核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法
【課題】 血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法を提供する。
【解決手段】 本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする。
【解決手段】 本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば人などの血液やウィルスに感染した植物の種子などの核酸を含む試料から核酸を抽出するための核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病原性を持つウィルスや微生物を検出するために、遺伝子工学的手法を用いたＮＡＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）検査法が取り入れられている。このＮＡＴ検査法は、ウィルスを構成する核酸を増幅してウィルスの有無を検出するため、感度および特異性が極めて高く、感染して間もない潜伏期間、すなわち宿主内において増殖が起こる手前の期間のように、ウィルスや微生物の数が少なく、従来の抗体検査法では検出が困難な期間（ウィンドウ期間）であっても、ウィルスを高感度に検出することが可能な方法として注目されている技術である。
而して、かかるＮＡＴ検査法においては、核酸を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）や、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）などが用いられており、不純物が存在するとこれらの反応が阻害される恐れがあるため、信頼性の高い検査を行うためには、可能な限り高純度の核酸を試料から抽出することが必要である。
【０００３】
一般に、試料から核酸を抽出するためには、試料を破砕して混合液の状態とされる。この混合液中には、核酸以外にも、タンパク質、脂質、糖質等が含まれるため、この混合液から核酸が分離精製される。このような核酸を抽出するための古典的な方法としては、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法が知られている（非特許文献１参照。）。然るに、このＡＧＰＣ法においては、核酸を抽出するための試薬としてフェノールやクロロホルムなどの毒劇物を用いる点や、多検体の処理に適さない点など、安全性、迅速性等に問題がある。
【０００４】
一方、試薬として毒劇物を用いることなしに核酸を抽出する方法としては、カオトロピック物質の存在下に、固相担体の表面上に核酸を特異的に吸着させる方法が知られている（特許文献１および非特許文献２参照）。この核酸抽出方法は、試薬の安全性の点やロボットを用いた自動化装置への応用が比較的容易である点において有用である。
このような核酸抽出方法において、高純度の核酸を抽出するためには、固相担体上に核酸以外の不純物をできるだけ吸着させないこと、固相担体上に吸着した核酸以外の不純物を、当該固相担体上に核酸を保持したまま除去することが肝要であり、前者の手段としては、試薬中の塩濃度を調節することによって、固相担体に対する吸着選択性を制御する方法、後者の手段としては、核酸が吸着した固相担体を、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を用いて洗浄する方法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、このような核酸抽出方法においては、試料中に核酸以外の物質を大量に含む場合には、核酸以外の不純物を除くために洗浄工程を多数回繰り返すことが必要となるため、これらの洗浄工程において核酸自体も失われてしまう、という問題がある。
特に、血液や植物種子は、糖質や色素等の負電荷を持つ物質が多量に含まれており、これらの物質は、固相担体との親和性において核酸と同様の挙動を示すため、試薬中の塩濃度を調節する方法では、核酸のみを選択的に吸着させることができず、多量の不純物が固相担体上に吸着するため、更に多くの洗浄工程が必要である。
また、ウィルスに感染した血液や植物種子などからウイルスの核酸を抽出する場合には、一定量の試料中に含まれるウィルスの量が極めて微量であるため、大量の血液や種子を試料として用い、当該試料に含まれる微量の核酸を抽出することが必要となるが、このような場合には、固相担体に吸着する不純物も更に増大するため、核酸のみを高純度に抽出することは極めて困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願２００１−７８７９０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chomczynski & Sacchi(1987) Analytical Biochemistry,162,156-159
【非特許文献２】R.Boom,C.J.A.Sol,M.M.M.Salimans,C.L.Jansen,P.M.E.Wertheim-van Dillen & J.van der Noordaa(1990)Jourmal of Microbiolooy,Vol.28,No.3.495-503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、
カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の核酸抽出用試薬キットは、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、上記の核酸抽出用試薬とを具えてなることを特徴とする。
【００１１】
本発明の核酸抽出方法は、上記の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特定の界面活性剤を用いることにより、固相担体上に核酸を保持したままで、当該固相担体から不純物を高い効率で除去することができるので、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜実施例３に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図２】比較例１に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図３】実施例４〜実施例６に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図４】比較例２に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図５】実施例４で得られた核酸溶液について行った核酸検出試験における電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】比較例２で得られた核酸溶液について行った核酸検出試験における電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
〔核酸抽出用試薬〕
本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中に含まれる核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられるものであって、水系媒体中にカオトロピック物質および特定の界面活性剤が含有されてなるものである。
【００１５】
本発明の核酸抽出用試薬に用いられるカオトロピック物質としては、特に限定されるものではなく、例えばチオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジンなどのグアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどのヨウ化金属塩、尿素などを、単独でまたは２種以上組み合わせて用いることができる。
本発明の核酸抽出用試薬中におけるカオトロピック物質の濃度は、１．０〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは３．０〜６．０ｍｏｌ／Ｌである。
【００１６】
本発明の核酸抽出用試薬においては、特定の界面活性剤として、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種が用いられる。これらは単独でまたは２種組み合わせて用いることができる。
本発明の核酸抽出用試薬中における特定の界面活性剤の割合は５質量％以下とされ、好ましくは１．０〜２．０質量％である。特定の界面活性剤の割合が５質量％を超える場合には、得られる核酸抽出用試薬の流動性を妨げる要因となり、試料の溶解性や、固相担体への核酸の吸着効率が著しく低下するため、核酸を抽出することが困難となる。一方、この割合が過小である場合には、不純物を十分に除去することが困難となることがある。
【００１７】
本発明の核酸抽出用試薬には、生化学分野で一般的に使用される緩衝剤を含有させることができ、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ系、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）系、Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）系、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）系、クエン酸ナトリウム系、コハク酸系、ホウ酸系、炭酸系、炭酸水素系などの緩衝剤を用いることができる。
【００１８】
〔核酸抽出用試薬キット〕
本発明の核酸抽出用試薬キットは、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、上記の核酸抽出用試薬とを具えてなるものである。
固相担体としては、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得るものであれば、特に限定されず、例えばシリカ粒子、シリカ膜、多孔質体シリカ、ポリスチレン粒子、ポリスチレン膜、ニトロセルロース膜、その他のポリマー材料などを用いることができる。
また、固相担体として粒子状のものを用いる場合には、粒子径が０．０５〜５００μｍのものが好ましく、より好ましくは０．１〜２００μｍである。
また、粒子状の固相担体としては、磁性体を含有するものを用いることができ、これにより、当該固相担体を磁力の作用によって容易に回収することができる。
【００１９】
また、本発明の核酸抽出用試薬キットは、上記の固相担体および核酸抽出用試薬の他に、当該核酸抽出用試薬と同様の構成の洗浄用試薬や、固相担体を洗浄するための洗浄液、固相担体から核酸を溶出させる溶出液を具えてなるものであってもよい。
ここで、洗浄液としては、エタノール水、アセトンなどを用いることができる。
また、溶出液としては、超純水、２回蒸留水、ＴＥ緩衝液などを用いることができる。
【００２０】
〔核酸抽出方法〕
本発明の核酸抽出方法は、上記の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有する。
粒子状の固相担体を用いる場合の具体的な一例について説明すると、核酸抽出用試薬に、核酸を含む試料を添加し、攪拌することによって、核酸抽出用試薬中に試料を均一に溶解または分散させ、更に、固相担体を添加して攪拌することにより、試料を固相担体に接触させる。その結果、試料中に含まれる核酸が固相担体の表面に吸着される。
次いで、例えば遠心分離法によって固相担体を沈殿させ、上清を除去することにより、核酸が吸着された固相担体を回収する。その後、回収した固相担体を洗浄液で洗浄して乾燥し、当該固相担体を溶出液に添加することにより、固相担体から核酸を溶出液中に溶出させることにより、目的とする核酸が抽出される。
【００２１】
以上において、核酸を含む試料としては、血液、ウィルスに感染した種子、食肉、毛髪、皮膚、血清、尿、糞便、精液、唾液、藻類、植物の葉、根、果実などを用いることができる。
また、試料を固相担体に接触させるための処理時間は、例えば１〜５分間である。
また、核酸が吸着された固相担体をエタノール水等の洗浄液で洗浄する前に、核酸抽出用試薬と同様の構成の洗浄用試薬によって洗浄することが好ましく、これにより、固相担体上に吸着された不純物を一層確実に除去することができる。
【００２２】
以上説明したように、本発明によれば、特定の界面活性剤を用いることにより、固相担体上に核酸を保持したままで、当該固相担体から不純物を高い効率で除去することができるので、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
〈実施例１〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。以下、これを試薬Ａとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。以下、これを洗浄用試薬ａとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ａと、洗浄用試薬ａと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる核酸抽出用試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（Ｉ）とする。
【００２５】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）を用い、以下のようにして、血液からゲノムＤＮＡを抽出した。
試薬Ａ５００ｍＬ中に血液１００ｍＬを添加し、攪拌して均一化し、更に、固相担体としてシリカ磁性ビーズ分散液２０μＬを添加し、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。
回収したシリカ磁性ビーズに、洗浄用試薬ａ５００ｍＬを加え、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。そして、回収したシリカ磁性ビーズを、７０％エタノール水で２回洗浄した後、乾燥した。その後、シリカ磁性ビーズに超純水１００μＬを加えることにより、核酸をシリカ磁性ビーズから水中に溶出させた。このようにして血液からゲノムＤＮＡを抽出し、核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００２６】
〈実施例２〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。これを試薬Ｂとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤としてポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｂとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ｂと、洗浄用試薬ｂと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる核酸抽出用試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（II）とする。
【００２７】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに試薬キット（II）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００２８】
〈実施例３〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％およびポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％（界面活性剤合計２質量％）を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。これを試薬Ｃとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％およびポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｃとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ｃと、洗浄用試薬ｃと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（III ）とする。
【００２９】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに試薬キット（III ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００３０】
〈比較例１〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤として「ＴｒｉｒｏｎＸ−１００」（Ｓｉｇｍａ社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の比較用の核酸抽出用試薬を調製した。これを比較用試薬Ｄとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤として「ＴｒｉｒｏｎＸ−１００」（Ｓｉｇｍａ社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｄとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
比較用試薬Ｄと、洗浄用試薬ｄと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（IV）とする。
【００３１】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに比較用試薬キット（IV）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約１０μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、この核酸溶液は赤色に着色しており、波長４００〜４５０ｎｍの領域にピークを有することから、核酸以外の不純物が含まれていることが確認された。この不純物は、ヘモグロビンに由来する色素によるものであると考えられる。
得られた核酸溶液の分光チャートを図２に示す。
【００３２】
〈実施例４〉
実施例１と同様にして作製した試薬キット（Ｉ）を用い、以下のようにして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出した。
メロン種子を粉砕し、この粉砕したメロン種子２ｇを試薬Ａ５００ｍＬ中に添加し、攪拌して均一化し、更に、固相担体としてシリカ磁性ビーズ分散液２０μＬを添加し、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。
回収したシリカ磁性ビーズに、洗浄用試薬ａ５００ｍＬを加え、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。そして、回収したシリカ磁性ビーズを、７０％エタノール水で２回洗浄した後、乾燥した。その後、シリカ磁性ビーズに超純水１００μＬを加えることにより、核酸をシリカ磁性ビーズから水中に溶出させた。このようにしてメロン種子からウィルスの核酸を抽出し、核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３３】
〈実施例５〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに実施例２と同様にして作製した試薬キット（II）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３４】
〈実施例６〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに実施例３と同様にして作製した試薬キット（III ）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３５】
〈比較例２〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに比較例１と同様にして作製した比較用試薬キット（IV）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４０μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、波長２８０ｎｍ付近にピークを有することから、核酸以外の不純物が含まれていることが確認された。
得られた核酸溶液の分光チャートを図４に示す。
【００３６】
〈核酸検出試験〉
実施例４および比較例２で得られた核酸溶液を、それぞれ１０〜１０7 倍の範囲で段階的に希釈することにより、合計で１１種類の希釈溶液を調製した。各希釈溶液の希釈倍率は、以下の通りである。
希釈溶液１：１０倍，希釈溶液２：１０2 倍，希釈溶液３：１０3 倍，希釈溶液４：１０4 倍，希釈溶液５：１０4 倍，希釈溶液６：１０5 倍，希釈溶液７：１０5 倍，希釈溶液８：１０6 倍，希釈溶液９：１０6 倍，希釈溶液１０：１０7 倍，希釈溶液１１：１０7 倍
【００３７】
これらの希釈液中の核酸をテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、ゲル電気泳動により確認した。結果を図５（実施例２）および図６（比較例２）に示す。
以上において、ＲＴ−ＰＣＲ法の条件は、以下の通りである。
装置：
東洋紡社製「ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ −ｐｌｕｓ−」
反応液：
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２２μＬ，５×Ｂｕｆｆｅｒ １０ｕＬ，２．５ｍＭｄＮＴＰｓ ６．０μＬ，２５ｍＭＭｍ（Ｏａｃ）2 ５．０μＬ，Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ，Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ，１０ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．０μＬ，２．５ ｕ／ｕＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．０ μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ ２．０μＬ
反応温度・反応時間：
６０℃で６０分間，９４℃で２分間，（９４℃で１分間，５５℃で１．５分間）×４０サイクル, ６０℃で７分間
【００３８】
図５および図６の結果から理解されるように、実施例４で抽出された核酸は、比較例２で抽出された核酸に比較して高い感度で検出されることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば人などの血液やウィルスに感染した植物の種子などの核酸を含む試料から核酸を抽出するための核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病原性を持つウィルスや微生物を検出するために、遺伝子工学的手法を用いたＮＡＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）検査法が取り入れられている。このＮＡＴ検査法は、ウィルスを構成する核酸を増幅してウィルスの有無を検出するため、感度および特異性が極めて高く、感染して間もない潜伏期間、すなわち宿主内において増殖が起こる手前の期間のように、ウィルスや微生物の数が少なく、従来の抗体検査法では検出が困難な期間（ウィンドウ期間）であっても、ウィルスを高感度に検出することが可能な方法として注目されている技術である。
而して、かかるＮＡＴ検査法においては、核酸を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）や、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）などが用いられており、不純物が存在するとこれらの反応が阻害される恐れがあるため、信頼性の高い検査を行うためには、可能な限り高純度の核酸を試料から抽出することが必要である。
【０００３】
一般に、試料から核酸を抽出するためには、試料を破砕して混合液の状態とされる。この混合液中には、核酸以外にも、タンパク質、脂質、糖質等が含まれるため、この混合液から核酸が分離精製される。このような核酸を抽出するための古典的な方法としては、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法が知られている（非特許文献１参照。）。然るに、このＡＧＰＣ法においては、核酸を抽出するための試薬としてフェノールやクロロホルムなどの毒劇物を用いる点や、多検体の処理に適さない点など、安全性、迅速性等に問題がある。
【０００４】
一方、試薬として毒劇物を用いることなしに核酸を抽出する方法としては、カオトロピック物質の存在下に、固相担体の表面上に核酸を特異的に吸着させる方法が知られている（特許文献１および非特許文献２参照）。この核酸抽出方法は、試薬の安全性の点やロボットを用いた自動化装置への応用が比較的容易である点において有用である。
このような核酸抽出方法において、高純度の核酸を抽出するためには、固相担体上に核酸以外の不純物をできるだけ吸着させないこと、固相担体上に吸着した核酸以外の不純物を、当該固相担体上に核酸を保持したまま除去することが肝要であり、前者の手段としては、試薬中の塩濃度を調節することによって、固相担体に対する吸着選択性を制御する方法、後者の手段としては、核酸が吸着した固相担体を、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を用いて洗浄する方法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、このような核酸抽出方法においては、試料中に核酸以外の物質を大量に含む場合には、核酸以外の不純物を除くために洗浄工程を多数回繰り返すことが必要となるため、これらの洗浄工程において核酸自体も失われてしまう、という問題がある。
特に、血液や植物種子は、糖質や色素等の負電荷を持つ物質が多量に含まれており、これらの物質は、固相担体との親和性において核酸と同様の挙動を示すため、試薬中の塩濃度を調節する方法では、核酸のみを選択的に吸着させることができず、多量の不純物が固相担体上に吸着するため、更に多くの洗浄工程が必要である。
また、ウィルスに感染した血液や植物種子などからウイルスの核酸を抽出する場合には、一定量の試料中に含まれるウィルスの量が極めて微量であるため、大量の血液や種子を試料として用い、当該試料に含まれる微量の核酸を抽出することが必要となるが、このような場合には、固相担体に吸着する不純物も更に増大するため、核酸のみを高純度に抽出することは極めて困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願２００１−７８７９０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chomczynski & Sacchi(1987) Analytical Biochemistry,162,156-159
【非特許文献２】R.Boom,C.J.A.Sol,M.M.M.Salimans,C.L.Jansen,P.M.E.Wertheim-van Dillen & J.van der Noordaa(1990)Jourmal of Microbiolooy,Vol.28,No.3.495-503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、
カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の核酸抽出用試薬キットは、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、上記の核酸抽出用試薬とを具えてなることを特徴とする。
【００１１】
本発明の核酸抽出方法は、上記の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特定の界面活性剤を用いることにより、固相担体上に核酸を保持したままで、当該固相担体から不純物を高い効率で除去することができるので、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜実施例３に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図２】比較例１に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図３】実施例４〜実施例６に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図４】比較例２に係る核酸溶液の分光チャートである。
【図５】実施例４で得られた核酸溶液について行った核酸検出試験における電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】比較例２で得られた核酸溶液について行った核酸検出試験における電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
〔核酸抽出用試薬〕
本発明の核酸抽出用試薬は、核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中に含まれる核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられるものであって、水系媒体中にカオトロピック物質および特定の界面活性剤が含有されてなるものである。
【００１５】
本発明の核酸抽出用試薬に用いられるカオトロピック物質としては、特に限定されるものではなく、例えばチオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジンなどのグアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどのヨウ化金属塩、尿素などを、単独でまたは２種以上組み合わせて用いることができる。
本発明の核酸抽出用試薬中におけるカオトロピック物質の濃度は、１．０〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは３．０〜６．０ｍｏｌ／Ｌである。
【００１６】
本発明の核酸抽出用試薬においては、特定の界面活性剤として、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種が用いられる。これらは単独でまたは２種組み合わせて用いることができる。
本発明の核酸抽出用試薬中における特定の界面活性剤の割合は５質量％以下とされ、好ましくは１．０〜２．０質量％である。特定の界面活性剤の割合が５質量％を超える場合には、得られる核酸抽出用試薬の流動性を妨げる要因となり、試料の溶解性や、固相担体への核酸の吸着効率が著しく低下するため、核酸を抽出することが困難となる。一方、この割合が過小である場合には、不純物を十分に除去することが困難となることがある。
【００１７】
本発明の核酸抽出用試薬には、生化学分野で一般的に使用される緩衝剤を含有させることができ、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ系、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）系、Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）系、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）系、クエン酸ナトリウム系、コハク酸系、ホウ酸系、炭酸系、炭酸水素系などの緩衝剤を用いることができる。
【００１８】
〔核酸抽出用試薬キット〕
本発明の核酸抽出用試薬キットは、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、上記の核酸抽出用試薬とを具えてなるものである。
固相担体としては、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得るものであれば、特に限定されず、例えばシリカ粒子、シリカ膜、多孔質体シリカ、ポリスチレン粒子、ポリスチレン膜、ニトロセルロース膜、その他のポリマー材料などを用いることができる。
また、固相担体として粒子状のものを用いる場合には、粒子径が０．０５〜５００μｍのものが好ましく、より好ましくは０．１〜２００μｍである。
また、粒子状の固相担体としては、磁性体を含有するものを用いることができ、これにより、当該固相担体を磁力の作用によって容易に回収することができる。
【００１９】
また、本発明の核酸抽出用試薬キットは、上記の固相担体および核酸抽出用試薬の他に、当該核酸抽出用試薬と同様の構成の洗浄用試薬や、固相担体を洗浄するための洗浄液、固相担体から核酸を溶出させる溶出液を具えてなるものであってもよい。
ここで、洗浄液としては、エタノール水、アセトンなどを用いることができる。
また、溶出液としては、超純水、２回蒸留水、ＴＥ緩衝液などを用いることができる。
【００２０】
〔核酸抽出方法〕
本発明の核酸抽出方法は、上記の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有する。
粒子状の固相担体を用いる場合の具体的な一例について説明すると、核酸抽出用試薬に、核酸を含む試料を添加し、攪拌することによって、核酸抽出用試薬中に試料を均一に溶解または分散させ、更に、固相担体を添加して攪拌することにより、試料を固相担体に接触させる。その結果、試料中に含まれる核酸が固相担体の表面に吸着される。
次いで、例えば遠心分離法によって固相担体を沈殿させ、上清を除去することにより、核酸が吸着された固相担体を回収する。その後、回収した固相担体を洗浄液で洗浄して乾燥し、当該固相担体を溶出液に添加することにより、固相担体から核酸を溶出液中に溶出させることにより、目的とする核酸が抽出される。
【００２１】
以上において、核酸を含む試料としては、血液、ウィルスに感染した種子、食肉、毛髪、皮膚、血清、尿、糞便、精液、唾液、藻類、植物の葉、根、果実などを用いることができる。
また、試料を固相担体に接触させるための処理時間は、例えば１〜５分間である。
また、核酸が吸着された固相担体をエタノール水等の洗浄液で洗浄する前に、核酸抽出用試薬と同様の構成の洗浄用試薬によって洗浄することが好ましく、これにより、固相担体上に吸着された不純物を一層確実に除去することができる。
【００２２】
以上説明したように、本発明によれば、特定の界面活性剤を用いることにより、固相担体上に核酸を保持したままで、当該固相担体から不純物を高い効率で除去することができるので、血液や植物種子などのように糖質や色素の含有量が多く、目的とする核酸の含有量が極めて少ない試料であっても、当該試料から高純度の核酸を抽出することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
〈実施例１〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。以下、これを試薬Ａとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。以下、これを洗浄用試薬ａとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ａと、洗浄用試薬ａと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる核酸抽出用試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（Ｉ）とする。
【００２５】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）を用い、以下のようにして、血液からゲノムＤＮＡを抽出した。
試薬Ａ５００ｍＬ中に血液１００ｍＬを添加し、攪拌して均一化し、更に、固相担体としてシリカ磁性ビーズ分散液２０μＬを添加し、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。
回収したシリカ磁性ビーズに、洗浄用試薬ａ５００ｍＬを加え、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。そして、回収したシリカ磁性ビーズを、７０％エタノール水で２回洗浄した後、乾燥した。その後、シリカ磁性ビーズに超純水１００μＬを加えることにより、核酸をシリカ磁性ビーズから水中に溶出させた。このようにして血液からゲノムＤＮＡを抽出し、核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００２６】
〈実施例２〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。これを試薬Ｂとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤としてポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｂとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ｂと、洗浄用試薬ｂと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる核酸抽出用試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（II）とする。
【００２７】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに試薬キット（II）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００２８】
〈実施例３〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％およびポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％（界面活性剤合計２質量％）を含有してなる、ｐＨ６．４の本発明の核酸抽出用試薬を調製した。これを試薬Ｃとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤としてポリエチレングリコールラウリルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％およびポリエチレングリコール−モノ−ｐ−イソオクチルエーテル（ナカライテスク社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｃとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
試薬Ｃと、洗浄用試薬ｃと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（III ）とする。
【００２９】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに試薬キット（III ）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図１に示す。
【００３０】
〈比較例１〉
（１）核酸抽出用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／ＬおよびＥＤＴＡ（ｗａｋｏ社製）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、並びに、界面活性剤として「ＴｒｉｒｏｎＸ−１００」（Ｓｉｇｍａ社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の比較用の核酸抽出用試薬を調製した。これを比較用試薬Ｄとする。
（２）洗浄用試薬の調製：
水中に、カオトロピック物質としてグアニジンチオシアン酸塩（ｗａｋｏ社製）５ｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｗａｋｏ社製）１００ｍｍｏｌ／Ｌ、および界面活性剤として「ＴｒｉｒｏｎＸ−１００」（Ｓｉｇｍａ社製）１質量％を含有してなる、ｐＨ６．４の洗浄用試薬を調製した。これを洗浄用試薬ｄとする。
（３）核酸抽出用試薬キットの作製：
比較用試薬Ｄと、洗浄用試薬ｄと、シリカ磁性ビーズ分散液とよりなる試薬キットを作製した。以下、これを試薬キット（IV）とする。
【００３１】
（４）血液からのゲノムＤＮＡの抽出：
試薬キット（Ｉ）の代わりに比較用試薬キット（IV）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、血液からゲノムＤＮＡを抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約１０μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、この核酸溶液は赤色に着色しており、波長４００〜４５０ｎｍの領域にピークを有することから、核酸以外の不純物が含まれていることが確認された。この不純物は、ヘモグロビンに由来する色素によるものであると考えられる。
得られた核酸溶液の分光チャートを図２に示す。
【００３２】
〈実施例４〉
実施例１と同様にして作製した試薬キット（Ｉ）を用い、以下のようにして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出した。
メロン種子を粉砕し、この粉砕したメロン種子２ｇを試薬Ａ５００ｍＬ中に添加し、攪拌して均一化し、更に、固相担体としてシリカ磁性ビーズ分散液２０μＬを添加し、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。
回収したシリカ磁性ビーズに、洗浄用試薬ａ５００ｍＬを加え、５分間攪拌した後、遠心分離処理して上清を除去することにより、シリカ磁性ビーズを回収した。そして、回収したシリカ磁性ビーズを、７０％エタノール水で２回洗浄した後、乾燥した。その後、シリカ磁性ビーズに超純水１００μＬを加えることにより、核酸をシリカ磁性ビーズから水中に溶出させた。このようにしてメロン種子からウィルスの核酸を抽出し、核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３３】
〈実施例５〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに実施例２と同様にして作製した試薬キット（II）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３４】
〈実施例６〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに実施例３と同様にして作製した試薬キット（III ）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約８５μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、核酸以外の吸収ピークは認められなかった。
得られた核酸溶液の分光チャートを図３に示す。
【００３５】
〈比較例２〉
試薬キット（Ｉ）の代わりに比較例１と同様にして作製した比較用試薬キット（IV）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ウィルスに感染したメロン種子からウィルスの核酸を抽出して核酸溶液を得た。
得られた核酸溶液を分光光度計「ｅＳｐｅｃｔ」（マルコム社製）で測定したところ、核酸の吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の値から、約４０μｇの核酸が抽出されていることが確認された。また、波長２８０ｎｍ付近にピークを有することから、核酸以外の不純物が含まれていることが確認された。
得られた核酸溶液の分光チャートを図４に示す。
【００３６】
〈核酸検出試験〉
実施例４および比較例２で得られた核酸溶液を、それぞれ１０〜１０7 倍の範囲で段階的に希釈することにより、合計で１１種類の希釈溶液を調製した。各希釈溶液の希釈倍率は、以下の通りである。
希釈溶液１：１０倍，希釈溶液２：１０2 倍，希釈溶液３：１０3 倍，希釈溶液４：１０4 倍，希釈溶液５：１０4 倍，希釈溶液６：１０5 倍，希釈溶液７：１０5 倍，希釈溶液８：１０6 倍，希釈溶液９：１０6 倍，希釈溶液１０：１０7 倍，希釈溶液１１：１０7 倍
【００３７】
これらの希釈液中の核酸をテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、ゲル電気泳動により確認した。結果を図５（実施例２）および図６（比較例２）に示す。
以上において、ＲＴ−ＰＣＲ法の条件は、以下の通りである。
装置：
東洋紡社製「ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ −ｐｌｕｓ−」
反応液：
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２２μＬ，５×Ｂｕｆｆｅｒ １０ｕＬ，２．５ｍＭｄＮＴＰｓ ６．０μＬ，２５ｍＭＭｍ（Ｏａｃ）2 ５．０μＬ，Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ，Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ，１０ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２．０μＬ，２．５ ｕ／ｕＬ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．０ μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ ２．０μＬ
反応温度・反応時間：
６０℃で６０分間，９４℃で２分間，（９４℃で１分間，５５℃で１．５分間）×４０サイクル, ６０℃で７分間
【００３８】
図５および図６の結果から理解されるように、実施例４で抽出された核酸は、比較例２で抽出された核酸に比較して高い感度で検出されることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、
カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする核酸抽出用試薬。
【請求項２】
カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、請求項１に記載の核酸抽出用試薬とを具えてなることを特徴とする核酸抽出用試薬キット。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１】
核酸を含む試料を固相担体に接触させることにより、当該固相担体の表面に当該試料中の核酸を吸着させると共に、この固相担体の表面に核酸を保持した状態で、当該固相担体から不純物を除去するために用いられる核酸抽出用試薬であって、
カオトロピック物質と、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルからなる群から選択された少なくとも１種の界面活性剤とを含有してなり、当該界面活性剤の割合が５質量％以下であることを特徴とする核酸抽出用試薬。
【請求項２】
カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体と、請求項１に記載の核酸抽出用試薬とを具えてなることを特徴とする核酸抽出用試薬キット。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸抽出用試薬中において、核酸を含む試料を、カオトロピック物質の存在下に核酸を吸着し得る固相担体に接触させる工程を有することを特徴とする核酸抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１９３８１４（Ｐ２０１０−１９３８１４Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４３５０９（Ｐ２００９−４３５０９）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（０００１３７４７６）株式会社マルコム (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（０００１３７４７６）株式会社マルコム (15)
【Ｆターム（参考）】
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