核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
【課題】サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための技術の提供。
【解決手段】外部から液体が導入される導入口１と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域４１〜４９と、導入口１から導入される液体を各反応領域内に供給する流路２，３と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップＡを用いて、検出対象核酸鎖を含む溶液を流路２，３に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、を行う核酸定量方法。
【解決手段】外部から液体が導入される導入口１と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域４１〜４９と、導入口１から導入される液体を各反応領域内に供給する流路２，３と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップＡを用いて、検出対象核酸鎖を含む溶液を流路２，３に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、を行う核酸定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップに関する。より詳しくは、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための核酸定量方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法等の核酸増幅法が、感染症や遺伝性疾患の診断、遺伝子の発現量解析やクローニングなどのために用いられている。また、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、これらの蛍光強度の増加量に基づいて検出対象核酸鎖の増幅量をリアルタイムに測定し、当初の検出対象核酸鎖量を定量するリアルタイム核酸増幅法も行われている。
【０００３】
非特許文献１では、微量な核酸鎖を正確に定量するための「デジタルＰＣＲ」と称される技術が提案されている。デジタルＰＣＲでは、検出対象核酸鎖を含むサンプルを反応溶液中に限界希釈し、複数の反応場（ウェル）に分注して、ＰＣＲ反応を行なう。そして、蛍光プローブ等を用い、増幅産物に由来する蛍光を発するウェルの数を計数する。限界希釈によって各ウェルには最大１分子（コピー）の検出対象核酸鎖しか存在しないと仮定できるため、蛍光を発するウェルの数によってサンプルに含まれる検出対象核酸鎖のコピー数を定量できる。
【０００４】
特許文献１には、デジタルＰＣＲにおいて、反応場となるチャネルをプレートに数千〜数百万配設し、サンプルに含まれる検出対象核酸鎖が各チャネルに１コピーずつ入るようにした核酸定量方法が提案されている。この方法によれば、１つのチャネルに検出対象核酸鎖が２コピー以上入ってしまうことにより蛍光を発するウェルの数と検出対象核酸鎖のコピー数とが不一致となってしまうことがなく、検出対象核酸鎖のコピー数を正確に定量できるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２６９１９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Digital PCR" Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, Vol.96, p.9236-9241
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、デジタルＰＣＲでは、サンプル中の検出対象核酸鎖のコピー数を正確に定量できる。一方で、核酸鎖量の定量を目的とした核酸増幅法において、特に感染症の診断を行うような場合には、サンプル中の病原体ゲノムの凡その量を測定し、病原体が多いか少ないかを調べることによって、重症度や発症段階の判定に役立てたいという要求がある。また、このような半定量的な測定は、遺伝子の発現量解析において、ｍＲＮＡのコピー数を正確に測定することまでは要せず、ｍＲＮＡの発現量が多いか少ないかを調べたいような場合にも望ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本発明は、外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いて、検出対象核酸鎖を含む溶液を前記流路に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、を行う核酸定量方法を提供する。
この核酸定量方法では、特定された反応領域における核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、前記溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。すなわち、この核酸定量方法では、特定された反応領域が、核酸増幅反応がより起こり難く構成されたものである程、多くの検出対象核酸鎖が前記溶液に含まれていたと判定できる。
この核酸定量方法において、前記核酸増幅反応用マイクロチップは、前記反応領域の内容積が異なることにより、あるいは、前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたものを用いることができる。この際、前記反応領域内に予め収容されている反応に必要な物質は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は酵素とできる。
【００１０】
また、本発明は、外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。
この核酸増幅反応用マイクロチップは、前記反応領域の内容積が異なることにより、あるいは、前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成できる。
これら核酸増幅反応用マイクロチップにおいて、前記反応領域は、一本の前記流路によって、一の反応領域内に導入された液体が該流路に溢流して隣り合う他の一の反応領域に順次導入されるように配設されたものとできる。
【００１１】
本発明において、「核酸増幅反応」には、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる温度サイクルを伴うＰＣＲ反応と、温度を伴わない各種等温増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（transcription-reverse transcription concerted）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップＡの構成を説明するための上面模式図である。
【図２】マイクロチップＡの構成を説明するための断面模式図である。
【図３】本発明の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップＢの構成を説明するための上面模式図である。
【図４】マイクロチップＢのウェル内に存在する核酸増幅反応に必要な物質を説明するための模式図である。
【図５】本発明の変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップＣの構成を説明するための上面模式図である。
【図６】インフルエンザウイルスゲノムの定量を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序により行う。
１．本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
２．本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
３．本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
【００１５】
１．本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
図１及び図２は、本発明の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を説明する模式図である。図１は上面模式図、図２は図1中のＰ−Ｐ断面に対応する断面模式図である。
【００１６】
図中、符号Ａで示すマイクロチップには、外部から液体（サンプル溶液）が導入される導入口１と、一端において導入口１に連通する主流路２と、主流路２から分岐する分岐流路３と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル４１〜４９（反応領域）が配設されている。主流路２の他端は、サンプル溶液を外部に排出する排出口５に連通されている。分岐流路３は、主流路２の導入口１への連通部と排出口５への連通部との間において主流路２から分岐し、各ウェルに接続されている。なお、マイクロチップＡにおいて、排出口５は必須の構成とはならず、導入口１から導入されたサンプル溶液が外部に排出されない構成であってもよい。
【００１７】
導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液は、分岐流路３を通流して、導入口１近位（送液方向上流）のウェル４１内から排出口５近位（送液方向下流）のウェル４９内にまで順次導入される。サンプル液には、検出対象核酸鎖となるＤＮＡやゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。また、サンプル溶液には、核酸増幅反応に必要なオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」とも称する）や酵素、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液（バッファー）溶質などの試薬が含まれ得る。
【００１８】
ウェル４１〜４９は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、内容積が次第に小さくされており、ウェル内に導入されるサンプル溶液の容量が導入口１近位のウェルほど多く、排出口５近位のウェルほど少なくなるように構成されている。ウェル４１〜４９の内容積は、送液方向に従って、例えば０．９〜０．０１倍程度、好ましくは０．５〜０．１倍程度の範囲で順次小さくなるように形成される。
【００１９】
各ウェル内における核酸増幅反応の起こり易さ（反応効率）は、該ウェル内に導入される検出対象核酸鎖の量に依存し、各ウェル内に導入される検出対象核酸鎖の量は、該ウェル内に導入されるサンプル溶液の容量、すなわちウェルの内容積に依存する。そのため、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェルの内容積を次第に小さく構成することにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成できる。
【００２０】
マイクロチップＡは、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１〜４９及び排出口５を形成した基板層ａ１に基板層ａ２を貼り合わせて構成されている。基板層ａ１，ａ２の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とすることができる。ウェル内で増幅産物の検出を光学的に行う場合には、基板層ａ１，ａ２の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。なお、導入口１等は、基板層ａ２に形成されていてもよく、基板層ａ１及び基板層ａ２の両方に一部ずつ形成されていてもよい。また、マイクロチップを構成する基板層は２以上であってよい。
【００２１】
（２）核酸定量方法
次に、マイクロチップＡを用いた本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法について説明する。
【００２２】
まず、サンプル溶液を導入口１から主流路２に送液し、ウェル４１〜４９内に導入し、定法に従ってＰＣＲ反応やＬＡＭＰ反応などの核酸増幅反応を行なう。例えばＰＣＲ法では、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる所定の温度サイクルを実施することにより、核酸増幅反応を進行させる。また、例えばＬＡＭＰ法では、所定の反応温度に保持することにより、核酸増幅反応を進行させる。
【００２３】
上述のように、マイクロチップＡは、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェルの内容積を次第に小さく構成することにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成されている。従って、この手順では、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じ、逆に、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が少ない場合には、より送液方向上流のウェル内でしか反応が生じない。
【００２４】
次に、各ウェル内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じたウェルを特定する。増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、マイクロチップＡの蛍光像を撮像し、得られた画像を画像処理システムで解析し、各ウェル内の蛍光色素からの蛍光信号をウェル毎に自動計測することによって行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、上記画像を目視によって観察し、あるいは蛍光顕微鏡等を用いてマイクロチップＡを観察し、各ウェル内からの蛍光の有無を確認することによって行ってもよい。
【００２５】
最後に、特定されたウェルにおける核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定する。マイクロチップＡでは、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じる。そのため、核酸増幅反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量の多寡を判定できる。具体的には、ウェル４１，４２で核酸増幅反応が生じた場合には、ウェル４１でのみ反応が生じた場合に比べて、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。同様に、ウェル４１からより送液方向下流のウェルを含むウェルで核酸増幅反応が生じている程、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。
【００２６】
さらに、検出対象核酸鎖を既知量で含む溶液を用いて、検出対象核酸鎖量と核酸増幅反応が生じるウェル（あるいはその容量）との関係を予め取得しておけば、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量をより正確に測定できる。
【００２７】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたマイクロチップを用いて核酸増幅反応を行ない、反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。
【００２８】
本実施形態では、マイクロチップに縦横３例で合計９つのウェルを均等間隔で配設する場合を例として説明したが、ウェルの数や配設位置は任意とでき、ウェルの形状も図に示した円柱形状に限定されない。また、導入口１に導入されたサンプル溶液を各ウェル内に供給するための流路の構成も、図に示した主流路２及び分岐流路３の態様に限定されない。
【００２９】
また、本実施形態では、ウェルの面積を変化させて内容積を小さく（あるいは大きく）する場合を例として説明したが、ウェルの内容積は深さを変化させることにより小さくしてもよい。また、内容積を異ならせたウェルの配列順序は、送液方向上流のウェルから下流の順で次第に小さくなる態様に限定されないものとする。
【００３０】
２．本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
図３は、本発明の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を説明する上面模式図である。
【００３１】
図中、符号Ｂで示すマイクロチップには、外部からサンプル溶液が導入される導入口１と、一端において導入口１に連通する主流路２と、主流路２から分岐する分岐流路３と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル４１〜４９が配設されている。主流路２の他端は、サンプル溶液を外部に排出する排出口５に連通されている。分岐流路３は、主流路２の導入口１への連通部と排出口５への連通部との間において主流路２から分岐し、各ウェルに接続されている。なお、マイクロチップＢにおいて、排出口５は必須の構成とはならず、導入口１から導入されたサンプル溶液が外部に排出されない構成であってもよい。
【００３２】
導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液は、分岐流路３を通流して、導入口１近位（送液方向上流）のウェル４１内から排出口５近位（送液方向下流）のウェル４９内にまで順次導入される。サンプル液には、検出対象核酸鎖となるＤＮＡやゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。
【００３３】
ウェル４１〜４９内には、核酸等幅反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されている。ウェル内に予め収容される物質は、核酸等幅反応において増幅産物を得るために必要な物質であって、具体的には、プライマーや酵素、核酸モノマー、反応緩衝液溶質などとされる。ウェル内に収容される物質はこれらのうち１あるいは２以上とでき、残りの物質はサンプル液中に含まれて導入口１からウェル内に導入される。
【００３４】
図４に、ウェル内にプライマーと酵素を異なる量で収容した例を示す。ウェル４１〜４９は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、収容されるプライマーＰ及び酵素Ｅの量が次第に少なくなるようにされている。図では、ウェル４１，４２，４３について、積層されて収容されたプライマーＰ及び酵素Ｅの積層厚を次第に小さくすることにより量を変化させた場合を示した。
【００３５】
ウェル４１〜４９のプライマーＰ及び酵素Ｅの量は、送液方向に従って、例えば０．９〜０．０１倍程度、好ましくは０．５〜０．１倍程度の範囲で順次少なくなるように収容される。
【００３６】
各ウェル内における核酸増幅反応の起こり易さ（反応効率）は、該ウェル内に収容された反応に必要な物質の量に依存する。そのため、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェル内に収容するプライマーＰ及び酵素Ｅの量を次第に少なくすることにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成できる。
【００３７】
（２）核酸定量方法
次に、マイクロチップＢを用いた本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法について説明する。
【００３８】
まず、サンプル溶液を導入口１から主流路２に送液し、ウェル４１〜４９内に導入する。これによって、ウェル内に予め収容されている反応に必要な物質（ここでは、プライマーＰ及び酵素Ｅ）と、サンプル溶液に含まれる残りの物質を検出対象核酸鎖が混合される。サンプル溶液の導入後、定法に従ってＰＣＲ反応やＬＡＭＰ反応などの核酸増幅反応を行なう。例えばＰＣＲ法では、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる所定の温度サイクルを実施することにより、核酸増幅反応を進行させる。また、例えばＬＡＭＰ法では、所定の反応温度に保持することにより、核酸増幅反応を進行させる。
【００３９】
上述のように、マイクロチップＢは、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェル内に収容された反応に必要な物質の量を次第に少なくすることにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成されている。従って、この手順では、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じ、逆に、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が少ない場合には、より送液方向上流のウェル内でしか反応が生じない。
【００４０】
次に、各ウェル内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じたウェルを特定する。増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、マイクロチップＢの蛍光像を撮像し、得られた画像を画像処理システムで解析し、各ウェル内の蛍光色素からの蛍光信号をウェル毎に自動計測することによって行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、上記画像を目視によって観察し、あるいは蛍光顕微鏡等を用いてマイクロチップＢを観察し、各ウェル内からの蛍光の有無を確認することによって行ってもよい。
【００４１】
最後に、特定されたウェルにおける核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定する。マイクロチップＢでは、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じる。そのため、核酸増幅反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量の多寡を判定できる。具体的には、ウェル４１，４２で核酸増幅反応が生じた場合には、ウェル４１でのみ反応が生じた場合に比べて、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。同様に、ウェル４１からより送液方向下流のウェルを含むウェルで核酸増幅反応が生じている程、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。
【００４２】
さらに、検出対象核酸鎖を既知量で含む溶液を用いて、検出対象核酸鎖量と核酸増幅反応が生じるウェル（あるいはその容量）との関係を予め取得しておけば、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量をより正確に測定できる。
【００４３】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたマイクロチップを用いて核酸増幅反応を行ない、反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。
【００４４】
本実施形態においても、第一実施形態において説明したように、ウェルの数や配設位置は任意とでき、ウェルの形状も図に示した円柱形状に限定されない。また、収容する反応に必要な物質の量を異ならせたウェルの配列順序は、送液方向上流のウェルから下流の順で次第に少なくなる態様に限定されないものとする。
【００４５】
さらに、導入口１に導入されたサンプル溶液を各ウェル内に供給するための流路の構成も、図に示した主流路２及び分岐流路３の態様に限定されず、例えば図５に示すような分岐流路を有さない構成を採用してもよい。図５に示すマイクロチップＣでは、ウェル４１〜４９は、主流路２によって、一のウェル内に導入されたサンプル溶液が主流路２に溢流して隣り合う他の一のウェルに順次導入されるように連通されて配設されている。導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液はまず導入口１近位のウェル４１に充填され、ウェル４１から溢流したサンプル溶液が隣接するウェル４２内に導入される。同様にして、ウェル４２から溢流したサンプル溶液が送液方向下流のウェルに順次導入される。
【００４６】
マイクロチップＢは、マイクロチップＡと同様に、２枚の基板層の貼り合わせによって構成できる。核酸増幅反応に必要な物質のウェル内への収容は、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１〜４９及び排出口５の成型後、基板層の貼り合せ前に、ウェル内にプライマー溶液や酵素溶液等を滴下し乾燥させることによって行うことができる。
【００４７】
導入口１等の成型は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。
【００４８】
プライマー溶液や酵素溶液等の乾燥は、風乾、真空乾燥あるいは凍結乾燥等によって、好ましくは緩徐に行う。ウェル内に収容する物質を酵素とする場合には、活性の低下や失活を防止するため、滴下した酵素溶液は、臨界点乾燥により乾燥させることが好ましい。また、ウェル内には、増幅産物の検出のための蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブも収容しておいてよい。ここで、プライマー溶液や酵素溶液等の滴下及び乾燥の順序は特に限定されず、プライマーや酵素は図４に示したように積層されて収容される必要はないものとする。
【００４９】
基板層の貼り合わせは、例えば、基板層の表面を酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化して貼り合せる方法を採用できる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材料に応じて適宜な条件を設定して行う。
【００５０】
３．本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
次に、本発明の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）について説明する。ここで、本実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成については、収容される物質以外、第二実施形態に係るマイクロチップＢと実質的に同一であるため、図３を参照しながら以下説明する。
【００５１】
図中、本実施形態に係るマイクロチップでは、ウェル４１〜４９のうち、少なくとも１つのウェルが、補正用ウェルとして用いられるという点以外は、第二実施形態に係るマイクロチップと実質的に同一である。そのため、ここでは、補正用ウェルについて主に説明する。また、特に、ウェル４９が補正用ウェルとして用いられる場合を例に以下説明する。ここでいう、補正用ウェルとは、濃度が予め認識されている核酸鎖が収容されたウェルである。
【００５２】
補正用ウェルには、他のウェル４１〜４８と同様に酵素Ｅ及びプライマーＰが収容され、更に、濃度が予め認識されている補正用核酸鎖が収容されている。なお、サンプル液に含まれる検出対象核酸鎖と、補正用核酸鎖とは、同一の配列であっても一部同一の配列であってもよい。検出対象核酸鎖と、補正用核酸鎖とが同一の配列の場合、例えば、検出対象核酸鎖にＲＮＡ、補正用核酸鎖にＤＮＡを用い、ウェル４１〜４８には、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼを収容し、補正用ウェルには、ＤＮＡポリメラーゼを収容する。一方、補正用核酸鎖と、補正用核酸鎖とが一部のみ同一の配列の場合、補正用ウェル及び他のウェル４１〜４８には、夫々に対応する異なるプライマーを収容すればよい。
【００５３】
（２）核酸定量方法
次に、本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法について説明する。なお、第三実施形態に係る核酸定量方法は、第二実施形態に係る核酸定量方法と比し、ウェル４１〜４９のうち、ウェル４９が補正用ウェルとして用いられる点以外は、実質的に同一であるため、ここでは、補正用ウェルが用いられる点についてのみ説明する。
【００５４】
すなわち、導入口１から送液したサンプル溶液は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で導入され、核酸増幅反応が進行する。そして、補正用ウェルでは、予め濃度が認識されている補正用核酸鎖の核酸増幅反応が進行する。次に、増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行う。
【００５５】
各ウェル４１〜４９に導入されるサンプル溶液には、夾雑物や反応阻害物等が含まれている可能性がある。そのため、上記夾雑物や反応阻害物等が、反応効率に影響を与え、測定のばらつきの要因となる。この点、本実施形態に係るマイクロチップでは、濃度が予め認識されている補正用核酸鎖が収容された補正用ウェルを設けているので、上記ばらつきを補正して蛍光の強度等から増幅産物の濃度の認識を可能にする。
【００５６】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、マイクロチップの１又は複数のウェルを補正用ウェルとして用いるため、検出対象核酸鎖を含むサンプル溶液中の夾雑物、反応阻害物等の影響を把握することができる。より具体的には、サンプル内の検出対象核酸鎖の量が同じでもサンプルに由来する夾雑物や反応阻害物等の影響の大小によって反応効率に差が生じ、蛍光強度が変わってくる。本実施形態に係る核酸定量方法によれば、このようなばらつきを補正することができる。
【００５７】
また、上述では、補正ウェルについては、１つのウェル４９のみを用いる例を挙げたが、２以上のウェルを用いてもよい。例えば、濃度が異なる複数のウェルを補正用ウェルとして用い、検出対象核酸鎖と補正用核酸鎖が同一配列である場合には、補正用ウェルの蛍光強度測定に基づいて、検量線を作成してサンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定することができる。
【００５８】
なお、本実施形態では、マイクロチップＢのウェルを補正用ウェルとして用いる場合を例に説明したが、本発明に係る第一実施形態に係るマイクロチップＡの１又は複数のウェルを補正用ウェルとして用いてもよい。
【実施例】
【００５９】
以下の手順に従って、従来のＲＴ−ＰＣＲ法と本発明に係る方法とを用いて核酸定量を行った。
【００６０】
インフルエンザ感染の疑いのある患者由来の鼻腔拭い液（１７検体）を１３０μＬの緩衝液に懸濁した。懸濁液の半量を、市販のインフルエンザウイルス用抽出試薬（栄研化学株式会社、Cat.No.LMP801）と混合した。市販のプライマーセット（栄研化学株式会社、Cat.No.PM0021）とＲＴ−ＲＡＭＰキット（栄研化学株式会社、Cat.No.LMP244）を用いて、混合液中のインフルエンザゲノムのＲＡＭＰ反応を行った。装置にはＢｉｏ−Ｒａｄ製のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ装置（Chromo4）を用い、マイクロチップには９ウェルのチップを用いた。ＲＡＭＰ反応の開始３０分以内に蛍光強度の増加が確認されたウェルをインフルエンザゲノム陽性と判定した。
【００６１】
また、鼻腔拭い液の懸濁液の半量から、市販のRNA抽出キット（QIAGEN、Cat.No.52904）を用いてインフルエンザゲノムを精製し、世界保健機関（WHO）推奨のプロトコール（“WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - revised” 23 November 2009）に従ってＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【００６２】
結果を、図６に示す。縦軸は、ＲＡＭＰ反応の開始３０分以内に蛍光強度の増加が確認された陽性ウェル数を示す。また、横軸は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による検出サイクル数を示す。ＲＴ−ＰＣＲ解析による検出サイクル数と陽性ウェル数との間に相関が認められ、陽性ウェルの数によって検体中のインフルエンザゲノム量を定量可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係る核酸定量方法等によれば、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定することができる。従って、本発明に係る核酸定量方法等は、サンプル中の病原体ゲノムの凡その量を測定し、病原体が多いか少ないかを調べることによって、感染症の重症度や発症段階を簡易に診断するために特に有用である。
【符号の説明】
【００６４】
Ａ，Ｂ，Ｃ：核酸増幅反応用マイクロチップ、Ｐ：プライマー、Ｅ：酵素、１：導入口、２：主流路、３：分岐流路、４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９：ウェル、５：排出口
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップに関する。より詳しくは、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための核酸定量方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法等の核酸増幅法が、感染症や遺伝性疾患の診断、遺伝子の発現量解析やクローニングなどのために用いられている。また、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、これらの蛍光強度の増加量に基づいて検出対象核酸鎖の増幅量をリアルタイムに測定し、当初の検出対象核酸鎖量を定量するリアルタイム核酸増幅法も行われている。
【０００３】
非特許文献１では、微量な核酸鎖を正確に定量するための「デジタルＰＣＲ」と称される技術が提案されている。デジタルＰＣＲでは、検出対象核酸鎖を含むサンプルを反応溶液中に限界希釈し、複数の反応場（ウェル）に分注して、ＰＣＲ反応を行なう。そして、蛍光プローブ等を用い、増幅産物に由来する蛍光を発するウェルの数を計数する。限界希釈によって各ウェルには最大１分子（コピー）の検出対象核酸鎖しか存在しないと仮定できるため、蛍光を発するウェルの数によってサンプルに含まれる検出対象核酸鎖のコピー数を定量できる。
【０００４】
特許文献１には、デジタルＰＣＲにおいて、反応場となるチャネルをプレートに数千〜数百万配設し、サンプルに含まれる検出対象核酸鎖が各チャネルに１コピーずつ入るようにした核酸定量方法が提案されている。この方法によれば、１つのチャネルに検出対象核酸鎖が２コピー以上入ってしまうことにより蛍光を発するウェルの数と検出対象核酸鎖のコピー数とが不一致となってしまうことがなく、検出対象核酸鎖のコピー数を正確に定量できるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２６９１９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Digital PCR" Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, Vol.96, p.9236-9241
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、デジタルＰＣＲでは、サンプル中の検出対象核酸鎖のコピー数を正確に定量できる。一方で、核酸鎖量の定量を目的とした核酸増幅法において、特に感染症の診断を行うような場合には、サンプル中の病原体ゲノムの凡その量を測定し、病原体が多いか少ないかを調べることによって、重症度や発症段階の判定に役立てたいという要求がある。また、このような半定量的な測定は、遺伝子の発現量解析において、ｍＲＮＡのコピー数を正確に測定することまでは要せず、ｍＲＮＡの発現量が多いか少ないかを調べたいような場合にも望ましい。
【０００８】
そこで、本発明は、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本発明は、外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いて、検出対象核酸鎖を含む溶液を前記流路に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、を行う核酸定量方法を提供する。
この核酸定量方法では、特定された反応領域における核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、前記溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。すなわち、この核酸定量方法では、特定された反応領域が、核酸増幅反応がより起こり難く構成されたものである程、多くの検出対象核酸鎖が前記溶液に含まれていたと判定できる。
この核酸定量方法において、前記核酸増幅反応用マイクロチップは、前記反応領域の内容積が異なることにより、あるいは、前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたものを用いることができる。この際、前記反応領域内に予め収容されている反応に必要な物質は、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は酵素とできる。
【００１０】
また、本発明は、外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを提供する。
この核酸増幅反応用マイクロチップは、前記反応領域の内容積が異なることにより、あるいは、前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成できる。
これら核酸増幅反応用マイクロチップにおいて、前記反応領域は、一本の前記流路によって、一の反応領域内に導入された液体が該流路に溢流して隣り合う他の一の反応領域に順次導入されるように配設されたものとできる。
【００１１】
本発明において、「核酸増幅反応」には、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる温度サイクルを伴うＰＣＲ反応と、温度を伴わない各種等温増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（transcription-reverse transcription concerted）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定するための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップＡの構成を説明するための上面模式図である。
【図２】マイクロチップＡの構成を説明するための断面模式図である。
【図３】本発明の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップＢの構成を説明するための上面模式図である。
【図４】マイクロチップＢのウェル内に存在する核酸増幅反応に必要な物質を説明するための模式図である。
【図５】本発明の変形例に係る核酸増幅反応用マイクロチップＣの構成を説明するための上面模式図である。
【図６】インフルエンザウイルスゲノムの定量を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序により行う。
１．本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
２．本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
３．本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
（２）核酸定量方法
【００１５】
１．本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
図１及び図２は、本発明の第一実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を説明する模式図である。図１は上面模式図、図２は図1中のＰ−Ｐ断面に対応する断面模式図である。
【００１６】
図中、符号Ａで示すマイクロチップには、外部から液体（サンプル溶液）が導入される導入口１と、一端において導入口１に連通する主流路２と、主流路２から分岐する分岐流路３と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル４１〜４９（反応領域）が配設されている。主流路２の他端は、サンプル溶液を外部に排出する排出口５に連通されている。分岐流路３は、主流路２の導入口１への連通部と排出口５への連通部との間において主流路２から分岐し、各ウェルに接続されている。なお、マイクロチップＡにおいて、排出口５は必須の構成とはならず、導入口１から導入されたサンプル溶液が外部に排出されない構成であってもよい。
【００１７】
導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液は、分岐流路３を通流して、導入口１近位（送液方向上流）のウェル４１内から排出口５近位（送液方向下流）のウェル４９内にまで順次導入される。サンプル液には、検出対象核酸鎖となるＤＮＡやゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。また、サンプル溶液には、核酸増幅反応に必要なオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」とも称する）や酵素、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液（バッファー）溶質などの試薬が含まれ得る。
【００１８】
ウェル４１〜４９は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、内容積が次第に小さくされており、ウェル内に導入されるサンプル溶液の容量が導入口１近位のウェルほど多く、排出口５近位のウェルほど少なくなるように構成されている。ウェル４１〜４９の内容積は、送液方向に従って、例えば０．９〜０．０１倍程度、好ましくは０．５〜０．１倍程度の範囲で順次小さくなるように形成される。
【００１９】
各ウェル内における核酸増幅反応の起こり易さ（反応効率）は、該ウェル内に導入される検出対象核酸鎖の量に依存し、各ウェル内に導入される検出対象核酸鎖の量は、該ウェル内に導入されるサンプル溶液の容量、すなわちウェルの内容積に依存する。そのため、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェルの内容積を次第に小さく構成することにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成できる。
【００２０】
マイクロチップＡは、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１〜４９及び排出口５を形成した基板層ａ１に基板層ａ２を貼り合わせて構成されている。基板層ａ１，ａ２の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とすることができる。ウェル内で増幅産物の検出を光学的に行う場合には、基板層ａ１，ａ２の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。なお、導入口１等は、基板層ａ２に形成されていてもよく、基板層ａ１及び基板層ａ２の両方に一部ずつ形成されていてもよい。また、マイクロチップを構成する基板層は２以上であってよい。
【００２１】
（２）核酸定量方法
次に、マイクロチップＡを用いた本発明の第一実施形態に係る核酸定量方法について説明する。
【００２２】
まず、サンプル溶液を導入口１から主流路２に送液し、ウェル４１〜４９内に導入し、定法に従ってＰＣＲ反応やＬＡＭＰ反応などの核酸増幅反応を行なう。例えばＰＣＲ法では、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる所定の温度サイクルを実施することにより、核酸増幅反応を進行させる。また、例えばＬＡＭＰ法では、所定の反応温度に保持することにより、核酸増幅反応を進行させる。
【００２３】
上述のように、マイクロチップＡは、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェルの内容積を次第に小さく構成することにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成されている。従って、この手順では、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じ、逆に、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が少ない場合には、より送液方向上流のウェル内でしか反応が生じない。
【００２４】
次に、各ウェル内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じたウェルを特定する。増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、マイクロチップＡの蛍光像を撮像し、得られた画像を画像処理システムで解析し、各ウェル内の蛍光色素からの蛍光信号をウェル毎に自動計測することによって行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、上記画像を目視によって観察し、あるいは蛍光顕微鏡等を用いてマイクロチップＡを観察し、各ウェル内からの蛍光の有無を確認することによって行ってもよい。
【００２５】
最後に、特定されたウェルにおける核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定する。マイクロチップＡでは、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じる。そのため、核酸増幅反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量の多寡を判定できる。具体的には、ウェル４１，４２で核酸増幅反応が生じた場合には、ウェル４１でのみ反応が生じた場合に比べて、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。同様に、ウェル４１からより送液方向下流のウェルを含むウェルで核酸増幅反応が生じている程、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。
【００２６】
さらに、検出対象核酸鎖を既知量で含む溶液を用いて、検出対象核酸鎖量と核酸増幅反応が生じるウェル（あるいはその容量）との関係を予め取得しておけば、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量をより正確に測定できる。
【００２７】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたマイクロチップを用いて核酸増幅反応を行ない、反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。
【００２８】
本実施形態では、マイクロチップに縦横３例で合計９つのウェルを均等間隔で配設する場合を例として説明したが、ウェルの数や配設位置は任意とでき、ウェルの形状も図に示した円柱形状に限定されない。また、導入口１に導入されたサンプル溶液を各ウェル内に供給するための流路の構成も、図に示した主流路２及び分岐流路３の態様に限定されない。
【００２９】
また、本実施形態では、ウェルの面積を変化させて内容積を小さく（あるいは大きく）する場合を例として説明したが、ウェルの内容積は深さを変化させることにより小さくしてもよい。また、内容積を異ならせたウェルの配列順序は、送液方向上流のウェルから下流の順で次第に小さくなる態様に限定されないものとする。
【００３０】
２．本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
図３は、本発明の第二実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を説明する上面模式図である。
【００３１】
図中、符号Ｂで示すマイクロチップには、外部からサンプル溶液が導入される導入口１と、一端において導入口１に連通する主流路２と、主流路２から分岐する分岐流路３と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル４１〜４９が配設されている。主流路２の他端は、サンプル溶液を外部に排出する排出口５に連通されている。分岐流路３は、主流路２の導入口１への連通部と排出口５への連通部との間において主流路２から分岐し、各ウェルに接続されている。なお、マイクロチップＢにおいて、排出口５は必須の構成とはならず、導入口１から導入されたサンプル溶液が外部に排出されない構成であってもよい。
【００３２】
導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液は、分岐流路３を通流して、導入口１近位（送液方向上流）のウェル４１内から排出口５近位（送液方向下流）のウェル４９内にまで順次導入される。サンプル液には、検出対象核酸鎖となるＤＮＡやゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが含まれる。
【００３３】
ウェル４１〜４９内には、核酸等幅反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されている。ウェル内に予め収容される物質は、核酸等幅反応において増幅産物を得るために必要な物質であって、具体的には、プライマーや酵素、核酸モノマー、反応緩衝液溶質などとされる。ウェル内に収容される物質はこれらのうち１あるいは２以上とでき、残りの物質はサンプル液中に含まれて導入口１からウェル内に導入される。
【００３４】
図４に、ウェル内にプライマーと酵素を異なる量で収容した例を示す。ウェル４１〜４９は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、収容されるプライマーＰ及び酵素Ｅの量が次第に少なくなるようにされている。図では、ウェル４１，４２，４３について、積層されて収容されたプライマーＰ及び酵素Ｅの積層厚を次第に小さくすることにより量を変化させた場合を示した。
【００３５】
ウェル４１〜４９のプライマーＰ及び酵素Ｅの量は、送液方向に従って、例えば０．９〜０．０１倍程度、好ましくは０．５〜０．１倍程度の範囲で順次少なくなるように収容される。
【００３６】
各ウェル内における核酸増幅反応の起こり易さ（反応効率）は、該ウェル内に収容された反応に必要な物質の量に依存する。そのため、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェル内に収容するプライマーＰ及び酵素Ｅの量を次第に少なくすることにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成できる。
【００３７】
（２）核酸定量方法
次に、マイクロチップＢを用いた本発明の第二実施形態に係る核酸定量方法について説明する。
【００３８】
まず、サンプル溶液を導入口１から主流路２に送液し、ウェル４１〜４９内に導入する。これによって、ウェル内に予め収容されている反応に必要な物質（ここでは、プライマーＰ及び酵素Ｅ）と、サンプル溶液に含まれる残りの物質を検出対象核酸鎖が混合される。サンプル溶液の導入後、定法に従ってＰＣＲ反応やＬＡＭＰ反応などの核酸増幅反応を行なう。例えばＰＣＲ法では、熱変性、アニーリング、伸長反応の３つのステップからなる所定の温度サイクルを実施することにより、核酸増幅反応を進行させる。また、例えばＬＡＭＰ法では、所定の反応温度に保持することにより、核酸増幅反応を進行させる。
【００３９】
上述のように、マイクロチップＢは、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で、ウェル内に収容された反応に必要な物質の量を次第に少なくすることにより、ウェル内における核酸増幅反応が同順で次第に起こり難くなるように構成されている。従って、この手順では、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じ、逆に、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が少ない場合には、より送液方向上流のウェル内でしか反応が生じない。
【００４０】
次に、各ウェル内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じたウェルを特定する。増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、マイクロチップＢの蛍光像を撮像し、得られた画像を画像処理システムで解析し、各ウェル内の蛍光色素からの蛍光信号をウェル毎に自動計測することによって行うことができる。また、核酸増幅反応が生じたウェルの特定は、上記画像を目視によって観察し、あるいは蛍光顕微鏡等を用いてマイクロチップＢを観察し、各ウェル内からの蛍光の有無を確認することによって行ってもよい。
【００４１】
最後に、特定されたウェルにおける核酸増幅反応の起こり易さの程度に基づいて、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定する。マイクロチップＢでは、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量が多いほど、送液方向下流のウェル内でまで核酸増幅反応が生じる。そのため、核酸増幅反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量の多寡を判定できる。具体的には、ウェル４１，４２で核酸増幅反応が生じた場合には、ウェル４１でのみ反応が生じた場合に比べて、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。同様に、ウェル４１からより送液方向下流のウェルを含むウェルで核酸増幅反応が生じている程、サンプル溶液により多くの検出対象核酸鎖が含まれていたと判定できる。
【００４２】
さらに、検出対象核酸鎖を既知量で含む溶液を用いて、検出対象核酸鎖量と核酸増幅反応が生じるウェル（あるいはその容量）との関係を予め取得しておけば、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖量をより正確に測定できる。
【００４３】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成されたマイクロチップを用いて核酸増幅反応を行ない、反応が生じたウェルを特定することで、サンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を測定できる。
【００４４】
本実施形態においても、第一実施形態において説明したように、ウェルの数や配設位置は任意とでき、ウェルの形状も図に示した円柱形状に限定されない。また、収容する反応に必要な物質の量を異ならせたウェルの配列順序は、送液方向上流のウェルから下流の順で次第に少なくなる態様に限定されないものとする。
【００４５】
さらに、導入口１に導入されたサンプル溶液を各ウェル内に供給するための流路の構成も、図に示した主流路２及び分岐流路３の態様に限定されず、例えば図５に示すような分岐流路を有さない構成を採用してもよい。図５に示すマイクロチップＣでは、ウェル４１〜４９は、主流路２によって、一のウェル内に導入されたサンプル溶液が主流路２に溢流して隣り合う他の一のウェルに順次導入されるように連通されて配設されている。導入口１から主流路２に送液されるサンプル溶液はまず導入口１近位のウェル４１に充填され、ウェル４１から溢流したサンプル溶液が隣接するウェル４２内に導入される。同様にして、ウェル４２から溢流したサンプル溶液が送液方向下流のウェルに順次導入される。
【００４６】
マイクロチップＢは、マイクロチップＡと同様に、２枚の基板層の貼り合わせによって構成できる。核酸増幅反応に必要な物質のウェル内への収容は、導入口１、主流路２、分岐流路３、ウェル４１〜４９及び排出口５の成型後、基板層の貼り合せ前に、ウェル内にプライマー溶液や酵素溶液等を滴下し乾燥させることによって行うことができる。
【００４７】
導入口１等の成型は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、あるいはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工によって行うことができる。
【００４８】
プライマー溶液や酵素溶液等の乾燥は、風乾、真空乾燥あるいは凍結乾燥等によって、好ましくは緩徐に行う。ウェル内に収容する物質を酵素とする場合には、活性の低下や失活を防止するため、滴下した酵素溶液は、臨界点乾燥により乾燥させることが好ましい。また、ウェル内には、増幅産物の検出のための蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブも収容しておいてよい。ここで、プライマー溶液や酵素溶液等の滴下及び乾燥の順序は特に限定されず、プライマーや酵素は図４に示したように積層されて収容される必要はないものとする。
【００４９】
基板層の貼り合わせは、例えば、基板層の表面を酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理により活性化して貼り合せる方法を採用できる。酸素プラズマ処理又は真空紫外光処理は、基板層の材料に応じて適宜な条件を設定して行う。
【００５０】
３．本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法及び核酸増幅反応用マイクロチップ
（１）核酸増幅反応用マイクロチップ
次に、本発明の第三実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）について説明する。ここで、本実施形態に係る核酸増幅反応用マイクロチップの構成については、収容される物質以外、第二実施形態に係るマイクロチップＢと実質的に同一であるため、図３を参照しながら以下説明する。
【００５１】
図中、本実施形態に係るマイクロチップでは、ウェル４１〜４９のうち、少なくとも１つのウェルが、補正用ウェルとして用いられるという点以外は、第二実施形態に係るマイクロチップと実質的に同一である。そのため、ここでは、補正用ウェルについて主に説明する。また、特に、ウェル４９が補正用ウェルとして用いられる場合を例に以下説明する。ここでいう、補正用ウェルとは、濃度が予め認識されている核酸鎖が収容されたウェルである。
【００５２】
補正用ウェルには、他のウェル４１〜４８と同様に酵素Ｅ及びプライマーＰが収容され、更に、濃度が予め認識されている補正用核酸鎖が収容されている。なお、サンプル液に含まれる検出対象核酸鎖と、補正用核酸鎖とは、同一の配列であっても一部同一の配列であってもよい。検出対象核酸鎖と、補正用核酸鎖とが同一の配列の場合、例えば、検出対象核酸鎖にＲＮＡ、補正用核酸鎖にＤＮＡを用い、ウェル４１〜４８には、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼを収容し、補正用ウェルには、ＤＮＡポリメラーゼを収容する。一方、補正用核酸鎖と、補正用核酸鎖とが一部のみ同一の配列の場合、補正用ウェル及び他のウェル４１〜４８には、夫々に対応する異なるプライマーを収容すればよい。
【００５３】
（２）核酸定量方法
次に、本発明の第三実施形態に係る核酸定量方法について説明する。なお、第三実施形態に係る核酸定量方法は、第二実施形態に係る核酸定量方法と比し、ウェル４１〜４９のうち、ウェル４９が補正用ウェルとして用いられる点以外は、実質的に同一であるため、ここでは、補正用ウェルが用いられる点についてのみ説明する。
【００５４】
すなわち、導入口１から送液したサンプル溶液は、送液方向上流のウェル４１から下流のウェル４９の順で導入され、核酸増幅反応が進行する。そして、補正用ウェルでは、予め濃度が認識されている補正用核酸鎖の核酸増幅反応が進行する。次に、増幅産物の検出は、蛍光色素や蛍光色素を標識した蛍光プローブを用い、増幅産物の生成に伴って蛍光色素から生じる蛍光を検出することにより行う。
【００５５】
各ウェル４１〜４９に導入されるサンプル溶液には、夾雑物や反応阻害物等が含まれている可能性がある。そのため、上記夾雑物や反応阻害物等が、反応効率に影響を与え、測定のばらつきの要因となる。この点、本実施形態に係るマイクロチップでは、濃度が予め認識されている補正用核酸鎖が収容された補正用ウェルを設けているので、上記ばらつきを補正して蛍光の強度等から増幅産物の濃度の認識を可能にする。
【００５６】
以上のように、本実施形態に係る核酸定量方法によれば、マイクロチップの１又は複数のウェルを補正用ウェルとして用いるため、検出対象核酸鎖を含むサンプル溶液中の夾雑物、反応阻害物等の影響を把握することができる。より具体的には、サンプル内の検出対象核酸鎖の量が同じでもサンプルに由来する夾雑物や反応阻害物等の影響の大小によって反応効率に差が生じ、蛍光強度が変わってくる。本実施形態に係る核酸定量方法によれば、このようなばらつきを補正することができる。
【００５７】
また、上述では、補正ウェルについては、１つのウェル４９のみを用いる例を挙げたが、２以上のウェルを用いてもよい。例えば、濃度が異なる複数のウェルを補正用ウェルとして用い、検出対象核酸鎖と補正用核酸鎖が同一配列である場合には、補正用ウェルの蛍光強度測定に基づいて、検量線を作成してサンプル溶液に含まれる検出対象核酸鎖の量を測定することができる。
【００５８】
なお、本実施形態では、マイクロチップＢのウェルを補正用ウェルとして用いる場合を例に説明したが、本発明に係る第一実施形態に係るマイクロチップＡの１又は複数のウェルを補正用ウェルとして用いてもよい。
【実施例】
【００５９】
以下の手順に従って、従来のＲＴ−ＰＣＲ法と本発明に係る方法とを用いて核酸定量を行った。
【００６０】
インフルエンザ感染の疑いのある患者由来の鼻腔拭い液（１７検体）を１３０μＬの緩衝液に懸濁した。懸濁液の半量を、市販のインフルエンザウイルス用抽出試薬（栄研化学株式会社、Cat.No.LMP801）と混合した。市販のプライマーセット（栄研化学株式会社、Cat.No.PM0021）とＲＴ−ＲＡＭＰキット（栄研化学株式会社、Cat.No.LMP244）を用いて、混合液中のインフルエンザゲノムのＲＡＭＰ反応を行った。装置にはＢｉｏ−Ｒａｄ製のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ装置（Chromo4）を用い、マイクロチップには９ウェルのチップを用いた。ＲＡＭＰ反応の開始３０分以内に蛍光強度の増加が確認されたウェルをインフルエンザゲノム陽性と判定した。
【００６１】
また、鼻腔拭い液の懸濁液の半量から、市販のRNA抽出キット（QIAGEN、Cat.No.52904）を用いてインフルエンザゲノムを精製し、世界保健機関（WHO）推奨のプロトコール（“WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - revised” 23 November 2009）に従ってＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【００６２】
結果を、図６に示す。縦軸は、ＲＡＭＰ反応の開始３０分以内に蛍光強度の増加が確認された陽性ウェル数を示す。また、横軸は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による検出サイクル数を示す。ＲＴ−ＰＣＲ解析による検出サイクル数と陽性ウェル数との間に相関が認められ、陽性ウェルの数によって検体中のインフルエンザゲノム量を定量可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係る核酸定量方法等によれば、サンプル中に含まれる検出対象核酸鎖の凡その量を簡便に測定することができる。従って、本発明に係る核酸定量方法等は、サンプル中の病原体ゲノムの凡その量を測定し、病原体が多いか少ないかを調べることによって、感染症の重症度や発症段階を簡易に診断するために特に有用である。
【符号の説明】
【００６４】
Ａ，Ｂ，Ｃ：核酸増幅反応用マイクロチップ、Ｐ：プライマー、Ｅ：酵素、１：導入口、２：主流路、３：分岐流路、４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９：ウェル、５：排出口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いて、
検出対象核酸鎖を含む溶液を前記流路に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、
各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、
を行う核酸定量方法。
【請求項２】
前記反応領域の内容積が異なることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いる請求項１記載の核酸定量方法。
【請求項３】
前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いる請求項１記載の核酸定量方法。
【請求項４】
前記反応領域内に予め収容されている反応に必要な物質が、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は酵素である請求項３記載の核酸定量方法。
【請求項５】
外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項６】
前記反応領域の内容積が異なることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された請求項５記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項７】
前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された請求項５記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項８】
前記反応領域が、一本の前記流路によって、一の反応領域内に導入された液体が該流路に溢流して隣り合う他の一の反応領域に順次導入されるように配設された請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項１】
外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いて、
検出対象核酸鎖を含む溶液を前記流路に通流して各反応領域内に導入し、核酸増幅反応を行う手順と、
各反応領域内の増幅産物を検出することにより、核酸増幅反応が生じた反応領域を特定する手順と、
を行う核酸定量方法。
【請求項２】
前記反応領域の内容積が異なることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いる請求項１記載の核酸定量方法。
【請求項３】
前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップを用いる請求項１記載の核酸定量方法。
【請求項４】
前記反応領域内に予め収容されている反応に必要な物質が、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は酵素である請求項３記載の核酸定量方法。
【請求項５】
外部から液体が導入される導入口と、核酸増幅反応の反応場となる複数の反応領域と、導入口から導入される液体を各反応領域内に供給する流路と、が配設され、かつ、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項６】
前記反応領域の内容積が異なることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された請求項５記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項７】
前記反応領域内に反応に必要な物質の少なくとも一部が異なる量で予め収容されていることにより、各反応領域内における核酸増幅反応の起こり易さの程度が変化するように構成された請求項５記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【請求項８】
前記反応領域が、一本の前記流路によって、一の反応領域内に導入された液体が該流路に溢流して隣り合う他の一の反応領域に順次導入されるように配設された請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸増幅反応用マイクロチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−８０８７０（Ｐ２０１２−８０８７０Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６１９３４（Ｐ２０１０−２６１９３４）
【出願日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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