核酸検出装置
【課題】TRC操作をさらに簡易化でき、かつ、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、検査結果の信頼性、安全性及び作業効率を向上させる核酸検出装置を提供する。
【解決手段】前後に水平移動可能な引き出し台車１１に、酵素試薬の分注のためのチップ４を載置したチップラック４ａと、蓋３を載置した蓋ラック３ａと、サンプル液と、試薬ミックスとを含む反応容器１を載置した反応容器ラック１ａと、酵素試薬を含有する容器２を載置した酵素試薬容器ラック２ａと、使用済みのチップ４のチップ廃棄部５とが隣接して配置され、さらにその後部に隣接して、反応容器１のインキュベーター６が配置され、その下方に、反応容器１内の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置され、これらの各容器ラック、チップ廃棄部５及びインキュベーター６の上方を水平移動可能に配設された移送装置１０上に酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９とが設置されている。
【解決手段】前後に水平移動可能な引き出し台車１１に、酵素試薬の分注のためのチップ４を載置したチップラック４ａと、蓋３を載置した蓋ラック３ａと、サンプル液と、試薬ミックスとを含む反応容器１を載置した反応容器ラック１ａと、酵素試薬を含有する容器２を載置した酵素試薬容器ラック２ａと、使用済みのチップ４のチップ廃棄部５とが隣接して配置され、さらにその後部に隣接して、反応容器１のインキュベーター６が配置され、その下方に、反応容器１内の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置され、これらの各容器ラック、チップ廃棄部５及びインキュベーター６の上方を水平移動可能に配設された移送装置１０上に酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９とが設置されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出を行う核酸検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の迅速検査法としてPCR法が普及している。標的核酸の増幅反応や増幅産物の検出という多段階に渡る操作の煩雑性は自動化によって克服されているものの、臨床検査の現場では、当日報告ができないなど、結果を得るまでの所要時間に不満も多い。リアルタイムPCRの臨床機器も登場し、今後普及していくと予想されるが、原理的に温度サイクルという物理量の変化を伴うPCR法では迅速化に自ずと限界がある。遺伝子検査の迅速化のため、一定温度の核酸増幅法が有利であるとの認識からTRC（Transcription Reverse-transcription Concerted reaction）法が開発された(特許文献１参照)。
【０００３】
TRC法は、TRC反応とINAFプローブ（Intercalation Activating Fluorescence probe）を組合せたRNA増幅のリアルタイム検出法である。TRC反応では、一定温度下で逆転写酵素とRNAポリメラーゼが協奏的に作用して逆転写反応と転写反応のサイクルを形成し、指数関数的なRNAの複写増幅が速やかに達成される。INAFプローブは増幅RNAと特異的に相補結合したときに蛍光増感を示すことから、TRC反応の初期段階から共存させておけば、RNAの複写増幅をリアルタイムにモニターすることが可能となる。
【０００４】
TRC法は、標的RNAの「トリミング」、「増幅サイクル」、「測定」の3つの工程から構成される。すべての反応工程は、一定温度下（例えば、４３℃）、１本の密閉容器内で連続的かつ同時並行で進行する。以下、各工程について詳述する。
【０００５】
(1) トリミング
標的RNAの特定位置にDNAオリゴマー（シザープローブ）が結合する。逆転写酵素のRNaseH活性によってDNA-RNAハイブリッド部位のRNAを消化し、これにより標的RNAは増幅領域の5'末端でトリミングされる。
【０００６】
(2) 増幅サイクル
5'末端がトリミングされたRNAは、逆転写反応と転写反応が協奏的に進む増幅工程に入る。まず、アンチセンス・プライマーを起点としたDNA相補鎖の伸長とRNaseH活性による標的RNAの消化により、cDNAが合成される（逆転写反応）。このとき、cDNAの3'末端は前工程でトリミングされた標的RNAの5'末端に一致することになる。このcDNAの3'末端にプロモーター・プライマーが結合し、両鎖の伸長反応によって二本鎖DNAが合成される。この二本鎖DNAはリーディング鎖の5'末端にT7プロモーター配列を持つことから、T7 RNA ポリメラーゼの作用により標的と相同的なRNAが次々と転写合成されていく（転写反応）。
合成されたRNAの各々は、新たなcDNA合成およびそれに続く二本鎖DNA合成の鋳型となることから、増幅サイクルが形成され、RNAの指数関数的な増幅が進行していく。
【０００７】
(3) 検出
増幅されたRNAの一部はINAFプローブと特異的に結合する。INAFプローブは、インターカレーター性蛍光色素がリンカーを介してオリゴヌクレオチド鎖リン酸ジエステルのリン原子に結合した構造をとる。水溶液中でフリーのINAFプローブは水分子の衝突により蛍光が消光された状態にある。標的核酸と結合すると、蛍光色素が二本鎖内にインターカレーションして衝突消光を逃れ、本来の蛍光特性が発揮されるようになり、蛍光強度が増加する。したがって、TRC反応を通して経時的に蛍光計測することでインターカレーションした蛍光色素の量を通じてRNA増幅量をリアルタイムに追跡できる。さらに、インターカレーターの種類を変えることによって異なる蛍光波長での同時測定が可能であり、内部標準および複数項目の同時測定への適用が可能となる。
以上のように、TRC法は、RNA増幅・検出を一定温度・一段階で、かつ一本の密閉容器内で実現する新しい遺伝子検査法である。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献１】保川清、医学の歩み、206(8),479-483,2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
TRC 法の操作は、基質試薬とプライマー試薬を等量混合した試薬ミックスに抽出RNAを添加してからプレインキュベーションし（トリミング工程（１））、その反応系に酵素試薬を添加し、所定温度・所定時間インキュベーションし（増幅工程（２））、その後蛍光強度の増大を測定する（検出工程（３））、ことで結果を得ることができる。現在、このTRC 法の操作の簡易化を図るため、前記試薬ミックスに抽出RNAを添加し、プレインキュベーションしてから酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでをマニュアル操作で行い、インキュベーターでのインキュベーション及び蛍光検出工程は自動化されている（例えば非特許文献１参照）。
【００１０】
しかしながら、現状の工程では、酵素試薬の添加、反応容器の密閉、インキュベーターへのセットについては依然マニュアル操作で行っているため、作業の確実性や作業能率に問題が残っていた。また、検出装置上で反応容器にサンプル液やTRC試薬ミックスの注入等の準備作業を行うことにより、検体や試薬が検出装置に飛び散ることによる汚染の危険があった。
【００１１】
また、蛍光検出後の反応容器について、測定し終えた反応容器がインキュベーター内に残っているため、未測定の反応容器との区別に注意を必要としていた。
【００１２】
本発明は、これら問題点を解決し、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加しインキュベーターにセットするまでの操作を自動化することで、TRC操作をさらに簡易化することができ、かつ、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性及び作業効率の向上を図ることができ、検査結果の信頼性を高めることができる核酸検出装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するために、請求項１の発明は、酵素試薬の分注のためのディスポーザブルピペットチップ（以下、単に「チップ」と記す。）を複数個載置したチップラックと、前記酵素試薬を含有する容器を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラックと、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器を複数個載置した反応容器ラックと、前記チップを用い、前記酵素試薬を含有する容器の酵素試薬を所定量吸引し、対応する前記反応容器に当該酵素試薬を吐出し、その後当該使用済みのチップを廃棄するための酵素試薬分注機構と、前記使用済みのチップを受容するためのチップ廃棄部と、前記反応容器の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋を複数個載置した蓋ラックと、前記反応容器を収容し、前記反応容器を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター部と、前記反応容器を前記蓋により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器ごと前記インキュベーター部にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構と、前記反応容器内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部と、を備えたことを特徴とする。これにより、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでの操作が自動化され、TRC操作がさらに簡易化される。
【００１４】
請求項２の発明は、前記チップラック、前記酵素試薬容器ラック、前記反応容器ラック、前記チップ廃棄部及び前記蓋ラックは、同一の引き出し台車に設置されており、該引き出し台車は、前記酵素試薬分注機構及び前記反応容器蓋閉め・移動機構の可動範囲の内側から外側まで移動可能であることを特徴とする。これにより、反応容器や酵素溶液容器のセッティングを検出器とは離れた箇所で行うことができ、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性の向上が図れ、反応容器、酵素溶液容器、チップ、蓋を近い場所にまとめることで作業効率の向上を図ることができる。
【００１５】
請求項３の発明は、前記酵素試薬分注機構が前記酵素試薬を吸引し、試薬ミックス及びサンプル液を含む反応容器に吐出した後、その混合物の吸引、吐出操作が反復可能であることを特徴とする。これにより、ボルテックス操作が不要になる。
【００１６】
請求項４の発明は、前記蓋が上部に凹部を有し、前記反応容器蓋閉め・移動機構が、前記蓋の上部の凹部に嵌合する先端部を有するロッド部と、つめ部を有する２本以上の開閉式ハンドとを含む蓋保持手段を備え、前記ロッド部を前記蓋の前記凹部に差込み、かつ開閉式ハンドを閉状態にすることでつめ部が前記蓋の側部を把持し、該蓋を前記反応容器の上面開口部に嵌挿嵌合し、前記反応容器を前記蓋とともに移動させることを特徴とする。これにより、前記反応容器の確実な蓋閉めと、反応容器の移動を簡易な装置にて可能とする。
【００１７】
請求項５の発明は、前記反応容器は、前記インキュベーター部で蛍光測定された後、前記反応容器蓋閉め・移動機構により、反応容器ラック部の元の設置位置に戻されることを特徴とする。これにより、測定し終えたものが一目でわかり、装置の作動に異常があった場合や、試薬の分注不良、分注のし忘れが一目でわかり、検査結果の信頼性を高めることができる。
【発明の効果】
【００１８】
以上説明したように、本発明の核酸検出装置では、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加しインキュベーターにセットするまでの操作を自動化することで、TRC法の操作をさらに簡易化することができる。
さらに、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性及び作業効率の向上を図ることができ、検査結果の信頼性を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の核酸検出装置の一実施形態について図に基づいて説明する。
図１は、本実施形態の組立斜視図であり、図２は概略組立図である。
前後に水平移動可能な引き出し台車１１に、酵素試薬の分注のためのチップ４を複数個載置したチップラック４ａと、反応容器１の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋３を複数個載置した蓋ラック３ａと、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する容器を複数個載置した反応容器ラック１ａと、酵素試薬を含有する容器２を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラック２ａと、使用済みのチップ４を受容するためのチップ廃棄部５と、が図１、２に示すように隣接して配置されている。
【００２０】
さらに、この引き出し台車１１の前後ストロークの後端側に隣接して、反応容器１を収容し、反応容器１を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター６が配置され、その下方に接して、反応容器１内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置されている。
【００２１】
これらの各容器ラック、チップ廃棄部５及びインキュベーター６の上方をＸ軸及びＹ軸方向に水平移動可能に配設された移送装置１０上に、チップ４を用い、酵素試薬容器２ａの酵素試薬を所定量吸引し、対応する反応容器１の上方に移動し、酵素試薬を反応容器１に吐出し、その後使用済みのチップ４を廃棄するための酵素試薬分注機構８と、反応容器１を蓋３により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器１ごと前記インキュベーター６にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構（以下、「蓋キャッチ機構」と記す。）９と、が設置されている。
【００２２】
コントローラ部にはパソコン、プリンターが備えられている。
【００２３】
次に、個々の装置の構成について説明する。
図１、図２及び図４に示すように、引き出し台車１１に搭載されたチップラック４ａは、酵素試薬の分注のためのチップ４を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦８列、横１２列に並んでおり最大９６本のチップ４を載置することが可能である。チップ４は細い円錐の外形であって、円錐の頂点から底面まで貫通孔が設けられた樹脂製の管であって、チップラック４ａの各ホルダ穴に先端（頂点側）を下にしてセットされる。
【００２４】
チップラック４ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載された蓋ラック３ａは、反応容器１の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋３を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦１２列、横８列に並んでおり最大９６本の蓋３を載置することが可能である。蓋３は横断面が円形で、縦断面が図６（ａ）に示すように上部に凹部及びフランジ部を有するゴム製キャップであり、蓋ラック３ａの各ホルダ穴に凹部を上にして、フランジ部を利用して垂直にセットされる。
【００２５】
同じく蓋ラック３ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載された反応容器ラック１ａは、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器１を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦８列、横６列に並んでおり最大４８本の反応容器１を載置することが可能である。反応容器１は略円錐の外形の底面に開口部を有する樹脂製容器であって、反応容器ラック１ａの各ホルダ穴に開口部を上にしてセットされる。
【００２６】
同じく反応容器ラック１ａの手前側に隣接して引き出し台車１１に搭載された酵素試薬容器ラック２ａは、酵素試薬を含有する容器を載置するためのラックであって、ホルダ穴が３個横１列に並んでおり最大３本の酵素試薬容器２を載置することが可能である。酵素試薬容器２は略円筒の外形の底面に開口部を有する樹脂製容器であって、開口部を上にして酵素試薬容器ラック２ａの各ホルダ穴に開口部を上にしてセットされる。
【００２７】
同じく反応容器ラック１ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載されたチップ廃棄部５は、反応容器１に酵素試薬容器２から酵素試薬を分注した後のチップ４を廃棄するための容器用スペースである。このように、廃棄ボックスを反応容器１の近くに配置することで、チップ４の液だれなどによる装置汚染及び環境汚染を最小限にできる。
【００２８】
次に、引き出し台車１１に隣接して奥側の固定部に設けられた検出部の構成について説明する。検出部は上部のインキュベーター６とその下部に設けられた蛍光検出部７からなる。
インキュベーター６は反応容器１を収容し、反応容器１を所定時間、所定温度に保つ恒温器である。１列あたり２４個のホルダ穴が横２列に配置され、最大４８個の反応容器１の収容が可能である。ホルダ穴の上部には、後述する蛍光による検出時にホルダ穴内をほぼ暗室とするべくシャッター６ｂが設置されている。
【００２９】
このインキュベーター６の下方に接して、反応容器１内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置されている。蛍光検出部７では、４３℃で恒温状態とした反応容器１内に増幅された核酸について、シャッター６ｂを閉じてほぼ暗室として蛍光による検出を行う。λ＝４７０ｎｍのLED７Ｂ１台と２台のPD７Ｅを搭載した蛍光検出器が左右方向に設置したレール上を走査可能であり、さらに図示しないシフト装置により該レール自体が前後２箇所に水平移動可能に設けられており、前後２列４８本の反応容器１の蛍光検出が可能となっている。
【００３０】
次に、引き出し台車１１上の各ラック及びチップ廃棄部５と、この後方に設置されたインキュベーター６の上方に移動可能に設けられた酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９について説明する。
両者は共に図１、図２（ａ）に示す移送装置１０に組みつけられており、前記範囲を移動可能となっている。移送装置１０はラックピニオン式でＸ−Ｙ方向に取付け台を水平移動可能としたものであり、取付け台に取り付けられた酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９とは各々Ｚ軸方向に垂直移動する機構を備えている。
【００３１】
酵素試薬分注機構８は、図９に示すように、昇降機構と、前記チップ４を先端に装着するためのノズル８ａと、酵素試薬容器２の酵素試薬を所定量吸引し、対応の反応容器１の上方に移動して該酵素試薬を吐出、混合するためのポンプ８ｂおよび圧力センサ８ｄを備えている。
【００３２】
蓋キャッチ機構９は、図６に示すように、昇降機構と、蓋３を蓋ラック３ａから取り上げる際、及び反応容器１に蓋３を取り付ける際、蓋３の上部の凹部３ｂに嵌合するロッド９ａと、蓋３の保持と蓋閉めした反応容器１の保持を行うつめ部付き開閉式ハンド９ｂと、からなる蓋３保持手段とを備えている。
【００３３】
以下に前記構成による核酸検出装置の検査方法について説明する。
まず、検査の概略の流れについて図２、３、４で説明する。
図３は検査手順を示す図であり、右下の太線で囲まれた部分が前記構成において自動化された部分である。まず、引き出し台車１１を図４に示すように、手前の前進限まで引き出してロックする。これにより、引き出し台車１１は、移送装置１０のＹ軸移送用レール架台の可動範囲から完全に外れるように設定されており、万一、移送装置１０が誤作動により引き出し台車１１の元位置に接近しても、移送装置１０と作業者及び検査用器具等との干渉が避けられるため、作業の安全性を確保することができるように構成される。
【００３４】
次に引き出し台車１１上の反応容器ラック１ａにセットされた反応容器１に、TRC試薬調製により得られたTRC試薬ミックス２０μｌと、検体を前処理及び核酸抽出処理して得られたサンプル液５μｌとを手動にて分注する。反応容器ラック１ａには最大４８本の反応容器１をセットすることができる。なお、前記サンプル液を得るための前処理及び核酸抽出処理は、汚染のリスクを避けるために別のエリアで行う。
【００３５】
そして、TRC酵素試薬を分注した酵素試薬容器２を酵素試薬容器ラック２ａにセットする。この酵素試薬容器２は最大３本までセット可能であり、一度に最大３種類のTRC酵素試薬による３項目の核酸検出が可能である。
【００３６】
さらに、チップラック４ａ及び蓋ラック３ａにチップ４及び蓋３をセットする。チップラック４ａには最大９６本のチップ４が、蓋ラック３ａには最大９６個の蓋３がセット可能である。実際の核酸検出試験においては、検出すべき反応容器１の数に、取り付け不良分を見込んだ予備分の数を加えた数以上のチップ４及び蓋３をセットする必要がある。
【００３７】
このように準備した後、引き出し台車１１を後退限まで戻し、核酸検出装置の自動検出モードのスタートスイッチを押す。これにより、図３の太線部分の操作が自動にて行われる。以下この自動操作について説明する。
【００３８】
まず、酵素試薬分注・混合操作が、移送台車及びこれに搭載された酵素試薬分注機構８により行われる（図５参照）。
酵素試薬分注操作は、まず、酵素試薬分注機構８のノズル８ａ先端にチップラック４ａ上にセットされたチップ４を取り付け、次に酵素試薬分注機構８のポンプ８ｂにて酵素試薬液を５μｌ吸引し、次にこの酵素試薬液を反応容器１に吐出することにより行われる。
混合操作は、前記操作の後、前記ノズル８ａをこの混合液中に差し込んだまま、混合液を１０μｌ吸引し、これを吐出する操作を繰り返すことにより行われる。
【００３９】
次に、反応容器密閉操作が、移送台車及びこれに搭載された前記蓋キャッチ機構９により行われる（図６参照）。
反応容器密閉操作は、まず、蓋キャッチ機構９が蓋ラック３ａ上の蓋３を取り上げ、次にこの蓋３を反応容器１の上部開口部に取り付けることにより行われる。
【００４０】
次に、インキュベーター６への移送操作が移送台車及びこれに搭載された前記蓋キャッチ機構９により行われる（図６参照）。
前記移送操作は、反応容器密閉操作の後、蓋キャッチ機構９が蓋３部を保持したまま反応容器１ごと上昇し、反応容器１をインキュベーター６へ搬送して装着することにより行われる。
【００４１】
次に、容器遮光操作が、インキュベーター６の各ホルダ穴上部を覆うシャッター６ｂにより行われる（図１２参照）。
容器遮光操作は、反応容器１がインキュベーター６に装着された後、直ちにシャッター６ｂを閉じることにより行う。シャッター６ｂは通常時は閉じていてインキュベーター６内は４３℃にて保たれており、新たな反応容器１をインキュベーター６に装着する時と、検出後の反応容器１を反応容器ラック１ａに搬送するときのみ開くように管理され、シャッター６ｂが閉じた状態のときに誤って反応容器１がインキュベーター６に搬入されることを防止する。
【００４２】
次に、増幅・蛍光検出操作がインキュベーター６及び蛍光検出部７により行われる（図７参照）。
増幅操作は、反応容器１がインキュベーター６内に装着された後、４３℃に保たれることで反応容器１内の核酸が増幅することにより行われる。
蛍光検出操作は、インキュベーター６の下部に接して設けられた蛍光検出部７により行われる。所定時間４３℃に保たれた反応容器１について、シャッター６ｂが閉まった条件下で、下方から励起光を当て、そこから発する蛍光を分析することにより行う。この蛍光検出の結果がパソコンに表示され、プリンターにて出力される。
【００４３】
次に、反応容器ラック１ａへの移送（以下「戻し搬送」と記す。）操作が、蓋キャッチ機構９により行われる（図８参照）。
戻し搬送操作は、蛍光検出後、インキュベーター６のシャッター６ｂを開けて、蓋キャッチ機構９により反応容器１を反応容器ラック１ａへ搬送し、元の位置に装着することにより行われる。
【００４４】
以下に、本実施形態の特徴部分である各機構の作用についてについて詳しく説明する。
【００４５】
図５（ａ）〜（ｄ）に示すように、前記酵素試薬の分取・分注操作における酵素試薬分注機構８は、
（ａ）まず、チップラック４ａのチップ４上に移動し、ノズル８ａを下降させてノズル８ａ先端にチップ４を連結する。
（ｂ）次に、酵素試薬容器ラック２ａの酵素試薬容器２上に移動し、下降してチップ４先端を酵素試薬液に差し入れ、同液を５μｌポンプ８ｂにて吸引する。
（ｃ）次に、反応容器ラック１ａの反応容器１上に移動し、下降してチップ４先端をTRC試薬ミックスと検体のサンプル液との混合液に差し入れ、同液中に前記酵素試薬５μｌを吐出し、その後、この混合液を１０μｌ吸引し、再びこれを吐出する操作を繰り返して混合液を撹拌する。
（ｄ）次に、チップ廃棄部５上に移動し、空気圧によりチップ４をノズル８ａ先端から切り離して廃棄する。
【００４６】
また、図６（ａ）〜（ｄ）に示すように、前記反応容器蓋閉め・搬送操作における蓋キャッチ機構９は、
（ａ）まず、蓋ラック３ａの蓋３上に移動し、爪部を開いて下降し、ロッド９ａ先端を蓋３上面に設けられた穴に挿入した後、爪部を閉じて蓋３を抱えて上昇する。
（ｂ）次に、反応容器ラック１ａの反応容器１上に移動し、下降して蓋３を反応容器１開口部に押し込んで蓋閉めを行う。
（ｃ）次に、そのまま上昇し、密閉した反応容器１を抱えてインキュベーター６に搬送する。
（ｄ）次に、インキュベーター６のホルダ穴上に移動し、下降して反応容器１をホルダ穴の台座６ａに押し込み、爪部を開いて上昇する。
【００４７】
また、図７に示すように、検出操作における蛍光検出部７は、１列に２４個のホルダ穴を有し２列から成るインキュベーター６の各列に収容された反応容器１を下方より照射して、そこから発する蛍光により目標核酸の有無を検出するものである。LED７ｂ、干渉フィルター７ｃ、ダイクロイックミラー７ｄ、PD（光検出器）７ｅを搭載した１台の計測ブロック７ａが、ホルダ穴の列と平行に配置されたレール上を、図７の紙面に垂直方向に水平移動可能に設けられており、さらに、前記レールがホルダ穴の列に対応した２ポジションを図７の矢印方向に左右に水平移動可能に設けられている。
【００４８】
また、図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、戻し搬送操作における蓋キャッチ機構９は、
（ａ）まず、インキュベーター６のホルダ穴上に移動し、爪部を開いて反応容器１位置に下降する。
（ｂ）次に、ロッド９ａ先端を蓋３上面に設けられた穴に挿入した後、爪部を閉じて蓋３部で反応容器１を抱えて上昇する。
（ｃ）次に、反応容器ラック１ａの当該反応容器１がセットされていたホルダ穴上に移動し、下降して反応容器１を元のホルダ穴にセットし、爪部を開いて上昇する。
【００４９】
以上、本実施形態の核酸検出装置の作用について説明したが、個々の装置の機能についてさらに詳しく説明する。
【００５０】
図９にて、図５で説明した酵素試薬分注機構８のポンプ８ｂによる酵素試薬液面の検知方法について説明する。
まず、ポンプ８ｂ内のシリンダピストン８ｃを吐出方向に動作させながらポンプ８ｂを降下させる。この動作中、常に圧力センサ８ｄでシリンダ内の圧力を監視しておく。この状態ではチップ４先端から空気が吐出し、シリンダ内の圧力はほぼ一定に保たれる。そして、チップ４先端が酵素試薬の液面に触れると、シリンダ内が密閉されることでシリンダ内の圧力が上昇する。この一定圧力以上の変化を捉えることで液面位置を検知する。
【００５１】
図１０にて、蓋３、反応容器１及びチップ４の検知方法について説明する。
移送装置１０に設置された発信機１０ａ（？）から発信されたレーザー光が、図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すように蓋３、反応容器１及びチップ４により遮られ、受信機１０ｂに届く光量に変化が生じる。これを検知することで蓋３、反応容器１及びチップ４が確実に保持されていることを確認し、次の操作に移行することで、誤操作防止、作業能率向上を図ることができる。
【００５２】
図１１にて、蓋３、反応容器１、チップ４及び酵素試薬容器２の架設検知方法について説明する。架設検知とは、これらの備品が各々の収納用ラックに収納されているかどうかを検知するものである。具体的手法としては、図１１に示すように検知器１０ｃのレーザー光を各備品に当てて、その反射光により備品の有無の検知を行う。
【００５３】
この架設検知により、各備品がラック上に収納されていることを確認した後、酵素試薬分注機構８、蓋キャッチ機構９を下降させて前記各操作を行う。この架設検知により、備品のない状態での酵素試薬分注機構８、蓋キャッチ機構９の操作を防止することができ、誤操作防止、作業能率向上が図れる。
【００５４】
図１２にて、インキュベーター６のシャッター６ｂ機構について説明する。
前記蓋キャッチ機構９にてインキュベーター６上部に搬送された反応容器１は、蓋キャッチ機構９の降下によりホルダ穴の一つに装入、固定される。その後、シャッター６ｂが閉められ、インキュベーター６内部はほぼ暗室とされる。
【００５５】
シャッター６ｂは、電動モータ駆動のラックピニオン方式でスライド移動により開閉し、図１２に示すように、４８箇所のホルダ穴の開口部６ｃが同時に開閉される。シャッター６ｂは、通常閉じており、前記のように反応容器１がインキュベーター６上部に搬送されると開き、反応容器１がホルダ穴に収容されると再び閉じるという動作を繰り返す。その間、インキュベーター６内は常に４３℃に保たれている。インキュベーター６は熱伝導性を考慮し、アルミブロックにて構成されるのが好ましい。
【００５６】
インキュベーター６内に収納された反応容器１内では、４３℃に保たれることで内部のサンプル液に標的となる核酸が存在していた場合は、その核酸が増幅され、図７に示すインキュベーター６下部の蛍光検出部７によって検出可能なレベルに達する。このような反応容器１については、シャッター６ｂにより遮光しほぼ暗室とした条件下で、下部から図７に示す経路で蛍光を測定することにより、標的となる核酸の存在を検出することができる。
【００５７】
具体的には図７において、LED７ｂからの波長λ＝４７０ｎｍの励起光が第一の干渉フィルター７ｃを通り、第一のダイクロイックミラー７ｄで反射されて反応容器１の底部からサンプル液体を励起し、第一のダイクロイックミラー７ｄを通過した蛍光の内、第二のダイクロイックミラー７ｄで反射して第二の干渉フィルター７ｃを通り第一のPD７ｅに入る蛍光と、第二のダイクロイックミラー７ｄをも通過して第三の干渉フィルター７ｃを通り第二のPD７ｅに入る蛍光とに分かれ、これら第一のPD７ｅと第二のPD７ｅの蛍光の強度比を比較演算することで標的の核酸を検出する。
【００５８】
以上説明したように、本発明の核酸検出装置では、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでの操作について、酵素試薬分注機構及び蓋キャッチ機構を設置することで、反応容器への酵素試薬の分注・混合、蓋の取り付けによる密閉、インキュベーターへの搬送を自動化し、さらに、検出後の反応容器ラックへの戻し搬送を自動化することで、TRC操作をさらに簡易化することができる。
【００５９】
また、引き出し台車上に各備品のラックを設置して、引き出した状態でサンプル液の注入等の準備作業を行うことにより、検体や試薬による検出装置の汚染が防げるとともに、例えば、反応容器や酵素溶液容器のセッティングの際に分注機構が作動して、作業者の手を巻き込んだりすることが避けられ、安全性の向上を図ることができ、さらに、反応容器、酵素溶液容器、チップ、蓋を近い場所にまとめることで作業効率の向上を図ることができる。
【００６０】
さらに、酵素試薬分注機構により酵素溶液を吸引し、試薬ミックス＋サンプル液を収容する反応容器に吐出し、その混合物を吸引し、吐出する操作を繰り返すことで反応溶液の混合が可能となり、ボルテックス操作が不要になる。
【００６１】
さらに、蓋キャッチ機構により、蓋の把持、反応容器の蓋閉め及び移動を確実に行うことで、作業効率の向上を図ることができる。
【００６２】
さらに、検出後の反応容器を蓋キャッチ機構により反応容器ラックの元の位置に戻すことにより、測定し終えた反応容器が一目でわかり、装置の作動異常や試薬の分注不良、分注のし忘れ等が早期に判明するため、これら不具合の拡大を防止することができ、検査結果の信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の核酸検出装置の一実施形態を示す組立斜視図である。
【図２】本発明の核酸検出装置の一実施形態を示す組立図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図３】本実施形態における検査の手順を示す図である。
【図４】本実施形態の引き出し台車の搭載物を示す図である。
【図５】本実施形態の酵素試薬の分取・分注操作の説明図である。
【図６】本実施形態の蓋閉め・搬送操作の説明図である。
【図７】本実施形態の蛍光検出部における検出操作の説明図である。
【図８】本実施形態の戻し搬送操作の説明図である。
【図９】本実施形態の酵素試薬分注機構の液面検知機構の説明図である。
【図１０】本実施形態の蓋、反応容器、チップの検知機構の説明図である。
【図１１】本実施形態の蓋、容器、チップの架設検知機構の説明図である。
【図１２】本実施形態のインキュベーターのシャッター機構の説明図である。
【符号の説明】
【００６４】
１ 反応容器
１ａ 反応容器ラック
２ 酵素試薬容器
２ａ 酵素試薬容器ラック
３ 蓋
３ａ 蓋ラック
３ｂ 凹部
４ チップ
４ａ チップラック
５ チップ廃棄部
６ インキュベーター
６ａ 台座
６ｂ シャッター
６ｃ 開口部
７ 蛍光検出部
７ａ 計測ブロック
７ｂ ＬＥＤ
７ｃ 干渉フィルター
７ｄ ダイクロイックミラー
７ｅ ＰＤ（光検出器）
８ 酵素試薬分注機構
８ａ ノズル
８ｂ ポンプ
８ｃ ピストン
８ｄ 圧力センサ
９ 蓋キャッチ機構
９ａ ロッド
９ｂ 開閉式ハンド
１０ 移送装置
１０ａ レーザー発信機
１０ｂ レーザー受信機
１０ｃ レーザー検知機
１１ 引き出し台車
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出を行う核酸検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症の迅速検査法としてPCR法が普及している。標的核酸の増幅反応や増幅産物の検出という多段階に渡る操作の煩雑性は自動化によって克服されているものの、臨床検査の現場では、当日報告ができないなど、結果を得るまでの所要時間に不満も多い。リアルタイムPCRの臨床機器も登場し、今後普及していくと予想されるが、原理的に温度サイクルという物理量の変化を伴うPCR法では迅速化に自ずと限界がある。遺伝子検査の迅速化のため、一定温度の核酸増幅法が有利であるとの認識からTRC（Transcription Reverse-transcription Concerted reaction）法が開発された(特許文献１参照)。
【０００３】
TRC法は、TRC反応とINAFプローブ（Intercalation Activating Fluorescence probe）を組合せたRNA増幅のリアルタイム検出法である。TRC反応では、一定温度下で逆転写酵素とRNAポリメラーゼが協奏的に作用して逆転写反応と転写反応のサイクルを形成し、指数関数的なRNAの複写増幅が速やかに達成される。INAFプローブは増幅RNAと特異的に相補結合したときに蛍光増感を示すことから、TRC反応の初期段階から共存させておけば、RNAの複写増幅をリアルタイムにモニターすることが可能となる。
【０００４】
TRC法は、標的RNAの「トリミング」、「増幅サイクル」、「測定」の3つの工程から構成される。すべての反応工程は、一定温度下（例えば、４３℃）、１本の密閉容器内で連続的かつ同時並行で進行する。以下、各工程について詳述する。
【０００５】
(1) トリミング
標的RNAの特定位置にDNAオリゴマー（シザープローブ）が結合する。逆転写酵素のRNaseH活性によってDNA-RNAハイブリッド部位のRNAを消化し、これにより標的RNAは増幅領域の5'末端でトリミングされる。
【０００６】
(2) 増幅サイクル
5'末端がトリミングされたRNAは、逆転写反応と転写反応が協奏的に進む増幅工程に入る。まず、アンチセンス・プライマーを起点としたDNA相補鎖の伸長とRNaseH活性による標的RNAの消化により、cDNAが合成される（逆転写反応）。このとき、cDNAの3'末端は前工程でトリミングされた標的RNAの5'末端に一致することになる。このcDNAの3'末端にプロモーター・プライマーが結合し、両鎖の伸長反応によって二本鎖DNAが合成される。この二本鎖DNAはリーディング鎖の5'末端にT7プロモーター配列を持つことから、T7 RNA ポリメラーゼの作用により標的と相同的なRNAが次々と転写合成されていく（転写反応）。
合成されたRNAの各々は、新たなcDNA合成およびそれに続く二本鎖DNA合成の鋳型となることから、増幅サイクルが形成され、RNAの指数関数的な増幅が進行していく。
【０００７】
(3) 検出
増幅されたRNAの一部はINAFプローブと特異的に結合する。INAFプローブは、インターカレーター性蛍光色素がリンカーを介してオリゴヌクレオチド鎖リン酸ジエステルのリン原子に結合した構造をとる。水溶液中でフリーのINAFプローブは水分子の衝突により蛍光が消光された状態にある。標的核酸と結合すると、蛍光色素が二本鎖内にインターカレーションして衝突消光を逃れ、本来の蛍光特性が発揮されるようになり、蛍光強度が増加する。したがって、TRC反応を通して経時的に蛍光計測することでインターカレーションした蛍光色素の量を通じてRNA増幅量をリアルタイムに追跡できる。さらに、インターカレーターの種類を変えることによって異なる蛍光波長での同時測定が可能であり、内部標準および複数項目の同時測定への適用が可能となる。
以上のように、TRC法は、RNA増幅・検出を一定温度・一段階で、かつ一本の密閉容器内で実現する新しい遺伝子検査法である。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献１】保川清、医学の歩み、206(8),479-483,2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
TRC 法の操作は、基質試薬とプライマー試薬を等量混合した試薬ミックスに抽出RNAを添加してからプレインキュベーションし（トリミング工程（１））、その反応系に酵素試薬を添加し、所定温度・所定時間インキュベーションし（増幅工程（２））、その後蛍光強度の増大を測定する（検出工程（３））、ことで結果を得ることができる。現在、このTRC 法の操作の簡易化を図るため、前記試薬ミックスに抽出RNAを添加し、プレインキュベーションしてから酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでをマニュアル操作で行い、インキュベーターでのインキュベーション及び蛍光検出工程は自動化されている（例えば非特許文献１参照）。
【００１０】
しかしながら、現状の工程では、酵素試薬の添加、反応容器の密閉、インキュベーターへのセットについては依然マニュアル操作で行っているため、作業の確実性や作業能率に問題が残っていた。また、検出装置上で反応容器にサンプル液やTRC試薬ミックスの注入等の準備作業を行うことにより、検体や試薬が検出装置に飛び散ることによる汚染の危険があった。
【００１１】
また、蛍光検出後の反応容器について、測定し終えた反応容器がインキュベーター内に残っているため、未測定の反応容器との区別に注意を必要としていた。
【００１２】
本発明は、これら問題点を解決し、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加しインキュベーターにセットするまでの操作を自動化することで、TRC操作をさらに簡易化することができ、かつ、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性及び作業効率の向上を図ることができ、検査結果の信頼性を高めることができる核酸検出装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するために、請求項１の発明は、酵素試薬の分注のためのディスポーザブルピペットチップ（以下、単に「チップ」と記す。）を複数個載置したチップラックと、前記酵素試薬を含有する容器を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラックと、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器を複数個載置した反応容器ラックと、前記チップを用い、前記酵素試薬を含有する容器の酵素試薬を所定量吸引し、対応する前記反応容器に当該酵素試薬を吐出し、その後当該使用済みのチップを廃棄するための酵素試薬分注機構と、前記使用済みのチップを受容するためのチップ廃棄部と、前記反応容器の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋を複数個載置した蓋ラックと、前記反応容器を収容し、前記反応容器を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター部と、前記反応容器を前記蓋により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器ごと前記インキュベーター部にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構と、前記反応容器内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部と、を備えたことを特徴とする。これにより、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでの操作が自動化され、TRC操作がさらに簡易化される。
【００１４】
請求項２の発明は、前記チップラック、前記酵素試薬容器ラック、前記反応容器ラック、前記チップ廃棄部及び前記蓋ラックは、同一の引き出し台車に設置されており、該引き出し台車は、前記酵素試薬分注機構及び前記反応容器蓋閉め・移動機構の可動範囲の内側から外側まで移動可能であることを特徴とする。これにより、反応容器や酵素溶液容器のセッティングを検出器とは離れた箇所で行うことができ、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性の向上が図れ、反応容器、酵素溶液容器、チップ、蓋を近い場所にまとめることで作業効率の向上を図ることができる。
【００１５】
請求項３の発明は、前記酵素試薬分注機構が前記酵素試薬を吸引し、試薬ミックス及びサンプル液を含む反応容器に吐出した後、その混合物の吸引、吐出操作が反復可能であることを特徴とする。これにより、ボルテックス操作が不要になる。
【００１６】
請求項４の発明は、前記蓋が上部に凹部を有し、前記反応容器蓋閉め・移動機構が、前記蓋の上部の凹部に嵌合する先端部を有するロッド部と、つめ部を有する２本以上の開閉式ハンドとを含む蓋保持手段を備え、前記ロッド部を前記蓋の前記凹部に差込み、かつ開閉式ハンドを閉状態にすることでつめ部が前記蓋の側部を把持し、該蓋を前記反応容器の上面開口部に嵌挿嵌合し、前記反応容器を前記蓋とともに移動させることを特徴とする。これにより、前記反応容器の確実な蓋閉めと、反応容器の移動を簡易な装置にて可能とする。
【００１７】
請求項５の発明は、前記反応容器は、前記インキュベーター部で蛍光測定された後、前記反応容器蓋閉め・移動機構により、反応容器ラック部の元の設置位置に戻されることを特徴とする。これにより、測定し終えたものが一目でわかり、装置の作動に異常があった場合や、試薬の分注不良、分注のし忘れが一目でわかり、検査結果の信頼性を高めることができる。
【発明の効果】
【００１８】
以上説明したように、本発明の核酸検出装置では、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加しインキュベーターにセットするまでの操作を自動化することで、TRC法の操作をさらに簡易化することができる。
さらに、検体や試薬による検出器の汚染が防げるとともに、安全性及び作業効率の向上を図ることができ、検査結果の信頼性を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の核酸検出装置の一実施形態について図に基づいて説明する。
図１は、本実施形態の組立斜視図であり、図２は概略組立図である。
前後に水平移動可能な引き出し台車１１に、酵素試薬の分注のためのチップ４を複数個載置したチップラック４ａと、反応容器１の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋３を複数個載置した蓋ラック３ａと、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する容器を複数個載置した反応容器ラック１ａと、酵素試薬を含有する容器２を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラック２ａと、使用済みのチップ４を受容するためのチップ廃棄部５と、が図１、２に示すように隣接して配置されている。
【００２０】
さらに、この引き出し台車１１の前後ストロークの後端側に隣接して、反応容器１を収容し、反応容器１を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター６が配置され、その下方に接して、反応容器１内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置されている。
【００２１】
これらの各容器ラック、チップ廃棄部５及びインキュベーター６の上方をＸ軸及びＹ軸方向に水平移動可能に配設された移送装置１０上に、チップ４を用い、酵素試薬容器２ａの酵素試薬を所定量吸引し、対応する反応容器１の上方に移動し、酵素試薬を反応容器１に吐出し、その後使用済みのチップ４を廃棄するための酵素試薬分注機構８と、反応容器１を蓋３により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器１ごと前記インキュベーター６にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構（以下、「蓋キャッチ機構」と記す。）９と、が設置されている。
【００２２】
コントローラ部にはパソコン、プリンターが備えられている。
【００２３】
次に、個々の装置の構成について説明する。
図１、図２及び図４に示すように、引き出し台車１１に搭載されたチップラック４ａは、酵素試薬の分注のためのチップ４を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦８列、横１２列に並んでおり最大９６本のチップ４を載置することが可能である。チップ４は細い円錐の外形であって、円錐の頂点から底面まで貫通孔が設けられた樹脂製の管であって、チップラック４ａの各ホルダ穴に先端（頂点側）を下にしてセットされる。
【００２４】
チップラック４ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載された蓋ラック３ａは、反応容器１の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋３を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦１２列、横８列に並んでおり最大９６本の蓋３を載置することが可能である。蓋３は横断面が円形で、縦断面が図６（ａ）に示すように上部に凹部及びフランジ部を有するゴム製キャップであり、蓋ラック３ａの各ホルダ穴に凹部を上にして、フランジ部を利用して垂直にセットされる。
【００２５】
同じく蓋ラック３ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載された反応容器ラック１ａは、標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器１を載置するためのラックであって、ホルダ穴が縦８列、横６列に並んでおり最大４８本の反応容器１を載置することが可能である。反応容器１は略円錐の外形の底面に開口部を有する樹脂製容器であって、反応容器ラック１ａの各ホルダ穴に開口部を上にしてセットされる。
【００２６】
同じく反応容器ラック１ａの手前側に隣接して引き出し台車１１に搭載された酵素試薬容器ラック２ａは、酵素試薬を含有する容器を載置するためのラックであって、ホルダ穴が３個横１列に並んでおり最大３本の酵素試薬容器２を載置することが可能である。酵素試薬容器２は略円筒の外形の底面に開口部を有する樹脂製容器であって、開口部を上にして酵素試薬容器ラック２ａの各ホルダ穴に開口部を上にしてセットされる。
【００２７】
同じく反応容器ラック１ａの右側に隣接して引き出し台車１１に搭載されたチップ廃棄部５は、反応容器１に酵素試薬容器２から酵素試薬を分注した後のチップ４を廃棄するための容器用スペースである。このように、廃棄ボックスを反応容器１の近くに配置することで、チップ４の液だれなどによる装置汚染及び環境汚染を最小限にできる。
【００２８】
次に、引き出し台車１１に隣接して奥側の固定部に設けられた検出部の構成について説明する。検出部は上部のインキュベーター６とその下部に設けられた蛍光検出部７からなる。
インキュベーター６は反応容器１を収容し、反応容器１を所定時間、所定温度に保つ恒温器である。１列あたり２４個のホルダ穴が横２列に配置され、最大４８個の反応容器１の収容が可能である。ホルダ穴の上部には、後述する蛍光による検出時にホルダ穴内をほぼ暗室とするべくシャッター６ｂが設置されている。
【００２９】
このインキュベーター６の下方に接して、反応容器１内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部７が配置されている。蛍光検出部７では、４３℃で恒温状態とした反応容器１内に増幅された核酸について、シャッター６ｂを閉じてほぼ暗室として蛍光による検出を行う。λ＝４７０ｎｍのLED７Ｂ１台と２台のPD７Ｅを搭載した蛍光検出器が左右方向に設置したレール上を走査可能であり、さらに図示しないシフト装置により該レール自体が前後２箇所に水平移動可能に設けられており、前後２列４８本の反応容器１の蛍光検出が可能となっている。
【００３０】
次に、引き出し台車１１上の各ラック及びチップ廃棄部５と、この後方に設置されたインキュベーター６の上方に移動可能に設けられた酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９について説明する。
両者は共に図１、図２（ａ）に示す移送装置１０に組みつけられており、前記範囲を移動可能となっている。移送装置１０はラックピニオン式でＸ−Ｙ方向に取付け台を水平移動可能としたものであり、取付け台に取り付けられた酵素試薬分注機構８と、蓋キャッチ機構９とは各々Ｚ軸方向に垂直移動する機構を備えている。
【００３１】
酵素試薬分注機構８は、図９に示すように、昇降機構と、前記チップ４を先端に装着するためのノズル８ａと、酵素試薬容器２の酵素試薬を所定量吸引し、対応の反応容器１の上方に移動して該酵素試薬を吐出、混合するためのポンプ８ｂおよび圧力センサ８ｄを備えている。
【００３２】
蓋キャッチ機構９は、図６に示すように、昇降機構と、蓋３を蓋ラック３ａから取り上げる際、及び反応容器１に蓋３を取り付ける際、蓋３の上部の凹部３ｂに嵌合するロッド９ａと、蓋３の保持と蓋閉めした反応容器１の保持を行うつめ部付き開閉式ハンド９ｂと、からなる蓋３保持手段とを備えている。
【００３３】
以下に前記構成による核酸検出装置の検査方法について説明する。
まず、検査の概略の流れについて図２、３、４で説明する。
図３は検査手順を示す図であり、右下の太線で囲まれた部分が前記構成において自動化された部分である。まず、引き出し台車１１を図４に示すように、手前の前進限まで引き出してロックする。これにより、引き出し台車１１は、移送装置１０のＹ軸移送用レール架台の可動範囲から完全に外れるように設定されており、万一、移送装置１０が誤作動により引き出し台車１１の元位置に接近しても、移送装置１０と作業者及び検査用器具等との干渉が避けられるため、作業の安全性を確保することができるように構成される。
【００３４】
次に引き出し台車１１上の反応容器ラック１ａにセットされた反応容器１に、TRC試薬調製により得られたTRC試薬ミックス２０μｌと、検体を前処理及び核酸抽出処理して得られたサンプル液５μｌとを手動にて分注する。反応容器ラック１ａには最大４８本の反応容器１をセットすることができる。なお、前記サンプル液を得るための前処理及び核酸抽出処理は、汚染のリスクを避けるために別のエリアで行う。
【００３５】
そして、TRC酵素試薬を分注した酵素試薬容器２を酵素試薬容器ラック２ａにセットする。この酵素試薬容器２は最大３本までセット可能であり、一度に最大３種類のTRC酵素試薬による３項目の核酸検出が可能である。
【００３６】
さらに、チップラック４ａ及び蓋ラック３ａにチップ４及び蓋３をセットする。チップラック４ａには最大９６本のチップ４が、蓋ラック３ａには最大９６個の蓋３がセット可能である。実際の核酸検出試験においては、検出すべき反応容器１の数に、取り付け不良分を見込んだ予備分の数を加えた数以上のチップ４及び蓋３をセットする必要がある。
【００３７】
このように準備した後、引き出し台車１１を後退限まで戻し、核酸検出装置の自動検出モードのスタートスイッチを押す。これにより、図３の太線部分の操作が自動にて行われる。以下この自動操作について説明する。
【００３８】
まず、酵素試薬分注・混合操作が、移送台車及びこれに搭載された酵素試薬分注機構８により行われる（図５参照）。
酵素試薬分注操作は、まず、酵素試薬分注機構８のノズル８ａ先端にチップラック４ａ上にセットされたチップ４を取り付け、次に酵素試薬分注機構８のポンプ８ｂにて酵素試薬液を５μｌ吸引し、次にこの酵素試薬液を反応容器１に吐出することにより行われる。
混合操作は、前記操作の後、前記ノズル８ａをこの混合液中に差し込んだまま、混合液を１０μｌ吸引し、これを吐出する操作を繰り返すことにより行われる。
【００３９】
次に、反応容器密閉操作が、移送台車及びこれに搭載された前記蓋キャッチ機構９により行われる（図６参照）。
反応容器密閉操作は、まず、蓋キャッチ機構９が蓋ラック３ａ上の蓋３を取り上げ、次にこの蓋３を反応容器１の上部開口部に取り付けることにより行われる。
【００４０】
次に、インキュベーター６への移送操作が移送台車及びこれに搭載された前記蓋キャッチ機構９により行われる（図６参照）。
前記移送操作は、反応容器密閉操作の後、蓋キャッチ機構９が蓋３部を保持したまま反応容器１ごと上昇し、反応容器１をインキュベーター６へ搬送して装着することにより行われる。
【００４１】
次に、容器遮光操作が、インキュベーター６の各ホルダ穴上部を覆うシャッター６ｂにより行われる（図１２参照）。
容器遮光操作は、反応容器１がインキュベーター６に装着された後、直ちにシャッター６ｂを閉じることにより行う。シャッター６ｂは通常時は閉じていてインキュベーター６内は４３℃にて保たれており、新たな反応容器１をインキュベーター６に装着する時と、検出後の反応容器１を反応容器ラック１ａに搬送するときのみ開くように管理され、シャッター６ｂが閉じた状態のときに誤って反応容器１がインキュベーター６に搬入されることを防止する。
【００４２】
次に、増幅・蛍光検出操作がインキュベーター６及び蛍光検出部７により行われる（図７参照）。
増幅操作は、反応容器１がインキュベーター６内に装着された後、４３℃に保たれることで反応容器１内の核酸が増幅することにより行われる。
蛍光検出操作は、インキュベーター６の下部に接して設けられた蛍光検出部７により行われる。所定時間４３℃に保たれた反応容器１について、シャッター６ｂが閉まった条件下で、下方から励起光を当て、そこから発する蛍光を分析することにより行う。この蛍光検出の結果がパソコンに表示され、プリンターにて出力される。
【００４３】
次に、反応容器ラック１ａへの移送（以下「戻し搬送」と記す。）操作が、蓋キャッチ機構９により行われる（図８参照）。
戻し搬送操作は、蛍光検出後、インキュベーター６のシャッター６ｂを開けて、蓋キャッチ機構９により反応容器１を反応容器ラック１ａへ搬送し、元の位置に装着することにより行われる。
【００４４】
以下に、本実施形態の特徴部分である各機構の作用についてについて詳しく説明する。
【００４５】
図５（ａ）〜（ｄ）に示すように、前記酵素試薬の分取・分注操作における酵素試薬分注機構８は、
（ａ）まず、チップラック４ａのチップ４上に移動し、ノズル８ａを下降させてノズル８ａ先端にチップ４を連結する。
（ｂ）次に、酵素試薬容器ラック２ａの酵素試薬容器２上に移動し、下降してチップ４先端を酵素試薬液に差し入れ、同液を５μｌポンプ８ｂにて吸引する。
（ｃ）次に、反応容器ラック１ａの反応容器１上に移動し、下降してチップ４先端をTRC試薬ミックスと検体のサンプル液との混合液に差し入れ、同液中に前記酵素試薬５μｌを吐出し、その後、この混合液を１０μｌ吸引し、再びこれを吐出する操作を繰り返して混合液を撹拌する。
（ｄ）次に、チップ廃棄部５上に移動し、空気圧によりチップ４をノズル８ａ先端から切り離して廃棄する。
【００４６】
また、図６（ａ）〜（ｄ）に示すように、前記反応容器蓋閉め・搬送操作における蓋キャッチ機構９は、
（ａ）まず、蓋ラック３ａの蓋３上に移動し、爪部を開いて下降し、ロッド９ａ先端を蓋３上面に設けられた穴に挿入した後、爪部を閉じて蓋３を抱えて上昇する。
（ｂ）次に、反応容器ラック１ａの反応容器１上に移動し、下降して蓋３を反応容器１開口部に押し込んで蓋閉めを行う。
（ｃ）次に、そのまま上昇し、密閉した反応容器１を抱えてインキュベーター６に搬送する。
（ｄ）次に、インキュベーター６のホルダ穴上に移動し、下降して反応容器１をホルダ穴の台座６ａに押し込み、爪部を開いて上昇する。
【００４７】
また、図７に示すように、検出操作における蛍光検出部７は、１列に２４個のホルダ穴を有し２列から成るインキュベーター６の各列に収容された反応容器１を下方より照射して、そこから発する蛍光により目標核酸の有無を検出するものである。LED７ｂ、干渉フィルター７ｃ、ダイクロイックミラー７ｄ、PD（光検出器）７ｅを搭載した１台の計測ブロック７ａが、ホルダ穴の列と平行に配置されたレール上を、図７の紙面に垂直方向に水平移動可能に設けられており、さらに、前記レールがホルダ穴の列に対応した２ポジションを図７の矢印方向に左右に水平移動可能に設けられている。
【００４８】
また、図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、戻し搬送操作における蓋キャッチ機構９は、
（ａ）まず、インキュベーター６のホルダ穴上に移動し、爪部を開いて反応容器１位置に下降する。
（ｂ）次に、ロッド９ａ先端を蓋３上面に設けられた穴に挿入した後、爪部を閉じて蓋３部で反応容器１を抱えて上昇する。
（ｃ）次に、反応容器ラック１ａの当該反応容器１がセットされていたホルダ穴上に移動し、下降して反応容器１を元のホルダ穴にセットし、爪部を開いて上昇する。
【００４９】
以上、本実施形態の核酸検出装置の作用について説明したが、個々の装置の機能についてさらに詳しく説明する。
【００５０】
図９にて、図５で説明した酵素試薬分注機構８のポンプ８ｂによる酵素試薬液面の検知方法について説明する。
まず、ポンプ８ｂ内のシリンダピストン８ｃを吐出方向に動作させながらポンプ８ｂを降下させる。この動作中、常に圧力センサ８ｄでシリンダ内の圧力を監視しておく。この状態ではチップ４先端から空気が吐出し、シリンダ内の圧力はほぼ一定に保たれる。そして、チップ４先端が酵素試薬の液面に触れると、シリンダ内が密閉されることでシリンダ内の圧力が上昇する。この一定圧力以上の変化を捉えることで液面位置を検知する。
【００５１】
図１０にて、蓋３、反応容器１及びチップ４の検知方法について説明する。
移送装置１０に設置された発信機１０ａ（？）から発信されたレーザー光が、図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すように蓋３、反応容器１及びチップ４により遮られ、受信機１０ｂに届く光量に変化が生じる。これを検知することで蓋３、反応容器１及びチップ４が確実に保持されていることを確認し、次の操作に移行することで、誤操作防止、作業能率向上を図ることができる。
【００５２】
図１１にて、蓋３、反応容器１、チップ４及び酵素試薬容器２の架設検知方法について説明する。架設検知とは、これらの備品が各々の収納用ラックに収納されているかどうかを検知するものである。具体的手法としては、図１１に示すように検知器１０ｃのレーザー光を各備品に当てて、その反射光により備品の有無の検知を行う。
【００５３】
この架設検知により、各備品がラック上に収納されていることを確認した後、酵素試薬分注機構８、蓋キャッチ機構９を下降させて前記各操作を行う。この架設検知により、備品のない状態での酵素試薬分注機構８、蓋キャッチ機構９の操作を防止することができ、誤操作防止、作業能率向上が図れる。
【００５４】
図１２にて、インキュベーター６のシャッター６ｂ機構について説明する。
前記蓋キャッチ機構９にてインキュベーター６上部に搬送された反応容器１は、蓋キャッチ機構９の降下によりホルダ穴の一つに装入、固定される。その後、シャッター６ｂが閉められ、インキュベーター６内部はほぼ暗室とされる。
【００５５】
シャッター６ｂは、電動モータ駆動のラックピニオン方式でスライド移動により開閉し、図１２に示すように、４８箇所のホルダ穴の開口部６ｃが同時に開閉される。シャッター６ｂは、通常閉じており、前記のように反応容器１がインキュベーター６上部に搬送されると開き、反応容器１がホルダ穴に収容されると再び閉じるという動作を繰り返す。その間、インキュベーター６内は常に４３℃に保たれている。インキュベーター６は熱伝導性を考慮し、アルミブロックにて構成されるのが好ましい。
【００５６】
インキュベーター６内に収納された反応容器１内では、４３℃に保たれることで内部のサンプル液に標的となる核酸が存在していた場合は、その核酸が増幅され、図７に示すインキュベーター６下部の蛍光検出部７によって検出可能なレベルに達する。このような反応容器１については、シャッター６ｂにより遮光しほぼ暗室とした条件下で、下部から図７に示す経路で蛍光を測定することにより、標的となる核酸の存在を検出することができる。
【００５７】
具体的には図７において、LED７ｂからの波長λ＝４７０ｎｍの励起光が第一の干渉フィルター７ｃを通り、第一のダイクロイックミラー７ｄで反射されて反応容器１の底部からサンプル液体を励起し、第一のダイクロイックミラー７ｄを通過した蛍光の内、第二のダイクロイックミラー７ｄで反射して第二の干渉フィルター７ｃを通り第一のPD７ｅに入る蛍光と、第二のダイクロイックミラー７ｄをも通過して第三の干渉フィルター７ｃを通り第二のPD７ｅに入る蛍光とに分かれ、これら第一のPD７ｅと第二のPD７ｅの蛍光の強度比を比較演算することで標的の核酸を検出する。
【００５８】
以上説明したように、本発明の核酸検出装置では、従来マニュアルで行っていた酵素試薬を添加し、インキュベーターにセットするまでの操作について、酵素試薬分注機構及び蓋キャッチ機構を設置することで、反応容器への酵素試薬の分注・混合、蓋の取り付けによる密閉、インキュベーターへの搬送を自動化し、さらに、検出後の反応容器ラックへの戻し搬送を自動化することで、TRC操作をさらに簡易化することができる。
【００５９】
また、引き出し台車上に各備品のラックを設置して、引き出した状態でサンプル液の注入等の準備作業を行うことにより、検体や試薬による検出装置の汚染が防げるとともに、例えば、反応容器や酵素溶液容器のセッティングの際に分注機構が作動して、作業者の手を巻き込んだりすることが避けられ、安全性の向上を図ることができ、さらに、反応容器、酵素溶液容器、チップ、蓋を近い場所にまとめることで作業効率の向上を図ることができる。
【００６０】
さらに、酵素試薬分注機構により酵素溶液を吸引し、試薬ミックス＋サンプル液を収容する反応容器に吐出し、その混合物を吸引し、吐出する操作を繰り返すことで反応溶液の混合が可能となり、ボルテックス操作が不要になる。
【００６１】
さらに、蓋キャッチ機構により、蓋の把持、反応容器の蓋閉め及び移動を確実に行うことで、作業効率の向上を図ることができる。
【００６２】
さらに、検出後の反応容器を蓋キャッチ機構により反応容器ラックの元の位置に戻すことにより、測定し終えた反応容器が一目でわかり、装置の作動異常や試薬の分注不良、分注のし忘れ等が早期に判明するため、これら不具合の拡大を防止することができ、検査結果の信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の核酸検出装置の一実施形態を示す組立斜視図である。
【図２】本発明の核酸検出装置の一実施形態を示す組立図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図３】本実施形態における検査の手順を示す図である。
【図４】本実施形態の引き出し台車の搭載物を示す図である。
【図５】本実施形態の酵素試薬の分取・分注操作の説明図である。
【図６】本実施形態の蓋閉め・搬送操作の説明図である。
【図７】本実施形態の蛍光検出部における検出操作の説明図である。
【図８】本実施形態の戻し搬送操作の説明図である。
【図９】本実施形態の酵素試薬分注機構の液面検知機構の説明図である。
【図１０】本実施形態の蓋、反応容器、チップの検知機構の説明図である。
【図１１】本実施形態の蓋、容器、チップの架設検知機構の説明図である。
【図１２】本実施形態のインキュベーターのシャッター機構の説明図である。
【符号の説明】
【００６４】
１ 反応容器
１ａ 反応容器ラック
２ 酵素試薬容器
２ａ 酵素試薬容器ラック
３ 蓋
３ａ 蓋ラック
３ｂ 凹部
４ チップ
４ａ チップラック
５ チップ廃棄部
６ インキュベーター
６ａ 台座
６ｂ シャッター
６ｃ 開口部
７ 蛍光検出部
７ａ 計測ブロック
７ｂ ＬＥＤ
７ｃ 干渉フィルター
７ｄ ダイクロイックミラー
７ｅ ＰＤ（光検出器）
８ 酵素試薬分注機構
８ａ ノズル
８ｂ ポンプ
８ｃ ピストン
８ｄ 圧力センサ
９ 蓋キャッチ機構
９ａ ロッド
９ｂ 開閉式ハンド
１０ 移送装置
１０ａ レーザー発信機
１０ｂ レーザー受信機
１０ｃ レーザー検知機
１１ 引き出し台車
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素試薬の分注のためのディスポーザブルピペットチップを複数個載置したチップラックと、
前記酵素試薬を含有する容器を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラックと、
標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器を複数個載置した反応容器ラックと、
前記ディスポーザブルピペットチップを用い、前記酵素試薬を含有する容器の酵素試薬を所定量吸引し、対応する前記反応容器に当該酵素試薬を吐出し、その後当該使用済みの前記ディスポーザブルピペットチップを廃棄するための酵素試薬分注機構と、
前記使用済みのディスポーザブルピペットチップを受容するためのディスポーザブルピペットチップ廃棄部と、
前記反応容器の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋を複数個載置した蓋ラックと、
前記反応容器を収容し、前記反応容器を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター部と、
前記反応容器を前記蓋により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器ごと前記インキュベーター部にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構と、
前記反応容器内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部と、
を備えた核酸検出装置。
【請求項２】
前記チップラック、前記酵素試薬容器ラック、前記反応容器ラック、前記ディスポーザブルピペットチップ廃棄部及び前記蓋ラックは、同一の引き出し台車に設置されており、該引き出し台車は、前記酵素試薬分注機構及び前記反応容器蓋閉め・移動機構の可動範囲の内側から外側まで移動可能であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸検出装置。
【請求項３】
前記酵素試薬分注機構は、前記酵素試薬を吸引し、試薬ミックス及びサンプル液を含む反応容器に吐出した後、その混合物の吸引、吐出操作が反復可能であることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸検出装置。
【請求項４】
前記蓋は上部に凹部を有し、前記反応容器蓋閉め・移動機構は、前記凹部に嵌合する先端部を有するロッド部と、つめ部を有する２本以上の開閉式ハンドとを含む蓋保持手段を備え、前記ロッド部を前記蓋の前記凹部に差込み、かつ開閉式ハンドを閉状態にすることでつめ部が前記蓋の側部を把持し、該蓋を前記反応容器の上面開口部に嵌挿嵌合し、前記反応容器を前記蓋とともに移動させることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記反応容器は、前記インキュベーター部で蛍光測定された後、前記反応容器蓋閉め・移動機構により、反応容器ラック部の元の設置位置に戻されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項１】
酵素試薬の分注のためのディスポーザブルピペットチップを複数個載置したチップラックと、
前記酵素試薬を含有する容器を１又は複数個載置した酵素試薬容器ラックと、
標的核酸を含有すると疑われるサンプル液と、基質試薬及びプライマー試薬を混合した試薬ミックスとを含む、上面開口部を有する反応容器を複数個載置した反応容器ラックと、
前記ディスポーザブルピペットチップを用い、前記酵素試薬を含有する容器の酵素試薬を所定量吸引し、対応する前記反応容器に当該酵素試薬を吐出し、その後当該使用済みの前記ディスポーザブルピペットチップを廃棄するための酵素試薬分注機構と、
前記使用済みのディスポーザブルピペットチップを受容するためのディスポーザブルピペットチップ廃棄部と、
前記反応容器の上面開口部と嵌挿嵌合可能な蓋を複数個載置した蓋ラックと、
前記反応容器を収容し、前記反応容器を所定時間、所定温度でインキュベートするためのインキュベーター部と、
前記反応容器を前記蓋により蓋閉めし、当該蓋閉めした反応容器ごと前記インキュベーター部にまで移動させる反応容器蓋閉め・移動機構と、
前記反応容器内の反応系の蛍光測定を行うための蛍光検出部と、
を備えた核酸検出装置。
【請求項２】
前記チップラック、前記酵素試薬容器ラック、前記反応容器ラック、前記ディスポーザブルピペットチップ廃棄部及び前記蓋ラックは、同一の引き出し台車に設置されており、該引き出し台車は、前記酵素試薬分注機構及び前記反応容器蓋閉め・移動機構の可動範囲の内側から外側まで移動可能であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸検出装置。
【請求項３】
前記酵素試薬分注機構は、前記酵素試薬を吸引し、試薬ミックス及びサンプル液を含む反応容器に吐出した後、その混合物の吸引、吐出操作が反復可能であることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸検出装置。
【請求項４】
前記蓋は上部に凹部を有し、前記反応容器蓋閉め・移動機構は、前記凹部に嵌合する先端部を有するロッド部と、つめ部を有する２本以上の開閉式ハンドとを含む蓋保持手段を備え、前記ロッド部を前記蓋の前記凹部に差込み、かつ開閉式ハンドを閉状態にすることでつめ部が前記蓋の側部を把持し、該蓋を前記反応容器の上面開口部に嵌挿嵌合し、前記反応容器を前記蓋とともに移動させることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸検出装置。
【請求項５】
前記反応容器は、前記インキュベーター部で蛍光測定された後、前記反応容器蓋閉め・移動機構により、反応容器ラック部の元の設置位置に戻されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−７７６３９（Ｐ２００９−７７６３９Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４８００９（Ｐ２００７−２４８００９）
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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