核酸検出方法
サンプルにおける複数の分析物を検出するための装置であって、反応槽と；前記反応槽内のサンプルに増幅処理を行うための手段と；サイズによって増幅プライマー構成要素を分離する動作可能な分離ステージと；現存のサイズを定量し、各々のサイズの色を決定するための光検出手段と；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定するための手段と；を含む方法を実施するための装置。この装置を使用する処理工程も記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出方法ならびに識別方法に関し、特に、マルチプレックスな核酸検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばウイルスなどの、核酸のマルチプレックスな検出方法は、特に、複数のウェル内に配置されたサンプルが各々平行して検出プロセスによって処理されることについて記載する国際公開公報ＷＯ／２００４／０８５４５５号の特許明細書に記載されている。
【０００３】
病原体のマルチプレックスな検出が、その一例が国際公開公報ＷＯ／２００２／０２４９５９号の特許明細書に記載されている、ＬＵＭＩＮＥＸ（ルミネックス）システムである免疫学的技術によって可能であることが示されてきた。その他の技術としては、国際公開公報ＷＯ／２００８／０５４８３０号の特許明細書に記載されている、標的分子をアレイとハイブリダイズすることである。かかる手法の欠点は、結果を得るまでに長時間を要することである。さらに、かかる手法は、しばしば極めて薄い分析物であっても確実に成功裏に検出されるために、大きなサンプルサイズを要求する。代替的な手法は、米国特許第４，６８３，２０２号の明細書に記載されているＰＣＲ処理である。従来から核酸は、ＰＣＲ後に、サイズ分割によって検出されており、これは時間がかかるが、その後生成された増幅プライマーを電気泳動法などの下流プロセスで処理するときに、分析物をそのサイズによって多重化する可能性を有するものである。最近では、核酸検出システムの大部分は、米国特許第６，８１４，９３４号の明細書などに記載されているリアルタイムＰＣＲによる。かかるリアルタイムＰＣＲの明らかな欠点は、この試験を行うために使用される器具に関する物理的な限界、すなわち、標的分子の検出が５つまでに制限されることである。この限界は、光システムの構造に基づく物理的なものであり、さらに、光学設計によって、光チャネル間のクロストークが発生する。このため、所望の分析物からの光が反応槽内に存在するその他の産物からの光によって遮られ、存在する分析物のレベルを定量化することを事実上極めて困難にしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、できるだけ短時間で、単一サンプル内の全ての病原体を検出できることである点に変わりない。原因物質が、ウイルス及び／またはバクテリアの任意の一群の１つたり得る場合に、感染症の発生が特定できないとき、かかる要求を満たす必要が特に生じる。かかる目的は、また、人類遺伝学や犯罪分析の場面で利用されるＤＮＡ鑑定など、幅広い分野での必要性がある。さらに重要な目的は、アンプリコンサイズが約７５ｂｐの範囲にわたるが、好ましくは、約６０ｂｐである、短い核酸配列の正確な検出と識別である。これらは、上記を含む従来の手法では、高い信頼度では分析されていない。
【０００５】
現在利用可能な化学的手段における限界は、試験的手法自体の特殊事情によって課される。ＳＹＢＲなどのインターカレートする染料の使用を含む検出の一般的方法によって、検出は可能であるものの、かかる方法が核酸配列に特異的でないことから、応用分野において大いに不利な状況にある。これにより、シグナルが生成されるために適正な核酸配列の存在を要求する、分子間相互作用を要件とする多くの検出システムやプローブの発明が生み出された。これらのうち１つの例が国際公開公報ＷＯ９７／４６７６７号の特許明細書に記載されている。この手法の欠点は、検出され得る最小サイズのアンプリコンが存在することから、余分な分子がかかる技術に設計上の負担を課すことである。さらに、プローブが提供する分子検出は、シグナルが生成されるために長時間を要するため、より高次の事象（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｅｖｅｎｔ）である。
【０００６】
セルフプローブプライマーが当業者に公知であるが、ＬＵＸシステムなどのそれは、配列特異的でなく、生成される任意の疑似産物が同様にシグナルを生成する。その他の公知の化学手法、すなわちＳｃｏｒｐｉｏｎｓ ＧＢ ２３３８３０１及び‘Ａｎｇｌｅｒ’手法、Ｌｅｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｌｉｎｉｃａ Ａｃｔａ ４５７：６１：７０；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７は、それ自体が増幅された配列内でプローブするプライマー配列を利用する。したがって、これらは高次の事象が起きること、つまり、所望の標的へのハイブリダイゼーションを要求しながら、短い増幅プライマーの要求を満たさない。増幅プライマー内に収容されるために、プローブされる配列用に、十分な余地がなければならないからである。
【０００７】
本発明は、特に、現行の化学手法が要求する、サイズが６０塩基未満の短い核酸フラグメントの検出に関して、これらの制限を克服する多くの手段を提供する。インターカレートする染料による手法は、高いバックグラウンドが、より短いアンプリコンによって生成された比較的低いシグナルをマスクするため、たとえ増幅効率が高くても、短い産物に関しては、特異性が低くなる傾向にある。加えて、かかる短いアンプリコンは、伝統的なプローブ法が採用されるための十分な塩基が全くなく、６０塩基程度がカットオフポイントと考えられる。
【０００８】
かかる短いアンプリコンは、宿主の免疫系によって処理された病原体核酸を検出しようと試みるときなど、標的ＤＮＡがせん断される試験において有利である。代替的に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるリサーチでは、そのサイズが２０から３０を超える塩基である二重鎖ＲＮＡ分子に重点を置き、これらの分子の検出は、既存のプローブ技術では不可能である。それは病原体を識別するＤＮＡ配列が、ヌクレオチドの短い反復から構成され得る場合にあり得て、同一のゲノム領域からの干渉がなく、反復回数のみを正確に測定できれば、有利となり得る。全てのアッセイタイプに対するかかる手法のさらなる利点は、反応速度の速さと、かかる短いアンプリコンに固有のＰＣＲ効率の高さである。
【０００９】
本特許明細書において、槽という用語は、処理対象の材料やサンプルを保持することができる任意のデバイスを指し、したがって、可能性としてシリコンチップまたはトレイ形状のウェル、チューブ（開管または閉管）、スライドを含み得、またはこれらから構成され得る。本発明は、特に、ウェル形状のマイクロタイター反応槽に関する。
【００１０】
本特許明細書において、熱サイクルという用語は、サンプルを循環的に加熱して複数温度にすることを指すために使用される。一般的な熱サイクル処理は、上部の変性温度、中間の伸長温度、下部の組み換え温度の３つの温度が使用される場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、かかる処理に要する時間を最短化するために、熱サイクル処理中に、できるだけ正確かつ迅速に、要求される温度に到達し、これを維持することである。
【００１１】
リアルタイム分析を行うシステムが存在する。国際公開公報ＷＯ２００４／０４５７７２号の特許明細書は、そのうちの１つを記載している。しかしながら、これらのシステムは、融点の測定や上記のリアルタイムＰＣＲ処理などのマルチプレックスな分析方法に限定される。同様に、米国特許第５５５２３２２号の明細書に記載されるＤＮＡシーケンサーなど、サイズ分離のためのオフラインシステムがある。
【００１２】
したがって、本発明の重要な目的は、分析物たる核酸の効率的なマルチプレックス分析のためのシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の実施態様によれば、１つのサンプル内の複数の分析物を検出する方法は、分析物の期待される性質により、１つまたは複数のプライマーを選択し、各プライマーを異なる染料で標識して、これを反応槽内に配置することと；前記反応槽内で分析対象のサンプルを配置することと；前記サンプルに増幅処理を行うことと；以後増幅プライマーと呼ぶ前記増幅されたサンプルの構成要素をそのサイズによって分離することと；現存の前記サイズを定量し、各々のサイズの色を測定することと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することと；を含む。
【００１４】
本発明のこの実施態様の増幅処理は、サンプル内の核酸が複数存在していても、単一反応槽内で達成され得る点が認識されるだろう。
【００１５】
増幅プライマーの構成要素の分離は、電気泳動法を行うために、増幅プライマーに電圧をかけることにより実行され得る。代替的に、遠心分離が採用され得る。
【００１６】
一般的な分離用の媒体は、アガロース、ポリアクリルアミド、及び当業者が精通しているその他の媒体を含む。
【００１７】
かかる処理は、増幅されたサンプルを前記反応槽から光検出装置へ移動させることを含み、後者は可能性としてキャピラリーチューブを含み得て、この中で、サイズの定量化と色の決定が行われる。かかる移動は、マイクロフルイディクスシステムによって達成され得る。しかしながら、１つの実施形態では、携帯サイズ、また別の実施形態では卓上サイズ、あるいはまた別の実施形態では実験装置に匹敵するサイズなどを有するキット内で全処理が行われ得る点、そしてその各場合においてオートメーション化され得る点が認識されるだろう。
【００１８】
光検出装置からの増幅装置の分離が可能であるにもかかわらず、手で持ち運べて、それゆえに、例えば、ある病気などが発生した農場へ出向く獣医による使用のように、フィールドで使用ができる上記プロセスを達成するための装置を即時提供することが可能であることが、本発明の１つの特徴である。関連のある動物又は動物の群れから発生する病気の兆候が、病原体についての何らかの示唆を行い、これにしたがってプライマーや染料が選択され得る。
【００１９】
機能（ｆａｃｉｌｉｔｙ）は、単一の閉管アッセイにおいて１０を超える、また、２０をも超える分析物の検出が可能であるが、少なくとも２つの分析物を検出可能である。
【００２０】
本発明の第二の実施態様によれば、１つのサンプル内で複数の分析物を検出するための装置であって、反応槽と；反応槽内のサンプルに増幅処理を行うための手段と；サイズにしたがった増幅プライマー構成要素を分離するために動作可能な分離ステージと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定するための手段と；を含む装置が提供される。
【００２１】
反応槽がマイクロタイターウェルであり、サンプル増幅手段がＰＣＲ装置を含み、分離ステージが増幅プライマーに電圧をかける手段を含み、増幅プライマーを分離電圧で処理する手段が電気泳動装置を含み、光検出手段がスペクトル検出器を含むことが好ましい。
【００２２】
したがって、本発明は、例えばＰＣＲによって、核酸を増幅して期待される核酸の増幅プライマーを生成し、その後、生成した増幅プライマーを物理的サイズに分離することによって、複数の核酸を同時に検出する機能を提供する。これは、増幅された標的をサイズと色によって同時に識別できることが効果的である。この機能は、１つの動作で検出可能な分析物、本件では病原体の数を大幅に増大させる。さらに、この動作は、６０分以内、場合によっては３０分以内にて完成され得る。
【００２３】
本発明の特徴によれば、サンプル内のオリゴヌクレオチドは、機能の範囲内で蛍光標識される。このようにして、極めて短いオリゴヌクレオチドプライマー配列が検出され得る。適切な染料は、とりわけ、フルオレセイン、ＴＥＴ、ＨＥＸなどの蛍光標識を含む。これは、所謂、システムの化学部分である。
【００２４】
この化学部分は、先行技術のシステムと比較して、配列特異的なシグナルを生成するために従来必要であった追加的な分子の要件を除外したという有利な特徴を有する。これは、既存の方法と比較して、２つの重要な有利な点をもたらす。１つは、配列検出のためにより小さな面積が考慮されればよい点であり、もう１つは、より小さなアンプリコンと、より高次な事象の欠落により、対象となる病原体のより迅速な検出が可能になる点である。
【００２５】
したがって、かかる機能は、サイズが異なるＰＣＲ産物を１ｂｐ毎に識別するために使用され得て、上記の蛍光標識されたプライマーを使用して１５以上のものが同時に識別され得る。
【００２６】
こうして、上記に概要を示した分離システムを利用して、産物が分離される。そして、分離されたフラグメントがスペクトル分析器によって光学的な照合を受けるときに、適切なソフトウェアが採用され得て、期待される波長とサイズバンド内における光の存在または不存在に基づいて、エンドユーザ用に結果を自動的に解明する。
【００２７】
したがって、本発明は、迅速な、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲと、これに続いて行われる、結果的に生成したアンプリコンのサイズによる分離が可能なシステムに関し、かかる識別が特異的に開発されたソフトウェアによってなされ得る。さらに、かかるシステムは、この分野における当業者に自明な様々な標的用の任意の短い（約６０ｂｐ）増幅プライマーを識別するために使用され得る。
【００２８】
動作中、グループを識別するために、所定グループの全ての標的が、同一の染料で標識され、リアルタイム分析が行われるよう、試験が構成され得ることが想定される。その後、後続のサイズ毎の分離によって、かかるグループ内での細分類が即時に行われる。これは、アッセイ依存的で、上記システムが、単一槽において最小で１通りの、最大で１００通り（これは１０通りの異なる色と１０通りの異なるアンプリコンサイズである）の分析物を識別し得る。本発明のこのシステム構成要素は３つのステージがあり、その実施例については、以下に概要を述べる。
【００２９】
第一のステージは、国際公開公報ＷＯ／２００８／１０７６８３号の特許明細書に概要が記載されている、迅速かつ正確な熱サイクルシステムを含むことが有利である。このステージは、３０分未満で完了され得る。
【００３０】
マルチプレックスな検出システムは、単一のまたは複数の照明光源を含む１つ以上の照明光源を有し得る。これらは、ダイオード励起の固体レーザー（単数・複数）であることが好ましいが、その他のＬＥＤ、ガス励起のレーザー、照明器具の任意の１つでもよい。その他の想定される実施形態において、かかる一連の照明光源は、システムが利用し得る染料の幅をさらに拡げるために使用され得る。
【００３１】
本発明は、最低限で６ｎｍの解像度、好ましくは１ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を活用することが有利である。これにより、１２通りの染料の識別が可能になり、そのために、現在では５つの病原体に制限されている既存技術をはるかに上回るアンプリコンの検出が可能になる。分析対象の波長は、最低で５００乃至７００ｎｍであるが、好ましくは３００乃至１０００ｎｍである。かかるシステムは、染料デコンボリューションソフトウェアによって、ピーク蛍光波長が僅か３ｎＭ分異なる染料間においても識別が可能である。デコンボリューションソフトウェアは、各スペクトルを、現存の各分析物から正確に分離し得る。
【００３２】
想定される各プローブシステムは、例えばＬＮＡ分子または当業者に知られる任意の修飾塩基などの修飾塩基の使用における近年の技術進歩を活用し得る。かかる分子の有利な点は、上記のプローブシステムを使用して、長さが２０塩基という短い増幅プライマーをも検出可能なことである。
【００３３】
本発明のその他の想定される実施形態は、順方向プライマーと逆方向プライマーとに別々に配置される２つの蛍光染料の配置に依存する。適正な増幅産物においてのみ、これらの蛍光分子同士が空間的に十分に接近してＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）が起こり、これによりシグナルが生成される。
【００３４】
定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定する工程は、適切な特注デコンボリューションソフトウェアを使用して達成され得る。かかるソフトウェアは、期待される波長バンド内の光の存在または不存在に基づいて、エンドユーザ用に結果を自動的に解明する。
【００３５】
光システムは、反応チャンバからの核酸アッセイの処理能力を発揮できるように配置され得るため、多くの熱サイクラーにおいて、試験が結果的に生じた増幅プライマーとともに行われ得て、その後単一リーダーに移動し、これによって診断結果が迅速に決定される。
【００３６】
採用され得るＰＣＲの形態に関しては、現在認められている任意のリアルタイムＰＣＲ検出による化学手法が可能である。プローブシステムは、国際公開公報ＷＯ／１９９９／０２８５００号に記載されたＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（商標）プローブの形態をとり得る。しかしながら、本明細書に記載された化学手法が好ましい。
【００３７】
本発明を、添付の図面を参照して、特定して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１（１ａ、１ｂ、１ｃ）は、本発明の検出原理を示す。
【図２】図２は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図３】図３は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図５】図５は、蛍光ピーク間の相互作用を示す。
【図６】図６は、経時的な増幅プライマー構成要素の分離を示す。
【図７】図７は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図８】図８は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図９】図９は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図１０】図１０は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【００３９】
本発明の第一の実施形態は、５´末端が、蛍光染料、好ましくは、ＣＹ５などの、より長い波長を有する染料で標識された配列特異的なプライマーを採用する。プローブシステムは、それが意図する標的と結合し、所望の配列の増幅のプライミングのために利用可能となる。標識されたプライマーは、ＳＹＴＯ９及びＥＶＡ ＧＲＥＥＮなどのその他の適切な染料が当業者に知られているが、好ましくはＳＹＢＲである、インターカレートする染料を含有する反応混合物中で増幅される。理想的には、この染料は、プライマー分子の５´末端にタグ付けされた染料よりも短い波長である。好ましい実施形態においては青色のレーザー光線である光源によって照らされると、ＳＹＢＲ染料が蛍光を発し、レーザーそのものはＣＹ５染料を励起できないものの、ＦＲＥＴ原理によって、その光エネルギーをＣＹ５へ変換させる。こうして、ＣＹ５シグナルが検出されて、生体反応の進行を測定し、分子レベルの潜在的病原菌の検出を可能にするために、使用される。この手法は、図２乃至図４においてその概要が示される。
【００４０】
第二の好ましい実施形態はスキャナの形態をとり、それゆえに熱サイクルシステムを要しない。かかるスキャナは、多くの熱サイクラーで試験が同時に行われて、その後単一リーダーに移動されて、診断結果が迅速に決定され得るため、増加した核酸アッセイの処理能力を可能にする。この方法は、色のみによる分離に適しており、これにより、最小限１つであるが、単一槽内の１２通りまでの異なる標的に対する検出が容易になされ得る。
【００４１】
第三の実施形態は、テール配列をプライマー自体に組み入れることである。テール分子の存在により、かかる短いアンプリコン上で使用されるＴａｑｍａｎなどの配列特異的なプローブ化学手法が可能となるが、これは、かかる修飾がなされなければ物理的に不可能であったものである。
【００４２】
第四の実施形態は、増幅産物に染料停止剤を使用することだろう。プライマーがＣＹ５で標識され、重複配置されている場合には、生体反応を完成させ、かつ、蛍光シグナルを生成するために、単一塩基伸長のみが要求される。
【００４３】
図５から分かるように、３つの別々の光学「ピーク」が、サンプルからのリターンスペクトル内に存在していても、各々の「ピーク」が融合されて１つのスペクトルになる。このことは、「ピーク」間の「クロストーク」を生み出すが、これは、励起時に染料がいかに反応するかを把握し、個別のピーク形状ならびに１つの「ピーク」の存在が、いかにして同一「サンプル」内で染料を二次励起するかを把握するデコンボリューションソフトウェアによって解明され、再度分離されなければならない。１つの例として、染料１がレーザーによって励起される。これにより、蛍光シグナルが生成され、これがレーザー光源とともに染料２を励起して、レーザーのみが励起を行う場合の染料２とは異なる光シグナルを生成する。
【００４４】
好ましい実施形態は、まず、マルチプレックスな検出が可能なリアルタイムＰＣＲ反応を行い、その後、増幅した分子を電気泳動法によってサイズごとに分離して、識別され得る分子数をさらに増加させる。
【００４５】
図７及び図８は、熱サイクルチャンバと、アガロース、ポリアクリルアミド、または当業者に公知のその他の任意の分画用の物質を含有し、電気泳動分離が起きるのに適切な追加的チャネルとを含む、使い捨ての反応槽を示す。かかる槽は、熱サイクル反応にて処理され、これにより、適正な分析物の存在下で、意図されたＰＣＲ産物を生成し、こうしてシステムによって検出される蛍光シグナルを生成する。反応の完成に続いて、マイクロフルイディクスシステムが、サンプルの一部分を同一場所に配置された分離用の媒体へと移動させ、電気泳動処理によってサイズ毎に整理される。
【００４６】
好ましい実施形態は、各々のバリエーションを異なる染料で標識することにより、一塩基多型（ＳＮＰ）の分離を可能にする。このようにして、ＳＮＰは、光検出器を通過するのに要する時間または、実際には、発光波長によって検出され得る。電気泳動用媒体における電極電圧は、サンプルの「捕獲」が行われている（つまり、蛍光は検出されない）間に高電圧が印加され、その後電圧が低下されて検出の分解能を高め、サイズ毎のＳＮＰ分析が、アンプリコンが壊れると予測される範囲内で行われ、正確性と分解能を維持しつつ、検出時間を減少させるように調整され得る。
【００４７】
図３は、４つの個々の多型を検出する４色を示す。それぞれ赤色と青色で標識されたＳＮＰは、従来のサイズ分離技術によっては正確に分離されていないことがみてとれる。増幅プライマーに結合した染料により、これらの移動する種の分離がはるかに簡便になる。かかる因子は、提案されているシステムが、サイズと発光波長の両方で分離するため、分析され得る産物の分量を増加させている。
【００４８】
サイズを分割されたサンプルは、こうして上記のスペクトル分析器によってスペクトル評価を受ける。このシステムによって、単一アッセイ内で最低２つであるが、実際にはゆうに２０を超える病原体が検出され得る。
【００４９】
図７に示すように、反応槽（１）は、ＰＣＲが起きる反応部分を有する。要求される加熱と冷却が、熱源／シンク６に付随し、逆転電圧極性を受けるペルチェ効果モジュール（４）によって達成される。熱エネルギーが熱伝導性の反応槽ホルダー（３）を通過して反応槽へと移動する。この反応チャンバの下には、電気泳動ゲルを含有するキャピラリー１１がある。キャピラリーの上には、標識されたＤＮＡが、前記ゲルを横切って選択された電極へ向かうことを容易にするために、バイアス電圧が電気接点（５）を介して供給され得る一対の電気接点（２）が示されている。
【００５０】
レーザー励起（７）は、標識された核酸がレーザー（単数・複数）の前を通過するときに、蛍光サイン（８）を生成する電気泳動ゲルを通過する。
【００５１】
この蛍光サイン（８）は、検出器（１０）を横切るスペクトルを生成する回折格子（９）上に向かう。
【００５２】
キャピラリーは、この高圧が創出した生成熱のために通常であれば可能な電圧よりも高い電圧で電気泳動を可能にする、一定温度４０乃至６０℃台に維持された除去モジュール（ＨＲＭ）熱源／シンク６を通過する。
【００５３】
これらのアッセイを完成するために、これらの短い核酸標的の増幅及び検出に適した化学手法が要求される。想定される本発明の第一の実施形態は、５´末端が蛍光染料で標識された配列特異的なプライマーであり、前記染料は、好ましくはＣＹ５などのより長い波長の染料であるが、これらに限定されず、当業者に公知の全ての染料を含む。プローブシステムは、それが意図する標的と結合し、所望の配列の増幅のプライミングのために利用可能となる。標識されたプライマーは、ＳＹＴＯ９及びＥＶＡ ＧＲＥＥＮなどの他の適切な染料が当業者に公知であるが、好ましい実施形態はＳＹＢＲである、インターカレートする染料を含有する反応混合物内で増幅される。重要なことは、この染料は、プライマー分子の５´末端にタグ付けされた染料よりも短い波長でなければならないことである。好ましい実施形態では青色のレーザー光線である光源によって照らされると、ＳＹＢＲ染料が蛍光を発し、レーザーそのものはＣＹ５染料を励起できないものの、ＦＲＥＴ原理によってその光エネルギーをＣＹ５へ変換させる。こうしてＣＹ５シグナルが検出されて、生体反応の進行を測定し、分子レベルで潜在的病原菌の検出を可能にするために、使用される。この手法は、図４においてその概要が示される。
【００５４】
想定される各プローブシステムは、例えばＬＮＡ分子または当業者に公知の任意の修飾塩基などの修飾塩基の使用における近年の技術進歩を活用し得る。かかる分子の有利な点は、上記のプローブシステムを使用して、長さが２０塩基という短い増幅プライマーが検出可能なことである。
【００５５】
本発明のその他の想定される実施形態は、順方向プライマーと逆方向プライマーとに別々に配置される２つの蛍光染料の配置に依存する。適正な増幅産物においてのみ、これらの蛍光分子同士が空間的に十分に接近してＦＲＥＴが起こり、これによって図４ｂに示すようにシグナルを生成する。
【００５６】
第三の好ましい実施形態は、テール配列をプライマー自体に組み入れることである。テール分子の存在により、かかる短いアンプリコン上で使用されるＴａｑｍａｎなどの配列特異的なプローブ化学手法が可能となる。これは、かかる修飾がなされなければ物理的に不可能であったものである。これは、図４ｃにおいて強調されている。この手法は、従来はヘアピン構造の生成のための相補的配列を提供するため、またはＡｎｇｌｅｒの化学手法など、セルフプローブのアンプリコン配列において、続いて使用される結合領域を提供するために利用されていた。短いアンプリコンにおけるプローブハイブリダイゼーション用の標的を提供するために５´配列テールを使用することは、そうでなければ適切な標的候補が選択できないため、この点において新規である。
【００５７】
最後の考えられる実施形態は、増幅産物に染料停止剤を使用することである。図４ｄにおいて示すように、生体反応を完成させ、かつ、蛍光シグナルを生成する両目的のために、単一塩基伸長のみが要求されるように、プライマーがＣＹ５で標識され、重複配置にて構成される。
【００５８】
上記のキットは特許請求の範囲に記載され、本明細書に示された全処理工程を実施し得るが、最高で４つまたは５つ程度の異なる核酸が存在する検出処理であって、処理過程中、化学段階を全て省略した処理も実施し得る旨、認識されるだろう。
【００５９】
図８は、本発明のさらなる実施形態を示す。かかる実施形態において、現存のリアルタイムＰＣＲが調整され、完成された増幅プライマーが後続のサイズ分離において回収され得るようにする。反応槽は、貫通可能な蓋が備えられ、リアルタイムＰＣＲ増幅処理完了後、蛍光標識された産物がサイズ毎に分離される。この装置は、槽の蓋を貫通可能で、かつ、蛍光標識された産物をサイズ毎に分離するために電気泳動法へ適用すべく調整されたキャピラリーシステムへ増幅プライマーを移動させ得るフルイディクスシステムを組み込んでいる。
１ 増幅産物を含む反応槽
２ 液体移動キャピラリーチューブ
３ 液体を移動させるための真空ポンプ
４ 電気泳動キャピラリー
５ 光検出器
【００６０】
例えば各々が同一のサンプルのいくつかを含む、例えば９６ウェルのアレイであって、全アレイをＰＣＲ処理することを採用したとしても、本発明では、単一のウェルの使用が可能であり、これによってその構成要素たる核酸を成功裏に分析するために要求されるサンプルのサイズならびにかかる処理に要求されるキットのサイズを大幅に小さくする点が、認識されるだろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出方法ならびに識別方法に関し、特に、マルチプレックスな核酸検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばウイルスなどの、核酸のマルチプレックスな検出方法は、特に、複数のウェル内に配置されたサンプルが各々平行して検出プロセスによって処理されることについて記載する国際公開公報ＷＯ／２００４／０８５４５５号の特許明細書に記載されている。
【０００３】
病原体のマルチプレックスな検出が、その一例が国際公開公報ＷＯ／２００２／０２４９５９号の特許明細書に記載されている、ＬＵＭＩＮＥＸ（ルミネックス）システムである免疫学的技術によって可能であることが示されてきた。その他の技術としては、国際公開公報ＷＯ／２００８／０５４８３０号の特許明細書に記載されている、標的分子をアレイとハイブリダイズすることである。かかる手法の欠点は、結果を得るまでに長時間を要することである。さらに、かかる手法は、しばしば極めて薄い分析物であっても確実に成功裏に検出されるために、大きなサンプルサイズを要求する。代替的な手法は、米国特許第４，６８３，２０２号の明細書に記載されているＰＣＲ処理である。従来から核酸は、ＰＣＲ後に、サイズ分割によって検出されており、これは時間がかかるが、その後生成された増幅プライマーを電気泳動法などの下流プロセスで処理するときに、分析物をそのサイズによって多重化する可能性を有するものである。最近では、核酸検出システムの大部分は、米国特許第６，８１４，９３４号の明細書などに記載されているリアルタイムＰＣＲによる。かかるリアルタイムＰＣＲの明らかな欠点は、この試験を行うために使用される器具に関する物理的な限界、すなわち、標的分子の検出が５つまでに制限されることである。この限界は、光システムの構造に基づく物理的なものであり、さらに、光学設計によって、光チャネル間のクロストークが発生する。このため、所望の分析物からの光が反応槽内に存在するその他の産物からの光によって遮られ、存在する分析物のレベルを定量化することを事実上極めて困難にしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、できるだけ短時間で、単一サンプル内の全ての病原体を検出できることである点に変わりない。原因物質が、ウイルス及び／またはバクテリアの任意の一群の１つたり得る場合に、感染症の発生が特定できないとき、かかる要求を満たす必要が特に生じる。かかる目的は、また、人類遺伝学や犯罪分析の場面で利用されるＤＮＡ鑑定など、幅広い分野での必要性がある。さらに重要な目的は、アンプリコンサイズが約７５ｂｐの範囲にわたるが、好ましくは、約６０ｂｐである、短い核酸配列の正確な検出と識別である。これらは、上記を含む従来の手法では、高い信頼度では分析されていない。
【０００５】
現在利用可能な化学的手段における限界は、試験的手法自体の特殊事情によって課される。ＳＹＢＲなどのインターカレートする染料の使用を含む検出の一般的方法によって、検出は可能であるものの、かかる方法が核酸配列に特異的でないことから、応用分野において大いに不利な状況にある。これにより、シグナルが生成されるために適正な核酸配列の存在を要求する、分子間相互作用を要件とする多くの検出システムやプローブの発明が生み出された。これらのうち１つの例が国際公開公報ＷＯ９７／４６７６７号の特許明細書に記載されている。この手法の欠点は、検出され得る最小サイズのアンプリコンが存在することから、余分な分子がかかる技術に設計上の負担を課すことである。さらに、プローブが提供する分子検出は、シグナルが生成されるために長時間を要するため、より高次の事象（ｈｉｇｈｅｒ ｏｒｄｅｒ ｅｖｅｎｔ）である。
【０００６】
セルフプローブプライマーが当業者に公知であるが、ＬＵＸシステムなどのそれは、配列特異的でなく、生成される任意の疑似産物が同様にシグナルを生成する。その他の公知の化学手法、すなわちＳｃｏｒｐｉｏｎｓ ＧＢ ２３３８３０１及び‘Ａｎｇｌｅｒ’手法、Ｌｅｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｌｉｎｉｃａ Ａｃｔａ ４５７：６１：７０；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７は、それ自体が増幅された配列内でプローブするプライマー配列を利用する。したがって、これらは高次の事象が起きること、つまり、所望の標的へのハイブリダイゼーションを要求しながら、短い増幅プライマーの要求を満たさない。増幅プライマー内に収容されるために、プローブされる配列用に、十分な余地がなければならないからである。
【０００７】
本発明は、特に、現行の化学手法が要求する、サイズが６０塩基未満の短い核酸フラグメントの検出に関して、これらの制限を克服する多くの手段を提供する。インターカレートする染料による手法は、高いバックグラウンドが、より短いアンプリコンによって生成された比較的低いシグナルをマスクするため、たとえ増幅効率が高くても、短い産物に関しては、特異性が低くなる傾向にある。加えて、かかる短いアンプリコンは、伝統的なプローブ法が採用されるための十分な塩基が全くなく、６０塩基程度がカットオフポイントと考えられる。
【０００８】
かかる短いアンプリコンは、宿主の免疫系によって処理された病原体核酸を検出しようと試みるときなど、標的ＤＮＡがせん断される試験において有利である。代替的に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるリサーチでは、そのサイズが２０から３０を超える塩基である二重鎖ＲＮＡ分子に重点を置き、これらの分子の検出は、既存のプローブ技術では不可能である。それは病原体を識別するＤＮＡ配列が、ヌクレオチドの短い反復から構成され得る場合にあり得て、同一のゲノム領域からの干渉がなく、反復回数のみを正確に測定できれば、有利となり得る。全てのアッセイタイプに対するかかる手法のさらなる利点は、反応速度の速さと、かかる短いアンプリコンに固有のＰＣＲ効率の高さである。
【０００９】
本特許明細書において、槽という用語は、処理対象の材料やサンプルを保持することができる任意のデバイスを指し、したがって、可能性としてシリコンチップまたはトレイ形状のウェル、チューブ（開管または閉管）、スライドを含み得、またはこれらから構成され得る。本発明は、特に、ウェル形状のマイクロタイター反応槽に関する。
【００１０】
本特許明細書において、熱サイクルという用語は、サンプルを循環的に加熱して複数温度にすることを指すために使用される。一般的な熱サイクル処理は、上部の変性温度、中間の伸長温度、下部の組み換え温度の３つの温度が使用される場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、かかる処理に要する時間を最短化するために、熱サイクル処理中に、できるだけ正確かつ迅速に、要求される温度に到達し、これを維持することである。
【００１１】
リアルタイム分析を行うシステムが存在する。国際公開公報ＷＯ２００４／０４５７７２号の特許明細書は、そのうちの１つを記載している。しかしながら、これらのシステムは、融点の測定や上記のリアルタイムＰＣＲ処理などのマルチプレックスな分析方法に限定される。同様に、米国特許第５５５２３２２号の明細書に記載されるＤＮＡシーケンサーなど、サイズ分離のためのオフラインシステムがある。
【００１２】
したがって、本発明の重要な目的は、分析物たる核酸の効率的なマルチプレックス分析のためのシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の実施態様によれば、１つのサンプル内の複数の分析物を検出する方法は、分析物の期待される性質により、１つまたは複数のプライマーを選択し、各プライマーを異なる染料で標識して、これを反応槽内に配置することと；前記反応槽内で分析対象のサンプルを配置することと；前記サンプルに増幅処理を行うことと；以後増幅プライマーと呼ぶ前記増幅されたサンプルの構成要素をそのサイズによって分離することと；現存の前記サイズを定量し、各々のサイズの色を測定することと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することと；を含む。
【００１４】
本発明のこの実施態様の増幅処理は、サンプル内の核酸が複数存在していても、単一反応槽内で達成され得る点が認識されるだろう。
【００１５】
増幅プライマーの構成要素の分離は、電気泳動法を行うために、増幅プライマーに電圧をかけることにより実行され得る。代替的に、遠心分離が採用され得る。
【００１６】
一般的な分離用の媒体は、アガロース、ポリアクリルアミド、及び当業者が精通しているその他の媒体を含む。
【００１７】
かかる処理は、増幅されたサンプルを前記反応槽から光検出装置へ移動させることを含み、後者は可能性としてキャピラリーチューブを含み得て、この中で、サイズの定量化と色の決定が行われる。かかる移動は、マイクロフルイディクスシステムによって達成され得る。しかしながら、１つの実施形態では、携帯サイズ、また別の実施形態では卓上サイズ、あるいはまた別の実施形態では実験装置に匹敵するサイズなどを有するキット内で全処理が行われ得る点、そしてその各場合においてオートメーション化され得る点が認識されるだろう。
【００１８】
光検出装置からの増幅装置の分離が可能であるにもかかわらず、手で持ち運べて、それゆえに、例えば、ある病気などが発生した農場へ出向く獣医による使用のように、フィールドで使用ができる上記プロセスを達成するための装置を即時提供することが可能であることが、本発明の１つの特徴である。関連のある動物又は動物の群れから発生する病気の兆候が、病原体についての何らかの示唆を行い、これにしたがってプライマーや染料が選択され得る。
【００１９】
機能（ｆａｃｉｌｉｔｙ）は、単一の閉管アッセイにおいて１０を超える、また、２０をも超える分析物の検出が可能であるが、少なくとも２つの分析物を検出可能である。
【００２０】
本発明の第二の実施態様によれば、１つのサンプル内で複数の分析物を検出するための装置であって、反応槽と；反応槽内のサンプルに増幅処理を行うための手段と；サイズにしたがった増幅プライマー構成要素を分離するために動作可能な分離ステージと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定するための手段と；を含む装置が提供される。
【００２１】
反応槽がマイクロタイターウェルであり、サンプル増幅手段がＰＣＲ装置を含み、分離ステージが増幅プライマーに電圧をかける手段を含み、増幅プライマーを分離電圧で処理する手段が電気泳動装置を含み、光検出手段がスペクトル検出器を含むことが好ましい。
【００２２】
したがって、本発明は、例えばＰＣＲによって、核酸を増幅して期待される核酸の増幅プライマーを生成し、その後、生成した増幅プライマーを物理的サイズに分離することによって、複数の核酸を同時に検出する機能を提供する。これは、増幅された標的をサイズと色によって同時に識別できることが効果的である。この機能は、１つの動作で検出可能な分析物、本件では病原体の数を大幅に増大させる。さらに、この動作は、６０分以内、場合によっては３０分以内にて完成され得る。
【００２３】
本発明の特徴によれば、サンプル内のオリゴヌクレオチドは、機能の範囲内で蛍光標識される。このようにして、極めて短いオリゴヌクレオチドプライマー配列が検出され得る。適切な染料は、とりわけ、フルオレセイン、ＴＥＴ、ＨＥＸなどの蛍光標識を含む。これは、所謂、システムの化学部分である。
【００２４】
この化学部分は、先行技術のシステムと比較して、配列特異的なシグナルを生成するために従来必要であった追加的な分子の要件を除外したという有利な特徴を有する。これは、既存の方法と比較して、２つの重要な有利な点をもたらす。１つは、配列検出のためにより小さな面積が考慮されればよい点であり、もう１つは、より小さなアンプリコンと、より高次な事象の欠落により、対象となる病原体のより迅速な検出が可能になる点である。
【００２５】
したがって、かかる機能は、サイズが異なるＰＣＲ産物を１ｂｐ毎に識別するために使用され得て、上記の蛍光標識されたプライマーを使用して１５以上のものが同時に識別され得る。
【００２６】
こうして、上記に概要を示した分離システムを利用して、産物が分離される。そして、分離されたフラグメントがスペクトル分析器によって光学的な照合を受けるときに、適切なソフトウェアが採用され得て、期待される波長とサイズバンド内における光の存在または不存在に基づいて、エンドユーザ用に結果を自動的に解明する。
【００２７】
したがって、本発明は、迅速な、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲと、これに続いて行われる、結果的に生成したアンプリコンのサイズによる分離が可能なシステムに関し、かかる識別が特異的に開発されたソフトウェアによってなされ得る。さらに、かかるシステムは、この分野における当業者に自明な様々な標的用の任意の短い（約６０ｂｐ）増幅プライマーを識別するために使用され得る。
【００２８】
動作中、グループを識別するために、所定グループの全ての標的が、同一の染料で標識され、リアルタイム分析が行われるよう、試験が構成され得ることが想定される。その後、後続のサイズ毎の分離によって、かかるグループ内での細分類が即時に行われる。これは、アッセイ依存的で、上記システムが、単一槽において最小で１通りの、最大で１００通り（これは１０通りの異なる色と１０通りの異なるアンプリコンサイズである）の分析物を識別し得る。本発明のこのシステム構成要素は３つのステージがあり、その実施例については、以下に概要を述べる。
【００２９】
第一のステージは、国際公開公報ＷＯ／２００８／１０７６８３号の特許明細書に概要が記載されている、迅速かつ正確な熱サイクルシステムを含むことが有利である。このステージは、３０分未満で完了され得る。
【００３０】
マルチプレックスな検出システムは、単一のまたは複数の照明光源を含む１つ以上の照明光源を有し得る。これらは、ダイオード励起の固体レーザー（単数・複数）であることが好ましいが、その他のＬＥＤ、ガス励起のレーザー、照明器具の任意の１つでもよい。その他の想定される実施形態において、かかる一連の照明光源は、システムが利用し得る染料の幅をさらに拡げるために使用され得る。
【００３１】
本発明は、最低限で６ｎｍの解像度、好ましくは１ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を活用することが有利である。これにより、１２通りの染料の識別が可能になり、そのために、現在では５つの病原体に制限されている既存技術をはるかに上回るアンプリコンの検出が可能になる。分析対象の波長は、最低で５００乃至７００ｎｍであるが、好ましくは３００乃至１０００ｎｍである。かかるシステムは、染料デコンボリューションソフトウェアによって、ピーク蛍光波長が僅か３ｎＭ分異なる染料間においても識別が可能である。デコンボリューションソフトウェアは、各スペクトルを、現存の各分析物から正確に分離し得る。
【００３２】
想定される各プローブシステムは、例えばＬＮＡ分子または当業者に知られる任意の修飾塩基などの修飾塩基の使用における近年の技術進歩を活用し得る。かかる分子の有利な点は、上記のプローブシステムを使用して、長さが２０塩基という短い増幅プライマーをも検出可能なことである。
【００３３】
本発明のその他の想定される実施形態は、順方向プライマーと逆方向プライマーとに別々に配置される２つの蛍光染料の配置に依存する。適正な増幅産物においてのみ、これらの蛍光分子同士が空間的に十分に接近してＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）が起こり、これによりシグナルが生成される。
【００３４】
定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定する工程は、適切な特注デコンボリューションソフトウェアを使用して達成され得る。かかるソフトウェアは、期待される波長バンド内の光の存在または不存在に基づいて、エンドユーザ用に結果を自動的に解明する。
【００３５】
光システムは、反応チャンバからの核酸アッセイの処理能力を発揮できるように配置され得るため、多くの熱サイクラーにおいて、試験が結果的に生じた増幅プライマーとともに行われ得て、その後単一リーダーに移動し、これによって診断結果が迅速に決定される。
【００３６】
採用され得るＰＣＲの形態に関しては、現在認められている任意のリアルタイムＰＣＲ検出による化学手法が可能である。プローブシステムは、国際公開公報ＷＯ／１９９９／０２８５００号に記載されたＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（商標）プローブの形態をとり得る。しかしながら、本明細書に記載された化学手法が好ましい。
【００３７】
本発明を、添付の図面を参照して、特定して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１（１ａ、１ｂ、１ｃ）は、本発明の検出原理を示す。
【図２】図２は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図３】図３は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図４】図４は、本発明の化学段階の実施形態を示す。
【図５】図５は、蛍光ピーク間の相互作用を示す。
【図６】図６は、経時的な増幅プライマー構成要素の分離を示す。
【図７】図７は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図８】図８は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図９】図９は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【図１０】図１０は、本発明に基づく装置の概略図を示す。
【００３９】
本発明の第一の実施形態は、５´末端が、蛍光染料、好ましくは、ＣＹ５などの、より長い波長を有する染料で標識された配列特異的なプライマーを採用する。プローブシステムは、それが意図する標的と結合し、所望の配列の増幅のプライミングのために利用可能となる。標識されたプライマーは、ＳＹＴＯ９及びＥＶＡ ＧＲＥＥＮなどのその他の適切な染料が当業者に知られているが、好ましくはＳＹＢＲである、インターカレートする染料を含有する反応混合物中で増幅される。理想的には、この染料は、プライマー分子の５´末端にタグ付けされた染料よりも短い波長である。好ましい実施形態においては青色のレーザー光線である光源によって照らされると、ＳＹＢＲ染料が蛍光を発し、レーザーそのものはＣＹ５染料を励起できないものの、ＦＲＥＴ原理によって、その光エネルギーをＣＹ５へ変換させる。こうして、ＣＹ５シグナルが検出されて、生体反応の進行を測定し、分子レベルの潜在的病原菌の検出を可能にするために、使用される。この手法は、図２乃至図４においてその概要が示される。
【００４０】
第二の好ましい実施形態はスキャナの形態をとり、それゆえに熱サイクルシステムを要しない。かかるスキャナは、多くの熱サイクラーで試験が同時に行われて、その後単一リーダーに移動されて、診断結果が迅速に決定され得るため、増加した核酸アッセイの処理能力を可能にする。この方法は、色のみによる分離に適しており、これにより、最小限１つであるが、単一槽内の１２通りまでの異なる標的に対する検出が容易になされ得る。
【００４１】
第三の実施形態は、テール配列をプライマー自体に組み入れることである。テール分子の存在により、かかる短いアンプリコン上で使用されるＴａｑｍａｎなどの配列特異的なプローブ化学手法が可能となるが、これは、かかる修飾がなされなければ物理的に不可能であったものである。
【００４２】
第四の実施形態は、増幅産物に染料停止剤を使用することだろう。プライマーがＣＹ５で標識され、重複配置されている場合には、生体反応を完成させ、かつ、蛍光シグナルを生成するために、単一塩基伸長のみが要求される。
【００４３】
図５から分かるように、３つの別々の光学「ピーク」が、サンプルからのリターンスペクトル内に存在していても、各々の「ピーク」が融合されて１つのスペクトルになる。このことは、「ピーク」間の「クロストーク」を生み出すが、これは、励起時に染料がいかに反応するかを把握し、個別のピーク形状ならびに１つの「ピーク」の存在が、いかにして同一「サンプル」内で染料を二次励起するかを把握するデコンボリューションソフトウェアによって解明され、再度分離されなければならない。１つの例として、染料１がレーザーによって励起される。これにより、蛍光シグナルが生成され、これがレーザー光源とともに染料２を励起して、レーザーのみが励起を行う場合の染料２とは異なる光シグナルを生成する。
【００４４】
好ましい実施形態は、まず、マルチプレックスな検出が可能なリアルタイムＰＣＲ反応を行い、その後、増幅した分子を電気泳動法によってサイズごとに分離して、識別され得る分子数をさらに増加させる。
【００４５】
図７及び図８は、熱サイクルチャンバと、アガロース、ポリアクリルアミド、または当業者に公知のその他の任意の分画用の物質を含有し、電気泳動分離が起きるのに適切な追加的チャネルとを含む、使い捨ての反応槽を示す。かかる槽は、熱サイクル反応にて処理され、これにより、適正な分析物の存在下で、意図されたＰＣＲ産物を生成し、こうしてシステムによって検出される蛍光シグナルを生成する。反応の完成に続いて、マイクロフルイディクスシステムが、サンプルの一部分を同一場所に配置された分離用の媒体へと移動させ、電気泳動処理によってサイズ毎に整理される。
【００４６】
好ましい実施形態は、各々のバリエーションを異なる染料で標識することにより、一塩基多型（ＳＮＰ）の分離を可能にする。このようにして、ＳＮＰは、光検出器を通過するのに要する時間または、実際には、発光波長によって検出され得る。電気泳動用媒体における電極電圧は、サンプルの「捕獲」が行われている（つまり、蛍光は検出されない）間に高電圧が印加され、その後電圧が低下されて検出の分解能を高め、サイズ毎のＳＮＰ分析が、アンプリコンが壊れると予測される範囲内で行われ、正確性と分解能を維持しつつ、検出時間を減少させるように調整され得る。
【００４７】
図３は、４つの個々の多型を検出する４色を示す。それぞれ赤色と青色で標識されたＳＮＰは、従来のサイズ分離技術によっては正確に分離されていないことがみてとれる。増幅プライマーに結合した染料により、これらの移動する種の分離がはるかに簡便になる。かかる因子は、提案されているシステムが、サイズと発光波長の両方で分離するため、分析され得る産物の分量を増加させている。
【００４８】
サイズを分割されたサンプルは、こうして上記のスペクトル分析器によってスペクトル評価を受ける。このシステムによって、単一アッセイ内で最低２つであるが、実際にはゆうに２０を超える病原体が検出され得る。
【００４９】
図７に示すように、反応槽（１）は、ＰＣＲが起きる反応部分を有する。要求される加熱と冷却が、熱源／シンク６に付随し、逆転電圧極性を受けるペルチェ効果モジュール（４）によって達成される。熱エネルギーが熱伝導性の反応槽ホルダー（３）を通過して反応槽へと移動する。この反応チャンバの下には、電気泳動ゲルを含有するキャピラリー１１がある。キャピラリーの上には、標識されたＤＮＡが、前記ゲルを横切って選択された電極へ向かうことを容易にするために、バイアス電圧が電気接点（５）を介して供給され得る一対の電気接点（２）が示されている。
【００５０】
レーザー励起（７）は、標識された核酸がレーザー（単数・複数）の前を通過するときに、蛍光サイン（８）を生成する電気泳動ゲルを通過する。
【００５１】
この蛍光サイン（８）は、検出器（１０）を横切るスペクトルを生成する回折格子（９）上に向かう。
【００５２】
キャピラリーは、この高圧が創出した生成熱のために通常であれば可能な電圧よりも高い電圧で電気泳動を可能にする、一定温度４０乃至６０℃台に維持された除去モジュール（ＨＲＭ）熱源／シンク６を通過する。
【００５３】
これらのアッセイを完成するために、これらの短い核酸標的の増幅及び検出に適した化学手法が要求される。想定される本発明の第一の実施形態は、５´末端が蛍光染料で標識された配列特異的なプライマーであり、前記染料は、好ましくはＣＹ５などのより長い波長の染料であるが、これらに限定されず、当業者に公知の全ての染料を含む。プローブシステムは、それが意図する標的と結合し、所望の配列の増幅のプライミングのために利用可能となる。標識されたプライマーは、ＳＹＴＯ９及びＥＶＡ ＧＲＥＥＮなどの他の適切な染料が当業者に公知であるが、好ましい実施形態はＳＹＢＲである、インターカレートする染料を含有する反応混合物内で増幅される。重要なことは、この染料は、プライマー分子の５´末端にタグ付けされた染料よりも短い波長でなければならないことである。好ましい実施形態では青色のレーザー光線である光源によって照らされると、ＳＹＢＲ染料が蛍光を発し、レーザーそのものはＣＹ５染料を励起できないものの、ＦＲＥＴ原理によってその光エネルギーをＣＹ５へ変換させる。こうしてＣＹ５シグナルが検出されて、生体反応の進行を測定し、分子レベルで潜在的病原菌の検出を可能にするために、使用される。この手法は、図４においてその概要が示される。
【００５４】
想定される各プローブシステムは、例えばＬＮＡ分子または当業者に公知の任意の修飾塩基などの修飾塩基の使用における近年の技術進歩を活用し得る。かかる分子の有利な点は、上記のプローブシステムを使用して、長さが２０塩基という短い増幅プライマーが検出可能なことである。
【００５５】
本発明のその他の想定される実施形態は、順方向プライマーと逆方向プライマーとに別々に配置される２つの蛍光染料の配置に依存する。適正な増幅産物においてのみ、これらの蛍光分子同士が空間的に十分に接近してＦＲＥＴが起こり、これによって図４ｂに示すようにシグナルを生成する。
【００５６】
第三の好ましい実施形態は、テール配列をプライマー自体に組み入れることである。テール分子の存在により、かかる短いアンプリコン上で使用されるＴａｑｍａｎなどの配列特異的なプローブ化学手法が可能となる。これは、かかる修飾がなされなければ物理的に不可能であったものである。これは、図４ｃにおいて強調されている。この手法は、従来はヘアピン構造の生成のための相補的配列を提供するため、またはＡｎｇｌｅｒの化学手法など、セルフプローブのアンプリコン配列において、続いて使用される結合領域を提供するために利用されていた。短いアンプリコンにおけるプローブハイブリダイゼーション用の標的を提供するために５´配列テールを使用することは、そうでなければ適切な標的候補が選択できないため、この点において新規である。
【００５７】
最後の考えられる実施形態は、増幅産物に染料停止剤を使用することである。図４ｄにおいて示すように、生体反応を完成させ、かつ、蛍光シグナルを生成する両目的のために、単一塩基伸長のみが要求されるように、プライマーがＣＹ５で標識され、重複配置にて構成される。
【００５８】
上記のキットは特許請求の範囲に記載され、本明細書に示された全処理工程を実施し得るが、最高で４つまたは５つ程度の異なる核酸が存在する検出処理であって、処理過程中、化学段階を全て省略した処理も実施し得る旨、認識されるだろう。
【００５９】
図８は、本発明のさらなる実施形態を示す。かかる実施形態において、現存のリアルタイムＰＣＲが調整され、完成された増幅プライマーが後続のサイズ分離において回収され得るようにする。反応槽は、貫通可能な蓋が備えられ、リアルタイムＰＣＲ増幅処理完了後、蛍光標識された産物がサイズ毎に分離される。この装置は、槽の蓋を貫通可能で、かつ、蛍光標識された産物をサイズ毎に分離するために電気泳動法へ適用すべく調整されたキャピラリーシステムへ増幅プライマーを移動させ得るフルイディクスシステムを組み込んでいる。
１ 増幅産物を含む反応槽
２ 液体移動キャピラリーチューブ
３ 液体を移動させるための真空ポンプ
４ 電気泳動キャピラリー
５ 光検出器
【００６０】
例えば各々が同一のサンプルのいくつかを含む、例えば９６ウェルのアレイであって、全アレイをＰＣＲ処理することを採用したとしても、本発明では、単一のウェルの使用が可能であり、これによってその構成要素たる核酸を成功裏に分析するために要求されるサンプルのサイズならびにかかる処理に要求されるキットのサイズを大幅に小さくする点が、認識されるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物の期待される性質により、１つまたは複数のプライマーを選択し、各プライマーを異なる染料で標識して、これを反応槽内に配置することと；前記反応槽内で分析対象のサンプルを配置することと；前記サンプルに増幅処理を行うことと；以後増幅プライマーと呼ぶ前記増幅されたサンプルの構成要素をそのサイズによって分離することと；現存の前記サイズを定量し、各々のサイズの色を測定することと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することと；を含む、サンプルにおける複数の分析物を検出する方法。
【請求項２】
前記増幅処理が、単一反応槽内で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離が、電圧をかけることによって達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離手段が、電気泳動法を採用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、アガロースまたはポリアクリルアミドを含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅されたサンプルを前記反応槽から光検出装置へ移動させることを含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記移動が、マイクロフルイディクスシステムによって達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記光検出装置が、キャピラリーチューブを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応槽が、マイクロタイターウェルである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅処理が、ＰＣＲを含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲ処理の概要が、国際公開公報ＷＯ／２００８／１０７６８３号明細書に記載されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
現存のサイズを定量し、各々のサイズの色を決定することが、１つまたは複数の照明光源を有するマルチプレックスな光検出システムを含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記照明光源が、ダイオード励起の固体レーザーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光システムが、最低限で６ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を採用する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光システムが、１ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を採用する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析対象の波長が、５００乃至７００ｎｍである、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析対象の波長が、３００乃至１０００ｎｍである、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することが、期待される波長バンド内の光の存在または不存在に基づいて、デコンボリューションソフトウェアの適用を含む、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーを標識することが、蛍光染料で短いオリゴヌクレオチドプライマー配列を標識することを含む、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記染料が、フルオレセイン、ＴＥＴ、ＨＥＸの１つまたは複数を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応槽と；前記反応槽内のサンプルに増幅処理を行うための手段と；サイズによって増幅プライマー構成要素を分離する動作可能な分離ステージと；現存のサイズを定量し、各々のサイズの色を決定するための光検出手段と；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定するための手段と；を含む、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置。
【請求項２２】
前記反応槽が、マイクロタイターウェルである、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記サンプル増幅手段が、ＰＣＲ装置を含む、請求項２１または２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記増幅プライマーを分離電圧で処理するための手段が、電気泳動装置を含む、請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
前記光検出手段が、スペクトル検出器を含む、請求項２１乃至２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記分離ステージが、前記増幅プライマーに電圧をかけるための手段を含む、請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
携帯用の、把持可能なキットを含む、請求項２１乃至２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
電気泳動法を採用して核酸増幅処理において増幅プライマーを分離する方法。
【請求項２９】
実質的に上述された、請求項１乃至２０及び請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
実質的に上述された、請求項２１乃至２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１】
分析物の期待される性質により、１つまたは複数のプライマーを選択し、各プライマーを異なる染料で標識して、これを反応槽内に配置することと；前記反応槽内で分析対象のサンプルを配置することと；前記サンプルに増幅処理を行うことと；以後増幅プライマーと呼ぶ前記増幅されたサンプルの構成要素をそのサイズによって分離することと；現存の前記サイズを定量し、各々のサイズの色を測定することと；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することと；を含む、サンプルにおける複数の分析物を検出する方法。
【請求項２】
前記増幅処理が、単一反応槽内で達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離が、電圧をかけることによって達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離手段が、電気泳動法を採用する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、アガロースまたはポリアクリルアミドを含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅されたサンプルを前記反応槽から光検出装置へ移動させることを含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記移動が、マイクロフルイディクスシステムによって達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記光検出装置が、キャピラリーチューブを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応槽が、マイクロタイターウェルである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅処理が、ＰＣＲを含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲ処理の概要が、国際公開公報ＷＯ／２００８／１０７６８３号明細書に記載されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
現存のサイズを定量し、各々のサイズの色を決定することが、１つまたは複数の照明光源を有するマルチプレックスな光検出システムを含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記照明光源が、ダイオード励起の固体レーザーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記光システムが、最低限で６ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を採用する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光システムが、１ｎｍの解像度を有するスペクトル検出器を採用する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析対象の波長が、５００乃至７００ｎｍである、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析対象の波長が、３００乃至１０００ｎｍである、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定することが、期待される波長バンド内の光の存在または不存在に基づいて、デコンボリューションソフトウェアの適用を含む、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマーを標識することが、蛍光染料で短いオリゴヌクレオチドプライマー配列を標識することを含む、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記染料が、フルオレセイン、ＴＥＴ、ＨＥＸの１つまたは複数を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応槽と；前記反応槽内のサンプルに増幅処理を行うための手段と；サイズによって増幅プライマー構成要素を分離する動作可能な分離ステージと；現存のサイズを定量し、各々のサイズの色を決定するための光検出手段と；定量の結果及び色の結果を既知のデータと比較して、現存の標的増幅プライマーの、またはその各々の、またはその一部の、またはその一部の各々の性質を決定するための手段と；を含む、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置。
【請求項２２】
前記反応槽が、マイクロタイターウェルである、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記サンプル増幅手段が、ＰＣＲ装置を含む、請求項２１または２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記増幅プライマーを分離電圧で処理するための手段が、電気泳動装置を含む、請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
前記光検出手段が、スペクトル検出器を含む、請求項２１乃至２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記分離ステージが、前記増幅プライマーに電圧をかけるための手段を含む、請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
携帯用の、把持可能なキットを含む、請求項２１乃至２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
電気泳動法を採用して核酸増幅処理において増幅プライマーを分離する方法。
【請求項２９】
実質的に上述された、請求項１乃至２０及び請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
実質的に上述された、請求項２１乃至２７のいずれか一項に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５３０２４３（Ｐ２０１２−５３０２４３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４５３４（Ｐ２０１２−５１４５３４）
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６３３９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１１３０２２２０）ビージー リサーチ エルティーディー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＧ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１１５６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６３３９
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５１１３０２２２０）ビージー リサーチ エルティーディー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＧ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】
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