核酸分子スクリーニング方法及びタンパク質検出・定量方法
【課題】標的物質を安定的に用いて核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく得る。
【解決手段】選択されたペプチド分子を包含するタンパク質を、例えば酵素処理することにより得られた断片ペプチドを、支持体に固定化し、固定化された断片ペプチドと核酸試料液中の核酸分子と接触させ、支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた前記相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する工程を含む核酸分子スクリーニング方法により、目的核酸分子を選別する。
【解決手段】選択されたペプチド分子を包含するタンパク質を、例えば酵素処理することにより得られた断片ペプチドを、支持体に固定化し、固定化された断片ペプチドと核酸試料液中の核酸分子と接触させ、支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた前記相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する工程を含む核酸分子スクリーニング方法により、目的核酸分子を選別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子スクリーニング方法及び核酸分子スクリーニング装置に関し、特に、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法及び、これにより得られた核酸分子を用いたタンパク質検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のタンパク質、ペプチドに結合する核酸及び／又はその誘導体を、その多種の候補の中から選択することは１９９０年以来行われており、その結合性の核酸及び／又はその誘導体はアプタマーと一般的に呼ばれている。アプタマーは、抗体と同様に目的とする特定物質に結合できるだけでなく、高い親和性を有しており、かつ抗体に比べて作製が容易であることから、特定の生理活性部位に特定的なアプタマーを医療分野等に利用することが期待されている。このようなアプタマーを得るための方法としては、アフィニティカラムによる分離や、ＰＣＲによる増幅などの手法が利用されている（例えば特許文献１及び特許文献２）。
アプタマーと特定タンパク質、ペプチドの結合性を評価する方法としては、標識が不要であることと感度の高さから近接場光、例えば表面プラズモン共鳴を利用する方法が挙げられる（例えば、非特許文献１）。また、表面以外の影響を受けずにバックグラウンドノイズを抑制できる点からも近接場光、例えば近接場光蛍光を利用する方法が挙げられる。（例えば非特許文献２）特にスクリーニングの操作中に結合性の評価を行い、その評価に基づいて任意の結合能を持つアプタマーだけを回収することができるため、スクリーニング効率が高いという利点を有している。（例えば非特許文献３）
【特許文献１】特開２００１−６１４７５号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２５４号公報
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry (2001) Vol.276, pp.21476-21481
【非特許文献２】Analytical Chemistry, (1998) Vol.70, pp.3419-3425
【非特許文献３】Analytical Biochemistry, (2005) Vol.342, pp.312-317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、タンパク質そのものやその特異的な部分配列のみを取り出し、その結合性のアプタマーをスクリーニングする方法は、対象となるタンパク質やペプチドの不安定性などの性質によって、所望のアプタマーが得られない場合がある。また、近接場光を利用した分析（以後、近接場光分析と呼ぶ）を行う場合には、目的とするタンパク質を測定面の最表面に固定化する必要があるが、目的タンパク質によっては、固定化操作で壊れる、不溶性のために固定化ができない、といった問題が生じる。
【０００４】
従って、本発明は、標的物質を安定的に用いて核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及びタンパク質検出・定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むものである。
【０００６】
ここで、前記分解処理工程は、酵素を用いてタンパク質を分解することであることが好ましい。
また、上記核酸分子スクリーニング方法では、前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含むことが好ましい。
増幅工程を設けた場合には、前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、少なくとも前記接触工程及び選別工程、好ましくは前記接触工程、選別工程及び増幅工程を、少なくとも１回繰り返すことが好ましい。
【０００７】
上記核酸分子スクリーニング方法では、前記固定化断片ペプチドが、同一タンパク質から得られる２種以上の断片ペプチドで構成されていてもよく、また、前記目的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体からなる群より選択されたものであってもよい。
また上記核酸分子スクリーニング方法では、前記近接場光分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析であることが好ましい。
また、上記接触工程を行う前に、核酸試料液の接触する部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことがより好ましい。
【０００８】
本発明のタンパク質検出・定量方法は、上記核酸分子スクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって、該ペプチドを含有するタンパク質の検出又は定量を行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、目的核酸分子を得るために断片ペプチドを用いているので、標的物質を安定的に用いて核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及びタンパク質検出・定量方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むものである。
【００１１】
本方法では、核酸試料液中の核酸分子から、選択された特定のペプチド分子に特異的に相互作用する目的核酸分子を、タンパク質を分解処理して得られた断片ペプチドを用いて選別する。
このような断片ペプチドは、断片ペプチド分子を包含したタンパク質そのものよりも、構造上の安定性が高く、支持体上への固定化操作で破壊されることが少ない。また、タンパク質そのものの場合には立体構造や親疎水性の関係から不溶性の性質を示すものであっても、断片ペプチドであれば溶液に溶けやすく、核酸試料液を用いたスクリーニングが容易になる。更には、安定状態では内側となる部位のペプチド分子であっても、断片ペプチドとすることにより、タンパク質の変性処理などを行うことなくこの部位に相互作用可能なアプタマーをスクリーニングしやすくすることができる。この結果、安定した標的物質、即ち断片ペプチドによって所望の核酸分子を効率よくまた再現性よく得ることができる。
なお、本発明における目的核酸分子と断片ペプチドとの相互作用とは、物理的、化学的、もしくは生化学的な結合・会合反応をいう。
【００１２】
本発明における核酸分子としては、核酸又は誘導体を挙げることができ、ＤＮＡ、ＲＮＡの他に、これらの誘導体、即ち、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡの一部を改変したものを含む。核酸誘導体としては、例えば、ＤＮＡと類似した構造を有し、ペプチド結合により骨格を形成する化合物であるＰＮＡ（ペプチド核酸）を挙げることができる。このような核酸分子のうち、本発明における目的核酸分子は、選択された特定のペプチド分子と特異的に相互作用する性質を有し、一般にアプタマーと呼ばれているものである。
【００１３】
核酸試料液を構成する溶液としては、核酸分子を安定して保持することができるものであればよく、一般にバッファー液として用いられているもの、例えば公知の緩衝溶液（化学便覧応用編改訂２版、１３１２頁〜１３２０頁）を基本に、食塩、金属イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなど）、安定化剤（ＤＴＴなど）などを添加したものを用いることができる。特に、ＰＢＳバッファー（リン酸バッファー生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどが好ましく用いられる。
なお、上記アプタマーが相互作用可能なペプチド分子を包含するタンパク質としては、特に限定されない。
【００１４】
本スクリーニング方法における分解処理工程では、支持体上に固定化するためのペプチド分子としての断片ペプチドを得るために、タンパク質分子を分解処理する。
この分解処理としては、タンパク質を所定の長さのペプチドに分解可能な処理であればよいが、タンパク質を比較的穏やかな条件で分解可能な化学的処理、特に酵素を用いた分解処理であることが好ましい。また、酵素による分解処理では１つのタンパク質から複数の断片ペプチドを容易に得ることができるため、目的とするペプチド分子を合成してスクリーニングするよりも多種のアプタマーを簡便に得ることができる。更に、酵素による分解処理では、タンパク質中における切断個所を制御することが可能であるため、得られる断片ペプチドの再現性の点からもより好ましい。
【００１５】
分解処理に用いられる酵素としては、各種プロテアーゼを好ましく用いることができる。このようなプロテアーゼとしては、ペプチドの加水分解に用いられるものであればよく、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、サブチリシン、ジスパーゼなどを挙げることができる。これらの酵素は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。用いられるタンパク質（ペプチド分子）の種類及び所望するアプタマーの種類、スクリーニングの目的によって、適宜選択することができる。
【００１６】
分解処理工程によって得られた断片ペプチドは、固定化工程において、支持体に固定化される。固定化断片ペプチドは、支持体上に単一又は複数種固定化することができるが、同一のタンパク質に由来する断片ペプチドである場合には、スクリーニングの効率を上げるために複数種存在していることが好ましい。
【００１７】
断片ペプチドを固定化するための支持体としては、近接場光分析の適性に対応して透明基板で構成されていてもよく、不透明基板で構成されていてもよい。また、近接場光分析の適性に対応して基板の断片ペプチド固定側に、金属部と、この金属部上または基板上に直接配置されると共に断片ペプチドを固定化できる官能基を有する固定化膜を備えたものを挙げることができる。
透明基板としては、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００１８】
金属部を構成する金属としては、例えば、プラズモン共鳴が生じ得るようなものを挙げることができる。好ましくは、金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、金が特に好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
金属部の形状は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、膜状で膜厚が０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１９】
金属部は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属部が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属部が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。
金属部の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２０】
固定化膜としては、例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロースなどのヒドロゲル、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。特に、ポリエチレングリコール誘導体、デキストラン誘導体は、生理活性維持の観点から好ましく用いられる。
固定化膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２１】
固定化方法としては、支持体表面に断片ペプチドを固定化できればいずれの方法であってもよいが、支持体表面のカルボキシル基と断片ペプチドのアミノ基とを共有結合により固定化するアミノカップリング法が、簡便性及び安定性の観点から好ましい。この目的で用いられるアミノカップリング法は、常法に従って行えばよく、例えば、Ｎ−エチル−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを用いる方法を挙げることができる。
【００２２】
接触工程では、固定化工程によって得られた固定化断片ペプチドに、試料液中の核酸分子を接触させる。この接触により、核酸試料溶液中に存在する核酸分子の多くが、固定化断片ペプチドと特異的に又は非特異的に相互作用する。
【００２３】
選別工程では、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する。
接触工程での接触直後では、特異的に固定化断片ペプチドと相互作用するアプタマー以外にも、低い親和性で非特異的に固定化断片ペプチドに相互作用する核酸分子や本来は相互作用しないが物理的、静電的に弱い結合・会合状態にある核酸分子（以下、「非特異的核酸分子」という）が固定化断片ペプチドに相互作用している。その後、このような非特異的核酸分子は固定化断片ペプチドから解離することにより、固定化断片ペプチドと相互作用する核酸分子群より排除され、固定化断片ペプチドに相互作用している核酸分子としてアプタマーを選別することができる。
【００２４】
本スクリーニング方法に適用可能な近接場光分析方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、ローカル・プラズモン・共鳴分析、グレーティング・カップルド・レゾナンス分析、二面偏波式干渉分析、近接場蛍光測定、表面増強ラマン散乱測定などを挙げることができる。このうちでも、簡便かつ高感度に経時的な相互作用量を監視することが可能なＳＰＲ分析であることが好ましい。
【００２５】
ＳＰＲ分析は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の反射面の逆側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料中の分子を分析することができる。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。
この装置を用いることによって、検出された全反射減衰の状態から、支持体上の固定化断片ペプチドと核酸分子との相互作用量を得ることができる。この相互作用量は、固定化断片ペプチドに相互作用する核酸分子の量に応じて変化する。即ち、固定化断片ペプチドと核酸分子とを接触させると、相互作用量は飽和量まで上昇し、それに続く洗浄工程によって非特異的に相互作用する核酸分子が固定化断片ペプチドから解離することによって、相互作用量は低下する。
【００２６】
上述したように、相互作用量は、非特異的核酸分子が固定化断片ペプチドから解離することによって低下するため、核酸分子の選別は、相互作用量の変化量として容易に評価することができる。
選別工程を終了すべき程度まで選別が行われたか否かの評価は、しきい値となる特定の相互作用量を予め設定して行ってもよく、また接触工程直後の最大相互作用量からの変化率を用いた場合のしきい値となる特定の変化率を用いて行ってもよい。また、後述するように繰り返し選別工程を行う場合には、前回の選別工程で得られた変化率との比較として評価してもよい。
【００２７】
これらの評価に用いられる値の設定は、選別工程終了時で得られる目的核酸分子の所望量に応じて適宜設定することができる。例えば、後述するように選別工程を繰り返し行うことによって効率よく目的核酸分子を選別することができるため、１回の選別工程で非特異的核酸分子の含有率を極端に下げる必要はない。このため、繰り返し選別工程を行う場合には、含有する非特異的核酸分子の量が多くなる値を設定しても、効率よく目的核酸分子を選別することができる。
【００２８】
選別工程において効率よく選別を行うために、バッファー液等を流して、弱く相互作用する核酸分子を積極的に解離させてもよい。このようなバッファー液の供給は、所望されるスクリーニングの精度に応じて、選別の時間や流速等を調製することができ、これにより、固定化断片ペプチドと相互作用している核酸分子の量を調整することができる。
【００２９】
選別工程によって固定化断片ペプチドと相互作用することによって選別された核酸分子は、その後、固定化断片ペプチドから強制的に分離させることによって回収することができる。相互作用している核酸分子を分離するには、両者の相互作用を解消するための分離手段を用いることができる。このような分離手段としては、アプタマー及び断片ペプチドに対して影響が少ない分離溶液を選択することが好ましく、このような分離溶液としては、７Ｍ尿素溶液などのカオトロピック試薬や１Ｍ塩化ナトリウム溶液などの高塩濃度溶液を挙げることができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを、ＰＣＲ法によって増幅する増幅工程を行うことが好ましい。これにより、断片ペプチドに相互作用するアプタマーの量を増やすことができる。増幅工程で用いられるＰＣＲは、アプタマーの種類に応じたポリメラーゼ及びヌクレオチドと、アプタマーに応じて作成されたプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってアプタマーを合成し増幅可能ないずれの方法によって行ってもよい。
【００３１】
増幅工程を行う際には、核酸分子の種類によっては、ＰＣＲ処理を効率よく実施するために好適な種類の核酸に変換するための変換工程を設けてもよい。このような変換工程としては、例えば、回収されたアプタマーがＲＮＡである場合には逆転写酵素を用いたＤＮＡへの逆転写工程を挙げることができる。
【００３２】
また本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを回収して、再度、接触工程及び選別工程（以下、この２工程をまとめて「スクリーニング工程」という）、場合によっては、これら２工程に加えて更に増幅工程を含めた３工程を、少なくとも１回、場合によって複数回、繰り返すことが好ましい。
図１には、増幅工程を含むスクリーニング工程を繰り返し行う場合の概念図が示されている。図１に示されるように、最初の接触工程では、核酸試料液中には多種の核酸分子が混在しているが、選別工程を経ることにより、断片ペプチドに特異的に相互作用するアプタマーが選別される。このとき、最初の選別工程で回収された核酸分子中にアプタマーと共に非特異的核酸分子が存在していたとしても、２回目のスクリーニング工程で再度選別され、排除される結果、２回目のスクリーニング工程後の核酸分子中のアプタマーの比率は、１回目のスクリーニング工程後の核酸分子中での比率よりも高くなる。
従って、これを繰り返すことにより、目的とするアプタマーをより一層効率よく且つ大量に得ることができる。
また、スクリーニング工程を繰り返し行うことにより一層効率よくアプタマーの選別を行うことができるので、選別工程における非特異的核酸分子の除去を長時間かけて行う必要がなく、さらに短時間で効率よくアプタマーを得ることができる。
【００３３】
スクリーニング工程の繰り返し回数は、断片ペプチドやアプタマーの種類等によって適宜変更することができるが、得られたアプタマーの量や、スクリーニング工程後の核酸試料液中に存在する非特異的核酸分子の量に基づいて判断することができる。
【００３４】
なお、本スクリーニング方法で用いられる装置、流路、支持体表面など、核酸分子と接触する部材及び部位に対しては、核酸分子の分解を排除するための処理を接触工程の前に予め行っておくことが好ましい。このような処理としては、ヌクレアーゼ除去処理を挙げることができる。ヌクレアーゼ除去処理では、ジエチルプロカーボネート（ＤＥＰＣ）、過酸化水素などの溶液を、核酸分子と接触する部材及び部位に接触させればよい。更に、核酸試料液の接触しうる部材、好ましくは少なくとも流路部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことがより好ましい。また、この場合ヌクレアーゼ除去処理後に該部材を高温に加熱することで、該ヌクレアーゼ除去処理に用いた処理液を揮発させて除いてもよい。
【００３５】
本スクリーニング方法には、市販のＳＰＲ装置及びＰＣＲ装置をそのまま適用することができる。また、ＳＰＲとＰＣＲとを共に備えたスクリーニング装置を用いることによって、より効率よく目的とするアプタマーを得ることができる。図２には、本発明のスクリーニング方法を適用可能なスクリーニング装置１００が示されている。スクリーニング装置１００は、ＳＰＲ部１０２及びＰＣＲ部１０４とで構成された動作部１０６と、これらの駆動を制御する制御部６０とを備えている。また、図示しない搬送部及び回収部を備えることによってスクリーニング方法を連続して実行可能とすることができる。
このようなＳＰＲ部１０４の一例を、以下に図面を参照しながら説明する。
【００３６】
図３には、上述したスクリーニング装置中のＳＰＲ部として好適なバイオセンサー１０が示されている。
バイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、断片ペプチドＰと核酸分子との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。
図３に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、断片ペプチドＰが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための図示しない押上機構が配置されている。
【００３７】
センサースティック４０は、図４及び図５に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８及び蒸発防止部材４９で構成されている。
【００３８】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａと、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａに対して一体的に形成された被保持部４２Ｂとを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図６にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３９】
金属膜５０の表面には、図６に示すように、固定化膜５０Ａが形成されている。固定化膜５０Ａは、断片ペプチドＰを金属膜５０上に固定化するためのものである。固定化膜５０Ａは、固定する断片ペプチドＰの種類に応じて選択される。
【００４０】
固定化膜５０Ａ上には、断片ペプチドＰが固定された測定領域Ｅ１と、断片ペプチドＰが固定されず、測定領域Ｅ１の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域Ｅ２とが形成される。即ち、参照領域Ｅ２は、断片ペプチドＰが固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するために設けられた領域である。この参照領域Ｅ２は、上述した固定化膜５０Ａを製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、固定化膜５０Ａに対して表面処理を施して、断片ペプチドＰと結合する結合基を失活させる。これにより、固定化膜５０Ａの一部が測定領域Ｅ１となり、残りの部分が参照領域Ｅ２となる。
図７にも示すように、参照領域Ｅ２と、参照領域Ｅ２よりも上流側に位置する測定領域Ｅ１とには、各々光ビームＬ２、Ｌ１が入射される。
【００４１】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが、各々７箇所に形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００４２】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図５に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０上に６個並べて配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、金属膜５０との間に、液体流路４５が構成される。したがって、１本のセンサースティック４０には、独立した６個の液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
【００４３】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、６個の流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００４４】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ｂを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００４５】
図３に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ及びスティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。
【００４６】
容器載置台１６には、化合物溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃棄液容器１９及び図示しない分離液容器が載置されている。化合物溶液プレート１７は、９６に区画されており、核酸試料液をストック可能とされている。バッファー液ストック容器１８は、容器１８Ａ〜１８Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
廃棄液容器１９は、複数の容器１９Ａ〜１９Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅと同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４７】
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａと、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２と、ヘッド２４とを含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向へ移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図８に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている（図８（Ａ）〜（Ｂ）参照）。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００４８】
なお、本バイオセンサー１０においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４９】
光学測定部５４は、図９に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１と参照領域Ｅ２の参照データＧ２とが求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００５０】
制御部６０は、ＰＣＲ部１０４と共に、ＳＰＲ部１０２であるバイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図９に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０には、図２に示されるように、各種の情報を表示する表示部６２と、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００５１】
制御部６０には図示しないメモリが備えられており、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データ及び、スクリーニングプログラムが記憶されている。
制御部６０に記憶される参照データＧ２は、断片ペプチドＰが固定化されていない固定化膜５０Ａ上にランニングバッファーを供給した際に求められる基準点と、核酸分子Ａを供給した際に求められる信号との変化量ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ、およそ１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ2に相当）で示されている。
【００５２】
このように、本バイオセンサー１０では、センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、測定処理が実行される。この相互作用量測定処理では、核酸試料液を液体流路４５へ供給し、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及び図示しない駆動系を駆動して、測定領域Ｅ１から測定データＧ１を取得し、参照領域Ｅ２から参照データＧ２を取得する。次いで、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して、相互作用量データＧ３を算出する。核酸試料液の供給が終了するとバッファー液の供給を開始する。その間、相互作用量データＧ３の算出を継続し、得られた相互作用量データＧ３が経時的に記憶される。ここでは、バッファー液の供給によって非特異的核酸分子の排除が行われて選別が進むため、相互作用量データＧ３は時間と共に小さい値になる。
【００５３】
制御部６０では、得られた相互作用量データＧ３が、所定の測定終了値になった場合又は外部から停止の信号が入力された場合に測定処理を終了し、バッファー液に代えて分離溶液を液体流路４５へ供給すると共に、測定領域Ｅ１から分離した核酸分子を回収する。所定時間の回収が完了すると、バイオセンサー１０での処理を完了し、ＰＣＲ部１０４でのＰＣＲ処理への切り替えを指示する。
なお、測定処理の終了を指示するために用いられる所定の測定終了値は、経時的に算出される相互作用量データＧ３に対するしきい値としてもよく、相互作用量データＧ３の変化率に対するしきい値としてもよい。
【００５４】
ＳＰＲ部１０２としてのバイオセンサー１０と、ＰＣＲ部１０４とを備えたスクリーニング装置１００を用いることによって、核酸溶液中の核酸分子から目的とするアプタマーを効率よくスクリーニングすることができる。
【００５５】
上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーは、目的とするタンパク質の断片ペプチドに相互作用するものであるため、目的とするタンパク質の検出ないしは定量に好ましく用いられる。
即ち、本発明のタンパク質の検出・定量方法は、上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーを用いて、目的核酸分子を相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって、該ペプチドを含有するタンパク質の検出・定量を行うものである。
タンパク質の検出ないしは定量は、本スクリーニング方法で得られたアプタマーを標識化することにより、標識に基づいて近接場光分析を用いないで検出・定量してもよいが、アプタマーを、本スクリーニング方法での断片ペプチドと同様に、支持体上に固定化して近接場光分析に基づいて検出・定量することが好ましい。近接場光分析を用いることによって、相互作用量に基づいて高感度且つ安定且つ簡便に、目的のタンパク質を検出ないしは定量を行うことができる。
【００５６】
本検出・定量方法に用いられるタンパク質は、化学的処理により断片化して得られた断片ペプチドであることが好ましい。断片ペプチドとすることにより、前述したように、不安定なタンパク質や水に不溶性のタンパク質でも、簡便に且つ再現良くタンパク質の検出ないしは定量を行うことができる。
なお、本発明において「検出ないしは定量」とは、タンパク質の検出及び定量の双方であってもよく、これらのいずれかであってもよいことを意味し、相互作用量データを用いることにより、検出と定量の双方を同時に行うことができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は限定されるものではない。
本実施例では、近接場光分析としてＳＰＲを用いた場合を例に説明する。
【００５８】
［実施例１］
各種溶液の調製及び断片ペプチドの固定化
（１）ランダムＲＮＡ混合溶液の調製
スクリーニング対象となる核酸溶液は、以下のようにして、ランダムＲＮＡ溶液として調製する。
まず、ランダムＲＮＡを得るための任意配列を有する１１４ｂｐのオリゴＤＮＡを化学合成によって得る。本ＤＮＡは、５’末端から４０ｂｐに下記に示す５’プライマー結合配列を有し、３’末端から２４ｂｐに下記の３’プライマー結合配列を有し、内部の５０ｂｐはランダム配列を有している。
【００５９】
【表１】
【００６０】
次いで、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ｐｒｉｍｅｒ（５’プライマー：上記結合配列、３’プライマー：上記結合配列の相補鎖），ｄＮＴＰ混合液を加え、６０℃（５０秒）、７２℃（７０秒）、９５℃（７０秒）のＰＣＲ反応を１５Ｃｙｃｌｅ行う。ＰＣＲ反応の詳細はタカラバイオ社推奨条件に従う。
ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）を用いてインヴィトロ転写反応を３７℃で３時間行う。インヴィトロ転写反応の詳細はPromega社推奨条件に従う。反応後、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿を行って転写産物のランダムＲＮＡ混合溶液を得る。
【００６１】
（２）断片ペプチドの調製
カルモジュリンを、トリプシン（Worthington Biochemical Corp.製）を用いて、３７℃３０分反応させる。反応後の液を限外ろ過カラム（MilliPore社、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ １０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）に注入し、１４，０００ｇ ５分間遠心する。得られたろ液を断片ペプチド溶液とし、２８０ｎｍの吸光度を指標としてペプチド濃度を見積もる。
【００６２】
（３）断片ペプチドの固定化
上述、バイオセンサー１０におけるセンサースティック４０に備えられた流路部材４４、保持部材４６を、１ｍｇ／ｍｌＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）に３７℃で２時間浸し、滅菌水で数回ゆすいだ後、１００℃で１５分間加熱する。
固定化膜５０Ａとして、ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）被覆処理を施したセンサースティックに測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２を空間的に分断するウェルを形成する敷居をセットする。ＨＢＳ−Ｐバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）でウェルを満たす。バッファーを除き、活性化液（０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳの等量混合液）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、活性化液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと速やかにバッファーを除いて測定領域Ｅ１には断片ペプチド溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＡｃｅｔａｔｅバッファーｐＨ６．０希釈）１００μｌを、参照領域Ｅ２にはＨＢＳ−Ｐをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ペプチド溶液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと、バッファーを除き、ブロッキング液（１Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ ｐH８．５）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ブロッキング液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、続けて、１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液１００μｌとＨＢＳ−Ｐでウェルを順に洗浄する。本操作によりペプチド固定化膜を得る。
【００６３】
［実施例２］
スクリーニング
ペプチドを固定化したセンサースティックからウェルを形成する敷居を取り外し、バイオセンサー１０にセットする。流路をＨＢＳ−Ｐバッファーで満たし、その状態で、実施例１で作製したランダムＲＮＡ混合溶液１００μｌを流路に１秒間で注入し断片ペプチド固定化膜に接触させ、５分放置する。このとき、固定化断片ペプチドと核酸分子とが相互作用を開始するため、相互作用量は上昇する。次いで、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌを流路に１秒間で注入し、その後、ＨＢＳ−Ｐバッファーを３０μｌずつゆっくり注入していく。この時、ＳＰＲ信号により相互作用の測定を行う。ＳＰＲ信号がベースラインと解離開始の信号の中間の値になるまで非特異的核酸分子が解離したら、７Ｍ 尿素を含むＨＥＰＥＳバッファー１００μｌを供給し、上記断片ペプチドに結合したＲＮＡ分子（アプタマー）を溶出し、回収する。
これにより、カルモジュリンの断片ペプチドに特異的に相互作用するアプタマーを得ることができる。
【００６４】
次いで、回収された核酸分子のアプタマーを増幅するためにＰＣＲを行う。
まず、回収された核酸分子溶液にイソプロパノール沈殿を行い、核酸分子溶液を濃縮する。濃縮された核酸分子（ＲＮＡ）に対して、逆転写酵素（Improm-IITM Reverse Transcriptase、Promega社製）を添加し、３０分間反応させて、ＤＮＡに変換する。逆転写反応の詳細はＰｒｏｍｅｇａ社推奨条件下で行う。得られたＤＮＡを含む溶液に、実施例１と同じ条件でＰＣＲ１５Ｃｙｃｌｅを行う。実施例のＰＣＲと同じ条件で。ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出する。これにより、最初のスクリーニングによって得られたアプタマーを大量に得ることができる。
【００６５】
上記ＰＣＲで得られた増幅アプタマーを含むＤＮＡ混合溶液に対して、転写工程、接触工程、回収工程、逆転写工程及びＰＣＲ工程の上述した一連の操作を３回繰り返す。これにより、カルモジュリンの断片ペプチドに対して相互作用するアプタマーを効率よく増幅しながらスクリーニングすることができ、目的とするアプタマーを効率よく得ることができる。
【００６６】
［実施例３］
アプタマーによるタンパク質の検出・定量
実施例１と同様に、固定化膜５０Ａとして、ＣＭＤ被覆処理を施したセンサースティックにアプタマーを固定化する。固定化方法は実施例１のペプチド固定化方法に従う。ただし、断片ペプチド溶液の代わりに、実施例２で回収されたＲＮＡ混合溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＢＳ−Ｐ）１００μｌを測定領域Ｅ１に反応させる。本操作によりアプタマー固定化膜を得る。次いでカルモジュリンを、実施例１と同じ手法により断片化し、断片ペプチド溶液を得る。
【００６７】
ＳＰＲ信号により相互作用量を測定しながら、得られた断片ペプチド溶液を、流路を介して供給し、アプタマー固定化膜に接触させる。カルモジュリンの断片ペプチドのうち、固定化アプタマーに対して結合能を有する断片ペプチドが存在する場合には、センサー表面膜上のアプタマーに結合し、ＳＰＲ信号が上昇する。この結果、アプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１において、参照領域Ｅ２と比べ、１５ＲＵのＳＰＲ信号が得られた。従って、断片ペプチド溶液中には、固定化アプタマーに対して親和性があるペプチド分子が、１５ＲＵの量で含まれていることがわかる。
【００６８】
［比較例１］
実施例１〜３の操作をカルモジュリンの断片化を行わず、ホールタンパク質として同様の操作を行う。結果、本比較例で得られたアプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１においては、参照領域Ｅ２と比べ０〜３ＲＵ程度しか信号の差が得られず、バックグラウンドノイズに隠れてしまった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のスクリーニング方法を説明する概念図である。
【図２】本発明に適用可能なスクリーニング装置の概略ブロック図である。
【図３】本発明において使用可能なＳＰＲ部の全体斜視図である。
【図４】本発明において使用可能なセンサースティックの斜視図である。
【図５】本発明において使用可能なセンサースティックの分解斜視図である。
【図６】本発明において使用可能なセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図７】本発明において使用可能なセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は本発明において使用可能な液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図９】本発明において使用可能なＳＰＲ部の光学測定部付近の概略図である。
【符号の説明】
【００７０】
１０ バイオセンサー
４０ センサースティック
５０ 金属膜
５０Ａ 固定化膜
５４ 光学測定部
６０Ｄ メモリ
６０ 制御部
６２ 表示部
６４ 入力部
Ｐ 断片ペプチド
Ｅ１ 測定領域
Ｅ２ 参照領域
１００ スクリーニング装置
１０２ ＳＰＲ部
１０４ ＰＣＲ部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子スクリーニング方法及び核酸分子スクリーニング装置に関し、特に、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法及び、これにより得られた核酸分子を用いたタンパク質検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定のタンパク質、ペプチドに結合する核酸及び／又はその誘導体を、その多種の候補の中から選択することは１９９０年以来行われており、その結合性の核酸及び／又はその誘導体はアプタマーと一般的に呼ばれている。アプタマーは、抗体と同様に目的とする特定物質に結合できるだけでなく、高い親和性を有しており、かつ抗体に比べて作製が容易であることから、特定の生理活性部位に特定的なアプタマーを医療分野等に利用することが期待されている。このようなアプタマーを得るための方法としては、アフィニティカラムによる分離や、ＰＣＲによる増幅などの手法が利用されている（例えば特許文献１及び特許文献２）。
アプタマーと特定タンパク質、ペプチドの結合性を評価する方法としては、標識が不要であることと感度の高さから近接場光、例えば表面プラズモン共鳴を利用する方法が挙げられる（例えば、非特許文献１）。また、表面以外の影響を受けずにバックグラウンドノイズを抑制できる点からも近接場光、例えば近接場光蛍光を利用する方法が挙げられる。（例えば非特許文献２）特にスクリーニングの操作中に結合性の評価を行い、その評価に基づいて任意の結合能を持つアプタマーだけを回収することができるため、スクリーニング効率が高いという利点を有している。（例えば非特許文献３）
【特許文献１】特開２００１−６１４７５号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２５４号公報
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry (2001) Vol.276, pp.21476-21481
【非特許文献２】Analytical Chemistry, (1998) Vol.70, pp.3419-3425
【非特許文献３】Analytical Biochemistry, (2005) Vol.342, pp.312-317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、タンパク質そのものやその特異的な部分配列のみを取り出し、その結合性のアプタマーをスクリーニングする方法は、対象となるタンパク質やペプチドの不安定性などの性質によって、所望のアプタマーが得られない場合がある。また、近接場光を利用した分析（以後、近接場光分析と呼ぶ）を行う場合には、目的とするタンパク質を測定面の最表面に固定化する必要があるが、目的タンパク質によっては、固定化操作で壊れる、不溶性のために固定化ができない、といった問題が生じる。
【０００４】
従って、本発明は、標的物質を安定的に用いて核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及びタンパク質検出・定量方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むものである。
【０００６】
ここで、前記分解処理工程は、酵素を用いてタンパク質を分解することであることが好ましい。
また、上記核酸分子スクリーニング方法では、前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含むことが好ましい。
増幅工程を設けた場合には、前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、少なくとも前記接触工程及び選別工程、好ましくは前記接触工程、選別工程及び増幅工程を、少なくとも１回繰り返すことが好ましい。
【０００７】
上記核酸分子スクリーニング方法では、前記固定化断片ペプチドが、同一タンパク質から得られる２種以上の断片ペプチドで構成されていてもよく、また、前記目的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体からなる群より選択されたものであってもよい。
また上記核酸分子スクリーニング方法では、前記近接場光分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析であることが好ましい。
また、上記接触工程を行う前に、核酸試料液の接触する部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことがより好ましい。
【０００８】
本発明のタンパク質検出・定量方法は、上記核酸分子スクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって、該ペプチドを含有するタンパク質の検出又は定量を行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、目的核酸分子を得るために断片ペプチドを用いているので、標的物質を安定的に用いて核酸試料液中の核酸分子から所望の核酸分子を効率よく得ることができる核酸分子スクリーニング方法及びタンパク質検出・定量方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の核酸分子スクリーニング方法は、核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、を含むものである。
【００１１】
本方法では、核酸試料液中の核酸分子から、選択された特定のペプチド分子に特異的に相互作用する目的核酸分子を、タンパク質を分解処理して得られた断片ペプチドを用いて選別する。
このような断片ペプチドは、断片ペプチド分子を包含したタンパク質そのものよりも、構造上の安定性が高く、支持体上への固定化操作で破壊されることが少ない。また、タンパク質そのものの場合には立体構造や親疎水性の関係から不溶性の性質を示すものであっても、断片ペプチドであれば溶液に溶けやすく、核酸試料液を用いたスクリーニングが容易になる。更には、安定状態では内側となる部位のペプチド分子であっても、断片ペプチドとすることにより、タンパク質の変性処理などを行うことなくこの部位に相互作用可能なアプタマーをスクリーニングしやすくすることができる。この結果、安定した標的物質、即ち断片ペプチドによって所望の核酸分子を効率よくまた再現性よく得ることができる。
なお、本発明における目的核酸分子と断片ペプチドとの相互作用とは、物理的、化学的、もしくは生化学的な結合・会合反応をいう。
【００１２】
本発明における核酸分子としては、核酸又は誘導体を挙げることができ、ＤＮＡ、ＲＮＡの他に、これらの誘導体、即ち、天然に存在するＤＮＡ、ＲＮＡの一部を改変したものを含む。核酸誘導体としては、例えば、ＤＮＡと類似した構造を有し、ペプチド結合により骨格を形成する化合物であるＰＮＡ（ペプチド核酸）を挙げることができる。このような核酸分子のうち、本発明における目的核酸分子は、選択された特定のペプチド分子と特異的に相互作用する性質を有し、一般にアプタマーと呼ばれているものである。
【００１３】
核酸試料液を構成する溶液としては、核酸分子を安定して保持することができるものであればよく、一般にバッファー液として用いられているもの、例えば公知の緩衝溶液（化学便覧応用編改訂２版、１３１２頁〜１３２０頁）を基本に、食塩、金属イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなど）、安定化剤（ＤＴＴなど）などを添加したものを用いることができる。特に、ＰＢＳバッファー（リン酸バッファー生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどが好ましく用いられる。
なお、上記アプタマーが相互作用可能なペプチド分子を包含するタンパク質としては、特に限定されない。
【００１４】
本スクリーニング方法における分解処理工程では、支持体上に固定化するためのペプチド分子としての断片ペプチドを得るために、タンパク質分子を分解処理する。
この分解処理としては、タンパク質を所定の長さのペプチドに分解可能な処理であればよいが、タンパク質を比較的穏やかな条件で分解可能な化学的処理、特に酵素を用いた分解処理であることが好ましい。また、酵素による分解処理では１つのタンパク質から複数の断片ペプチドを容易に得ることができるため、目的とするペプチド分子を合成してスクリーニングするよりも多種のアプタマーを簡便に得ることができる。更に、酵素による分解処理では、タンパク質中における切断個所を制御することが可能であるため、得られる断片ペプチドの再現性の点からもより好ましい。
【００１５】
分解処理に用いられる酵素としては、各種プロテアーゼを好ましく用いることができる。このようなプロテアーゼとしては、ペプチドの加水分解に用いられるものであればよく、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、サブチリシン、ジスパーゼなどを挙げることができる。これらの酵素は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。用いられるタンパク質（ペプチド分子）の種類及び所望するアプタマーの種類、スクリーニングの目的によって、適宜選択することができる。
【００１６】
分解処理工程によって得られた断片ペプチドは、固定化工程において、支持体に固定化される。固定化断片ペプチドは、支持体上に単一又は複数種固定化することができるが、同一のタンパク質に由来する断片ペプチドである場合には、スクリーニングの効率を上げるために複数種存在していることが好ましい。
【００１７】
断片ペプチドを固定化するための支持体としては、近接場光分析の適性に対応して透明基板で構成されていてもよく、不透明基板で構成されていてもよい。また、近接場光分析の適性に対応して基板の断片ペプチド固定側に、金属部と、この金属部上または基板上に直接配置されると共に断片ペプチドを固定化できる官能基を有する固定化膜を備えたものを挙げることができる。
透明基板としては、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００１８】
金属部を構成する金属としては、例えば、プラズモン共鳴が生じ得るようなものを挙げることができる。好ましくは、金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、金が特に好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
金属部の形状は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、膜状で膜厚が０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００１９】
金属部は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属部が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属部が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。
金属部の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２０】
固定化膜としては、例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロースなどのヒドロゲル、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。特に、ポリエチレングリコール誘導体、デキストラン誘導体は、生理活性維持の観点から好ましく用いられる。
固定化膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２１】
固定化方法としては、支持体表面に断片ペプチドを固定化できればいずれの方法であってもよいが、支持体表面のカルボキシル基と断片ペプチドのアミノ基とを共有結合により固定化するアミノカップリング法が、簡便性及び安定性の観点から好ましい。この目的で用いられるアミノカップリング法は、常法に従って行えばよく、例えば、Ｎ−エチル−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを用いる方法を挙げることができる。
【００２２】
接触工程では、固定化工程によって得られた固定化断片ペプチドに、試料液中の核酸分子を接触させる。この接触により、核酸試料溶液中に存在する核酸分子の多くが、固定化断片ペプチドと特異的に又は非特異的に相互作用する。
【００２３】
選別工程では、前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する。
接触工程での接触直後では、特異的に固定化断片ペプチドと相互作用するアプタマー以外にも、低い親和性で非特異的に固定化断片ペプチドに相互作用する核酸分子や本来は相互作用しないが物理的、静電的に弱い結合・会合状態にある核酸分子（以下、「非特異的核酸分子」という）が固定化断片ペプチドに相互作用している。その後、このような非特異的核酸分子は固定化断片ペプチドから解離することにより、固定化断片ペプチドと相互作用する核酸分子群より排除され、固定化断片ペプチドに相互作用している核酸分子としてアプタマーを選別することができる。
【００２４】
本スクリーニング方法に適用可能な近接場光分析方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、ローカル・プラズモン・共鳴分析、グレーティング・カップルド・レゾナンス分析、二面偏波式干渉分析、近接場蛍光測定、表面増強ラマン散乱測定などを挙げることができる。このうちでも、簡便かつ高感度に経時的な相互作用量を監視することが可能なＳＰＲ分析であることが好ましい。
【００２５】
ＳＰＲ分析は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の反射面の逆側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料中の分子を分析することができる。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。
この装置を用いることによって、検出された全反射減衰の状態から、支持体上の固定化断片ペプチドと核酸分子との相互作用量を得ることができる。この相互作用量は、固定化断片ペプチドに相互作用する核酸分子の量に応じて変化する。即ち、固定化断片ペプチドと核酸分子とを接触させると、相互作用量は飽和量まで上昇し、それに続く洗浄工程によって非特異的に相互作用する核酸分子が固定化断片ペプチドから解離することによって、相互作用量は低下する。
【００２６】
上述したように、相互作用量は、非特異的核酸分子が固定化断片ペプチドから解離することによって低下するため、核酸分子の選別は、相互作用量の変化量として容易に評価することができる。
選別工程を終了すべき程度まで選別が行われたか否かの評価は、しきい値となる特定の相互作用量を予め設定して行ってもよく、また接触工程直後の最大相互作用量からの変化率を用いた場合のしきい値となる特定の変化率を用いて行ってもよい。また、後述するように繰り返し選別工程を行う場合には、前回の選別工程で得られた変化率との比較として評価してもよい。
【００２７】
これらの評価に用いられる値の設定は、選別工程終了時で得られる目的核酸分子の所望量に応じて適宜設定することができる。例えば、後述するように選別工程を繰り返し行うことによって効率よく目的核酸分子を選別することができるため、１回の選別工程で非特異的核酸分子の含有率を極端に下げる必要はない。このため、繰り返し選別工程を行う場合には、含有する非特異的核酸分子の量が多くなる値を設定しても、効率よく目的核酸分子を選別することができる。
【００２８】
選別工程において効率よく選別を行うために、バッファー液等を流して、弱く相互作用する核酸分子を積極的に解離させてもよい。このようなバッファー液の供給は、所望されるスクリーニングの精度に応じて、選別の時間や流速等を調製することができ、これにより、固定化断片ペプチドと相互作用している核酸分子の量を調整することができる。
【００２９】
選別工程によって固定化断片ペプチドと相互作用することによって選別された核酸分子は、その後、固定化断片ペプチドから強制的に分離させることによって回収することができる。相互作用している核酸分子を分離するには、両者の相互作用を解消するための分離手段を用いることができる。このような分離手段としては、アプタマー及び断片ペプチドに対して影響が少ない分離溶液を選択することが好ましく、このような分離溶液としては、７Ｍ尿素溶液などのカオトロピック試薬や１Ｍ塩化ナトリウム溶液などの高塩濃度溶液を挙げることができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを、ＰＣＲ法によって増幅する増幅工程を行うことが好ましい。これにより、断片ペプチドに相互作用するアプタマーの量を増やすことができる。増幅工程で用いられるＰＣＲは、アプタマーの種類に応じたポリメラーゼ及びヌクレオチドと、アプタマーに応じて作成されたプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってアプタマーを合成し増幅可能ないずれの方法によって行ってもよい。
【００３１】
増幅工程を行う際には、核酸分子の種類によっては、ＰＣＲ処理を効率よく実施するために好適な種類の核酸に変換するための変換工程を設けてもよい。このような変換工程としては、例えば、回収されたアプタマーがＲＮＡである場合には逆転写酵素を用いたＤＮＡへの逆転写工程を挙げることができる。
【００３２】
また本発明のスクリーニング方法では、選別工程において選別されたアプタマーを回収して、再度、接触工程及び選別工程（以下、この２工程をまとめて「スクリーニング工程」という）、場合によっては、これら２工程に加えて更に増幅工程を含めた３工程を、少なくとも１回、場合によって複数回、繰り返すことが好ましい。
図１には、増幅工程を含むスクリーニング工程を繰り返し行う場合の概念図が示されている。図１に示されるように、最初の接触工程では、核酸試料液中には多種の核酸分子が混在しているが、選別工程を経ることにより、断片ペプチドに特異的に相互作用するアプタマーが選別される。このとき、最初の選別工程で回収された核酸分子中にアプタマーと共に非特異的核酸分子が存在していたとしても、２回目のスクリーニング工程で再度選別され、排除される結果、２回目のスクリーニング工程後の核酸分子中のアプタマーの比率は、１回目のスクリーニング工程後の核酸分子中での比率よりも高くなる。
従って、これを繰り返すことにより、目的とするアプタマーをより一層効率よく且つ大量に得ることができる。
また、スクリーニング工程を繰り返し行うことにより一層効率よくアプタマーの選別を行うことができるので、選別工程における非特異的核酸分子の除去を長時間かけて行う必要がなく、さらに短時間で効率よくアプタマーを得ることができる。
【００３３】
スクリーニング工程の繰り返し回数は、断片ペプチドやアプタマーの種類等によって適宜変更することができるが、得られたアプタマーの量や、スクリーニング工程後の核酸試料液中に存在する非特異的核酸分子の量に基づいて判断することができる。
【００３４】
なお、本スクリーニング方法で用いられる装置、流路、支持体表面など、核酸分子と接触する部材及び部位に対しては、核酸分子の分解を排除するための処理を接触工程の前に予め行っておくことが好ましい。このような処理としては、ヌクレアーゼ除去処理を挙げることができる。ヌクレアーゼ除去処理では、ジエチルプロカーボネート（ＤＥＰＣ）、過酸化水素などの溶液を、核酸分子と接触する部材及び部位に接触させればよい。更に、核酸試料液の接触しうる部材、好ましくは少なくとも流路部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことがより好ましい。また、この場合ヌクレアーゼ除去処理後に該部材を高温に加熱することで、該ヌクレアーゼ除去処理に用いた処理液を揮発させて除いてもよい。
【００３５】
本スクリーニング方法には、市販のＳＰＲ装置及びＰＣＲ装置をそのまま適用することができる。また、ＳＰＲとＰＣＲとを共に備えたスクリーニング装置を用いることによって、より効率よく目的とするアプタマーを得ることができる。図２には、本発明のスクリーニング方法を適用可能なスクリーニング装置１００が示されている。スクリーニング装置１００は、ＳＰＲ部１０２及びＰＣＲ部１０４とで構成された動作部１０６と、これらの駆動を制御する制御部６０とを備えている。また、図示しない搬送部及び回収部を備えることによってスクリーニング方法を連続して実行可能とすることができる。
このようなＳＰＲ部１０４の一例を、以下に図面を参照しながら説明する。
【００３６】
図３には、上述したスクリーニング装置中のＳＰＲ部として好適なバイオセンサー１０が示されている。
バイオセンサー１０は、金属膜の表面に発生する表面プラズモンを利用して、断片ペプチドＰと核酸分子との相互作用を測定する、いわゆる表面プラズモンセンサーである。
図３に示すように、バイオセンサー１０は、トレイ保持部１２、搬送部１４、容器載置台１６、液体吸排部２０、光学測定部５４及び制御部６０を備えている。
トレイ保持部１２は、載置台１２Ａ及びベルト１２Ｂを含んで構成されている。載置台１２Ａは、矢印Ｙ方向に架け渡されたベルト１２Ｂに取り付けられており、ベルト１２Ｂの回転により矢印Ｙ方向に移動可能とされている。載置台１２Ａ上には、２枚のトレイＴが位置決めして載置される。トレイＴには、センサースティック４０が８本収納されている。センサースティック４０は、断片ペプチドＰが固定されるチップであり、詳細については後述する。載置台１２Ａの下には、センサースティック４０を後述するスティック保持部材１４Ｃの位置まで押し上げるための図示しない押上機構が配置されている。
【００３７】
センサースティック４０は、図４及び図５に示すように、誘電体ブロック４２、流路部材４４、保持部材４６、接着部材４８及び蒸発防止部材４９で構成されている。
【００３８】
誘電体ブロック４２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされたプリズム部４２Ａと、プリズム部４２Ａの両端部にプリズム部４２Ａに対して一体的に形成された被保持部４２Ｂとを備えている。プリズム部４２Ａの互いに平行な２面の内の広い側の上面には、図６にも示すように金属膜５０が形成されている。誘電体ブロック４２は、いわゆるプリズムとして機能し、バイオセンサー１０での測定の際には、プリズム部４２Ａの対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から金属膜５０との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００３９】
金属膜５０の表面には、図６に示すように、固定化膜５０Ａが形成されている。固定化膜５０Ａは、断片ペプチドＰを金属膜５０上に固定化するためのものである。固定化膜５０Ａは、固定する断片ペプチドＰの種類に応じて選択される。
【００４０】
固定化膜５０Ａ上には、断片ペプチドＰが固定された測定領域Ｅ１と、断片ペプチドＰが固定されず、測定領域Ｅ１の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域Ｅ２とが形成される。即ち、参照領域Ｅ２は、断片ペプチドＰが固定された測定領域Ｅ１から得られるデータを補正するために設けられた領域である。この参照領域Ｅ２は、上述した固定化膜５０Ａを製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、固定化膜５０Ａに対して表面処理を施して、断片ペプチドＰと結合する結合基を失活させる。これにより、固定化膜５０Ａの一部が測定領域Ｅ１となり、残りの部分が参照領域Ｅ２となる。
図７にも示すように、参照領域Ｅ２と、参照領域Ｅ２よりも上流側に位置する測定領域Ｅ１とには、各々光ビームＬ２、Ｌ１が入射される。
【００４１】
プリズム部４２Ａの両側面には、上側の端辺に沿って保持部材４６と係合される係合凸部４２Ｃが、下側の端辺に沿ってプリズム部４２Ａの上面と垂直な仮想面の延長上に構成される垂直凸部４２Ｄが、各々７箇所に形成されている。また、誘電体ブロック４２の下面の長手方向に沿った中央部には、係合溝４２Ｅが形成されている。
【００４２】
流路部材４４は、誘電体ブロック４２よりもわずかに狭幅の直方体状とされ、図５に示すように、誘電体ブロック４２の金属膜５０上に６個並べて配置されている。各々の流路部材４４の下面には流路溝４４Ａが形成されており、上面に形成された供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと連通されて、金属膜５０との間に、液体流路４５が構成される。したがって、１本のセンサースティック４０には、独立した６個の液体流路４５が構成される。流路部材４４の側壁には、保持部材４６の内側の図示しない凹部に圧入されて保持部材４６との密着性を確保するための凸部４４Ｂが形成されている。
【００４３】
保持部材４６は、長尺とされ、上面板４６Ａ及び２枚の側面板４６Ｂで構成されている。側面板４６Ｂには、誘電体ブロック４２の係合凸部４２Ｃと係合される係合孔４６Ｃが形成されている。保持部材４６は、６個の流路部材４４を間に挟んで係合孔４６Ｃと係合凸部４２Ｃとが係合されて、誘電体ブロック４２に取り付けられる。これにより、流路部材４４は、誘電体ブロック４２に取り付けられる。上面板４６Ａには、流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂと対向する位置に、流路部材４４に向けて狭くなるテーパー状のピペット挿入孔４６Ｄが形成されている。また、隣り合うピペット挿入孔４６Ｄとピペット挿入孔４６Ｄとの間には、位置決め用のボス４６Ｅが形成されている。
【００４４】
保持部材４６の上面には、蒸発防止部材４９が接着部材４８を介して接着されている。接着部材４８のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置にはピペット挿入用の孔４８Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４８Ｅが形成されている。また、蒸発防止部材４９のピペット挿入孔４６Ｄと対向する位置には十字状の切り込みであるスリット４９Ｄが形成され、ボス４６Ｅと対向する位置には位置決め用の孔４９Ｅが形成されている。ボス４６Ｅを孔４８Ｅ及び４９Ｅに挿通させて、蒸発防止部材４９を保持部材５２の上面に接着することにより、蒸発防止部材４９のスリット４９Ｄと流路部材４４の供給口４５Ａ及び排出口４５Ｂとが対向するように構成される。ピペットチップＣＰの非挿入時には、スリット４９Ｄ部分が供給口４５Ｂを覆い、液体流路４５に供給されている液体の蒸発が防止される。
【００４５】
図３に示すように、バイオセンサー１０の搬送部１４は、上部ガイドレール１４Ａ、下部ガイドレール１４Ｂ及びスティック保持部材１４Ｃ、を含んで構成されている。上部ガイドレール１４Ａ及び下部ガイドレール１４Ｂは、トレイ保持部１２及び光学測定部５４の上部で、矢印Ｙ方向と直交する矢印Ｘ方向に水平に配置されている。上部ガイドレール１４Ａには、スティック保持部材１４Ｃが取り付けられている。スティック保持部材１４Ｃは、センサースティック４０の両端部の被保持部４２Ｂを保持可能とされていると共に、上部ガイドレール１４Ａに沿って移動可能とされている。スティック保持部材１４Ｃに保持されたセンサースティック４０の係合溝４２Ｅと下部ガイドレール１４Ｂとが係合され、スティック保持部材１４Ｃが矢印Ｘ方向に移動することにより、センサースティック４０が光学測定部５４上の測定部５６に搬送される。
【００４６】
容器載置台１６には、化合物溶液プレート１７、バッファー液ストック容器１８、廃棄液容器１９及び図示しない分離液容器が載置されている。化合物溶液プレート１７は、９６に区画されており、核酸試料液をストック可能とされている。バッファー液ストック容器１８は、容器１８Ａ〜１８Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅには、後述するピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
廃棄液容器１９は、複数の容器１９Ａ〜１９Ｅで構成されており、容器１８Ａ〜１８Ｅと同様にピペットチップＣＰを挿入可能な開口Ｋが形成されている。
【００４７】
液体吸排部２０は、上部ガイドレール１４Ａと、ガイドレール１６Ｂよりも上方で、矢印Ｙ方向に架け渡された横断レール２２と、ヘッド２４とを含んで構成されている。横断レール２２は、図示しない駆動機構により、矢印Ｘ方向へ移動可能とされている。また、ヘッド２４は、横断レール２２に取り付けられ、矢印Ｙ方向に移動可能とされている。また、ヘッド２４は、図示しない駆動機構により、鉛直方向（矢印Ｚ方向）にも移動可能とされている。ヘッド２４は、図８に示すように、２本のピペット部２４Ａ、２４Ｂを備えている。ピペット部２４Ａ、２４Ｂには、先端部にピペットチップＣＰが取り付けられ、個々にＺ方向の長さを調整可能とされている（図８（Ａ）〜（Ｂ）参照）。ピペットチップＣＰは、図示しないピペットチップストッカーに多数ストックされており、必要に応じて交換可能とされている。
【００４８】
なお、本バイオセンサー１０においてはセンサースティック４０への液体供給はピペットチップＣＰにより行われるが、ピペットチップの代わりに、一端が上記各溶液プレートに接続され、他端がセンサースティック４０に接続可能とされたインジェクションチューブを設け、送液ポンプにより液体の供給を行ってもよい。
【００４９】
光学測定部５４は、図９に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅを含んで構成されている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、２本の光ビームＬ１、Ｌ２となり、測定部５６に配置された誘電体ブロック４２の測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２に入射される。測定領域Ｅ１及び参照領域Ｅ２において、光ビームＬ１、Ｌ２は、金属膜５０と誘電体ブロック４２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬ１、Ｌ２は、誘電体ブロック４２と金属膜５０との界面で全反射される。全反射された光ビームＬ１、Ｌ２も、種々の反射角成分をもって反射される。この全反射された光ビームＬ１、Ｌ２は、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、測定領域Ｅ１の測定データＧ１と参照領域Ｅ２の参照データＧ２とが求められる。この測定データＧ１、参照データＧ２が制御部６０へ出力される。
【００５０】
制御部６０は、ＰＣＲ部１０４と共に、ＳＰＲ部１０２であるバイオセンサー１０の全体を制御する機能を有し、図９に示すように、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及びバイオセンサー１０の図示しない駆動系と接続されている。制御部６０には、図２に示されるように、各種の情報を表示する表示部６２と、各種の指示、情報を入力するための入力部６４と接続されている。
【００５１】
制御部６０には図示しないメモリが備えられており、バイオセンサー１０を制御するための各種プログラムや、各種データ及び、スクリーニングプログラムが記憶されている。
制御部６０に記憶される参照データＧ２は、断片ペプチドＰが固定化されていない固定化膜５０Ａ上にランニングバッファーを供給した際に求められる基準点と、核酸分子Ａを供給した際に求められる信号との変化量ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ、およそ１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ2に相当）で示されている。
【００５２】
このように、本バイオセンサー１０では、センサースティック４０が測定部５６へ搬送され、入力部６４から測定開始の指示が入力されると、制御部６０では、測定処理が実行される。この相互作用量測定処理では、核酸試料液を液体流路４５へ供給し、光源５４Ａ、信号処理部５４Ｅ及び図示しない駆動系を駆動して、測定領域Ｅ１から測定データＧ１を取得し、参照領域Ｅ２から参照データＧ２を取得する。次いで、測定データＧ１を参照データＧ２で補正して、相互作用量データＧ３を算出する。核酸試料液の供給が終了するとバッファー液の供給を開始する。その間、相互作用量データＧ３の算出を継続し、得られた相互作用量データＧ３が経時的に記憶される。ここでは、バッファー液の供給によって非特異的核酸分子の排除が行われて選別が進むため、相互作用量データＧ３は時間と共に小さい値になる。
【００５３】
制御部６０では、得られた相互作用量データＧ３が、所定の測定終了値になった場合又は外部から停止の信号が入力された場合に測定処理を終了し、バッファー液に代えて分離溶液を液体流路４５へ供給すると共に、測定領域Ｅ１から分離した核酸分子を回収する。所定時間の回収が完了すると、バイオセンサー１０での処理を完了し、ＰＣＲ部１０４でのＰＣＲ処理への切り替えを指示する。
なお、測定処理の終了を指示するために用いられる所定の測定終了値は、経時的に算出される相互作用量データＧ３に対するしきい値としてもよく、相互作用量データＧ３の変化率に対するしきい値としてもよい。
【００５４】
ＳＰＲ部１０２としてのバイオセンサー１０と、ＰＣＲ部１０４とを備えたスクリーニング装置１００を用いることによって、核酸溶液中の核酸分子から目的とするアプタマーを効率よくスクリーニングすることができる。
【００５５】
上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーは、目的とするタンパク質の断片ペプチドに相互作用するものであるため、目的とするタンパク質の検出ないしは定量に好ましく用いられる。
即ち、本発明のタンパク質の検出・定量方法は、上記スクリーニング方法によって得られたアプタマーを用いて、目的核酸分子を相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって、該ペプチドを含有するタンパク質の検出・定量を行うものである。
タンパク質の検出ないしは定量は、本スクリーニング方法で得られたアプタマーを標識化することにより、標識に基づいて近接場光分析を用いないで検出・定量してもよいが、アプタマーを、本スクリーニング方法での断片ペプチドと同様に、支持体上に固定化して近接場光分析に基づいて検出・定量することが好ましい。近接場光分析を用いることによって、相互作用量に基づいて高感度且つ安定且つ簡便に、目的のタンパク質を検出ないしは定量を行うことができる。
【００５６】
本検出・定量方法に用いられるタンパク質は、化学的処理により断片化して得られた断片ペプチドであることが好ましい。断片ペプチドとすることにより、前述したように、不安定なタンパク質や水に不溶性のタンパク質でも、簡便に且つ再現良くタンパク質の検出ないしは定量を行うことができる。
なお、本発明において「検出ないしは定量」とは、タンパク質の検出及び定量の双方であってもよく、これらのいずれかであってもよいことを意味し、相互作用量データを用いることにより、検出と定量の双方を同時に行うことができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は限定されるものではない。
本実施例では、近接場光分析としてＳＰＲを用いた場合を例に説明する。
【００５８】
［実施例１］
各種溶液の調製及び断片ペプチドの固定化
（１）ランダムＲＮＡ混合溶液の調製
スクリーニング対象となる核酸溶液は、以下のようにして、ランダムＲＮＡ溶液として調製する。
まず、ランダムＲＮＡを得るための任意配列を有する１１４ｂｐのオリゴＤＮＡを化学合成によって得る。本ＤＮＡは、５’末端から４０ｂｐに下記に示す５’プライマー結合配列を有し、３’末端から２４ｂｐに下記の３’プライマー結合配列を有し、内部の５０ｂｐはランダム配列を有している。
【００５９】
【表１】
【００６０】
次いで、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ｐｒｉｍｅｒ（５’プライマー：上記結合配列、３’プライマー：上記結合配列の相補鎖），ｄＮＴＰ混合液を加え、６０℃（５０秒）、７２℃（７０秒）、９５℃（７０秒）のＰＣＲ反応を１５Ｃｙｃｌｅ行う。ＰＣＲ反応の詳細はタカラバイオ社推奨条件に従う。
ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega社製）を用いてインヴィトロ転写反応を３７℃で３時間行う。インヴィトロ転写反応の詳細はPromega社推奨条件に従う。反応後、フェノール・クロロホルム処理、イソプロパノール沈殿を行って転写産物のランダムＲＮＡ混合溶液を得る。
【００６１】
（２）断片ペプチドの調製
カルモジュリンを、トリプシン（Worthington Biochemical Corp.製）を用いて、３７℃３０分反応させる。反応後の液を限外ろ過カラム（MilliPore社、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ １０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）に注入し、１４，０００ｇ ５分間遠心する。得られたろ液を断片ペプチド溶液とし、２８０ｎｍの吸光度を指標としてペプチド濃度を見積もる。
【００６２】
（３）断片ペプチドの固定化
上述、バイオセンサー１０におけるセンサースティック４０に備えられた流路部材４４、保持部材４６を、１ｍｇ／ｍｌＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）に３７℃で２時間浸し、滅菌水で数回ゆすいだ後、１００℃で１５分間加熱する。
固定化膜５０Ａとして、ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）被覆処理を施したセンサースティックに測定領域Ｅ１と参照領域Ｅ２を空間的に分断するウェルを形成する敷居をセットする。ＨＢＳ−Ｐバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）でウェルを満たす。バッファーを除き、活性化液（０．２ＭのＥＤＣと０．０５ＭのＮＨＳの等量混合液）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、活性化液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと速やかにバッファーを除いて測定領域Ｅ１には断片ペプチド溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＡｃｅｔａｔｅバッファーｐＨ６．０希釈）１００μｌを、参照領域Ｅ２にはＨＢＳ−Ｐをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ペプチド溶液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、そのあと、バッファーを除き、ブロッキング液（１Ｍ エタノールアミン・ＨＣｌ ｐH８．５）１００μｌをウェルに１秒間で注入し、３０分放置する。続けて、ブロッキング液を除き、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌをウェルに１秒間で注入し、続けて、１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液１００μｌとＨＢＳ−Ｐでウェルを順に洗浄する。本操作によりペプチド固定化膜を得る。
【００６３】
［実施例２］
スクリーニング
ペプチドを固定化したセンサースティックからウェルを形成する敷居を取り外し、バイオセンサー１０にセットする。流路をＨＢＳ−Ｐバッファーで満たし、その状態で、実施例１で作製したランダムＲＮＡ混合溶液１００μｌを流路に１秒間で注入し断片ペプチド固定化膜に接触させ、５分放置する。このとき、固定化断片ペプチドと核酸分子とが相互作用を開始するため、相互作用量は上昇する。次いで、ＨＢＳ−Ｐバッファー１００μｌを流路に１秒間で注入し、その後、ＨＢＳ−Ｐバッファーを３０μｌずつゆっくり注入していく。この時、ＳＰＲ信号により相互作用の測定を行う。ＳＰＲ信号がベースラインと解離開始の信号の中間の値になるまで非特異的核酸分子が解離したら、７Ｍ 尿素を含むＨＥＰＥＳバッファー１００μｌを供給し、上記断片ペプチドに結合したＲＮＡ分子（アプタマー）を溶出し、回収する。
これにより、カルモジュリンの断片ペプチドに特異的に相互作用するアプタマーを得ることができる。
【００６４】
次いで、回収された核酸分子のアプタマーを増幅するためにＰＣＲを行う。
まず、回収された核酸分子溶液にイソプロパノール沈殿を行い、核酸分子溶液を濃縮する。濃縮された核酸分子（ＲＮＡ）に対して、逆転写酵素（Improm-IITM Reverse Transcriptase、Promega社製）を添加し、３０分間反応させて、ＤＮＡに変換する。逆転写反応の詳細はＰｒｏｍｅｇａ社推奨条件下で行う。得られたＤＮＡを含む溶液に、実施例１と同じ条件でＰＣＲ１５Ｃｙｃｌｅを行う。実施例のＰＣＲと同じ条件で。ＰＣＲ反応終了後、イソプロパノール沈殿を行って抽出し、ＰＣＲ産物を抽出する。これにより、最初のスクリーニングによって得られたアプタマーを大量に得ることができる。
【００６５】
上記ＰＣＲで得られた増幅アプタマーを含むＤＮＡ混合溶液に対して、転写工程、接触工程、回収工程、逆転写工程及びＰＣＲ工程の上述した一連の操作を３回繰り返す。これにより、カルモジュリンの断片ペプチドに対して相互作用するアプタマーを効率よく増幅しながらスクリーニングすることができ、目的とするアプタマーを効率よく得ることができる。
【００６６】
［実施例３］
アプタマーによるタンパク質の検出・定量
実施例１と同様に、固定化膜５０Ａとして、ＣＭＤ被覆処理を施したセンサースティックにアプタマーを固定化する。固定化方法は実施例１のペプチド固定化方法に従う。ただし、断片ペプチド溶液の代わりに、実施例２で回収されたＲＮＡ混合溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ ＨＢＳ−Ｐ）１００μｌを測定領域Ｅ１に反応させる。本操作によりアプタマー固定化膜を得る。次いでカルモジュリンを、実施例１と同じ手法により断片化し、断片ペプチド溶液を得る。
【００６７】
ＳＰＲ信号により相互作用量を測定しながら、得られた断片ペプチド溶液を、流路を介して供給し、アプタマー固定化膜に接触させる。カルモジュリンの断片ペプチドのうち、固定化アプタマーに対して結合能を有する断片ペプチドが存在する場合には、センサー表面膜上のアプタマーに結合し、ＳＰＲ信号が上昇する。この結果、アプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１において、参照領域Ｅ２と比べ、１５ＲＵのＳＰＲ信号が得られた。従って、断片ペプチド溶液中には、固定化アプタマーに対して親和性があるペプチド分子が、１５ＲＵの量で含まれていることがわかる。
【００６８】
［比較例１］
実施例１〜３の操作をカルモジュリンの断片化を行わず、ホールタンパク質として同様の操作を行う。結果、本比較例で得られたアプタマー固定化膜の測定領域Ｅ１においては、参照領域Ｅ２と比べ０〜３ＲＵ程度しか信号の差が得られず、バックグラウンドノイズに隠れてしまった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のスクリーニング方法を説明する概念図である。
【図２】本発明に適用可能なスクリーニング装置の概略ブロック図である。
【図３】本発明において使用可能なＳＰＲ部の全体斜視図である。
【図４】本発明において使用可能なセンサースティックの斜視図である。
【図５】本発明において使用可能なセンサースティックの分解斜視図である。
【図６】本発明において使用可能なセンサースティックの１の液体流路部分の断面図である。
【図７】本発明において使用可能なセンサースティックの測定領域、参照領域へ光ビームが入射している状態を示す図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）は本発明において使用可能な液体供給部を構成するピペット部の側面図である。
【図９】本発明において使用可能なＳＰＲ部の光学測定部付近の概略図である。
【符号の説明】
【００７０】
１０ バイオセンサー
４０ センサースティック
５０ 金属膜
５０Ａ 固定化膜
５４ 光学測定部
６０Ｄ メモリ
６０ 制御部
６２ 表示部
６４ 入力部
Ｐ 断片ペプチド
Ｅ１ 測定領域
Ｅ２ 参照領域
１００ スクリーニング装置
１０２ ＳＰＲ部
１０４ ＰＣＲ部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、
前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、
前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、
前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、
前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、
を含む核酸分子スクリーニング方法。
【請求項２】
前記分解処理工程が、酵素を用いてタンパク質を分解することである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含む請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、前記接触工程及び選別工程を少なくとも１回繰り返す請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記固定化断片ペプチドが、同一タンパク質から得られる２種以上の断片ペプチドで構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記目的核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体からなる群より選択されたものである請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記近接場光を利用した分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析である請求項１〜６項のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記接触工程の前に、核酸試料液の接触しうる部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことを特徴とした、請求項１〜３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜７項のいずれかに記載のスクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって該ペプチドを含有するタンパク質の検出又は定量を行う、タンパク質の検出・定量方法。
【請求項１】
核酸試料液中の核酸分子から、選択されたペプチド分子に特異的に相互作用する核酸又は核酸誘導体である目的核酸分子をスクリーニングする核酸分子スクリーニング方法であって、
前記ペプチド分子を包含するタンパク質を分解処理して、断片ペプチドを得る分解処理工程と、
前記断片ペプチドを支持体に固定化して、固定化断片ペプチドを得る固定化工程と、
前記核酸試料液中の核酸分子と前記固定化断片ペプチドとを接触させる接触工程と、
前記支持体表面における近接場光を利用した分析を行って前記固定化断片ペプチドと前記核酸分子との相互作用量を得ながら、得られた相互作用量に基づいて、前記核酸試料液中の核酸分子から前記目的核酸分子を選別する選別工程と、
を含む核酸分子スクリーニング方法。
【請求項２】
前記分解処理工程が、酵素を用いてタンパク質を分解することである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記選別工程によって選別された目的核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する増幅工程、を更に含む請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記増幅工程によって得られた増幅目的核酸分子を回収して、前記接触工程及び選別工程を少なくとも１回繰り返す請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記固定化断片ペプチドが、同一タンパク質から得られる２種以上の断片ペプチドで構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記目的核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体からなる群より選択されたものである請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記近接場光を利用した分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析である請求項１〜６項のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記接触工程の前に、核酸試料液の接触しうる部材を、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）又は過酸化水素を含む溶液に浸すことを特徴とした、請求項１〜３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜７項のいずれかに記載のスクリーニング方法で得られた目的核酸分子を用いて、該目的核酸分子と相互作用するペプチドの検出又は定量を行うことによって該ペプチドを含有するタンパク質の検出又は定量を行う、タンパク質の検出・定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−２４０２８２（Ｐ２００７−２４０２８２Ａ）
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６１８５９（Ｐ２００６−６１８５９）
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月７日（２００６．３．７）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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