核酸分析素子及びそれを用いた核酸分析装置
【課題】読み取り結果におけるエラー率を小さくするために、ヌクレオチドが単分子核酸に取り込まれたとき発生する色素からの蛍光強度を増強する。
【解決手段】プラズモン励起により強い近接場光を発生させる導電性散乱体３２の頂点部１の材質を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、頂点以外の散乱体表面の材質を塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成されない材質とすることで、散乱体頂点部に塩基伸長酵素５を１分子固定する。頂点に発生する強い近接場光で色素を励起することにより、蛍光強度を増強する。
【解決手段】プラズモン励起により強い近接場光を発生させる導電性散乱体３２の頂点部１の材質を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、頂点以外の散乱体表面の材質を塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成されない材質とすることで、散乱体頂点部に塩基伸長酵素５を１分子固定する。頂点に発生する強い近接場光で色素を励起することにより、蛍光強度を増強する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析素子及びそれを用いた核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場などにおいて、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の塩基配列を高速に調べる装置が要求されている。
従来、塩基配列を調べるために用いられている電気泳動を利用した方法では、検査対象のＤＮＡ又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い、終端が特定の塩基となった相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片試料を調製する。この断片試料を、電気泳動により分子量ごとに分離することで、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する。
【０００３】
核酸分析の所要時間を短くするために、核酸を基板上に２次元的に配列し、各核酸の塩基伸長反応を並列的に検出する方法が開発されている。この方法では、検出対象の核酸のテンプレート（１本鎖となった核酸）を、塩基伸長酵素と共に、基板上に２次元的に配列する。それを色素が結合したヌクレオチド（核酸の構成要素）が含まれた溶液中に浸す。検出対象の核酸にヌクレオチドが取り込まれる際、ヌクレオチドに結合していた色素が発する蛍光をＣＣＤにより検出する。ヌクレオチドの種類ごとに異なる色素を結合させておけば、蛍光の波長を識別することにより、取り込まれるヌクレオチドの種類を同定し、核酸の塩基配列を同定することが出来る。この方法において、蛍光の検出感度を上げるためには、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法等のＤＮＡ断片増幅法を用いることにより、一つの核酸断片からそのコピーを合成し、同じ種類の核酸の塊（クラスタ）を形成する。このクラスタを観測することにより、蛍光強度を強くする。以上のように、検出対象の核酸を高密度に配列することにより、５０万以上の並列処理が可能になり、スループット向上と試薬使用量低減が可能になる。
【０００４】
近年、核酸をコピーせずに、単分子の状態で、塩基伸長反応を観察する方法も開発されている（John Eid et al., Science Vol.323, p133 (2009)）。この方法では、基板表面に微小開口を２次元的に形成し、各々の微小開口中に塩基伸長酵素を一つ固定する。検出対象の核酸は塩基伸長酵素に捕捉させる。色素が結合したヌクレオチドが含まれた溶液に浸けると、塩基伸長酵素により、ヌクレオチドが核酸に取り込まれる。このとき、微小開口を通過した励起光により、色素が励起され、蛍光が発生する。この蛍光を検出することにより、核酸に順次取り込まれるヌクレオチドの種類をリアルタイムに検出することが出来る。従来のクラスタを観測する方法では、クラスタを構成する各核酸の塩基伸長反応が、各々同じスピードで進むように、反応を人為的に制御する必要がある。例えば、取り込ませるヌクレオチドにターミネータ分子をつけておき、核酸に取り込まれた後、塩基伸長反応が一旦止まるようにする。その後紫外光照射によりターミネータの働きを止め、各分子一斉に次の反応が進むようにする。これに対し、単分子を測定する方法では、測定対象が１分子であるため、このような反応制御は不要で、高速な測定が可能になる。また、クラスタを用いた方法では、ばらつきの存在により、塩基伸長反応が進むにつれて、クラスタを構成する各分子の反応に不揃いが生じる。その結果、一つのサンプルで読み取ることが出来る塩基数（Read長）には限界がある。これに対し、単分子を測定する方法では、ばらつぎの影響がないため、Read長を大きくすることが出来る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science Vol.323, p133 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
単分子核酸の塩基配列を読み取る装置において、ヌクレオチドが単分子核酸に取り込まれたとき発生する色素からの蛍光は微弱である。そのため、検出信号はノイズの影響を受けやすく、読み取り結果にエラーが生じる可能性がある。エラー率を小さくするためには、単分子核酸に結合した色素から発生する蛍光強度を増強することにより検出信号強度を大きくすることが好ましい。
【０００７】
本発明は、読み取り結果のエラー率を小さくするために、単分子核酸に結合した色素から発生する蛍光強度を増強するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
光透過性を有する基板上に、三角形の形状をした、導電性を有する散乱体を形成する。この散乱体に光を導入すると、散乱体中にはプラズモン共鳴が発生し、頂点部には強い近接場光が発生する。三角形の頂点部の材質と、それ以外の表面部の材質は異なるようにし、頂点部の材質は、塩基伸長反応を促進するための酵素（塩基伸長酵素）を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、それ以外の表面部の材質は、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成されない材料とする。散乱体が形成された基板を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基を形成させるための溶液に浸すと、官能基が頂点部に選択的に形成される。さらに、塩基伸長酵素を含む溶液に浸すと、頂点部に塩基伸長酵素が固定される。頂点部の材質が異なった部分の幅は、いずれも塩基伸長酵素の幅の２倍よりも小さくなるようにする。このようにすれば、頂点部に塩基伸長酵素が２個以上つくことは出来ないため、頂点部に塩基伸長酵素１分子を選択的に固定させることが出来る。
【０００９】
頂点部に塩基伸長酵素が形成された散乱体を、検出対象の核酸（１本鎖となったＤＮＡもしくはＲＮＡ）が含まれる溶液に浸すと、検出対象の核酸は、塩基伸長酵素に捕捉される。溶液中にヌクレオチドを導入すると、ヌクレオチドは、塩基伸長酵素により核酸に取り込まれる。このとき、あらかじめヌクレオチドに蛍光色素を結合させておくと、塩基伸長酵素近傍には近接場光が発生しているため、その近接場光により、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光色素が励起され、蛍光が発生する。ヌクレオチドに結合した蛍光色素の発光波長は、ヌクレオチドの種類ごとに、異なるようにする。核酸分子に取り込まれた時に発生する蛍光波長を識別することにより、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することが出来る。
【００１０】
上記方法において、三角形の頂点部には、プラズモン共鳴により、強い近接場光が発生し、その強度（パワー密度）は、入射光強度よりも強くなる。したがって、ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光強度は、導電性を有する散乱体を用いずに光照射した場合に比べ強くなる。その結果、信号強度を大きくすることが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。
【００１１】
上記の材質が異なる頂点部は、頂点部以外の表面に対して、散乱体の面に垂直な方向に突き出しているとした。このようにした場合、散乱体中の電荷は、突き出していないときに比べ、より小さな領域に集中するので電荷密度が上がり、近接場光強度を強くすることが出来る。また、このような構造にすることにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが可能になる。すなわち、複数の層からなる三角形の形状をした金属プレートが基板表面に埋め込まれたものを、電子線リソグラフィ及びドライエッチングにより作製した後、表面をイオンミリングでエッチングすることにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが出来る。
【００１２】
上記説明では、散乱体の形状を三角形としたが、近接場光が発生する先鋭化された頂点部を有するものであれば、他の形状でも良く、例えば頂点部が棒状になった三角形や、楕円、長方形などであっても良い。
【００１３】
散乱体は、頂点部、頂点部以外の散乱体表面、散乱体の内部それぞれにおいて材質が異なるようにしても良いし、頂点部以外の散乱体表面と散乱体内部の材質を同じにする、もしくは頂点部と散乱体内部の材質を同じにしても良い。また、散乱体内部を複数の材質の層で構成しても良い。
【００１４】
上記散乱体は、基板表面に形成した凹部に配置されるように形成すると良い。このようにすることにより、散乱体側面への塩基伸長酵素の付着を抑制することが可能になり、散乱体の頂点部のみに塩基伸長酵素を固定することが出来る。
【００１５】
塩基伸長酵素を散乱体の頂点部に固定することに代えて、他の物質を介して、検出対象である核酸を頂点部に固定しても良い。検出対象である核酸を頂点部に固定後、塩基伸長酵素及びヌクレオチドを溶液中に供給すると、塩基伸長反応が起こり、溶液中のヌクレオチドが、核酸に取り込まれる。取り込まれる際発生する蛍光を観察することにより、塩基配列を知ることが出来る。
【００１６】
散乱体頂点部に塩基伸長酵素を固定する場合、塩基伸長酵素と頂点部は、半導体微粒子を介して結合させても良い。このように半導体微粒子を用いた場合、半導体微粒子に吸収された励起光のエネルギが色素に移動することで、ヌクレオチドに固定された色素が励起され、蛍光が発生する。したがって、励起光の波長が、蛍光色素の吸収波長と異なるようにすることが出来る。散乱体に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチドに固定された色素からの発光を誘発する。その発光は、バックグランドとして検出器により検出され、信号の信号／ノイズ比の低下を招く。これに対し、半導体微粒子を用いることにより色素の吸収波長と異なる波長の光を照射することにより、検出対象である色素を励起することが出来れば、溶液中に浮遊する色素からの蛍光を抑えることが可能になり、バックグランドの検出を抑制することが可能になる。
【００１７】
散乱体周辺には、光を反射もしくは吸収する遮光膜を形成しても良い。遮光膜を設けることにより、散乱体に入射しなかった光が溶液中に進入することを抑制することが出来る。その結果、溶液中に浮遊するヌクレオチドに固定された色素からの発光を抑制することが出来、バックグランド光の検出を抑制することが出来る（信号の信号／ノイズ比を上げることが出来る）。また、遮光膜が導電性のある材料で出来ている場合、遮光膜の端に集中した電荷と、散乱体の頂点部に集中した電荷が互いに引き合うように相互作用する結果、散乱体頂点近傍に発生する近接場光強度が強くなる。
【００１８】
導電性を有する遮光膜が形成された構造において、遮光膜から頂点部までの基板に水平な方向の距離は、短い方が、頂点部に集中した電荷と遮光膜の端に集中した電荷が、より強く相互作用するため、強い近接場光を発生させることが出来る。この近接場光の増強効果を得るためには、遮光膜から頂点部までの距離は、４０ｎｍ以下にするのが好ましい。
【００１９】
遮光膜から頂点部までの、散乱体の面に対して垂直な方向の距離は、頂点部に固定する塩基伸長酵素の寸法（もしくは頂点部に固定する核酸の寸法）以下にするのが好ましい。遮光膜が形成された構造において、遮光膜の端にも電荷が集まるため、遮光膜の端にも強い近接場光が発生する。塩基伸長酵素の近傍において強い近接場光を発生させるためには、遮光膜の端（基板側の角）の近傍に塩基伸長酵素が存在するようにすると良い。遮光膜から頂点部までの距離（基板に垂直な方向の距離）が、実施的に、塩基伸長酵素の寸法（もしくは頂点部に固定する核酸の寸法）以下になるようにすると、遮光膜の端に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が位置するようにすることが出来るので、塩基伸長酵素の近傍において強い近接場光を発生させることが出来る。
【００２０】
遮光膜の材質は、遮光性を有するものであれば任意で、金属にしても良いし、誘電体多層膜にしても良い。ただし、散乱体頂点部に発生する近接場光を増強するためには、散乱体の材質は、金属などの導電性を有する材料にするのが好ましい。また、遮光膜の材質が、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合可能な材質である場合、散乱体周辺の開口部において、遮光膜の側面（開口部の側面）に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が複数固定される可能性がある。これを防ぐためには、遮光膜の材質を、散乱体表面層と同様に、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合しにくい材質にするのが好ましい。
【００２１】
散乱体周辺に形成する膜は、長方形や三角形などの形状を持つ導電性を有する膜であっても良い。散乱体の近接場光が発生する頂点近傍に、このような膜を形成することにより、頂点部に発生する近接場光を増強させることが出来る。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、単分子核酸の塩基配列を読み取る装置において、ヌクレオチドが単分子核酸に取り込まれたとき発生する色素からの蛍光強度を強くすることが出来る。その結果、検出信号の信号強度を大きくすることが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の核酸分析素子を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図２】本発明の構造を作製する方法を示す図であり、（ａ）は複数の層からなる金属プレートを形成する工程を示す図、（ｂ）は表面をエッチングする工程を示す図。
【図３】散乱体近傍に発生する近接場光強度分布を示す図。
【図４】先端部に核酸又は半導体微粒子を固定した場合を示す図であり、（ａ）は核酸を固定した場合の図、（ｂ）は半導体微粒子を固定した場合の図。
【図５】散乱体の形状を示す図であり、（ａ）は頂点部が段階的に細くなった場合の図、（ｂ）は楕円である場合の図、（ｃ）は直方体である場合の図。
【図６】異なる層構造を持つ場合を示す断面図であり、（ａ）は表面部と散乱体内部が一体となった場合の図、（ｂ）は頂点部と散乱体内部が一体となった場合の図、（ｃ）は散乱体内部が多層構造となった場合の図。
【図７】散乱体周辺に遮光膜が形成された場合を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図８】散乱体近傍に遮光膜が形成された場合に、散乱体近傍に発生する近接場光強度分布を示す図。
【図９】散乱体頂点部と遮光膜の距離と近接場光強度の関係を示す図。
【図１０】散乱体周辺の一部に導電性の膜が形成された場合を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図１１】散乱体周辺に形成される導電性の膜の形状が三角形である場合を示す図。
【図１２】核酸分析装置を示す図であり、（ａ）は全体図、（ｂ）は散乱体の配置方法を示す図。
【図１３】光照射方法を示す図で、試料に対し垂直に光を導入する場合を示す図。
【図１４】光照射方法を示す図で、光の全反射を用いて照射する場合を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による核酸検出素子の構成例を示す図である。図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は側断面図である。光透過性を有する基板４表面に設けた微小な凹部の中に、三角形の形状をした、導電性を有する散乱体３２を形成する。特開２００１−２５５２５４号公報や特開２００４−１５１０４６号公報に示されるように、このような散乱体に、図中ｘ方向に偏光した光を入射させると、散乱体中の電荷が三角形の頂点部に集中する。その結果、頂点近傍には局在した電磁場（近接場光）が発生する。特に、散乱体中の電荷振動の共鳴周波数（プラズモン共鳴周波数）と入射光の振動数を一致させると、入射光のエネルギは、電荷振動のエネルギに効率良く変換され、頂点部に非常に強い近接場光が発生する。
【００２５】
本発明の構造において、この導電性を有する三角形の散乱体の頂点部１の材質と、それ以外の表面部２の材質は異なるようにする。そして、頂点部１の材質は、塩基伸長反応を促進するための酵素（塩基伸長酵素）５を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、それ以外の表面部２の材質は、塩基伸長酵素５を固定させるのに必要な官能基を形成できない材料とする。基板表面に散乱体を形成後、その基板を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基を形成させるための溶液に浸すと、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が頂点部１に選択的に形成される。次に、塩基伸長酵素を含む溶液に浸すと、頂点部１に塩基伸長酵素が固定される。頂点部１のｘ方向の幅（Ｌ5）及びｙ方向の幅（Ｌ50）は、いずれも塩基伸長酵素の幅の２倍よりも小さくなるようにする。このようにすれば、頂点部に塩基伸長酵素が２個以上つくことは出来ないため、頂点部１に塩基伸長酵素１分子を選択的に固定させることが出来る。
【００２６】
頂点部に塩基伸長酵素が形成された散乱体を、検出対象の核酸２０（１本鎖となったＤＮＡもしくはＲＮＡ）が含まれる溶液に浸すと、検出対象の核酸２０は、塩基伸長酵素５に捕捉される。溶液中にヌクレオチド９を導入すると、ヌクレオチド９は、塩基伸長酵素５により核酸２０に取り込まれる。このとき、あらかじめヌクレオチド９に蛍光色素を結合させておくと、塩基伸長酵素近傍には近接場光が発生しているため、その近接場光により、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光色素が励起され、蛍光が発生する。ヌクレオチドに結合した色素の発光波長は、ヌクレオチドの種類ごとに、異なるようにする。核酸分子２０に取り込まれた時に発生する蛍光波長を識別することにより、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することが出来る。上記素子において、三角形の頂点部には、プラズモン共鳴により、強い近接場光が発生し、その強度（パワー密度）は、入射光強度よりも強くなる。したがって、ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光強度は、導電性を有する散乱体を用いずに光照射した場合に比べ強くなる。その結果、信号強度を大きくするこが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。なお、蛍光は、塩基伸長酵素５の近傍にある色素から発生するが、塩基伸長酵素は近接場光が発生する先端部１に固定されているため、塩基対が伸びても、色素に照射される近接場光の強度は一定となる。したがって、発生する蛍光強度は一定となる。
【００２７】
本実施例において、基板４の材質は石英とし、色素を励起するための光６は基板４の裏側から入射させた。励起光６の波長は５３２ｎｍとした。導電性を有する散乱体は、頂点部１、表面層２及び散乱体の本体３の３つの部分から構成されるようにし、頂点部１の材質はＡｕ、表面層２の材質はＴｉ、散乱体内部３の材質はＡｌとした。頂点部１の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍ、散乱体内部３の厚さ（ｄ3）は１０ｎｍとした。基板表面から頂点部１までの距離（ｄ4）は、５ｎｍとした。三角形の頂点部の曲率半径は５ｎｍ、頂点の頂角は６０度とした。プラズモン共鳴周波数は散乱体の材質及び長さＬ1に依存する。本実施例の構成では、長さＬ1は９０ｎｍとした。塩基伸長酵素としては、デオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いた。頂点部のＡｕの部分の表面に、有機硫黄化合物と反応させることにより、頂点部のＡｕ部表面のみにチオール基を導入した。チオール基には、ビオチンを結合させ、デオキシリボ核酸ポリメラーゼには、アビジンを結合させた。そしてビオチンとアビジンを結合させることにより、デオキシリボ核酸ポリメラーゼと頂点部１をつないだ。デオキシリボ核酸ポリメラーゼの１分子の大きさは約１０ｎｍである。したがって、頂点部１に塩基伸長酵素を一分子固定するためには、頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）及びｙ方向の幅（Ｌ50）は、その一分子の大きさの２倍である２０ｎｍよりも小さくする必要がある。本実施例では、Ｌ5＝１０ｎｍ、Ｌ50＝１８ｎｍとした。
【００２８】
図１の実施例において、頂点部１は、頂点部以外の表面２に対してｚ方向に突き出している構造とした。このようにした場合、散乱体中の電荷は、突き出していないときに比べより小さな領域に集中するので（ｘｙ方向だけではなく、ｚ方向に対しても幅が狭まっている）電荷密度が上がり、近接場光強度を強くすることが出来る。また、このような構造にすれば、図２に示すような作製方法により、頂点部１の材質が異なった構造を容易に作製することが可能になる。すなわち、まず図２（ａ）のように、基板４の上にレジスト３７を塗布し、電子線を照射することにより、三角形の開口部を持つレジストパターンを形成する。次に、図２（ｂ）のように、レジストの開口部における基板表面をReactive Ion Etching装置によりエッチングすることにより、基板４に溝３８を形成する。次に、図２（ｃ）のように、散乱体内部となる層３、散乱体の表面層となる層２、及び頂点部１の材質の層３４、の３つの層を蒸着装置により成膜する。次に、図２（ｄ）のように、レジストを除去することにより、溝周辺に形成された膜を除去する。最後に、図２（ｅ）のように、頂点部１の材質の層３４をイオンミリング装置によりエッチングする。このとき、イオンビーム３５を斜めに当てると、頂点部は周囲の影になるため、エッチングされずに残る。これにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが出来る。
【００２９】
上記実施例において、散乱体３２は、基板４表面に埋め込まれるように加工した。もし埋め込まれていない場合、散乱体の頂点部１の側面及び散乱体の内部３の側面にも、塩基伸長酵素が付いてしまう。その結果、複数の塩基伸長酵素が存在するため、単分子測定が困難となる。これに対し、散乱体３２を基板４に埋め込めば、側面に塩基伸長酵素が付くことがなく、散乱体の頂点部１表面にのみ塩基伸長酵素を固定することが出来る。
【００３０】
図３に、本実施例の構造により発生する近接場光強度分布の計算結果を示す。観測面は、頂点部から２ｎｍ離れた面とした。この図に示すように、頂点近傍に強い近接場光が発生し、そのスポット径は１０ｎｍ以下となる。頂点部の強度は入射光強度の１５０倍となるため、その分蛍光強度を強くすることが可能である。
【００３１】
上記実施例では、基板４として石英基板を用いたが、光透過性を有するものであれば他の材料でも良く、例えばＡｌ2Ｏ3基板を用いても良い。
【００３２】
上記実施例において、散乱体内部３の材質はＡｌとしたが、他の材質にしても良く、例えば、Ｃｕ，Ａｕ，Ｐｔ，Ｔｉもしくはそれらの合金などにしても良い。特に、ＡｕやＰｔなど化学的に安定な材質を用いれば、溶液中に素子を浸けたとき素子が腐食することを防ぐことが出来る。本実施例では、腐食が問題となる溶液に対しては、例えば散乱体内部３の材質としてＰｔを用いた。このとき、散乱体の長さ（Ｌ1）は１００ｎｍとし、厚さ（ｄ3）は５０ｎｍとした。なお、プラズモン共鳴波長は散乱体の長さ（Ｌ1）に依存し、最適な長さは材質ごとに異なる。また厚さ（ｄ3）に関しても、最適な厚さは材質ごとに異なる。したがって、材料ごとに長さや厚さを調整するのが好ましい。
【００３３】
上記実施例では、塩基伸長酵素５を固定させるための官能基としてチオール基を用いたが、他の官能基を用いても良い。例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、ケトン基、ＮＨＳ−エステル基、イミドエステル基、スルフィジル基、エポキシ基、ヒドラジド基などの官能基を用いても良い。また官能基と塩基伸長酵素をアビジン、ビオチン、デンドロン、クラウンエーテルなどの化合物を介して結合させても良い。このような化合物を用いることにより、塩基伸長酵素の固定化率を上げることが出来る。
【００３４】
上記実施例では、頂点部１及び表面部２の材質は、それぞれＡｕ，Ｔｉとしたが、塩基伸長酵素を固定するのに必要な官能基を頂点部に選択的につけることが出来る組み合わせであれば良く、例えばつぎのような組み合わせにしても良い。
【００３５】
(1) 頂点部１の材質をＡｕ，Ａｇ，Ｉｎ，Ｐｄ，Ｒｕ，Ｚｎ又はそれらの合金にし、表面部２の材質をＡｌやＣｕ，Ｃｒ又はそれらの合金又はＳｉＯ2，ＴｉＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｃｒ2Ｏ3，ＩＴＯなどの誘電体にする。この場合、有機硫黄化合物、有機セレン化合物、又は有機テルル化合物などを反応させることで、塩基伸長酵素を固定するための官能基を、頂点部１に付けることが出来る。
【００３６】
(2) 頂点部１の材質をＴｉ，Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｄ，Ａｌ，Ｇａ，Ｉｎ，Ｎｂ，Ｚｒ，Ｔａ，Ｈｆ又はそれらの合金とし、表面部２の材質をＡｕ，Ａｇ，Ｐｔ又はそれらの合金にする。この場合、カルボン酸、ホスホン酸、リン酸エステル、有機シラン化合物を反応させることで、塩基伸長酵素を固定するための官能基を、頂点部１に付けることが出来る。
【００３７】
なお、散乱体表面層２の材質をＴｉやＣｒなどの金属にする場合、その金属層の表面にはＴｉＯ2やＣｒ2Ｏ3などの酸化膜層が形成されても問題ない。例えば、散乱体表面層２の表面が外気に触れた際、表面には酸化膜が形成される可能性があるが、問題はない。
【００３８】
上記実施例では、塩基伸長酵素としてデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いたが、他の酵素を用いても良い。また、塩基伸長酵素を頂点部１に固定することに代えて、図４（ａ）に示すように、他の物質を介して、検出対象である核酸２０を頂点部１に固定しても良い。例えば、検出対象とは異なるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸、又はタンパク質、又は染色体、核様体、細胞膜、細胞壁、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、レセプター、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などを介して、測定対象である核酸を頂点部１に固定させても良い。このような構造を用いる場合、検出対象である核酸２０を頂点部１に固定後、塩基伸長酵素５及びヌクレオチド９を溶液中に供給すると、塩基伸長反応が起こり、溶液中のヌクレオチドが、核酸に取り込まれる。取り込まれる際発生する蛍光を観察することにより、塩基配列を知ることが出来る。
【００３９】
図４（ｂ）に示すように、散乱体の頂点部１に半導体微粒子３９を配置し、その半導体微粒子３９上に塩基伸長酵素５を固定しても良い。この場合、近接場光のエネルギは、まず半導体微粒子３９に吸収される。この半導体微粒子３９中のエネルギが、双極子相互作用により、ヌクレオチドに固定された色素へ移動し、色素から蛍光が発生する。半導体微粒子を用いない場合、散乱体３２に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を誘発する。その発光は、バックグランドとして検出器により検出され、信号の信号／ノイズ比の低下を招く。これに対し、半導体微粒子を用いた場合、入射光の波長は、半導体微粒子の吸収波長に一致させる必要があるが、半導体微粒子の吸収波長と、色素の吸収波長は異なるので、入射光により色素は直接励起されない。したがって、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光は生じなく、バックグランド光を低減させる、すなわち信号の信号／ノイズ比を向上させることが出来る。
【００４０】
本実施例では、半導体微粒子として、ＣｄＳｅ微粒子の表面をＺｎＳで覆い、さらにその表面をストレプトアビジンで修飾したもの（インビトロジェン社製品名「Qdot(R)ストレプトアビジン標識」）を用いた。塩基伸長酵素としてデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用い、そこにビオチンを付加した。リンカータンパクであるストレプトアビジンにビオチンを結合させることで、塩基伸長酵素と半導体微粒子を結合させた。先端部１の材質はＴｉとし、そこに上記半導体微粒子を結合させた。
【００４１】
上記実施例では、散乱体の形状を三角形としたが、近接場光が発生する先鋭化された頂点部を有するものであれば、他の形状でも良く、例えば図５に示すように他の形状にしても良い。図５（ａ）は、三角形の頂点部が棒状になった形状の実施例を示す。散乱体を構成する膜構成は、図１の実施例と同じとし、散乱体のｘ方向の長さ（Ｌ8）は、１００ｎｍとした。棒状になった部分のｘ方向の長さ（Ｌ9）は２０ｎｍとし、ｙ方向の幅（Ｌ12）は１０ｎｍとした。頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。入射光の偏光方向はｘ方向とした。図５（ｂ）の実施例では、散乱体の形状は長軸と短軸の比が３：１の楕円とし、長軸の長さ（Ｌ10）は９０ｎｍとした。頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。図５（ｃ）の実施例では、散乱体の形状は長方形とした。散乱体のｘ方向の長さ（Ｌ11）は３０ｎｍ、ｙ方向の長さ（Ｌ12）は１０ｎｍとし、頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。
【００４２】
上記実施例では、散乱体は、３層より構成するとしたが、２層もしくは４層以上より構成しても良い。図６（ａ）の実施例では、散乱体表面層２の材質を散乱体内部の層３と同じとすることで２層構造とした。頂点部１の層の材質はＡｕとし、散乱体内部の層３の材質はＴｉとした。頂点部１の層の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、散乱体内部の層３の厚さ（ｄ3）は５０ｎｍとした。図６（ｂ）の実施例では、頂点部１の材質を散乱体内部の層３と同じとすることで２層構造とした。頂点部１の層及び散乱体内部の層３の材質はＡｕとし、散乱体表面層２の材質はＴｉとした。頂点部から散乱体内部の層３の上面までの厚さ（ｄ5）は１０ｎｍとし、散乱体表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍとした。図６（ｃ）の実施例では、散乱体内部の層３を２層に分けることで４層構造とした。頂点部１の層の材質はＡｕ、散乱体表面層２の材質をＴｉ、散乱体内部の層３をＰｔ、その下に設けられた別の材質の層３１の材質をＡｌとした。頂点部１の層の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、散乱体表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍ、散乱体内部の層３の厚さ（ｄ3）は１０ｎｍ、その下の層３１の厚さ（ｄ6）は２０ｎｍとした。
【００４３】
図１の実施例のように散乱体内部の層３の材質をＡｌとしたとき、ヌクレオチドを含む溶液によりＡｌが腐食する可能性がある。これは、散乱体内部の層３は散乱体表面層２により覆われているが、散乱体表面層２が薄い場合、部分的に存在する隙間をとおして溶液が進入する可能性があるためである。これに対し、図６（ｃ）の実施例のように、Ａｌの層の上にＰｔ層を設けることにより、溶液がＡｌの層へ進入することを防ぐことが出来る。
【００４４】
次に、散乱体周辺に遮光膜が形成された場合について説明する。
図７の実施例では、三角形の散乱体周辺に光を反射又は吸収する遮光用の膜７を形成した。図７（ａ）は上面図、図７（ｂ）は側断面図である。遮光膜７がない場合、散乱体に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を誘発する。その結果、バックグランド光が多く検出されて、信号の信号／ノイズ比が低下する。これに対し、本実施例のように散乱体周辺に遮光膜７を形成すると、散乱体に入射しなかった光が溶液中に進入することを防ぐことが出来、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を抑制することが出来る。本実施例では、遮光膜７の材質をＴｉ、遮光膜７の開口部の形状を散乱体３と同じ形状とした。遮光膜７の厚さは３０ｎｍとした。遮光膜７の開口部の幅（Ｌ2）は１１３ｎｍとし、頂点部１と遮光膜のｘ方向の距離（Ｌ3）は３ｎｍ、三角形の底辺部と遮光膜の距離（Ｌ4）は１０ｎｍとした。散乱体の頂点部１と遮光膜のｚ方向の距離（ｄ4）は５ｎｍとした。
【００４５】
図８に、上記のように遮光膜を形成したとき、頂点部１近傍に発生する近接場光の強度分布を示す。この分布は、頂点部１からｚ方向に２ｎｍ離れた面内における強度分布を示す。この図に示すように、頂点部１近傍に発生する近接場光強度は、入射光強度の約４００倍となり、遮光膜を配置することにより、頂点部１に発生する近接場光強度は強くなる。遮光膜が導電性を有する材質で出来ている場合、遮光膜の端には、金属プレート頂点に集まる電荷と逆の極性を持つ電荷が集まる。遮光膜が金属プレート頂点に近づくと、金属プレート頂点の電荷と、遮光膜の端の電荷はお互いに引き合うように相互作用する結果、遮光膜と金属プレート頂点の間に強い近接場光が発生すると考えられる。
【００４６】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、頂点部１と遮光膜７の間の距離Ｄ（＝｛（ｄ4）2＋（Ｌ3）2｝1/2）は短い方が、頂点部１に集中した電荷と遮光膜７の端に集中した電荷が、より強く相互作用するため、強い近接場光を発生させることが出来る。図９は、頂点部１と遮光膜７の間の距離Ｄと近接場光強度の関係を示す。この図に示すように、距離Ｄが４０ｎｍ以下になると、遮光膜の存在による近接場光強度の増大が起こる。したがって、距離Ｄは４０ｎｍ以下にするのが好ましい。なお、遮光膜を単にバックグランド光の除去を目的に設置する場合は、距離Ｄは４０ｎｍ以下でなくても良い。
【００４７】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、遮光膜の端にも電荷が集まるため、遮光膜の端にも強い近接場光が発生する。塩基伸長酵素５の近傍もしくは頂点部１に固定する核酸の近傍において強い近接場光を発生させるためには、遮光膜７の端（基板側の角）の近傍に塩基伸長酵素もしくは頂点部１に固定する核酸が存在するようにすると良い。そのためには、遮光膜７と頂点部１のｚ方向の距離ｄ4が、塩基伸長酵素５の寸法もしくは頂点部１に固定する核酸の寸法以下になるようにするのが好ましい。本実施例では、塩基伸長酵素５として、寸法がおよそ１０ｎｍのデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いた。したがって、この場合は、距離ｄ4は１０ｎｍ以下にすることが好ましく、本実施例では、ｄ4＝５ｎｍとした。頂点部１と遮光膜７の間の水平方向の距離Ｌ3は５ｎｍとした。
【００４８】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、散乱体の頂点部と反対側のエッジ（三角形の底辺部）３３における散乱体と遮光膜の距離（Ｌ4）が小さすぎると、散乱体の頂点部と反対側のエッジ３３に集中した電荷と遮光膜のエッジに集中した電荷が相互作用する結果、散乱体の頂点部の反対側のエッジ３３と遮光膜のエッジの間に、局在した電磁場が発生してしまう。強度は、頂点部に発生する近接場光ほど強くはないが、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素がこの光により励起され、バックグランド光が発生してしまう可能性がある。この影響を小さくするためには、散乱体の頂点部と反対側（三角形の底辺部）における遮光膜との距離（Ｌ4）は、頂点部１と遮光膜７の間のｘ方向の距離（Ｌ3）よりも大きくするのが好ましい。
【００４９】
上記遮光膜の材質は、遮光性を有するものであれば任意であり、Ｃｒ，Ａｕ，Ｐｔなどの金属にしても良い。また、遮光膜７を金属の膜にすることに換えて、反射率が透過率よりも大きくなるように設計された誘電体多層膜（例えば、Ａｌ2Ｏ3とＳｉＯ2の多層膜）にしても良い。ただし、散乱体頂点部に発生する近接場光を増強するためには、散乱体の材質は、金属などの導電性を有する材料にするのが好ましい。また、遮光膜７の材質が、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合可能な材質である場合、散乱体周辺の開口部において、遮光膜７の側面（開口部の側面）に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が複数固定される可能性がある。これを防ぐためには、遮光膜７の材質を、散乱体表面層２と同様に、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合しにくい材質にするのが好ましい。
【００５０】
上記実施例では、散乱体の周辺に、遮光を目的に、膜を全面に形成したが、頂点部１に発生する近接場光の強度を強くすることを目的に、頂点部１近傍にのみ導電性を有する膜を形成しても良い。図１０は、頂点部１近傍に、長方形の膜８を形成した実施例を示す。図１０（ａ）は上面図、図１０（ｂ）は側断面図である。頂点近傍に形成された膜８の材質はＴｉとし、ｘ方向の幅（Ｌ20）を３００ｎｍ、ｙ方向の幅（Ｌ21）を５００ｎｍ、厚さを３０ｎｍとした。散乱体の頂点部１と遮光膜のｚ方向の距離（ｄ4）は５ｎｍとした。散乱体の形状、材質、寸法は、図１の実施例と同じとした。頂点近傍に形成された膜８のｘ方向及びｙ方向の幅は他の値にしても良く、例えば、ｘ方向の幅（Ｌ20）を１００ｎｍ、ｙ方向の幅（Ｌ21）を３００ｎｍ、としても良い。また、実際には、上記散乱体はマトリックス状に配置するため、頂点近傍に形成された膜８もマトリックス状に配置することになるが、ｙ方向の幅（Ｌ21）を長くすることにより、頂点近傍に形成された膜８が互いに接合するようにしても良い（例えば、散乱体を１μｍ間隔で基板上に並べるとき、ｙ方向の幅（Ｌ21）を１μｍ以上とする）。
【００５１】
上記実施例では、散乱体頂点近傍に形成する膜８の形状は長方形としたが、他の形状にしても良い。例えば、図１１に示すように、膜８の形状を三角形にしても良い。この場合、膜８のｘ方向の長さ（Ｌ7）を適当な値にすると、膜８中にもプラズモンが励起され、その頂点部２１に強い電荷の集中が起こる。そして、頂点部２１に集中した電荷と、散乱体の頂点部１に集中した電荷の相互作用により、２つの頂点の間により強い近接場光を発生させることが出来る。本実施例では、膜８の材質はＴｉ、ｘ方向の長さ（Ｌ7）は９０ｎｍ、厚さは３０ｎｍとした。散乱体の形状、材質、寸法は、図１の実施例と同じとした。
【００５２】
以下、核酸分析装置の実施例について記載する。
図１２は、核酸分析装置の構成図を示す。本実施例では、基板４上に図１に示されるような三角形の形状をした散乱体を、図１２（ｂ）に示すように、マトリックス状に配置した。散乱体は、ｘ方向に４０００個、ｙ方向に３０００個並べた。ｘ方向のピッチ（ｐx）は１μｍ、ｙ方向のピッチ（ｐy）も１μｍとした。散乱体の総数は１２００万個で、散乱体が存在する領域のｘ方向の幅Ｗ10＝４ｍｍ、ｙ方向の幅Ｗ11＝３ｍｍである。散乱体が形成された基板４の上には、薬液を供給するための反応チャンバ１１をかぶせた。図１３に示すように、反応チャンバ１１には、薬液を流すための溝２７及び検出窓１２を形成した。反応チャンバ１１と基板４の間から薬液が漏れないように、溝２７の周辺にはＯリング３６を配置した。核酸、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド等の溶液は薬液タンク２５内に保存し、そこから薬液供給用配管１３を通して、反応チャンバ１１内に形成された溝２７に注入した。薬液タンク２５の温度は、温度制御器により制御した。薬液供給用配管１３内を流れる液体の流量は、バルブ２４により制御した。廃液は、薬液排出用配管２３を通して、廃液タンク２６内に回収した。薬液を流すための溝２７のｘ，ｙ方向の幅は８ｍｍ×８ｍｍとし、散乱体すべての表面が薬液に浸されるようにした。反応チャンバの材質は、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂とした。検出窓１２の材質はガラスとし、厚さは０．１７ｍｍとした。
【００５３】
図１３に示すように、色素を励起するための光は、基板４の裏側から垂直に入射させた。光源１４としては、ＹＡＧレーザ（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）を用い、その光のスポット径をレンズ１５により調整し、レーザ光が散乱体全面に照射されるようにした。ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光は、検出窓１２を通して検出した。蛍光は、対物レンズ１６により平行光にした後、結像レンズ１８により集光し、ＣＣＤカメラ１９等の撮像装置により検出した。対物レンズ１６と結像レンズ１８の間には、発生する蛍光波長のみ透過するフィルタ１７を配置することで、励起光がＣＣＤカメラ１９に入射することを防いだ。各散乱体から発生する蛍光は、ＣＣＤカメラ１９によりリアルタイムに検出した。蛍光色素の種類は、ＣＣＤに映された蛍光色の違いにより識別した。
【００５４】
上記実施例では、入射光は基板４に対し垂直に入射させたが、斜めに入射させても良い。図１４は、プリズムを利用して入射光を斜めに入射させた場合の実施例を示す。この実施例では、光源１４としては、ＹＡＧレーザ（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）を用い、レーザ１４からの出射光をレンズ１５により平行光にし、プリズム２９に入射させた。プリズム２９の上には、核酸検出素子が形成された基板１０を配置し、基板１０の表面で入射光が全反射するようにした。蛍光の検出は、図１３の実施例と同様に、基板１０の反対側に設置された対物レンズ１６及びＣＣＤカメラ１９を用いて行った。図１３のように、基板に垂直に光を入射させる場合、近接場光に変換されなかった光は、溶液中に進み、溶液中の色素からの蛍光（バックグランド光）を発生させてしまう。これに対し、プリズム２９を用いる場合、入射光はプリズム表面で全反射するため、溶液中に進入する入射光の量は小さくなる。その結果、バックグランド光の検出を抑えることが出来る。
【符号の説明】
【００５５】
１ 頂点部
２ 散乱体表面層
３ 散乱体内部
４ 基板
５ 塩基伸長酵素
６ 入射光
７ 遮光膜
８ 頂点近傍に形成された金属膜
９ 色素が結合したヌクレオチド
１０ 核酸検出素子が形成された基板
１１ 反応チャンバ
１２ 検出窓
１３ 薬液供給用配管
１４ レーザ
１５ レンズ
１６ 対物レンズ
１７ フィルタ
１８ 結像レンズ
１９ ＣＣＤカメラ
２０ 核酸
２１ 頂点部
２２ マトリックス状に並べられた核酸検出素子
２３ 薬液排出用配管
２４ バルブ
２５ 薬液タンク
２６ 廃液タンク
２７ 薬液を流すための溝
２９ プリズム
３１ 散乱体内部に設けられた別の材質の層
３２ 導電性を有する散乱体
３３ 頂点と反対側のエッジ
３４ 頂点部と同じ材質の層
３５ イオンビーム
３６ Ｏリング
３７ レジスト
３８ 溝
３９ 半導体微粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析素子及びそれを用いた核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場などにおいて、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の塩基配列を高速に調べる装置が要求されている。
従来、塩基配列を調べるために用いられている電気泳動を利用した方法では、検査対象のＤＮＡ又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い、終端が特定の塩基となった相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片試料を調製する。この断片試料を、電気泳動により分子量ごとに分離することで、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する。
【０００３】
核酸分析の所要時間を短くするために、核酸を基板上に２次元的に配列し、各核酸の塩基伸長反応を並列的に検出する方法が開発されている。この方法では、検出対象の核酸のテンプレート（１本鎖となった核酸）を、塩基伸長酵素と共に、基板上に２次元的に配列する。それを色素が結合したヌクレオチド（核酸の構成要素）が含まれた溶液中に浸す。検出対象の核酸にヌクレオチドが取り込まれる際、ヌクレオチドに結合していた色素が発する蛍光をＣＣＤにより検出する。ヌクレオチドの種類ごとに異なる色素を結合させておけば、蛍光の波長を識別することにより、取り込まれるヌクレオチドの種類を同定し、核酸の塩基配列を同定することが出来る。この方法において、蛍光の検出感度を上げるためには、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法等のＤＮＡ断片増幅法を用いることにより、一つの核酸断片からそのコピーを合成し、同じ種類の核酸の塊（クラスタ）を形成する。このクラスタを観測することにより、蛍光強度を強くする。以上のように、検出対象の核酸を高密度に配列することにより、５０万以上の並列処理が可能になり、スループット向上と試薬使用量低減が可能になる。
【０００４】
近年、核酸をコピーせずに、単分子の状態で、塩基伸長反応を観察する方法も開発されている（John Eid et al., Science Vol.323, p133 (2009)）。この方法では、基板表面に微小開口を２次元的に形成し、各々の微小開口中に塩基伸長酵素を一つ固定する。検出対象の核酸は塩基伸長酵素に捕捉させる。色素が結合したヌクレオチドが含まれた溶液に浸けると、塩基伸長酵素により、ヌクレオチドが核酸に取り込まれる。このとき、微小開口を通過した励起光により、色素が励起され、蛍光が発生する。この蛍光を検出することにより、核酸に順次取り込まれるヌクレオチドの種類をリアルタイムに検出することが出来る。従来のクラスタを観測する方法では、クラスタを構成する各核酸の塩基伸長反応が、各々同じスピードで進むように、反応を人為的に制御する必要がある。例えば、取り込ませるヌクレオチドにターミネータ分子をつけておき、核酸に取り込まれた後、塩基伸長反応が一旦止まるようにする。その後紫外光照射によりターミネータの働きを止め、各分子一斉に次の反応が進むようにする。これに対し、単分子を測定する方法では、測定対象が１分子であるため、このような反応制御は不要で、高速な測定が可能になる。また、クラスタを用いた方法では、ばらつきの存在により、塩基伸長反応が進むにつれて、クラスタを構成する各分子の反応に不揃いが生じる。その結果、一つのサンプルで読み取ることが出来る塩基数（Read長）には限界がある。これに対し、単分子を測定する方法では、ばらつぎの影響がないため、Read長を大きくすることが出来る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science Vol.323, p133 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
単分子核酸の塩基配列を読み取る装置において、ヌクレオチドが単分子核酸に取り込まれたとき発生する色素からの蛍光は微弱である。そのため、検出信号はノイズの影響を受けやすく、読み取り結果にエラーが生じる可能性がある。エラー率を小さくするためには、単分子核酸に結合した色素から発生する蛍光強度を増強することにより検出信号強度を大きくすることが好ましい。
【０００７】
本発明は、読み取り結果のエラー率を小さくするために、単分子核酸に結合した色素から発生する蛍光強度を増強するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
光透過性を有する基板上に、三角形の形状をした、導電性を有する散乱体を形成する。この散乱体に光を導入すると、散乱体中にはプラズモン共鳴が発生し、頂点部には強い近接場光が発生する。三角形の頂点部の材質と、それ以外の表面部の材質は異なるようにし、頂点部の材質は、塩基伸長反応を促進するための酵素（塩基伸長酵素）を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、それ以外の表面部の材質は、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が形成されない材料とする。散乱体が形成された基板を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基を形成させるための溶液に浸すと、官能基が頂点部に選択的に形成される。さらに、塩基伸長酵素を含む溶液に浸すと、頂点部に塩基伸長酵素が固定される。頂点部の材質が異なった部分の幅は、いずれも塩基伸長酵素の幅の２倍よりも小さくなるようにする。このようにすれば、頂点部に塩基伸長酵素が２個以上つくことは出来ないため、頂点部に塩基伸長酵素１分子を選択的に固定させることが出来る。
【０００９】
頂点部に塩基伸長酵素が形成された散乱体を、検出対象の核酸（１本鎖となったＤＮＡもしくはＲＮＡ）が含まれる溶液に浸すと、検出対象の核酸は、塩基伸長酵素に捕捉される。溶液中にヌクレオチドを導入すると、ヌクレオチドは、塩基伸長酵素により核酸に取り込まれる。このとき、あらかじめヌクレオチドに蛍光色素を結合させておくと、塩基伸長酵素近傍には近接場光が発生しているため、その近接場光により、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光色素が励起され、蛍光が発生する。ヌクレオチドに結合した蛍光色素の発光波長は、ヌクレオチドの種類ごとに、異なるようにする。核酸分子に取り込まれた時に発生する蛍光波長を識別することにより、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することが出来る。
【００１０】
上記方法において、三角形の頂点部には、プラズモン共鳴により、強い近接場光が発生し、その強度（パワー密度）は、入射光強度よりも強くなる。したがって、ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光強度は、導電性を有する散乱体を用いずに光照射した場合に比べ強くなる。その結果、信号強度を大きくすることが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。
【００１１】
上記の材質が異なる頂点部は、頂点部以外の表面に対して、散乱体の面に垂直な方向に突き出しているとした。このようにした場合、散乱体中の電荷は、突き出していないときに比べ、より小さな領域に集中するので電荷密度が上がり、近接場光強度を強くすることが出来る。また、このような構造にすることにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが可能になる。すなわち、複数の層からなる三角形の形状をした金属プレートが基板表面に埋め込まれたものを、電子線リソグラフィ及びドライエッチングにより作製した後、表面をイオンミリングでエッチングすることにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが出来る。
【００１２】
上記説明では、散乱体の形状を三角形としたが、近接場光が発生する先鋭化された頂点部を有するものであれば、他の形状でも良く、例えば頂点部が棒状になった三角形や、楕円、長方形などであっても良い。
【００１３】
散乱体は、頂点部、頂点部以外の散乱体表面、散乱体の内部それぞれにおいて材質が異なるようにしても良いし、頂点部以外の散乱体表面と散乱体内部の材質を同じにする、もしくは頂点部と散乱体内部の材質を同じにしても良い。また、散乱体内部を複数の材質の層で構成しても良い。
【００１４】
上記散乱体は、基板表面に形成した凹部に配置されるように形成すると良い。このようにすることにより、散乱体側面への塩基伸長酵素の付着を抑制することが可能になり、散乱体の頂点部のみに塩基伸長酵素を固定することが出来る。
【００１５】
塩基伸長酵素を散乱体の頂点部に固定することに代えて、他の物質を介して、検出対象である核酸を頂点部に固定しても良い。検出対象である核酸を頂点部に固定後、塩基伸長酵素及びヌクレオチドを溶液中に供給すると、塩基伸長反応が起こり、溶液中のヌクレオチドが、核酸に取り込まれる。取り込まれる際発生する蛍光を観察することにより、塩基配列を知ることが出来る。
【００１６】
散乱体頂点部に塩基伸長酵素を固定する場合、塩基伸長酵素と頂点部は、半導体微粒子を介して結合させても良い。このように半導体微粒子を用いた場合、半導体微粒子に吸収された励起光のエネルギが色素に移動することで、ヌクレオチドに固定された色素が励起され、蛍光が発生する。したがって、励起光の波長が、蛍光色素の吸収波長と異なるようにすることが出来る。散乱体に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチドに固定された色素からの発光を誘発する。その発光は、バックグランドとして検出器により検出され、信号の信号／ノイズ比の低下を招く。これに対し、半導体微粒子を用いることにより色素の吸収波長と異なる波長の光を照射することにより、検出対象である色素を励起することが出来れば、溶液中に浮遊する色素からの蛍光を抑えることが可能になり、バックグランドの検出を抑制することが可能になる。
【００１７】
散乱体周辺には、光を反射もしくは吸収する遮光膜を形成しても良い。遮光膜を設けることにより、散乱体に入射しなかった光が溶液中に進入することを抑制することが出来る。その結果、溶液中に浮遊するヌクレオチドに固定された色素からの発光を抑制することが出来、バックグランド光の検出を抑制することが出来る（信号の信号／ノイズ比を上げることが出来る）。また、遮光膜が導電性のある材料で出来ている場合、遮光膜の端に集中した電荷と、散乱体の頂点部に集中した電荷が互いに引き合うように相互作用する結果、散乱体頂点近傍に発生する近接場光強度が強くなる。
【００１８】
導電性を有する遮光膜が形成された構造において、遮光膜から頂点部までの基板に水平な方向の距離は、短い方が、頂点部に集中した電荷と遮光膜の端に集中した電荷が、より強く相互作用するため、強い近接場光を発生させることが出来る。この近接場光の増強効果を得るためには、遮光膜から頂点部までの距離は、４０ｎｍ以下にするのが好ましい。
【００１９】
遮光膜から頂点部までの、散乱体の面に対して垂直な方向の距離は、頂点部に固定する塩基伸長酵素の寸法（もしくは頂点部に固定する核酸の寸法）以下にするのが好ましい。遮光膜が形成された構造において、遮光膜の端にも電荷が集まるため、遮光膜の端にも強い近接場光が発生する。塩基伸長酵素の近傍において強い近接場光を発生させるためには、遮光膜の端（基板側の角）の近傍に塩基伸長酵素が存在するようにすると良い。遮光膜から頂点部までの距離（基板に垂直な方向の距離）が、実施的に、塩基伸長酵素の寸法（もしくは頂点部に固定する核酸の寸法）以下になるようにすると、遮光膜の端に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が位置するようにすることが出来るので、塩基伸長酵素の近傍において強い近接場光を発生させることが出来る。
【００２０】
遮光膜の材質は、遮光性を有するものであれば任意で、金属にしても良いし、誘電体多層膜にしても良い。ただし、散乱体頂点部に発生する近接場光を増強するためには、散乱体の材質は、金属などの導電性を有する材料にするのが好ましい。また、遮光膜の材質が、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合可能な材質である場合、散乱体周辺の開口部において、遮光膜の側面（開口部の側面）に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が複数固定される可能性がある。これを防ぐためには、遮光膜の材質を、散乱体表面層と同様に、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合しにくい材質にするのが好ましい。
【００２１】
散乱体周辺に形成する膜は、長方形や三角形などの形状を持つ導電性を有する膜であっても良い。散乱体の近接場光が発生する頂点近傍に、このような膜を形成することにより、頂点部に発生する近接場光を増強させることが出来る。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、単分子核酸の塩基配列を読み取る装置において、ヌクレオチドが単分子核酸に取り込まれたとき発生する色素からの蛍光強度を強くすることが出来る。その結果、検出信号の信号強度を大きくすることが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の核酸分析素子を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図２】本発明の構造を作製する方法を示す図であり、（ａ）は複数の層からなる金属プレートを形成する工程を示す図、（ｂ）は表面をエッチングする工程を示す図。
【図３】散乱体近傍に発生する近接場光強度分布を示す図。
【図４】先端部に核酸又は半導体微粒子を固定した場合を示す図であり、（ａ）は核酸を固定した場合の図、（ｂ）は半導体微粒子を固定した場合の図。
【図５】散乱体の形状を示す図であり、（ａ）は頂点部が段階的に細くなった場合の図、（ｂ）は楕円である場合の図、（ｃ）は直方体である場合の図。
【図６】異なる層構造を持つ場合を示す断面図であり、（ａ）は表面部と散乱体内部が一体となった場合の図、（ｂ）は頂点部と散乱体内部が一体となった場合の図、（ｃ）は散乱体内部が多層構造となった場合の図。
【図７】散乱体周辺に遮光膜が形成された場合を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図８】散乱体近傍に遮光膜が形成された場合に、散乱体近傍に発生する近接場光強度分布を示す図。
【図９】散乱体頂点部と遮光膜の距離と近接場光強度の関係を示す図。
【図１０】散乱体周辺の一部に導電性の膜が形成された場合を示す図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は側断面図。
【図１１】散乱体周辺に形成される導電性の膜の形状が三角形である場合を示す図。
【図１２】核酸分析装置を示す図であり、（ａ）は全体図、（ｂ）は散乱体の配置方法を示す図。
【図１３】光照射方法を示す図で、試料に対し垂直に光を導入する場合を示す図。
【図１４】光照射方法を示す図で、光の全反射を用いて照射する場合を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による核酸検出素子の構成例を示す図である。図１（ａ）は上面図、図１（ｂ）は側断面図である。光透過性を有する基板４表面に設けた微小な凹部の中に、三角形の形状をした、導電性を有する散乱体３２を形成する。特開２００１−２５５２５４号公報や特開２００４−１５１０４６号公報に示されるように、このような散乱体に、図中ｘ方向に偏光した光を入射させると、散乱体中の電荷が三角形の頂点部に集中する。その結果、頂点近傍には局在した電磁場（近接場光）が発生する。特に、散乱体中の電荷振動の共鳴周波数（プラズモン共鳴周波数）と入射光の振動数を一致させると、入射光のエネルギは、電荷振動のエネルギに効率良く変換され、頂点部に非常に強い近接場光が発生する。
【００２５】
本発明の構造において、この導電性を有する三角形の散乱体の頂点部１の材質と、それ以外の表面部２の材質は異なるようにする。そして、頂点部１の材質は、塩基伸長反応を促進するための酵素（塩基伸長酵素）５を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材質とし、それ以外の表面部２の材質は、塩基伸長酵素５を固定させるのに必要な官能基を形成できない材料とする。基板表面に散乱体を形成後、その基板を、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基を形成させるための溶液に浸すと、塩基伸長酵素を固定させるのに必要な官能基が頂点部１に選択的に形成される。次に、塩基伸長酵素を含む溶液に浸すと、頂点部１に塩基伸長酵素が固定される。頂点部１のｘ方向の幅（Ｌ5）及びｙ方向の幅（Ｌ50）は、いずれも塩基伸長酵素の幅の２倍よりも小さくなるようにする。このようにすれば、頂点部に塩基伸長酵素が２個以上つくことは出来ないため、頂点部１に塩基伸長酵素１分子を選択的に固定させることが出来る。
【００２６】
頂点部に塩基伸長酵素が形成された散乱体を、検出対象の核酸２０（１本鎖となったＤＮＡもしくはＲＮＡ）が含まれる溶液に浸すと、検出対象の核酸２０は、塩基伸長酵素５に捕捉される。溶液中にヌクレオチド９を導入すると、ヌクレオチド９は、塩基伸長酵素５により核酸２０に取り込まれる。このとき、あらかじめヌクレオチド９に蛍光色素を結合させておくと、塩基伸長酵素近傍には近接場光が発生しているため、その近接場光により、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光色素が励起され、蛍光が発生する。ヌクレオチドに結合した色素の発光波長は、ヌクレオチドの種類ごとに、異なるようにする。核酸分子２０に取り込まれた時に発生する蛍光波長を識別することにより、取り込まれたヌクレオチドの種類を同定することが出来る。上記素子において、三角形の頂点部には、プラズモン共鳴により、強い近接場光が発生し、その強度（パワー密度）は、入射光強度よりも強くなる。したがって、ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光強度は、導電性を有する散乱体を用いずに光照射した場合に比べ強くなる。その結果、信号強度を大きくするこが可能になり、読み取り結果におけるエラー率を小さくすることが出来る。なお、蛍光は、塩基伸長酵素５の近傍にある色素から発生するが、塩基伸長酵素は近接場光が発生する先端部１に固定されているため、塩基対が伸びても、色素に照射される近接場光の強度は一定となる。したがって、発生する蛍光強度は一定となる。
【００２７】
本実施例において、基板４の材質は石英とし、色素を励起するための光６は基板４の裏側から入射させた。励起光６の波長は５３２ｎｍとした。導電性を有する散乱体は、頂点部１、表面層２及び散乱体の本体３の３つの部分から構成されるようにし、頂点部１の材質はＡｕ、表面層２の材質はＴｉ、散乱体内部３の材質はＡｌとした。頂点部１の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍ、散乱体内部３の厚さ（ｄ3）は１０ｎｍとした。基板表面から頂点部１までの距離（ｄ4）は、５ｎｍとした。三角形の頂点部の曲率半径は５ｎｍ、頂点の頂角は６０度とした。プラズモン共鳴周波数は散乱体の材質及び長さＬ1に依存する。本実施例の構成では、長さＬ1は９０ｎｍとした。塩基伸長酵素としては、デオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いた。頂点部のＡｕの部分の表面に、有機硫黄化合物と反応させることにより、頂点部のＡｕ部表面のみにチオール基を導入した。チオール基には、ビオチンを結合させ、デオキシリボ核酸ポリメラーゼには、アビジンを結合させた。そしてビオチンとアビジンを結合させることにより、デオキシリボ核酸ポリメラーゼと頂点部１をつないだ。デオキシリボ核酸ポリメラーゼの１分子の大きさは約１０ｎｍである。したがって、頂点部１に塩基伸長酵素を一分子固定するためには、頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）及びｙ方向の幅（Ｌ50）は、その一分子の大きさの２倍である２０ｎｍよりも小さくする必要がある。本実施例では、Ｌ5＝１０ｎｍ、Ｌ50＝１８ｎｍとした。
【００２８】
図１の実施例において、頂点部１は、頂点部以外の表面２に対してｚ方向に突き出している構造とした。このようにした場合、散乱体中の電荷は、突き出していないときに比べより小さな領域に集中するので（ｘｙ方向だけではなく、ｚ方向に対しても幅が狭まっている）電荷密度が上がり、近接場光強度を強くすることが出来る。また、このような構造にすれば、図２に示すような作製方法により、頂点部１の材質が異なった構造を容易に作製することが可能になる。すなわち、まず図２（ａ）のように、基板４の上にレジスト３７を塗布し、電子線を照射することにより、三角形の開口部を持つレジストパターンを形成する。次に、図２（ｂ）のように、レジストの開口部における基板表面をReactive Ion Etching装置によりエッチングすることにより、基板４に溝３８を形成する。次に、図２（ｃ）のように、散乱体内部となる層３、散乱体の表面層となる層２、及び頂点部１の材質の層３４、の３つの層を蒸着装置により成膜する。次に、図２（ｄ）のように、レジストを除去することにより、溝周辺に形成された膜を除去する。最後に、図２（ｅ）のように、頂点部１の材質の層３４をイオンミリング装置によりエッチングする。このとき、イオンビーム３５を斜めに当てると、頂点部は周囲の影になるため、エッチングされずに残る。これにより、頂点部の材質が異なった構造を容易に作製することが出来る。
【００２９】
上記実施例において、散乱体３２は、基板４表面に埋め込まれるように加工した。もし埋め込まれていない場合、散乱体の頂点部１の側面及び散乱体の内部３の側面にも、塩基伸長酵素が付いてしまう。その結果、複数の塩基伸長酵素が存在するため、単分子測定が困難となる。これに対し、散乱体３２を基板４に埋め込めば、側面に塩基伸長酵素が付くことがなく、散乱体の頂点部１表面にのみ塩基伸長酵素を固定することが出来る。
【００３０】
図３に、本実施例の構造により発生する近接場光強度分布の計算結果を示す。観測面は、頂点部から２ｎｍ離れた面とした。この図に示すように、頂点近傍に強い近接場光が発生し、そのスポット径は１０ｎｍ以下となる。頂点部の強度は入射光強度の１５０倍となるため、その分蛍光強度を強くすることが可能である。
【００３１】
上記実施例では、基板４として石英基板を用いたが、光透過性を有するものであれば他の材料でも良く、例えばＡｌ2Ｏ3基板を用いても良い。
【００３２】
上記実施例において、散乱体内部３の材質はＡｌとしたが、他の材質にしても良く、例えば、Ｃｕ，Ａｕ，Ｐｔ，Ｔｉもしくはそれらの合金などにしても良い。特に、ＡｕやＰｔなど化学的に安定な材質を用いれば、溶液中に素子を浸けたとき素子が腐食することを防ぐことが出来る。本実施例では、腐食が問題となる溶液に対しては、例えば散乱体内部３の材質としてＰｔを用いた。このとき、散乱体の長さ（Ｌ1）は１００ｎｍとし、厚さ（ｄ3）は５０ｎｍとした。なお、プラズモン共鳴波長は散乱体の長さ（Ｌ1）に依存し、最適な長さは材質ごとに異なる。また厚さ（ｄ3）に関しても、最適な厚さは材質ごとに異なる。したがって、材料ごとに長さや厚さを調整するのが好ましい。
【００３３】
上記実施例では、塩基伸長酵素５を固定させるための官能基としてチオール基を用いたが、他の官能基を用いても良い。例えばアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、ケトン基、ＮＨＳ−エステル基、イミドエステル基、スルフィジル基、エポキシ基、ヒドラジド基などの官能基を用いても良い。また官能基と塩基伸長酵素をアビジン、ビオチン、デンドロン、クラウンエーテルなどの化合物を介して結合させても良い。このような化合物を用いることにより、塩基伸長酵素の固定化率を上げることが出来る。
【００３４】
上記実施例では、頂点部１及び表面部２の材質は、それぞれＡｕ，Ｔｉとしたが、塩基伸長酵素を固定するのに必要な官能基を頂点部に選択的につけることが出来る組み合わせであれば良く、例えばつぎのような組み合わせにしても良い。
【００３５】
(1) 頂点部１の材質をＡｕ，Ａｇ，Ｉｎ，Ｐｄ，Ｒｕ，Ｚｎ又はそれらの合金にし、表面部２の材質をＡｌやＣｕ，Ｃｒ又はそれらの合金又はＳｉＯ2，ＴｉＯ2，Ａｌ2Ｏ3，Ｃｒ2Ｏ3，ＩＴＯなどの誘電体にする。この場合、有機硫黄化合物、有機セレン化合物、又は有機テルル化合物などを反応させることで、塩基伸長酵素を固定するための官能基を、頂点部１に付けることが出来る。
【００３６】
(2) 頂点部１の材質をＴｉ，Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｄ，Ａｌ，Ｇａ，Ｉｎ，Ｎｂ，Ｚｒ，Ｔａ，Ｈｆ又はそれらの合金とし、表面部２の材質をＡｕ，Ａｇ，Ｐｔ又はそれらの合金にする。この場合、カルボン酸、ホスホン酸、リン酸エステル、有機シラン化合物を反応させることで、塩基伸長酵素を固定するための官能基を、頂点部１に付けることが出来る。
【００３７】
なお、散乱体表面層２の材質をＴｉやＣｒなどの金属にする場合、その金属層の表面にはＴｉＯ2やＣｒ2Ｏ3などの酸化膜層が形成されても問題ない。例えば、散乱体表面層２の表面が外気に触れた際、表面には酸化膜が形成される可能性があるが、問題はない。
【００３８】
上記実施例では、塩基伸長酵素としてデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いたが、他の酵素を用いても良い。また、塩基伸長酵素を頂点部１に固定することに代えて、図４（ａ）に示すように、他の物質を介して、検出対象である核酸２０を頂点部１に固定しても良い。例えば、検出対象とは異なるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸、又はタンパク質、又は染色体、核様体、細胞膜、細胞壁、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、レセプター、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などを介して、測定対象である核酸を頂点部１に固定させても良い。このような構造を用いる場合、検出対象である核酸２０を頂点部１に固定後、塩基伸長酵素５及びヌクレオチド９を溶液中に供給すると、塩基伸長反応が起こり、溶液中のヌクレオチドが、核酸に取り込まれる。取り込まれる際発生する蛍光を観察することにより、塩基配列を知ることが出来る。
【００３９】
図４（ｂ）に示すように、散乱体の頂点部１に半導体微粒子３９を配置し、その半導体微粒子３９上に塩基伸長酵素５を固定しても良い。この場合、近接場光のエネルギは、まず半導体微粒子３９に吸収される。この半導体微粒子３９中のエネルギが、双極子相互作用により、ヌクレオチドに固定された色素へ移動し、色素から蛍光が発生する。半導体微粒子を用いない場合、散乱体３２に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を誘発する。その発光は、バックグランドとして検出器により検出され、信号の信号／ノイズ比の低下を招く。これに対し、半導体微粒子を用いた場合、入射光の波長は、半導体微粒子の吸収波長に一致させる必要があるが、半導体微粒子の吸収波長と、色素の吸収波長は異なるので、入射光により色素は直接励起されない。したがって、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光は生じなく、バックグランド光を低減させる、すなわち信号の信号／ノイズ比を向上させることが出来る。
【００４０】
本実施例では、半導体微粒子として、ＣｄＳｅ微粒子の表面をＺｎＳで覆い、さらにその表面をストレプトアビジンで修飾したもの（インビトロジェン社製品名「Qdot(R)ストレプトアビジン標識」）を用いた。塩基伸長酵素としてデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用い、そこにビオチンを付加した。リンカータンパクであるストレプトアビジンにビオチンを結合させることで、塩基伸長酵素と半導体微粒子を結合させた。先端部１の材質はＴｉとし、そこに上記半導体微粒子を結合させた。
【００４１】
上記実施例では、散乱体の形状を三角形としたが、近接場光が発生する先鋭化された頂点部を有するものであれば、他の形状でも良く、例えば図５に示すように他の形状にしても良い。図５（ａ）は、三角形の頂点部が棒状になった形状の実施例を示す。散乱体を構成する膜構成は、図１の実施例と同じとし、散乱体のｘ方向の長さ（Ｌ8）は、１００ｎｍとした。棒状になった部分のｘ方向の長さ（Ｌ9）は２０ｎｍとし、ｙ方向の幅（Ｌ12）は１０ｎｍとした。頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。入射光の偏光方向はｘ方向とした。図５（ｂ）の実施例では、散乱体の形状は長軸と短軸の比が３：１の楕円とし、長軸の長さ（Ｌ10）は９０ｎｍとした。頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。図５（ｃ）の実施例では、散乱体の形状は長方形とした。散乱体のｘ方向の長さ（Ｌ11）は３０ｎｍ、ｙ方向の長さ（Ｌ12）は１０ｎｍとし、頂点部１の材質が異なった部分のｘ方向の幅（Ｌ5）は１０ｎｍとした。
【００４２】
上記実施例では、散乱体は、３層より構成するとしたが、２層もしくは４層以上より構成しても良い。図６（ａ）の実施例では、散乱体表面層２の材質を散乱体内部の層３と同じとすることで２層構造とした。頂点部１の層の材質はＡｕとし、散乱体内部の層３の材質はＴｉとした。頂点部１の層の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、散乱体内部の層３の厚さ（ｄ3）は５０ｎｍとした。図６（ｂ）の実施例では、頂点部１の材質を散乱体内部の層３と同じとすることで２層構造とした。頂点部１の層及び散乱体内部の層３の材質はＡｕとし、散乱体表面層２の材質はＴｉとした。頂点部から散乱体内部の層３の上面までの厚さ（ｄ5）は１０ｎｍとし、散乱体表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍとした。図６（ｃ）の実施例では、散乱体内部の層３を２層に分けることで４層構造とした。頂点部１の層の材質はＡｕ、散乱体表面層２の材質をＴｉ、散乱体内部の層３をＰｔ、その下に設けられた別の材質の層３１の材質をＡｌとした。頂点部１の層の厚さ（ｄ1）は３ｎｍ、散乱体表面層２の厚さ（ｄ2）は７ｎｍ、散乱体内部の層３の厚さ（ｄ3）は１０ｎｍ、その下の層３１の厚さ（ｄ6）は２０ｎｍとした。
【００４３】
図１の実施例のように散乱体内部の層３の材質をＡｌとしたとき、ヌクレオチドを含む溶液によりＡｌが腐食する可能性がある。これは、散乱体内部の層３は散乱体表面層２により覆われているが、散乱体表面層２が薄い場合、部分的に存在する隙間をとおして溶液が進入する可能性があるためである。これに対し、図６（ｃ）の実施例のように、Ａｌの層の上にＰｔ層を設けることにより、溶液がＡｌの層へ進入することを防ぐことが出来る。
【００４４】
次に、散乱体周辺に遮光膜が形成された場合について説明する。
図７の実施例では、三角形の散乱体周辺に光を反射又は吸収する遮光用の膜７を形成した。図７（ａ）は上面図、図７（ｂ）は側断面図である。遮光膜７がない場合、散乱体に入射しなかった光は、溶液中に進入し、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を誘発する。その結果、バックグランド光が多く検出されて、信号の信号／ノイズ比が低下する。これに対し、本実施例のように散乱体周辺に遮光膜７を形成すると、散乱体に入射しなかった光が溶液中に進入することを防ぐことが出来、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素からの発光を抑制することが出来る。本実施例では、遮光膜７の材質をＴｉ、遮光膜７の開口部の形状を散乱体３と同じ形状とした。遮光膜７の厚さは３０ｎｍとした。遮光膜７の開口部の幅（Ｌ2）は１１３ｎｍとし、頂点部１と遮光膜のｘ方向の距離（Ｌ3）は３ｎｍ、三角形の底辺部と遮光膜の距離（Ｌ4）は１０ｎｍとした。散乱体の頂点部１と遮光膜のｚ方向の距離（ｄ4）は５ｎｍとした。
【００４５】
図８に、上記のように遮光膜を形成したとき、頂点部１近傍に発生する近接場光の強度分布を示す。この分布は、頂点部１からｚ方向に２ｎｍ離れた面内における強度分布を示す。この図に示すように、頂点部１近傍に発生する近接場光強度は、入射光強度の約４００倍となり、遮光膜を配置することにより、頂点部１に発生する近接場光強度は強くなる。遮光膜が導電性を有する材質で出来ている場合、遮光膜の端には、金属プレート頂点に集まる電荷と逆の極性を持つ電荷が集まる。遮光膜が金属プレート頂点に近づくと、金属プレート頂点の電荷と、遮光膜の端の電荷はお互いに引き合うように相互作用する結果、遮光膜と金属プレート頂点の間に強い近接場光が発生すると考えられる。
【００４６】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、頂点部１と遮光膜７の間の距離Ｄ（＝｛（ｄ4）2＋（Ｌ3）2｝1/2）は短い方が、頂点部１に集中した電荷と遮光膜７の端に集中した電荷が、より強く相互作用するため、強い近接場光を発生させることが出来る。図９は、頂点部１と遮光膜７の間の距離Ｄと近接場光強度の関係を示す。この図に示すように、距離Ｄが４０ｎｍ以下になると、遮光膜の存在による近接場光強度の増大が起こる。したがって、距離Ｄは４０ｎｍ以下にするのが好ましい。なお、遮光膜を単にバックグランド光の除去を目的に設置する場合は、距離Ｄは４０ｎｍ以下でなくても良い。
【００４７】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、遮光膜の端にも電荷が集まるため、遮光膜の端にも強い近接場光が発生する。塩基伸長酵素５の近傍もしくは頂点部１に固定する核酸の近傍において強い近接場光を発生させるためには、遮光膜７の端（基板側の角）の近傍に塩基伸長酵素もしくは頂点部１に固定する核酸が存在するようにすると良い。そのためには、遮光膜７と頂点部１のｚ方向の距離ｄ4が、塩基伸長酵素５の寸法もしくは頂点部１に固定する核酸の寸法以下になるようにするのが好ましい。本実施例では、塩基伸長酵素５として、寸法がおよそ１０ｎｍのデオキシリボ核酸ポリメラーゼを用いた。したがって、この場合は、距離ｄ4は１０ｎｍ以下にすることが好ましく、本実施例では、ｄ4＝５ｎｍとした。頂点部１と遮光膜７の間の水平方向の距離Ｌ3は５ｎｍとした。
【００４８】
上記導電性を有する遮光膜が形成された構造において、散乱体の頂点部と反対側のエッジ（三角形の底辺部）３３における散乱体と遮光膜の距離（Ｌ4）が小さすぎると、散乱体の頂点部と反対側のエッジ３３に集中した電荷と遮光膜のエッジに集中した電荷が相互作用する結果、散乱体の頂点部の反対側のエッジ３３と遮光膜のエッジの間に、局在した電磁場が発生してしまう。強度は、頂点部に発生する近接場光ほど強くはないが、溶液中に浮遊するヌクレオチド９に固定された色素がこの光により励起され、バックグランド光が発生してしまう可能性がある。この影響を小さくするためには、散乱体の頂点部と反対側（三角形の底辺部）における遮光膜との距離（Ｌ4）は、頂点部１と遮光膜７の間のｘ方向の距離（Ｌ3）よりも大きくするのが好ましい。
【００４９】
上記遮光膜の材質は、遮光性を有するものであれば任意であり、Ｃｒ，Ａｕ，Ｐｔなどの金属にしても良い。また、遮光膜７を金属の膜にすることに換えて、反射率が透過率よりも大きくなるように設計された誘電体多層膜（例えば、Ａｌ2Ｏ3とＳｉＯ2の多層膜）にしても良い。ただし、散乱体頂点部に発生する近接場光を増強するためには、散乱体の材質は、金属などの導電性を有する材料にするのが好ましい。また、遮光膜７の材質が、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合可能な材質である場合、散乱体周辺の開口部において、遮光膜７の側面（開口部の側面）に塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が複数固定される可能性がある。これを防ぐためには、遮光膜７の材質を、散乱体表面層２と同様に、塩基伸長酵素（もしくは頂点部に固定する核酸）が結合しにくい材質にするのが好ましい。
【００５０】
上記実施例では、散乱体の周辺に、遮光を目的に、膜を全面に形成したが、頂点部１に発生する近接場光の強度を強くすることを目的に、頂点部１近傍にのみ導電性を有する膜を形成しても良い。図１０は、頂点部１近傍に、長方形の膜８を形成した実施例を示す。図１０（ａ）は上面図、図１０（ｂ）は側断面図である。頂点近傍に形成された膜８の材質はＴｉとし、ｘ方向の幅（Ｌ20）を３００ｎｍ、ｙ方向の幅（Ｌ21）を５００ｎｍ、厚さを３０ｎｍとした。散乱体の頂点部１と遮光膜のｚ方向の距離（ｄ4）は５ｎｍとした。散乱体の形状、材質、寸法は、図１の実施例と同じとした。頂点近傍に形成された膜８のｘ方向及びｙ方向の幅は他の値にしても良く、例えば、ｘ方向の幅（Ｌ20）を１００ｎｍ、ｙ方向の幅（Ｌ21）を３００ｎｍ、としても良い。また、実際には、上記散乱体はマトリックス状に配置するため、頂点近傍に形成された膜８もマトリックス状に配置することになるが、ｙ方向の幅（Ｌ21）を長くすることにより、頂点近傍に形成された膜８が互いに接合するようにしても良い（例えば、散乱体を１μｍ間隔で基板上に並べるとき、ｙ方向の幅（Ｌ21）を１μｍ以上とする）。
【００５１】
上記実施例では、散乱体頂点近傍に形成する膜８の形状は長方形としたが、他の形状にしても良い。例えば、図１１に示すように、膜８の形状を三角形にしても良い。この場合、膜８のｘ方向の長さ（Ｌ7）を適当な値にすると、膜８中にもプラズモンが励起され、その頂点部２１に強い電荷の集中が起こる。そして、頂点部２１に集中した電荷と、散乱体の頂点部１に集中した電荷の相互作用により、２つの頂点の間により強い近接場光を発生させることが出来る。本実施例では、膜８の材質はＴｉ、ｘ方向の長さ（Ｌ7）は９０ｎｍ、厚さは３０ｎｍとした。散乱体の形状、材質、寸法は、図１の実施例と同じとした。
【００５２】
以下、核酸分析装置の実施例について記載する。
図１２は、核酸分析装置の構成図を示す。本実施例では、基板４上に図１に示されるような三角形の形状をした散乱体を、図１２（ｂ）に示すように、マトリックス状に配置した。散乱体は、ｘ方向に４０００個、ｙ方向に３０００個並べた。ｘ方向のピッチ（ｐx）は１μｍ、ｙ方向のピッチ（ｐy）も１μｍとした。散乱体の総数は１２００万個で、散乱体が存在する領域のｘ方向の幅Ｗ10＝４ｍｍ、ｙ方向の幅Ｗ11＝３ｍｍである。散乱体が形成された基板４の上には、薬液を供給するための反応チャンバ１１をかぶせた。図１３に示すように、反応チャンバ１１には、薬液を流すための溝２７及び検出窓１２を形成した。反応チャンバ１１と基板４の間から薬液が漏れないように、溝２７の周辺にはＯリング３６を配置した。核酸、反応酵素、バッファー、ヌクレオチド等の溶液は薬液タンク２５内に保存し、そこから薬液供給用配管１３を通して、反応チャンバ１１内に形成された溝２７に注入した。薬液タンク２５の温度は、温度制御器により制御した。薬液供給用配管１３内を流れる液体の流量は、バルブ２４により制御した。廃液は、薬液排出用配管２３を通して、廃液タンク２６内に回収した。薬液を流すための溝２７のｘ，ｙ方向の幅は８ｍｍ×８ｍｍとし、散乱体すべての表面が薬液に浸されるようにした。反応チャンバの材質は、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂とした。検出窓１２の材質はガラスとし、厚さは０．１７ｍｍとした。
【００５３】
図１３に示すように、色素を励起するための光は、基板４の裏側から垂直に入射させた。光源１４としては、ＹＡＧレーザ（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）を用い、その光のスポット径をレンズ１５により調整し、レーザ光が散乱体全面に照射されるようにした。ヌクレオチドが核酸に取り込まれた際発生する蛍光は、検出窓１２を通して検出した。蛍光は、対物レンズ１６により平行光にした後、結像レンズ１８により集光し、ＣＣＤカメラ１９等の撮像装置により検出した。対物レンズ１６と結像レンズ１８の間には、発生する蛍光波長のみ透過するフィルタ１７を配置することで、励起光がＣＣＤカメラ１９に入射することを防いだ。各散乱体から発生する蛍光は、ＣＣＤカメラ１９によりリアルタイムに検出した。蛍光色素の種類は、ＣＣＤに映された蛍光色の違いにより識別した。
【００５４】
上記実施例では、入射光は基板４に対し垂直に入射させたが、斜めに入射させても良い。図１４は、プリズムを利用して入射光を斜めに入射させた場合の実施例を示す。この実施例では、光源１４としては、ＹＡＧレーザ（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）を用い、レーザ１４からの出射光をレンズ１５により平行光にし、プリズム２９に入射させた。プリズム２９の上には、核酸検出素子が形成された基板１０を配置し、基板１０の表面で入射光が全反射するようにした。蛍光の検出は、図１３の実施例と同様に、基板１０の反対側に設置された対物レンズ１６及びＣＣＤカメラ１９を用いて行った。図１３のように、基板に垂直に光を入射させる場合、近接場光に変換されなかった光は、溶液中に進み、溶液中の色素からの蛍光（バックグランド光）を発生させてしまう。これに対し、プリズム２９を用いる場合、入射光はプリズム表面で全反射するため、溶液中に進入する入射光の量は小さくなる。その結果、バックグランド光の検出を抑えることが出来る。
【符号の説明】
【００５５】
１ 頂点部
２ 散乱体表面層
３ 散乱体内部
４ 基板
５ 塩基伸長酵素
６ 入射光
７ 遮光膜
８ 頂点近傍に形成された金属膜
９ 色素が結合したヌクレオチド
１０ 核酸検出素子が形成された基板
１１ 反応チャンバ
１２ 検出窓
１３ 薬液供給用配管
１４ レーザ
１５ レンズ
１６ 対物レンズ
１７ フィルタ
１８ 結像レンズ
１９ ＣＣＤカメラ
２０ 核酸
２１ 頂点部
２２ マトリックス状に並べられた核酸検出素子
２３ 薬液排出用配管
２４ バルブ
２５ 薬液タンク
２６ 廃液タンク
２７ 薬液を流すための溝
２９ プリズム
３１ 散乱体内部に設けられた別の材質の層
３２ 導電性を有する散乱体
３３ 頂点と反対側のエッジ
３４ 頂点部と同じ材質の層
３５ イオンビーム
３６ Ｏリング
３７ レジスト
３８ 溝
３９ 半導体微粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近接場光を発生する頂点部を有する導電性散乱体と、
前記頂点部に固定された塩基伸長反応を促進するための酵素もしくは核酸と、
を備えることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部は前記酵素もしくは前記核酸を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材料からなり、前記導電性散乱体の前記頂点部以外は前記官能基を形成出来ない材料からなることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部の幅は、前記酵素もしくは前記核酸の寸法の２倍よりも小さいことを特徴とする核酸分析素子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体は三角形、頂点が棒状になった三角形、楕円、もしくは長方形の形状を有することを特徴とする核酸分析素子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体は透明基板の表面に形成された凹部の中に配置されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部は前記導電性散乱体の表面から突出していることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記酵素もしくは核酸が、半導体微粒子を介して前記頂点部に固定されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体の周辺に遮光性を有する膜が形成されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜は、前記酵素もしくは核酸を固定させるのに必要な官能基を形成出来ない材料からなることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜は導電性を有し、前記頂点部と前記遮光性を有する膜との間の距離が４０ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１１】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜が導電性を有し、前記頂点部と前記遮光性を有する膜の間の、前記導電性散乱体の表面に対して垂直な方向の距離が、前記頂点部に固定された前記酵素もしくは核酸の寸法以下であることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体が複数個、２次元的に整列して配置されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１３】
核酸分析素子と、
前記核酸分析素子を光照射する光源と、
前記核酸分析素子から発生された蛍光を撮像する撮像装置と、
蛍光色素が結合したヌクレオチドを含む溶液を前記核酸分析素子の表面に供給する手段と、を備え
前記核酸分析素子は、表面に凹部が形成された透明基板と、前記凹部の中に配置された近接場光を発生する頂点部を有する導電性散乱体と、前記頂点部に固定された塩基伸長反応を促進するための酵素もしくは核酸とを有することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１】
近接場光を発生する頂点部を有する導電性散乱体と、
前記頂点部に固定された塩基伸長反応を促進するための酵素もしくは核酸と、
を備えることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部は前記酵素もしくは前記核酸を固定させるのに必要な官能基が形成可能な材料からなり、前記導電性散乱体の前記頂点部以外は前記官能基を形成出来ない材料からなることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部の幅は、前記酵素もしくは前記核酸の寸法の２倍よりも小さいことを特徴とする核酸分析素子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体は三角形、頂点が棒状になった三角形、楕円、もしくは長方形の形状を有することを特徴とする核酸分析素子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体は透明基板の表面に形成された凹部の中に配置されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記頂点部は前記導電性散乱体の表面から突出していることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記酵素もしくは核酸が、半導体微粒子を介して前記頂点部に固定されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体の周辺に遮光性を有する膜が形成されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜は、前記酵素もしくは核酸を固定させるのに必要な官能基を形成出来ない材料からなることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜は導電性を有し、前記頂点部と前記遮光性を有する膜との間の距離が４０ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１１】
請求項８に記載の核酸分析素子において、前記遮光性を有する膜が導電性を有し、前記頂点部と前記遮光性を有する膜の間の、前記導電性散乱体の表面に対して垂直な方向の距離が、前記頂点部に固定された前記酵素もしくは核酸の寸法以下であることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の核酸分析素子において、前記導電性散乱体が複数個、２次元的に整列して配置されていることを特徴とする核酸分析素子。
【請求項１３】
核酸分析素子と、
前記核酸分析素子を光照射する光源と、
前記核酸分析素子から発生された蛍光を撮像する撮像装置と、
蛍光色素が結合したヌクレオチドを含む溶液を前記核酸分析素子の表面に供給する手段と、を備え
前記核酸分析素子は、表面に凹部が形成された透明基板と、前記凹部の中に配置された近接場光を発生する頂点部を有する導電性散乱体と、前記頂点部に固定された塩基伸長反応を促進するための酵素もしくは核酸とを有することを特徴とする核酸分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−３８９３２（Ｐ２０１１−３８９３２Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８７４３５（Ｐ２００９−１８７４３５）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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