核酸分離方法および核酸分離用の固体基板
【課題】アミノ基とカルボキシル基とを含み第１ｐＨで正電荷を帯びる物質を利用して核酸を分離する方法、および該方法に使われうる核酸分離用の固体基板を提供する。
【解決手段】核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、正電荷を帯びる二官能性物質とを、第１ｐＨで接触させて核酸を該物質に結合させるステップ、および第１ｐＨより高い第２ｐＨで該核酸を放出させるステップを含む、核酸を含む試料から核酸を分離する方法および該方法に使われうる核酸分離用の固体基板である。
【解決手段】核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、正電荷を帯びる二官能性物質とを、第１ｐＨで接触させて核酸を該物質に結合させるステップ、および第１ｐＨより高い第２ｐＨで該核酸を放出させるステップを含む、核酸を含む試料から核酸を分離する方法および該方法に使われうる核酸分離用の固体基板である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基とカルボキシル基とを含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる物質を利用して核酸を分離する方法、およびそれに使われうる核酸分離用の固体基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＨ依存性イオン交換マトリックスを利用した核酸の分離方法が公知である。例えば、特許文献１には、イオン化可能な基を有している物質を利用する核酸の分離方法が開示されている。ここで、核酸と結合するようなイオン化可能な基は、第１ｐＨで正電荷を帯びており、イオン化可能な基を有する物質は、結合していた核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで、放出する。イオン化可能な基を有する物質の例としては、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−トリヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、およびトリヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）などが含まれる。また、特許文献２には、シリカ磁性粒子と；芳香族炭化水素環、前記芳香族炭化水素環に共有的に付着しているスペーサ、および第１末端で前記シリカ磁性粒子に付着しており、第２末端で前記スペーサに付着しているリンカーアルキル鎖を有するリンカーを含む複数個の第１イオン交換配位子と、を含むｐＨ依存性イオン交換マトリックスを利用する核酸の分離方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許公開第２００１／００１８５１３号公報
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、前記従来技術によっても、イオン化可能な基を有する物質と核酸との結合速度が大きく、ｐＨを上昇させた場合核酸を放出する効率が高い物質は、依然として要求されている。この現状を鑑みて、本発明者らは、核酸とさらに速い速度で結合して迅速に核酸と吸着でき、ｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率が顕著に高い物質を探索していたところ、カルボキシル基とアミノ基とをいずれも含む二官能性物質を発見して本発明を完成するに至った。
【０００４】
すなわち、本発明の目的は、核酸との結合速度が速く、かつｐＨを上昇させたときに核酸の放出効率の高い物質を利用し、核酸を迅速、かつ効率的に分離する方法を提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的は、前記方法に使われうる核酸分離用の固体基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて、前記核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、を含み、前記二官能性物質は、下記化学式（１）、または、下記化学式（２）で表されることを特徴とする、核酸の分離方法を提供する：
【０００７】
【化１】
【０００８】
前記化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【０００９】
【化２】
【００１０】
【化３】
【００１１】
(式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００１２】
【化４】
【００１３】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００１４】
【化５】
【００１５】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【００１６】
【化６】
【００１７】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍは１〜１０の整数であり、Ｙ’は窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００１８】
前記他の目的を達成するために、本発明は、 核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固定化されている固体基板とを、前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固体基板に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記固体基板上に固定化される官能基が、下記化学式（３）または下記化学式（４）で表されることを特徴とする核酸の分離方法を提供する。：
【００１９】
【化７】
【００２０】
前記化学式（３）中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【００２１】
【化８】
【００２２】
【化９】
【００２３】
（式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００２６】
【化１１】
【００２７】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【００２８】
【化１２】
【００２９】
前記化学式（４）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり；Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００３０】
前記他の目的を達成するために、本発明は、固体基板上に前記化学式（３）または（４）で表される官能基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板を提供する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の核酸分離方法によれば、迅速、かつ効率的に核酸を分離できる。また、本発明の固体基板を用いることにより、迅速、かつ効率的に核酸を分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の第一は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、を含み、前記二官能性物質は、下記化学式（１）で表される。
【００３３】
【化１３】
【００３４】
化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり、好ましくはｎおよびｎ’が１〜３である。なお、ｎおよびｎ’は、同一であっても、異なるものであってもよい。また、化学式（１）中、Ａは、下記化学式
【００３５】
【化１４】
【００３６】
【化１５】
【００３７】
(式中、ｘはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００３８】
【化１６】
【００３９】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００４０】
【化１７】
【００４１】
のいずれか１つで表される基である。さらに、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。
【００４２】
前記二官能性物質は、また下記化学式（２）でも表される。
【００４３】
【化１８】
【００４４】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）である。また、Ｒ１としては同種のもののみが存在してもよいし、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’の２種が存在していてもよい。Ｒ2も同様である。また前記化学式（２）中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基である。Ｒ３は同種のもののみが存在してもよいし、２種以上が存在していてもよい。ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００４５】
化学式（１）または（２）で表される二官能性物質は、１種のみを用いてもよいし、また２種以上を混合して用いることもできる。
【００４６】
前記化学式（１）で、Ａは、２個のカルボキシル基と２個のカルボニル基とを含み、好ましくは、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、および１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸二無水物の誘導体由来の二価の基である。前記カルボニル基は、それぞれ化学式（１）中の−ＮＨと結合している。
【００４７】
前記化学式（１）において、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。好ましくは、前記Ｙは、ピリジニルまたはイミダゾリル基であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００４８】
前記化学式（２）において、Ｒ１および／またはＲ２が、Ｙ’が−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’である場合、Ｙ’は、好ましくは、ピリジニル基またはイミダゾリル基であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００４９】
本発明の核酸分離方法は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて核酸を前記二官能性物質に結合させるステップを含む。前記試料には、核酸を含むもの、例えば、血液および細胞を含む溶液のような生物学的試料またはＰＣＲ産物を含む溶液のような化学的核酸溶液が含まれる。
【００５０】
本発明において、試料中の核酸が結合される物質の一実施形態は、アミノ基とカルボキシル基とを含む物質であって第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質である。
【００５１】
本発明の一具体例で、前記二官能性物質は、前記化学式（１）で、ｎおよびは、１〜１０の整数、好ましくはｎが１〜３の整数であり、Ａは、
【００５２】
【化１９】
【００５３】
のいずれか１つであり、Ｙは、
【００５４】
【化２０】
【００５５】
のいずれか１つである前記化学式（１）である。
【００５６】
また、他の具体例は、前記化学式（２）で、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数、好ましくはｍが１〜３の整数であり、Ｙ’が
【００５７】
【化２１】
【００５８】
のいずれか１つである）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である前記化学式（１）である。
【００５９】
化学式（１）の化合物と化学式（２）の化合物は、アミノ基とカルボキシル基とをそれぞれ有する化合物である。化学式（１）の化合物は、好ましくは第１ｐＨで正電荷と負電荷とが約２：１の割合で含まれることが好ましい。また、前記化学式（２）の化合物は、好ましくは、−ＯＨと、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’とが、モル比で１：１〜３：１の割合で含まれている化合物である。
【００６０】
本発明において、化学式（１）の化合物は、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物のようなテトラカルボン酸二無水物、および４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾールのようなｎが１〜１０の整数であり、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＹを化学反応させることによって得られる。また、化学式（２）の化合物は、下記化学式（５）の化合物と、ＮＨ２（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’は、窒素含有ヘテロ環塩基である）と、を化学反応させることによって得られる：
【００６１】
【化２２】
【００６２】
式中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。その結果得られる化学式（２）の化合物のうち、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との比率は、反応物中の−ＯＨとＮＨ２（ＣＨ２）ｍＹ’の量を調節することによって調整することができる。
【００６３】
前記化学式（５）の好ましい一例は下記化学式（６）の化合物である：
【００６４】
【化２３】
【００６５】
式中、ｐは１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００６６】
化学式（５）の化合物は、ポリ無水物である。前記ポリ無水物は、遠心分離のような分離工程によって溶液から容易に分離されうる。したがって、核酸と、前記ポリ無水物から得られる化学式（２）の重合体とを結合させて得られる核酸−二官能性物質の複合体を溶液から分離し、分離された核酸−二官能性物質の複合体を第２ｐＨで溶出させることによって、核酸が容易に前記複合体から分離されうる。
【００６７】
本発明の第二は、下記化学式（３）で表される官能基が固定化されている固体基板である。
【００６８】
【化２４】
【００６９】
式中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【００７０】
【化２５】
【００７１】
【化２６】
【００７２】
（式中、ｘはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００７３】
【化２７】
【００７４】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００７５】
【化２８】
【００７６】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。
【００７７】
または、下記化学式（４）で表される官能基が固定化されている固体基板である。
【００７８】
【化２９】
【００７９】
式中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’基（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。なお、上記化学式（４）中、Ｒ１としては同種のもののみが存在してもよいし、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’の２種が存在していてもよい。Ｒ2も同様である。また、Ｒ３は同種のもののみが存在してもよいし、２種以上が存在していてもよい。
【００８０】
化学式（３）または（４）で表される官能基は、１種のみを固体基板への固定化に用いてもよいし、また２種以上を用いることもできる。
【００８１】
前記化学式（３）中、好ましくは、ｎは、１〜１０の整数であり、Ａは、
【００８２】
【化３０】
【００８３】
のいずれか１つであり、Ｙは、
【００８４】
【化３１】
【００８５】
のいずれか１つである官能基である。
【００８６】
また、前記化学式（４）中、好ましくは、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、Ｙ’が
【００８７】
【化３２】
【００８８】
のいずれか１つであり、ｍは１〜１０の整数である）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数の官能基である。
【００８９】
前記化学式（４）の好ましい一例は下記化学式（７）
【００９０】
【化３３】
【００９１】
で表される基である（式中、ｐは１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である）。また、好ましくは、前記化学式（４）中の−ＯＨと、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である官能基である。
【００９２】
本発明の前記実施形態で、前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質から選択されうるが、それらの例に限定されるものではない。また、前記固体基板は、任意の形態を有したものでありうる。例えば、球形、板状または無晶形の形状を有するものでありうるが、これらの例に限定されるものではない。また、前記固体基板は、化学式（３）または化学式（４）で表される基を固定化するために、活性化されていることもある。例えば、アミノ基のような活性基がコーティングされている基板でありうる。
【００９３】
本発明において、固体基板上に化学式（３）または化学式（４）の各化合物が固定化される固体基板は、当業界に公知の任意の固定化方法によって製造することができる。例えば、ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のようなアミノ基でコーティングされている固体基板（例えば、シリコン、ガラスまたはプラスチック物質から構成される）に１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物のようなテトラカルボン酸二無水物を化学反応させて基板上に固定化した後、ｎが１〜１０の整数であり、Ｙが窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＹで表される化合物（例えば、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）を化学反応させることによって製造することができる。また、化学式（４）の官能基が固定化されている固体基板は、例えば、化学式（５）のポリ無水物を、アミノ基がコーティングされている基板上に化学反応させることによって固定化した後、ｐが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｐＹ’の化合物（例えば、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）を化学反応させることによって製造することができる。
【００９４】
本発明において、試料中の核酸が結合される物質の他の実施形態は、上記のようにして得られる固体基板である。結合されうる核酸は、前記二官能性物質のところで述べた通りである。
【００９５】
本発明は、また固体基板上に上記化学式（３）または化学式（４）で表される基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板を提供し、さらにこれを利用した核酸の分離方法を提供する。
【００９６】
本発明において、前記第１ｐＨは、化学式（１）の化合物および化学式（２）の化合物または化学式（３）および化学式（４）の基内のカルボキシル基のｐＫａ値より低いｐＨが好ましい。具体的に、前記第１ｐＨは２〜３．５であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００９７】
本発明の方法は、得られた核酸−二官能性物質複合体または核酸−官能基が固定化された固体基板複合体から前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで核酸を分離するステップを含む。この際、核酸を分離させるステップは、前記複合体を混合物から分離し、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液中から溶出するステップを含む。
【００９８】
第２ｐＨは前記第１ｐＨより高ければ、いかなる値でも可能であるが、好ましくは、５〜１０である。前記核酸−物質複合体を溶出するために使われる溶液は、水およびバッファなどでありうる。
【００９９】
本発明の核酸分離用の固体基板は、第１ｐＨで正電荷を有し、第２ｐＨに負電荷を有するだけではなく、第１ｐＨで核酸と結合する場合に速く結合し、第２ｐＨで核酸を効率的に放出させることができる特性を有している。したがって、本発明の核酸分離用の固体基板は、試料中の核酸を分離するのに有用に使われうる。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１：化学式（７）の基が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では、下記化学式（７）の官能基が固定化された固体基板を製造し、第１ｐＨでＤＮＡを結合させた後、第２ｐＨで、前記ＤＮＡ−基板複合体から核酸を回収した。
【０１０２】
本実施例で使われた下記化学式（７）の官能基は、
【０１０３】
【化３４】
【０１０４】
式中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、および−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２（対照群）、４−（アミノメチル）ピリジニル（実験群１）、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾリル（実験群２）基から選択され、ｐは２であり、ｌは、約２０００であり、Ｒ１とＲ２中の−ＯＨ基と、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’基との比率は、約２：１であった。
【０１０５】
基板上への前記化学式（７）で表される官能基の固定化は、次の通り行った。まず、アミノ基でコーティングされたガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＧＡＰＳ ｇｌａｓｓ、コーニング社）基板を溶媒がＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）である２００ｍＭ（反復単位基準）のポリ無水物（エチレン−無水マレイン酸交互共重合体）（分子量Ｍｗ １００，０００−５０００，０００）に室温で１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。得られた前記ポリ無水物が結合されたガラス基板をＮＭＰ中のエチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（濃度は、モル比であり、エチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジン、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾール：Ｈ２Ｏ＝４：６）中に室温で１時間浸漬した後、エタノールで洗浄して乾燥した。前記エチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジン、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾールの濃度は４００ｍＭおよび水６００ｍＭであった。
【０１０６】
得られた化学式（７）の官能基が固定化された２枚のガラス基板上に、ｐＨ３で、５’末端がＣｙ３と標識された配列番号１のＤＮＡと反応させた。反応は、前記ＤＮＡ １μＭを含む０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を基板上に添加してふたをして覆い、室温で１分間放置することによって行われた。反応後、一方のガラス基板は０．１５Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ３で洗浄し、他方のガラス基板はｐＨ７．９で洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ ３５０）でＡｘｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（米国・ＧｅｎｅＰｉｘ社）を使用して蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定結果を下記表１に表した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
表１に表したように、ＤＮＡの回収率は、実験群１および２で対照群に比べて顕著に高かった。
実施例２：化学式（７）の基が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では実施例１と同じ方法で製作された化学式（７）の各官能基が固定化された１枚の基板を用いた。本実施例では、ｐＨ３でＤＮＡを結合させ、洗浄した後、ｐＨ３で蛍光強度を測定した。その後、基板を再度洗浄し、ｐＨ７．９で蛍光強度を測定した。
【０１０９】
その結果、測定された蛍光強度は、下記表２のようである。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
表２に示したように、実験群１及実験群２の基板を利用する場合、対照群１に比べて顕著に優れた回収率を表した。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のアミノ基とカルボキシル基とを含んで第１ｐＨで正電荷を帯びる物質を利用して核酸を分離する方法、および該方法に使われうる核酸分離用の固体基板は、例えば、試料分析関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ基とカルボキシル基とを含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる物質を利用して核酸を分離する方法、およびそれに使われうる核酸分離用の固体基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＨ依存性イオン交換マトリックスを利用した核酸の分離方法が公知である。例えば、特許文献１には、イオン化可能な基を有している物質を利用する核酸の分離方法が開示されている。ここで、核酸と結合するようなイオン化可能な基は、第１ｐＨで正電荷を帯びており、イオン化可能な基を有する物質は、結合していた核酸を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで、放出する。イオン化可能な基を有する物質の例としては、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−トリヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、およびトリヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）などが含まれる。また、特許文献２には、シリカ磁性粒子と；芳香族炭化水素環、前記芳香族炭化水素環に共有的に付着しているスペーサ、および第１末端で前記シリカ磁性粒子に付着しており、第２末端で前記スペーサに付着しているリンカーアルキル鎖を有するリンカーを含む複数個の第１イオン交換配位子と、を含むｐＨ依存性イオン交換マトリックスを利用する核酸の分離方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許公開第２００１／００１８５１３号公報
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、前記従来技術によっても、イオン化可能な基を有する物質と核酸との結合速度が大きく、ｐＨを上昇させた場合核酸を放出する効率が高い物質は、依然として要求されている。この現状を鑑みて、本発明者らは、核酸とさらに速い速度で結合して迅速に核酸と吸着でき、ｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率が顕著に高い物質を探索していたところ、カルボキシル基とアミノ基とをいずれも含む二官能性物質を発見して本発明を完成するに至った。
【０００４】
すなわち、本発明の目的は、核酸との結合速度が速く、かつｐＨを上昇させたときに核酸の放出効率の高い物質を利用し、核酸を迅速、かつ効率的に分離する方法を提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的は、前記方法に使われうる核酸分離用の固体基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて、前記核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、を含み、前記二官能性物質は、下記化学式（１）、または、下記化学式（２）で表されることを特徴とする、核酸の分離方法を提供する：
【０００７】
【化１】
【０００８】
前記化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【０００９】
【化２】
【００１０】
【化３】
【００１１】
(式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００１２】
【化４】
【００１３】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００１４】
【化５】
【００１５】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【００１６】
【化６】
【００１７】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍは１〜１０の整数であり、Ｙ’は窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００１８】
前記他の目的を達成するために、本発明は、 核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固定化されている固体基板とを、前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固体基板に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記固体基板上に固定化される官能基が、下記化学式（３）または下記化学式（４）で表されることを特徴とする核酸の分離方法を提供する。：
【００１９】
【化７】
【００２０】
前記化学式（３）中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【００２１】
【化８】
【００２２】
【化９】
【００２３】
（式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００２６】
【化１１】
【００２７】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【００２８】
【化１２】
【００２９】
前記化学式（４）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり；Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００３０】
前記他の目的を達成するために、本発明は、固体基板上に前記化学式（３）または（４）で表される官能基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板を提供する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の核酸分離方法によれば、迅速、かつ効率的に核酸を分離できる。また、本発明の固体基板を用いることにより、迅速、かつ効率的に核酸を分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の第一は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、を含み、前記二官能性物質は、下記化学式（１）で表される。
【００３３】
【化１３】
【００３４】
化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり、好ましくはｎおよびｎ’が１〜３である。なお、ｎおよびｎ’は、同一であっても、異なるものであってもよい。また、化学式（１）中、Ａは、下記化学式
【００３５】
【化１４】
【００３６】
【化１５】
【００３７】
(式中、ｘはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００３８】
【化１６】
【００３９】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００４０】
【化１７】
【００４１】
のいずれか１つで表される基である。さらに、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。
【００４２】
前記二官能性物質は、また下記化学式（２）でも表される。
【００４３】
【化１８】
【００４４】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）である。また、Ｒ１としては同種のもののみが存在してもよいし、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’の２種が存在していてもよい。Ｒ2も同様である。また前記化学式（２）中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基である。Ｒ３は同種のもののみが存在してもよいし、２種以上が存在していてもよい。ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００４５】
化学式（１）または（２）で表される二官能性物質は、１種のみを用いてもよいし、また２種以上を混合して用いることもできる。
【００４６】
前記化学式（１）で、Ａは、２個のカルボキシル基と２個のカルボニル基とを含み、好ましくは、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，２’，３，３’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）エーテル二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルホン二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，２，５，６−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−ヘキサフルオロプロパン二無水物、シクロブタンテトラカルボン酸二無水物、メチルシクロブタンテトラカルボン酸二無水物、および１，２，３，４−テトラカルボキシブタン二無水物からなる群から選択されるテトラカルボン酸二無水物の誘導体由来の二価の基である。前記カルボニル基は、それぞれ化学式（１）中の−ＮＨと結合している。
【００４７】
前記化学式（１）において、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。好ましくは、前記Ｙは、ピリジニルまたはイミダゾリル基であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００４８】
前記化学式（２）において、Ｒ１および／またはＲ２が、Ｙ’が−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’である場合、Ｙ’は、好ましくは、ピリジニル基またはイミダゾリル基であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００４９】
本発明の核酸分離方法は、核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて核酸を前記二官能性物質に結合させるステップを含む。前記試料には、核酸を含むもの、例えば、血液および細胞を含む溶液のような生物学的試料またはＰＣＲ産物を含む溶液のような化学的核酸溶液が含まれる。
【００５０】
本発明において、試料中の核酸が結合される物質の一実施形態は、アミノ基とカルボキシル基とを含む物質であって第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質である。
【００５１】
本発明の一具体例で、前記二官能性物質は、前記化学式（１）で、ｎおよびは、１〜１０の整数、好ましくはｎが１〜３の整数であり、Ａは、
【００５２】
【化１９】
【００５３】
のいずれか１つであり、Ｙは、
【００５４】
【化２０】
【００５５】
のいずれか１つである前記化学式（１）である。
【００５６】
また、他の具体例は、前記化学式（２）で、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数、好ましくはｍが１〜３の整数であり、Ｙ’が
【００５７】
【化２１】
【００５８】
のいずれか１つである）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である前記化学式（１）である。
【００５９】
化学式（１）の化合物と化学式（２）の化合物は、アミノ基とカルボキシル基とをそれぞれ有する化合物である。化学式（１）の化合物は、好ましくは第１ｐＨで正電荷と負電荷とが約２：１の割合で含まれることが好ましい。また、前記化学式（２）の化合物は、好ましくは、−ＯＨと、−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’とが、モル比で１：１〜３：１の割合で含まれている化合物である。
【００６０】
本発明において、化学式（１）の化合物は、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物のようなテトラカルボン酸二無水物、および４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾールのようなｎが１〜１０の整数であり、Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＹを化学反応させることによって得られる。また、化学式（２）の化合物は、下記化学式（５）の化合物と、ＮＨ２（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’は、窒素含有ヘテロ環塩基である）と、を化学反応させることによって得られる：
【００６１】
【化２２】
【００６２】
式中、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。その結果得られる化学式（２）の化合物のうち、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との比率は、反応物中の−ＯＨとＮＨ２（ＣＨ２）ｍＹ’の量を調節することによって調整することができる。
【００６３】
前記化学式（５）の好ましい一例は下記化学式（６）の化合物である：
【００６４】
【化２３】
【００６５】
式中、ｐは１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【００６６】
化学式（５）の化合物は、ポリ無水物である。前記ポリ無水物は、遠心分離のような分離工程によって溶液から容易に分離されうる。したがって、核酸と、前記ポリ無水物から得られる化学式（２）の重合体とを結合させて得られる核酸−二官能性物質の複合体を溶液から分離し、分離された核酸−二官能性物質の複合体を第２ｐＨで溶出させることによって、核酸が容易に前記複合体から分離されうる。
【００６７】
本発明の第二は、下記化学式（３）で表される官能基が固定化されている固体基板である。
【００６８】
【化２４】
【００６９】
式中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【００７０】
【化２５】
【００７１】
【化２６】
【００７２】
（式中、ｘはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【００７３】
【化２７】
【００７４】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【００７５】
【化２８】
【００７６】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である。
【００７７】
または、下記化学式（４）で表される官能基が固定化されている固体基板である。
【００７８】
【化２９】
【００７９】
式中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’基（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である。なお、上記化学式（４）中、Ｒ１としては同種のもののみが存在してもよいし、−ＯＨ、または−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’の２種が存在していてもよい。Ｒ2も同様である。また、Ｒ３は同種のもののみが存在してもよいし、２種以上が存在していてもよい。
【００８０】
化学式（３）または（４）で表される官能基は、１種のみを固体基板への固定化に用いてもよいし、また２種以上を用いることもできる。
【００８１】
前記化学式（３）中、好ましくは、ｎは、１〜１０の整数であり、Ａは、
【００８２】
【化３０】
【００８３】
のいずれか１つであり、Ｙは、
【００８４】
【化３１】
【００８５】
のいずれか１つである官能基である。
【００８６】
また、前記化学式（４）中、好ましくは、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、Ｙ’が
【００８７】
【化３２】
【００８８】
のいずれか１つであり、ｍは１〜１０の整数である）であり、Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、ｌは、１〜３０，０００の整数の官能基である。
【００８９】
前記化学式（４）の好ましい一例は下記化学式（７）
【００９０】
【化３３】
【００９１】
で表される基である（式中、ｐは１〜１０の整数であり、ｌは、１〜３０，０００の整数である）。また、好ましくは、前記化学式（４）中の−ＯＨと、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である官能基である。
【００９２】
本発明の前記実施形態で、前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質から選択されうるが、それらの例に限定されるものではない。また、前記固体基板は、任意の形態を有したものでありうる。例えば、球形、板状または無晶形の形状を有するものでありうるが、これらの例に限定されるものではない。また、前記固体基板は、化学式（３）または化学式（４）で表される基を固定化するために、活性化されていることもある。例えば、アミノ基のような活性基がコーティングされている基板でありうる。
【００９３】
本発明において、固体基板上に化学式（３）または化学式（４）の各化合物が固定化される固体基板は、当業界に公知の任意の固定化方法によって製造することができる。例えば、ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２のようなアミノ基でコーティングされている固体基板（例えば、シリコン、ガラスまたはプラスチック物質から構成される）に１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸二無水物のようなテトラカルボン酸二無水物を化学反応させて基板上に固定化した後、ｎが１〜１０の整数であり、Ｙが窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｎＹで表される化合物（例えば、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）を化学反応させることによって製造することができる。また、化学式（４）の官能基が固定化されている固体基板は、例えば、化学式（５）のポリ無水物を、アミノ基がコーティングされている基板上に化学反応させることによって固定化した後、ｐが１〜１０の整数であり、Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基であるＮＨ２（ＣＨ２）ｐＹ’の化合物（例えば、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）を化学反応させることによって製造することができる。
【００９４】
本発明において、試料中の核酸が結合される物質の他の実施形態は、上記のようにして得られる固体基板である。結合されうる核酸は、前記二官能性物質のところで述べた通りである。
【００９５】
本発明は、また固体基板上に上記化学式（３）または化学式（４）で表される基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板を提供し、さらにこれを利用した核酸の分離方法を提供する。
【００９６】
本発明において、前記第１ｐＨは、化学式（１）の化合物および化学式（２）の化合物または化学式（３）および化学式（４）の基内のカルボキシル基のｐＫａ値より低いｐＨが好ましい。具体的に、前記第１ｐＨは２〜３．５であるが、これらの例に限定されるものではない。
【００９７】
本発明の方法は、得られた核酸−二官能性物質複合体または核酸−官能基が固定化された固体基板複合体から前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで核酸を分離するステップを含む。この際、核酸を分離させるステップは、前記複合体を混合物から分離し、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液中から溶出するステップを含む。
【００９８】
第２ｐＨは前記第１ｐＨより高ければ、いかなる値でも可能であるが、好ましくは、５〜１０である。前記核酸−物質複合体を溶出するために使われる溶液は、水およびバッファなどでありうる。
【００９９】
本発明の核酸分離用の固体基板は、第１ｐＨで正電荷を有し、第２ｐＨに負電荷を有するだけではなく、第１ｐＨで核酸と結合する場合に速く結合し、第２ｐＨで核酸を効率的に放出させることができる特性を有している。したがって、本発明の核酸分離用の固体基板は、試料中の核酸を分離するのに有用に使われうる。
【実施例】
【０１００】
以下、本発明を実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【０１０１】
実施例１：化学式（７）の基が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では、下記化学式（７）の官能基が固定化された固体基板を製造し、第１ｐＨでＤＮＡを結合させた後、第２ｐＨで、前記ＤＮＡ−基板複合体から核酸を回収した。
【０１０２】
本実施例で使われた下記化学式（７）の官能基は、
【０１０３】
【化３４】
【０１０４】
式中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨ、および−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２（対照群）、４−（アミノメチル）ピリジニル（実験群１）、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾリル（実験群２）基から選択され、ｐは２であり、ｌは、約２０００であり、Ｒ１とＲ２中の−ＯＨ基と、−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’基との比率は、約２：１であった。
【０１０５】
基板上への前記化学式（７）で表される官能基の固定化は、次の通り行った。まず、アミノ基でコーティングされたガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＧＡＰＳ ｇｌａｓｓ、コーニング社）基板を溶媒がＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）である２００ｍＭ（反復単位基準）のポリ無水物（エチレン−無水マレイン酸交互共重合体）（分子量Ｍｗ １００，０００−５０００，０００）に室温で１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。得られた前記ポリ無水物が結合されたガラス基板をＮＭＰ中のエチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジンまたは１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（濃度は、モル比であり、エチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジン、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾール：Ｈ２Ｏ＝４：６）中に室温で１時間浸漬した後、エタノールで洗浄して乾燥した。前記エチレンジアミン、４−（アミノメチル）ピリジン、または１−（３−アミノプロピル）イミダゾールの濃度は４００ｍＭおよび水６００ｍＭであった。
【０１０６】
得られた化学式（７）の官能基が固定化された２枚のガラス基板上に、ｐＨ３で、５’末端がＣｙ３と標識された配列番号１のＤＮＡと反応させた。反応は、前記ＤＮＡ １μＭを含む０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液を基板上に添加してふたをして覆い、室温で１分間放置することによって行われた。反応後、一方のガラス基板は０．１５Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ３で洗浄し、他方のガラス基板はｐＨ７．９で洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ ３５０）でＡｘｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ（米国・ＧｅｎｅＰｉｘ社）を使用して蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定結果を下記表１に表した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
表１に表したように、ＤＮＡの回収率は、実験群１および２で対照群に比べて顕著に高かった。
実施例２：化学式（７）の基が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では実施例１と同じ方法で製作された化学式（７）の各官能基が固定化された１枚の基板を用いた。本実施例では、ｐＨ３でＤＮＡを結合させ、洗浄した後、ｐＨ３で蛍光強度を測定した。その後、基板を再度洗浄し、ｐＨ７．９で蛍光強度を測定した。
【０１０９】
その結果、測定された蛍光強度は、下記表２のようである。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
表２に示したように、実験群１及実験群２の基板を利用する場合、対照群１に比べて顕著に優れた回収率を表した。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のアミノ基とカルボキシル基とを含んで第１ｐＨで正電荷を帯びる物質を利用して核酸を分離する方法、および該方法に使われうる核酸分離用の固体基板は、例えば、試料分析関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて、前記核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記二官能性物質は、下記化学式（１）、または、下記化学式（２）で表されることを特徴とする、核酸の分離方法：
【化１】
前記化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【化２】
【化３】
(式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【化４】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【化５】
で表される基のいずれか１つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【化６】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍは１〜１０の整数であり、Ｙ’は窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【請求項２】
前記二官能性物質は、前記化学式（１）中のｎおよびｎ’が、１〜１０の整数であり；Ａが、下記化学式
【化７】
で表される基のいずれか１つであり；Ｙが、
【化８】
で表される基のいずれか1つである前記化学式（１）、または、
前記化学式（２）中のＲ１とＲ２が、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が
【化９】
で表される基のいずれか１つである）であり；Ｒ３が、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌが、１〜３０，０００の整数である前記化学式（２）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸を放出させるステップは、核酸−二官能性物質の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨである溶液中で前記核酸を溶出するステップを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１ｐＨは２〜３．５であり、前記第２ｐＨは５〜１０である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記化学式（２）中の、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固定化されている固体基板とを、前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固体基板に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記固体基板上に固定化される官能基が、下記化学式（３）または下記化学式（４）で表されることを特徴とする核酸の分離方法：
【化１０】
前記化学式（３）中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【化１１】
【化１２】
（式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【化１３】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【化１４】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【化１５】
前記化学式（４）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり；Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【請求項７】
前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸を放出させるステップは、核酸−官能基が固定化された固体基板の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨである溶液中で前記核酸を溶出するステップを含む請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１ｐＨは２〜３．５であり、前記第２ｐＨは５〜１０である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学式（４）中、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固体基板上に前記化学式（３）または（４）で表される官能基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板。
【請求項１２】
前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の固体基板。
【請求項１３】
前記化学式（４）中の、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１の割合である請求項１１または請求項１２に記載の固体基板。
【請求項１】
核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる二官能性物質とを、前記第１ｐＨで接触させて、前記核酸を前記二官能性物質に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記二官能性物質は、下記化学式（１）、または、下記化学式（２）で表されることを特徴とする、核酸の分離方法：
【化１】
前記化学式（１）中、ｎおよびｎ’は、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【化２】
【化３】
(式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【化４】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【化５】
で表される基のいずれか１つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【化６】
前記化学式（２）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍは１〜１０の整数であり、Ｙ’は窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【請求項２】
前記二官能性物質は、前記化学式（１）中のｎおよびｎ’が、１〜１０の整数であり；Ａが、下記化学式
【化７】
で表される基のいずれか１つであり；Ｙが、
【化８】
で表される基のいずれか1つである前記化学式（１）、または、
前記化学式（２）中のＲ１とＲ２が、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり、Ｙ’が
【化９】
で表される基のいずれか１つである）であり；Ｒ３が、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌが、１〜３０，０００の整数である前記化学式（２）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸を放出させるステップは、核酸−二官能性物質の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨである溶液中で前記核酸を溶出するステップを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１ｐＨは２〜３．５であり、前記第２ｐＨは５〜１０である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記化学式（２）中の、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
核酸を含む試料と、アミノ基およびカルボキシル基を含み、第１ｐＨで正電荷を帯びる官能基が固定化されている固体基板とを、前記第１ｐＨで接触させ、前記核酸を前記固体基板に結合させるステップと、
結合している前記核酸を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨで放出させるステップと、
を含み、
前記固体基板上に固定化される官能基が、下記化学式（３）または下記化学式（４）で表されることを特徴とする核酸の分離方法：
【化１０】
前記化学式（３）中、ｎは、１〜１０の整数であり；Ａは、下記化学式
【化１１】
【化１２】
（式中、ＸはＯ、ＣＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２またはＣ（ＣＦ３）２である）、
【化１３】
（式中、カルボニル基とカルボキシル基との置換位置は、環連結部を除いては、任意の位置の炭素でありうる）、
【化１４】
で表される基のいずれか一つであり；Ｙは、窒素含有ヘテロ環塩基である：
【化１５】
前記化学式（４）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じであるか、または異なり、−ＯＨまたは−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’（この際、ｍが１〜１０の整数であり；Ｙ’が窒素含有ヘテロ環塩基である）であり；Ｒ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり；ｌは、１〜３０，０００の整数である。
【請求項７】
前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸を放出させるステップは、核酸−官能基が固定化された固体基板の複合体を混合物から分離して、前記第２ｐＨである溶液中で前記核酸を溶出するステップを含む請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１ｐＨは２〜３．５であり、前記第２ｐＨは５〜１０である請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学式（４）中、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１である請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固体基板上に前記化学式（３）または（４）で表される官能基が固定化されていることを特徴とする核酸分離用の固体基板。
【請求項１２】
前記固体基板を構成する材料は、シリコン、ガラスおよびプラスチック物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の固体基板。
【請求項１３】
前記化学式（４）中の、−ＯＨと−ＮＨ（ＣＨ２）ｐＹ’との割合が、モル比で１：１〜３：１の割合である請求項１１または請求項１２に記載の固体基板。
【公開番号】特開２００６−２８８３９８（Ｐ２００６−２８８３９８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０８９３４（Ｐ２００６−１０８９３４）
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]