光ファイバーコネクター（束）を有するＳｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚ．）シリーズ６００ ４ポートカメラであってもよい。このシステムは、４０９６×４０９６または１６００万超のピクセルを有していてもよく、１０％〜＞４０％に及ぶ量子効率を有する。したがって、波長に依存して、ＣＣＤセンサー上に画像化された４０％もの光子は、検出可能な電子に変換される可能性がある。
【０１９１】
蛍光部分は、標識として使用されてもよく、反応イベントの検出は、レーザーを用いてアレイの表面をスキャンするために、共焦点走査型顕微鏡を使用して実行されてもよく、またはより小さな光学解像度が可能な走査型近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの他の技術が入手可能であり、それによって、「より密な」アレイの使用を可能にする。たとえば、ＳＮＯＭを使用して、個々のポリヌクレオチドは、１００ｎｍ、たとえば１０ｎｍ×１０ｎｍ未満の距離、離れている場合、識別される可能性がある。さらに、走査トンネル顕微鏡（Binningら、Helvetica Physica Acta、５５巻：７２６〜７３５頁、１９８２年）および原子間力顕微鏡（Hanswaら、AnnuRev Biophys Biomol Struct、２３巻：１１５〜１３９頁、１９９４年）が使用することができる。
【０１９２】
本発明は、次に続く非限定的な実施例によって示される、多数の態様を有する。
【実施例】
【０１９３】
（実施例１）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子の使用
Ｔｎ７ドナープラスミドｐＧＰＳ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＰＡＣ／ｏｒｉＶベクターの完全なコピーを加えた、λｃｏｓ部位を含有する転位性カセットを構築する（図１−１）。次いで、転位性カセットは、標的ＤＮＡの中に転位する（図１−１）。転位は、サザンブロッティングによって確認することができる。
【０１９４】
標的ＤＮＡの中への転位性エレメントの転位後に、それは、λ抽出物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてパッケージする（図１−２）。プロヘッドは満たされるであろうが、パッケージングは、第２のｃｏｓ部位の欠如により完了しなくてもよい。欠けているｃｏｓ部位を提供するために、頭部からはみ出たあらゆるＤＮＡを除去するために、調製物は、Ｓａｕ３Ａを用いて消化する。次に、ファージ尾部を追加して、ヘッドフルＤＮＡを含有するλｄｏｃＬビリオンを産生する。ビリオンＤＮＡの一方の末端は、ｃｏｓＬで終了し、他方は、Ｓａｕ３Ａ突出で終了する。
【０１９５】
パッケージＤＮＡ分子を環状にし、安定性のプラスミドを形成するために、第２のｃｏｓ部位を、図３において示されるように、リンカーをアニールすることによってＳａｕ３Ａに追加する。リンカーによって追加したｃｏｓ部位は、ＤＮＡが環状になるまたはコンカテマーを形成することを可能にする。次いで、第２回のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングは、それぞれの末端にｃｏｓ突出を有するＤＮＡ分子を産生する。ＤＮＡ分子は、環状になり、両端にλｃｏｓ部位を有するカプシド形成ＤＮＡを有する完全に感染性の形態で再度パッケージされる。これらの調製物は、次いで、高効率でかつ好都合に、細胞の中にＰＡＣを導入するために使用される。
【０１９６】
（実施例２）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子のさらなる使用
誘発性複製開始点を含むベクター構築物と一致する、ファージベースのサイズ選択およびランダムクローニングのためのバクテリオファージλ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングシステムを設計した。このクローニングシステムは、バクテリオファージＰ１またはＰ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングおよびより大きな（ヘッドフル容量）バクテリオファージを取り込むように拡張することができる。バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するためのそのような手法を図２において示す。
【０１９７】
ファージパッケージング開始認識部位は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位によって標的ＤＮＡの中に導入する。トランスポゾンは、ファージ特異的パッケージング開始部位、転位のための１９ｂｐ Ｔｎ５モザイク末端、クローニングＤＮＡの増幅のためのｏｒｉＶ、およびプラスミド選択のための抗生物質抵抗性を付与する遺伝子を含む。転位に続いて、バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムは、クローニングＤＮＡをパッケージするために使用される。パッケージングは、ファージ特異的パッケージング部位で開始され、ファージカプシドのヘッドフル容量に達するまで続く。この容量、およびしたがってクローン挿入断片サイズは、使用する特異的なファージに基づくものであってもよい。
【０１９８】
ファージ頭部からはみ出たＤＮＡおよびあらゆる非パッケージＤＮＡは、ＤＮアーゼＩまたは４塩基認識制限エンドヌクレアーゼによって消化する。パッケージＤＮＡは、ヌクレアーゼ消化から保護される。次いで、クローンの、後の環状化を可能にするＤＮＡリンカーを、パッケージＤＮＡの末端の末端にライゲーションする。その代わりに、パッケージＤＮＡは、ファージ頭部から抽出し、その後、リンカーライゲーションおよび再度パッケージングを続けてもよい。次いで、ファージ尾部を追加し、クローニングＤＮＡを含有するビリオンは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質移入し、その後、抗生物質抵抗性の選択を続けるために使用する。
【０１９９】
（実施例３）
ＰＡＣクローニングベクターの中にＤＮＡをクローニングするためのλｄｏｃ粒子の代替の使用
実施例１の手順を、プロヘッドがＤＮＡで満たされるポイントまで行ない、次いで、Ｓａｕ３Ａを用いて切断する。ファージ尾部を直接、追加する代わりに、図３のリンカーを使用して、ＤＮＡがカプシドからはみ出ている一方で、ｃｏｓＲ部位をλｄｏｃ粒子にライゲーションする。リンカーをライゲーションした後に、実施例１におけるように、尾部を追加する。正常なｃｏｓＲおよびｃｏｓＬ末端を有するファージ粒子は、カプシドを破壊して開け、ＤＮＡを環状にし、再度パッケージすることが必要ではなく、細胞の中にＰＡＣを導入するために直接、使用されるので、これは、全体的なプロセスを単純化する。
【０２００】
（実施例４）
ｉｎ ｖｉｖｏトランスポゾン組換えクローニング
実施例１および３において、かなりの量のクローニング容量がベクターによって取られる。これは、ＰＡＣベクターが、相当な長さを有し、したがって、そうでなければクローニングＤＮＡに当てることができる、カプシドにおける空間を占めるという事実によって引き起こされる。この制限について検討するために、ｃｏｓ部位の側面に位置する修飾Ｔｎ５転位性末端、組換えのためのａｔｔＰ部位、および選択可能マーカーとしてのＫａｎＲを含む転位カセットを調製する。トランスポゾンは、ゲノムＤＮＡの中にランダムにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて導入し、ｃｏｓ部位からパッケージし、Ｓａｕ３Ａ消化し、ｃｏｓＲリンカーを追加し、結果として生じた断片を精製し、再度パッケージする。次いで、挿入断片は、ａｔｔＰ部位を含有する修飾ＰＡＣベクターを含む株の中に導入する。これは、ａｔｔＢに対する同起源の組換え部位である。株は、ＩＰＴＧ誘発性Ｐｔａｃプロモーター下でｐＨＳ３−１プラスミドからＩｎｔタンパク質を発現する（Leeら１９９０年）。宿主はまた、組換えがプラスミドとのみ生じることを確実にするためにＩＳ−ともする。一度、細胞において、挿入断片がｃｏｓ突出を介して環化したら、それらは、Ｉｎｔ媒介性の組換えを通してＰＡＣの中に組換えられる。組換え体は、ベクター（ＣａｍＲ）および挿入断片（ＫａｎＲ）の両方に対する抗生物質を含有する培地上で平板培養することによって選択する。
【０２０１】
（実施例５）
転位性クローニングベクター
一連の転位性クローニングベクターは、バクテリオファージｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを使用するクローニングのための形質を含むように構築した。これらの形質は、１）バクテリオファージλのファージ特異的パッケージング開始部位（ｃｏｓ）および１６２ｂｐ Ｐ１パッケージング開始部位（ｐａｃ）、２）誘発性複製開始点、ｏｒｉＶ、ならびに３）転位のための１９ｂｐモザイク末端配列が側面に位置するカナマイシン抵抗性遺伝子を含む。この構築物におけるモザイク末端は、高活性Ｔｎ５ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位システムに基づくものであり、トランスポゾンの発生を可能にするように設計し、パッケージ部位、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｏｒｉＶ、およびＰｖｕＩＩ制限酵素を用いる消化後のモザイク末端を含む。標的ＤＮＡの中へのトランスポゾンの組み込みは、クロラムフェニコール（Ｃａｍｒ）についての選択によって確認することができ、カナマイシン（Ｋａｎｓ）に対する感度についてさらにスクリーニングすることができる。ｃｏｓファージパッケージング開始部位およびｐａｃファージパッケージング開始部位の位置は、組み込みに続いて、パッケージングが、これらの部位で始まり、最終的に隣接標的ＤＮＡまで、ベクターを通して時計回りに続く（図４を参照）ように設計する。これは、クローンが、安定して選択され、パッケージング、形質移入、および環状化に続いてプラスミドとして維持されることを可能にする。
【０２０２】
ｃｏｓ、ｐａｃ、ならびにｃｏｓおよびｐａｃの両方を含有する一連の３つのプラスミドを構築した。最後に、Ｋａｎｒ遺伝子の側面に位置する１９ｂｐモザイク末端配列を、最終産物の３つのベクターに追加した。ベクターシリーズのそれぞれの構成要素を個々に試験し、予想通りに機能することを示した。３つのベクターはすべて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて効率的に転位し、ＤＨ１０Ｂゲノムの中に組み込まれることが示された。転位に続いて分析した形質転換体の約９８％が、Ｃａｍｒ Ｋａｎｓであり、組み込みが確認された。候補からのゲノムＤＮＡのサザンブロッティングにより、ゲノムの中へのランダムな組み込みを確認した。
【０２０３】
ｃｏｓ機能性を２つの実験によって確認した。精製λターミナーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いる単純な消化により、ベクターのｃｏｓ切断を確認した。さらに、プラスミドマルチマーから構成されるコンカテマーが、λプロファージによってｉｎ ｖｉｖｏにおいてパッケージされ得るかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｖｏコスミドパッケージングアッセイを行なった。ｃｏｓを含有する２つのベクターから産生されるコンカテマーは、Ｃａｍｒ形質導入粒子の数によって測定されるように、効率的にパッケージされたが、ｐａｃのみを有するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてλによってパッケージすることができなかった。
【０２０４】
（実施例６）
ファージパッケージング部位のライゲーション
パッケージ部位は、線状転位性クローニングベクターを、部分的に消化したゲノムＤＮＡに直接、ライゲーションすることによって、標的ＤＮＡの中に導入する。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（または全多重クローニング部位）を、ｔＬ３ターミネーターおよびモザイク末端の間に位置するユニークなＰｍｅＩ部位で、転位性クローニングベクターの中に導入する。ＥｃｏＲＩ部分的消化物を使用する場合、転位性クローニングベクターは、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩによって消化し、精製し、一方の末端に平滑末端化ＰｖｕＩＩおよびｐａｃ／ｃｏｓ部位ならびに反対の末端にＥｃｏＲＩ付着末端を有する線状転位性クローニングベクターがもたらされる。ＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ二重消化物は、ベクターエレメントを含有するクローンを用いる一方向のパッケージングをもたらす。
【０２０５】
線状転位性クローニングベクターを、部分的に消化したゲノムＤＮＡにライゲーションする。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング反応を行ない、転位性クローニングベクターの構成要素を通して、転位性クローニングベクター上のパッケージ部位でパッケージングを開始し、ファージ頭部のヘッドフル容量に達するまで、ライゲーションゲノムＤＮＡまで続ける。転位によるパッケージング開始部位の導入と同様に、はみ出たＤＮＡは消化し、適切なリンカーは、ＤＮＡの環状化のためにライゲーションし、ファージ尾部を追加し、使用したクローニングＤＮＡを含有するビリオンをＥ．ｃｏｌｉに形質移入する。
【０２０６】
（実施例７）
λまたはＰ１を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
市販で入手可能なλ ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング抽出物は、シングルチューブシステムとして、段階１および段階２のパッケージング抽出物を組み合わせたものである。クローニングシステムは、順次、２つのパッケージ段階を順次使用してもよい。２つの従来の相補的な溶原性Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＨＢ２６９０（段階１）およびＢＨＢ２６８８（段階２）からの抽出物を生成し、試験した。２段階パッケージングシステムの効率は、市販で入手可能なシングルチューブシステムに匹敵した。さらに、発明者らは、段階１抽出物を使用して、パッケージベクターのｃｏｓ切断を示し、実施例５において記載されるベクターの機能性を確認することができた。バクテリオファージＰ１のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングシステムについては、発明者らは、それぞれ、株ＮＳ３２０８およびＮＳ３２１０から、Ｐ１溶原菌の段階１および段階２の抽出物を生成した（Corenら、J Mol Biol、２４９巻：１７６〜８４頁、１９９５）。発明者らはまた、段階１（ｐａｃａｓｅ）抽出物を使用して、パッケージベクターのｐａｃ部位の切断をも示した。
【０２０７】
（実施例８）
λファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニングおよびファージカプシドのアフィニティー精製
本実施例は、λファージパッケージングを使用するＤＮＡのクローニングおよびファージカプシドのアフィニティー精製について記載する。ｃｏｓ部位、複製開始点、および薬剤抵抗性マーカーを含有する核酸は、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ転位によって、ゲノムＤＮＡの中にランダムに挿入する。λターミナーゼ（Ｎｕ１およびＡの遺伝子の産物を含有する）は、ｃｏｓ部位におよびλプロヘッドに結合し、次いで、ｃｏｓ部位でＤＮＡを切断する（図６）。次いで、ＡＴＰ駆動モーターは、プロヘッドの中にＤＮＡを詰め込む。ウイルスカプシドは、カプシドへのＤタンパク質の追加によって、ＤＮＡがその中に挿入されるとともに拡張する。約５０ｋｂのＤＮＡがカプシドを満たすまで、このプロセスは続く。カプシドからぶら下がったままのＤＮＡは、頻繁に切断する制限部位を用いて切断することができる。カプシドの内部にあるＤＮＡは保護されるので、カプシドの外部にあるＤＮＡのみを制限酵素によって切断することができる。
【０２０８】
ＤＮＡの制限に続いて、ファージカプシドは、カラムに結合した抗Ｄタンパク質抗体を使用してアフィニティー精製する。精製カプシドからのＤＮＡは、フェノール抽出によって単離することができる。次いで、ＤＮＡは環状にし、細菌の中に形質転換する。
【０２０９】
（実施例９）
Ｐ２２ＨＴファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニング
本実施例は、Ｐ２２ＨＴファージパッケージングを使用するゲノムＤＮＡのクローニングについて記載する。Ｇｐ２およびＧｐ３のタンパク質を含有するＰ２２ＨＴターミナーゼは、ランダムな部位でゲノムＤＮＡに結合し、それを切断する（図７）。ターミナーゼは、ＤＮＡに結合したままであり、プロヘッドがいっぱいになるまで、Ｐ２２プロヘッドの中にそれを詰め込む。カプシドが拡張するとともに、それは、広がり、破壊されたＤＮＡになお付着しているターミナーゼを放出する立体構造変化を受ける。次いで、ターミナーゼは、新しいプロヘッドの中にＤＮＡを挿入し、ＤＮＡパッケージングの新しいサイクルを始めることができる。ターミナーゼは、隣接ゲノムＤＮＡセグメントの連続パッケージングの多くのサイクルを続けることができる。
【０２１０】
パッケージＤＮＡをクローニングするために、ファージカプシドは、拡張されたカプシドの外部に存在するエピトープに結合することができる抗体を含有するカラムを使用してアフィニティー精製することができる。カプシドはまた、差次的沈降または等密度遠心分離によって単離することもできる。これらの方法は、ＤＮアーゼ消化が伴い得る。ＤＮＡは、上記に記載されるように、さらにそれを抽出し、環状にし、細菌の中に形質転換することによってクローニングすることができる。
【０２１１】
（実施例１０）
ファージパッケージングによってクローニングされたゲノムＤＮＡの末端の配列の特徴づけ
本実施例は、ファージベースのシステムを使用してパッケージされたゲノムＤＮＡの末端の配列をどのように特徴づけることができるかについて記載する。ゲノムＤＮＡは、ファージカプシドから最初に単離される。次に、ＥｃｏＰ１５Ｉ部位が側面に位置する２つの外向きリーチングプライマー配列を含有する核酸を、単離ＤＮＡ断片の末端にライゲーションする（図８）。図９Ｂは、リーチングプライマー対核酸の構造を示す。リーチングプライマー対断片は、２つの異なるゲノムＤＮＡ分子へのリーチングプライマー対断片のライゲーションを回避するのに十分に低い稀釈度で単離ＤＮＡにライゲーションする。リーチングプライマー対断片の末端は、それとモノマー環を形成することを回避するためにリン酸化されなくてもよい。
【０２１２】
ライゲーションに続いて、ＤＮＡをＥｃｏＰ１５Ｉを用いて消化し、これにより、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位から２７ｂｐ離れたところでＤＮＡを切断する。この制限酵素を用いるＥｃｏＲ消化は、２つのリーチングプライマー配列、側面に位置するＥｃｏＰ１５Ｉ部位、およびそれぞれの末端に２７ｂｐのゲノムＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を放出する。放出断片におけるゲノムＤＮＡは、パッケージゲノムＤＮＡのそれぞれの末端を表わす。放出断片は、フィルインすることができる。図９Ａは、平滑末端を作り出すために、放出断片のＥｃｏＰ１５Ｉ切断末端をどのようにフィルインすることができるかを示す。次いで、放出平滑断片は、ライゲーションして、対になった末端環ＤＮＡを作り出すことができる。次いで、このＤＮＡは、２つのリーチングプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅することができ（図１０）、次いで、増幅産物は、配列決定することができる。リーチングプライマー対部位の間に制限部位がある場合、対になった末端環は、ＰＣＲ増幅の前に適切な制限酵素を用いて切断することによって線状にしてもよい。ＤＮＡはまた、固相核酸増幅を使用して増幅を行なうことによって、ＰＣＲ増幅し、直接配列決定してもよい。上記に記載されるアプローチはまた、ビーズエマルションＰＣＲ増幅および配列決定における使用のために、磁性ビーズに結合させたリーチングプライマーのうち１つに適応することができる（図１１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）核酸を含むカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記配列決定が、
（ａ）水性マイクロリアクターが、前記核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
複数の核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）それぞれが核酸を含む複数のカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記配列決定が、
（ａ）複数の水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸが、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２つの異なるコロニープライマーＸを、請求項１３に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
１つまたは複数の前記核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体が、ガラスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、核酸鋳型および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
２つの異なるコロニープライマーＸを、請求項３２に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１つより多い核酸コロニー中に存在する前記核酸の完全なまたは部分的な配列が同時に決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記固体支持体が、ガラスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
それぞれの核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で核酸増幅反応を行なうステップと
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸の中にパッケージング開始部位を導入するステップであって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸が、前記パッケージング開始部位の下流にあるステップと、
（ｂ）前記パッケージング開始部位でパッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項５３】
前記パッケージング開始部位が、λ、Ｐ１、Ｐ７、またはＴ４パッケージング開始部位である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸がベクターである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸が染色体ＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸が全ゲノムである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記パッケージング開始部位が、前記核酸の中にランダムに導入される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記パッケージング開始部位が、前記標的核酸の中への第１の核酸の転位によって前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、転位性末端および前記パッケージング開始部位を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記転位性末端が、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記パッケージング開始部位が、第１の核酸および前記標的核酸をライゲーションすることによって、前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、前記パッケージング開始部位を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記パッケージされた核酸が、カプシド中にパッケージされる、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
パッケージングは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の核酸が、組み込み部位をさらに含み、前記パッケージされた核酸が、前記組み込み部位を含む、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項６５】
相補的な組み込み部位でベクターの中に前記パッケージされた核酸を組み込むステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の核酸の前記組み込み部位が、ａｔｔＢであり、前記ベクターの前記組み込み部位が、ａｔｔＰである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
組み込みは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
組み込みは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の核酸が、複製開始点を含む、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記複製開始点が、低コピー複製開始点である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複製開始点が、高コピー複製開始点である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の核酸が、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記高コピー複製開始点が、複製誘発剤に条件付きで応答性である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１の核酸が、前記複製誘発剤をコードする核酸をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記複製誘発剤が、ＴｒｆＡである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項５６に記載の方法に従ってゲノムから複数の核酸をクローニングするステップを含む、ゲノムライブラリーを産生する方法。
【請求項７７】
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸をＰ２２ＨＴターミナーゼと接触させるステップと、
（ｂ）パッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む方法。
【請求項７８】
前記標的核酸が全ゲノムである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記パッケージされた核酸がカプシド中にパッケージされる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項７９に記載の方法。
【請求項１】
核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）核酸を含むカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記配列決定が、
（ａ）水性マイクロリアクターが、前記核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
複数の核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）それぞれが核酸を含む複数のカプシドを提供するステップと、
（ｂ）前記核酸を単離するステップと、
（ｃ）前記核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記配列決定が、
（ａ）複数の水性マイクロリアクターが、核酸の単一コピー、前記核酸に結合することができる単一ビーズ、および核酸増幅を行なうために必要な試薬を含有する増幅反応溶液を含むように、油中水型エマルション中で前記水性マイクロリアクターの中に前記核酸を送達するステップと、
（ｂ）前記マイクロリアクター中で前記核酸を増幅して前記核酸の増幅コピーを形成し、前記マイクロリアクター中で前記増幅コピーを前記ビーズに結合させるステップと、
（ｃ）平面表面上にある少なくとも１０，０００個の反応チャンバーのアレイに前記ビーズを送達するステップであって、複数の前記反応チャンバーが単一核酸結合ビーズしか含まないステップと、
（ｄ）複数の前記反応チャンバー上で配列決定反応を同時に行なうステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが、少なくとも１０，０００個の増幅コピーに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列決定反応が、ピロリン酸ベースの配列決定反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列決定反応が、
（ａ）有効量の配列決定プライマーを前記核酸の前記増幅コピーにアニールし、ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて前記配列決定プライマーを伸長させて、配列決定産物、および前記所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合には配列決定反応副産物を得るステップと、
（ｂ）前記配列決定反応副産物を同定し、それによって、反応チャンバー中で前記核酸の配列を決定するステップと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸが、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
２つの異なるコロニープライマーＸを、請求項１３に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
１つまたは複数の前記核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体が、ガラスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、核酸鋳型および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数のコロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で１つまたは複数の核酸増幅反応を行なうステップと
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、オリゴヌクレオチド配列Ｙに相補的であり、コロニープライマーＸは、オリゴヌクレオチド配列Ｙと同じ配列である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
２つの異なるコロニープライマーＸを、請求項３２に記載のステップ（ａ）における前記核酸と混合し、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚが、前記コロニープライマーＸのうち１つにハイブリダイズすることができ、前記オリゴヌクレオチドＹが、前記コロニープライマーＸのうち１つの配列と同じである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
核酸コロニーにおける前記核酸を配列決定するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記配列決定するステップが、標識ヌクレオチドの取り込みおよび検出を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸コロニーを視覚化する追加のステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記視覚化ステップが、標識核酸プローブまたは非標識核酸プローブの使用を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１つより多い核酸コロニー中に存在する前記核酸の完全なまたは部分的な配列が同時に決定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に共有結合で固定するための前記手段が、化学的に修飾された基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸および前記コロニープライマーを前記固体支持体に固定するための前記手段が、前記核酸および前記コロニープライマーを前記支持体に共有結合で固定するための手段を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学的に修飾可能な官能基が、アミノ基である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が固定される前記固体支持体が、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレンおよびポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、ならびにシリコンウェーハからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記固体支持体が、ガラスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体支持体上の前記核酸コロニーの密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記固体支持体に付着した前記コロニープライマーＸの密度が、少なくとも１ｆｍｏｌ／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
それぞれの核酸の密度が、１０，０００／ｍｍ２〜１００，０００／ｍｍ２である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）における前記核酸を単離するステップが、
（ａ）第１のアダプター末端および第２のアダプター末端を前記核酸にライゲーションするステップであって、前記第１のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｙを含み、前記核酸の５’末端にライゲーションし、前記第２のアダプター末端が、オリゴヌクレオチド配列Ｚを含み、前記核酸の３’末端にライゲーションし、第１のアダプターが、５’末端で固体支持体に前記核酸を固定するための手段を有するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記核酸を、前記固体支持体の存在下において、１つまたは複数の縮重コロニープライマーＸと混合するステップであって、それぞれのコロニープライマーＸが、前記オリゴヌクレオチド配列Ｚにハイブリダイズすることができ、５’末端で前記固体支持体に前記コロニープライマーを固定するための手段を有し、それによって、前記核酸および前記コロニープライマーの両方の５’末端が、前記固体支持体に固定され、核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、ＤＮＡ変性条件下での水または水性緩衝液を用いる洗浄によって、それらを除去することができないように、前記固体支持体に固定されるステップと、
（ｃ）核酸コロニーが生成されるように、前記固定された核酸上で核酸増幅反応を行なうステップと
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ａ）の前記核酸および前記コロニープライマーの両方の前記５’末端が、共有結合を介して前記固体支持体に固定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸の中にパッケージング開始部位を導入するステップであって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸が、前記パッケージング開始部位の下流にあるステップと、
（ｂ）前記パッケージング開始部位でパッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項５３】
前記パッケージング開始部位が、λ、Ｐ１、Ｐ７、またはＴ４パッケージング開始部位である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸がベクターである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸が染色体ＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸が全ゲノムである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記パッケージング開始部位が、前記核酸の中にランダムに導入される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記パッケージング開始部位が、前記標的核酸の中への第１の核酸の転位によって前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、転位性末端および前記パッケージング開始部位を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記転位性末端が、Ｔｎ７、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｍｕ、およびＭａｒｉｎｅｒからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記パッケージング開始部位が、第１の核酸および前記標的核酸をライゲーションすることによって、前記標的核酸の中に導入され、前記第１の核酸が、前記パッケージング開始部位を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記パッケージされた核酸が、カプシド中にパッケージされる、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
パッケージングは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１の核酸が、組み込み部位をさらに含み、前記パッケージされた核酸が、前記組み込み部位を含む、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項６５】
相補的な組み込み部位でベクターの中に前記パッケージされた核酸を組み込むステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の核酸の前記組み込み部位が、ａｔｔＢであり、前記ベクターの前記組み込み部位が、ａｔｔＰである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
組み込みは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
組み込みは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の核酸が、複製開始点を含む、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記複製開始点が、低コピー複製開始点である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複製開始点が、高コピー複製開始点である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の核酸が、低コピー複製開始点および高コピー複製開始点を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記高コピー複製開始点が、複製誘発剤に条件付きで応答性である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１の核酸が、前記複製誘発剤をコードする核酸をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記複製誘発剤が、ＴｒｆＡである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項５６に記載の方法に従ってゲノムから複数の核酸をクローニングするステップを含む、ゲノムライブラリーを産生する方法。
【請求項７７】
標的核酸から核酸をクローニングする方法であって、
（ａ）標的核酸をＰ２２ＨＴターミナーゼと接触させるステップと、
（ｂ）パッケージングを開始し、それによって、前記標的核酸からクローニングされる前記核酸がパッケージされるステップと、
（ｃ）前記パッケージされた核酸を単離するステップと
を含む方法。
【請求項７８】
前記標的核酸が全ゲノムである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記パッケージされた核酸がカプシド中にパッケージされる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生じる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
パッケージングが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生じる、請求項７９に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５２９８６２（Ｐ２０１０−５２９８６２Ａ）
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３３５２（Ｐ２０１０−５１３３５２）
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７１６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７５１５
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０８３１４６０７）スカラブ ゲノミクス， エルエルシー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７１６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７５１５
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０８３１４６０７）スカラブ ゲノミクス， エルエルシー (4)
【Ｆターム（参考）】
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