核酸抽出用の組成物およびキット、ならびにこれらの利用
【課題】土壌からＲＮＡを高収量で簡便に抽出する技術を実現する。
【解決手段】核酸抽出液を調製するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、アロフェンマスキング剤を含んでいる。本発明において用いられるアロフェンマスキング剤は、フッ化化合物およびケイ酸化合物からなる群より選択される化合物の少なくとも１つである。本発明に係る組成物およびキットは、ＥＤＴＡ、リン酸および／またはＳＤＳをさらに含んでいてもよい。
【解決手段】核酸抽出液を調製するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、アロフェンマスキング剤を含んでいる。本発明において用いられるアロフェンマスキング剤は、フッ化化合物およびケイ酸化合物からなる群より選択される化合物の少なくとも１つである。本発明に係る組成物およびキットは、ＥＤＴＡ、リン酸および／またはＳＤＳをさらに含んでいてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から核酸を高収量で簡便に抽出する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生育している植物内での物質の分布および動態を知るために、植物内における物質動態をイメージングする技術が開発されている。
【０００３】
植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることは、植物内における本来の物質動態を知るために重要であると考えられる。土壌のｐＨ、無機塩類濃度といった土壌の理化学性および土壌中に存在する微生物が植物の生育に大きな影響を与えることは、古くから知られている。また、空気中に含まれている物質（特に微生物）も植物の生育に影響を与え得る。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌や、植物が置かれた雰囲気についての情報を解析する、優れた技術が不可欠であると考えられる。
【０００４】
微生物は、土壌中に非常に多く存在している（土壌１ｇあたりに１０８〜１０９個）。その種類は極めて多様であり、天然に存在する微生物のうち、かなりの種類が土壌に分布しているといわれている。しかし、土壌中に存在する微生物は、培養が非常に困難であり、培養可能な土壌微生物は全体の１０％に満たない。このように、土壌微生物はそのほとんどが未知の存在である。
【０００５】
近年、土壌から核酸を直接抽出して分子生物学的手法での解析を行うことにより、土壌微生物についての情報を得ることが可能になってきた。すなわち、土壌中の微生物に関する情報は、微生物由来の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を土壌から検出することによって得られている。
【０００６】
土壌から微生物ＤＮＡを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌からのＤＮＡの抽出技術は、培養困難な土壌微生物の遺伝子の取得を容易にし、未解明であった土壌微生物の群集解析、および酵素合成などに有用なコンビナトリアルケミストリーへ新たな土壌微生物遺伝子資源の供給を可能とし、学術的にも産業面にも大きく寄与した。
【０００７】
しかし、日本特有の土壌である火山灰土壌は、非晶質アルミニウム（アロフェン）を含有しているので、これらの物質が核酸抽出工程において溶液中の核酸を強力に吸着してしまい、その結果として、火山灰土壌からの核酸抽出が困難であった。
【０００８】
本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７３３７７（国際公開日：２００５（平成１７）年８月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＤＮＡは比較的安定な物質であり、土壌に残留する傾向がある。しかし、ＤＮＡはすでに死滅した微生物まで評価している可能性がある。一方、ＲＮＡは化学的に不安定であり、ＤＮＡよりもはるかに分解されやすく、微生物が死滅するとＲＮａｓｅなどによって速やかに分解される。よって、ＲＮＡを抽出および解析することができれば、土壌中の生きた微生物を正確に評価することが可能となる。
【００１０】
しかし、ＲＮＡはＤＮＡよりも強力かつ迅速にアロフェンに吸着されてしまうので、特許文献１記載の技術ではＲＮＡ抽出を効率よく行うことができなかった。また、ＲＮＡ抽出に関しては、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ開発されていない。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得ることであり、具体的には、土壌から核酸（特にＲＮＡ）を高収量で簡便に抽出する技術を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは試行錯誤の結果、抽出液にフッ素化合物を添加することにより、核酸を効率よく抽出し得ることを見出した。
【００１３】
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。上記化合物は、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６およびＮＨ４ＰＦ６からなる群より選択される化合物であることが好ましく、Ｎａ２ＳｉＦ６であることがより好ましい。なお、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、Ｎａ２ＳｉＦ６を５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含んでいることがなお好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る組成物は、ＥＤＴＡおよび／またはリン酸をさらに含んでいてもよい。本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、ＥＤＴＡを５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることが好ましい。また、本発明にリン酸が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、リン酸を１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、界面活性剤を５％以下の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るキットは、核酸抽出液を調製するためのものであり、上述した組成物の成分を別個に備えている形態であればよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【００１７】
本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。
【００１９】
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
〔１：核酸抽出液調製用の組成物およびキット〕
本発明は、核酸抽出液を調製するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましく、火山灰土壌に由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることがさらに好ましい。
【００２３】
本明細書中において使用される場合、用語「組成物」は、各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図され、用語「キット」は、各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている状態であることが意図される。
【００２４】
上述したように、火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。この技術は、アロフェンを含有する土壌からＤＮＡを効率よく抽出する技術として非常に優れている。しかし、ＲＮＡは高塩濃度条件下で不溶化して沈殿してしまうので、ＲＮＡ抽出用の技術として適切ではない。
【００２５】
本発明者らは土壌からのＲＮＡ抽出技術を開発するために更なる検討を重ねたが、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ知られていないので、開発に適用すべき具体的な指標がなく、試行錯誤を繰り返した。その結果、特定の化合物を用いれば、低塩濃度条件下であってもアロフェンの吸着能力を不活性化し得ることを見出した。
【００２６】
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としている。
【００２７】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物としては、例えば、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６、ＮＨ４ＰＦ６などが挙げられるがこれらに限定されない。後述する実施例においてＮａ２ＳｉＦ６を用いて本発明を実証し、Ｎａ２ＳｉＦ６は溶解度が低いがアロフェンとの反応性が高いことを示している。ＲＮＡは塩濃度が高いと不溶化して沈殿してしまうため、塩濃度が高くなる高濃度のＥＤＴＡ、リン酸溶液は使用することが困難である。しかし、水溶液中でＮａ２ＳｉＦ６を土壌と混和すると徐々に反応が進み、塩濃度が比較的低い状態でアロフェンを不活性化し得ることがわかった。なお、本明細書を読んだ当業者であれば、このような効果を奏する化合物はＮａ２ＳｉＦ６に限定されないことを容易に理解する。
【００２８】
本発明においてＮａ２ＳｉＦ６が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＮａ２ＳｉＦ６は好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいる。
【００２９】
特許文献１に開示されるように、ＥＤＴＡもまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、ＥＤＴＡをさらに含んでいてもよい。ただし、特許文献１において用いられているような高濃度のＥＤＴＡでは目的の効果を奏さないので、本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＥＤＴＡは好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいる。なお、ＤＮａｓｅの不活性化を考慮すると、抽出液中のＥＤＴＡの濃度は１００ｍＭ以下で用いられることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００ｍＭ以下で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることがなおさらに好ましい。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「リン酸」はリン酸緩衝液またはリン酸緩衝化剤を包含する。リン酸緩衝液は当該分野において周知であり、ＤＮＡ抽出においてよく用いられている。特許文献１に開示されるように、リン酸もまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、リン酸をさらに含んでいてもよい。特許文献１において用いられているような高濃度でなくても目的の効果を奏し得るが、後述する実施例において示すように、リン酸濃度は高い方が好ましい。本発明にリン酸が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてリン酸は１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいる。本発明に係る組成物が含んでいるリン酸の形態は特に限定されず、固体であっても液体であってもよく、当業者に容易に理解され得る。なお、本発明を実施するにおいて、リン酸はＥＤＴＡと併用されても単独で用いられてもよい。
【００３１】
細菌や真菌などからの核酸抽出の際には、界面活性剤によって細胞のタンパク質を変性させて細胞構造を破壊することが必要である。よって、本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、調製された核酸抽出液中において、界面活性剤は好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましいがこれらに限定されない。
【００３２】
なお、核酸抽出液のｐＨは好ましくは７以上、より好ましくは７．５以上、さらに好ましくは８．０〜９．０の範囲内である。よって、本発明に係る組成物は、調製された核酸抽出液中において上記ｐＨ環境が提供されるように、緩衝液（または緩衝化剤）をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つ以外に、上述した組成物の成分をさらに別個に備えている形態であってもよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。また、核酸抽出を実施するために必要な試薬または器具をさらに備えていてもよく、抽出後に精製を行う場合は、精製を実行するに必要な試薬又は器具をさらに備えていてもよい。
【００３４】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。
【００３５】
〔２：核酸抽出液およびその製造方法〕
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。
【００３６】
種々の核酸抽出液が当該分野において知られている。すなわち、本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を公知の核酸抽出液に混合（添加）することによって製造され得る。また、用いられる公知の核酸抽出液がＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤を含んでいない場合は、これらをさらに混合（添加）すればよいといえる。
【００３７】
このように本発明に係る核酸抽出液は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでおり、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。
【００３８】
〔３：核酸抽出方法〕
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。
【００３９】
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。
【００４０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
〔土壌サンプル〕
図１に示した２種類の土壌を用いた。弥生堆肥区土壌は堆肥を年に一回投入しているため、比較的有機物の集積が進んだ淡色黒ボク土壌である。群馬農業試験場の畑地土壌は有機物の集積があまり進んでいない淡色黒ボク土壌である。
【００４２】
〔土壌核酸溶液の抽出〕
上記２種類の土壌の風乾細土５０ｇに、２０ｍｌのＬＢ培地（ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／１Ｌ）を添加し、３０℃で２日間インキュベートした。インキュベートした土壌０．２５ｇを２ｍｌのスクリューキャップチューブに取り、これに１ｇのシリカ／ジルコニアビーズ（直径０．１ｍｍのものと０．５ｍｍのものとを２：１で混合したもの）と直径５ｍｍのガラスビーズを一個添加した。このチューブにＮａ２ＳｉＦ６溶液（０．５ｇ／ｍｌ）を１０μｌ、２５μｌ、５０μｌまたは１００μｌ添加し、さらに抽出液［Ｉ］〜［ＩＩＩ］のいずれかを先に添加したＮａ２ＳｉＦ６溶液と合わせて１２５０μｌになるように添加した。なお、抽出液にはＲＮａｓｅ阻害剤としてＡＴＡ（aurintricarboxylic acid）を含有させている。
【００４３】
【化１】
【００４４】
これらチューブ中の試料に対して、ビーズ破砕機（Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００ トミー精工）で３０００ｒｐｍにて３０秒間のＢｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、次いで、この試料を６５℃で３０分間インキュベートした。続いて、１０，０００×ｇ、２５℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清７５０μｌに等量のクロロホルムを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、１２，０００×ｇ、２５℃で２０分間遠心分離し、上清５００μｌを回収した。この上清を適時希釈後に等量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、ＤＮＡおよびＲＮＡを沈殿として回収した。この沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥した。乾燥させた沈殿物を５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、土壌核酸溶液を得た。
【００４５】
〔ＤＮＡおよびＲＮＡの定量〕
ＤＮＡとＲＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動（×０．５ ＴＡＥ緩衝液中で５０Ｖにて３０分間）によって分離した後に、このゲルをＳＹＢＲ ＧｒｅｅＩＩで１時間染色した。ＢＡＳ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて、４７３ｎｍ励起、５３２ｎｍカットの条件でＤＮＡ、ＲＮＡを蛍光により定量的に検出した。ゲルの上端に近い５０００ｂｐより大きいサイズの部分をＤＮＡとして、２３Ｓ ｒＲＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡの２本のｒＲＮＡバンドをＲＮＡとして、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅによって輝度を計測した。なお、各ゲルには、４〜５段階の標準としてλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を０．０５μｇ〜０．２５μｇを同時に電気泳動し、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を基準にした検量線に基づいてＤＮＡ量およびＲＮＡ量を定量した。
【００４６】
〔結果〕
結果を図２〜４に示す。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加により土壌からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出量が増加したことがわかる。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加量を土壌２５０ｍｇあたり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲内で検討した。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加の必要量は土壌によって異なっていたが、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇ程度添加すると良好な結果が得られた。Ｎａ２ＳｉＦ６を多く入れることによるｐＨ低下に伴って収量が低下することが懸念されたが、特に問題なかった。なお、従来ＤＮＡの抽出が非常に困難であった群馬農業試験場土壌（有機物含量が少ない淡色黒ボク土壌）に対しては、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇのＮａ２ＳｉＦ６の添加により抽出量の大幅な向上が得られた。また、抽出液のリン酸濃度が濃いほど抽出量が向上し、抽出液［ＩＩＩ］が最もよい結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術として、土壌からのＤＮＡの抽出技術と同様に有用であるとともに、土壌で活動している微生物を正確に評価し得、その結果、土壌での土壌微生物の生態をリアルタイムに検出し得る。このように、本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術は、植物病害や特定の遺伝子発現解析など幅広い分野への活用が期待し得るとともに、わが国の土壌微生物の生態を明らかにするためにも非常に有用な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例において用いた土壌の性状を示す図である。
【図２】弥生堆肥区土壌から抽出したＤＮＡの量を示すグラフである。
【図３】弥生堆肥区土壌から抽出したＲＮＡの量を示すグラフである。
【図４】群馬農業試験場の畑地土壌から抽出したＤＮＡの量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から核酸を高収量で簡便に抽出する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生育している植物内での物質の分布および動態を知るために、植物内における物質動態をイメージングする技術が開発されている。
【０００３】
植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることは、植物内における本来の物質動態を知るために重要であると考えられる。土壌のｐＨ、無機塩類濃度といった土壌の理化学性および土壌中に存在する微生物が植物の生育に大きな影響を与えることは、古くから知られている。また、空気中に含まれている物質（特に微生物）も植物の生育に影響を与え得る。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌や、植物が置かれた雰囲気についての情報を解析する、優れた技術が不可欠であると考えられる。
【０００４】
微生物は、土壌中に非常に多く存在している（土壌１ｇあたりに１０８〜１０９個）。その種類は極めて多様であり、天然に存在する微生物のうち、かなりの種類が土壌に分布しているといわれている。しかし、土壌中に存在する微生物は、培養が非常に困難であり、培養可能な土壌微生物は全体の１０％に満たない。このように、土壌微生物はそのほとんどが未知の存在である。
【０００５】
近年、土壌から核酸を直接抽出して分子生物学的手法での解析を行うことにより、土壌微生物についての情報を得ることが可能になってきた。すなわち、土壌中の微生物に関する情報は、微生物由来の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を土壌から検出することによって得られている。
【０００６】
土壌から微生物ＤＮＡを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌からのＤＮＡの抽出技術は、培養困難な土壌微生物の遺伝子の取得を容易にし、未解明であった土壌微生物の群集解析、および酵素合成などに有用なコンビナトリアルケミストリーへ新たな土壌微生物遺伝子資源の供給を可能とし、学術的にも産業面にも大きく寄与した。
【０００７】
しかし、日本特有の土壌である火山灰土壌は、非晶質アルミニウム（アロフェン）を含有しているので、これらの物質が核酸抽出工程において溶液中の核酸を強力に吸着してしまい、その結果として、火山灰土壌からの核酸抽出が困難であった。
【０００８】
本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７３３７７（国際公開日：２００５（平成１７）年８月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＤＮＡは比較的安定な物質であり、土壌に残留する傾向がある。しかし、ＤＮＡはすでに死滅した微生物まで評価している可能性がある。一方、ＲＮＡは化学的に不安定であり、ＤＮＡよりもはるかに分解されやすく、微生物が死滅するとＲＮａｓｅなどによって速やかに分解される。よって、ＲＮＡを抽出および解析することができれば、土壌中の生きた微生物を正確に評価することが可能となる。
【００１０】
しかし、ＲＮＡはＤＮＡよりも強力かつ迅速にアロフェンに吸着されてしまうので、特許文献１記載の技術ではＲＮＡ抽出を効率よく行うことができなかった。また、ＲＮＡ抽出に関しては、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ開発されていない。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得ることであり、具体的には、土壌から核酸（特にＲＮＡ）を高収量で簡便に抽出する技術を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは試行錯誤の結果、抽出液にフッ素化合物を添加することにより、核酸を効率よく抽出し得ることを見出した。
【００１３】
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。上記化合物は、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６およびＮＨ４ＰＦ６からなる群より選択される化合物であることが好ましく、Ｎａ２ＳｉＦ６であることがより好ましい。なお、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、Ｎａ２ＳｉＦ６を５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含んでいることがなお好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る組成物は、ＥＤＴＡおよび／またはリン酸をさらに含んでいてもよい。本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、ＥＤＴＡを５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることが好ましい。また、本発明にリン酸が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、リン酸を１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、本発明を用いて調製される核酸抽出液は、界面活性剤を５％以下の濃度で含んでいることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、５％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るキットは、核酸抽出液を調製するためのものであり、上述した組成物の成分を別個に備えている形態であればよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。
【００１７】
本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。
【００１９】
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
〔１：核酸抽出液調製用の組成物およびキット〕
本発明は、核酸抽出液を調製するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることが好ましく、火山灰土壌に由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることがさらに好ましい。
【００２３】
本明細書中において使用される場合、用語「組成物」は、各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図され、用語「キット」は、各種成分の少なくとも１つが別物質（例えば、容器）中に含有されている状態であることが意図される。
【００２４】
上述したように、火山灰土壌のようにアロフェンを含有する土壌から核酸を効率よく抽出するためには、核酸を吸着し得るアロフェンを効果的に破壊するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ（アロフェンに特に吸着されやすい）が吸着されてしまう前にアロフェンの吸着部位をブロックする必要がある。本発明者らは、ＥＤＴＡおよびリン酸溶液を高濃度で使用することによってアロフェンの吸着能力を不活性化し、簡便にＤＮＡを抽出する技術を開発している（特許文献１参照）。この技術は、アロフェンを含有する土壌からＤＮＡを効率よく抽出する技術として非常に優れている。しかし、ＲＮＡは高塩濃度条件下で不溶化して沈殿してしまうので、ＲＮＡ抽出用の技術として適切ではない。
【００２５】
本発明者らは土壌からのＲＮＡ抽出技術を開発するために更なる検討を重ねたが、土壌からＲＮＡを高収量で抽出する技術は未だ知られていないので、開発に適用すべき具体的な指標がなく、試行錯誤を繰り返した。その結果、特定の化合物を用いれば、低塩濃度条件下であってもアロフェンの吸着能力を不活性化し得ることを見出した。
【００２６】
本発明に係る組成物は、核酸抽出液を調製するためのものであり、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としている。
【００２７】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物としては、例えば、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＦ６、Ｋ２ＳｉＦ６、（ＮＨ４）２ＳｉＦ６、ＮａＰＦ６、ＫＰＦ６、ＮＨ４ＰＦ６などが挙げられるがこれらに限定されない。後述する実施例においてＮａ２ＳｉＦ６を用いて本発明を実証し、Ｎａ２ＳｉＦ６は溶解度が低いがアロフェンとの反応性が高いことを示している。ＲＮＡは塩濃度が高いと不溶化して沈殿してしまうため、塩濃度が高くなる高濃度のＥＤＴＡ、リン酸溶液は使用することが困難である。しかし、水溶液中でＮａ２ＳｉＦ６を土壌と混和すると徐々に反応が進み、塩濃度が比較的低い状態でアロフェンを不活性化し得ることがわかった。なお、本明細書を読んだ当業者であれば、このような効果を奏する化合物はＮａ２ＳｉＦ６に限定されないことを容易に理解する。
【００２８】
本発明においてＮａ２ＳｉＦ６が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＮａ２ＳｉＦ６は好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいる。
【００２９】
特許文献１に開示されるように、ＥＤＴＡもまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、ＥＤＴＡをさらに含んでいてもよい。ただし、特許文献１において用いられているような高濃度のＥＤＴＡでは目的の効果を奏さないので、本発明にＥＤＴＡが用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてＥＤＴＡは好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜３００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいる。なお、ＤＮａｓｅの不活性化を考慮すると、抽出液中のＥＤＴＡの濃度は１００ｍＭ以下で用いられることが好ましい。よって、本発明に係る組成物は、１００ｍＭ以下で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることがなおさらに好ましい。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「リン酸」はリン酸緩衝液またはリン酸緩衝化剤を包含する。リン酸緩衝液は当該分野において周知であり、ＤＮＡ抽出においてよく用いられている。特許文献１に開示されるように、リン酸もまたアロフェンを不活性化するに有効である。よって、本発明に係る組成物もまた、リン酸をさらに含んでいてもよい。特許文献１において用いられているような高濃度でなくても目的の効果を奏し得るが、後述する実施例において示すように、リン酸濃度は高い方が好ましい。本発明にリン酸が用いられる場合、調製された核酸抽出液中においてリン酸は１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいる。本発明に係る組成物が含んでいるリン酸の形態は特に限定されず、固体であっても液体であってもよく、当業者に容易に理解され得る。なお、本発明を実施するにおいて、リン酸はＥＤＴＡと併用されても単独で用いられてもよい。
【００３１】
細菌や真菌などからの核酸抽出の際には、界面活性剤によって細胞のタンパク質を変性させて細胞構造を破壊することが必要である。よって、本発明に係る組成物は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明に界面活性剤が用いられる場合、調製された核酸抽出液中において、界面活性剤は好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で含まれ得る。よって、本発明に係る組成物は、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることが好ましい。なお、本発明に利用可能な界面活性剤は、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることが好ましいがこれらに限定されない。
【００３２】
なお、核酸抽出液のｐＨは好ましくは７以上、より好ましくは７．５以上、さらに好ましくは８．０〜９．０の範囲内である。よって、本発明に係る組成物は、調製された核酸抽出液中において上記ｐＨ環境が提供されるように、緩衝液（または緩衝化剤）をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つ以外に、上述した組成物の成分をさらに別個に備えている形態であってもよい。すなわち、本発明に係るキットは、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴としており、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに備えていてもよい。また、核酸抽出を実施するために必要な試薬または器具をさらに備えていてもよく、抽出後に精製を行う場合は、精製を実行するに必要な試薬又は器具をさらに備えていてもよい。
【００３４】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。
【００３５】
〔２：核酸抽出液およびその製造方法〕
本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴としており、該溶液にＥＤＴＡを含ませる工程、該溶液にリン酸を含ませる工程、または該溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含してもよい。
【００３６】
種々の核酸抽出液が当該分野において知られている。すなわち、本発明に係る核酸抽出液の製造方法は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を公知の核酸抽出液に混合（添加）することによって製造され得る。また、用いられる公知の核酸抽出液がＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤を含んでいない場合は、これらをさらに混合（添加）すればよいといえる。
【００３７】
このように本発明に係る核酸抽出液は、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでおり、ＥＤＴＡ、リン酸および／または界面活性剤をさらに含んでいてもよい。本発明を用いれば、土壌からＤＮＡだけでなくＲＮＡも高収量で抽出することができる。
【００３８】
〔３：核酸抽出方法〕
本発明に係る核酸抽出方法は、上述した核酸抽出液を用いることを特徴としており、具体的には、フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含している。
【００３９】
本発明に係る核酸抽出方法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出するために用いられることが好ましい。
【００４０】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
〔土壌サンプル〕
図１に示した２種類の土壌を用いた。弥生堆肥区土壌は堆肥を年に一回投入しているため、比較的有機物の集積が進んだ淡色黒ボク土壌である。群馬農業試験場の畑地土壌は有機物の集積があまり進んでいない淡色黒ボク土壌である。
【００４２】
〔土壌核酸溶液の抽出〕
上記２種類の土壌の風乾細土５０ｇに、２０ｍｌのＬＢ培地（ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／１Ｌ）を添加し、３０℃で２日間インキュベートした。インキュベートした土壌０．２５ｇを２ｍｌのスクリューキャップチューブに取り、これに１ｇのシリカ／ジルコニアビーズ（直径０．１ｍｍのものと０．５ｍｍのものとを２：１で混合したもの）と直径５ｍｍのガラスビーズを一個添加した。このチューブにＮａ２ＳｉＦ６溶液（０．５ｇ／ｍｌ）を１０μｌ、２５μｌ、５０μｌまたは１００μｌ添加し、さらに抽出液［Ｉ］〜［ＩＩＩ］のいずれかを先に添加したＮａ２ＳｉＦ６溶液と合わせて１２５０μｌになるように添加した。なお、抽出液にはＲＮａｓｅ阻害剤としてＡＴＡ（aurintricarboxylic acid）を含有させている。
【００４３】
【化１】
【００４４】
これらチューブ中の試料に対して、ビーズ破砕機（Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００ トミー精工）で３０００ｒｐｍにて３０秒間のＢｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、次いで、この試料を６５℃で３０分間インキュベートした。続いて、１０，０００×ｇ、２５℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清７５０μｌに等量のクロロホルムを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、１２，０００×ｇ、２５℃で２０分間遠心分離し、上清５００μｌを回収した。この上清を適時希釈後に等量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを添加し、次いでｖｏｒｔｅｘし、２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、ＤＮＡおよびＲＮＡを沈殿として回収した。この沈殿物を、７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥した。乾燥させた沈殿物を５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、土壌核酸溶液を得た。
【００４５】
〔ＤＮＡおよびＲＮＡの定量〕
ＤＮＡとＲＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動（×０．５ ＴＡＥ緩衝液中で５０Ｖにて３０分間）によって分離した後に、このゲルをＳＹＢＲ ＧｒｅｅＩＩで１時間染色した。ＢＡＳ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて、４７３ｎｍ励起、５３２ｎｍカットの条件でＤＮＡ、ＲＮＡを蛍光により定量的に検出した。ゲルの上端に近い５０００ｂｐより大きいサイズの部分をＤＮＡとして、２３Ｓ ｒＲＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡの２本のｒＲＮＡバンドをＲＮＡとして、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅによって輝度を計測した。なお、各ゲルには、４〜５段階の標準としてλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を０．０５μｇ〜０．２５μｇを同時に電気泳動し、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を基準にした検量線に基づいてＤＮＡ量およびＲＮＡ量を定量した。
【００４６】
〔結果〕
結果を図２〜４に示す。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加により土壌からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出量が増加したことがわかる。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加量を土壌２５０ｍｇあたり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲内で検討した。Ｎａ２ＳｉＦ６の添加の必要量は土壌によって異なっていたが、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇ程度添加すると良好な結果が得られた。Ｎａ２ＳｉＦ６を多く入れることによるｐＨ低下に伴って収量が低下することが懸念されたが、特に問題なかった。なお、従来ＤＮＡの抽出が非常に困難であった群馬農業試験場土壌（有機物含量が少ない淡色黒ボク土壌）に対しては、２５０ｍｇの土壌に対し５０ｍｇのＮａ２ＳｉＦ６の添加により抽出量の大幅な向上が得られた。また、抽出液のリン酸濃度が濃いほど抽出量が向上し、抽出液［ＩＩＩ］が最もよい結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術として、土壌からのＤＮＡの抽出技術と同様に有用であるとともに、土壌で活動している微生物を正確に評価し得、その結果、土壌での土壌微生物の生態をリアルタイムに検出し得る。このように、本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術は、植物病害や特定の遺伝子発現解析など幅広い分野への活用が期待し得るとともに、わが国の土壌微生物の生態を明らかにするためにも非常に有用な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例において用いた土壌の性状を示す図である。
【図２】弥生堆肥区土壌から抽出したＤＮＡの量を示すグラフである。
【図３】弥生堆肥区土壌から抽出したＲＮＡの量を示すグラフである。
【図４】群馬農業試験場の畑地土壌から抽出したＤＮＡの量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸抽出液を調製するための組成物であって、
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記化合物がＮａ２ＳｉＦ６であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＤＴＡをさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
リン酸をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤がＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
５％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴とする核酸抽出液を調製するためのキット。
【請求項１３】
ＥＤＴＡをさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
リン酸をさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１７】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴とする核酸抽出液の製造方法。
【請求項１８】
前記溶液にＥＤＴＡを含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記溶液にリン酸を含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１】
核酸抽出液を調製するための組成物であって、
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含んでいることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記化合物がＮａ２ＳｉＦ６であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
５〜５０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＮａ２ＳｉＦ６を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＤＴＡをさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
５０〜１００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにＥＤＴＡを含んでいることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
リン酸をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
１００〜３００ｍＭの範囲内の濃度で核酸抽出液中に供給されるようにリン酸を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
界面活性剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤がＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
５％以下の濃度で核酸抽出液中に供給されるように界面活性剤を含んでいることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルから核酸を抽出する核酸抽出液を調製するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを備えていることを特徴とする核酸抽出液を調製するためのキット。
【請求項１３】
ＥＤＴＡをさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
リン酸をさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
界面活性剤をさらに備えていることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む抽出液中でサンプルから核酸を抽出する工程を包含することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１７】
フッ化化合物およびケイ酸化合物から選択される化合物の少なくとも１つを含む溶液を調製する工程を包含することを特徴とする核酸抽出液の製造方法。
【請求項１８】
前記溶液にＥＤＴＡを含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記溶液にリン酸を含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記溶液に界面活性剤を含ませる工程をさらに包含することを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−８２０６８（Ｐ２００９−８２０６８Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５５９４７（Ｐ２００７−２５５９４７）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
[ Back to top ]