核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キット
【課題】操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を精製することができる核酸精製方法の提供。
【解決手段】
核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂１０により吸着する手順を含み、上記イオン交換樹脂１０には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。上記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が小さな第２の陽イオン交換樹脂とを用いてもよい。
【解決手段】
核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂１０により吸着する手順を含み、上記イオン交換樹脂１０には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。上記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が小さな第２の陽イオン交換樹脂とを用いてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キットに関する。より詳しくは、イオン交換樹脂により夾雑物を吸着することで核酸を精製する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。例えば、医学分野では、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列に基づいた診断が行われており、農業分野では遺伝子組み換え作物の判定等でＤＮＡ鑑定が活用されている。
【０００３】
核酸増幅反応では、微量サンプル中の核酸を高効率に増幅して検出できる。しかし、サンプルに含まれる核酸が極めて微量である場合には、検出下限量未満となる場合がある。さらに、サンプル中の核酸濃度が極めて低い場合には、反応場へ導入可能な容積のサンプル中に増幅対象核酸が含まれなかったために検出が不能となる場合がある。これらの場合には、予め精製や濃縮等をして抽出した核酸を反応場に導入することが有効となる。
【０００４】
ここで、核酸の精製という点に着目すると、従来、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法が知られている。また、核酸吸着能を有する多孔質担体を用いた核酸の精製方法も知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−０８０５５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０６０８４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のフェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法は、有害な有機溶媒を使用する必要があり、遠心分離操作等に手間がかかっていた。また、核酸吸着能を有する多孔質担体を用いた核酸の精製方法においては、複数の工程を行う必要があり、操作の簡便性からも課題があった。そのため、操作がより簡便であり、短時間で高効率に核酸を精製することができる方法が希求されていた。
【０００７】
そこで、本技術は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を精製することができる核酸精製方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本技術は、核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、上記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法を提供する。上記陽イオン交換樹脂により、サンプルに含まれる正電荷を有するタンパク質や金属塩等のカチオンを吸着することが可能になる。また、上記陰イオン交換樹脂により、サンプルに含まれる主に核酸以外の負電荷を有するアニオンを吸着することが可能になる。
また、上記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いることが好ましい。ここで、排除限界分子量とは、イオン交換樹脂に吸着させようとした種々の化合物において、イオン交換樹脂の細孔内に侵入しづらくなる化合物、すなわちイオン交換樹脂の細孔内に吸着されづらくなる化合物のうち、最も低い分子量をもつものの分子量をいう。換言すれば、当該排除限界分子量より高い分子量を有する化合物については、イオン交換樹脂に吸着されづらくなる。
上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が高い上記第１の陽イオン交換樹脂が、上記タンパク質を選択的に吸着しやすくなる。また、上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が低い上記第２の陽イオン交換樹脂が、主に金属塩等のカチオンを選択的に吸着しやすくなる。
また、上記第１の陽イオン交換樹脂により上記物質を吸着してから、上記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより上記物質を吸着することが好ましい。この場合、例えば、上層に上記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に上記陰イオン交換樹脂と上記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの上記上層側から上記サンプルを流入してもよい。このように、サンプル中の物質について、まず第１の陽イオン交換樹脂によりサンプル中のタンパク質を主に選択的に吸着し、次いで第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂によりサンプル中の金属塩を主に選択的に吸着することで、よりサンプル中の物質の吸着効率は向上する。
また、上記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であってもよく、上記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０であることが好ましい。
また、上記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋（ナトリウムイオン）であることが好ましい。また、上記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋（プロトン）であることが好ましい。
また、上記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−（水酸化物イオン）であることが好ましい。
また、上記第２の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％であることが好ましい。ここで、イオン交換容量とは、イオン交換樹脂の単位量当たりの交換基の総数のことを指す。例えば、第２の陽イオン交換樹脂の対イオンがＨ＋である場合、イオン交換容量とは、第２の陽イオン交換樹脂１ｍｌ中に含まれるＨ＋の総数のことを指す。上記第２の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合が、５０％〜１５０％であることで、イオン交換樹脂によるサンプルに含まれる物質の吸着をする前とその後のｐＨの変動をより安定に抑制することが可能になる。
また、上記核酸精製方法では、サンプルに非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を添加して上記物質を吸着することがより好ましい。サンプルに非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を添加することで、核酸の樹脂に対する物理的な吸着を抑制することが可能になる。
上記物質は、例えば、夾雑物である。当該夾雑物は、例えば、タンパク質と金属塩とを含有する。また、夾雑物は、タンパク質や金属塩の他にサンプル中の核酸の分析において不要な、種々のペプチド、糖、塩、低分子アニオン（例えば、フマル酸、フタル酸、フミン酸、フルボ酸）等の物質を含有していてもよい。
【０００９】
また、上記課題解決のため、本技術は、核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法を提供する。
上記電気泳動は、アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について行われてもよい。また、上記電気泳動は、上記サンプルと、上記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、上記脱水縮合反応の縮合剤と、を混合して、上記核酸について行われてもよい。
【００１０】
また、本技術は、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂と、前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を抽出することができる核酸精製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【図２】本技術の第１実施形態に係る第１の陽イオン交換樹脂により夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【図３】本技術の第１実施形態に係る第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【図４】本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【図５】陽イオン交換樹脂による吸着処理後の核酸回収率を示すグラフである（試験例１）。
【図６】陽イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（試験例１）。
【図７】陽イオン交換樹脂の対イオン種（Ｎａ＋、Ｈ＋）の核酸回収率に対する影響を検討した結果を示すグラフである（試験例２）。
【図８】イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例４、５）
【図９】イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例４、５）
【図１０】イオン交換樹脂による吸着処理後のＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例６）
【図１１】イオン交換樹脂による吸着処理後のＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例７）
【図１２】サンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例１２）。
【図１３】サンプルのＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例１２）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
（１）核酸精製用キット
（２）核酸精製方法
２．本技術の第２実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
３．核酸抽出方法
【００１４】
１．本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
（１）核酸精製用キット
まず、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法に用いる核酸精製用キットについて、図１（Ａ）を参照しながら説明する。図１（Ａ）〜（Ｃ）は、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【００１５】
図１（Ａ）中、符号１で示す核酸精製用キットは、サンプルに含まれる核酸以外の物質（以下、夾雑物と記す）を吸着し、核酸を精製する。核酸精製用キット１は、イオン交換樹脂１０と、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具３とを主に有する。なお、本技術で用いるサンプルとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ぬぐい液、口腔スワブ、唾液、血清、血漿、末梢血単球細胞、脳脊髄液、糞、尿、培養細胞、生検組織等の生体試料が挙げられる。また、サンプルとしては、生体試料の他に、河川水、海水、土壌等も挙げられる。
【００１６】
核酸精製器具３は、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、サンプルを流通させる。核酸精製器具３については、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、サンプルを流通可能であれば、形状や材質等は特に限定されるものではない。例えば、核酸精製器具３としては、図１（Ａ）に示すように、上部が開口した形状を有する市販のサンプル管やチップ等を用いることが可能である。また、核酸精製器具３は、例えば、上部及び下部が開口した筒状に形成されていてもよい。この場合には、サンプルを核酸精製器具３に流通し、イオン交換樹脂１０によりサンプルを吸着した後に、下部から流れ出るサンプルを回収するために、別途チップ等を用いることが可能である。
【００１７】
本技術に係るイオン交換樹脂１０は、サンプルに含まれる夾雑物を吸着する。イオン交換樹脂１０は、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とを含む。なお、上記夾雑物は、例えば、タンパク質と金属塩とを含有する。また、夾雑物は、タンパク質や金属塩の他にサンプル中の核酸の分析において不要な、種々のペプチド、糖、塩、低分子アニオン（例えば、フマル酸、フタル酸、フミン酸、フルボ酸）等の物質を含有していてもよい。
【００１８】
上記陽イオン交換樹脂は、カチオン性の夾雑物を主に吸着する。陽イオン交換樹脂は、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを含むことが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂は、サンプルに含まれるタンパク質を主に吸着するために用いられる。第２の陽イオン交換樹脂は、サンプルに含まれる金属イオン等の陽イオン（カチオン）を主に吸着するために用いられる。
【００１９】
第１の陽イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれるタンパク質を吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。このとき、第１の陽イオン交換樹脂は、ＳＯ３−を固定イオンとすることが好ましい。また、対イオンとしては、特に限定されるものではなく、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、プロトン（Ｈ＋）等が挙げられる。この点、これらのイオンを用いた場合のイオンを交換する強さ（イオンの選択性）の順序は、Ｃａ２＋＞Ｃｕ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｍｇ２＋＞Ｋ＋＞ＮＨ４＋＞Ｎａ＋＞Ｈ＋である。従って、イオン交換する強さを考慮すると、対イオンは、Ｈ＋であることが好ましい。一方で、対イオンがＨ＋である場合、サンプルのｐＨが酸性側にシフトしやすい。これに対し、対イオンがＮａ＋である場合、対イオンがＨ＋である場合よりも、金属塩を吸着する機能は弱くなるものの、サンプルのｐＨの変動を抑制することが可能である。また、対イオンがＮａ＋である場合であっても、第１の陽イオン交換樹脂はタンパク質を十分に吸着することができる。そのため、第１の陽イオン交換樹脂は、Ｎａ＋を対イオンとして有する強酸性陽イオン交換樹脂（Ｎａ＋型強酸性陽イオン交換樹脂）であることが好ましい。
【００２０】
第２の陽イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれる金属塩等のカチオンを吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。このとき、第２の陽イオン交換樹脂は、ＳＯ３−を固定イオンとすることが好ましい。また、対イオンとしては、特に限定されるものではないが、上述したイオンを交換する強さ（イオンの選択性）の順序を考慮すると、第２の陽イオン交換樹脂の対イオンはプロトン（Ｈ＋）であることがより好ましい。
【００２１】
陰イオン交換樹脂は、サンプルに含まれる陰イオン（アニオン）を吸着する。陰イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれる金属塩等のアニオンを吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強塩基性陰イオン交換樹脂であることが好ましい。また、陰イオン交換樹脂は、例えば、トリメチルアンモニウム基を持つＩ型及びジメチルエタノールアンモニウム基を持つＩＩ型の強塩基性陰イオン交換樹脂のうちのいずれとすることも可能である。ここで、Ｉ型においては、陰イオンを交換吸着する強さ（イオンの選択性）の順序は、ＨＳＯ４−＞ＮＯ３−＞Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞ＨＣＯ３−＞ＨＣＯＯ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｆ−＞ＯＨ−となる。また、ＩＩ型においては、陰イオンを交換吸着する強さ（イオンの選択性）の順序は、ＨＳＯ４−＞ＮＯ３−＞Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞ＨＣＯ３−＞ＯＨ−＞ＨＣＯＯ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｆ−となる。そして、上記Ｉ型及びＩＩ型の陰イオン交換樹脂のうち、Ｉ型の方が塩化物イオン（Ｃｌ−）等をより精度良く吸着することが可能である。そのため、陰イオン交換樹脂は、Ｉ型であり、対イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ−）を有することが好ましい。
【００２２】
また、核酸精製用キット１には、夾雑物の吸着と共に核酸を吸着しないように、非イオン性界面活性剤や非イオン性親水性高分子化合物等の非イオン性化合物等の添加剤が含まれていてもよい。非イオン性化合物としては、例えば、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルセルロース等の非イオン性親水性高分子化合物も挙げられる。これらの例示した非イオン性化合物は、単独で用いてもよいし、複数種組み合わせて用いてもよい。更に、核酸精製用キット１には、ＥＤＴＡ等のキレート添加剤が含まれていてもよい。
【００２３】
また、核酸精製用キット１には、緩衝液が含まれていてもよい。かかる緩衝液用の緩衝剤としては、例えば、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳ(ｐＨ：３．９〜５．１、ｐＫａ：４．５５)、ＭＥＳ（ｐＨ：５．５〜７．０、ｐＫａ：６．１５）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ：５．７〜７．３、ｐＫａ：６．４６）、ＡＤＡ（ｐＨ：５．８〜７．４、ｐＫａ：６．６０）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ：６．１〜７．５、ｐＫａ：６．８０）、ＡＣＥＳ（ｐＨ：６．０〜７．５、ｐＫａ：６．９０）、ＭＯＰＳＯ（ｐＨ：６．２〜７．４、ｐＫａ：６．９５）、ＢＥＳ（ｐＨ：６．６〜８．０、ｐＫａ：７．１５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ：６．５〜７．９，ｐＫａ：７．２０）、ＴＥＳ（ｐＨ：６．８〜８．２、ｐＫａ：７．５０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ：６．８〜８．２、ｐＫａ：７．５５）、ＤＩＰＳＯ（ｐＨ：６．９〜８．１、ｐＫａ：７．６）、ＴＡＰＳＯ（ｐＨ：７．０〜８．２、ｐＫａ：７．７）、ＰＯＰＳＯ（ｐＨ：７．２〜８．５、ｐＫａ：７．８５）、ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ：７．４〜８．６、ｐＫａ：７．９）、ＥＰＰＳ（ｐＨ：７．５〜８．５、ｐＫａ：８．０）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ：７．８〜８．８、ｐＫａ：８．１５）、Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ：７．７〜９．１、ｐＫａ：８．３５）、ＴＡＰＳ（ｐＨ：７．７〜９．１、ｐＫａ：８．４）、ＣＨＥＳ（ｐＨ：８．６〜１０．０、ｐＫａ：９．５）、ＣＡＰＳＯ（ｐＨ：９．３〜１０．７、ｐＫａ：１０．０）、ＣＡＰＳ（ｐＨ：９．７〜１１．１、ｐＫａ：１０．４０）等が挙げられる。なお、上記例示した各緩衝剤のｐＨの範囲は、緩衝液を添加したサンプルのｐＨとして適当な範囲を指す。また、上記例示した各緩衝剤のｐＫａは、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳを除いて２０℃におけるｐＫａを指す（ＨｏｍｏＰＩＰＥＳについては、３７℃におけるｐＫａを示す。）。サンプルを希釈した緩衝液のｐＨは、４〜８であることが好ましい。この点、本実施形態において上記例示した緩衝剤の中では、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡが好適に用いられる。
【００２４】
（２）核酸精製方法
次に、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順について、図１（Ａ）〜（Ｃ）を参照しながら説明する。
【００２５】
ここで、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法を説明する前に、まず、本技術の関連技術に係る核酸精製方法について説明する。関連技術に係る核酸精製方法としては、ゼオライトを用いてサンプルの夾雑物を吸着する方法を挙げることができる（例えば、特許文献２参照）。
【００２６】
関連技術に係る核酸精製方法では、生体試料等のサンプルに含まれるアニオン及びカチオンのうち、カチオンのみの除去が可能である。そのため、関連技術に係る核酸精製方法では、サンプルの精製により、プロトンが放出されることになり、サンプルを含有する液のｐＨが低下する（より酸性側にシフトする）。この点、サンプルの精製後、核酸増幅反応はｐＨ７〜９で実行される場合があるため、ゼオライトと接触させるサンプルを含有する液のｐＨを予め高めに設定する（アルカリ側に設定する）必要がある。そのため、上記関連技術に係る核酸精製方法では、操作が煩雑になる場合がある。また、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。
【００２７】
また、上記関連技術に係る核酸精製方法は、サンプルをアルカリ性の化合物と界面活性剤（例えば、ＳＤＳ等）との混合試薬で希釈した後に、高温で加熱する工程を含む。そのため、この点からも、上記関連技術に係る核酸精製方法では、操作が煩雑になる場合がある。また、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。
【００２８】
また、上記関連技術に係る核酸精製方法では、サンプルの精製後、サンプル中にアニオンが残留することがある。更に、サンプル中には、アニオン性界面活性剤が含まれていることもある。そのため、サンプルの精製後、核酸を電気泳動させる際に、サンプル中の電解質濃度が高くなり、サンプルが発熱しやすくなる。従って、この点からも、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性がある。更に、発熱によるサンプルの対流の発生により、核酸の電気泳動濃縮の効率が低下する場合もある。
【００２９】
この点、以下に詳述する本技術に係る核酸精製方法は、本願発明者らの鋭意検討の結果見出されたものであり、煩雑な操作を必要とせず、操作を非常に簡便にし、短時間に高効率で核酸を精製可能にした方法である。
【００３０】
本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法では、まず、容器５に収容された核酸を含有するサンプルＡ及びサンプルＡを希釈した緩衝液が、ピペット５０に取り付けたピペットチップ５１に充填される（図１（Ａ）参照）。次に、ピペットチップ５１に充填されたサンプルＡ及びサンプルＡを希釈した緩衝液は、核酸精製器具３に注入される（図１（Ｂ）参照）。このとき、核酸精製器具３は、イオン交換樹脂１０を内部に保持している。そのため、サンプルＡに含まれる夾雑物は、イオン交換樹脂１０により吸着される。
【００３１】
最後に、夾雑物がイオン交換樹脂１０により吸着されることで精製されたサンプルＡは、イオン交換樹脂１０を通過して核酸精製器具３の下部に貯留される（図１（Ｃ）参照）。
【００３２】
図１（Ａ）〜（Ｃ）に示した工程後、サンプルＡについては、核酸増幅反応をすることが可能である。例えば、サンプルＡを固相化した核酸増幅試薬に添加して核酸増幅反応をすることが可能である。また、本実施形態では、サンプルをイオン交換樹脂１０により脱塩することにより、二重らせんＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにし、核酸増幅反応前にＤＮＡの変性を適宜行うことも可能である。
【００３３】
ここで、図２及び図３を参照しながら、サンプルＡに含まれる夾雑物がイオン交換樹脂１０により吸着される状態（図１（Ｂ）中、（Ｉ）で示す部分）について、より詳細に説明する。図２は、図１（Ｂ）において、特に第１の陽イオン交換樹脂が夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。図３は、図１（Ｂ）において、特に第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【００３４】
まず、図２を参照しながら、イオン交換樹脂１０に含まれる第１の陽イオン交換樹脂２０が、サンプルＡに含まれる夾雑物を吸着する状態を説明する。なお、図２において、符号Ｂで示されるものは、サンプルＡに含まれる核酸であり、符号Ｃで示されるものは、サンプルＡに含まれる夾雑物の一例であるタンパク質である。また、ここでは、第１の陽イオン交換樹脂２０については、対イオンとしてナトリウムイオン（Ｎａ＋）を有する強酸性陽イオン交換樹脂とする。
【００３５】
第１の陽イオン交換樹脂２０は、ＳＯ３−等のアニオン２１と、対イオンであるＮａ＋２２とを有する。また、第１の陽イオン交換樹脂２０には、タンパク質Ｃを吸着する領域２３が形成される。
【００３６】
図２に示すように、核酸精製器具３内に通流されたサンプルＡに含まれるタンパク質Ｃは、正に帯電しているため、表面にアニオン２１を有する第１の陽イオン交換樹脂２０に吸着される。例えば、タンパク質Ｃは、領域２３に吸着される。一方、核酸Ｂは、負に帯電しているため、第１の陽イオン交換樹脂２０に吸着されることなく、サンプルＡに含まれる緩衝液等の流れに誘導されて流されていく。また、第１の陽イオン交換樹脂２０の対イオンはＮａ＋２２であるため、対イオンがＨ＋である場合に比べ、金属塩については吸着しづらく（脱塩しづらく）、タンパク質Ｃを選択的に吸着することが可能である。
【００３７】
この際、サンプルＡについては、サンプルＡを希釈する緩衝液のｐＨを４〜８にしておくことが好ましい。サンプルＡを希釈する緩衝液のｐＨを４〜８にしておく（酸性にしておく）ことで、より安定に、核酸Ｂを負に帯電させつつ、夾雑物（主にタンパク質Ｃ）のみを正に帯電させておくことが可能になる。そのため、タンパク質Ｃのみを第１の陽イオン交換樹脂２０に安定に吸着させ、核酸Ｂをより高効率に精製することができる。また、第１の陽イオン交換樹脂２０が強酸性陽イオン交換樹脂であることで、第１の陽イオン交換樹脂２０は広範囲のｐＨ条件下（例えば、ｐＨ：３〜１３）で負電荷を有していることが可能である。そのため、上述したように、サンプルを酸性にしておいても、タンパク質Ｃを第１の陽イオン交換樹脂２０に安定に吸着させることが可能になる。更に、サンプルＡのｐＨを４〜８にしておく（酸性にしておく）ことで、ＲＮＡ分解酵素の活性を抑えることができるため、ＲＮＡを好適に精製可能である。
【００３８】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量は、サンプルＡに含まれるタンパク質Ｃが領域２３に取り込まれる程度に規定されていることが好ましい。より具体的には、第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量は、５０００以上であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量が５０００以上であることで、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００３９】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４０】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の粒子自体の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の比重が０．５以上２．５以下であることでも、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００４１】
次に、図３を参照しながら、イオン交換樹脂１０に含まれる陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０によりサンプルＡに含まれる夾雑物を吸着する状態を説明する。
【００４２】
図３において、符号Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３で示されるものは、サンプルＡに含まれる夾雑物の一例である金属塩が有するカチオン又はアニオンである。本実施形態では、特に限定されるものではないが、ここでは、Ｄ１を塩化物イオン等のアニオンとし、Ｄ２をナトリウムイオン等のカチオンとし、Ｄ３をマグネシウムイオン等のカチオンとする。
【００４３】
まず、図３を参照しながら、陰イオン交換樹脂３０が夾雑物（主に塩化物イオンＤ１等のアニオン）を吸着する状態について説明する。本実施形態において、陰イオン交換樹脂３０については、対イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ−）を有するＩ型の強塩基性陰イオン交換樹脂とする。
【００４４】
陰イオン交換樹脂３０は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３＋等のカチオン３１と、対イオンであるＯＨ−３２とを有する。また、陰イオン交換樹脂３０には、塩化物イオンＤ１等のアニオンを吸着する領域３３が形成される。
【００４５】
図３に示すように、核酸精製器具３に通流されたサンプルＡに含まれる塩化物イオンＤ１は、負に帯電しているため、表面にカチオン３１を有する陰イオン交換樹脂３０に吸着される。例えば、塩化物イオンＤ１は、領域３３に吸着される。一方、核酸Ｂも負に帯電しているものの、核酸Ｂは塩化物イオンＤ１等のアニオンに比べ体積が大きいため、陰イオン交換樹脂３０には吸着されにくい。この点、陰イオン交換樹脂３０の排除限界分子量は、１００以上２０００以下であることが好ましい。陰イオン交換樹脂３０の排除限界分子量が１００以上２０００以下であることで、より精度良く、核酸Ｂの吸着を抑制し、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４６】
また、陰イオン交換樹脂３０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、より精度良く、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４７】
また、陰イオン交換樹脂３０の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。陰イオン交換樹脂３０の比重が０．５以上２．５以下であることでも、より精度良く、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００４８】
次に、図３を参照しながら、第２の陽イオン交換樹脂４０が夾雑物（主にナトリウムイオンＤ２及びマグネシウムイオンＤ３等のカチオン）を吸着する状態について説明する。本実施形態において、第２の陽イオン交換樹脂４０については、対イオンとしてＨ＋イオン（プロトン）を有する強酸性陽イオン交換樹脂とする。
【００４９】
第２の陽イオン交換樹脂４０は、ＳＯ３−等のアニオン４１と、Ｈ＋４２とを有する。また、第２の陽イオン交換樹脂４０には、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンを吸着する領域４３が形成される。
【００５０】
図３に示すように、核酸精製器具３に通流されたサンプルＡに含まれるナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンは、正に帯電しているため、表面にアニオン４１を有する第２の陽イオン交換樹脂４０に吸着される。例えば、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３は、領域４３に吸着される。一方、核酸Ｂは、負に帯電しているため、第２の陽イオン交換樹脂４０に吸着されることなく、サンプルＡに含まれる緩衝液等の流れに誘導されて流されていく。
【００５１】
ここで、第２の陽イオン交換樹脂４０は、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも排除限界分子量が低い。そのため、単位体積当たりの表面積が大きくなり、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも脱塩しやすくなる。また、第２の陽イオン交換樹脂４０が対イオンとしてプロトンを有する場合、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも脱塩しやすくなる。好ましくは、第２の陽イオン交換樹脂４０の排除限界分子量は、１００以上２０００以下である。第２の陽イオン交換樹脂４０の排除限界分子量が１００以上２０００以下であることでナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着をより精度良く行うことが可能になる。
【００５２】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、より精度良く、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着を行うことが可能になる。更に、第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径は、１μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径が１μｍ以上２０００μｍ以下であることで、溶液をイオン交換樹脂に通液させるときの圧力を低く抑えることが可能になる。
【００５３】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の比重は、０．５以上２．５以下であることでも、より精度良く、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着を行うことが可能になる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００５４】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０に対する陰イオン交換樹脂３０のイオン交換容量の割合は５０％〜１５０％であることが好ましい。上記イオン交換容量の割合が５０％〜１５０％であることで、サンプルのｐＨの変動をより安定に抑制しつつ脱塩することが可能になる。
【００５５】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０に対する陰イオン交換樹脂３０の用量の割合は５０％〜１５０％であることが好ましい。上記用量の割合が５０％〜１５０％であることでも、サンプルのｐＨの変動をより安定に抑制しつつ脱塩することが可能になる。
【００５６】
また、図２及び図３には図示していないが、核酸Ｂがイオン交換樹脂により吸着されることを抑制するために、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等の非イオン性界面活性剤がサンプルＡ中に適宜添加されることが好ましい。また、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルセルロース等の非イオン性親水性高分子化合物等の非イオン性化合物もサンプルＡ中に適宜添加されることが好ましい。
【００５７】
以上、説明してきた本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法によれば、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂からなるイオン交換樹脂１０を吸着担体として用いることで、サンプルに含まれる夾雑物を吸着することができる。例えば、サンプルとして血液試料等を用いる場合には、複雑な前処理工程を介さず、直接吸着工程を行うことができる。このように、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、非常に簡便な操作で、短時間に高効率で核酸を抽出することができる。また、このような核酸精製方法については、数秒間の時間で全工程を行うことが可能であり、短時間で核酸を精製することができる。
【００５８】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、例えば、シリカ固相抽出のように洗浄工程を含まないものであるため、微量のサンプル量で操作を行うことができ、装置の小型化も実現できる。また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、サンプルを酸性条件下（好ましくは、ｐＨ：４〜８）で夾雑物の吸着処理を行うことが可能である。すなわち、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、サンプルをアルカリ性にしたり、加熱したりする工程を要しない。そのため、サンプルにＲＮＡが含まれる場合にはＲＮＡの分解を抑制しつつ、サンプルの精製を行うこともできる。また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、酸性領域で超音波破砕を行うことにより、ＲＮａｓｅの働きを抑制することもできる。
【００５９】
また、固相化した核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応をする場合にはサンプルを希釈しないため、夾雑物による核酸増幅反応に対する阻害が顕著に表れることになる。しかしながら、本実施形態に係る核酸精製方法により精製したサンプルでは、サンプルに存在していた夾雑物が除去されているため、核酸を直接固相化した核酸増幅試薬に添加して核酸増幅反応を行うことができる。
【００６０】
また、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法によれば、陽イオン交換樹脂として、第１の陽イオン交換樹脂と、該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いることが可能である。そのため、サンプル中の夾雑物に、金属塩及びタンパク質が含まれている場合にも、双方を効率的に除去することができる。
【００６１】
本実施形態に係る核酸精製方法によるサンプル中の夾雑物の吸着・除去については、第１の陽イオン交換樹脂及び第２の陽イオン交換樹脂が強酸性陽イオン交換樹脂である場合、より効率的である。また、第１の陽イオン交換樹脂の対イオンがＮａ＋である場合や第２の陽イオン交換樹脂の対イオンがＨ＋である場合には、より効率的に夾雑物を除去できる。
【００６２】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、陰イオン交換樹脂が強塩基性陽イオン交換樹脂である場合、より効率的に夾雑物を除去できる。また、陰イオン交換樹脂の対イオンがＯＨ−である場合、より効率的に夾雑物を除去できる。
【００６３】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、第２の陽イオン交換樹脂に対する陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合を、５０％〜１５０％とすることで、サンプルのｐＨの変動を抑制することができる。そのため、上述したように、例えば、サンプルにＲＮＡが含まれる場合にはＲＮＡの分解を抑制しつつ、サンプルの精製を行うこともできる。
【００６４】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、非イオン性界面活性剤や非イオン性親水性高分子化合物等のノニオン性化合物を用いることが可能である。この場合、核酸がイオン交換樹脂のマトリクスに吸着することを抑制し、効率的に夾雑物を除去することができる。
【００６５】
２．本技術の第２実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
図４（Ａ）〜（Ｃ）は、本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【００６６】
図４（Ａ）中、符号１０１で示す核酸精製用キットは、イオン交換樹脂１０と、イオン交換樹脂１０に内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具３とを含む。イオン交換樹脂１０については、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とを用いる。そして、本実施形態に係る核酸精製用キット１０１では、陽イオン交換樹脂に、第１の陽イオン交換樹脂２０と、第２の陽イオン交換樹脂４０とを用いる。
【００６７】
本実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法は、本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法と比し、第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に対し、上層（サンプルが注入される側）に収容されている状態で核酸の精製が行われるという点が主に異なる。そのため、本実施形態では、第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に対し、上層に設けられているという点について主に説明する。
【００６８】
本実施形態に係る核酸精製方法では、核酸精製器具３に第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０よりも上層側に収容されている。そのため、上層側から注入されるサンプルＡは、第１の陽イオン交換樹脂２０にまず接触する（図４（Ｂ）参照）。
【００６９】
次いで、第１の陽イオン交換樹脂２０により夾雑物の一部が除去されたサンプルＡは、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に接触する。なお、サンプルＡの夾雑物に含まれるタンパク質が第１の陽イオン交換樹脂２０により吸着される状態（図４（Ｂ）中、（ＩＩ）で示す部分）については、図２を参照しながら説明した第１の陽イオン交換樹脂２０がタンパク質を吸着する状態と同様にして説明できる。そのため、ここではその詳細な説明を省略する。また、サンプルＡ中の夾雑物に含まれる金属塩が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０により吸着される状態（図４（Ｂ）中、（ＩＩＩ）で示す部分）についても、図３を参照しながら説明した陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０が金属塩を吸着する状態と同様にして説明できる。そのため、ここではその詳細な説明も省略する。なお、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０については、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０の何れが上層に収容されていてもよいし、夫々が混合されて第１の陽イオン交換樹脂２０の下層に収容されていてもよい。
【００７０】
最後に、イオン交換樹脂１０により夾雑物が吸着された後に、精製されたサンプルＡは、下層に貯留される（図４（Ｃ）参照）。
【００７１】
本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法によれば、第１の陽イオン交換樹脂２０によりサンプルＡ中の夾雑物を吸着してから、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０により夾雑物を吸着する。そのため、本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法によれば、より体積が大きなタンパク質を除去してから、より体積が小さな金属塩を除去することが可能になり、より効率的に夾雑物の除去を行うことができる。
【００７２】
３．核酸抽出方法
次に、本技術の各実施形態に係る核酸精製方法を含む核酸抽出方法について説明する。本技術に係る核酸抽出方法は、核酸増幅反応を行うための前処理として、核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行うものである。
【００７３】
上記各手順については、特に限定されるものではないが、例えば、同一のセル内で全ての手順を行うことが可能である。同一のセル内で各手順を行う場合、超音波処理を行う超音波発生部をセルに設けることが可能である。また、上記セルに、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を収容しておくことが可能である。陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂については、上述した本技術の各実施形態に係る核酸精製方法で用いたイオン交換樹脂１０（第１の陽イオン交換樹脂２０、陰イオン交換樹脂３０、第２の陽イオン交換樹脂４０）を用いることが可能である。また、上記セルに、電気泳動用の負極及び正極を設け、電気泳動をした核酸を堰き止める堰止部（例えば、透析膜、高分子ゲル等）を設けることが可能である。
【００７４】
また、核酸の電気泳動の際に、核酸にアニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入しておくことも可能である。ここで、上記インターカレーターとしては、例えば、スルホ基を官能基として有する化合物が挙げられる。具体的には、上記インターカレーターとしては、例えば、９，１０−アントラキノン−２，６−ジスルホン酸、アントラキノン−１−スルホン酸ナトリウム、アントラキノン−２，７−ジスルホン酸二ナトリウム、アントラキノン−１，５−ジスルホン酸二ナトリウム、アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム等が挙げられる。このように、核酸にアニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入しておくことで、核酸の電気泳動において、核酸の等電点を調節することができる。すなわち、核酸の電気泳動速度を制御しつつ、核酸を濃縮精製することができる。
【００７５】
更に、サンプルに含まれる夾雑物の１つであるタンパク質等のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミン、エチレンジアミン等の化合物と脱水縮合反応させておくことも可能である。脱水縮合反応においては、縮合剤としてカルボジイミド系化合物を用いることが可能である。カルボジイミド系化合物の具体例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はジイソピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等が挙げられる。これにより、核酸の電気泳動の際に、サンプル中にタンパク質が存在する場合であっても、タンパク質中のカルボキシル基と脱水縮合反応をする核酸とタンパク質との等電点の差を大きくすることで、核酸とタンパク質とを精度良く分離することができる。
【００７６】
このように、上記各手順を行うことで、非常に簡便に、高効率に濃縮した核酸を回収することができる。特に、各手順を同一のセル内で行う場合には、他の装置等にサンプルを移す必要がないため、サンプルとして感染性を有する検体等を扱う場合には、操作者に対する感染のリスクを低減することができる。
【００７７】
なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。
（２）前記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が小さな第２の陽イオン交換樹脂とを用いる、前記（１）記載の核酸精製方法。
（３）前記第１の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、前記（２）記載の核酸精製方法。
（４）上層に前記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、前記（２）又は（３）に記載の核酸精製方法。
（５）前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、前記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０である、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（６）前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（７）前記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋である、前記（２）〜（６）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（８）前記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋である、前記（２）〜（７）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（９）前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１０）前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−である、前記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１１）前記第２の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％である、前記（２）〜（１０）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１２）非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を用いて前記物質を吸着する、前記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１３）前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、前記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１４）核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法。
（１５）アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、前記（１４）記載の核酸抽出方法。
（１６）前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、前記（１４）又は（１５）に記載の核酸抽出方法。
（１７）陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂と、前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キット。
【実施例】
【００７８】
１．強酸性陽イオン交換樹脂による吸着処理の核酸精製能に対する影響
＜試験例１＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm, Millipore製)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）)を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)（（株）同仁化学研究所製）を調製し、BSA (和光純薬工業（株）製)を0.5質量%となるように加え、さらにCy3修飾した20merオリゴDNA (Sigma Aldrich Co. 製)を5μMとなるように加えた。このタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。スピンダウンした液をNanoDrop D-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc. 製)にて吸光度測定し、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後の吸光度の違いから、核酸精製能を評価した。BSAの吸光度はProtein A280モードで評価し、核酸の吸光度はmicro arrayモードでCy3の吸光度で評価した。さらに、生体環境下に近づけるため、上記タンパク質−核酸混合溶液に最終濃度が0.09質量%となるようにNaCl (和光純薬工業（株）製)を添加し、同様に強酸性イオン交換樹脂処理をおこなった。
【００７９】
評価結果を図５に示す。図５に示すように、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後のCy3 オリゴ DNAおよびBSA濃度より、核酸の回収率はNaClを含む場合で約100%、NaClを含まない場合で約72%であった。一方、BSAの回収率はNaClを含む場合で約20%、NaClを含まない場合で約14%であった。このことから、強酸性陽イオン交換樹脂処理をすることにより、タンパク質−核酸の混在系においても、DNA存在比を向上させられることを確認できた。
【００８０】
また、イオン交換樹脂により夾雑物の吸着処理をしたサンプル、及び当該吸着処理をしていないサンプルの夫々のLAMP反応の結果を図６に示す。LAMP反応については、まず、サンプル、酵素、蛍光色素、核酸モノマー、バッファー、ターゲット核酸鎖増幅用のプライマーセット、リアルタイム測定用のプローブを混合し、LAMP反応液を調製した。各濃度はLoopamp DNA 増幅試薬キット（栄研化学（株）製）およびLoopamp RNA 増幅試薬キット（栄研化学（株）製）に準じて実施した。反応温度は63℃で実施した。LAMP反応は、リアルタイム計測が可能なサーマルサイクラーChromo4（バイオラッド製、米国）を用いて測定を行った。1Cycle を 1min と設定した。プローブは、消光プローブのQPプローブ（J-bio21, 日本: http://www.j-bio21.co.jp/tech/qpmethod.htm（［平成２３年７月１９日］、題目：QP法））を使用しているので、核酸の増幅と共に蛍光強度の低下が観察される。図６に示すように、イオン交換樹脂により夾雑物の吸着処理をしたサンプルでは、核酸増幅反応を検出することができた。なお、以下に記載のLAMP反応は上記と同様の条件で行った。
【００８１】
２．陽イオン交換樹脂の対イオンについての検討
＜試験例２＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）) を100mg計量して入れた。また、スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に上記陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型)を1M HCl溶液に通し、中性になるまで純水で洗浄することで調製した陽イオン交換樹脂（NuviaS H+型）を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)を調製し、BSAを0.5質量%となるように加え、Cy3修飾した20merオリゴDNAを4μMとなるように加え、さらにNaClを0.09質量%となるように加えた。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。夫々の強酸性陽イオン交換樹脂による核酸精製能については、試験例１と同様にして評価した。Na+の濃度についてはHoriba Cardy Sodium Compact Ion Meter (C-122) (（株）堀場製作所製)により測定した。また、pHについては、ポケットpH計S2K712 (ISFETCOM（株）製)により測定した。評価結果を図７に示す。また、評価結果をまとめたものを表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、核酸の回収率が高く、核酸の精製率も高いことが分かった。一方で、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、Na+の濃度が高く、脱塩しづらいことが分かった。
【００８４】
H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、吸着処理後のサンプルのpHが吸着処理前のpHに比べ低下する（酸化する）ことが分かった。これは、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、核酸の負電荷が弱められ、核酸が陽イオン交換樹脂のH+上に非特異的に保持されやすくなり、核酸の回収率が低くなったものと考えられる。
【００８５】
３．塩濃度についての検討
＜試験例３＞
本試験例では、陽イオン交換樹脂によりサンプル中の夾雑物を吸着する際におけるサンプル中の塩濃度の影響について検討した。
【００８６】
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）)を100mg計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、BSAを0.5質量%となるように加え、Cy3修飾した20merオリゴDNAを4μMとなるように加え、更にNaClを3.3、0.9、又は0.33mg/mLとなるように加え、3種類のサンプルを用意した。また、NaClを添加していない以外は、上記3種類のサンプルと同様の条件で作製したサンプルも用意した。これらのサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。夫々のサンプルの核酸精製能については、試験例１、２と同様にして評価した。評価結果をまとめたものを表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
表２に示すように、NaClの濃度が0.33、0.9、3.3mg／mLの場合は、上記濃度が0mg／mLの場合に比べ、核酸の回収率が高くなることが分かった。また、NaClの濃度が0.33、0.9、3.3mg／mLの場合では、核酸回収率はいずれも100%であった。この結果より、血液等のように、内部に塩が存在するサンプルを用いて核酸精製を行う場合には、精製時にサンプルに塩を添加する必要はないものと考えられる。一方、菌等のように、内部に塩が存在しないサンプルを用いて核酸精製を行う場合には、精製時にサンプルに塩を添加することが好ましいものと考えられる。
【００８９】
４．イオン交換樹脂種による脱塩に対する影響
以下、実施例１〜３、及び比較例１、２でイオン交換樹脂種による脱塩に対する影響について検討した。
【００９０】
＜実施例１＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。吸着処理前のNa+の濃度は、0.45mg/mLであり、pHは4.9であった。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を1/10倍に希釈するように加え、サンプルを調製した。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、上記イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。その後、サンプル中のNa+の濃度及びpHを測定した。
【００９１】
＜実施例２＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９２】
＜実施例３＞
実施例２と比し、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:70mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例２と同様にして評価した。
【００９３】
＜比較例１＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mgのみを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９４】
＜比較例２＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mgのみを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９５】
実施例１〜３、及び比較例１、２における評価結果をまとめたものを表３に示す。
【００９６】
【表３】
【００９７】
実施例１、実施例２、及び実施例３では、H＋型の強酸性陽イオン交換樹脂とOH−型の強塩基性陰イオン交換樹脂とを混合したイオン交換樹脂を用いることにより、比較例１及び比較例２に比し、サンプルをより精度良く脱塩できた。また、実施例１、実施例２、及び実施例３では、比較例２に比し、サンプルのpH変化をより精度良く抑制できた。
【００９８】
また、実施例２及び実施例３に示すように、強酸性陽イオン交換樹脂と強塩基性陰イオン交換樹脂との用量を等量としても、又は等イオン交換容量としても、脱塩効果及びpH変化の抑制を実現できることが示唆された。
【００９９】
５．脱塩によるLAMP反応及びRT-LAMP反応に対する影響
以下、実施例４、５、及び比較例３〜５で脱塩処理によるLAMP反応及びRT-LAMP反応に対する影響について検討した。
【０１００】
＜実施例４＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にNaClを0.9mg／mLとなるように加えた。得られたサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。ＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応については、試験例１と同様の方法にして行った。
【０１０１】
＜実施例５＞
実施例４と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０２】
＜比較例３＞
実施例４と比し、サンプルとしてNaClを添加していないものを用い、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０３】
＜比較例４＞
実施例４と比し、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０４】
＜比較例５＞
実施例４と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））：50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mgを用いた以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０５】
実施例４、５、及び比較例３〜５における評価結果をまとめたものを図８及び図９に示す。実施例４、実施例５、及び比較例４から、イオン交換樹脂によりサンプルの脱塩を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応におけるTt値が小さくなることが分かった。実施例４、実施例５、及び比較例４から、イオン交換樹脂によりサンプルの脱塩を行うことで、LAMP反応の進行が良好になることが示唆された。また、実施例４及び実施例５から、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)をイオン交換樹脂として用いることによるLAMP反応への影響は小さいことが分かった。これは、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)をイオン交換樹脂として用いても、サンプルの脱塩に対する影響は小さいことによるものと考えられる。また、比較例４及び比較例５では、LAMP反応の進行を良好にしづらいことが分かった。LAMP反応の進行を良好にするには、サンプルの脱塩を十分に行う必要があることが示唆された。
【０１０６】
６．添加剤についての検討
以下、実施例６及び実施例７で添加剤（Brij35及びEDTA）の影響について検討した。
＜実施例６＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積％となるように加え、EDTAを1mMとなるように加えた。得られた核酸を含有するサンプルについて、実施例４と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１０７】
＜実施例７＞
実施例６に比し、Brij35及びEDTAをサンプルに添加していないという点以外は、実施例６と同様にして評価を行った。
【０１０８】
実施例６及び実施例７における評価結果を図１０及び図１１に示す。また、評価結果をまとめたものを表４に示す。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
実施例６では、イオン交換樹脂によりサンプルの夾雑物の吸着処理を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応のいずれにおいても、吸着処理前に比べTt値が小さくなることが分かった。一方、実施例７では、イオン交換樹脂によりサンプルの夾雑物の吸着処理を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応のいずれにおいても、吸着処理前に比べTt値が大きくなることが分かった。これは、実施例６では、実施例７に比べ、サンプルにBrij35及び1mM EDTAを添加したことで、核酸の回収率が高くなったことによるものと考えられる。
【０１１１】
７．界面活性剤／親水性高分子についての検討
以下、実施例８〜１１で、界面活性剤／親水性高分子の影響について検討した。
＜実施例８＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））：50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積％となるように加えた。実施例７では、サンプルに非イオン界面活性剤又は非イオン性親水性高分子を加えなかった。得られた核酸を含有するサンプルについて、試験例１と同様に、核酸回収率を評価した。
【０１１２】
＜実施例９＞
実施例８に比し、イオン交換樹脂による吸着処理の前のサンプルに非イオン性界面活性剤としてBrij35を0.5体積％となるように添加したという点以外は、実施例８と同様にして評価を行った。
【０１１３】
＜実施例１０＞
実施例９に比し、非イオン性界面活性剤として、Brij35の代わりに、Tween20を用いたという点以外は、実施例９と同様にして評価を行った。
【０１１４】
＜実施例１１＞
実施例９に比し、Brij35の代わりに、非イオン性親水性高分子であるPEG20000を用いたという点以外は、実施例９と同様にして評価を行った。
【０１１５】
実施例８〜１１における評価結果を表５に示す。
【０１１６】
【表５】
【０１１７】
実施例７に比べ、実施例８〜１０では核酸の回収率がいずれも高く、非イオン界面活性剤（Brij35、Tween20）又は非イオン性親水性高分子（PEG20000）をサンプルに添加してサンプルの吸着処理を行うことで、核酸の回収率が上がることが実証された。
【０１１８】
８．本技術に係る吸着処理とゼオライトによる吸着処理との比較
以下、実施例１２及び比較例６で本技術に係る吸着処理とゼオライトによる吸着処理との比較実験を行った。
＜実施例１２＞
実施例７で用いたサンプルと同様にして調製したサンプルを準備した。同様の組成の３サンプル夫々について３回ずつ、実施例７と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１１９】
＜比較例６＞
50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を5体積%加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、サンプルを調製した。次いで、サンプルを熱アルカリ処理し、ゼオライトで夾雑物の吸着処理を行った。得られた同様の組成の３サンプル夫々について３回ずつ、実施例４と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１２０】
実施例１２及び比較例６における評価結果を図１２（LAMP反応）及び図１３（RT-LAMP反応）に示す。実施例１２及び比較例６から、ゼオライトでサンプルの夾雑物の吸着処理を行った場合よりも、イオン交換樹脂でサンプルの夾雑物の吸着処理を行った場合の方が、核酸増幅反応の進行を良好なものにすることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本技術に係る核酸精製方法は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を抽出することができる。従って、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応のための核酸精製処理に適用され、核酸が微量あるいは極低濃度でしか含まれないサンプル中の核酸を精製するために用いられ得る。
【符号の説明】
【０１２２】
１、１０１：核酸精製用キット、３：核酸精製器具、１０：イオン交換樹脂、２０：第１の陽イオン交換樹脂、３０：陰イオン交換樹脂、４０：第２の陽イオン交換樹脂
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キットに関する。より詳しくは、イオン交換樹脂により夾雑物を吸着することで核酸を精製する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。例えば、医学分野では、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列に基づいた診断が行われており、農業分野では遺伝子組み換え作物の判定等でＤＮＡ鑑定が活用されている。
【０００３】
核酸増幅反応では、微量サンプル中の核酸を高効率に増幅して検出できる。しかし、サンプルに含まれる核酸が極めて微量である場合には、検出下限量未満となる場合がある。さらに、サンプル中の核酸濃度が極めて低い場合には、反応場へ導入可能な容積のサンプル中に増幅対象核酸が含まれなかったために検出が不能となる場合がある。これらの場合には、予め精製や濃縮等をして抽出した核酸を反応場に導入することが有効となる。
【０００４】
ここで、核酸の精製という点に着目すると、従来、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法が知られている。また、核酸吸着能を有する多孔質担体を用いた核酸の精製方法も知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−０８０５５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０６０８４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のフェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法は、有害な有機溶媒を使用する必要があり、遠心分離操作等に手間がかかっていた。また、核酸吸着能を有する多孔質担体を用いた核酸の精製方法においては、複数の工程を行う必要があり、操作の簡便性からも課題があった。そのため、操作がより簡便であり、短時間で高効率に核酸を精製することができる方法が希求されていた。
【０００７】
そこで、本技術は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を精製することができる核酸精製方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本技術は、核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、上記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法を提供する。上記陽イオン交換樹脂により、サンプルに含まれる正電荷を有するタンパク質や金属塩等のカチオンを吸着することが可能になる。また、上記陰イオン交換樹脂により、サンプルに含まれる主に核酸以外の負電荷を有するアニオンを吸着することが可能になる。
また、上記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いることが好ましい。ここで、排除限界分子量とは、イオン交換樹脂に吸着させようとした種々の化合物において、イオン交換樹脂の細孔内に侵入しづらくなる化合物、すなわちイオン交換樹脂の細孔内に吸着されづらくなる化合物のうち、最も低い分子量をもつものの分子量をいう。換言すれば、当該排除限界分子量より高い分子量を有する化合物については、イオン交換樹脂に吸着されづらくなる。
上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が高い上記第１の陽イオン交換樹脂が、上記タンパク質を選択的に吸着しやすくなる。また、上記陽イオン交換樹脂のうち、より排除限界分子量が低い上記第２の陽イオン交換樹脂が、主に金属塩等のカチオンを選択的に吸着しやすくなる。
また、上記第１の陽イオン交換樹脂により上記物質を吸着してから、上記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより上記物質を吸着することが好ましい。この場合、例えば、上層に上記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に上記陰イオン交換樹脂と上記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの上記上層側から上記サンプルを流入してもよい。このように、サンプル中の物質について、まず第１の陽イオン交換樹脂によりサンプル中のタンパク質を主に選択的に吸着し、次いで第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂によりサンプル中の金属塩を主に選択的に吸着することで、よりサンプル中の物質の吸着効率は向上する。
また、上記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であってもよく、上記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０であることが好ましい。
また、上記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋（ナトリウムイオン）であることが好ましい。また、上記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋（プロトン）であることが好ましい。
また、上記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂であることが好ましい。また、上記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−（水酸化物イオン）であることが好ましい。
また、上記第２の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％であることが好ましい。ここで、イオン交換容量とは、イオン交換樹脂の単位量当たりの交換基の総数のことを指す。例えば、第２の陽イオン交換樹脂の対イオンがＨ＋である場合、イオン交換容量とは、第２の陽イオン交換樹脂１ｍｌ中に含まれるＨ＋の総数のことを指す。上記第２の陽イオン交換樹脂に対する上記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合が、５０％〜１５０％であることで、イオン交換樹脂によるサンプルに含まれる物質の吸着をする前とその後のｐＨの変動をより安定に抑制することが可能になる。
また、上記核酸精製方法では、サンプルに非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を添加して上記物質を吸着することがより好ましい。サンプルに非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を添加することで、核酸の樹脂に対する物理的な吸着を抑制することが可能になる。
上記物質は、例えば、夾雑物である。当該夾雑物は、例えば、タンパク質と金属塩とを含有する。また、夾雑物は、タンパク質や金属塩の他にサンプル中の核酸の分析において不要な、種々のペプチド、糖、塩、低分子アニオン（例えば、フマル酸、フタル酸、フミン酸、フルボ酸）等の物質を含有していてもよい。
【０００９】
また、上記課題解決のため、本技術は、核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法を提供する。
上記電気泳動は、アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について行われてもよい。また、上記電気泳動は、上記サンプルと、上記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、上記脱水縮合反応の縮合剤と、を混合して、上記核酸について行われてもよい。
【００１０】
また、本技術は、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂と、前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を抽出することができる核酸精製方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【図２】本技術の第１実施形態に係る第１の陽イオン交換樹脂により夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【図３】本技術の第１実施形態に係る第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【図４】本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【図５】陽イオン交換樹脂による吸着処理後の核酸回収率を示すグラフである（試験例１）。
【図６】陽イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（試験例１）。
【図７】陽イオン交換樹脂の対イオン種（Ｎａ＋、Ｈ＋）の核酸回収率に対する影響を検討した結果を示すグラフである（試験例２）。
【図８】イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例４、５）
【図９】イオン交換樹脂による吸着処理後のサンプルのＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例４、５）
【図１０】イオン交換樹脂による吸着処理後のＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例６）
【図１１】イオン交換樹脂による吸着処理後のＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果（Ｔｔ値）を示すグラフである（実施例７）
【図１２】サンプルのＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例１２）。
【図１３】サンプルのＲＴ−ＬＡＭＰ反応の結果を示すグラフである（実施例１２）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
（１）核酸精製用キット
（２）核酸精製方法
２．本技術の第２実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
３．核酸抽出方法
【００１４】
１．本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
（１）核酸精製用キット
まず、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法に用いる核酸精製用キットについて、図１（Ａ）を参照しながら説明する。図１（Ａ）〜（Ｃ）は、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【００１５】
図１（Ａ）中、符号１で示す核酸精製用キットは、サンプルに含まれる核酸以外の物質（以下、夾雑物と記す）を吸着し、核酸を精製する。核酸精製用キット１は、イオン交換樹脂１０と、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具３とを主に有する。なお、本技術で用いるサンプルとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ぬぐい液、口腔スワブ、唾液、血清、血漿、末梢血単球細胞、脳脊髄液、糞、尿、培養細胞、生検組織等の生体試料が挙げられる。また、サンプルとしては、生体試料の他に、河川水、海水、土壌等も挙げられる。
【００１６】
核酸精製器具３は、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、サンプルを流通させる。核酸精製器具３については、イオン交換樹脂１０を内部に保持し、サンプルを流通可能であれば、形状や材質等は特に限定されるものではない。例えば、核酸精製器具３としては、図１（Ａ）に示すように、上部が開口した形状を有する市販のサンプル管やチップ等を用いることが可能である。また、核酸精製器具３は、例えば、上部及び下部が開口した筒状に形成されていてもよい。この場合には、サンプルを核酸精製器具３に流通し、イオン交換樹脂１０によりサンプルを吸着した後に、下部から流れ出るサンプルを回収するために、別途チップ等を用いることが可能である。
【００１７】
本技術に係るイオン交換樹脂１０は、サンプルに含まれる夾雑物を吸着する。イオン交換樹脂１０は、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とを含む。なお、上記夾雑物は、例えば、タンパク質と金属塩とを含有する。また、夾雑物は、タンパク質や金属塩の他にサンプル中の核酸の分析において不要な、種々のペプチド、糖、塩、低分子アニオン（例えば、フマル酸、フタル酸、フミン酸、フルボ酸）等の物質を含有していてもよい。
【００１８】
上記陽イオン交換樹脂は、カチオン性の夾雑物を主に吸着する。陽イオン交換樹脂は、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを含むことが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂は、サンプルに含まれるタンパク質を主に吸着するために用いられる。第２の陽イオン交換樹脂は、サンプルに含まれる金属イオン等の陽イオン（カチオン）を主に吸着するために用いられる。
【００１９】
第１の陽イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれるタンパク質を吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。このとき、第１の陽イオン交換樹脂は、ＳＯ３−を固定イオンとすることが好ましい。また、対イオンとしては、特に限定されるものではなく、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、プロトン（Ｈ＋）等が挙げられる。この点、これらのイオンを用いた場合のイオンを交換する強さ（イオンの選択性）の順序は、Ｃａ２＋＞Ｃｕ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｍｇ２＋＞Ｋ＋＞ＮＨ４＋＞Ｎａ＋＞Ｈ＋である。従って、イオン交換する強さを考慮すると、対イオンは、Ｈ＋であることが好ましい。一方で、対イオンがＨ＋である場合、サンプルのｐＨが酸性側にシフトしやすい。これに対し、対イオンがＮａ＋である場合、対イオンがＨ＋である場合よりも、金属塩を吸着する機能は弱くなるものの、サンプルのｐＨの変動を抑制することが可能である。また、対イオンがＮａ＋である場合であっても、第１の陽イオン交換樹脂はタンパク質を十分に吸着することができる。そのため、第１の陽イオン交換樹脂は、Ｎａ＋を対イオンとして有する強酸性陽イオン交換樹脂（Ｎａ＋型強酸性陽イオン交換樹脂）であることが好ましい。
【００２０】
第２の陽イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれる金属塩等のカチオンを吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強酸性陽イオン交換樹脂であることが好ましい。このとき、第２の陽イオン交換樹脂は、ＳＯ３−を固定イオンとすることが好ましい。また、対イオンとしては、特に限定されるものではないが、上述したイオンを交換する強さ（イオンの選択性）の順序を考慮すると、第２の陽イオン交換樹脂の対イオンはプロトン（Ｈ＋）であることがより好ましい。
【００２１】
陰イオン交換樹脂は、サンプルに含まれる陰イオン（アニオン）を吸着する。陰イオン交換樹脂としては、サンプルに含まれる金属塩等のアニオンを吸着することが可能であれば、特に限定されるものではないが、強塩基性陰イオン交換樹脂であることが好ましい。また、陰イオン交換樹脂は、例えば、トリメチルアンモニウム基を持つＩ型及びジメチルエタノールアンモニウム基を持つＩＩ型の強塩基性陰イオン交換樹脂のうちのいずれとすることも可能である。ここで、Ｉ型においては、陰イオンを交換吸着する強さ（イオンの選択性）の順序は、ＨＳＯ４−＞ＮＯ３−＞Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞ＨＣＯ３−＞ＨＣＯＯ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｆ−＞ＯＨ−となる。また、ＩＩ型においては、陰イオンを交換吸着する強さ（イオンの選択性）の順序は、ＨＳＯ４−＞ＮＯ３−＞Ｂｒ−＞Ｃｌ−＞ＨＣＯ３−＞ＯＨ−＞ＨＣＯＯ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｆ−となる。そして、上記Ｉ型及びＩＩ型の陰イオン交換樹脂のうち、Ｉ型の方が塩化物イオン（Ｃｌ−）等をより精度良く吸着することが可能である。そのため、陰イオン交換樹脂は、Ｉ型であり、対イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ−）を有することが好ましい。
【００２２】
また、核酸精製用キット１には、夾雑物の吸着と共に核酸を吸着しないように、非イオン性界面活性剤や非イオン性親水性高分子化合物等の非イオン性化合物等の添加剤が含まれていてもよい。非イオン性化合物としては、例えば、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。また、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルセルロース等の非イオン性親水性高分子化合物も挙げられる。これらの例示した非イオン性化合物は、単独で用いてもよいし、複数種組み合わせて用いてもよい。更に、核酸精製用キット１には、ＥＤＴＡ等のキレート添加剤が含まれていてもよい。
【００２３】
また、核酸精製用キット１には、緩衝液が含まれていてもよい。かかる緩衝液用の緩衝剤としては、例えば、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳ(ｐＨ：３．９〜５．１、ｐＫａ：４．５５)、ＭＥＳ（ｐＨ：５．５〜７．０、ｐＫａ：６．１５）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ：５．７〜７．３、ｐＫａ：６．４６）、ＡＤＡ（ｐＨ：５．８〜７．４、ｐＫａ：６．６０）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ：６．１〜７．５、ｐＫａ：６．８０）、ＡＣＥＳ（ｐＨ：６．０〜７．５、ｐＫａ：６．９０）、ＭＯＰＳＯ（ｐＨ：６．２〜７．４、ｐＫａ：６．９５）、ＢＥＳ（ｐＨ：６．６〜８．０、ｐＫａ：７．１５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ：６．５〜７．９，ｐＫａ：７．２０）、ＴＥＳ（ｐＨ：６．８〜８．２、ｐＫａ：７．５０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ：６．８〜８．２、ｐＫａ：７．５５）、ＤＩＰＳＯ（ｐＨ：６．９〜８．１、ｐＫａ：７．６）、ＴＡＰＳＯ（ｐＨ：７．０〜８．２、ｐＫａ：７．７）、ＰＯＰＳＯ（ｐＨ：７．２〜８．５、ｐＫａ：７．８５）、ＨＥＰＰＳＯ（ｐＨ：７．４〜８．６、ｐＫａ：７．９）、ＥＰＰＳ（ｐＨ：７．５〜８．５、ｐＫａ：８．０）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ：７．８〜８．８、ｐＫａ：８．１５）、Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ：７．７〜９．１、ｐＫａ：８．３５）、ＴＡＰＳ（ｐＨ：７．７〜９．１、ｐＫａ：８．４）、ＣＨＥＳ（ｐＨ：８．６〜１０．０、ｐＫａ：９．５）、ＣＡＰＳＯ（ｐＨ：９．３〜１０．７、ｐＫａ：１０．０）、ＣＡＰＳ（ｐＨ：９．７〜１１．１、ｐＫａ：１０．４０）等が挙げられる。なお、上記例示した各緩衝剤のｐＨの範囲は、緩衝液を添加したサンプルのｐＨとして適当な範囲を指す。また、上記例示した各緩衝剤のｐＫａは、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳを除いて２０℃におけるｐＫａを指す（ＨｏｍｏＰＩＰＥＳについては、３７℃におけるｐＫａを示す。）。サンプルを希釈した緩衝液のｐＨは、４〜８であることが好ましい。この点、本実施形態において上記例示した緩衝剤の中では、ＨｏｍｏＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡが好適に用いられる。
【００２４】
（２）核酸精製方法
次に、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法の手順について、図１（Ａ）〜（Ｃ）を参照しながら説明する。
【００２５】
ここで、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法を説明する前に、まず、本技術の関連技術に係る核酸精製方法について説明する。関連技術に係る核酸精製方法としては、ゼオライトを用いてサンプルの夾雑物を吸着する方法を挙げることができる（例えば、特許文献２参照）。
【００２６】
関連技術に係る核酸精製方法では、生体試料等のサンプルに含まれるアニオン及びカチオンのうち、カチオンのみの除去が可能である。そのため、関連技術に係る核酸精製方法では、サンプルの精製により、プロトンが放出されることになり、サンプルを含有する液のｐＨが低下する（より酸性側にシフトする）。この点、サンプルの精製後、核酸増幅反応はｐＨ７〜９で実行される場合があるため、ゼオライトと接触させるサンプルを含有する液のｐＨを予め高めに設定する（アルカリ側に設定する）必要がある。そのため、上記関連技術に係る核酸精製方法では、操作が煩雑になる場合がある。また、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。
【００２７】
また、上記関連技術に係る核酸精製方法は、サンプルをアルカリ性の化合物と界面活性剤（例えば、ＳＤＳ等）との混合試薬で希釈した後に、高温で加熱する工程を含む。そのため、この点からも、上記関連技術に係る核酸精製方法では、操作が煩雑になる場合がある。また、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性もある。
【００２８】
また、上記関連技術に係る核酸精製方法では、サンプルの精製後、サンプル中にアニオンが残留することがある。更に、サンプル中には、アニオン性界面活性剤が含まれていることもある。そのため、サンプルの精製後、核酸を電気泳動させる際に、サンプル中の電解質濃度が高くなり、サンプルが発熱しやすくなる。従って、この点からも、サンプルにＲＮＡが含まれていると、当該ＲＮＡの分解をもたらす可能性がある。更に、発熱によるサンプルの対流の発生により、核酸の電気泳動濃縮の効率が低下する場合もある。
【００２９】
この点、以下に詳述する本技術に係る核酸精製方法は、本願発明者らの鋭意検討の結果見出されたものであり、煩雑な操作を必要とせず、操作を非常に簡便にし、短時間に高効率で核酸を精製可能にした方法である。
【００３０】
本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法では、まず、容器５に収容された核酸を含有するサンプルＡ及びサンプルＡを希釈した緩衝液が、ピペット５０に取り付けたピペットチップ５１に充填される（図１（Ａ）参照）。次に、ピペットチップ５１に充填されたサンプルＡ及びサンプルＡを希釈した緩衝液は、核酸精製器具３に注入される（図１（Ｂ）参照）。このとき、核酸精製器具３は、イオン交換樹脂１０を内部に保持している。そのため、サンプルＡに含まれる夾雑物は、イオン交換樹脂１０により吸着される。
【００３１】
最後に、夾雑物がイオン交換樹脂１０により吸着されることで精製されたサンプルＡは、イオン交換樹脂１０を通過して核酸精製器具３の下部に貯留される（図１（Ｃ）参照）。
【００３２】
図１（Ａ）〜（Ｃ）に示した工程後、サンプルＡについては、核酸増幅反応をすることが可能である。例えば、サンプルＡを固相化した核酸増幅試薬に添加して核酸増幅反応をすることが可能である。また、本実施形態では、サンプルをイオン交換樹脂１０により脱塩することにより、二重らせんＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにし、核酸増幅反応前にＤＮＡの変性を適宜行うことも可能である。
【００３３】
ここで、図２及び図３を参照しながら、サンプルＡに含まれる夾雑物がイオン交換樹脂１０により吸着される状態（図１（Ｂ）中、（Ｉ）で示す部分）について、より詳細に説明する。図２は、図１（Ｂ）において、特に第１の陽イオン交換樹脂が夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。図３は、図１（Ｂ）において、特に第２の陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が夾雑物を吸着する状態を概念的に説明した模式図である。
【００３４】
まず、図２を参照しながら、イオン交換樹脂１０に含まれる第１の陽イオン交換樹脂２０が、サンプルＡに含まれる夾雑物を吸着する状態を説明する。なお、図２において、符号Ｂで示されるものは、サンプルＡに含まれる核酸であり、符号Ｃで示されるものは、サンプルＡに含まれる夾雑物の一例であるタンパク質である。また、ここでは、第１の陽イオン交換樹脂２０については、対イオンとしてナトリウムイオン（Ｎａ＋）を有する強酸性陽イオン交換樹脂とする。
【００３５】
第１の陽イオン交換樹脂２０は、ＳＯ３−等のアニオン２１と、対イオンであるＮａ＋２２とを有する。また、第１の陽イオン交換樹脂２０には、タンパク質Ｃを吸着する領域２３が形成される。
【００３６】
図２に示すように、核酸精製器具３内に通流されたサンプルＡに含まれるタンパク質Ｃは、正に帯電しているため、表面にアニオン２１を有する第１の陽イオン交換樹脂２０に吸着される。例えば、タンパク質Ｃは、領域２３に吸着される。一方、核酸Ｂは、負に帯電しているため、第１の陽イオン交換樹脂２０に吸着されることなく、サンプルＡに含まれる緩衝液等の流れに誘導されて流されていく。また、第１の陽イオン交換樹脂２０の対イオンはＮａ＋２２であるため、対イオンがＨ＋である場合に比べ、金属塩については吸着しづらく（脱塩しづらく）、タンパク質Ｃを選択的に吸着することが可能である。
【００３７】
この際、サンプルＡについては、サンプルＡを希釈する緩衝液のｐＨを４〜８にしておくことが好ましい。サンプルＡを希釈する緩衝液のｐＨを４〜８にしておく（酸性にしておく）ことで、より安定に、核酸Ｂを負に帯電させつつ、夾雑物（主にタンパク質Ｃ）のみを正に帯電させておくことが可能になる。そのため、タンパク質Ｃのみを第１の陽イオン交換樹脂２０に安定に吸着させ、核酸Ｂをより高効率に精製することができる。また、第１の陽イオン交換樹脂２０が強酸性陽イオン交換樹脂であることで、第１の陽イオン交換樹脂２０は広範囲のｐＨ条件下（例えば、ｐＨ：３〜１３）で負電荷を有していることが可能である。そのため、上述したように、サンプルを酸性にしておいても、タンパク質Ｃを第１の陽イオン交換樹脂２０に安定に吸着させることが可能になる。更に、サンプルＡのｐＨを４〜８にしておく（酸性にしておく）ことで、ＲＮＡ分解酵素の活性を抑えることができるため、ＲＮＡを好適に精製可能である。
【００３８】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量は、サンプルＡに含まれるタンパク質Ｃが領域２３に取り込まれる程度に規定されていることが好ましい。より具体的には、第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量は、５０００以上であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の排除限界分子量が５０００以上であることで、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００３９】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４０】
また、第１の陽イオン交換樹脂２０の粒子自体の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の比重が０．５以上２．５以下であることでも、夾雑物中、タンパク質Ｃを特に選択的に吸着し、除去しやすくなる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００４１】
次に、図３を参照しながら、イオン交換樹脂１０に含まれる陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０によりサンプルＡに含まれる夾雑物を吸着する状態を説明する。
【００４２】
図３において、符号Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３で示されるものは、サンプルＡに含まれる夾雑物の一例である金属塩が有するカチオン又はアニオンである。本実施形態では、特に限定されるものではないが、ここでは、Ｄ１を塩化物イオン等のアニオンとし、Ｄ２をナトリウムイオン等のカチオンとし、Ｄ３をマグネシウムイオン等のカチオンとする。
【００４３】
まず、図３を参照しながら、陰イオン交換樹脂３０が夾雑物（主に塩化物イオンＤ１等のアニオン）を吸着する状態について説明する。本実施形態において、陰イオン交換樹脂３０については、対イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ−）を有するＩ型の強塩基性陰イオン交換樹脂とする。
【００４４】
陰イオン交換樹脂３０は、ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３＋等のカチオン３１と、対イオンであるＯＨ−３２とを有する。また、陰イオン交換樹脂３０には、塩化物イオンＤ１等のアニオンを吸着する領域３３が形成される。
【００４５】
図３に示すように、核酸精製器具３に通流されたサンプルＡに含まれる塩化物イオンＤ１は、負に帯電しているため、表面にカチオン３１を有する陰イオン交換樹脂３０に吸着される。例えば、塩化物イオンＤ１は、領域３３に吸着される。一方、核酸Ｂも負に帯電しているものの、核酸Ｂは塩化物イオンＤ１等のアニオンに比べ体積が大きいため、陰イオン交換樹脂３０には吸着されにくい。この点、陰イオン交換樹脂３０の排除限界分子量は、１００以上２０００以下であることが好ましい。陰イオン交換樹脂３０の排除限界分子量が１００以上２０００以下であることで、より精度良く、核酸Ｂの吸着を抑制し、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４６】
また、陰イオン交換樹脂３０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第１の陽イオン交換樹脂２０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、より精度良く、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。
【００４７】
また、陰イオン交換樹脂３０の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。陰イオン交換樹脂３０の比重が０．５以上２．５以下であることでも、より精度良く、塩化物イオンＤ１等のカチオンを選択的に吸着し、除去しやすくなる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００４８】
次に、図３を参照しながら、第２の陽イオン交換樹脂４０が夾雑物（主にナトリウムイオンＤ２及びマグネシウムイオンＤ３等のカチオン）を吸着する状態について説明する。本実施形態において、第２の陽イオン交換樹脂４０については、対イオンとしてＨ＋イオン（プロトン）を有する強酸性陽イオン交換樹脂とする。
【００４９】
第２の陽イオン交換樹脂４０は、ＳＯ３−等のアニオン４１と、Ｈ＋４２とを有する。また、第２の陽イオン交換樹脂４０には、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンを吸着する領域４３が形成される。
【００５０】
図３に示すように、核酸精製器具３に通流されたサンプルＡに含まれるナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンは、正に帯電しているため、表面にアニオン４１を有する第２の陽イオン交換樹脂４０に吸着される。例えば、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３は、領域４３に吸着される。一方、核酸Ｂは、負に帯電しているため、第２の陽イオン交換樹脂４０に吸着されることなく、サンプルＡに含まれる緩衝液等の流れに誘導されて流されていく。
【００５１】
ここで、第２の陽イオン交換樹脂４０は、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも排除限界分子量が低い。そのため、単位体積当たりの表面積が大きくなり、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも脱塩しやすくなる。また、第２の陽イオン交換樹脂４０が対イオンとしてプロトンを有する場合、第１の陽イオン交換樹脂２０よりも脱塩しやすくなる。好ましくは、第２の陽イオン交換樹脂４０の排除限界分子量は、１００以上２０００以下である。第２の陽イオン交換樹脂４０の排除限界分子量が１００以上２０００以下であることでナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着をより精度良く行うことが可能になる。
【００５２】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径は、１μｍ以上３０００μｍ以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径が１μｍ以上３０００μｍ以下であることでも、より精度良く、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着を行うことが可能になる。更に、第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径は、１μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の平均体積粒子径が１μｍ以上２０００μｍ以下であることで、溶液をイオン交換樹脂に通液させるときの圧力を低く抑えることが可能になる。
【００５３】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０の比重は、０．５以上２．５以下であることが好ましい。第２の陽イオン交換樹脂４０の比重は、０．５以上２．５以下であることでも、より精度良く、ナトリウムイオンＤ２やマグネシウムイオンＤ３等のカチオンの吸着を行うことが可能になる。さらに、粒子自体の比重は１．０以上２．５以下であることがより好ましい。上記比重が１．０以上２．５以下であることで、粒子が溶液中で沈降しやすくなることにより、容易に溶液から粒子を除去することが可能になる。
【００５４】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０に対する陰イオン交換樹脂３０のイオン交換容量の割合は５０％〜１５０％であることが好ましい。上記イオン交換容量の割合が５０％〜１５０％であることで、サンプルのｐＨの変動をより安定に抑制しつつ脱塩することが可能になる。
【００５５】
また、第２の陽イオン交換樹脂４０に対する陰イオン交換樹脂３０の用量の割合は５０％〜１５０％であることが好ましい。上記用量の割合が５０％〜１５０％であることでも、サンプルのｐＨの変動をより安定に抑制しつつ脱塩することが可能になる。
【００５６】
また、図２及び図３には図示していないが、核酸Ｂがイオン交換樹脂により吸着されることを抑制するために、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ２０、又はＴｒｉｔｏｎＸ１００等の非イオン性界面活性剤がサンプルＡ中に適宜添加されることが好ましい。また、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルセルロース等の非イオン性親水性高分子化合物等の非イオン性化合物もサンプルＡ中に適宜添加されることが好ましい。
【００５７】
以上、説明してきた本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法によれば、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂からなるイオン交換樹脂１０を吸着担体として用いることで、サンプルに含まれる夾雑物を吸着することができる。例えば、サンプルとして血液試料等を用いる場合には、複雑な前処理工程を介さず、直接吸着工程を行うことができる。このように、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、非常に簡便な操作で、短時間に高効率で核酸を抽出することができる。また、このような核酸精製方法については、数秒間の時間で全工程を行うことが可能であり、短時間で核酸を精製することができる。
【００５８】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、例えば、シリカ固相抽出のように洗浄工程を含まないものであるため、微量のサンプル量で操作を行うことができ、装置の小型化も実現できる。また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、サンプルを酸性条件下（好ましくは、ｐＨ：４〜８）で夾雑物の吸着処理を行うことが可能である。すなわち、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、サンプルをアルカリ性にしたり、加熱したりする工程を要しない。そのため、サンプルにＲＮＡが含まれる場合にはＲＮＡの分解を抑制しつつ、サンプルの精製を行うこともできる。また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、酸性領域で超音波破砕を行うことにより、ＲＮａｓｅの働きを抑制することもできる。
【００５９】
また、固相化した核酸増幅試薬を用いて核酸増幅反応をする場合にはサンプルを希釈しないため、夾雑物による核酸増幅反応に対する阻害が顕著に表れることになる。しかしながら、本実施形態に係る核酸精製方法により精製したサンプルでは、サンプルに存在していた夾雑物が除去されているため、核酸を直接固相化した核酸増幅試薬に添加して核酸増幅反応を行うことができる。
【００６０】
また、本技術の第１実施形態に係る核酸精製方法によれば、陽イオン交換樹脂として、第１の陽イオン交換樹脂と、該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いることが可能である。そのため、サンプル中の夾雑物に、金属塩及びタンパク質が含まれている場合にも、双方を効率的に除去することができる。
【００６１】
本実施形態に係る核酸精製方法によるサンプル中の夾雑物の吸着・除去については、第１の陽イオン交換樹脂及び第２の陽イオン交換樹脂が強酸性陽イオン交換樹脂である場合、より効率的である。また、第１の陽イオン交換樹脂の対イオンがＮａ＋である場合や第２の陽イオン交換樹脂の対イオンがＨ＋である場合には、より効率的に夾雑物を除去できる。
【００６２】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、陰イオン交換樹脂が強塩基性陽イオン交換樹脂である場合、より効率的に夾雑物を除去できる。また、陰イオン交換樹脂の対イオンがＯＨ−である場合、より効率的に夾雑物を除去できる。
【００６３】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、第２の陽イオン交換樹脂に対する陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合を、５０％〜１５０％とすることで、サンプルのｐＨの変動を抑制することができる。そのため、上述したように、例えば、サンプルにＲＮＡが含まれる場合にはＲＮＡの分解を抑制しつつ、サンプルの精製を行うこともできる。
【００６４】
また、本実施形態に係る核酸精製方法によれば、非イオン性界面活性剤や非イオン性親水性高分子化合物等のノニオン性化合物を用いることが可能である。この場合、核酸がイオン交換樹脂のマトリクスに吸着することを抑制し、効率的に夾雑物を除去することができる。
【００６５】
２．本技術の第２実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法
図４（Ａ）〜（Ｃ）は、本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法の手順を説明するための模式図である。
【００６６】
図４（Ａ）中、符号１０１で示す核酸精製用キットは、イオン交換樹脂１０と、イオン交換樹脂１０に内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具３とを含む。イオン交換樹脂１０については、陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂とを用いる。そして、本実施形態に係る核酸精製用キット１０１では、陽イオン交換樹脂に、第１の陽イオン交換樹脂２０と、第２の陽イオン交換樹脂４０とを用いる。
【００６７】
本実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法は、本技術の第１実施形態に係る核酸精製用キット及び核酸精製方法と比し、第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に対し、上層（サンプルが注入される側）に収容されている状態で核酸の精製が行われるという点が主に異なる。そのため、本実施形態では、第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に対し、上層に設けられているという点について主に説明する。
【００６８】
本実施形態に係る核酸精製方法では、核酸精製器具３に第１の陽イオン交換樹脂２０が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０よりも上層側に収容されている。そのため、上層側から注入されるサンプルＡは、第１の陽イオン交換樹脂２０にまず接触する（図４（Ｂ）参照）。
【００６９】
次いで、第１の陽イオン交換樹脂２０により夾雑物の一部が除去されたサンプルＡは、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０に接触する。なお、サンプルＡの夾雑物に含まれるタンパク質が第１の陽イオン交換樹脂２０により吸着される状態（図４（Ｂ）中、（ＩＩ）で示す部分）については、図２を参照しながら説明した第１の陽イオン交換樹脂２０がタンパク質を吸着する状態と同様にして説明できる。そのため、ここではその詳細な説明を省略する。また、サンプルＡ中の夾雑物に含まれる金属塩が陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０により吸着される状態（図４（Ｂ）中、（ＩＩＩ）で示す部分）についても、図３を参照しながら説明した陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０が金属塩を吸着する状態と同様にして説明できる。そのため、ここではその詳細な説明も省略する。なお、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０については、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０の何れが上層に収容されていてもよいし、夫々が混合されて第１の陽イオン交換樹脂２０の下層に収容されていてもよい。
【００７０】
最後に、イオン交換樹脂１０により夾雑物が吸着された後に、精製されたサンプルＡは、下層に貯留される（図４（Ｃ）参照）。
【００７１】
本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法によれば、第１の陽イオン交換樹脂２０によりサンプルＡ中の夾雑物を吸着してから、陰イオン交換樹脂３０及び第２の陽イオン交換樹脂４０により夾雑物を吸着する。そのため、本技術の第２実施形態に係る核酸精製方法によれば、より体積が大きなタンパク質を除去してから、より体積が小さな金属塩を除去することが可能になり、より効率的に夾雑物の除去を行うことができる。
【００７２】
３．核酸抽出方法
次に、本技術の各実施形態に係る核酸精製方法を含む核酸抽出方法について説明する。本技術に係る核酸抽出方法は、核酸増幅反応を行うための前処理として、核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行うものである。
【００７３】
上記各手順については、特に限定されるものではないが、例えば、同一のセル内で全ての手順を行うことが可能である。同一のセル内で各手順を行う場合、超音波処理を行う超音波発生部をセルに設けることが可能である。また、上記セルに、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を収容しておくことが可能である。陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂については、上述した本技術の各実施形態に係る核酸精製方法で用いたイオン交換樹脂１０（第１の陽イオン交換樹脂２０、陰イオン交換樹脂３０、第２の陽イオン交換樹脂４０）を用いることが可能である。また、上記セルに、電気泳動用の負極及び正極を設け、電気泳動をした核酸を堰き止める堰止部（例えば、透析膜、高分子ゲル等）を設けることが可能である。
【００７４】
また、核酸の電気泳動の際に、核酸にアニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入しておくことも可能である。ここで、上記インターカレーターとしては、例えば、スルホ基を官能基として有する化合物が挙げられる。具体的には、上記インターカレーターとしては、例えば、９，１０−アントラキノン−２，６−ジスルホン酸、アントラキノン−１−スルホン酸ナトリウム、アントラキノン−２，７−ジスルホン酸二ナトリウム、アントラキノン−１，５−ジスルホン酸二ナトリウム、アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム等が挙げられる。このように、核酸にアニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入しておくことで、核酸の電気泳動において、核酸の等電点を調節することができる。すなわち、核酸の電気泳動速度を制御しつつ、核酸を濃縮精製することができる。
【００７５】
更に、サンプルに含まれる夾雑物の１つであるタンパク質等のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミン、エチレンジアミン等の化合物と脱水縮合反応させておくことも可能である。脱水縮合反応においては、縮合剤としてカルボジイミド系化合物を用いることが可能である。カルボジイミド系化合物の具体例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はジイソピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等が挙げられる。これにより、核酸の電気泳動の際に、サンプル中にタンパク質が存在する場合であっても、タンパク質中のカルボキシル基と脱水縮合反応をする核酸とタンパク質との等電点の差を大きくすることで、核酸とタンパク質とを精度良く分離することができる。
【００７６】
このように、上記各手順を行うことで、非常に簡便に、高効率に濃縮した核酸を回収することができる。特に、各手順を同一のセル内で行う場合には、他の装置等にサンプルを移す必要がないため、サンプルとして感染性を有する検体等を扱う場合には、操作者に対する感染のリスクを低減することができる。
【００７７】
なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。
（２）前記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が小さな第２の陽イオン交換樹脂とを用いる、前記（１）記載の核酸精製方法。
（３）前記第１の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、前記（２）記載の核酸精製方法。
（４）上層に前記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、前記（２）又は（３）に記載の核酸精製方法。
（５）前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、前記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０である、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（６）前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（７）前記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋である、前記（２）〜（６）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（８）前記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋である、前記（２）〜（７）のいずれか１つに記載の核酸抽出方法。
（９）前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１０）前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−である、前記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１１）前記第２の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％である、前記（２）〜（１０）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１２）非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を用いて前記物質を吸着する、前記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１３）前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、前記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の核酸精製方法。
（１４）核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法。
（１５）アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、前記（１４）記載の核酸抽出方法。
（１６）前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、前記（１４）又は（１５）に記載の核酸抽出方法。
（１７）陽イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂と、前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キット。
【実施例】
【００７８】
１．強酸性陽イオン交換樹脂による吸着処理の核酸精製能に対する影響
＜試験例１＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm, Millipore製)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）)を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)（（株）同仁化学研究所製）を調製し、BSA (和光純薬工業（株）製)を0.5質量%となるように加え、さらにCy3修飾した20merオリゴDNA (Sigma Aldrich Co. 製)を5μMとなるように加えた。このタンパク質と核酸の混合液を、常温にて十分に攪拌させた後、強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。スピンダウンした液をNanoDrop D-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc. 製)にて吸光度測定し、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後の吸光度の違いから、核酸精製能を評価した。BSAの吸光度はProtein A280モードで評価し、核酸の吸光度はmicro arrayモードでCy3の吸光度で評価した。さらに、生体環境下に近づけるため、上記タンパク質−核酸混合溶液に最終濃度が0.09質量%となるようにNaCl (和光純薬工業（株）製)を添加し、同様に強酸性イオン交換樹脂処理をおこなった。
【００７９】
評価結果を図５に示す。図５に示すように、強酸性陽イオン交換樹脂処理前後のCy3 オリゴ DNAおよびBSA濃度より、核酸の回収率はNaClを含む場合で約100%、NaClを含まない場合で約72%であった。一方、BSAの回収率はNaClを含む場合で約20%、NaClを含まない場合で約14%であった。このことから、強酸性陽イオン交換樹脂処理をすることにより、タンパク質−核酸の混在系においても、DNA存在比を向上させられることを確認できた。
【００８０】
また、イオン交換樹脂により夾雑物の吸着処理をしたサンプル、及び当該吸着処理をしていないサンプルの夫々のLAMP反応の結果を図６に示す。LAMP反応については、まず、サンプル、酵素、蛍光色素、核酸モノマー、バッファー、ターゲット核酸鎖増幅用のプライマーセット、リアルタイム測定用のプローブを混合し、LAMP反応液を調製した。各濃度はLoopamp DNA 増幅試薬キット（栄研化学（株）製）およびLoopamp RNA 増幅試薬キット（栄研化学（株）製）に準じて実施した。反応温度は63℃で実施した。LAMP反応は、リアルタイム計測が可能なサーマルサイクラーChromo4（バイオラッド製、米国）を用いて測定を行った。1Cycle を 1min と設定した。プローブは、消光プローブのQPプローブ（J-bio21, 日本: http://www.j-bio21.co.jp/tech/qpmethod.htm（［平成２３年７月１９日］、題目：QP法））を使用しているので、核酸の増幅と共に蛍光強度の低下が観察される。図６に示すように、イオン交換樹脂により夾雑物の吸着処理をしたサンプルでは、核酸増幅反応を検出することができた。なお、以下に記載のLAMP反応は上記と同様の条件で行った。
【００８１】
２．陽イオン交換樹脂の対イオンについての検討
＜試験例２＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）) を100mg計量して入れた。また、スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に上記陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型)を1M HCl溶液に通し、中性になるまで純水で洗浄することで調製した陽イオン交換樹脂（NuviaS H+型）を100mg計量して入れた。次いで、50mM MESバッファー(pH5)を調製し、BSAを0.5質量%となるように加え、Cy3修飾した20merオリゴDNAを4μMとなるように加え、さらにNaClを0.09質量%となるように加えた。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。夫々の強酸性陽イオン交換樹脂による核酸精製能については、試験例１と同様にして評価した。Na+の濃度についてはHoriba Cardy Sodium Compact Ion Meter (C-122) (（株）堀場製作所製)により測定した。また、pHについては、ポケットpH計S2K712 (ISFETCOM（株）製)により測定した。評価結果を図７に示す。また、評価結果をまとめたものを表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、核酸の回収率が高く、核酸の精製率も高いことが分かった。一方で、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、Na+の濃度が高く、脱塩しづらいことが分かった。
【００８４】
H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合には、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、吸着処理後のサンプルのpHが吸着処理前のpHに比べ低下する（酸化する）ことが分かった。これは、H+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合、Na+型の陽イオン交換樹脂を用いた場合に比べ、核酸の負電荷が弱められ、核酸が陽イオン交換樹脂のH+上に非特異的に保持されやすくなり、核酸の回収率が低くなったものと考えられる。
【００８５】
３．塩濃度についての検討
＜試験例３＞
本試験例では、陽イオン交換樹脂によりサンプル中の夾雑物を吸着する際におけるサンプル中の塩濃度の影響について検討した。
【００８６】
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S Na+型（Bio Rad社製）)を100mg計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、BSAを0.5質量%となるように加え、Cy3修飾した20merオリゴDNAを4μMとなるように加え、更にNaClを3.3、0.9、又は0.33mg/mLとなるように加え、3種類のサンプルを用意した。また、NaClを添加していない以外は、上記3種類のサンプルと同様の条件で作製したサンプルも用意した。これらのサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。夫々のサンプルの核酸精製能については、試験例１、２と同様にして評価した。評価結果をまとめたものを表２に示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
表２に示すように、NaClの濃度が0.33、0.9、3.3mg／mLの場合は、上記濃度が0mg／mLの場合に比べ、核酸の回収率が高くなることが分かった。また、NaClの濃度が0.33、0.9、3.3mg／mLの場合では、核酸回収率はいずれも100%であった。この結果より、血液等のように、内部に塩が存在するサンプルを用いて核酸精製を行う場合には、精製時にサンプルに塩を添加する必要はないものと考えられる。一方、菌等のように、内部に塩が存在しないサンプルを用いて核酸精製を行う場合には、精製時にサンプルに塩を添加することが好ましいものと考えられる。
【００８９】
４．イオン交換樹脂種による脱塩に対する影響
以下、実施例１〜３、及び比較例１、２でイオン交換樹脂種による脱塩に対する影響について検討した。
【００９０】
＜実施例１＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。吸着処理前のNa+の濃度は、0.45mg/mLであり、pHは4.9であった。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を1/10倍に希釈するように加え、サンプルを調製した。このサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、上記イオン交換樹脂封入スピンカラムに200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。その後、サンプル中のNa+の濃度及びpHを測定した。
【００９１】
＜実施例２＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９２】
＜実施例３＞
実施例２と比し、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:70mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例２と同様にして評価した。
【００９３】
＜比較例１＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mgのみを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９４】
＜比較例２＞
実施例１と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いる代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mgのみを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。
【００９５】
実施例１〜３、及び比較例１、２における評価結果をまとめたものを表３に示す。
【００９６】
【表３】
【００９７】
実施例１、実施例２、及び実施例３では、H＋型の強酸性陽イオン交換樹脂とOH−型の強塩基性陰イオン交換樹脂とを混合したイオン交換樹脂を用いることにより、比較例１及び比較例２に比し、サンプルをより精度良く脱塩できた。また、実施例１、実施例２、及び実施例３では、比較例２に比し、サンプルのpH変化をより精度良く抑制できた。
【００９８】
また、実施例２及び実施例３に示すように、強酸性陽イオン交換樹脂と強塩基性陰イオン交換樹脂との用量を等量としても、又は等イオン交換容量としても、脱塩効果及びpH変化の抑制を実現できることが示唆された。
【００９９】
５．脱塩によるLAMP反応及びRT-LAMP反応に対する影響
以下、実施例４、５、及び比較例３〜５で脱塩処理によるLAMP反応及びRT-LAMP反応に対する影響について検討した。
【０１００】
＜実施例４＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にNaClを0.9mg／mLとなるように加えた。得られたサンプルを、常温にて十分に攪拌させた後、Na+型又はH+型である強酸性陽イオン交換樹脂封入スピンカラムに夫々200μL滴下し、十分に攪拌させた。その後、12000Gにて2分間遠心し、混合液をスピンダウンした。ＬＡＭＰ反応及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応については、試験例１と同様の方法にして行った。
【０１０１】
＜実施例５＞
実施例４と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを用いた以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０２】
＜比較例３＞
実施例４と比し、サンプルとしてNaClを添加していないものを用い、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０３】
＜比較例４＞
実施例４と比し、サンプルをイオン交換樹脂封入スピンカラムに滴下していないという点以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０４】
＜比較例５＞
実施例４と比し、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））：50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgの代わりに、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mgを用いた以外は、実施例４と同様にして評価した。
【０１０５】
実施例４、５、及び比較例３〜５における評価結果をまとめたものを図８及び図９に示す。実施例４、実施例５、及び比較例４から、イオン交換樹脂によりサンプルの脱塩を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応におけるTt値が小さくなることが分かった。実施例４、実施例５、及び比較例４から、イオン交換樹脂によりサンプルの脱塩を行うことで、LAMP反応の進行が良好になることが示唆された。また、実施例４及び実施例５から、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)をイオン交換樹脂として用いることによるLAMP反応への影響は小さいことが分かった。これは、強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)をイオン交換樹脂として用いても、サンプルの脱塩に対する影響は小さいことによるものと考えられる。また、比較例４及び比較例５では、LAMP反応の進行を良好にしづらいことが分かった。LAMP反応の進行を良好にするには、サンプルの脱塩を十分に行う必要があることが示唆された。
【０１０６】
６．添加剤についての検討
以下、実施例６及び実施例７で添加剤（Brij35及びEDTA）の影響について検討した。
＜実施例６＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））:50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積％となるように加え、EDTAを1mMとなるように加えた。得られた核酸を含有するサンプルについて、実施例４と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１０７】
＜実施例７＞
実施例６に比し、Brij35及びEDTAをサンプルに添加していないという点以外は、実施例６と同様にして評価を行った。
【０１０８】
実施例６及び実施例７における評価結果を図１０及び図１１に示す。また、評価結果をまとめたものを表４に示す。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
実施例６では、イオン交換樹脂によりサンプルの夾雑物の吸着処理を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応のいずれにおいても、吸着処理前に比べTt値が小さくなることが分かった。一方、実施例７では、イオン交換樹脂によりサンプルの夾雑物の吸着処理を行うことで、LAMP反応及びRT-LAMP反応のいずれにおいても、吸着処理前に比べTt値が大きくなることが分かった。これは、実施例６では、実施例７に比べ、サンプルにBrij35及び1mM EDTAを添加したことで、核酸の回収率が高くなったことによるものと考えられる。
【０１１１】
７．界面活性剤／親水性高分子についての検討
以下、実施例８〜１１で、界面活性剤／親水性高分子の影響について検討した。
＜実施例８＞
スピンフィルタカラム(Ultrafree-MC,0.45μm)に強酸性陽イオン交換樹脂(Nuvia S (Na+型)（Bio Rad社製）)：100mg、強酸性陽イオン交換樹脂（AG1-X8 (H+型)（Bio Rad社製））：50mg、及び強塩基性陰イオン交換樹脂（AG50W-X8 (OH-型) （Bio Rad社製））：50mgを計量して入れた。次いで、50 mM MESバッファー(pH5)となるように調製し、ウシ全血を10体積%となるように加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、更にBrij35を0.5体積％となるように加えた。実施例７では、サンプルに非イオン界面活性剤又は非イオン性親水性高分子を加えなかった。得られた核酸を含有するサンプルについて、試験例１と同様に、核酸回収率を評価した。
【０１１２】
＜実施例９＞
実施例８に比し、イオン交換樹脂による吸着処理の前のサンプルに非イオン性界面活性剤としてBrij35を0.5体積％となるように添加したという点以外は、実施例８と同様にして評価を行った。
【０１１３】
＜実施例１０＞
実施例９に比し、非イオン性界面活性剤として、Brij35の代わりに、Tween20を用いたという点以外は、実施例９と同様にして評価を行った。
【０１１４】
＜実施例１１＞
実施例９に比し、Brij35の代わりに、非イオン性親水性高分子であるPEG20000を用いたという点以外は、実施例９と同様にして評価を行った。
【０１１５】
実施例８〜１１における評価結果を表５に示す。
【０１１６】
【表５】
【０１１７】
実施例７に比べ、実施例８〜１０では核酸の回収率がいずれも高く、非イオン界面活性剤（Brij35、Tween20）又は非イオン性親水性高分子（PEG20000）をサンプルに添加してサンプルの吸着処理を行うことで、核酸の回収率が上がることが実証された。
【０１１８】
８．本技術に係る吸着処理とゼオライトによる吸着処理との比較
以下、実施例１２及び比較例６で本技術に係る吸着処理とゼオライトによる吸着処理との比較実験を行った。
＜実施例１２＞
実施例７で用いたサンプルと同様にして調製したサンプルを準備した。同様の組成の３サンプル夫々について３回ずつ、実施例７と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１１９】
＜比較例６＞
50 mM MESバッファー(pH5)を調製し、ウシ全血を5体積%加え、超音波破砕したビフィズス菌を1000copy/uLとなるように加え、サンプルを調製した。次いで、サンプルを熱アルカリ処理し、ゼオライトで夾雑物の吸着処理を行った。得られた同様の組成の３サンプル夫々について３回ずつ、実施例４と同様にし、LAMP反応及びRT-LAMP反応を行い、評価した。
【０１２０】
実施例１２及び比較例６における評価結果を図１２（LAMP反応）及び図１３（RT-LAMP反応）に示す。実施例１２及び比較例６から、ゼオライトでサンプルの夾雑物の吸着処理を行った場合よりも、イオン交換樹脂でサンプルの夾雑物の吸着処理を行った場合の方が、核酸増幅反応の進行を良好なものにすることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本技術に係る核酸精製方法は、操作が簡便であり、短時間で高効率に核酸を抽出することができる。従って、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅反応のための核酸精製処理に適用され、核酸が微量あるいは極低濃度でしか含まれないサンプル中の核酸を精製するために用いられ得る。
【符号の説明】
【０１２２】
１、１０１：核酸精製用キット、３：核酸精製器具、１０：イオン交換樹脂、２０：第１の陽イオン交換樹脂、３０：陰イオン交換樹脂、４０：第２の陽イオン交換樹脂
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、
前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。
【請求項２】
前記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いる、請求項１記載の核酸精製方法。
【請求項３】
前記第１の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、請求項２記載の核酸精製方法。
【請求項４】
上層に前記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、請求項３記載の核酸精製方法。
【請求項５】
前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、
前記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０である、請求項４記載の核酸精製方法。
【請求項６】
前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、請求項５記載の核酸精製方法。
【請求項７】
前記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋である、請求項６記載の核酸精製方法。
【請求項８】
前記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋である、請求項７記載の核酸精製方法。
【請求項９】
前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項８記載の核酸精製方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−である、請求項９記載の核酸精製方法。
【請求項１１】
前記第２の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％である、請求項１０記載の核酸精製方法。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を前記サンプルに混合して前記物質を吸着する、請求項１１記載の核酸精製方法。
【請求項１３】
前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、請求項１２記載の核酸精製方法。
【請求項１４】
核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、
陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び
電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法。
【請求項１５】
アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項１４記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項１５記載の核酸抽出方法。
【請求項１７】
陽イオン交換樹脂と、
陰イオン交換樹脂と、
前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キット。
【請求項１】
核酸を含有するサンプルに含まれる物質をイオン交換樹脂により吸着する手順を含み、
前記イオン交換樹脂には、陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂を用いる核酸精製方法。
【請求項２】
前記陽イオン交換樹脂には、第１の陽イオン交換樹脂と、当該第１の陽イオン交換樹脂よりも排除限界分子量が低い第２の陽イオン交換樹脂とを用いる、請求項１記載の核酸精製方法。
【請求項３】
前記第１の陽イオン交換樹脂により前記物質を吸着してから、前記陰イオン交換樹脂と第２の陽イオン交換樹脂とにより前記物質を吸着する、請求項２記載の核酸精製方法。
【請求項４】
上層に前記第１の陽イオン交換樹脂を有し、下層に前記陰イオン交換樹脂と前記第２の陽イオン交換樹脂とを有するカラムの前記上層側から前記サンプルを流入する、請求項３記載の核酸精製方法。
【請求項５】
前記手順は、緩衝液で希釈された前記サンプルに含まれる物質を前記イオン交換樹脂により吸着する手順であり、
前記緩衝液のｐＨは４．０〜８．０である、請求項４記載の核酸精製方法。
【請求項６】
前記陽イオン交換樹脂は、強酸性陽イオン交換樹脂である、請求項５記載の核酸精製方法。
【請求項７】
前記第１の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｎａ＋である、請求項６記載の核酸精製方法。
【請求項８】
前記第２の陽イオン交換樹脂の対イオンは、Ｈ＋である、請求項７記載の核酸精製方法。
【請求項９】
前記陰イオン交換樹脂は、強塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項８記載の核酸精製方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換樹脂の対イオンは、ＯＨ−である、請求項９記載の核酸精製方法。
【請求項１１】
前記第２の陽イオン交換樹脂に対する前記陰イオン交換樹脂のイオン交換容量の割合は、５０％〜１５０％である、請求項１０記載の核酸精製方法。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤及び／又は非イオン性親水性高分子化合物を前記サンプルに混合して前記物質を吸着する、請求項１１記載の核酸精製方法。
【請求項１３】
前記物質は、少なくともタンパク質と金属塩とを含有する夾雑物である、請求項１２記載の核酸精製方法。
【請求項１４】
核酸を含有するサンプルの超音波処理をする手順、
陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂により前記サンプルに含まれる物質を吸着する手順、及び
電気泳動により移動する前記核酸を堰き止めることで前記核酸を濃縮する手順の各手順を行う核酸抽出方法。
【請求項１５】
アニオン性官能基を有するインターカレーターを挿入した前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項１４記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記サンプルと、前記サンプル中に含まれる物質が含有するカルボキシル基と脱水縮合反応をする官能基を有する化合物と、該脱水縮合反応の縮合剤と、を混合し、前記核酸について前記電気泳動を行う、請求項１５記載の核酸抽出方法。
【請求項１７】
陽イオン交換樹脂と、
陰イオン交換樹脂と、
前記陽イオン交換樹脂及び前記陰イオン交換樹脂を内部に保持し、核酸を含有するサンプルを流通可能な核酸精製器具と、を含む核酸精製用キット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図３】
【図４】
【図１】
【図５】
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【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１３−５９２７５（Ｐ２０１３−５９２７５Ａ）
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９８９４９（Ｐ２０１１−１９８９４９）
【出願日】平成２３年９月１３日（２０１１．９．１３）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１３日（２０１１．９．１３）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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