核酸定量法
【課題】簡便に核酸を定量する方法の提供。
【解決手段】実施形態の核酸定量法は以下の通り、(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得る、(b)濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備する、(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得る、(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに混合する；(e)前記タグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させる、(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量する。
【解決手段】実施形態の核酸定量法は以下の通り、(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得る、(b)濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備する、(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得る、(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに混合する；(e)前記タグ配列と鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させる、(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、一般的に核酸定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現量、遺伝子変異・多型を解析することは、病気の薬効、副作用などに関連する遺伝子を発見したり、また個人の体質、病気のなりやすさを診断し、個人に合わせたテーラーメイド医療を実現するために重要である。更にまた、感染症の原因となる細菌やウィルスの感染量、遺伝子変異・多型を解析することは、適切な診断・治療を施すために重要である。
【０００３】
現在使用されている遺伝子発現量、細菌・ウィルス量を定量する方法には、例えば、リアルタイムPCRやDNAチップなど、プローブとのハイブリダイゼーションの可否により、判定されている。リアルタイムPCR法は、簡便、且つ比較的短時間で検査を行うことが出来る。しかしながら、複数の遺伝子を同時に検査したい場合には、遺伝子毎に検査を行わなくてはならず、不便である。また、DNAチップを用いた方式は、蛍光標識法が主流であり、操作が煩雑、高価な装置が必要であり、研究用途に限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、簡便に核酸を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態の核酸定量法は、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b) 濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記タグ配列は、これを含むプライマーが、前記検体毎に鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに混合することと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量することと；
を具備する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】タグ導入プライマー、プローブの設計方法。
【図２】定量法の原理図（基本）を示す図。
【図３】定量法の原理図（複数核酸マルチ増幅）を示す図。
【図４】定量法の原理図（複数検体同時検出）を示す図。
【図５】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 別々増幅）を示す図。
【図６】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 同時増幅）を示す図。
【図７】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 同一ターゲット）を示す図。
【図８】LAMPの基本プライマー設計を示す図。
【図９】LAMPの中間産物を示す図。。
【図１０】定量法の原理図（LAMP増幅法を用いた場合）を示す図。
【図１１】タグ導入プライマー・プローブの設計方法（LAMP法の場合）を示す図。
【図１２】プローブ核酸固定化基体の概略構成を示す平面図-1 。
【図１３】プローブ核酸固定化基体の概略構成を示す平面図-2 。
【図１４Ａ】実施例１の図。
【図１４Ｂ】実施例１の図。
【図１４Ｃ】実施例１の図。
【図１４Ｄ】実施例１の図。
【図１４Ｅ】実施例１の図。
【図１４Ｆ】実施例１の図。
【図１５】実施例２の図。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［定義］
「核酸」とは、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。
【０００８】
「検体」とは、本実施形態に従い解析方法を行なうべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行えばよい。例えば、検体は液体であってもよく、その場合、「被検液」と称してもよい。従って、「被検液」とは、核酸または鋳型核酸が存在する可能性のある溶液と解されてよい。
【０００９】
検体に含まれる核酸を「検体核酸」と称する。検体核酸のうち、本実施形態のプライマーにより増幅しようとする配列を「鋳型配列」と称す。鋳型配列を含む核酸を「鋳型核酸」または「鋳型」と称す。
【００１０】
「標的核酸」とは、鋳型核酸または鋳型配列を、本実施形態に従うフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅して得られた増幅産物をいう。標的核酸は、その一部に標的配列を含む。
【００１１】
「標的配列」とは、核酸プローブを用いて標的核酸を検出するために利用される。
【００１２】
「核酸プローブ」とは、標的配列と相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは基体などの固相上に固定化されて使用され、鋳型配列に由来の領域を含む増幅産物とハイブリッドを形成する。
【００１３】
「鋳型配列由来の領域」とは、プライマーによって増幅される領域のうち、プライマーが結合する領域以外の領域で、鋳型の配列が反映される領域を意味する。遺伝子多型または遺伝子変異を検出する場合には、それらの部位がこの領域内に収まるように設計される。
【００１４】
「DNAチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。DNAチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「DNAアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００１５】
また、解析される項目は、例えば、遺伝子発現量の測定、ウイルスおよび／または細菌などに由来する核酸などの定量、多型についての遺伝子型の同定および／または変異の有無の検出などであってよい。これに限定するものではない。
【００１６】
「増幅」とは、プライマーセットを用いて目的とする核酸を増幅することをいい、PCR法およびLAMP法を含む。「LAMP法」は、LAMP法およびRT-LAMP法を含む。「RT-LAMP法」は、等温遺伝子増幅法であるLAMP法の１種である。RT-LAMP法は、逆転写反応とLAMP反応を同時に行うことによりRNAを鋳型として、LAMP増幅を行う方法である。ここおいて単に「LAMP法」と記載した場合、特に記載のない限り「LAMP法」と「RT-LAMP法」の両方について言及すると解されてよい。LAMP法とRT-LAMP法のプライマーは互いに同じプライマーを用いることが可能である。
【００１７】
［実施形態］
以下、本実施形態について説明する。
【００１８】
実施形態の定量方法は、検体を段階的に希釈し、得られた複数の希釈液それぞれについて、標的配列が検出される否かを検出し、標的配列が検出された希釈液の希釈倍率と、検出されなかった希釈液の希釈倍率、即ち、希釈による標的配列の検出限界を指標として、元液である検体に含まれる核酸量を測定する原理を利用し、且つこの際に、異なるタグ配列を使用することにより、検体に含まれる標的核酸を増幅することにより、複数の検体、複数の遺伝子、遺伝子変異および／または遺伝子多型を含む核酸を同時解析することが可能となり、且つ簡便、安価に核酸量を決定することを達成するものである。
【００１９】
＜希釈溶液の取得方法＞
検体の希釈溶液は、マイクロピペットを用いるマニュアル操作または自動装置によって段階希釈して作製すればよい。また、それ自身公知のグラジエント送液装置技術を用いてもよい。段階希釈された異なる濃度の希釈溶液は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上または９以上など、定量の精度や検体の状態などに応じて選択されてよく、更に、段階希釈の程度、即ち、１段階の希釈における希釈程度は、２倍希釈、３倍希釈、４倍希釈、５倍希釈、６倍希釈、１０倍希釈、３０倍希釈、１００倍希釈、１００倍希釈など所望に応じて選択されてよい。また、本実施形態を繰り返し行うことにより、より詳細な定量が達成されてもよい。
【００２０】
＜定量解析用プライマー＞
図１のタグ導入Fプライマーに例示されるように、プライマーには、鋳型核酸のプライマー結合部位に結合する配列と、検体希釈液を解析するためのタグ配列を導入する。または必要に応じてタグ配列は複数検体を検出するためにも使われる。
【００２１】
タグ配列は各段階希釈液によって異なる配列を用いる。また、複数検体を同時にDNAチップ検出する場合には、検体希釈液毎、且つ検体毎に互いに識別可能な異なるタグ配列を準備する。タグ配列の塩基数は3塩基〜7塩基であってよい。タグ配列は、それを含むプライマーが鋳型核酸に結合した際に、タグ配列部分が鋳型核酸には結合せずにループアウトするように設計される。またタグ配列を単に「タグ」とも称する。
【００２２】
プライマーの長さは、13〜40塩基、例えば、15〜30塩基であってよい。タグ配列を含むプライマー（以下「タグ配列含有プライマー」または「タグ含有プライマー」とも称する）の場合、長さは16〜47塩基、例えば、18〜37塩基であってよい。
【００２３】
前記タグ配列のプライマーへの挿入場所については、次のことが重要である。即ち、プライマーはタグ配列部分がループアウトして鋳型に結合する必要がある。更に、核酸プローブはタグ配列と鋳型配列由来の配列の両方を含む必要がある。従って、タグ配列は、PCR増幅の場合、Forwardプライマー(Fプライマー)および／またはReverseプライマー(Rプライマー)の3’末端側から6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。LAMP増幅の場合、F2領域および/またはB2領域の3'末端から6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。具体的には、FIPプライマーのF2配列の3'末端から6塩基目から12塩基目、および／またはBIPプライマーのB2配列の6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。これにより良好な増幅と検出特性が得られる。
【００２４】
タグ配列を構成する核酸の種類は、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質であれば特に限定されない。
【００２５】
＜変異および多型解析用プライマー＞
核酸の定量に加えて、鋳型核酸中の変異、多型または型判別を行いたい場合には、変異、多型および／または型判別用プライマーセットを準備すればよい。当該プライマーセットは、増幅産物中に変異、多型または型を含むように設計され、この領域を核酸プローブで検出することにより、変異、多型または型判別を行うことができる。当該プライマーセットは、定量用のタグ導入プライマーを含むプライマーセットと同一のものであってもよく、各々に別のプライマーセットを準備してもよい。また、別に準備する場合には、定量用に準備したプライマーセットとマルチ増幅してもよい。
【００２６】
＜定量解析用核酸プローブ＞
核酸プローブは、定量用に増幅した標的核酸の中に含まれるタグ配列を検出するため、タグ配列に相補的な配列を含むように設計される。また図１に示すように鋳型配列由来の領域と相補的な配列を含むように設計される。
【００２７】
本実施形態に従う核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、5〜50塩基の範囲が好ましく、10〜40塩基の範囲がより好ましく、15〜35塩基の範囲がさらに好ましい。
【００２８】
また、核酸プローブは、基体に固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾したものであってもよい。官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。
【００２９】
核酸プローブを固定化するための固相は、一般的にDNAチップのための固相として使用される何れかの基体であればよい。そのような基体は、ガラス、シリコン、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、又は光ファイバーなどによって構成されてよいが、これらに限定されない。これらの基体上に複数種の核酸プローブを固定化し、DNAチップを構成すればよい。
【００３０】
＜変異および多型解析用核酸プローブ＞
核酸の定量解析と同時に、検体中の核酸の遺伝子変異および／または多型を解析したい場合には、変異および／または多型を検出する核酸プローブを準備する。例えば、野生型検出用の核酸プローブ、変異型検出用の核酸プローブをそれぞれ用い、野生型検出用の核酸プローブと標的核酸、変異型検出用の核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション量を比較することにより、検体の遺伝子型を同時に判定することができる。
【００３１】
検体中の遺伝子の型判別、種判別を行う場合には、検出したい型および／または種を検出する核酸プローブを準備する。例えば、細菌の同じ属に分類されている複数の種を同定する場合に、例えば属共通に増幅するプライマーセットを準備し、増幅を行う。この属共通のプライマーセットにタグを導入し、前述のようにタグ導入核酸プローブで検出すれば、細菌の核酸量を定量することができる。さらに、各々の種に特徴的で他の種と特異性の出せる領域をプローブ領域に設定する。各々の種に特徴的な配列を有する、種同定用の核酸プローブと標的核酸、種と無関係の配列を示すネガティブコントロール用核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション量を比較することにより、細菌の核酸の定量と同時に種の同定を行うことができる（実施例２参照）。
【００３２】
＜方法＞
次にタグ配列を導入したプライマーとDNAチップを用いた核酸定量方法について説明する。
【００３３】
図２に示すように、まず、検体希釈液ごとに配列の異なるタグ配列（タグ配列１、タグ配列２、タグ配列３・・・）を導入したプライマー（100倍希釈用プライマー、101倍希釈用プライマー、102倍希釈用プライマー・・・）を準備し、検体希釈液毎に独立した反応系において増幅を行なう。検体希釈液毎に独立した反応系とは、各希釈液が混じり合わない反応系であればよい。例えば、希釈液毎に別チューブで増幅を行えばよい。「反応系」とは、そこにおいて反応が行なわれるための反応場をいい、例えば、チューブおよびウェルなどの容器であればよい。
【００３４】
増幅後、希釈液毎に一部配列が異なる増幅産物が得られる。希釈液の鋳型量が最低検出濃度以下の場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。各反応系において得られた増幅産物は、希釈液毎に異なるタグ配列と鋳型核酸由来の領域を含む。従って、増幅産物に含まれるタグ配列を同定し、いずれの段階の希釈液までが増幅されたかを特定することにより、原液の核酸量を定量することができる。
【００３５】
この増幅産物を混合し、図２に示すように基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。
【００３６】
図２では100倍、101倍、102倍希釈溶液での例を示したが、希釈液数については、これに限定されないことは明らかである。
【００３７】
さらに、図３に示すように、１つの反応系内で配列の異なる複数の鋳型配列をマルチ増幅することも可能である。増幅後、検体の増幅産物に対しDNAチップ検出を行えば、複数の鋳型配列について、核酸定量を行うことができる。検出は、基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。図３では２つの鋳型配列の例を示したが、鋳型核酸の数は、これに限定されないことは明らかである。
【００３８】
さらに、図４に示すように、希釈液毎且つ検体毎に異なるタグを準備すれば、複数検体を同時検出することも可能である。増幅後、検体の増幅産物に対しDNAチップ検出を行えば、複数の検体について、核酸定量を行うことができる。図４では３つの検体の例を示したが、検体の数は、これに限定されないことは明らかである。
【００３９】
さらに、図５、図６および図７に示すように、変異、多型および/または型解析を行うためのプライマーセットを準備すれば、定量と変異、多型および/または型解析を同時に行うことができる。変異、多型および/または型解析を行うためのプライマーセットは、図５に示すように定量用プライマーセットとは独立して増幅を行ってもよいし、図６に示すようにマルチ増幅を行っても良い。さらに図７に示すように定量用のプライマーセットと変異、多型および/または型解析用のプライマーセットが同一のものであってもよい（実施例２は図７のもの）。図５、図６、図７では1つの変異、多型および/または型解析用のプライマーセットの例を示したが、プライマーセットの数は、これに限定されないことは明らかである。
【００４０】
本実施形態における検出対象は、例えば個体のゲノムDNA、ゲノムRNA、mRNAなどが含まれる。個体は、これらに限定されるものでないが、ヒト、ヒト以外の動物、植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物が含まれる。
【００４１】
これらの核酸は、個体から採取した試料、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等から抽出される。或いは、微生物から直接抽出される。核酸の抽出は、これらに限定されないが、市販の核酸抽出キットであるＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用して実行することができる。個体試料や微生物から抽出された核酸を含む溶液を被検液とする。
【００４２】
検体は、本実施形態の方法に係る増幅法により増幅される。検出対象がRNAの場合には、増幅前に例えば逆転写酵素によって相補鎖DNAに変換することができる。逆転写酵素とDNAポリメラーゼの両方を同一チューブ内に添加し、逆転写とDNA増幅を同時に行ってもよい。
【００４３】
増幅法については、例えば、Polymerase chain reaction法（PCR法）、Loop mediated isothermal amplification法(LAMP法)、Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN法)、SMAP法、Nucleic acid sequence-based amplification法(NASBA法)、Strand displacement amplification (SDA法)、Ligase chain reaction(LCR法)、Rolling Circle Amplification法(RCA法)などの方法を用いることができる。得られた増幅産物は、必要に応じて断片化されるか、1本鎖化される。1本鎖化する手段としては、例えば、熱変性、ビーズや酵素等を用いる方法、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う方法などそれ自身公知の方法を使用してよい。LAMP法やICAN法などによって増幅され、産物中に1本鎖領域が存在し、この1本鎖領域を標的配列とする場合には、そのままハイブリダイゼーション工程に供することができる。
【００４４】
この１本鎖化工程が不要となるため、増幅により得られた標的核酸はステム・ループ構造を有することが好ましい。ステム・ループ構造を有する増幅産物は、１本鎖であるループ部分の配列をプローブとの反応に都合よく用いることができる。
【００４５】
標的核酸の増幅には、LAMP法が好適に用いられる。LAMP法は、迅速かつ簡便な遺伝子増幅法であり、増幅産物中にステム・ループ構造を有している。
【００４６】
図８はLAMP法で使用される基本的なプライマーの設計例を示す図である。図８の模式図を用いて、LAMP法の原理を簡単に説明する。LAMP法では、鋳型核酸の最大８つの領域を認識する６種類のプライマーと鎖置換型DNA合成酵素を用いる。鋳型核酸は、等温（60〜65℃）条件下で増幅される。上記８つの領域は、鋳型核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側から順にB3c領域、B2c領域、LBc領域、及びB1c領域と定義される。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、及びB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、及びB3c領域の相補鎖における領域を示している。図８に示す８種のプライマーは、5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPインナープライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPインナープライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、LBc領域と同じ配列をもつLBcプライマーである。増幅反応に必須なのはFIPインナープライマー、BIPインナープライマーであり、F3プライマー、B3プライマー、LFプライマーおよびLBプライマーは、増幅効率を高めるために添加される。
【００４７】
LAMP法による増幅産物中には図９に示すようなループ構造が形成され、F2領域からF1領域の間、F2c領域からF1c領域の間、B2領域からB1領域間、およびB2c領域からB1c領域間が１本鎖の領域となる。このため、この領域に標的配列を設計すれば、簡便かつ高感度に標的核酸を検出できる。
【００４８】
LFプライマーおよび/またはLBプライマーと標的配列が重なる場合には、LFプライマーおよび/またはLBプライマーは添加しない方が好ましい。
【００４９】
図10を用いてLAMP法を用いた場合のタグ配列導入プライマーとDNAチップを用いた核酸定量法について説明する。
【００５０】
まず、F2領域および/またはB2領域に前記タグ配列を導入したプライマーを希釈液毎に準備する。
【００５１】
次に、該プライマーを用いて希釈液毎に独立した反応系において増幅を行なう。例えば、希釈液毎に別チューブで増幅を行えばよい。増幅後、１本鎖ループ部分に希釈液毎に一部配列が異なる増幅産物が得られる。希釈液の鋳型量が最低検出濃度以下の場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。この増幅産物を混合し、図10に示すように基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。各反応系において得られた増幅産物は、希釈液毎に異なるタグ配列と鋳型核酸由来の領域を含む。従って、増幅産物に含まれるタグ配列を同定し、いずれの段階の希釈液までが増幅されたかを特定することにより、原液の核酸量を定量することができる。図１０では100倍、101倍、102倍希釈溶液での例を示したが、希釈液数については、これに限定されないことは明らかである。
【００５２】
さらに、１つの反応系内で異なる配列からなる複数種類の鋳型配列をマルチ増幅することも可能である。増幅後、各希釈液の増幅産物に対し、DNAチップ検出を行えば、複数の鋳型配列について、核酸定量を行うことができる。検出は、基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。
【００５３】
＜DNAチップ＞
本実施形態において使用されるDNAチップは、基体と基体上に固定化された核酸プローブとを具備すればよい。DNAチップの基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってよい。
【００５４】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００５５】
DNAチップの例を模式図として図１２に示すが、これに限定するものではない。DNAチップは、基体1に固定化領域2を具備する。核酸プローブは該固定化領域２に固定化される。このようなDNAチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１に配置される固定化領域２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなDNAチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。
【００５６】
DNAチップの他の例を図１３に示す。図１３のDNAチップは、基体11に電極12を具備する。核酸プローブは該電極12に固定化される。電極12は、パット13に接続される。電極12からの電気的情報はパット13を介して取得される。このようなDNAチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体11に配置される電極12の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のDNAチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。
【００５７】
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム又はタングステンのような金属単体及びそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素又はそれらの酸化物又は化合物を用いることができるが、それらに限定されない。
【００５８】
本例のようなDNAチップは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられてよい。
【００５９】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドが十分に形成される適切な条件下で行えばよい。適切な条件は、標的核酸の種類及び構造、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行えばよい。反応温度は10℃〜90℃の範囲であってよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めても良い。反応溶液中には、硫酸デキストラン、サケ精子DNA、及び牛胸腺DNAのようなハイブリダーゼション促進剤、EDTA、又は界面活性剤などを添加してもよい。
【００６０】
＜洗浄条件＞
ハイブリダイゼーション後、DNAチップを洗浄するための洗浄液は、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いて調製したSSC溶液、Tris-HCｌ溶液、Tween20溶液、又はSDS溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は、例えば10℃〜70℃の範囲で行う。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。或いは、洗浄液中にDNAチップを浸漬させてもよい。この場合、洗浄液は温度制御可能な容器中に収容されることが好ましい。
【００６１】
＜検出方法＞
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
【００６２】
(a)蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをFITC、Cy3、Cy5、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または2次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
【００６３】
(b)電気化学的検出方式
当該分野で周知の2本鎖認識物質を用いる。2本鎖認識物質は、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの2本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
【００６４】
2本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には１ng/mL~1mg/mLの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が0.001〜5の範囲であり、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いることができる。
【００６５】
測定は、例えば2本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、2本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、及びファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。
【００６６】
＜アッセイキット＞
本実施形態は、アッセイキットの形態であってもよい。アッセイキットは、上述の何れかの実施形態の核酸定量用の少なくとも１のタグ配列を導入されたプライマーを含むプライマーセットを含めばよく、更に、任意に、希釈液、各種酵素、反応容器、取扱説明書などを含んでもよい。
【００６７】
アッセイキットに含まれるプライマーセットの例を以下に記す。
【００６８】
鋳型配列の5’末端側よりF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側よりB3c領域、B2c領域、LBc領域、B1c領域を設定したとき、
（1） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー；
（2） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
（3） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
（4） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（5） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（6） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（7） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
（8） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるを挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
（9） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー。
【００６９】
しかしながら、上記の実施形態に合わせて様々なプライマーセットが選択されてよく、そのような構成は、当業者には十分に理解され、それらの構成も本実施形態の例に含まれる。
【００７０】
＜最低検出限界について＞
本実施形態において利用できる最低検出限界の測定法は、それ自身公知の何れの測定法も使用してよい。例えば、一般的に使用される次のようは最低検出限界の測定方法を利用してもよい。
【００７１】
はじめに、（１）標準鋳型の重量を既存の計量器具で測定する。次に（２）標準鋳型の長さ、塩基の種類などから1コピー当たりの質量を計算する。その後、前記（１）で測定した重量を（２）で算出した1コピー当たりの質量で割り算すれば、標準鋳型のコピー数を算出することができる。次にコピー数が明確になった標準鋳型について、段階希釈し、設計したプライマーで増幅を行う。増幅反応液の組成、反応条件は、適宜検討し、最適化する。どの段階希釈液まで増幅可能であったかを検討することにより、最低検出限界を算出することができる。標準鋳型は増幅する領域を導入したプラスミドでもよいし、合成したRNAでもよいし、検査対象とする生物種の全ゲノムであってもよい。
【００７２】
例えば、標準鋳型を増幅したい領域を導入したプラスミドとした場合、例えば、プラスミドの長さが4000bp、増幅領域（インサート）の長さが1000bpであった場合、増幅領域を導入したプラスミドの全長は5000bpとなる。標準鋳型の重量は20ng/μLであったとする。また、5000bpのプラスミドの1コピー当たりの質量は（5000bp×660）/（6.02×1023）となる。よって、標準鋳型のコピー数は、（20×6.02×1023）/(5000bp×660×109）＝3.69×109copies/μLとなる。このようにコピー数が既知となった標準鋳型について、段階希釈を行い最低検出限界を調べればよい。
【実施例１】
【００７３】
本実施形態の方法による検出の具体例を示す。
【００７４】
タグ配列を導入したプライマーにより、核酸量をDNAチップにより定量する方法について示す実施例を詳述する。
【００７５】
（１）鋳型核酸の希釈液の準備
鋳型核酸は、マウスに感染するHelicobacter属に属するHelicobacter hepaticusの16SrRNA配列をプラスミドへ導入したものを用いた。106ccopies/μL 、105ccopies/μL、104ccopies/μL、103ccopies/μL、102ccopies/μL、101ccopies/μLのプラスミド溶液をTE溶液で各々100倍（原液）、101倍、102倍、103倍、104倍希釈し、段階希釈液を作製した。
【００７６】
（２）標的核酸の増幅
上記（１）で段階希釈した溶液を、各々LAMP反応溶液中に1μL添加し、LAMP増幅を行った。
【００７７】
［プライマー］
プライマーセットはHelicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori（配列は表１ＡおよびＢ）を含め、Helicobacter属を共通で増幅するものを使用した。標的核酸の増幅に用いた合成DNAオリゴプライマーを表２に示した。変異に対応するためFIPプライマーは2種を等量混合した。FIPプライマーに100倍希釈溶液を増幅するタグ1（CTG）導入プライマー、101倍希釈溶液を増幅するタグ2（GGA）導入プライマー、102倍希釈溶液を増幅するタグ3（CCT）導入プライマー、103倍希釈溶液を増幅するタグ4（TCC）導入プライマー、104倍希釈溶液を増幅するタグ5（ATC）導入プライマーの５種を準備した。このプライマーセットの最低検出限界は、102ccopies/反応液であった。
【表１Ａ】
【００７８】
【表１Ｂ】
【００７９】
【表２】
【００８０】
［LAMP反応液］
LAMP法に用いた反応溶液の組成を表３に示した。
【表３】
【００８１】
［核酸の増幅］
LAMP法により、63℃で１時間、核酸を増幅させた。ネガティブコントロールでは、鋳型の代わりに滅菌水を用いた。増幅はGeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）で行った。
【００８２】
（３）標的核酸のDNAチップ検出
上記（２）で増幅した産物のチップ検出を行った。
【００８３】
［核酸プローブ］
検出に使用した合成DNAオリゴ核酸プローブを表４に示した。
【表４】
【００８４】
核酸プローブとして、タグ1（100倍希釈溶液）検出用、タグ2（101倍希釈溶液）検出用、タグ3（102倍希釈溶液）検出用、タグ4（103倍希釈溶液）検出用、タグ5（104倍希釈溶液）検出用の5種を準備した。また、ネガティブコントロールとして、Helicobacter遺伝子配列とは無関係な配列を有するネガティブプローブ5種を混合して用いた。以上のプローブは、金電極に固定化するために3’末端側をチオール修飾した。
【００８５】
［プローブ固定化電極］
上記のプローブを、金電極へ固定化した。プローブの固定化は、チオールと金との強い共有結合性を利用して行った。1mMメルカプトヘキサノール溶液を含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、乾燥させた。同一プローブは各4電極にスポットした。各プローブの電極の位置を以下に示す。乾燥後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極を得た。
【００８６】
［電極配置］
電極の配列は次の通りとした；
1−4電極 ネガティブプローブ
5−8電極 タグ1検出用プローブ
9−12電極 タグ2検出用プローブ
13−16電極 タグ3検出用プローブ
17−20電極 タグ4検出用プローブ
21−24電極 タグ5検出用プローブ
25−28電極 ネガティブプローブ。
【００８７】
[ハイブリダイゼーション]
上記のように作製したプローブ固定化電極を、2×SSCの塩を添加したLAMP産物に浸漬し、64℃で10分間静置させて、ハイブリダイゼーションを行った。その後、プローブ固定化電極を0.2×SSC溶液に44℃で3分間浸漬して洗浄した。次いで、プローブ固定化電極を、挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に1分間浸漬した。その後、ヘキスト33258溶液の酸化電流応答を測定した。
【００８８】
［結果］
図１４に示すように、106ccopies/反応液については、100希釈、101希釈、102希釈、103希釈、104希釈全てにおいて、信号増加が検出された。105copies/反応液については103希釈まで、104copies/反応液については102希釈まで、103copies/反応液については101希釈まで、102copies/反応液については100希釈まで信号増加が検出された。101copies/反応液については、全ての希釈段階で信号増加が検出されなかった。これにより、タグ導入プライマーを用いることにより、検体の核酸量を定量できることが示された。
【実施例２】
【００８９】
核酸量および遺伝子型の両方を同時にDNAチップにより同時検出する方法について示す実施例を詳述する。
【００９０】
（１）鋳型核酸の希釈液の準備
鋳型核酸は、実施例1と同様のプラスミドを用いた。104ccopies/μLのプラスミド溶液をTE溶液で100倍（原液）、101倍、102倍、103倍、104倍希釈し、段階希釈液を作製した。
【００９１】
（２）標的核酸の増幅
実施例1と同様の方法で行った。このプライマーセットは、Helicobacter属を共通で増幅すると共に、増幅されている鋳型由来領域にはHelicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori各々を識別できる領域が含まれており、この領域をプローブで検出することにより、種判別も行うことができる。
【００９２】
（３）標的核酸のDNAチップ検出
［核酸プローブ］
検出に使用した合成DNAオリゴ核酸プローブを表４に示した。
【００９３】
鋳型核酸量を定量するための核酸プローブとして、タグ1（100倍希釈溶液）検出用、タグ2（101倍希釈溶液）検出用、タグ3（102倍希釈溶液）検出用、タグ4（103倍希釈溶液）検出用、タグ5（104倍希釈溶液）検出用の5種を準備した。また、種判別するための核酸プローブとして、Helicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori各々を検出するプローブを準備した。また実施例1同様、ネガティブコントロールとして、Helicobacter遺伝子配列とは無関係な配列を有するネガティブプローブ5種を混合して用いた。以上のプローブは、金電極に固定化するために3’末端側をチオール修飾した。
【００９４】
［プローブ固定化電極］
実施例1と同様の方法で行った。
【００９５】
［電極配置］
電極配置は次の通りとした；
1−4電極 ネガティブプローブ
5−8電極 Helicobacter hepaticus検出用プローブ
9−12電極 Helicobacter bilis検出用プローブ
13−16電極 Helicobacter typhlonius検出用プローブ
17−20電極 Helicobacter pylori検出用プローブ
21−24電極 タグ1検出用プローブ
25−28電極 タグ2検出用プローブ
29−32電極 タグ3検出用プローブ
33−36電極 タグ4検出用プローブ
37−40電極 タグ5検出用プローブ
41−44電極 ネガティブプローブ。
【００９６】
[ハイブリダイゼーション]
実施例1と同様の方法で行った。
【００９７】
［結果］
図１５に示すように、定量用プローブについては、102希釈まで信号増加が見られており、原液は104copies/反応液であることが示された。また、型判別用プローブについては、Helicobacter hepaticusを検出するプローブから信号増加が見られた。これらの結果から、タグ導入プライマー、タグ導入核酸プローブ、型判別用核酸プローブ、およびDNAチップを用いることにより、核酸定量と型判別を同時に解析できることが示された。
【００９８】
このように本実施形態により、複数の検体、複数の遺伝子、遺伝子変異および／または遺伝子多型を含む核酸を同時解析することが可能となり、且つ簡便、安価に核酸量を決定することが達成される。
【符号の説明】
【００９９】
１…基体、２…固定化領域、１１…基体、１２…電極、１３…パット
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、一般的に核酸定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現量、遺伝子変異・多型を解析することは、病気の薬効、副作用などに関連する遺伝子を発見したり、また個人の体質、病気のなりやすさを診断し、個人に合わせたテーラーメイド医療を実現するために重要である。更にまた、感染症の原因となる細菌やウィルスの感染量、遺伝子変異・多型を解析することは、適切な診断・治療を施すために重要である。
【０００３】
現在使用されている遺伝子発現量、細菌・ウィルス量を定量する方法には、例えば、リアルタイムPCRやDNAチップなど、プローブとのハイブリダイゼーションの可否により、判定されている。リアルタイムPCR法は、簡便、且つ比較的短時間で検査を行うことが出来る。しかしながら、複数の遺伝子を同時に検査したい場合には、遺伝子毎に検査を行わなくてはならず、不便である。また、DNAチップを用いた方式は、蛍光標識法が主流であり、操作が煩雑、高価な装置が必要であり、研究用途に限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、簡便に核酸を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態の核酸定量法は、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b) 濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記タグ配列は、これを含むプライマーが、前記検体毎に鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに混合することと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量することと；
を具備する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】タグ導入プライマー、プローブの設計方法。
【図２】定量法の原理図（基本）を示す図。
【図３】定量法の原理図（複数核酸マルチ増幅）を示す図。
【図４】定量法の原理図（複数検体同時検出）を示す図。
【図５】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 別々増幅）を示す図。
【図６】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 同時増幅）を示す図。
【図７】定量法の原理図（定量＋遺伝子変異・多型解析 同一ターゲット）を示す図。
【図８】LAMPの基本プライマー設計を示す図。
【図９】LAMPの中間産物を示す図。。
【図１０】定量法の原理図（LAMP増幅法を用いた場合）を示す図。
【図１１】タグ導入プライマー・プローブの設計方法（LAMP法の場合）を示す図。
【図１２】プローブ核酸固定化基体の概略構成を示す平面図-1 。
【図１３】プローブ核酸固定化基体の概略構成を示す平面図-2 。
【図１４Ａ】実施例１の図。
【図１４Ｂ】実施例１の図。
【図１４Ｃ】実施例１の図。
【図１４Ｄ】実施例１の図。
【図１４Ｅ】実施例１の図。
【図１４Ｆ】実施例１の図。
【図１５】実施例２の図。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［定義］
「核酸」とは、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質を総括的に示す語である。
【０００８】
「検体」とは、本実施形態に従い解析方法を行なうべき対象であり、核酸を含む可能性のある試料であればよい。検体は、増幅反応および／またはハイブリダイゼーション反応を妨害しない状態であることが好ましい。例えば、生体などから得られた材料を、本実施形態に従う検体として使用するためには、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行えばよい。例えば、検体は液体であってもよく、その場合、「被検液」と称してもよい。従って、「被検液」とは、核酸または鋳型核酸が存在する可能性のある溶液と解されてよい。
【０００９】
検体に含まれる核酸を「検体核酸」と称する。検体核酸のうち、本実施形態のプライマーにより増幅しようとする配列を「鋳型配列」と称す。鋳型配列を含む核酸を「鋳型核酸」または「鋳型」と称す。
【００１０】
「標的核酸」とは、鋳型核酸または鋳型配列を、本実施形態に従うフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅して得られた増幅産物をいう。標的核酸は、その一部に標的配列を含む。
【００１１】
「標的配列」とは、核酸プローブを用いて標的核酸を検出するために利用される。
【００１２】
「核酸プローブ」とは、標的配列と相補的な配列を含む核酸である。核酸プローブは基体などの固相上に固定化されて使用され、鋳型配列に由来の領域を含む増幅産物とハイブリッドを形成する。
【００１３】
「鋳型配列由来の領域」とは、プライマーによって増幅される領域のうち、プライマーが結合する領域以外の領域で、鋳型の配列が反映される領域を意味する。遺伝子多型または遺伝子変異を検出する場合には、それらの部位がこの領域内に収まるように設計される。
【００１４】
「DNAチップ」とは、検出しようとする核酸に相補的な配列を有する核酸プローブと、検出対象の核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸を解析する装置である。DNAチップの語は、一般的に使用される「核酸チップ」、「マイクロアレイ」および「DNAアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００１５】
また、解析される項目は、例えば、遺伝子発現量の測定、ウイルスおよび／または細菌などに由来する核酸などの定量、多型についての遺伝子型の同定および／または変異の有無の検出などであってよい。これに限定するものではない。
【００１６】
「増幅」とは、プライマーセットを用いて目的とする核酸を増幅することをいい、PCR法およびLAMP法を含む。「LAMP法」は、LAMP法およびRT-LAMP法を含む。「RT-LAMP法」は、等温遺伝子増幅法であるLAMP法の１種である。RT-LAMP法は、逆転写反応とLAMP反応を同時に行うことによりRNAを鋳型として、LAMP増幅を行う方法である。ここおいて単に「LAMP法」と記載した場合、特に記載のない限り「LAMP法」と「RT-LAMP法」の両方について言及すると解されてよい。LAMP法とRT-LAMP法のプライマーは互いに同じプライマーを用いることが可能である。
【００１７】
［実施形態］
以下、本実施形態について説明する。
【００１８】
実施形態の定量方法は、検体を段階的に希釈し、得られた複数の希釈液それぞれについて、標的配列が検出される否かを検出し、標的配列が検出された希釈液の希釈倍率と、検出されなかった希釈液の希釈倍率、即ち、希釈による標的配列の検出限界を指標として、元液である検体に含まれる核酸量を測定する原理を利用し、且つこの際に、異なるタグ配列を使用することにより、検体に含まれる標的核酸を増幅することにより、複数の検体、複数の遺伝子、遺伝子変異および／または遺伝子多型を含む核酸を同時解析することが可能となり、且つ簡便、安価に核酸量を決定することを達成するものである。
【００１９】
＜希釈溶液の取得方法＞
検体の希釈溶液は、マイクロピペットを用いるマニュアル操作または自動装置によって段階希釈して作製すればよい。また、それ自身公知のグラジエント送液装置技術を用いてもよい。段階希釈された異なる濃度の希釈溶液は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上または９以上など、定量の精度や検体の状態などに応じて選択されてよく、更に、段階希釈の程度、即ち、１段階の希釈における希釈程度は、２倍希釈、３倍希釈、４倍希釈、５倍希釈、６倍希釈、１０倍希釈、３０倍希釈、１００倍希釈、１００倍希釈など所望に応じて選択されてよい。また、本実施形態を繰り返し行うことにより、より詳細な定量が達成されてもよい。
【００２０】
＜定量解析用プライマー＞
図１のタグ導入Fプライマーに例示されるように、プライマーには、鋳型核酸のプライマー結合部位に結合する配列と、検体希釈液を解析するためのタグ配列を導入する。または必要に応じてタグ配列は複数検体を検出するためにも使われる。
【００２１】
タグ配列は各段階希釈液によって異なる配列を用いる。また、複数検体を同時にDNAチップ検出する場合には、検体希釈液毎、且つ検体毎に互いに識別可能な異なるタグ配列を準備する。タグ配列の塩基数は3塩基〜7塩基であってよい。タグ配列は、それを含むプライマーが鋳型核酸に結合した際に、タグ配列部分が鋳型核酸には結合せずにループアウトするように設計される。またタグ配列を単に「タグ」とも称する。
【００２２】
プライマーの長さは、13〜40塩基、例えば、15〜30塩基であってよい。タグ配列を含むプライマー（以下「タグ配列含有プライマー」または「タグ含有プライマー」とも称する）の場合、長さは16〜47塩基、例えば、18〜37塩基であってよい。
【００２３】
前記タグ配列のプライマーへの挿入場所については、次のことが重要である。即ち、プライマーはタグ配列部分がループアウトして鋳型に結合する必要がある。更に、核酸プローブはタグ配列と鋳型配列由来の配列の両方を含む必要がある。従って、タグ配列は、PCR増幅の場合、Forwardプライマー(Fプライマー)および／またはReverseプライマー(Rプライマー)の3’末端側から6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。LAMP増幅の場合、F2領域および/またはB2領域の3'末端から6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。具体的には、FIPプライマーのF2配列の3'末端から6塩基目から12塩基目、および／またはBIPプライマーのB2配列の6塩基目から12塩基目に挿入されればよい。これにより良好な増幅と検出特性が得られる。
【００２４】
タグ配列を構成する核酸の種類は、DNA、RNA、PNA、LNA、S-オリゴ、メチルホスホネートオリゴなど、その一部の構造を塩基配列によって表すことが可能な物質であれば特に限定されない。
【００２５】
＜変異および多型解析用プライマー＞
核酸の定量に加えて、鋳型核酸中の変異、多型または型判別を行いたい場合には、変異、多型および／または型判別用プライマーセットを準備すればよい。当該プライマーセットは、増幅産物中に変異、多型または型を含むように設計され、この領域を核酸プローブで検出することにより、変異、多型または型判別を行うことができる。当該プライマーセットは、定量用のタグ導入プライマーを含むプライマーセットと同一のものであってもよく、各々に別のプライマーセットを準備してもよい。また、別に準備する場合には、定量用に準備したプライマーセットとマルチ増幅してもよい。
【００２６】
＜定量解析用核酸プローブ＞
核酸プローブは、定量用に増幅した標的核酸の中に含まれるタグ配列を検出するため、タグ配列に相補的な配列を含むように設計される。また図１に示すように鋳型配列由来の領域と相補的な配列を含むように設計される。
【００２７】
本実施形態に従う核酸プローブの鎖長は、特に限定されるものではないが、5〜50塩基の範囲が好ましく、10〜40塩基の範囲がより好ましく、15〜35塩基の範囲がさらに好ましい。
【００２８】
また、核酸プローブは、基体に固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾したものであってもよい。官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。
【００２９】
核酸プローブを固定化するための固相は、一般的にDNAチップのための固相として使用される何れかの基体であればよい。そのような基体は、ガラス、シリコン、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、又は光ファイバーなどによって構成されてよいが、これらに限定されない。これらの基体上に複数種の核酸プローブを固定化し、DNAチップを構成すればよい。
【００３０】
＜変異および多型解析用核酸プローブ＞
核酸の定量解析と同時に、検体中の核酸の遺伝子変異および／または多型を解析したい場合には、変異および／または多型を検出する核酸プローブを準備する。例えば、野生型検出用の核酸プローブ、変異型検出用の核酸プローブをそれぞれ用い、野生型検出用の核酸プローブと標的核酸、変異型検出用の核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション量を比較することにより、検体の遺伝子型を同時に判定することができる。
【００３１】
検体中の遺伝子の型判別、種判別を行う場合には、検出したい型および／または種を検出する核酸プローブを準備する。例えば、細菌の同じ属に分類されている複数の種を同定する場合に、例えば属共通に増幅するプライマーセットを準備し、増幅を行う。この属共通のプライマーセットにタグを導入し、前述のようにタグ導入核酸プローブで検出すれば、細菌の核酸量を定量することができる。さらに、各々の種に特徴的で他の種と特異性の出せる領域をプローブ領域に設定する。各々の種に特徴的な配列を有する、種同定用の核酸プローブと標的核酸、種と無関係の配列を示すネガティブコントロール用核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション量を比較することにより、細菌の核酸の定量と同時に種の同定を行うことができる（実施例２参照）。
【００３２】
＜方法＞
次にタグ配列を導入したプライマーとDNAチップを用いた核酸定量方法について説明する。
【００３３】
図２に示すように、まず、検体希釈液ごとに配列の異なるタグ配列（タグ配列１、タグ配列２、タグ配列３・・・）を導入したプライマー（100倍希釈用プライマー、101倍希釈用プライマー、102倍希釈用プライマー・・・）を準備し、検体希釈液毎に独立した反応系において増幅を行なう。検体希釈液毎に独立した反応系とは、各希釈液が混じり合わない反応系であればよい。例えば、希釈液毎に別チューブで増幅を行えばよい。「反応系」とは、そこにおいて反応が行なわれるための反応場をいい、例えば、チューブおよびウェルなどの容器であればよい。
【００３４】
増幅後、希釈液毎に一部配列が異なる増幅産物が得られる。希釈液の鋳型量が最低検出濃度以下の場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。各反応系において得られた増幅産物は、希釈液毎に異なるタグ配列と鋳型核酸由来の領域を含む。従って、増幅産物に含まれるタグ配列を同定し、いずれの段階の希釈液までが増幅されたかを特定することにより、原液の核酸量を定量することができる。
【００３５】
この増幅産物を混合し、図２に示すように基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。
【００３６】
図２では100倍、101倍、102倍希釈溶液での例を示したが、希釈液数については、これに限定されないことは明らかである。
【００３７】
さらに、図３に示すように、１つの反応系内で配列の異なる複数の鋳型配列をマルチ増幅することも可能である。増幅後、検体の増幅産物に対しDNAチップ検出を行えば、複数の鋳型配列について、核酸定量を行うことができる。検出は、基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。図３では２つの鋳型配列の例を示したが、鋳型核酸の数は、これに限定されないことは明らかである。
【００３８】
さらに、図４に示すように、希釈液毎且つ検体毎に異なるタグを準備すれば、複数検体を同時検出することも可能である。増幅後、検体の増幅産物に対しDNAチップ検出を行えば、複数の検体について、核酸定量を行うことができる。図４では３つの検体の例を示したが、検体の数は、これに限定されないことは明らかである。
【００３９】
さらに、図５、図６および図７に示すように、変異、多型および/または型解析を行うためのプライマーセットを準備すれば、定量と変異、多型および/または型解析を同時に行うことができる。変異、多型および/または型解析を行うためのプライマーセットは、図５に示すように定量用プライマーセットとは独立して増幅を行ってもよいし、図６に示すようにマルチ増幅を行っても良い。さらに図７に示すように定量用のプライマーセットと変異、多型および/または型解析用のプライマーセットが同一のものであってもよい（実施例２は図７のもの）。図５、図６、図７では1つの変異、多型および/または型解析用のプライマーセットの例を示したが、プライマーセットの数は、これに限定されないことは明らかである。
【００４０】
本実施形態における検出対象は、例えば個体のゲノムDNA、ゲノムRNA、mRNAなどが含まれる。個体は、これらに限定されるものでないが、ヒト、ヒト以外の動物、植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物が含まれる。
【００４１】
これらの核酸は、個体から採取した試料、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等から抽出される。或いは、微生物から直接抽出される。核酸の抽出は、これらに限定されないが、市販の核酸抽出キットであるＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用して実行することができる。個体試料や微生物から抽出された核酸を含む溶液を被検液とする。
【００４２】
検体は、本実施形態の方法に係る増幅法により増幅される。検出対象がRNAの場合には、増幅前に例えば逆転写酵素によって相補鎖DNAに変換することができる。逆転写酵素とDNAポリメラーゼの両方を同一チューブ内に添加し、逆転写とDNA増幅を同時に行ってもよい。
【００４３】
増幅法については、例えば、Polymerase chain reaction法（PCR法）、Loop mediated isothermal amplification法(LAMP法)、Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN法)、SMAP法、Nucleic acid sequence-based amplification法(NASBA法)、Strand displacement amplification (SDA法)、Ligase chain reaction(LCR法)、Rolling Circle Amplification法(RCA法)などの方法を用いることができる。得られた増幅産物は、必要に応じて断片化されるか、1本鎖化される。1本鎖化する手段としては、例えば、熱変性、ビーズや酵素等を用いる方法、T7 RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行う方法などそれ自身公知の方法を使用してよい。LAMP法やICAN法などによって増幅され、産物中に1本鎖領域が存在し、この1本鎖領域を標的配列とする場合には、そのままハイブリダイゼーション工程に供することができる。
【００４４】
この１本鎖化工程が不要となるため、増幅により得られた標的核酸はステム・ループ構造を有することが好ましい。ステム・ループ構造を有する増幅産物は、１本鎖であるループ部分の配列をプローブとの反応に都合よく用いることができる。
【００４５】
標的核酸の増幅には、LAMP法が好適に用いられる。LAMP法は、迅速かつ簡便な遺伝子増幅法であり、増幅産物中にステム・ループ構造を有している。
【００４６】
図８はLAMP法で使用される基本的なプライマーの設計例を示す図である。図８の模式図を用いて、LAMP法の原理を簡単に説明する。LAMP法では、鋳型核酸の最大８つの領域を認識する６種類のプライマーと鎖置換型DNA合成酵素を用いる。鋳型核酸は、等温（60〜65℃）条件下で増幅される。上記８つの領域は、鋳型核酸の5’末端側から順にF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側から順にB3c領域、B2c領域、LBc領域、及びB1c領域と定義される。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、及びB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、及びB3c領域の相補鎖における領域を示している。図８に示す８種のプライマーは、5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPインナープライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPインナープライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、LBc領域と同じ配列をもつLBcプライマーである。増幅反応に必須なのはFIPインナープライマー、BIPインナープライマーであり、F3プライマー、B3プライマー、LFプライマーおよびLBプライマーは、増幅効率を高めるために添加される。
【００４７】
LAMP法による増幅産物中には図９に示すようなループ構造が形成され、F2領域からF1領域の間、F2c領域からF1c領域の間、B2領域からB1領域間、およびB2c領域からB1c領域間が１本鎖の領域となる。このため、この領域に標的配列を設計すれば、簡便かつ高感度に標的核酸を検出できる。
【００４８】
LFプライマーおよび/またはLBプライマーと標的配列が重なる場合には、LFプライマーおよび/またはLBプライマーは添加しない方が好ましい。
【００４９】
図10を用いてLAMP法を用いた場合のタグ配列導入プライマーとDNAチップを用いた核酸定量法について説明する。
【００５０】
まず、F2領域および/またはB2領域に前記タグ配列を導入したプライマーを希釈液毎に準備する。
【００５１】
次に、該プライマーを用いて希釈液毎に独立した反応系において増幅を行なう。例えば、希釈液毎に別チューブで増幅を行えばよい。増幅後、１本鎖ループ部分に希釈液毎に一部配列が異なる増幅産物が得られる。希釈液の鋳型量が最低検出濃度以下の場合には増幅は起こらず、増幅産物は得られない。この増幅産物を混合し、図10に示すように基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。各反応系において得られた増幅産物は、希釈液毎に異なるタグ配列と鋳型核酸由来の領域を含む。従って、増幅産物に含まれるタグ配列を同定し、いずれの段階の希釈液までが増幅されたかを特定することにより、原液の核酸量を定量することができる。図１０では100倍、101倍、102倍希釈溶液での例を示したが、希釈液数については、これに限定されないことは明らかである。
【００５２】
さらに、１つの反応系内で異なる配列からなる複数種類の鋳型配列をマルチ増幅することも可能である。増幅後、各希釈液の増幅産物に対し、DNAチップ検出を行えば、複数の鋳型配列について、核酸定量を行うことができる。検出は、基体上に固定化した各タグ配列に相補的な配列を含む核酸プローブとハイブリダイゼーションさせる。その後、増幅産物と核酸プローブのハイブリダイゼーションを適宜の検出法により検出する。
【００５３】
＜DNAチップ＞
本実施形態において使用されるDNAチップは、基体と基体上に固定化された核酸プローブとを具備すればよい。DNAチップの基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってよい。
【００５４】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００５５】
DNAチップの例を模式図として図１２に示すが、これに限定するものではない。DNAチップは、基体1に固定化領域2を具備する。核酸プローブは該固定化領域２に固定化される。このようなDNAチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１に配置される固定化領域２の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなDNAチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。
【００５６】
DNAチップの他の例を図１３に示す。図１３のDNAチップは、基体11に電極12を具備する。核酸プローブは該電極12に固定化される。電極12は、パット13に接続される。電極12からの電気的情報はパット13を介して取得される。このようなDNAチップは、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体11に配置される電極12の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のDNAチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。
【００５７】
電極は、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム又はタングステンのような金属単体及びそれらの合金、或いは、グラファイト、グラシーカーボンのような炭素又はそれらの酸化物又は化合物を用いることができるが、それらに限定されない。
【００５８】
本例のようなDNAチップは、電気化学的な検出方法のために好適に用いられてよい。
【００５９】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
ハイブリダイゼーションは、ハイブリッドが十分に形成される適切な条件下で行えばよい。適切な条件は、標的核酸の種類及び構造、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液中でハイブリダイゼーションを行えばよい。反応温度は10℃〜90℃の範囲であってよい。攪拌や振盪などにより、反応効率を高めても良い。反応溶液中には、硫酸デキストラン、サケ精子DNA、及び牛胸腺DNAのようなハイブリダーゼション促進剤、EDTA、又は界面活性剤などを添加してもよい。
【００６０】
＜洗浄条件＞
ハイブリダイゼーション後、DNAチップを洗浄するための洗浄液は、イオン強度が0.01〜5の範囲であり、pH5〜9の範囲の緩衝液が好適に用いられる。洗浄液は塩及び界面活性剤などを含むことが好ましい。例えば、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いて調製したSSC溶液、Tris-HCｌ溶液、Tween20溶液、又はSDS溶液などが好適に用いられる。洗浄温度は、例えば10℃〜70℃の範囲で行う。洗浄液は、プローブ固定化基体の表面又は核酸プローブを固定化した領域に通過又は滞留させる。或いは、洗浄液中にDNAチップを浸漬させてもよい。この場合、洗浄液は温度制御可能な容器中に収容されることが好ましい。
【００６１】
＜検出方法＞
ハイブリダイゼーション工程により生じたハイブリッドの検出は、蛍光検出方式及び電気化学的検出方式を利用することができる。
【００６２】
(a)蛍光検出方式
蛍光標識物質を用いて検出する。核酸の増幅工程で用いるプライマーをFITC、Cy3、Cy5、又はローダミンなどの蛍光色素のような、蛍光学的に活性な物質で標識してもよい。或いは、それらの物質で標識したセカンドプローブを用いてもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。検出装置により、標識された配列または2次プローブ中の標識を検出する。使用する標識に応じて適切な検出装置を用いる。例えば、蛍光物質を標識として用いた場合、蛍光検出器を用いて検出する。
【００６３】
(b)電気化学的検出方式
当該分野で周知の2本鎖認識物質を用いる。2本鎖認識物質は、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーターから選択してよい。更に、これらの2本鎖認識物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾してもよい。
【００６４】
2本鎖認識物質は、種類によって異なるが、一般的には１ng/mL~1mg/mLの範囲の濃度で使用する。この際には、イオン強度が0.001〜5の範囲であり、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いることができる。
【００６５】
測定は、例えば2本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、2本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で印加するか、或いは、パルスで印加するか、或いは、定電位を印加してもよい。ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、及びファンクションジェネレーターのような装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。電気化学的検出は、当該分野で周知の方法によって実施することができる。
【００６６】
＜アッセイキット＞
本実施形態は、アッセイキットの形態であってもよい。アッセイキットは、上述の何れかの実施形態の核酸定量用の少なくとも１のタグ配列を導入されたプライマーを含むプライマーセットを含めばよく、更に、任意に、希釈液、各種酵素、反応容器、取扱説明書などを含んでもよい。
【００６７】
アッセイキットに含まれるプライマーセットの例を以下に記す。
【００６８】
鋳型配列の5’末端側よりF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側よりB3c領域、B2c領域、LBc領域、B1c領域を設定したとき、
（1） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー；
（2） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
（3） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
（4） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（5） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（6） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
（7） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
（8） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるを挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
（9） 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー。
【００６９】
しかしながら、上記の実施形態に合わせて様々なプライマーセットが選択されてよく、そのような構成は、当業者には十分に理解され、それらの構成も本実施形態の例に含まれる。
【００７０】
＜最低検出限界について＞
本実施形態において利用できる最低検出限界の測定法は、それ自身公知の何れの測定法も使用してよい。例えば、一般的に使用される次のようは最低検出限界の測定方法を利用してもよい。
【００７１】
はじめに、（１）標準鋳型の重量を既存の計量器具で測定する。次に（２）標準鋳型の長さ、塩基の種類などから1コピー当たりの質量を計算する。その後、前記（１）で測定した重量を（２）で算出した1コピー当たりの質量で割り算すれば、標準鋳型のコピー数を算出することができる。次にコピー数が明確になった標準鋳型について、段階希釈し、設計したプライマーで増幅を行う。増幅反応液の組成、反応条件は、適宜検討し、最適化する。どの段階希釈液まで増幅可能であったかを検討することにより、最低検出限界を算出することができる。標準鋳型は増幅する領域を導入したプラスミドでもよいし、合成したRNAでもよいし、検査対象とする生物種の全ゲノムであってもよい。
【００７２】
例えば、標準鋳型を増幅したい領域を導入したプラスミドとした場合、例えば、プラスミドの長さが4000bp、増幅領域（インサート）の長さが1000bpであった場合、増幅領域を導入したプラスミドの全長は5000bpとなる。標準鋳型の重量は20ng/μLであったとする。また、5000bpのプラスミドの1コピー当たりの質量は（5000bp×660）/（6.02×1023）となる。よって、標準鋳型のコピー数は、（20×6.02×1023）/(5000bp×660×109）＝3.69×109copies/μLとなる。このようにコピー数が既知となった標準鋳型について、段階希釈を行い最低検出限界を調べればよい。
【実施例１】
【００７３】
本実施形態の方法による検出の具体例を示す。
【００７４】
タグ配列を導入したプライマーにより、核酸量をDNAチップにより定量する方法について示す実施例を詳述する。
【００７５】
（１）鋳型核酸の希釈液の準備
鋳型核酸は、マウスに感染するHelicobacter属に属するHelicobacter hepaticusの16SrRNA配列をプラスミドへ導入したものを用いた。106ccopies/μL 、105ccopies/μL、104ccopies/μL、103ccopies/μL、102ccopies/μL、101ccopies/μLのプラスミド溶液をTE溶液で各々100倍（原液）、101倍、102倍、103倍、104倍希釈し、段階希釈液を作製した。
【００７６】
（２）標的核酸の増幅
上記（１）で段階希釈した溶液を、各々LAMP反応溶液中に1μL添加し、LAMP増幅を行った。
【００７７】
［プライマー］
プライマーセットはHelicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori（配列は表１ＡおよびＢ）を含め、Helicobacter属を共通で増幅するものを使用した。標的核酸の増幅に用いた合成DNAオリゴプライマーを表２に示した。変異に対応するためFIPプライマーは2種を等量混合した。FIPプライマーに100倍希釈溶液を増幅するタグ1（CTG）導入プライマー、101倍希釈溶液を増幅するタグ2（GGA）導入プライマー、102倍希釈溶液を増幅するタグ3（CCT）導入プライマー、103倍希釈溶液を増幅するタグ4（TCC）導入プライマー、104倍希釈溶液を増幅するタグ5（ATC）導入プライマーの５種を準備した。このプライマーセットの最低検出限界は、102ccopies/反応液であった。
【表１Ａ】
【００７８】
【表１Ｂ】
【００７９】
【表２】
【００８０】
［LAMP反応液］
LAMP法に用いた反応溶液の組成を表３に示した。
【表３】
【００８１】
［核酸の増幅］
LAMP法により、63℃で１時間、核酸を増幅させた。ネガティブコントロールでは、鋳型の代わりに滅菌水を用いた。増幅はGeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）で行った。
【００８２】
（３）標的核酸のDNAチップ検出
上記（２）で増幅した産物のチップ検出を行った。
【００８３】
［核酸プローブ］
検出に使用した合成DNAオリゴ核酸プローブを表４に示した。
【表４】
【００８４】
核酸プローブとして、タグ1（100倍希釈溶液）検出用、タグ2（101倍希釈溶液）検出用、タグ3（102倍希釈溶液）検出用、タグ4（103倍希釈溶液）検出用、タグ5（104倍希釈溶液）検出用の5種を準備した。また、ネガティブコントロールとして、Helicobacter遺伝子配列とは無関係な配列を有するネガティブプローブ5種を混合して用いた。以上のプローブは、金電極に固定化するために3’末端側をチオール修飾した。
【００８５】
［プローブ固定化電極］
上記のプローブを、金電極へ固定化した。プローブの固定化は、チオールと金との強い共有結合性を利用して行った。1mMメルカプトヘキサノール溶液を含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、乾燥させた。同一プローブは各4電極にスポットした。各プローブの電極の位置を以下に示す。乾燥後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極を得た。
【００８６】
［電極配置］
電極の配列は次の通りとした；
1−4電極 ネガティブプローブ
5−8電極 タグ1検出用プローブ
9−12電極 タグ2検出用プローブ
13−16電極 タグ3検出用プローブ
17−20電極 タグ4検出用プローブ
21−24電極 タグ5検出用プローブ
25−28電極 ネガティブプローブ。
【００８７】
[ハイブリダイゼーション]
上記のように作製したプローブ固定化電極を、2×SSCの塩を添加したLAMP産物に浸漬し、64℃で10分間静置させて、ハイブリダイゼーションを行った。その後、プローブ固定化電極を0.2×SSC溶液に44℃で3分間浸漬して洗浄した。次いで、プローブ固定化電極を、挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に1分間浸漬した。その後、ヘキスト33258溶液の酸化電流応答を測定した。
【００８８】
［結果］
図１４に示すように、106ccopies/反応液については、100希釈、101希釈、102希釈、103希釈、104希釈全てにおいて、信号増加が検出された。105copies/反応液については103希釈まで、104copies/反応液については102希釈まで、103copies/反応液については101希釈まで、102copies/反応液については100希釈まで信号増加が検出された。101copies/反応液については、全ての希釈段階で信号増加が検出されなかった。これにより、タグ導入プライマーを用いることにより、検体の核酸量を定量できることが示された。
【実施例２】
【００８９】
核酸量および遺伝子型の両方を同時にDNAチップにより同時検出する方法について示す実施例を詳述する。
【００９０】
（１）鋳型核酸の希釈液の準備
鋳型核酸は、実施例1と同様のプラスミドを用いた。104ccopies/μLのプラスミド溶液をTE溶液で100倍（原液）、101倍、102倍、103倍、104倍希釈し、段階希釈液を作製した。
【００９１】
（２）標的核酸の増幅
実施例1と同様の方法で行った。このプライマーセットは、Helicobacter属を共通で増幅すると共に、増幅されている鋳型由来領域にはHelicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori各々を識別できる領域が含まれており、この領域をプローブで検出することにより、種判別も行うことができる。
【００９２】
（３）標的核酸のDNAチップ検出
［核酸プローブ］
検出に使用した合成DNAオリゴ核酸プローブを表４に示した。
【００９３】
鋳型核酸量を定量するための核酸プローブとして、タグ1（100倍希釈溶液）検出用、タグ2（101倍希釈溶液）検出用、タグ3（102倍希釈溶液）検出用、タグ4（103倍希釈溶液）検出用、タグ5（104倍希釈溶液）検出用の5種を準備した。また、種判別するための核酸プローブとして、Helicobacter hepaticus、Helicobacter bilis、Helicobacter typhlonius、Helicobacter pylori各々を検出するプローブを準備した。また実施例1同様、ネガティブコントロールとして、Helicobacter遺伝子配列とは無関係な配列を有するネガティブプローブ5種を混合して用いた。以上のプローブは、金電極に固定化するために3’末端側をチオール修飾した。
【００９４】
［プローブ固定化電極］
実施例1と同様の方法で行った。
【００９５】
［電極配置］
電極配置は次の通りとした；
1−4電極 ネガティブプローブ
5−8電極 Helicobacter hepaticus検出用プローブ
9−12電極 Helicobacter bilis検出用プローブ
13−16電極 Helicobacter typhlonius検出用プローブ
17−20電極 Helicobacter pylori検出用プローブ
21−24電極 タグ1検出用プローブ
25−28電極 タグ2検出用プローブ
29−32電極 タグ3検出用プローブ
33−36電極 タグ4検出用プローブ
37−40電極 タグ5検出用プローブ
41−44電極 ネガティブプローブ。
【００９６】
[ハイブリダイゼーション]
実施例1と同様の方法で行った。
【００９７】
［結果］
図１５に示すように、定量用プローブについては、102希釈まで信号増加が見られており、原液は104copies/反応液であることが示された。また、型判別用プローブについては、Helicobacter hepaticusを検出するプローブから信号増加が見られた。これらの結果から、タグ導入プライマー、タグ導入核酸プローブ、型判別用核酸プローブ、およびDNAチップを用いることにより、核酸定量と型判別を同時に解析できることが示された。
【００９８】
このように本実施形態により、複数の検体、複数の遺伝子、遺伝子変異および／または遺伝子多型を含む核酸を同時解析することが可能となり、且つ簡便、安価に核酸量を決定することが達成される。
【符号の説明】
【００９９】
１…基体、２…固定化領域、１１…基体、１２…電極、１３…パット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸量を定量する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項２】
複数の遺伝子の核酸量を定量する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットであり、濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、互いに異なる複数のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸をマルチ増幅し、当該タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、前記（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、検体の複数の遺伝子の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項３】
複数検体の核酸量を定量する方法であって、
(a)複数の検体を希釈液により各々段階希釈し、段階希釈液を得ることと、
(b) 濃度の異なる前記各段階希釈液毎および異なる検体毎に互いに異なるタグ配列を含むプライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記何れもタグ配列も、これを含むプライマーが、前記何れの検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎および検体毎に独立した反応系で、タグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎および検体毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（e）において得られた前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、複数検体の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項４】
複数検体の複数遺伝子の核酸量を定量する方法であって、
(a)複数の検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々準備することと、
濃度の異なる各段階希釈液毎および異なる検体毎に異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記何れの検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎および異なる検体毎に独立した反応系で、互いに異なる複数のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸をマルチ増幅し、当該タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎および異なる検体毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、複数検体の複数遺伝子の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項５】
核酸量の定量および遺伝子変異／多型を同時に検出する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)定量解析用の標的核酸および変異／多型検出用の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々別々に準備することと、
ここにおいて、前記定量解析用プライマーセットは、異なる濃度の前記各段階希釈液毎に異なるタグ配列を含むプライマーを含み、前記タグ配列は、これを含むプライマーが、前記検体毎の鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、定量解析用タグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)段階希釈液または希釈前の検体のいずれか１つを用いて、変異/多型検出用プライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、増幅産物を得ることと、
(e)前記段階希釈液毎に得られた定量解析用増幅産物と変異／多型検出用増幅産物を１つに合わせることと；
(f)当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、遺伝子変異/多型を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（e）で混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(g)（f）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、当該検体の核酸量の定量および遺伝子変異/多型を検出することと；
を具備する解析方法。
【請求項６】
核酸量の定量および遺伝子変異/多型を同時に検出する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)定量解析用の標的核酸と変異／多型検出用の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを共通で1つ準備することと、
ここにおいて、前記プライマーセットは、定量解析用プライマーおよび遺伝子変異/多型検出用プライマーは、濃度の異なる各段階希釈液毎に異なるタグ配列を含むプライマー含み、前記タグ配列は、それを含むプライマーが、前記検体毎の鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、当該定量解析用および遺伝子変異/多型検出用のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた定量解析用増幅産物および変異/多型検出用増幅産物を１つに合わせることと；
(e)当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む定量解析用標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、遺伝子変異/多型を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、当該検体の核酸量の定量および遺伝子変異/多型を検出することと；
を具備する解析方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の解析方法であって、遺伝子増幅法がLAMP法である方法。
【請求項８】
複数の遺伝子の核酸量を定量するためのLAMP増幅用のプライマーセットを含むアッセイキットであって、
前記プライマーセットが、以下の1〜9からなる群より少なくとも１選択される；
鋳型配列の5’末端側よりF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側よりB3c領域、B2c領域、LBc領域、B1c領域を設定したとき、
1． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー；
2． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
3． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
4． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
5． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
6． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
7． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
8． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるを挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
9． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
アッセイキット。
【請求項１】
核酸量を定量する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、前記プライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列の導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた前記増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、前記検体の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項２】
複数の遺伝子の核酸量を定量する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットであり、濃度の異なる前記各段階希釈液毎に、異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを含む、複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、互いに異なる複数のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸をマルチ増幅し、当該タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、前記（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、検体の複数の遺伝子の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項３】
複数検体の核酸量を定量する方法であって、
(a)複数の検体を希釈液により各々段階希釈し、段階希釈液を得ることと、
(b) 濃度の異なる前記各段階希釈液毎および異なる検体毎に互いに異なるタグ配列を含むプライマーを含む、標的核酸を増幅するためのプライマーセットを準備することと、
ここで、前記何れもタグ配列も、これを含むプライマーが、前記何れの検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎および検体毎に独立した反応系で、タグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸を増幅し、タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎および検体毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（e）において得られた前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、複数検体の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項４】
複数検体の複数遺伝子の核酸量を定量する方法であって、
(a)複数の検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)複数の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々準備することと、
濃度の異なる各段階希釈液毎および異なる検体毎に異なるタグ配列を含むタグ配列導入プライマーを準備することと、
ここで、前記何れのタグ配列も、これを含むプライマーが、前記何れの検体に含まれる鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎および異なる検体毎に独立した反応系で、互いに異なる複数のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、鋳型核酸をマルチ増幅し、当該タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎および異なる検体毎に得られた増幅産物を１つに合わせることと；
(e)前記当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、複数検体の複数遺伝子の核酸量を定量することと；
を具備する解析方法。
【請求項５】
核酸量の定量および遺伝子変異／多型を同時に検出する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)定量解析用の標的核酸および変異／多型検出用の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを各々別々に準備することと、
ここにおいて、前記定量解析用プライマーセットは、異なる濃度の前記各段階希釈液毎に異なるタグ配列を含むプライマーを含み、前記タグ配列は、これを含むプライマーが、前記検体毎の鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、定量解析用タグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)段階希釈液または希釈前の検体のいずれか１つを用いて、変異/多型検出用プライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、増幅産物を得ることと、
(e)前記段階希釈液毎に得られた定量解析用増幅産物と変異／多型検出用増幅産物を１つに合わせることと；
(f)当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、遺伝子変異/多型を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（e）で混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(g)（f）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、当該検体の核酸量の定量および遺伝子変異/多型を検出することと；
を具備する解析方法。
【請求項６】
核酸量の定量および遺伝子変異/多型を同時に検出する方法であって、
(a)検体を希釈液により段階希釈し、複数の段階希釈液を得ることと、
(b)定量解析用の標的核酸と変異／多型検出用の標的核酸を増幅するためのプライマーセットを共通で1つ準備することと、
ここにおいて、前記プライマーセットは、定量解析用プライマーおよび遺伝子変異/多型検出用プライマーは、濃度の異なる各段階希釈液毎に異なるタグ配列を含むプライマー含み、前記タグ配列は、それを含むプライマーが、前記検体毎の鋳型核酸中の鋳型配列にハイブリダイズしたときにループアウトするように設計される；
(c)前記段階希釈液毎に独立した反応系で、当該定量解析用および遺伝子変異/多型検出用のタグ配列導入プライマーを含むプライマーセットを用いて、前記鋳型核酸を増幅し、前記タグ配列が導入された増幅産物を得ることと、
(d)前記段階希釈液毎に得られた定量解析用増幅産物および変異/多型検出用増幅産物を１つに合わせることと；
(e)当該タグ配列と前記鋳型核酸の鋳型配列に由来する配列とを含む定量解析用標的配列を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、遺伝子変異/多型を検出するための配列を有し、基体上に固定化された核酸プローブと、（d）において混合された前記増幅産物とを反応させることと；
(f)（e）において生じたハイブリダイゼーション量を検出することにより、当該検体の核酸量の定量および遺伝子変異/多型を検出することと；
を具備する解析方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の解析方法であって、遺伝子増幅法がLAMP法である方法。
【請求項８】
複数の遺伝子の核酸量を定量するためのLAMP増幅用のプライマーセットを含むアッセイキットであって、
前記プライマーセットが、以下の1〜9からなる群より少なくとも１選択される；
鋳型配列の5’末端側よりF3領域、F2領域、LF領域、F1領域、3’末端側よりB3c領域、B2c領域、LBc領域、B1c領域を設定したとき、
1． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー；
2． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
3． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、および5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー；
4． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
5． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
6． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、およびB3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー；
7． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもつBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
8． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもつFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるを挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
9． 5’末端側にF1と相補的な配列をもち3’末端側にF2と同じ配列をもち、且つF2配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したFIPプライマー、5’末端側にB1cと同じ配列をもち3’末端側にB2cと相補的な配列をもち、且つB2c配列内に異なる濃度の段階希釈液よって互いに異なるタグ配列を挿入したBIPプライマー、F3領域と同じ配列をもつF3プライマー、B3c領域と相補的な配列をもつB3プライマー、LF領域と相補的な配列をもつLFcプライマー、およびLBc領域と同じ配列をもつLBcプライマー；
アッセイキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２００２２３（Ｐ２０１２−２００２２３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６８９１２（Ｐ２０１１−６８９１２）
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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