核酸分析装置及び核酸分析方法
【課題】 核酸試料の保持部材を強固な構成とする。また、試料保持部や保持部材の取り付け操作を容易にする。
【解決手段】 核酸伸張を光検出して核酸分析する装置であって、核酸試料に対して相補鎖合成基質を供給する分注器と、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部との間に、試料保持部の分注器と対面する面が反応部と対面するように試料保持部材を回転させる回転機構を備える。
【解決手段】 核酸伸張を光検出して核酸分析する装置であって、核酸試料に対して相補鎖合成基質を供給する分注器と、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部との間に、試料保持部の分注器と対面する面が反応部と対面するように試料保持部材を回転させる回転機構を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光を利用した核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を分析する装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列決定には、サンガー法を用いたキャピラリＤＮＡシーケンサが最も広く普及している。この装置は３０億塩基対からなるヒトゲノムＤＮＡの全配列を解読するヒトゲノム計画に大きく貢献した。２００３年にヒトゲノム配列解析は終了したが、微生物、植物などの研究対象の広がりや遺伝子機能解析を目指した比較ゲノム解析などが残されており、大規模ゲノム解析センタ向けに高速・高スループットな大規模ＤＮＡシーケンシングの需要はいまだ伸びている。一方で、遺伝子診断向け、一般研究室向けなどへのＤＮＡシーケンサの普及のためには、低コスト化、そして容易な操作性といった性能をもたせる必要があると考えられる。
【０００３】
上記要望を満たすために、サンガー法と異なる方法を用いたＤＮＡの塩基配列決定法がいくつか提案されている。その中の一つに、ＤＮＡの伸長時に生成されるピロリン酸（ＰＰｉ）を、化学発光を用いて検出することにより、塩基配列を決定する方法（パイロシーケンス法）がある（特許文献１）。この方法では、まず、ターゲットとなるＤＮＡ鎖にプライマをハイブリダイズさせ、相補鎖合成酵素（ポリメラーゼなど）が入った反応液に導入し、相補鎖合成核酸基質であるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に前記反応液に加えて相補鎖合成を行う。前記反応液には、ポリメラーゼの他に、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ｄＮＴＰ分解酵素（アピラーゼ）が存在する。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてＰＰｉが生成される。このＰＰｉがＡＴＰスルフリラーゼの働きによってＡＰＳに付加されてＡＴＰが生じる。前記ＡＴＰとルシフェリンからルシフェラーゼの働きよって発光を生じる。この光を検出することで、加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたかを判断できる。相補鎖合成が行われなかったｄＮＴＰは、反応液中に含まれるアピラーゼによって分解される。上記工程を４種のｄＮＴＰで順次行われることで、相補鎖の塩基配列を決定していくことが可能となる。ｄＮＴＰの一つであるｄＡＴＰは、ルシフェリンとルシフェラーゼによって発光を生じさせるため背景光が上昇し、計測・解析精度の劣化につながる。Ｎｙｒｅｎらは、ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰのアナログであるｄＡＴＰαＳを用いることで前記問題を解決している（特許文献２）。また、ＡＰＳもルシフェリンとルシフェラーゼによって光を生じさせるため、背景光の原因となる。神原らは、ＡＰＳとＡＴＰスルフリラーゼに変わり、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）とホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸リン酸ジキナーゼＰＰＤＫを用いることで上記問題を解決している（特許文献３）。
【０００４】
上述のようにパイロシーケンス法は、レーザのような光源を使わずに塩基配列決定が可能となるため、サンガー法を用いたＤＮＡシーケンサに比べて、装置構成が簡易になり、安価かつ小型化が容易となる。実際に、神原らはこのパイロシーケンス法を用いた小型のＤＮＡシーケンサを開発している（非特許文献１）。
【０００５】
一方、パイロシーケンス法では、相補鎖合成反応とｄＮＴＰの分解反応が共存することに由来する問題がある。ｄＮＴＰ分解酵素が多いと、相補鎖合成前にｄＮＴＰがすべて分解され、いくつかの未反応のＤＮＡ鎖が反応液中に存在することになる。また、ｄＮＴＰ分解酵素が少ないと、ｄＮＴＰの分解が遅くなるため、次のｄＮＴＰが反応液に導入する際に未分解のｄＮＴＰが残存し、一度に相補鎖合成が進行するいくつかのＤＮＡ鎖が反応液中に存在することになる。いずれの場合でもＤＮＡ鎖間で伸長度合いのばらつきが生じ、ＤＮＡ鎖の配列解析精度の低下につながる。神原らは、これらの問題を解決するために、相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応を含めた発光反応を空間的に分離する方法を提案している（分離反応方式）（特許文献４）。
【０００６】
図１に、特許文献４に記載の相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応を含めた発光反応を空間的に分離する構成を示す。試薬（例えばｄＮＴＰ）を分注する分注器３０３と反応液が入った反応容器１０１が上下に配置され（分注器３０３が反応容器１０１の上に位置する）、ＤＮＡ鎖を保持する保持部材４０１が分注器３０３と反応容器１０１の間に配置され、保持部材４０１の上下移動により、保持部材４０１の反応液１０２からの出し入れを繰り返して測定を行う構成である。保持部材４０１にはプライマとハイブリしたＤＮＡ鎖とポリメラーゼが、反応液１０２中にはｄＮＴＰ分解酵素と発光反応に関わる試薬が含まれており、保持部材４０１が反応液１０２外部にある時にｄＮＴＰを保持部材４０１に導入して相補鎖合成反応を行い、保持部材４０１が反応液１０２内部にある時に発光液反応とｄＮＴＰ分解反応を行う。上記方法により相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応・発光反応を空間的に分離する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第3533223号
【特許文献２】特許第3510272号
【特許文献３】特開2007-97471号公報
【特許文献４】特開2009-247297号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Electrophoresis、 22、 3497-3504、2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献４の構成において、保持部材４０１の例として、直径３ｍｍのメンブレンを挙げている。そして、保持部材４０１は、固定・上下移動させる手段である移動台（ここでは固定ピン４０３とする）に固定されている。固定ピン４０３の保持部材４０１への固定位置は、保持部材４０１のｄＮＴＰが分注される分注面４０２側（上方側）となっている。保持部材４０１は、ｄＮＴＰを精度良く分注するために、分注器３０３のｄＮＴＰ分注位置から０．５ｍｍ程度の距離のところまで近づくことになる。そのため、固定ピン４０３と分注器３０３は干渉することとなる。分注器３０３は、４種のｄＮＴＰに対応した２００μＬの容量のリザーバ３０１を持ち、それぞれのリザーバ３０１の下部にキャピラリ３０２が備えられている。前記４つのリザーバ３０１の中央に１ｍｍの貫通穴３０４があり、固定ピン４０３は貫通穴３０４に通されている。そのため、固定ピン４０３の直径は１ｍｍ以下となる。一方、ある程度量（数十μＬ以上）のｄＮＴＰを保持するために必要なリザーバ３０１の高さ、リザーバ３０１へ圧力を供給するための配管部等を考慮すると、固定ピン４０３の長さは２０ｍｍ以上必要となる。
【００１０】
以上より、分注器３０３と固定ピン４０３の干渉を防ぐため、保持部材４０１の固定・移動手段である固定ピン４０３は直径１ｍｍ以下長さ２０ｍｍ以上の棒材となり、非常に脆弱となり（折れやすい）、取り扱いが困難な形状となる。
【００１１】
また、保持部材４０１と固定ピン４０３を装置に取り付ける際には、固定ピン４０３を分注器３０３の貫通穴３０４に通す作業が必要となってしまう。
【００１２】
固定ピン４０３の強度向上のために、直径を太くすることが考えられる。例えば、直径４ｍｍのメンブレン（保持部材４０１）に直径３ｍｍの固定ピン４０３を取付けることも可能だが、ｄＮＴＰを分注する領域が小さくなるため、分注精度が低下する。メンブレン（保持部材４０１）の面積を拡大することで上記問題を解決できるが、大きなメンブレン（保持部材４０１）を入れるために反応容器１０１を大きくする必要があり、その分、反応試薬の量が増大するため試薬コストが上昇してしまう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、核酸分析装置として、核酸試料の試料保持部を備える試料保持部材と、試料保持部に対し核酸試料と相補鎖合成反応をする相補鎖合成基質を供給する分注器と、試料保持部が浸漬され相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と、発光酵素による発光を検出する光検出器と、試料保持部材を支持し分注器と反応部との間に設けられ、試料保持部の分注器と対面する面が反応部と対面するように回転する回転機構と、分注器による分注及び回転機構による回転を制御する制御部を備える。
【００１４】
また、核酸試料が試料保持部に固定された試料保持部材を用いた分析方法として、当該試料保持部を前記核酸試料と相補鎖合成反応する相補鎖合成基質を供給する分注器に対面させる工程と、分注器から相補鎖合成基質を試料保持部に対して供給する工程と、試料保持部の分注器と対面する面が、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と対面するように試料保持部材を回転させる工程と、試料保持部を反応溶液に浸漬する工程と、発光酵素による発光を検出する工程とを有する。
【発明の効果】
【００１５】
上記構成により、試料保持部を保持する保持部材が分注器と干渉しない構成となり、試料保持部材を強固な構成とすることができる。また、試料保持部や保持部材の取り付け操作も容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】課題を説明するための分離反応方式の例。
【図２】本発明による分離反応方式の一例。
【図３】パイロシーケンス反応様式概略図。
【図４】本発明による分析装置の概略図の一例。
【図５】回転機構部周辺拡大図。
【図６】回転機構駆動プロセスの一例。
【図７】メンブレン方式の一例。
【図８】シーケンス操作フローチャート。
【図９】磁気ビーズを用いた例でのスティックとスティックホルダの断面図。
【図１０】磁気ビーズのスティック分注面での固定概念図。
【図１１】磁気回路を用いたスティックとスティックホルダの断面図。
【図１２】磁石回転型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１３】磁石移動型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１４】電磁石型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１５】セファロースビーズを用いた実施例でのスティックとスティックホルダの断面図。
【図１６】反応プレート型分析装置の概略図の一例。
【図１７】実施例４における回転機構駆動プロセス。
【図１８】磁気回路構造の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図２に、固定ピン４０４の固定部が保持部材４０１の分注面４０２と異なる面にあり、試薬分注後に分注面４０２が反応液１０２に浸漬可能な構造を示す。これを実現するために、固定ピン４０４を回転運動可能な構成とする。具体的には、保持部材４０１の分注面４０２の裏面に固定ピン４０４を固定する。分注面４０２に試薬が分注された後に、固定ピン４０４は回転して分注面４０２が反応容器１０１側（下側）に向く。その後、固定ピン４０４を下降させ、反応容器１０１内の反応液１０２に保持部材４０１を浸漬させる。固定ピン４０４と保持部材４０１は同一でも良く、例えば棒状固定ピンの片端面に核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）が固定され、かつ前記面が分注面という構成でも良い。固定ピン４０４の回転運動と上下運動を同時に行っても良い。さらに、図１６に示すように、反応溶液１０２が反応プレートに載っているような場合、固定ピン４０４は上下運動を行わずに回転運動のみでも良い。
【００１８】
このような構成を用いた分離反応方式においては、保持部材を固定する固定ピンを分注器と干渉しない構成となるため、固定ピンの太さは保持部材と同等以上の太さにでき、非常に強固なもとなり、また、保持部材・固定ピンの取り付け操作も容易となる。
【００１９】
以下、実施例にしたがって、具体的な構成を説明する。
【実施例１】
【００２０】
本実施例では、パイロシーケンシング法を用いて、測定対象の塩基配列を決定する。パイロシーケンスに関しては、特許文献２に記載の反応と配列決定の原理を採用した。図３にその反応様式の概略図を示す。パイロシーケンス反応では、配列を決定したいターゲットＤＮＡを一本鎖（ｓｓＤＮＡ）にした後に、プライマをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを加え、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を順次反応液中に加えて相補鎖合成反応を行い、相補鎖合成の際に副産物して生成されるＰＰｉをＡＭＰとＰＥＰとＰＰＤＫによりＡＴＰに変換し、ＡＴＰとルシフェリンをルシフェラーゼ存在下で反応させて発光させる。余剰のｄＮＴＰはアピラーゼによって分解される。本実施例では、ＰＰｉをＡＴＰに変換させるために、ＡＭＰ、ＰＥＰ、ＰＰＤＫを用いたが、ＡＴＰスルフリラーゼとＡＰＳを用いた系でも良い。
【００２１】
図４に本発明の分析装置の概観を示す。本装置は、反応収容部、光検出部、試薬分注部、回転機構部から構成される。これらの構成部は遮光されるように筺体に覆われている。
【００２２】
反応収容部１０６は直径５ｍｍ深さ１０ｍｍの４つの反応容器１０１が９ｍｍピッチで１列に配置されている。反応容器１０１の直径、深さ、数およびピッチは任意であり、限定されるものではない。さらに、反応容器１０１は複数列で配置しても良い。また、反応収容部１０６は、市販の反応容器（例えばＮｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏTMＭｏｄｕｌｅｓ；ＣＡＴ Ｎｏ．４７３５３９）とそれを固定するホルダを組み合わせた形状でも良い。パイロシーケンス反応では室温よりも高い温度で実施される場合がある（２８℃〜３５℃）。そこで、反応液を効率よく温調するために、反応収容部１０６には温度制御手段１０５が接続されている。本実施例では温度制御手段１０５としてペルチェ素子を使用したが、ヒータなどでも良い。また、反応液を攪拌するために、反応収容部１０６には攪拌手段１０４が接続されている。本実施例では、攪拌手段１０４として、回転軸に偏心カムが付いているモータを用い、前記偏心カムを反応収容部１０６に掘られた溝にあてがい、モータが回転することで、反応収容部１０６が振動する構成とした。温度制御手段１０５と攪拌手段１０４は、Ｈ８マイコン５０１（ＨＤ６４Ｆ３０５２ＢＦ２５、ルネサステクノロジ）によって動作が制御される。
【００２３】
光検出部は、全体を導電性材料で作られた導電性筺体２０５で覆われている。導電性筺体２０５内部には４つの光検出器２０１が収納されており、各光検出器２０１は各反応容器１０１の下方に１：１の関係で配置されている。光検出器２０１としてフォトダイオード（ＳｉフォトダイオードＳ１１３３−０１、浜松ホトニクス）を使用したが、ラインセンサやＣＣＤを用いて４つの反応容器１０１からの発光を１つの光検出器で検出しても良い。光検出器２０１と反応収容部１０６底部の間には、裏面に透明電極層（ここではＩＴＯを用いた）を有したガラス基板２０２が配置されており、前記透明電極層は導電性筺体２０５に電気的に接続され、装置の設置電位に接続されている。光検出器２０１からの信号は、導電性筺体２０５内に内蔵されたアンプ２０３（ｏｐＡ１２９ＵＢ、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により増幅され、導電性筺体２０５外部に配置されたマルチプレクサ２０４（ＭＡＸ４０５１ＡＣＳＥ、 Ｍａｘｉｍ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により４つの光検出器２０１からの信号を時分割してＡ／Ｄ変換され、Ｈ８マイコン５０１で信号処理され、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）に出力される。
【００２４】
試薬分注部は、分注器３０３、分注器ホルダ３０５、圧力配管ブロック３０６で構成される。分注器３０３は、試薬（ここではｄＮＴＰ４種）が５０μＬ収容できる４つのリザーバ３０１が一体となっており、各リザーバ３０１の底部にはキャピラリ３０２（外径３７０μｍ、内径５０μｍ）が具備されている。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰは、リザーバ３０１上面より加圧され、キャピラリ３０２端面から分注される。各分注器３０３は各反応容器１０１と対向する配置となるよう分注器ホルダ３０５によって保持される。ｄＮＴＰを加圧分注するために、分注器３０３上面には圧力配管ブロック３０６が接続されている。圧力配管ブロック３０６では、４種のｄＮＴＰが収容されるリザーバ３０１それぞれに、かつ、４つの分注器３０３において同じｄＮＴＰが収容されたリザーバ３０１には同時に圧力を印加できるような流路３０７が形成されている。最終的には、圧力配管ブロック３０６の背面で４本の流路に集約される。圧力配管ブロック３０６背部にて、前記４本の流路に４本の配管チューブ３０８がそれぞれ接続されており、すべての配管チューブ３０８が１つの圧力供給源５０２に接続されている。ここでは、圧力供給源５０２としてＣＯ２高圧ガスタンクを使用したが、それ以外の手段を用いても良い。各配管チューブ３０８と圧力供給源５０２の間には電磁弁３０９が設けてある。電磁弁３０９はＨ８マイコン５０１に接続されており、電磁弁３０９の開閉のタイミングを制御し、各ｄＮＴＰの分注タイミングと量を制御する。
【００２５】
回転機構部は、スティック４０５、スティックホルダ４０６、回転駆動部４０７で構成され、試薬分注部と反応収容部の間に配置される。本実施例では、ＤＮＡ鎖を固定する保持部材と保持部材を固定する固定ピンは一体となった棒状構造（スティック）を使用した。回転機構部周辺の拡大図を図５に示す。スティック４０５は、直径は３ｍｍ、長さは１５ｍｍであり、材質をポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）とした。直径と長さは、反応容器１０１内に導入できるサイズであれば、特に限定されるものではない。また、材質はＰＥＥＫに限定されるものではない。スティック４０５の分注面４０２には、ＤＮＡ鎖を固定できるよう表面処理がされている。具体的には分注面４０２にアビジンをコートした。４本のスティック４０５は、各分注器３０３と各反応容器１０１に対して１：１になるようにスティックホルダ４０６に固定される。スティック４０５はスティックホルダ４０６から着脱可能な構成とした。着脱可能な構成として、スティックホルダ４０６内部に内蔵されたボールプランジャとスティック側面に設けられたスティック溝４０８を利用した。
【００２６】
回転駆動部４０７は、ホルダ固定プレート４０９、アーム４１０、リニアガイド４１６、上下モータ４１９で構成される。スティックホルダ４０６はホルダ固定プレート４０９を介して回転駆動部４０７に固定される。スティックホルダ４０６をホルダ固定プレート４０９に固定する際は、磁石４１２を用いて容易に着脱可能な構成とした。また、取り付け位置はガイドピン４１１を用いて取付再現性を確保した。ホルダ固定プレート４０９はアーム４１０に対して回転軸４１５を中心に回転できるように接続されており、回転軸４１５の片端には偏心カム４１３が、もう一方の端にはピニオン４１７が固定されている。アーム４１０はリニアガイド４１６に固定されており、上下モータ４１９によって上下に駆動する。上下モータ４１９はＨ８マイコン５０１に接続されており、上下モータ４１９を介して回転駆動部４０７の上下動を制御する。
【００２７】
図６に回転機構部４０７の駆動プロセスを示す。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰをスティック４０５の分注面４０２に分注し、伸長反応のために数秒静置する（図６（ａ））。上下モータ４１９によってアーム４１０を下降させる。その際に、ピニオン４１７の歯が装置筺体に取付けられたラック４１８の歯とかみ合いながらアーム４１０が下降するため、回転軸４１５を中心にスティックホルダ４０６が回転する（図６（ｂ））。アーム４１０が所定の距離下降すると、ラック４８の歯からピニオン４１７の歯が外れるため、スティックホルダ４０６とスティック４０５の回転運動は停止する。偏心カム４１３とストッパ４１４を用いて、スティックホルダ４０６とスティック４０５の回転を完全に止める。この動作により、スティック４０５の分注面４０２はｄＮＴＰが分注された時から１８０度回転したことになる。また、この時スティック４０５の分注面４０２は反応容器１０１にはまだ入っていない（図６（ｃ））。アーム４１０はさらに下降し、反応容器１０１内底面から１ｍｍの位置で下方移動を停止し、分注面４０２が反応容器１０１内の反応液に浸漬される（図６（ｄ））。アーム４１０が上昇する際は、前記工程と逆の動作となる。
【００２８】
スティックホルダ４０６は、ピニオン４１７の歯がラック４１８の歯に当たるまでは回転運動を行わずに上昇し、ピニオン４１７とラック４１８の歯が当たると回転運動を行いながら上昇し、アーム４１０が最上面まで上昇すると分注面４０２が上方を向く状態で回転運動を停止し、ｄＮＴＰが分注される状態となる。この時、分注面４０２と分注器３０３のキャピラリ３０２ｄＮＴＰ吐出端との距離は１ｍｍになるようにした。以上のプロセスを繰り返すことでパイロシーケンス反応を行う。本実施例では、ピニオン４１７とラック４１８を用いて分注面４０２の回転運動を行ったが、回転軸４１５に小型モータを接続し、小型モータをＨ８マイコン５０１に接続して、小型モータをコントロールすることで、分注面４０２の回転運動を行っても良い。
【００２９】
また、ここでは上下モータ４１９によってアーム４１０を上下に動かしている例を示したが、スティック４０５と反応容器１０１との相対位置を制御できればよいので、例えば、反応容器１０１が上下に動くような機構を設けるようにしてもよい。
【００３０】
本実施例では、ＤＮＡ鎖を固定する保持部材と保持部材を固定する固定ピンは一体となったスティックを使用したが、保持部材と固定ピンを分割して取り外せるようになっていても良い。保持部材としてメンブレンを用いた例を示す（図７）。ここでは、メンブレン４２０として直径３ｍｍのＳＡＭ２（Ｒ） Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｖ７８６１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。このメンブレン４２０には共有結合によりストレプトアビジンがコートされている。メンブレン４２０の分注面４０２とは異なる面に直径１ｍｍ、長さ５ｍｍのピン４２１が固定されており、ピン４２１はピンホルダ４２２を介してスティックホルダ４０６に固定される。ピン４２１の直径と長さは、反応容器１０１内に導入できるサイズであれば、特に限定されるものではない。しかし、メンブレン４２０が反応液に浸漬する際に、分注面４０２と反対の面からも効率良く反応液がメンブレンに伝わるようにするため、ピン４２１は、強度を考慮しながら可能な限り細くした方が良い。なお、ピンホルダ４２２とスティックホルダ４０６は着脱可能な構成とした。スティックホルダ４０６は、保持部材と固定ピンが一体となったスティックの場合と同様に回転駆動部４０７に固定する。上記方法により、保持部材と保持部材を固定する固定ピンを分離した場合でも、固定ピンは分注器と干渉しないため、固定ピンの直径が細くても短くできる、つまり強固にすることができる。
【００３１】
以下、図８のフローチャートに沿って測定対象のＤＮＡのパイロシーケンス反応の方法を説明する。まず、５’末端にビオチン標識された配列解析対象の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をプライマとハイブリダイズさせる（６０１）。前記プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を分注面４０２に滴下、５分間静置し、ビオチン−アビジン結合を介してプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を分注面４０２に固定する（６０２）。スティック４０５の分注面４０２を２×Ｃバッファ（組成：１２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＭｇＡｃ２）で洗浄する（６０３）。次いで、分注面４０２にポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）を滴下、５分間静置し、分注面４０２に固定されたプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体と結合させる（６０４）。ポリメラーゼのプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体への固定を，ポリメラーゼを反応液に導入し，下記分注面４０２を反応液に１分間浸漬する工程６０８で行っても良い。前記プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体が固定されたスティック４０５をスティックホルダ４０６に取付け、スティックホルダ４０６を装置に取り付ける（６０５）。前記操作はすべて装置外部で行われる。４種のｄＮＴＰを分注器３０３のそれぞれのリザーバ３０１に導入し、また反応液を反応容器１０１に導入し、分注器３０３と反応容器１０１を装置に取り付ける（６０６）。反応液の組成は、発光のための酵素とｄＮＴＰ分解酵素が満たされているように、例えば、６０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭＭｇＡｃ、１５ｍＵ/μＬ ＰＰＤＫ、６０μＭ ルシフェラーゼ、４００μＭ ルシフェリン、８０μＭ ＰＥＰ・３Ｎａ、４００μＭ ＡＭＰ、１ｎＬ/μＬ ＢＳＡ、２００μＭ ＤＴＴ、１．２ｍＵ/μＬ アピラーゼとした。
【００３２】
上下モータ４１９を駆動して、スティック４０５の回転・下降動作を行い（６０７）、分注面４０２を反応液に１分間浸漬する（６０８）。前記浸漬工程により、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体やポリメラーゼに含まれるＡＴＰやＰＰｉを分解し、背景光の上昇を防ぐことができる。次いで、スティック４０５の回転・上昇動作を行い（６０９）、分注面４０２にｄＮＴＰを０．５μＬ滴下し、相補鎖合成反応のために６秒間静置した（６１０）。０．５μＬ程度の量であれば、スティック４０５の回転速度にもよるが、液体の表面張力により、スティック４０５を回転運動させてもｄＮＴＰ溶液が分注面４０２からこぼれ落ちることはない。分注量は０．５μＬに限る必要はないが、スティック４０５の回転運動時にこぼれない程度の量以下である必要がある。スティックを６秒間静置した後に、スティック４０５の回転・下降動作を行い（６１１）、分注面４０２を反応液に浸漬させる（６１２）。分注面４０２を反応液に浸漬した直後に攪拌手段１０４であるモータを駆動させ、反応液を攪拌するとともに、発光計測を行う（６１３）。この時、ＰＰＤＫ、ルシフェラーゼによる発光反応とアピラーゼによる余剰のｄＮＴＰの分解反応が行われる。前記発光の有無と強度を確認して、分注したｄＮＴＰによって相補鎖合成が行われたか、何塩基分相補鎖合成が行われたかを判断する。攪拌を１１４秒間行った後に、攪拌動作をやめ、スティック４０５の回転・上昇動作を行い（６１４）、分注面４０２を分注器３０３直下に配置し、次のｄＮＴＰを分注する。６１０から６１４の動作を分注面４０２へのｄＮＴＰの分注（６１０）からスティック４０５の回転・上昇動作（６１４）を繰り返して発光計測することにより、測定対象の塩基配列を決定できる。
【００３３】
本実施例では、ビオチン−アビジン結合を用いて保持部材にＤＮＡを固定したが、固定方法はその限りではない。例えば、ポリメラーゼにビオチンを標識し、前記ビオチン標識ポリメラーゼを保持部材に固定して、前記ビオチン標識ポリメラーゼにプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を結合させる方法を用いても良い。
【００３４】
ＤＮＡの相補鎖合成反応では，プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体の自己ハイブリダイゼーションなどの高次構造形成により，相補鎖合成反応の効率が著しく低下する場合がある。前記問題を解決するため，スティック４０５の分注面４０２に温度調節（３０℃〜４０℃）機構を設ける，反応液にＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）や変性剤となるＤＭＳＯなどを加えても良い。
【実施例２】
【００３５】
本実施例では、保持部材として磁気ビーズを用いて、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。スティックとスティックホルダ以外の装置構成、ＤＮＡ鎖の保持部材への固定方法以外の反応プロセスは実施例１と同等である。
【００３６】
図９にＤＮＡ鎖が固定された磁気ビーズを固定する柱状のスティックとスティックホルダの断面図を示す。スティック４０５は直径４ｍｍ、長さ１５ｍｍで片端面が塞がれた筒状の形状である。ここでは、円筒状の構成を示しているがこれに限られない。材質はＰＥＥＫを用いた。スティック４０５の直径、長さ、材質は、この限りではない。但し、材質に関しては、すべて磁性体だとスティック４０５全体に磁気ビーズが固定されてしまうため、非磁性体が良い。円筒を塞ぐ片端面のみ磁性体とし、それ以外は非磁性体であっても良い。
【００３７】
スティック４０５の内側面に磁気シールドシート４２６を覆い、磁気ビーズがスティック４０５側面に固定されないようにした。さらに、分注面４０２の周囲にヘリ４４７を設けて、分注面が攪拌している反応液中に存在する時に、磁気ビーズが反応液の攪拌によりスティック４０５の側面に移動しないような工夫を施した。磁気ビーズのスティック側面への移動防止対策として前記方法以外に，磁気回路を用いた方法（図１８）も考えられる。図９の磁石４２３の代わりに、内底面に磁石４４９が固定された片端面が閉じた筒状構造の磁性体（例えば７８パーマロイ）キャップ４５０を用いることにより，磁場は図１８磁性体キャップ４５０と磁石４４９の上面に形成され，磁性体キャップ４５０の側面には形成されなくなる。そのため，磁気シールドシート４２６，ヘリ４４７が無くても，磁気ビーズはスティック４０５の分注面のみに安定して固定されることになる。
【００３８】
スティック４０５とスティックホルダ４０６は，実施例１と同じように、ボールプランジャ４２５とスティック４０５の側面に設けられたスティック溝４０８を用いて、着脱可能な構成とした。スティックホルダ４０６には、スティック２０５の筒内部に内包されるよう、磁石４２３が先端に固定された磁石固定ピン４２４が具備されている。磁石固定ピン４２４の磁石４２３が固定された面と異なる面をバネ４２７で押すことにより、磁石４２３が常にスティック内底面４３０を押し、スティック外底面（つまり分注面４０２）の磁場強度の着脱再現性が得られる構成とした。また、磁石固定ピン４２４の片端に突起４２８を作り、突起４２８がスティックホルダ４０６内部の受け面４２９と干渉することで、磁石固定ピン４２４がスティックホルダ４０６から外れない構成とした。
【００３９】
磁気ビーズへの測定対象となるＤＮＡ鎖の固定方法および前記ＤＮＡ固定磁気ビーズのスティック４０５への固定方法を説明する。測定対象のＤＮＡを、ＰＣＲを用いて５’末端にビオチン６０２標識させ、ビオチン６０２標識ＤＮＡをアビジン６０４が標識された磁気ビーズ６０５（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｒ） Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定した（図１０（ａ））。磁気ビーズ６０５は、直径２．８μｍ、疎水性のビーズであるが、これ以外のものを使用しても良い。また、ＤＮＡ鎖と磁気ビーズの固定手段として、ビオチン−アビジン結合を利用したが、それ以外の方法で固定しても良い。次いで、ＤＮＡ鎖が固定された磁気ビーズ６０５に０．２Ｎ ＮａＯＨを加え、アルカリ変性する。アルカリ変性した後に、磁石台を用いて磁気ビーズ固定鎖と上清に含まれる遊離鎖に分け、磁気ビーズ６０５に固定されたｓｓＤＮＡ６０１を作製する。磁気ビーズ６０５に固定されたｓｓＤＮＡ６０１（０．５ｐｍｏｌ）に４倍量（２ｐｍｏｌ）のプライマ６０３を加え、ｓｓＤＮＡ６０１へプライマ６０３をハイブリダイズさせ、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を作製する。前記ハイブリダイズ後に、磁気ビーズ６０５が入った溶液にポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）を加えて５分間静置し、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体にポリメラーゼを結合させる。前記磁気ビーズ６０５が入った溶液をスティックホルダ４０６に取り付けられたスティック４０５の分注面４０２に滴下し、磁気ビーズを分注面４０２に固定する（図１０（ｂ））。前記固定作業の後に、余剰の溶液を取り除き、装置に取り付け、実施例１と同等のシーケンスプロセスを行う。
【００４０】
図９に示した磁石１個のみを用いた場合では、分注面４０２の中心に磁気ビーズが固まりを形成する。磁気ビーズの量によっては、磁気ビーズの固定領域の面積に対する高さの割合が大きくなり、前記磁気ビーズ塊の中心へのｄＮＴＰの浸透が遅くなることがある。このような場合、磁気ビーズ塊の中心部のＤＮＡ鎖の相補鎖合成反応の効率が低下し、ＤＮＡ鎖間での相補鎖合成反応の不均一が生じることによるシーケンス解析精度低下につながる。前記問題を防ぐ手段として、図１１に示すように、リング型磁石４３２を用いることが考えられる。これにより、磁気ビーズが分注面４０２の外周に分散固定され、磁気ビーズの固定領域の面積に対する高さの割合が小さくなり、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透をより速く、均等に行うことができ、相補鎖合成の不均一を抑えることができる。リング形状は、スティック２０５の内部側面に沿った形が望ましい。上記方法以外に、分注面で固定した磁気ビーズを攪拌させることで、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透の効率を向上させることも考えられる。
【００４１】
図１２に磁石回転型のスティックとスティックホルダ断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４３６に小型のモータ４３５が内蔵されており、モータ４３５の軸にはシャフト４３４が接続されており、シャフト４３４の先端には小型の磁石４３３が固定されている。小型磁石４３３は、少なくともスティック４０５の内径よりも小さい径を有するような大きさである。そして、固定される部位としては、スティックの中心軸から小型磁石４３３が遠ざかるようにするとよい。スティック４０５をスティックホルダ４３６に取付けると、シャフト４３４と磁石４３３はスティック４０５内に配置される。ｄＮＴＰ分注後にモータ４３５を回転させることで、磁石４３３がスティック４０５内部で回転し、分注面４０２に固定された磁気ビーズも回転する。磁気ビーズの回転動作による攪拌により、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透の効率を向上させることができる。磁場強度を弱めることにより強固に集積した磁気ビーズの集積度合い（固定度合い）を緩め、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくする方法も考えられる。
【００４２】
図１３に磁石移動型のスティックとスティック断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４４０にはシャフト４３９が具備されており、シャフト４３９の先端にはスプリング４３８が接続されており、スプリング４３８の片端には磁石４３７が固定されている。スティック４０５をスティックホルダ４４０に取付けると、シャフト４３９、スプリング４３８、磁石４３７はスティック４０５内部に入る構成となっている。スプリング４３８の伸張方向は、スティック４０５の中心軸方向である。分注面４０２が上方を向いている時は、磁石４３７の重さでスプリング４３８が縮まり、磁石４３７は分注面４０２から離れる。磁石４３７が分注面４０２から離れることにより、磁場強度が弱くなり、磁気ビーズの集積度合いが緩まり、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくなる。分注面４０２が下方に向いている時は、スプリング４３８によって磁石４３７をスティック内底面に押しつけるため、磁気ビーズが分注面４０２に固定され、磁気ビーズが反応容器１０１に落ちることを防ぐ。上記方法以外に、ｄＮＴＰ分注時に磁場強度を弱める方法として電磁石を用いる方法がある。
【００４３】
図１４に電磁石型スティックとスティックホルダの断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４４０には、磁性体シャフト４４１（ここでは鉄性のシャフト）が具備されており、磁性体シャフト４４１には絶縁性被覆の付いた電線（ここではニクロム線４４２）が巻き付けられている。ニクロム線４４２は、ＯＮ／ＯＦＦをＨ８マイコン５０１で制御される電源に接続されている。ｄＮＴＰをスティック４５０の分注面４０２に分注する際には、前記電源をＯＦＦにし、磁性体シャフト４４１から磁場が発生しないようにする。前記操作により、磁場強度が弱くなり、磁気ビーズの集積度合いが緩まり、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくなる。スティック４０５が回転・下降する際には、前記電源をＯＮにし、磁性体シャフト４４１から磁場を発生させ、磁気ビーズを分注面４０２に固定する。前記操作により、分注面４０２が反応液に浸漬した際に、磁気ビーズが反応液に拡散することを防ぐ。また、分注面４０２が反応液に浸漬する際に、あえて前記電源をＯＦＦにすることで、磁気ビーズを反応液に拡散させ、相補鎖合成によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰの反応液の拡散効率を向上させても良い。この場合、分注面４０２を反応液から取出す際に、前記電源をＯＮにして、反応液に分散した磁気ビーズを分注面４０２に再固定する必要がある。
【００４４】
以上のように本発明を用いると、分注面裏面での固定ピン配置により、固定ピンが分注器と干渉することがないため、固定ピンの脆弱性の抑制や取り付け容易性の向上以外に、様々な形状の磁石を使用でき、反応効率の向上などが可能となる。
【実施例３】
【００４５】
本実施例では、保持部材としてセファロースビーズを用いて、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。スティックとスティックホルダ以外の装置構成、ＤＮＡ鎖の保持部材への固定方法以外の反応プロセスは実施例１と同等である。
【００４６】
図１５に保持部材としてセファロースビーズを用いた時に使用するスティックとスティックホルダ断面図を示す。スティック４４３の片端面にセファロースビーズ４４４を導入し、メンブレンフィルタで作られたフィルタキャップ４４５で閉じ込める。図１５のように凹部を有するとセファロースビーズを導入しやすい。セファロースビーズ４４４として、ストレプトアビジンがコートされた平均粒子径３４μｍのビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌａｂ Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｈｉｔｒａｐ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。フィルタキャップ４４５のメンブレンフィルタとして、メッシュサイズ１２μｍ、ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ製（ＩＳＯＰＯＲＥTM ＭＥＭＢＲＡＮＥ ＦＩＬＴＥＲＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用した。セファロースビーズ４４４の大きさよりもメンブレンフィルタのメッシュサイズの方が小さいため、フィルタキャップ４４５内部にｄＮＴＰ溶液は浸透するが、セファロースビーズ４４４はフィルタキャップ４４５外部には移動できない。メンブレンフィルタとして、多数の孔が開いたものを用いてもよく、そのときに孔の大きさについてもビーズの大きさよりも小さくなるようなものを用いる。
【００４７】
セファロースビーズ４４４へのＤＮＡ固定方法を説明する。セファロースビーズ４４４を、カラムを用いてバッファで洗浄し、５’末端ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をセファロースビーズ４４４に添加し、ｄｓＤＮＡをセファロースビーズ４４４に固定する。次いで、カラムを用いてセファロースビーズ４４４をバッファで洗浄し、未結合のｄｓＤＮＡを洗い流す。０．２Ｎ ＮａＯＨを添加して、変性させ、バッファでセファロースビーズ４４４を洗浄してセファロースビーズ４４４に固定されたｓｓＤＮＡを作製する。前記工程で得られたｓｓＤＮＡが固定されたセファロースビーズ４４４をスティック４４３に導入し、フィルタキャップ４４５をスティック４４３先端に取付ける。その後、スティック４４３をスティックホルダ４４６に取付け、スティックホルダ４４６を装置に取り付け、実施例１と同等のシーケンスプロセスを行う。
【実施例４】
【００４８】
本実施例では、回転駆動のみでスティック分注面の位置制御を行い、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。回転機構部、反応収容部以外の装置構成、反応プロセスは実施例１と同等である。
【００４９】
図１６に本実施例で使用する分析装置の概観を示す。本実施例では、反応収容部を構成する反応容器に代わり、反応プレート１０７を使用する。反応プレート１０７の材質として、ステンレスを使用したが、その限りではない。また、反応プレート１０７の表面は疎水処理が施されている。反応プレート１０７には光学的に透明な材質の検出窓１０８が具備されている。検出窓１０８の材質として石英ガラスを使用したが、光学的に透明であれば、その限りではない。検出窓１０８の図１６の上側の端面には親水処理が施されている。そのため、反応プレート１０７に実施例１と同等の反応液を滴下すると、検出窓１０８を中心に反応液滴１０９が形成される。反応プレート１０７を光学的に透明な材質を使用することで、検出窓１０８を使用しなくても良い。この場合、反応液滴１０９が所定の位置に維持されるように、前記所定の位置のみに親水処理を施し、それ以外の表面には疎水処理を施すことが望ましい。尚、親水処理、疎水処理は、親水処理部が疎水処理部よりも相対的に反応溶液に対する親水度が高くなるように処理されればよい。
【００５０】
反応プレート１０７には温度制御手段１０５が接続されており、反応プレートを介して反応液滴の温度調節が可能となっている。温度制御手段１０５としてペルチェを用いたが、その限りではない。反応プレート１０７は、検出窓１０８の直下に検出器２０１が位置するように、ガラス基板２０２の上部に配置した。
【００５１】
回転機構部は、実施例１と同様にスティック４０５、スティックホルダ４０６、回転駆動部４０７で構成され、試薬分注部と反応収容部の間に配置される。スティック４０５とスティックホルダ４０６は実施例１と同等である。また、スティック４０５とスティックホルダ４０６の回転駆動部４０７への取付方法も実施例１と同等である。回転駆動部４０７は、ホルダ固定プレート４０９、アーム４１０、モータ４４８で構成される。ホルダ固定プレート４０９はアーム４１０に対して回転軸４１５を中心に回転できるように接続されており、回転軸４１５の片端にはモータ４４８が接続されている。モータ４４８はＨ８マイコン５０１に接続されており、モータ４４８を介して回転駆動部４０７の回転運動を制御する。
【００５２】
図１７に回転機構部４０７の駆動プロセスを示す。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰをスティック４０５の分注面４０２に分注し、伸長反応のために数秒静置する（図１７（ａ））。次いで、モータ４４８によって、回転軸４１５を中心にホルダ固定プレート４０９を介してスティックホルダ４０６を回転させる。この動作により、スティック４０５の分注面４０２はｄＮＴＰが分注された時から１８０度回転し、分注面４０２が反応プレート１０７上の反応液滴１０９に接触する（図１７（ｂ））。相補鎖合成反応によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰを効率良く反応液滴１０９に拡散させるために、分注面４０２を反応液滴１０９に接触した際に、モータ４４８によってスティック４０５を図１７（ｂ）で左右にわずかに回転動作させた。反応プレート１０７を振動させて、相補鎖合成反応によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰを効率良く反応液滴１０９に拡散させても良い。分注面４０２にｄＮＴＰを分注する時は、前記工程と逆の動作となる。
【００５３】
モータ４４８によって、回転軸４１５を中心にスティックホルダ４０６を１８０度回転させ、ｄＮＴＰが分注される状態にする。この時、分注面４０２と分注器３０３のキャピラリ３０２ｄＮＴＰ吐出端との距離は１ｍｍになるようにした。以上のプロセスを繰り返すことでパイロシーケンス反応を行う。
【符号の説明】
【００５４】
１０１：反応容器、１０２：反応液、１０３：溝、１０４：攪拌手段、１０５：温度制御手段、１０６：反応収容部、１０７：反応プレート、１０８：検出窓、１０９：反応液滴、２０１：光検出器、２０２：ガラス基板、２３０：アンプ、２０４：マルチプレクサ、２０５：導電性筺体、３０１：リザーバ、３０２：キャピラリ、３０３：分注器、３０４：貫通穴、３０５：分注器ホルダ、３０６：圧力配管ブロック、３０７：流路、３０８：配管チューブ、３０９：電磁弁、４０１：保持部材、４０２：分注面、４０３：固定ピン、４０４：固定ピン、４０５：スティック、４０６：スティックホルダ、４０７：回転駆動部、４０８：スティック溝、４０９：ホルダ固定プレート、４１０：アーム、４１１：ガイドピン、４１２：磁石、４１３：偏心カム、４１４：ストッパ、４１５：回転軸、４１６：リニアガイド、４１７：ピニオン、４１８：ラック、４１９：上下モータ、４２０：メンブレン、４２１：ピン、４２２：ピンホルダ、４２３：磁石、４２４：磁石固定ピン、４２５：ボールプランジャ、４２６：磁気シールド、４２７：バネ、４２８：突起、４２９：受け面、４３０：スティック内底面、４３２：リング型磁石、４３３：磁石、４３４：シャフト、４３５：モータ、４３６：スティックホルダ、４３７：磁石、４３８：スプリング、４３９：シャフト、４４０：スティックホルダ、４４１：磁性体シャフト、４４２：ニクロム線、４４３：スティック、４４４：セファロースビーズ、４４５：フィルタキャップ、４４６：スティックホルダ、４４７：ヘリ、４４８：モータ、４４９：磁石、４５０：磁性体キャップ、５０１：Ｈ８マイコン、５０２：圧力供給源、６０１：ｓｓＤＮＡ、６０２：ビオチン、６０３：プライマ、６０４：アビジン、６０５：磁気ビーズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光を利用した核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を分析する装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列決定には、サンガー法を用いたキャピラリＤＮＡシーケンサが最も広く普及している。この装置は３０億塩基対からなるヒトゲノムＤＮＡの全配列を解読するヒトゲノム計画に大きく貢献した。２００３年にヒトゲノム配列解析は終了したが、微生物、植物などの研究対象の広がりや遺伝子機能解析を目指した比較ゲノム解析などが残されており、大規模ゲノム解析センタ向けに高速・高スループットな大規模ＤＮＡシーケンシングの需要はいまだ伸びている。一方で、遺伝子診断向け、一般研究室向けなどへのＤＮＡシーケンサの普及のためには、低コスト化、そして容易な操作性といった性能をもたせる必要があると考えられる。
【０００３】
上記要望を満たすために、サンガー法と異なる方法を用いたＤＮＡの塩基配列決定法がいくつか提案されている。その中の一つに、ＤＮＡの伸長時に生成されるピロリン酸（ＰＰｉ）を、化学発光を用いて検出することにより、塩基配列を決定する方法（パイロシーケンス法）がある（特許文献１）。この方法では、まず、ターゲットとなるＤＮＡ鎖にプライマをハイブリダイズさせ、相補鎖合成酵素（ポリメラーゼなど）が入った反応液に導入し、相補鎖合成核酸基質であるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に前記反応液に加えて相補鎖合成を行う。前記反応液には、ポリメラーゼの他に、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ｄＮＴＰ分解酵素（アピラーゼ）が存在する。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてＰＰｉが生成される。このＰＰｉがＡＴＰスルフリラーゼの働きによってＡＰＳに付加されてＡＴＰが生じる。前記ＡＴＰとルシフェリンからルシフェラーゼの働きよって発光を生じる。この光を検出することで、加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたかを判断できる。相補鎖合成が行われなかったｄＮＴＰは、反応液中に含まれるアピラーゼによって分解される。上記工程を４種のｄＮＴＰで順次行われることで、相補鎖の塩基配列を決定していくことが可能となる。ｄＮＴＰの一つであるｄＡＴＰは、ルシフェリンとルシフェラーゼによって発光を生じさせるため背景光が上昇し、計測・解析精度の劣化につながる。Ｎｙｒｅｎらは、ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰのアナログであるｄＡＴＰαＳを用いることで前記問題を解決している（特許文献２）。また、ＡＰＳもルシフェリンとルシフェラーゼによって光を生じさせるため、背景光の原因となる。神原らは、ＡＰＳとＡＴＰスルフリラーゼに変わり、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）とホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸リン酸ジキナーゼＰＰＤＫを用いることで上記問題を解決している（特許文献３）。
【０００４】
上述のようにパイロシーケンス法は、レーザのような光源を使わずに塩基配列決定が可能となるため、サンガー法を用いたＤＮＡシーケンサに比べて、装置構成が簡易になり、安価かつ小型化が容易となる。実際に、神原らはこのパイロシーケンス法を用いた小型のＤＮＡシーケンサを開発している（非特許文献１）。
【０００５】
一方、パイロシーケンス法では、相補鎖合成反応とｄＮＴＰの分解反応が共存することに由来する問題がある。ｄＮＴＰ分解酵素が多いと、相補鎖合成前にｄＮＴＰがすべて分解され、いくつかの未反応のＤＮＡ鎖が反応液中に存在することになる。また、ｄＮＴＰ分解酵素が少ないと、ｄＮＴＰの分解が遅くなるため、次のｄＮＴＰが反応液に導入する際に未分解のｄＮＴＰが残存し、一度に相補鎖合成が進行するいくつかのＤＮＡ鎖が反応液中に存在することになる。いずれの場合でもＤＮＡ鎖間で伸長度合いのばらつきが生じ、ＤＮＡ鎖の配列解析精度の低下につながる。神原らは、これらの問題を解決するために、相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応を含めた発光反応を空間的に分離する方法を提案している（分離反応方式）（特許文献４）。
【０００６】
図１に、特許文献４に記載の相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応を含めた発光反応を空間的に分離する構成を示す。試薬（例えばｄＮＴＰ）を分注する分注器３０３と反応液が入った反応容器１０１が上下に配置され（分注器３０３が反応容器１０１の上に位置する）、ＤＮＡ鎖を保持する保持部材４０１が分注器３０３と反応容器１０１の間に配置され、保持部材４０１の上下移動により、保持部材４０１の反応液１０２からの出し入れを繰り返して測定を行う構成である。保持部材４０１にはプライマとハイブリしたＤＮＡ鎖とポリメラーゼが、反応液１０２中にはｄＮＴＰ分解酵素と発光反応に関わる試薬が含まれており、保持部材４０１が反応液１０２外部にある時にｄＮＴＰを保持部材４０１に導入して相補鎖合成反応を行い、保持部材４０１が反応液１０２内部にある時に発光液反応とｄＮＴＰ分解反応を行う。上記方法により相補鎖合成反応とｄＮＴＰ分解反応・発光反応を空間的に分離する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第3533223号
【特許文献２】特許第3510272号
【特許文献３】特開2007-97471号公報
【特許文献４】特開2009-247297号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Electrophoresis、 22、 3497-3504、2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献４の構成において、保持部材４０１の例として、直径３ｍｍのメンブレンを挙げている。そして、保持部材４０１は、固定・上下移動させる手段である移動台（ここでは固定ピン４０３とする）に固定されている。固定ピン４０３の保持部材４０１への固定位置は、保持部材４０１のｄＮＴＰが分注される分注面４０２側（上方側）となっている。保持部材４０１は、ｄＮＴＰを精度良く分注するために、分注器３０３のｄＮＴＰ分注位置から０．５ｍｍ程度の距離のところまで近づくことになる。そのため、固定ピン４０３と分注器３０３は干渉することとなる。分注器３０３は、４種のｄＮＴＰに対応した２００μＬの容量のリザーバ３０１を持ち、それぞれのリザーバ３０１の下部にキャピラリ３０２が備えられている。前記４つのリザーバ３０１の中央に１ｍｍの貫通穴３０４があり、固定ピン４０３は貫通穴３０４に通されている。そのため、固定ピン４０３の直径は１ｍｍ以下となる。一方、ある程度量（数十μＬ以上）のｄＮＴＰを保持するために必要なリザーバ３０１の高さ、リザーバ３０１へ圧力を供給するための配管部等を考慮すると、固定ピン４０３の長さは２０ｍｍ以上必要となる。
【００１０】
以上より、分注器３０３と固定ピン４０３の干渉を防ぐため、保持部材４０１の固定・移動手段である固定ピン４０３は直径１ｍｍ以下長さ２０ｍｍ以上の棒材となり、非常に脆弱となり（折れやすい）、取り扱いが困難な形状となる。
【００１１】
また、保持部材４０１と固定ピン４０３を装置に取り付ける際には、固定ピン４０３を分注器３０３の貫通穴３０４に通す作業が必要となってしまう。
【００１２】
固定ピン４０３の強度向上のために、直径を太くすることが考えられる。例えば、直径４ｍｍのメンブレン（保持部材４０１）に直径３ｍｍの固定ピン４０３を取付けることも可能だが、ｄＮＴＰを分注する領域が小さくなるため、分注精度が低下する。メンブレン（保持部材４０１）の面積を拡大することで上記問題を解決できるが、大きなメンブレン（保持部材４０１）を入れるために反応容器１０１を大きくする必要があり、その分、反応試薬の量が増大するため試薬コストが上昇してしまう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため、核酸分析装置として、核酸試料の試料保持部を備える試料保持部材と、試料保持部に対し核酸試料と相補鎖合成反応をする相補鎖合成基質を供給する分注器と、試料保持部が浸漬され相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と、発光酵素による発光を検出する光検出器と、試料保持部材を支持し分注器と反応部との間に設けられ、試料保持部の分注器と対面する面が反応部と対面するように回転する回転機構と、分注器による分注及び回転機構による回転を制御する制御部を備える。
【００１４】
また、核酸試料が試料保持部に固定された試料保持部材を用いた分析方法として、当該試料保持部を前記核酸試料と相補鎖合成反応する相補鎖合成基質を供給する分注器に対面させる工程と、分注器から相補鎖合成基質を試料保持部に対して供給する工程と、試料保持部の分注器と対面する面が、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と対面するように試料保持部材を回転させる工程と、試料保持部を反応溶液に浸漬する工程と、発光酵素による発光を検出する工程とを有する。
【発明の効果】
【００１５】
上記構成により、試料保持部を保持する保持部材が分注器と干渉しない構成となり、試料保持部材を強固な構成とすることができる。また、試料保持部や保持部材の取り付け操作も容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】課題を説明するための分離反応方式の例。
【図２】本発明による分離反応方式の一例。
【図３】パイロシーケンス反応様式概略図。
【図４】本発明による分析装置の概略図の一例。
【図５】回転機構部周辺拡大図。
【図６】回転機構駆動プロセスの一例。
【図７】メンブレン方式の一例。
【図８】シーケンス操作フローチャート。
【図９】磁気ビーズを用いた例でのスティックとスティックホルダの断面図。
【図１０】磁気ビーズのスティック分注面での固定概念図。
【図１１】磁気回路を用いたスティックとスティックホルダの断面図。
【図１２】磁石回転型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１３】磁石移動型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１４】電磁石型のスティックとスティックホルダの断面図。
【図１５】セファロースビーズを用いた実施例でのスティックとスティックホルダの断面図。
【図１６】反応プレート型分析装置の概略図の一例。
【図１７】実施例４における回転機構駆動プロセス。
【図１８】磁気回路構造の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図２に、固定ピン４０４の固定部が保持部材４０１の分注面４０２と異なる面にあり、試薬分注後に分注面４０２が反応液１０２に浸漬可能な構造を示す。これを実現するために、固定ピン４０４を回転運動可能な構成とする。具体的には、保持部材４０１の分注面４０２の裏面に固定ピン４０４を固定する。分注面４０２に試薬が分注された後に、固定ピン４０４は回転して分注面４０２が反応容器１０１側（下側）に向く。その後、固定ピン４０４を下降させ、反応容器１０１内の反応液１０２に保持部材４０１を浸漬させる。固定ピン４０４と保持部材４０１は同一でも良く、例えば棒状固定ピンの片端面に核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）が固定され、かつ前記面が分注面という構成でも良い。固定ピン４０４の回転運動と上下運動を同時に行っても良い。さらに、図１６に示すように、反応溶液１０２が反応プレートに載っているような場合、固定ピン４０４は上下運動を行わずに回転運動のみでも良い。
【００１８】
このような構成を用いた分離反応方式においては、保持部材を固定する固定ピンを分注器と干渉しない構成となるため、固定ピンの太さは保持部材と同等以上の太さにでき、非常に強固なもとなり、また、保持部材・固定ピンの取り付け操作も容易となる。
【００１９】
以下、実施例にしたがって、具体的な構成を説明する。
【実施例１】
【００２０】
本実施例では、パイロシーケンシング法を用いて、測定対象の塩基配列を決定する。パイロシーケンスに関しては、特許文献２に記載の反応と配列決定の原理を採用した。図３にその反応様式の概略図を示す。パイロシーケンス反応では、配列を決定したいターゲットＤＮＡを一本鎖（ｓｓＤＮＡ）にした後に、プライマをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを加え、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を順次反応液中に加えて相補鎖合成反応を行い、相補鎖合成の際に副産物して生成されるＰＰｉをＡＭＰとＰＥＰとＰＰＤＫによりＡＴＰに変換し、ＡＴＰとルシフェリンをルシフェラーゼ存在下で反応させて発光させる。余剰のｄＮＴＰはアピラーゼによって分解される。本実施例では、ＰＰｉをＡＴＰに変換させるために、ＡＭＰ、ＰＥＰ、ＰＰＤＫを用いたが、ＡＴＰスルフリラーゼとＡＰＳを用いた系でも良い。
【００２１】
図４に本発明の分析装置の概観を示す。本装置は、反応収容部、光検出部、試薬分注部、回転機構部から構成される。これらの構成部は遮光されるように筺体に覆われている。
【００２２】
反応収容部１０６は直径５ｍｍ深さ１０ｍｍの４つの反応容器１０１が９ｍｍピッチで１列に配置されている。反応容器１０１の直径、深さ、数およびピッチは任意であり、限定されるものではない。さらに、反応容器１０１は複数列で配置しても良い。また、反応収容部１０６は、市販の反応容器（例えばＮｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏTMＭｏｄｕｌｅｓ；ＣＡＴ Ｎｏ．４７３５３９）とそれを固定するホルダを組み合わせた形状でも良い。パイロシーケンス反応では室温よりも高い温度で実施される場合がある（２８℃〜３５℃）。そこで、反応液を効率よく温調するために、反応収容部１０６には温度制御手段１０５が接続されている。本実施例では温度制御手段１０５としてペルチェ素子を使用したが、ヒータなどでも良い。また、反応液を攪拌するために、反応収容部１０６には攪拌手段１０４が接続されている。本実施例では、攪拌手段１０４として、回転軸に偏心カムが付いているモータを用い、前記偏心カムを反応収容部１０６に掘られた溝にあてがい、モータが回転することで、反応収容部１０６が振動する構成とした。温度制御手段１０５と攪拌手段１０４は、Ｈ８マイコン５０１（ＨＤ６４Ｆ３０５２ＢＦ２５、ルネサステクノロジ）によって動作が制御される。
【００２３】
光検出部は、全体を導電性材料で作られた導電性筺体２０５で覆われている。導電性筺体２０５内部には４つの光検出器２０１が収納されており、各光検出器２０１は各反応容器１０１の下方に１：１の関係で配置されている。光検出器２０１としてフォトダイオード（ＳｉフォトダイオードＳ１１３３−０１、浜松ホトニクス）を使用したが、ラインセンサやＣＣＤを用いて４つの反応容器１０１からの発光を１つの光検出器で検出しても良い。光検出器２０１と反応収容部１０６底部の間には、裏面に透明電極層（ここではＩＴＯを用いた）を有したガラス基板２０２が配置されており、前記透明電極層は導電性筺体２０５に電気的に接続され、装置の設置電位に接続されている。光検出器２０１からの信号は、導電性筺体２０５内に内蔵されたアンプ２０３（ｏｐＡ１２９ＵＢ、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により増幅され、導電性筺体２０５外部に配置されたマルチプレクサ２０４（ＭＡＸ４０５１ＡＣＳＥ、 Ｍａｘｉｍ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により４つの光検出器２０１からの信号を時分割してＡ／Ｄ変換され、Ｈ８マイコン５０１で信号処理され、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）に出力される。
【００２４】
試薬分注部は、分注器３０３、分注器ホルダ３０５、圧力配管ブロック３０６で構成される。分注器３０３は、試薬（ここではｄＮＴＰ４種）が５０μＬ収容できる４つのリザーバ３０１が一体となっており、各リザーバ３０１の底部にはキャピラリ３０２（外径３７０μｍ、内径５０μｍ）が具備されている。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰは、リザーバ３０１上面より加圧され、キャピラリ３０２端面から分注される。各分注器３０３は各反応容器１０１と対向する配置となるよう分注器ホルダ３０５によって保持される。ｄＮＴＰを加圧分注するために、分注器３０３上面には圧力配管ブロック３０６が接続されている。圧力配管ブロック３０６では、４種のｄＮＴＰが収容されるリザーバ３０１それぞれに、かつ、４つの分注器３０３において同じｄＮＴＰが収容されたリザーバ３０１には同時に圧力を印加できるような流路３０７が形成されている。最終的には、圧力配管ブロック３０６の背面で４本の流路に集約される。圧力配管ブロック３０６背部にて、前記４本の流路に４本の配管チューブ３０８がそれぞれ接続されており、すべての配管チューブ３０８が１つの圧力供給源５０２に接続されている。ここでは、圧力供給源５０２としてＣＯ２高圧ガスタンクを使用したが、それ以外の手段を用いても良い。各配管チューブ３０８と圧力供給源５０２の間には電磁弁３０９が設けてある。電磁弁３０９はＨ８マイコン５０１に接続されており、電磁弁３０９の開閉のタイミングを制御し、各ｄＮＴＰの分注タイミングと量を制御する。
【００２５】
回転機構部は、スティック４０５、スティックホルダ４０６、回転駆動部４０７で構成され、試薬分注部と反応収容部の間に配置される。本実施例では、ＤＮＡ鎖を固定する保持部材と保持部材を固定する固定ピンは一体となった棒状構造（スティック）を使用した。回転機構部周辺の拡大図を図５に示す。スティック４０５は、直径は３ｍｍ、長さは１５ｍｍであり、材質をポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）とした。直径と長さは、反応容器１０１内に導入できるサイズであれば、特に限定されるものではない。また、材質はＰＥＥＫに限定されるものではない。スティック４０５の分注面４０２には、ＤＮＡ鎖を固定できるよう表面処理がされている。具体的には分注面４０２にアビジンをコートした。４本のスティック４０５は、各分注器３０３と各反応容器１０１に対して１：１になるようにスティックホルダ４０６に固定される。スティック４０５はスティックホルダ４０６から着脱可能な構成とした。着脱可能な構成として、スティックホルダ４０６内部に内蔵されたボールプランジャとスティック側面に設けられたスティック溝４０８を利用した。
【００２６】
回転駆動部４０７は、ホルダ固定プレート４０９、アーム４１０、リニアガイド４１６、上下モータ４１９で構成される。スティックホルダ４０６はホルダ固定プレート４０９を介して回転駆動部４０７に固定される。スティックホルダ４０６をホルダ固定プレート４０９に固定する際は、磁石４１２を用いて容易に着脱可能な構成とした。また、取り付け位置はガイドピン４１１を用いて取付再現性を確保した。ホルダ固定プレート４０９はアーム４１０に対して回転軸４１５を中心に回転できるように接続されており、回転軸４１５の片端には偏心カム４１３が、もう一方の端にはピニオン４１７が固定されている。アーム４１０はリニアガイド４１６に固定されており、上下モータ４１９によって上下に駆動する。上下モータ４１９はＨ８マイコン５０１に接続されており、上下モータ４１９を介して回転駆動部４０７の上下動を制御する。
【００２７】
図６に回転機構部４０７の駆動プロセスを示す。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰをスティック４０５の分注面４０２に分注し、伸長反応のために数秒静置する（図６（ａ））。上下モータ４１９によってアーム４１０を下降させる。その際に、ピニオン４１７の歯が装置筺体に取付けられたラック４１８の歯とかみ合いながらアーム４１０が下降するため、回転軸４１５を中心にスティックホルダ４０６が回転する（図６（ｂ））。アーム４１０が所定の距離下降すると、ラック４８の歯からピニオン４１７の歯が外れるため、スティックホルダ４０６とスティック４０５の回転運動は停止する。偏心カム４１３とストッパ４１４を用いて、スティックホルダ４０６とスティック４０５の回転を完全に止める。この動作により、スティック４０５の分注面４０２はｄＮＴＰが分注された時から１８０度回転したことになる。また、この時スティック４０５の分注面４０２は反応容器１０１にはまだ入っていない（図６（ｃ））。アーム４１０はさらに下降し、反応容器１０１内底面から１ｍｍの位置で下方移動を停止し、分注面４０２が反応容器１０１内の反応液に浸漬される（図６（ｄ））。アーム４１０が上昇する際は、前記工程と逆の動作となる。
【００２８】
スティックホルダ４０６は、ピニオン４１７の歯がラック４１８の歯に当たるまでは回転運動を行わずに上昇し、ピニオン４１７とラック４１８の歯が当たると回転運動を行いながら上昇し、アーム４１０が最上面まで上昇すると分注面４０２が上方を向く状態で回転運動を停止し、ｄＮＴＰが分注される状態となる。この時、分注面４０２と分注器３０３のキャピラリ３０２ｄＮＴＰ吐出端との距離は１ｍｍになるようにした。以上のプロセスを繰り返すことでパイロシーケンス反応を行う。本実施例では、ピニオン４１７とラック４１８を用いて分注面４０２の回転運動を行ったが、回転軸４１５に小型モータを接続し、小型モータをＨ８マイコン５０１に接続して、小型モータをコントロールすることで、分注面４０２の回転運動を行っても良い。
【００２９】
また、ここでは上下モータ４１９によってアーム４１０を上下に動かしている例を示したが、スティック４０５と反応容器１０１との相対位置を制御できればよいので、例えば、反応容器１０１が上下に動くような機構を設けるようにしてもよい。
【００３０】
本実施例では、ＤＮＡ鎖を固定する保持部材と保持部材を固定する固定ピンは一体となったスティックを使用したが、保持部材と固定ピンを分割して取り外せるようになっていても良い。保持部材としてメンブレンを用いた例を示す（図７）。ここでは、メンブレン４２０として直径３ｍｍのＳＡＭ２（Ｒ） Ｂｉｏｔｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｖ７８６１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。このメンブレン４２０には共有結合によりストレプトアビジンがコートされている。メンブレン４２０の分注面４０２とは異なる面に直径１ｍｍ、長さ５ｍｍのピン４２１が固定されており、ピン４２１はピンホルダ４２２を介してスティックホルダ４０６に固定される。ピン４２１の直径と長さは、反応容器１０１内に導入できるサイズであれば、特に限定されるものではない。しかし、メンブレン４２０が反応液に浸漬する際に、分注面４０２と反対の面からも効率良く反応液がメンブレンに伝わるようにするため、ピン４２１は、強度を考慮しながら可能な限り細くした方が良い。なお、ピンホルダ４２２とスティックホルダ４０６は着脱可能な構成とした。スティックホルダ４０６は、保持部材と固定ピンが一体となったスティックの場合と同様に回転駆動部４０７に固定する。上記方法により、保持部材と保持部材を固定する固定ピンを分離した場合でも、固定ピンは分注器と干渉しないため、固定ピンの直径が細くても短くできる、つまり強固にすることができる。
【００３１】
以下、図８のフローチャートに沿って測定対象のＤＮＡのパイロシーケンス反応の方法を説明する。まず、５’末端にビオチン標識された配列解析対象の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をプライマとハイブリダイズさせる（６０１）。前記プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を分注面４０２に滴下、５分間静置し、ビオチン−アビジン結合を介してプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を分注面４０２に固定する（６０２）。スティック４０５の分注面４０２を２×Ｃバッファ（組成：１２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＭｇＡｃ２）で洗浄する（６０３）。次いで、分注面４０２にポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）を滴下、５分間静置し、分注面４０２に固定されたプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体と結合させる（６０４）。ポリメラーゼのプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体への固定を，ポリメラーゼを反応液に導入し，下記分注面４０２を反応液に１分間浸漬する工程６０８で行っても良い。前記プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体が固定されたスティック４０５をスティックホルダ４０６に取付け、スティックホルダ４０６を装置に取り付ける（６０５）。前記操作はすべて装置外部で行われる。４種のｄＮＴＰを分注器３０３のそれぞれのリザーバ３０１に導入し、また反応液を反応容器１０１に導入し、分注器３０３と反応容器１０１を装置に取り付ける（６０６）。反応液の組成は、発光のための酵素とｄＮＴＰ分解酵素が満たされているように、例えば、６０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭＭｇＡｃ、１５ｍＵ/μＬ ＰＰＤＫ、６０μＭ ルシフェラーゼ、４００μＭ ルシフェリン、８０μＭ ＰＥＰ・３Ｎａ、４００μＭ ＡＭＰ、１ｎＬ/μＬ ＢＳＡ、２００μＭ ＤＴＴ、１．２ｍＵ/μＬ アピラーゼとした。
【００３２】
上下モータ４１９を駆動して、スティック４０５の回転・下降動作を行い（６０７）、分注面４０２を反応液に１分間浸漬する（６０８）。前記浸漬工程により、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体やポリメラーゼに含まれるＡＴＰやＰＰｉを分解し、背景光の上昇を防ぐことができる。次いで、スティック４０５の回転・上昇動作を行い（６０９）、分注面４０２にｄＮＴＰを０．５μＬ滴下し、相補鎖合成反応のために６秒間静置した（６１０）。０．５μＬ程度の量であれば、スティック４０５の回転速度にもよるが、液体の表面張力により、スティック４０５を回転運動させてもｄＮＴＰ溶液が分注面４０２からこぼれ落ちることはない。分注量は０．５μＬに限る必要はないが、スティック４０５の回転運動時にこぼれない程度の量以下である必要がある。スティックを６秒間静置した後に、スティック４０５の回転・下降動作を行い（６１１）、分注面４０２を反応液に浸漬させる（６１２）。分注面４０２を反応液に浸漬した直後に攪拌手段１０４であるモータを駆動させ、反応液を攪拌するとともに、発光計測を行う（６１３）。この時、ＰＰＤＫ、ルシフェラーゼによる発光反応とアピラーゼによる余剰のｄＮＴＰの分解反応が行われる。前記発光の有無と強度を確認して、分注したｄＮＴＰによって相補鎖合成が行われたか、何塩基分相補鎖合成が行われたかを判断する。攪拌を１１４秒間行った後に、攪拌動作をやめ、スティック４０５の回転・上昇動作を行い（６１４）、分注面４０２を分注器３０３直下に配置し、次のｄＮＴＰを分注する。６１０から６１４の動作を分注面４０２へのｄＮＴＰの分注（６１０）からスティック４０５の回転・上昇動作（６１４）を繰り返して発光計測することにより、測定対象の塩基配列を決定できる。
【００３３】
本実施例では、ビオチン−アビジン結合を用いて保持部材にＤＮＡを固定したが、固定方法はその限りではない。例えば、ポリメラーゼにビオチンを標識し、前記ビオチン標識ポリメラーゼを保持部材に固定して、前記ビオチン標識ポリメラーゼにプライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を結合させる方法を用いても良い。
【００３４】
ＤＮＡの相補鎖合成反応では，プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体の自己ハイブリダイゼーションなどの高次構造形成により，相補鎖合成反応の効率が著しく低下する場合がある。前記問題を解決するため，スティック４０５の分注面４０２に温度調節（３０℃〜４０℃）機構を設ける，反応液にＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）や変性剤となるＤＭＳＯなどを加えても良い。
【実施例２】
【００３５】
本実施例では、保持部材として磁気ビーズを用いて、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。スティックとスティックホルダ以外の装置構成、ＤＮＡ鎖の保持部材への固定方法以外の反応プロセスは実施例１と同等である。
【００３６】
図９にＤＮＡ鎖が固定された磁気ビーズを固定する柱状のスティックとスティックホルダの断面図を示す。スティック４０５は直径４ｍｍ、長さ１５ｍｍで片端面が塞がれた筒状の形状である。ここでは、円筒状の構成を示しているがこれに限られない。材質はＰＥＥＫを用いた。スティック４０５の直径、長さ、材質は、この限りではない。但し、材質に関しては、すべて磁性体だとスティック４０５全体に磁気ビーズが固定されてしまうため、非磁性体が良い。円筒を塞ぐ片端面のみ磁性体とし、それ以外は非磁性体であっても良い。
【００３７】
スティック４０５の内側面に磁気シールドシート４２６を覆い、磁気ビーズがスティック４０５側面に固定されないようにした。さらに、分注面４０２の周囲にヘリ４４７を設けて、分注面が攪拌している反応液中に存在する時に、磁気ビーズが反応液の攪拌によりスティック４０５の側面に移動しないような工夫を施した。磁気ビーズのスティック側面への移動防止対策として前記方法以外に，磁気回路を用いた方法（図１８）も考えられる。図９の磁石４２３の代わりに、内底面に磁石４４９が固定された片端面が閉じた筒状構造の磁性体（例えば７８パーマロイ）キャップ４５０を用いることにより，磁場は図１８磁性体キャップ４５０と磁石４４９の上面に形成され，磁性体キャップ４５０の側面には形成されなくなる。そのため，磁気シールドシート４２６，ヘリ４４７が無くても，磁気ビーズはスティック４０５の分注面のみに安定して固定されることになる。
【００３８】
スティック４０５とスティックホルダ４０６は，実施例１と同じように、ボールプランジャ４２５とスティック４０５の側面に設けられたスティック溝４０８を用いて、着脱可能な構成とした。スティックホルダ４０６には、スティック２０５の筒内部に内包されるよう、磁石４２３が先端に固定された磁石固定ピン４２４が具備されている。磁石固定ピン４２４の磁石４２３が固定された面と異なる面をバネ４２７で押すことにより、磁石４２３が常にスティック内底面４３０を押し、スティック外底面（つまり分注面４０２）の磁場強度の着脱再現性が得られる構成とした。また、磁石固定ピン４２４の片端に突起４２８を作り、突起４２８がスティックホルダ４０６内部の受け面４２９と干渉することで、磁石固定ピン４２４がスティックホルダ４０６から外れない構成とした。
【００３９】
磁気ビーズへの測定対象となるＤＮＡ鎖の固定方法および前記ＤＮＡ固定磁気ビーズのスティック４０５への固定方法を説明する。測定対象のＤＮＡを、ＰＣＲを用いて５’末端にビオチン６０２標識させ、ビオチン６０２標識ＤＮＡをアビジン６０４が標識された磁気ビーズ６０５（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｒ） Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定した（図１０（ａ））。磁気ビーズ６０５は、直径２．８μｍ、疎水性のビーズであるが、これ以外のものを使用しても良い。また、ＤＮＡ鎖と磁気ビーズの固定手段として、ビオチン−アビジン結合を利用したが、それ以外の方法で固定しても良い。次いで、ＤＮＡ鎖が固定された磁気ビーズ６０５に０．２Ｎ ＮａＯＨを加え、アルカリ変性する。アルカリ変性した後に、磁石台を用いて磁気ビーズ固定鎖と上清に含まれる遊離鎖に分け、磁気ビーズ６０５に固定されたｓｓＤＮＡ６０１を作製する。磁気ビーズ６０５に固定されたｓｓＤＮＡ６０１（０．５ｐｍｏｌ）に４倍量（２ｐｍｏｌ）のプライマ６０３を加え、ｓｓＤＮＡ６０１へプライマ６０３をハイブリダイズさせ、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体を作製する。前記ハイブリダイズ後に、磁気ビーズ６０５が入った溶液にポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）を加えて５分間静置し、プライマ−ｓｓＤＮＡ複合体にポリメラーゼを結合させる。前記磁気ビーズ６０５が入った溶液をスティックホルダ４０６に取り付けられたスティック４０５の分注面４０２に滴下し、磁気ビーズを分注面４０２に固定する（図１０（ｂ））。前記固定作業の後に、余剰の溶液を取り除き、装置に取り付け、実施例１と同等のシーケンスプロセスを行う。
【００４０】
図９に示した磁石１個のみを用いた場合では、分注面４０２の中心に磁気ビーズが固まりを形成する。磁気ビーズの量によっては、磁気ビーズの固定領域の面積に対する高さの割合が大きくなり、前記磁気ビーズ塊の中心へのｄＮＴＰの浸透が遅くなることがある。このような場合、磁気ビーズ塊の中心部のＤＮＡ鎖の相補鎖合成反応の効率が低下し、ＤＮＡ鎖間での相補鎖合成反応の不均一が生じることによるシーケンス解析精度低下につながる。前記問題を防ぐ手段として、図１１に示すように、リング型磁石４３２を用いることが考えられる。これにより、磁気ビーズが分注面４０２の外周に分散固定され、磁気ビーズの固定領域の面積に対する高さの割合が小さくなり、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透をより速く、均等に行うことができ、相補鎖合成の不均一を抑えることができる。リング形状は、スティック２０５の内部側面に沿った形が望ましい。上記方法以外に、分注面で固定した磁気ビーズを攪拌させることで、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透の効率を向上させることも考えられる。
【００４１】
図１２に磁石回転型のスティックとスティックホルダ断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４３６に小型のモータ４３５が内蔵されており、モータ４３５の軸にはシャフト４３４が接続されており、シャフト４３４の先端には小型の磁石４３３が固定されている。小型磁石４３３は、少なくともスティック４０５の内径よりも小さい径を有するような大きさである。そして、固定される部位としては、スティックの中心軸から小型磁石４３３が遠ざかるようにするとよい。スティック４０５をスティックホルダ４３６に取付けると、シャフト４３４と磁石４３３はスティック４０５内に配置される。ｄＮＴＰ分注後にモータ４３５を回転させることで、磁石４３３がスティック４０５内部で回転し、分注面４０２に固定された磁気ビーズも回転する。磁気ビーズの回転動作による攪拌により、ｄＮＴＰの磁気ビーズへの浸透の効率を向上させることができる。磁場強度を弱めることにより強固に集積した磁気ビーズの集積度合い（固定度合い）を緩め、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくする方法も考えられる。
【００４２】
図１３に磁石移動型のスティックとスティック断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４４０にはシャフト４３９が具備されており、シャフト４３９の先端にはスプリング４３８が接続されており、スプリング４３８の片端には磁石４３７が固定されている。スティック４０５をスティックホルダ４４０に取付けると、シャフト４３９、スプリング４３８、磁石４３７はスティック４０５内部に入る構成となっている。スプリング４３８の伸張方向は、スティック４０５の中心軸方向である。分注面４０２が上方を向いている時は、磁石４３７の重さでスプリング４３８が縮まり、磁石４３７は分注面４０２から離れる。磁石４３７が分注面４０２から離れることにより、磁場強度が弱くなり、磁気ビーズの集積度合いが緩まり、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくなる。分注面４０２が下方に向いている時は、スプリング４３８によって磁石４３７をスティック内底面に押しつけるため、磁気ビーズが分注面４０２に固定され、磁気ビーズが反応容器１０１に落ちることを防ぐ。上記方法以外に、ｄＮＴＰ分注時に磁場強度を弱める方法として電磁石を用いる方法がある。
【００４３】
図１４に電磁石型スティックとスティックホルダの断面図を示す。磁石、磁石固定ピン、バネ以外の構成は図９と同等である。スティックホルダ４４０には、磁性体シャフト４４１（ここでは鉄性のシャフト）が具備されており、磁性体シャフト４４１には絶縁性被覆の付いた電線（ここではニクロム線４４２）が巻き付けられている。ニクロム線４４２は、ＯＮ／ＯＦＦをＨ８マイコン５０１で制御される電源に接続されている。ｄＮＴＰをスティック４５０の分注面４０２に分注する際には、前記電源をＯＦＦにし、磁性体シャフト４４１から磁場が発生しないようにする。前記操作により、磁場強度が弱くなり、磁気ビーズの集積度合いが緩まり、ｄＮＴＰが磁気ビーズ塊の中心に浸透しやすくなる。スティック４０５が回転・下降する際には、前記電源をＯＮにし、磁性体シャフト４４１から磁場を発生させ、磁気ビーズを分注面４０２に固定する。前記操作により、分注面４０２が反応液に浸漬した際に、磁気ビーズが反応液に拡散することを防ぐ。また、分注面４０２が反応液に浸漬する際に、あえて前記電源をＯＦＦにすることで、磁気ビーズを反応液に拡散させ、相補鎖合成によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰの反応液の拡散効率を向上させても良い。この場合、分注面４０２を反応液から取出す際に、前記電源をＯＮにして、反応液に分散した磁気ビーズを分注面４０２に再固定する必要がある。
【００４４】
以上のように本発明を用いると、分注面裏面での固定ピン配置により、固定ピンが分注器と干渉することがないため、固定ピンの脆弱性の抑制や取り付け容易性の向上以外に、様々な形状の磁石を使用でき、反応効率の向上などが可能となる。
【実施例３】
【００４５】
本実施例では、保持部材としてセファロースビーズを用いて、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。スティックとスティックホルダ以外の装置構成、ＤＮＡ鎖の保持部材への固定方法以外の反応プロセスは実施例１と同等である。
【００４６】
図１５に保持部材としてセファロースビーズを用いた時に使用するスティックとスティックホルダ断面図を示す。スティック４４３の片端面にセファロースビーズ４４４を導入し、メンブレンフィルタで作られたフィルタキャップ４４５で閉じ込める。図１５のように凹部を有するとセファロースビーズを導入しやすい。セファロースビーズ４４４として、ストレプトアビジンがコートされた平均粒子径３４μｍのビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌａｂ Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｈｉｔｒａｐ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。フィルタキャップ４４５のメンブレンフィルタとして、メッシュサイズ１２μｍ、ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ製（ＩＳＯＰＯＲＥTM ＭＥＭＢＲＡＮＥ ＦＩＬＴＥＲＳ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用した。セファロースビーズ４４４の大きさよりもメンブレンフィルタのメッシュサイズの方が小さいため、フィルタキャップ４４５内部にｄＮＴＰ溶液は浸透するが、セファロースビーズ４４４はフィルタキャップ４４５外部には移動できない。メンブレンフィルタとして、多数の孔が開いたものを用いてもよく、そのときに孔の大きさについてもビーズの大きさよりも小さくなるようなものを用いる。
【００４７】
セファロースビーズ４４４へのＤＮＡ固定方法を説明する。セファロースビーズ４４４を、カラムを用いてバッファで洗浄し、５’末端ビオチン標識二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をセファロースビーズ４４４に添加し、ｄｓＤＮＡをセファロースビーズ４４４に固定する。次いで、カラムを用いてセファロースビーズ４４４をバッファで洗浄し、未結合のｄｓＤＮＡを洗い流す。０．２Ｎ ＮａＯＨを添加して、変性させ、バッファでセファロースビーズ４４４を洗浄してセファロースビーズ４４４に固定されたｓｓＤＮＡを作製する。前記工程で得られたｓｓＤＮＡが固定されたセファロースビーズ４４４をスティック４４３に導入し、フィルタキャップ４４５をスティック４４３先端に取付ける。その後、スティック４４３をスティックホルダ４４６に取付け、スティックホルダ４４６を装置に取り付け、実施例１と同等のシーケンスプロセスを行う。
【実施例４】
【００４８】
本実施例では、回転駆動のみでスティック分注面の位置制御を行い、パイロシーケンシング法による測定対象の塩基配列を決定する。回転機構部、反応収容部以外の装置構成、反応プロセスは実施例１と同等である。
【００４９】
図１６に本実施例で使用する分析装置の概観を示す。本実施例では、反応収容部を構成する反応容器に代わり、反応プレート１０７を使用する。反応プレート１０７の材質として、ステンレスを使用したが、その限りではない。また、反応プレート１０７の表面は疎水処理が施されている。反応プレート１０７には光学的に透明な材質の検出窓１０８が具備されている。検出窓１０８の材質として石英ガラスを使用したが、光学的に透明であれば、その限りではない。検出窓１０８の図１６の上側の端面には親水処理が施されている。そのため、反応プレート１０７に実施例１と同等の反応液を滴下すると、検出窓１０８を中心に反応液滴１０９が形成される。反応プレート１０７を光学的に透明な材質を使用することで、検出窓１０８を使用しなくても良い。この場合、反応液滴１０９が所定の位置に維持されるように、前記所定の位置のみに親水処理を施し、それ以外の表面には疎水処理を施すことが望ましい。尚、親水処理、疎水処理は、親水処理部が疎水処理部よりも相対的に反応溶液に対する親水度が高くなるように処理されればよい。
【００５０】
反応プレート１０７には温度制御手段１０５が接続されており、反応プレートを介して反応液滴の温度調節が可能となっている。温度制御手段１０５としてペルチェを用いたが、その限りではない。反応プレート１０７は、検出窓１０８の直下に検出器２０１が位置するように、ガラス基板２０２の上部に配置した。
【００５１】
回転機構部は、実施例１と同様にスティック４０５、スティックホルダ４０６、回転駆動部４０７で構成され、試薬分注部と反応収容部の間に配置される。スティック４０５とスティックホルダ４０６は実施例１と同等である。また、スティック４０５とスティックホルダ４０６の回転駆動部４０７への取付方法も実施例１と同等である。回転駆動部４０７は、ホルダ固定プレート４０９、アーム４１０、モータ４４８で構成される。ホルダ固定プレート４０９はアーム４１０に対して回転軸４１５を中心に回転できるように接続されており、回転軸４１５の片端にはモータ４４８が接続されている。モータ４４８はＨ８マイコン５０１に接続されており、モータ４４８を介して回転駆動部４０７の回転運動を制御する。
【００５２】
図１７に回転機構部４０７の駆動プロセスを示す。リザーバ３０１に収容されたｄＮＴＰをスティック４０５の分注面４０２に分注し、伸長反応のために数秒静置する（図１７（ａ））。次いで、モータ４４８によって、回転軸４１５を中心にホルダ固定プレート４０９を介してスティックホルダ４０６を回転させる。この動作により、スティック４０５の分注面４０２はｄＮＴＰが分注された時から１８０度回転し、分注面４０２が反応プレート１０７上の反応液滴１０９に接触する（図１７（ｂ））。相補鎖合成反応によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰを効率良く反応液滴１０９に拡散させるために、分注面４０２を反応液滴１０９に接触した際に、モータ４４８によってスティック４０５を図１７（ｂ）で左右にわずかに回転動作させた。反応プレート１０７を振動させて、相補鎖合成反応によって生成されたＰＰｉや余剰のｄＮＴＰを効率良く反応液滴１０９に拡散させても良い。分注面４０２にｄＮＴＰを分注する時は、前記工程と逆の動作となる。
【００５３】
モータ４４８によって、回転軸４１５を中心にスティックホルダ４０６を１８０度回転させ、ｄＮＴＰが分注される状態にする。この時、分注面４０２と分注器３０３のキャピラリ３０２ｄＮＴＰ吐出端との距離は１ｍｍになるようにした。以上のプロセスを繰り返すことでパイロシーケンス反応を行う。
【符号の説明】
【００５４】
１０１：反応容器、１０２：反応液、１０３：溝、１０４：攪拌手段、１０５：温度制御手段、１０６：反応収容部、１０７：反応プレート、１０８：検出窓、１０９：反応液滴、２０１：光検出器、２０２：ガラス基板、２３０：アンプ、２０４：マルチプレクサ、２０５：導電性筺体、３０１：リザーバ、３０２：キャピラリ、３０３：分注器、３０４：貫通穴、３０５：分注器ホルダ、３０６：圧力配管ブロック、３０７：流路、３０８：配管チューブ、３０９：電磁弁、４０１：保持部材、４０２：分注面、４０３：固定ピン、４０４：固定ピン、４０５：スティック、４０６：スティックホルダ、４０７：回転駆動部、４０８：スティック溝、４０９：ホルダ固定プレート、４１０：アーム、４１１：ガイドピン、４１２：磁石、４１３：偏心カム、４１４：ストッパ、４１５：回転軸、４１６：リニアガイド、４１７：ピニオン、４１８：ラック、４１９：上下モータ、４２０：メンブレン、４２１：ピン、４２２：ピンホルダ、４２３：磁石、４２４：磁石固定ピン、４２５：ボールプランジャ、４２６：磁気シールド、４２７：バネ、４２８：突起、４２９：受け面、４３０：スティック内底面、４３２：リング型磁石、４３３：磁石、４３４：シャフト、４３５：モータ、４３６：スティックホルダ、４３７：磁石、４３８：スプリング、４３９：シャフト、４４０：スティックホルダ、４４１：磁性体シャフト、４４２：ニクロム線、４４３：スティック、４４４：セファロースビーズ、４４５：フィルタキャップ、４４６：スティックホルダ、４４７：ヘリ、４４８：モータ、４４９：磁石、４５０：磁性体キャップ、５０１：Ｈ８マイコン、５０２：圧力供給源、６０１：ｓｓＤＮＡ、６０２：ビオチン、６０３：プライマ、６０４：アビジン、６０５：磁気ビーズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の試料保持部を備える試料保持部材と、
前記試料保持部に対し、前記核酸試料と相補鎖合成反応をする相補鎖合成基質を供給する分注器と、
前記試料保持部が浸漬され、前記相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と、前記相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と、
前記発光酵素による発光を検出する光検出器と、
前記試料保持部材を支持し、前記分注器と前記反応部との間に設けられ、前記試料保持部の前記分注器と対面する面が、前記反応部と対面するように回転する回転機構と、
前記分注器による分注、前記回転機構による回転を制御する制御部と、を備えた核酸分析装置。
【請求項２】
前記試料保持部と前記反応部との相対距離を制御するように前記試料保持部材を移動させる上下機構を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項３】
前記回転機構は、前記上下機構による前記試料保持部材の移動に伴い回転する回転部材を備えることを特徴とする請求項２記載の核酸分析装置。
【請求項４】
前記試料保持部材は、前記試料保持部を有する柱状構造をしていることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項５】
前記試料保持部材は、前記試料保持部としてのメンブレンを固定したものであることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項６】
前記試料保持部材をはめ込むホルダを備え、前記ホルダを介して前記試料保持部材が前記回転機構に支持されることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項７】
前記反応部は、前記反応溶液を保持する容器を備えることを特徴とする請求項２記載の核酸分析装置。
【請求項８】
前記反応部は、前記反応溶液を保持する親水性領域と、前記親水性領域よりも親水度の低い疎水性領域を有するプレートであることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項９】
前記試料保持部材は、前記試料保持部を底面とする筒状部材と、前記筒状部材の内部に磁性体を備えていることを特徴とする請求項４記載の核酸分析装置。
【請求項１０】
前記筒状部材の内側面は磁気シールドを備えていることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１１】
前記磁性体は、前記筒状部材の内側面に沿ったリング形状の磁石であることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１２】
前記磁性体は、前記筒状部材の内径よりも小さい径を有する磁石であって、前記磁石の中心軸が前記筒状部材の中心軸と異なるように固定部材によって固定され、前記固定部材を前記筒状部材の内周に沿って回転させる回転機構を備えることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１３】
前記筒状部材は、内部に前記筒状部材の中心軸方向に伸縮するバネを備え、前記磁性体は、前記試料保持部と前記バネとの間に置かれた磁石であることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１４】
前記磁性体は電線が巻かれた電磁石であり、前記制御部は、前記試料保持部が前記分注器に対面しているときには電源ＯＦＦ、前記試料保持部が前記反応部と対面しているときには電源ＯＮするように制御することを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１５】
前記試料保持部は、測定対象の試料が固定されたビーズを保持する凹部と、前記凹部をカバーし前記ビーズよりも小さい孔を有するメンブレンを備えることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項１６】
ポリメラーゼが結合した核酸試料が試料保持部に固定された試料保持部材を用いた分析方法であって、
前記試料保持部を、前記核酸試料と相補鎖合成反応する相補鎖合成基質を供給する分注器に対面させる工程と、
前記分注器から相補鎖合成基質を前記試料保持部に対して供給する工程と、
前記試料保持部の前記分注器と対面する面が、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と前記相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と対面するように前記試料保持部材を回転させる工程と、
前記試料保持部を、前記反応溶液に浸漬する工程と、
前記発光酵素による発光を検出する工程とを有する核酸分析方法。
【請求項１７】
前記分注器から相補鎖合成基質を前記試料保持部に対して供給する工程の前に、前記試料保持部を前記反応溶液に浸漬する工程を有することを特徴とする請求項１６記載の核酸分析方法。
【請求項１】
核酸試料の試料保持部を備える試料保持部材と、
前記試料保持部に対し、前記核酸試料と相補鎖合成反応をする相補鎖合成基質を供給する分注器と、
前記試料保持部が浸漬され、前記相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と、前記相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と、
前記発光酵素による発光を検出する光検出器と、
前記試料保持部材を支持し、前記分注器と前記反応部との間に設けられ、前記試料保持部の前記分注器と対面する面が、前記反応部と対面するように回転する回転機構と、
前記分注器による分注、前記回転機構による回転を制御する制御部と、を備えた核酸分析装置。
【請求項２】
前記試料保持部と前記反応部との相対距離を制御するように前記試料保持部材を移動させる上下機構を備えることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項３】
前記回転機構は、前記上下機構による前記試料保持部材の移動に伴い回転する回転部材を備えることを特徴とする請求項２記載の核酸分析装置。
【請求項４】
前記試料保持部材は、前記試料保持部を有する柱状構造をしていることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項５】
前記試料保持部材は、前記試料保持部としてのメンブレンを固定したものであることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項６】
前記試料保持部材をはめ込むホルダを備え、前記ホルダを介して前記試料保持部材が前記回転機構に支持されることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項７】
前記反応部は、前記反応溶液を保持する容器を備えることを特徴とする請求項２記載の核酸分析装置。
【請求項８】
前記反応部は、前記反応溶液を保持する親水性領域と、前記親水性領域よりも親水度の低い疎水性領域を有するプレートであることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項９】
前記試料保持部材は、前記試料保持部を底面とする筒状部材と、前記筒状部材の内部に磁性体を備えていることを特徴とする請求項４記載の核酸分析装置。
【請求項１０】
前記筒状部材の内側面は磁気シールドを備えていることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１１】
前記磁性体は、前記筒状部材の内側面に沿ったリング形状の磁石であることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１２】
前記磁性体は、前記筒状部材の内径よりも小さい径を有する磁石であって、前記磁石の中心軸が前記筒状部材の中心軸と異なるように固定部材によって固定され、前記固定部材を前記筒状部材の内周に沿って回転させる回転機構を備えることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１３】
前記筒状部材は、内部に前記筒状部材の中心軸方向に伸縮するバネを備え、前記磁性体は、前記試料保持部と前記バネとの間に置かれた磁石であることを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１４】
前記磁性体は電線が巻かれた電磁石であり、前記制御部は、前記試料保持部が前記分注器に対面しているときには電源ＯＦＦ、前記試料保持部が前記反応部と対面しているときには電源ＯＮするように制御することを特徴とする請求項９記載の核酸分析装置。
【請求項１５】
前記試料保持部は、測定対象の試料が固定されたビーズを保持する凹部と、前記凹部をカバーし前記ビーズよりも小さい孔を有するメンブレンを備えることを特徴とする請求項１記載の核酸分析装置。
【請求項１６】
ポリメラーゼが結合した核酸試料が試料保持部に固定された試料保持部材を用いた分析方法であって、
前記試料保持部を、前記核酸試料と相補鎖合成反応する相補鎖合成基質を供給する分注器に対面させる工程と、
前記分注器から相補鎖合成基質を前記試料保持部に対して供給する工程と、
前記試料保持部の前記分注器と対面する面が、相補鎖合成反応による生成物と反応して発光させる発光酵素と前記相補鎖合成基質の分解酵素とを含む反応溶液を保持する反応部と対面するように前記試料保持部材を回転させる工程と、
前記試料保持部を、前記反応溶液に浸漬する工程と、
前記発光酵素による発光を検出する工程とを有する核酸分析方法。
【請求項１７】
前記分注器から相補鎖合成基質を前記試料保持部に対して供給する工程の前に、前記試料保持部を前記反応溶液に浸漬する工程を有することを特徴とする請求項１６記載の核酸分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−３４６１２（Ｐ２０１２−３４６１２Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７６９１８（Ｐ２０１０−１７６９１８）
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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