核酸増幅法
【課題】核酸増幅反応特にＰＣＲの多重反応において、プライマー二量体の形成を抑制或いは排除し、増殖特異性を高めるための方法を提供する。
【解決手段】増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において、標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触させる方法。
【解決手段】増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において、標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を増幅するための方法、特に感染性微生物の診断テストにおける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により核酸配列を増幅するためには、標的核酸内部の異なる配列にハイブリダイズする少なくとも二種のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが必要である。一般に、３’端の配列に相同性がある複数のオリゴヌクレオチドの使用は避けることが望ましい。相同３’端を有するプライマーは互いにハイブリダイズし合う可能性があり、プライマー二量体をはじめとする各種の増幅アーチファクトをもたらすことになる。
【０００３】
３’端が相補的であるプライマーのハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ反応成分のすべてを混合した後、増幅開始前に、反応混合物中にマグネシウムが存在することにより低温においてプライマー対合体が安定化するために起こり得る。プライマー二量体の形成は、室温又はこれより低温で、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー対合体の伸長によって起こる。生じるプライマー二量体産物はＰＣＲにおいて増幅され、プライマー及びポリメラーゼをめぐり標的核酸と競争する。最初の段階で十分なプライマー二量体産物が形成されてしまうと、後続のＰＣＲ増幅においてこの産物が選定した標的を凌駕してしまい、（１）偽陰性結果、すなわち当該試料には特定の配列が実際には存在するのに含まれないように見えること、或いは（２）「ノー・テスト」結果、すなわち内部陽性対照からのシグナルがまったく得られないこと、をもたらす場合がある。
【０００４】
プライマーセットの一次配列の他、プライマー二量体形成に寄与する主要因子として、アッセイ特異的マスター混合物（ＡＳＭＭ）に含まれるプライマーのモル量が多いこと；反応体の添加順序（例えば、ＡＳＭＭ、ＭｇＣｌ２ 溶液、標的／試料の順に添加するとプライマー二量体の形成が増加する）；ＡＳＭＭへのＭｇＣｌ２ の添加と標的の添加との間のインキュベーション期間；並びに、ＰＣＲ熱サイクルを開始する前の、完全な増幅反応混合物、すなわち、標的及びポリメラーゼをはじめとする増幅に必要な成分のすべてを含むもの、をインキュベートする時間、が挙げられる。
【０００５】
プライマーとポリメラーゼの核酸増幅用混合物におけるプライマー二量体の形成を抑制するための方法がいくつか知られている。それらの方法には以下のものが含まれる。
１．個別具体的な反応混合物において各ＰＣＲプライマーを他のすべてのプライマーとの３’端の相同性が最も低くなるように注意して設計する方法。しかしながら、この方法は、多重反応、すなわち異なる標的核酸配列に向けた数種類の増幅プライマー対を含む反応においては困難となる。さらに、プライマー対が単一の場合でも、例えば、同定領域又は保存領域のような別の拘束因子により達成が困難となる場合もある。
【０００６】
２．プライマー二量体の形成に利用され得る時間を短縮するため、アッセイ特異的反応混合物を調製した後すぐに熱サイクル／増幅反応を実行する方法。しかしながら、実用上、特に多数の試料をスクリーニングする場合には、この方法では困難な場合がある。
３．潜在的なプライマー二量体を不安定化するために試薬の添加順序を変更する方法。例えば、ＭｇＣｌ２ を最後の成分として添加すると、プライマー二量体の形成を抑制することができる。しかしながら、この方法は、（１）プライマー二量体の形成を排除するものではない、（２）不便である、そして（３）試料の標的で塩化マグネシウム溶液が汚染される可能性がある、という理由で望ましくはない。
【０００７】
４．プライマー対合体が形成し得る温度においてポリメラーゼ活性を阻害するが高温では不活化される抗ポリメラーゼ抗体である「引き金」抗体を使用する方法。したがって、ポリメラーゼは、プライマー二量体が形成できないような高温においてのみ活性化される（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８７，２８７号並びに欧州特許出願第０５９２０３５号参照）。しかしながら、抗体／ポリメラーゼの結合は平衡過程であるため、すべてのポリメラーゼを完全に結合させることはできない。このため、抗体系のＰＣＲ制御は、特に複雑な増幅反応においては、必ずしも１００％有効であるものではない。
【０００８】
５．高温開始型ＰＣＲを実施する方法（Chouら、Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992）。この方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを除く全成分を反応混合物に添加し、産物変性工程で反応を開始し、その後に反応管を開けて当該ポリメラーゼを反応混合物に添加するというものである。この方法は、プライマー二量体の形成を抑制する点では有効であるが、いくつかの理由から実用的ではない。最も顕著な理由として、取扱いが非常に煩わしく、アンプリコンのキャリオーバーの可能性を著しく増大させてしまうことが挙げられる。
【０００９】
６．加熱されるまでは比較的不活性であるAmpliTaq Gold のような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて高温開始型ＰＣＲを実施する方法（欧州特許出願第６２４６４１号及び米国特許第５，４９１，０８６号参照）。しかしながら、AmpliTaq Gold は低温において有意な残存酵素活性を保持するため、なおも副産物を生じる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの方法の中に、プライマー二量体の形成を成功裏に排除することが予測できるものはない。プライマーを慎重に設計し、Ｔａｑポリメラーゼとの組合せで引き金抗体又はAmpliTaq Gold を使用することで、プライマー二量体の形成を抑制することはできても、これを排除することはない。このように、当該技術分野では、ＰＣＲ反応、特に多重反応において、プライマー二量体の形成を一層抑制し、或いは排除するための改良法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標的核酸の増幅の特異性を高めるための方法を提供するものである。本発明は、標的に特異的なオリゴヌクレオチド増幅プライマーと核酸ポリメラーゼを要する反応のすべてに適用可能である。本発明は、一側面として、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及びポリメラーゼを接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１２】
別の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、その際に当該担体核酸の濃度を増幅反応混合物１ｍＬ当たり約１〜約１００μｇの範囲とし、そして当該プライマー／担体混合物に、約１００℃未満の温度で、標的核酸、Ｔａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１３】
また別の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制するための方法であって、一種又は二種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌクレオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラーゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１４】
第四の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に標的核酸、ポリメラーゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１５】
担体核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク核酸をはじめとし、どのような核酸でも使用することができる。当該担体をＤＮＡとすることが好ましく、そしてこれをウシ胸腺ＤＮＡとすることが最も好ましい。典型的には、最終増幅反応混合物中での濃度が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範囲となるように、担体を添加する。
【００１６】
本発明の方法は、増幅アッセイ中の非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制する点で特に有利である。本法は、特に、増幅反応混合物を、増幅反応の開始前に、標的核酸を変性させるのに要する温度よりも低い温度（すなわち、１００℃未満）において維持する場合に適用することができる。このような条件には、例えば、増幅反応混合物を、室温又は室温よりも若干低い温度において約１〜約２４時間維持するという場合が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、核酸増幅混合物に担体核酸を添加すると、標的核酸の増幅の効率及び特異性が相当に高くなるという発見に基づくものである。具体的には、本発明の方法は、熱サイクル工程において増幅混合物の温度を高める前のプライマー二量体の形成量を減少させることにより、増幅アッセイに際して非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制することとなる。
【００１８】
本発明の実施には、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及びタンパク生化学における多くの技術が使用され、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);及び Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)に説明がある。
【００１９】
本明細書中の用語「増幅反応混合物」は、少なくとも増幅プライマーと、標的核酸と、デオキシヌクレオチドと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩と、緩衝液とを、核酸増幅反応を進行させるに十分な量で含む増幅に十分な混合物をさす。
本明細書中の用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボ／ポリデオキシリボ混合型ヌクレオチドからなる任意の長さのプリン及びピリミジン含有ポリマーをさす。これには一本鎖及び二本鎖の分子、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの各バイブリッド、並びにアミノ酸骨格に塩基を複合化して形成される「タンパク核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。また、変性塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２０】
本明細書中の用語である「相補的な」核酸配列は、元の配列とのワトソン−クリック型塩基対合に関与するアンチセンス配列をさす。
【００２１】
本明細書中の用語「プライマー」は、目的の一本鎖核酸配列と二本鎖を形成し且つ、例えば、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼの使用により相補鎖の重合を可能ならしめるオリゴヌクレオチドであって、長さがヌクレオチド数で約６〜約５０、好ましくは約１２〜約２５、最も好ましくは約１２〜約１８の範囲にあるものをさす。
【００２２】
本明細書中の用語「増幅」は、核酸を複製するための反復工程をさす。好適な増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中の用語「標的核酸」は、そのサブ配列がＰＣＲ反応において増幅される核酸鋳型をさす。
【００２４】
内部陽性対照（ＩＰＣ）標的核酸は、プラスミドベクター中にクローン化され、その後典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用で線状化された合成核酸配列である。ＩＰＣは、典型的には、ジェネリックなプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を有し、核酸増幅反応において偽陰性結果に対するジェネリックな対照として働く。
【００２５】
好適な内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は以下の通りである。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明は、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の酵素的複製を開始するために標的核酸と共に一種又は二種以上のオリゴヌクレオチドをインキュベートする反応であればいずれのものに対しても適用することができる。このような反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれる。
【００２８】
これらの反応では、オリゴヌクレオチドプライマー、緩衝液及び塩、デオキシヌクレオチド並びにその他の任意成分を含有するアッセイ特異的マスター混合物を処方する。次いで、標的核酸を添加し、その後、反応を触媒する酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、及び／又は反応の進行に必要なマグネシウム塩、例えば、塩化マグネシウム、を添加する。
【００２９】
本発明の方法に用いるのに適した他の成分として、低温においてポリメラーゼに結合しこれを不活化するが、高温では自身が不活化されてポリメラーゼを活性化させることになる抗ポリメラーゼ抗体が含まれるが、これに限定されない。また、反応混合物にエキソヌクレアーゼやグリコシラーゼを含めてもよい。
【００３０】
本発明を実施する際、標的核酸、ポリメラーゼ又はマグネシウム塩との混合前に、オリゴヌクレオチドプライマーと担体核酸とを接触させる。
【００３１】
本発明による担体核酸は、原核生物又は真核生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、合成ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、又はランダム及び／又は特異的なＰＮＡ（ペプチド核酸）をはじめとする（これらに限定されない）任意の核酸を含むことができる。好ましくは、担体はＤＮＡ、最も好ましくはウシ胸腺ＤＮＡを含む。
【００３２】
本発明で使用するための担体核酸は常用方法により調製することができる。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは除タンパク処理により単離することができる。ＤＮＡは、例えば、Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185に記載のホスホルアミダイト固相担体法、Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078に記載の方法、その他の周知方法を用いて化学合成することができる。
【００３３】
本発明に用いられる核酸は、当該技術分野で知られている任意の手段により修飾することもできる。このような修飾の例として、メチル化、「キャップ」、天然ヌクレオチドの一又は二以上を類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート、等）又は荷電結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、等）で修飾したもの、が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は、一又は二以上の追加的な共有結合された部分、例えば、タンパク質（例、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン、等）、挿入体（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレート剤（例、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属、等）及びアルキル化剤を含むことができる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホルアミデート結合の形成により誘導体化されることができる。リン酸基の酸素原子の一又は二以上を硫黄原子に置き換えたチオール化増幅プライマーを、例えば、Eckstein et al., Ann, Rev. Biochem. 54:367 (1985); Zon et al., Anticancer Drug Design 6:539 (1991); 及びOlson et al., PNAS 83:1451 (1990) に記載の方法により合成することができる。
【００３４】
増幅反応体積における担体核酸の最終濃度が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範囲となるに十分な量の担体核酸をプライマー含有マスター混合物に添加する。当該反応におけるプライマーの典型量は約０．１Ｍ〜約１Ｍの範囲の濃度である。担体の最適量は具体的なアッセイについて個別に決定することができる。この決定は、標準化されたマスター混合物への担体核酸の添加量を増加させていき、標的核酸及び酵素を添加し、そして反応に引き続き、特異的増幅産物と非特異的増幅産物の量を監視することにより行うことができる（例えば、後述の例１を参照のこと）。
【００３５】
担体核酸は、標的核酸の添加前にオリゴヌクレオチドプライマーと混合することが好ましい。次いで、そのプライマー／担体混合物を標的核酸、当該増幅反応を触媒するポリメラーゼ及び当該ポリメラーゼの効率的作用に欠かせないマグネシウム塩と混合する。典型的には、その反応混合物を、増幅反応の開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持する。好ましくは、増幅を熱サイクルにより行い、そして混合物の温度を熱サイクルの開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持する。最も好ましくは、当該反応混合物を増幅反応の開始前にほぼ室温において維持する。
【００３６】
理論に拘束されることを望むものではないが、プライマー二量体の形成が抑制されるメカニズムとして異なるいくつかのものが考えられる。第一は、ポリメラーゼが担体核酸に結合するというものである。このことは、混合物にさらに抗ポリメラーゼ抗体を存在させる場合に特に有益である。抗ポリメラーゼ抗体が結合していないポリメラーゼ分子が担体核酸に結合されることにより、存在するかもしれない対合したプライマーが伸長する可能性を一層低くするからである。第二に、担体核酸は混合物中の対合したプライマーの数を減らすと考えられる。プライマーは担体ＤＮＡにも弱くアニールするためである。プライマーが担体核酸に結合することにより形成された非特異的伸長産物は、これらの非特異的部位のための対合プライマーが存在しないため、ＰＣＲの標的増幅段階において増幅されない。このため、プライマー二量体の形成（その他の非特異的核酸産物の形成）が抑制される。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明を限定することなく説明するものである。
実施例１：ＨＩＶ配列のＰＣＲ増幅に対する担体核酸の効果
ＨＩＶ増幅反応に担体核酸を添加した効果を監視するために以下の実験を実施した。
【００３８】
表１に示した１１種のプライマー、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、AmpliTaq、及び二種のAmpliTaq引き金抗体（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８７，２８７号；欧州特許第０５９２０３５号）を含有するマスター混合物を配合した。マスター混合物は、ウシ胸腺ＤＮＡを含まないものと含むものとを調製した（それぞれ第Ｉグループ、第IIグループ）。
【００３９】
【表１】
【００４０】
第Ｉグループ、第IIグループのアリコート各５０μＬに、２５μＬの１６ｍＭ ＭｇＣｌ２ を添加し、続いて２５μＬの標的混合物（２０ｍＭ ＮａＯＨに１３．３コピーの内部陽性対照標的核酸を含む）を添加した。各グループにつき、３種類の実験プロトコルを採用した。これを以下の表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
Ｉ（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体ＤＮＡは含まない
II（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体（ウシ胸腺）ＤＮＡを含む
【００４３】
反応混合物の一組（記号Ａで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール化されていないが、第二の組（記号Ｂで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール化されている。
【００４４】
すべての反応は２回繰り返した。混合物の７５μＬのアリコートをブランクの核酸パウチ（Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY)に添加した。ＰＣＲ増幅反応の条件は以下の通りとした。
【００４５】
（１）ＤＮＡ及びAmpliTaq引き金抗体を完全変性させるため９６℃３分間；
（２）９６℃５秒間に続く６２℃４０秒間を５サイクル；
（３）９６℃５秒間に続く６８℃４０秒間を３５サイクル。
増幅産物をパウチから取り出し、トリス−ホウ酸緩衝液中で４％アガロースゲル電気泳動法により分離した。増幅ＤＮＡ産物を臭化エチジウム染色法により検出した。
【００４６】
実験結果は、ゲルの写真において特異的（ＩＰＣ）産物及び非特異的産物（プライマー二量体その他の正しくないプライミング産物）の強度を目視検査することにより評価した（表３）。特異的及び非特異的な産物のバンド強度を０〜１０のスケールで目視評価した。ここで０は検出できるバンドが存在しないことを、そして１０は最大強度をそれぞれ表す。ＮＡは評価されなかったことを表す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
３種のサブセット（ａ〜ｃ）のすべてにおいて、第IIグループの増幅反応は、第Ｉグループと比較して、特異的産物のバンドは強く、非特異的産物のバンドは弱くなった。このことは、実験のＡ部（非チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても、実験のＢ部（チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても当てはまった。４種類のグループのすべてにおいて、熱サイクル工程の前に約４時間室温で混合物をインキュベーションすることを含み、プライマー二量体の形成により有利な条件を混合物に適用するほど（ａ〜ｃ）、プライマー二量体産物の量は増加し、そして特異的産物の量は減少した。Ｉ−ｃでは、唯一の可視ゲルバンドは強いプライマー二量体のバンドであった。対照的に、II−ｃの反応では、強い産物バンドが認められ、これに釣り合うようにプライマー二量体産物は非常に少なくなった。最後に、ＩＰＣプライマーのチオール化（Ｂ部）は、特異的産物の合成を若干増加させることとなったが、これは担体核酸を含むマスター混合物の配合によるほどの利益ではなかった。
【００４９】
全ての特許、出願、論文、刊行物、及び本明細書で記載の試験方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
当業者は、上記の詳細な説明に関して、本発明の多くの変形を提案するはずである。かかる明確な変形は、添付の特許請求の範囲で十分意図される範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸を増幅するための方法、特に感染性微生物の診断テストにおける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により核酸配列を増幅するためには、標的核酸内部の異なる配列にハイブリダイズする少なくとも二種のオリゴヌクレオチド増幅プライマーが必要である。一般に、３’端の配列に相同性がある複数のオリゴヌクレオチドの使用は避けることが望ましい。相同３’端を有するプライマーは互いにハイブリダイズし合う可能性があり、プライマー二量体をはじめとする各種の増幅アーチファクトをもたらすことになる。
【０００３】
３’端が相補的であるプライマーのハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ反応成分のすべてを混合した後、増幅開始前に、反応混合物中にマグネシウムが存在することにより低温においてプライマー対合体が安定化するために起こり得る。プライマー二量体の形成は、室温又はこれより低温で、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー対合体の伸長によって起こる。生じるプライマー二量体産物はＰＣＲにおいて増幅され、プライマー及びポリメラーゼをめぐり標的核酸と競争する。最初の段階で十分なプライマー二量体産物が形成されてしまうと、後続のＰＣＲ増幅においてこの産物が選定した標的を凌駕してしまい、（１）偽陰性結果、すなわち当該試料には特定の配列が実際には存在するのに含まれないように見えること、或いは（２）「ノー・テスト」結果、すなわち内部陽性対照からのシグナルがまったく得られないこと、をもたらす場合がある。
【０００４】
プライマーセットの一次配列の他、プライマー二量体形成に寄与する主要因子として、アッセイ特異的マスター混合物（ＡＳＭＭ）に含まれるプライマーのモル量が多いこと；反応体の添加順序（例えば、ＡＳＭＭ、ＭｇＣｌ２ 溶液、標的／試料の順に添加するとプライマー二量体の形成が増加する）；ＡＳＭＭへのＭｇＣｌ２ の添加と標的の添加との間のインキュベーション期間；並びに、ＰＣＲ熱サイクルを開始する前の、完全な増幅反応混合物、すなわち、標的及びポリメラーゼをはじめとする増幅に必要な成分のすべてを含むもの、をインキュベートする時間、が挙げられる。
【０００５】
プライマーとポリメラーゼの核酸増幅用混合物におけるプライマー二量体の形成を抑制するための方法がいくつか知られている。それらの方法には以下のものが含まれる。
１．個別具体的な反応混合物において各ＰＣＲプライマーを他のすべてのプライマーとの３’端の相同性が最も低くなるように注意して設計する方法。しかしながら、この方法は、多重反応、すなわち異なる標的核酸配列に向けた数種類の増幅プライマー対を含む反応においては困難となる。さらに、プライマー対が単一の場合でも、例えば、同定領域又は保存領域のような別の拘束因子により達成が困難となる場合もある。
【０００６】
２．プライマー二量体の形成に利用され得る時間を短縮するため、アッセイ特異的反応混合物を調製した後すぐに熱サイクル／増幅反応を実行する方法。しかしながら、実用上、特に多数の試料をスクリーニングする場合には、この方法では困難な場合がある。
３．潜在的なプライマー二量体を不安定化するために試薬の添加順序を変更する方法。例えば、ＭｇＣｌ２ を最後の成分として添加すると、プライマー二量体の形成を抑制することができる。しかしながら、この方法は、（１）プライマー二量体の形成を排除するものではない、（２）不便である、そして（３）試料の標的で塩化マグネシウム溶液が汚染される可能性がある、という理由で望ましくはない。
【０００７】
４．プライマー対合体が形成し得る温度においてポリメラーゼ活性を阻害するが高温では不活化される抗ポリメラーゼ抗体である「引き金」抗体を使用する方法。したがって、ポリメラーゼは、プライマー二量体が形成できないような高温においてのみ活性化される（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８７，２８７号並びに欧州特許出願第０５９２０３５号参照）。しかしながら、抗体／ポリメラーゼの結合は平衡過程であるため、すべてのポリメラーゼを完全に結合させることはできない。このため、抗体系のＰＣＲ制御は、特に複雑な増幅反応においては、必ずしも１００％有効であるものではない。
【０００８】
５．高温開始型ＰＣＲを実施する方法（Chouら、Nuc. Acids Res. 20:1717-1723, 1992）。この方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを除く全成分を反応混合物に添加し、産物変性工程で反応を開始し、その後に反応管を開けて当該ポリメラーゼを反応混合物に添加するというものである。この方法は、プライマー二量体の形成を抑制する点では有効であるが、いくつかの理由から実用的ではない。最も顕著な理由として、取扱いが非常に煩わしく、アンプリコンのキャリオーバーの可能性を著しく増大させてしまうことが挙げられる。
【０００９】
６．加熱されるまでは比較的不活性であるAmpliTaq Gold のような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて高温開始型ＰＣＲを実施する方法（欧州特許出願第６２４６４１号及び米国特許第５，４９１，０８６号参照）。しかしながら、AmpliTaq Gold は低温において有意な残存酵素活性を保持するため、なおも副産物を生じる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの方法の中に、プライマー二量体の形成を成功裏に排除することが予測できるものはない。プライマーを慎重に設計し、Ｔａｑポリメラーゼとの組合せで引き金抗体又はAmpliTaq Gold を使用することで、プライマー二量体の形成を抑制することはできても、これを排除することはない。このように、当該技術分野では、ＰＣＲ反応、特に多重反応において、プライマー二量体の形成を一層抑制し、或いは排除するための改良法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標的核酸の増幅の特異性を高めるための方法を提供するものである。本発明は、標的に特異的なオリゴヌクレオチド増幅プライマーと核酸ポリメラーゼを要する反応のすべてに適用可能である。本発明は、一側面として、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及びポリメラーゼを接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１２】
別の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、一種又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、その際に当該担体核酸の濃度を増幅反応混合物１ｍＬ当たり約１〜約１００μｇの範囲とし、そして当該プライマー／担体混合物に、約１００℃未満の温度で、標的核酸、Ｔａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１３】
また別の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制するための方法であって、一種又は二種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌクレオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラーゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１４】
第四の側面として、本発明は、増幅反応混合物として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法であって、一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして当該プライマー／担体混合物に標的核酸、ポリメラーゼ及びマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法に関する。
【００１５】
担体核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク核酸をはじめとし、どのような核酸でも使用することができる。当該担体をＤＮＡとすることが好ましく、そしてこれをウシ胸腺ＤＮＡとすることが最も好ましい。典型的には、最終増幅反応混合物中での濃度が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範囲となるように、担体を添加する。
【００１６】
本発明の方法は、増幅アッセイ中の非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制する点で特に有利である。本法は、特に、増幅反応混合物を、増幅反応の開始前に、標的核酸を変性させるのに要する温度よりも低い温度（すなわち、１００℃未満）において維持する場合に適用することができる。このような条件には、例えば、増幅反応混合物を、室温又は室温よりも若干低い温度において約１〜約２４時間維持するという場合が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、核酸増幅混合物に担体核酸を添加すると、標的核酸の増幅の効率及び特異性が相当に高くなるという発見に基づくものである。具体的には、本発明の方法は、熱サイクル工程において増幅混合物の温度を高める前のプライマー二量体の形成量を減少させることにより、増幅アッセイに際して非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制することとなる。
【００１８】
本発明の実施には、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及びタンパク生化学における多くの技術が使用され、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);及び Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)に説明がある。
【００１９】
本明細書中の用語「増幅反応混合物」は、少なくとも増幅プライマーと、標的核酸と、デオキシヌクレオチドと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩と、緩衝液とを、核酸増幅反応を進行させるに十分な量で含む増幅に十分な混合物をさす。
本明細書中の用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボ／ポリデオキシリボ混合型ヌクレオチドからなる任意の長さのプリン及びピリミジン含有ポリマーをさす。これには一本鎖及び二本鎖の分子、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの各バイブリッド、並びにアミノ酸骨格に塩基を複合化して形成される「タンパク核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。また、変性塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２０】
本明細書中の用語である「相補的な」核酸配列は、元の配列とのワトソン−クリック型塩基対合に関与するアンチセンス配列をさす。
【００２１】
本明細書中の用語「プライマー」は、目的の一本鎖核酸配列と二本鎖を形成し且つ、例えば、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼの使用により相補鎖の重合を可能ならしめるオリゴヌクレオチドであって、長さがヌクレオチド数で約６〜約５０、好ましくは約１２〜約２５、最も好ましくは約１２〜約１８の範囲にあるものをさす。
【００２２】
本明細書中の用語「増幅」は、核酸を複製するための反復工程をさす。好適な増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中の用語「標的核酸」は、そのサブ配列がＰＣＲ反応において増幅される核酸鋳型をさす。
【００２４】
内部陽性対照（ＩＰＣ）標的核酸は、プラスミドベクター中にクローン化され、その後典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用で線状化された合成核酸配列である。ＩＰＣは、典型的には、ジェネリックなプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結合配列を有し、核酸増幅反応において偽陰性結果に対するジェネリックな対照として働く。
【００２５】
好適な内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は以下の通りである。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明は、標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の酵素的複製を開始するために標的核酸と共に一種又は二種以上のオリゴヌクレオチドをインキュベートする反応であればいずれのものに対しても適用することができる。このような反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、核酸単一塩基増幅法及び転写介在型増幅法が含まれる。
【００２８】
これらの反応では、オリゴヌクレオチドプライマー、緩衝液及び塩、デオキシヌクレオチド並びにその他の任意成分を含有するアッセイ特異的マスター混合物を処方する。次いで、標的核酸を添加し、その後、反応を触媒する酵素、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、及び／又は反応の進行に必要なマグネシウム塩、例えば、塩化マグネシウム、を添加する。
【００２９】
本発明の方法に用いるのに適した他の成分として、低温においてポリメラーゼに結合しこれを不活化するが、高温では自身が不活化されてポリメラーゼを活性化させることになる抗ポリメラーゼ抗体が含まれるが、これに限定されない。また、反応混合物にエキソヌクレアーゼやグリコシラーゼを含めてもよい。
【００３０】
本発明を実施する際、標的核酸、ポリメラーゼ又はマグネシウム塩との混合前に、オリゴヌクレオチドプライマーと担体核酸とを接触させる。
【００３１】
本発明による担体核酸は、原核生物又は真核生物のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、合成ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、又はランダム及び／又は特異的なＰＮＡ（ペプチド核酸）をはじめとする（これらに限定されない）任意の核酸を含むことができる。好ましくは、担体はＤＮＡ、最も好ましくはウシ胸腺ＤＮＡを含む。
【００３２】
本発明で使用するための担体核酸は常用方法により調製することができる。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡは除タンパク処理により単離することができる。ＤＮＡは、例えば、Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185に記載のホスホルアミダイト固相担体法、Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078に記載の方法、その他の周知方法を用いて化学合成することができる。
【００３３】
本発明に用いられる核酸は、当該技術分野で知られている任意の手段により修飾することもできる。このような修飾の例として、メチル化、「キャップ」、天然ヌクレオチドの一又は二以上を類似体で置換すること、ヌクレオチド間修飾、例えば、無荷電結合（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート、等）又は荷電結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、等）で修飾したもの、が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は、一又は二以上の追加的な共有結合された部分、例えば、タンパク質（例、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン、等）、挿入体（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレート剤（例、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属、等）及びアルキル化剤を含むことができる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホルアミデート結合の形成により誘導体化されることができる。リン酸基の酸素原子の一又は二以上を硫黄原子に置き換えたチオール化増幅プライマーを、例えば、Eckstein et al., Ann, Rev. Biochem. 54:367 (1985); Zon et al., Anticancer Drug Design 6:539 (1991); 及びOlson et al., PNAS 83:1451 (1990) に記載の方法により合成することができる。
【００３４】
増幅反応体積における担体核酸の最終濃度が約１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜約７５μｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２５〜約５０μｇ／ｍＬの範囲となるに十分な量の担体核酸をプライマー含有マスター混合物に添加する。当該反応におけるプライマーの典型量は約０．１Ｍ〜約１Ｍの範囲の濃度である。担体の最適量は具体的なアッセイについて個別に決定することができる。この決定は、標準化されたマスター混合物への担体核酸の添加量を増加させていき、標的核酸及び酵素を添加し、そして反応に引き続き、特異的増幅産物と非特異的増幅産物の量を監視することにより行うことができる（例えば、後述の例１を参照のこと）。
【００３５】
担体核酸は、標的核酸の添加前にオリゴヌクレオチドプライマーと混合することが好ましい。次いで、そのプライマー／担体混合物を標的核酸、当該増幅反応を触媒するポリメラーゼ及び当該ポリメラーゼの効率的作用に欠かせないマグネシウム塩と混合する。典型的には、その反応混合物を、増幅反応の開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持する。好ましくは、増幅を熱サイクルにより行い、そして混合物の温度を熱サイクルの開始前に約９０〜約１００℃未満の温度に維持する。最も好ましくは、当該反応混合物を増幅反応の開始前にほぼ室温において維持する。
【００３６】
理論に拘束されることを望むものではないが、プライマー二量体の形成が抑制されるメカニズムとして異なるいくつかのものが考えられる。第一は、ポリメラーゼが担体核酸に結合するというものである。このことは、混合物にさらに抗ポリメラーゼ抗体を存在させる場合に特に有益である。抗ポリメラーゼ抗体が結合していないポリメラーゼ分子が担体核酸に結合されることにより、存在するかもしれない対合したプライマーが伸長する可能性を一層低くするからである。第二に、担体核酸は混合物中の対合したプライマーの数を減らすと考えられる。プライマーは担体ＤＮＡにも弱くアニールするためである。プライマーが担体核酸に結合することにより形成された非特異的伸長産物は、これらの非特異的部位のための対合プライマーが存在しないため、ＰＣＲの標的増幅段階において増幅されない。このため、プライマー二量体の形成（その他の非特異的核酸産物の形成）が抑制される。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は本発明を限定することなく説明するものである。
実施例１：ＨＩＶ配列のＰＣＲ増幅に対する担体核酸の効果
ＨＩＶ増幅反応に担体核酸を添加した効果を監視するために以下の実験を実施した。
【００３８】
表１に示した１１種のプライマー、トリス緩衝液、ｄＮＴＰ、AmpliTaq、及び二種のAmpliTaq引き金抗体（米国特許第５，３３８，６７１号及び同第５，５８７，２８７号；欧州特許第０５９２０３５号）を含有するマスター混合物を配合した。マスター混合物は、ウシ胸腺ＤＮＡを含まないものと含むものとを調製した（それぞれ第Ｉグループ、第IIグループ）。
【００３９】
【表１】
【００４０】
第Ｉグループ、第IIグループのアリコート各５０μＬに、２５μＬの１６ｍＭ ＭｇＣｌ２ を添加し、続いて２５μＬの標的混合物（２０ｍＭ ＮａＯＨに１３．３コピーの内部陽性対照標的核酸を含む）を添加した。各グループにつき、３種類の実験プロトコルを採用した。これを以下の表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
Ｉ（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体ＤＮＡは含まない
II（ａ，ｂ，ｃ）＝マスター混合物中に担体（ウシ胸腺）ＤＮＡを含む
【００４３】
反応混合物の一組（記号Ａで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール化されていないが、第二の組（記号Ｂで表す）では、ＩＰＣプライマーはチオール化されている。
【００４４】
すべての反応は２回繰り返した。混合物の７５μＬのアリコートをブランクの核酸パウチ（Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY)に添加した。ＰＣＲ増幅反応の条件は以下の通りとした。
【００４５】
（１）ＤＮＡ及びAmpliTaq引き金抗体を完全変性させるため９６℃３分間；
（２）９６℃５秒間に続く６２℃４０秒間を５サイクル；
（３）９６℃５秒間に続く６８℃４０秒間を３５サイクル。
増幅産物をパウチから取り出し、トリス−ホウ酸緩衝液中で４％アガロースゲル電気泳動法により分離した。増幅ＤＮＡ産物を臭化エチジウム染色法により検出した。
【００４６】
実験結果は、ゲルの写真において特異的（ＩＰＣ）産物及び非特異的産物（プライマー二量体その他の正しくないプライミング産物）の強度を目視検査することにより評価した（表３）。特異的及び非特異的な産物のバンド強度を０〜１０のスケールで目視評価した。ここで０は検出できるバンドが存在しないことを、そして１０は最大強度をそれぞれ表す。ＮＡは評価されなかったことを表す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
３種のサブセット（ａ〜ｃ）のすべてにおいて、第IIグループの増幅反応は、第Ｉグループと比較して、特異的産物のバンドは強く、非特異的産物のバンドは弱くなった。このことは、実験のＡ部（非チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても、実験のＢ部（チオール化ＩＰＣプライマーを使用）についても当てはまった。４種類のグループのすべてにおいて、熱サイクル工程の前に約４時間室温で混合物をインキュベーションすることを含み、プライマー二量体の形成により有利な条件を混合物に適用するほど（ａ〜ｃ）、プライマー二量体産物の量は増加し、そして特異的産物の量は減少した。Ｉ−ｃでは、唯一の可視ゲルバンドは強いプライマー二量体のバンドであった。対照的に、II−ｃの反応では、強い産物バンドが認められ、これに釣り合うようにプライマー二量体産物は非常に少なくなった。最後に、ＩＰＣプライマーのチオール化（Ｂ部）は、特異的産物の合成を若干増加させることとなったが、これは担体核酸を含むマスター混合物の配合によるほどの利益ではなかった。
【００４９】
全ての特許、出願、論文、刊行物、及び本明細書で記載の試験方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
当業者は、上記の詳細な説明に関して、本発明の多くの変形を提案するはずである。かかる明確な変形は、添付の特許請求の範囲で十分意図される範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、Ｔａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させ、さらに、
前記増幅反応における担体核酸の濃度を増幅反応体積１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲とすることを特徴とする方法。
【請求項１２】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制するための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌクレオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラーゼ及び一種又は二種以上のマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に前記標的核酸を接触させ、さらに
前記プライマー／担体混合物の調製後に、前記プライマーと、ポリメラーゼ、一種又は二種以上のマグネシウム塩及びこれらの混合物からなる群より選ばれた成分とを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記担体核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、緩衝剤、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記温度が室温である、請求項６に記載の方法。
【請求項３４】
前記温度が室温である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記温度が室温である、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、標的核酸と、核酸ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、一種又は二種以上のマグネシウム塩及び核酸ポリメラーゼを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、塩化マグネシウムとが含まれる増幅反応において標的核酸の増幅特異性を高めるための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のプライマーとウシ胸腺ＤＮＡを含む担体核酸とを含むプライマー／担体混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、Ｔａｑポリメラーゼ及び塩化マグネシウムを接触させ、さらに、
前記増幅反応における担体核酸の濃度を増幅反応体積１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲とすることを特徴とする方法。
【請求項１２】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応において非標的核酸のポリメラーゼ伸長を抑制するための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上の増幅プライマーと担体核酸とを含むオリゴヌクレオチドプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に、標的核酸、ポリメラーゼ及び一種又は二種以上のマグネシウム塩を接触させることを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
増幅反応試薬として標的核酸に特異的な一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド増幅プライマーと、ポリメラーゼと、一種又は二種以上のマグネシウム塩とが含まれる、標的核酸を増幅するための反応においてプライマー二量体その他の非特異的核酸増幅産物の形成を抑制するための方法であって、
（ａ）一種又は二種以上のプライマーと担体核酸とを含むプライマー／担体核酸混合物を調製し、そして
（ｂ）前記プライマー／担体混合物に前記標的核酸を接触させ、さらに
前記プライマー／担体混合物の調製後に、前記プライマーと、ポリメラーゼ、一種又は二種以上のマグネシウム塩及びこれらの混合物からなる群より選ばれた成分とを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記担体核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記担体核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡがウシ胸腺ＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり１〜１００μｇの範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記担体核酸の前記増幅反応における存在濃度が１ｍＬ当たり５〜７５μｇの範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物を、前記増幅反応の開始前に９０〜１００℃未満の温度で維持する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度を熱サイクルの開始前に維持する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記マグネシウム塩が塩化マグネシウムを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物がさらに、抗ポリメラーゼ抗体、緩衝剤、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、エキソヌクレアーゼ及びグリコシラーゼからなる群より選択された成分又はこれらの任意の組合せを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記温度が室温である、請求項６に記載の方法。
【請求項３４】
前記温度が室温である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記温度が室温である、請求項２８に記載の方法。
【公開番号】特開２０１１−１２０５９４（Ｐ２０１１−１２０５９４Ａ）
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２５０８（Ｐ２０１１−２５０８）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【分割の表示】特願２０００−３２６６０（Ｐ２０００−３２６６０）の分割
【原出願日】平成１２年２月３日（２０００．２．３）
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５０８（Ｐ２０１１−２５０８）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【分割の表示】特願２０００−３２６６０（Ｐ２０００−３２６６０）の分割
【原出願日】平成１２年２月３日（２０００．２．３）
【出願人】（５９４１９９３３７）オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド (14)
【Ｆターム（参考）】
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