核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板
【課題】検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度な検出が可能であり、しかも低コスト・短時間での検出が可能である。
【解決手段】基板１６表面に一対のオリゴヌクレオチド鎖１２の一方の末端を固定化して立設し、固定化したオリゴヌクレオチド鎖それぞれと相補的な配列を有する標的核酸配列１０（１本鎖）を結合させ、基板１６上に架橋状態の架橋構造体を形成させることにより微細な網目状空間２０を作り出し、この網目状空間２０にリガンド２２を物理的な吸着作用で取り込み、リガンド２２に反応する活性物質で発色させるようにした。
【解決手段】基板１６表面に一対のオリゴヌクレオチド鎖１２の一方の末端を固定化して立設し、固定化したオリゴヌクレオチド鎖それぞれと相補的な配列を有する標的核酸配列１０（１本鎖）を結合させ、基板１６上に架橋状態の架橋構造体を形成させることにより微細な網目状空間２０を作り出し、この網目状空間２０にリガンド２２を物理的な吸着作用で取り込み、リガンド２２に反応する活性物質で発色させるようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板に係り、特に検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で、しかも簡易かつ低コストで検出するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、検体固有の核酸配列を標的として検出する方法としては、基板上に固定化させたオリゴヌクレオチド鎖に標的核酸配列を結合させ、結合した標的核酸配列に蛍光物質を標識した異なるオリゴヌクレオチド鎖を結合させる。そして、特定波長の光（レーザー光等）を当てることで、標識蛍光物質の反射光シグナルを検出・増幅することで特定の核酸配列が検体サンプル中に存在するかを検出する。別の検出方法としては、基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖に、標的核酸配列を結合させ、オリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、結合した標的核酸配列を鋳型として伸長反応させ、その際に取り込まれる塩基物
質に蛍光物質を標識する。そして、特定波長の光（レーザー光等）を当てることで、標識蛍光物質の反射光シグナルを検出・増幅する。
【０００３】
しかし、これらの検出方法は、蛍光物質を検出しなくてはならないため、特定波長光を出す特殊な検出装置を必要とするため検出装置が高価であり、一部の研究期間や大学機関等に使用が限定されている状況である。したがって、例えば水処理現場等において、水（検体サンプル）中におけるノロウイルス、クリプトスポリジウム等の病原微生物を簡易に検出する手法としては、操作が繁雑なうえ分析装置が高価な為、採用できないという問題がある。
【０００４】
このような背景から、例えば水処理等の検出を行う現場において低コストで簡便に特定の核酸配列を標的として検出する方法として、非特許文献１、特許文献１、特許文献２に記載されるＭＰＥＸ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＥＸｔｅｎｓｉｏｎ 法）が開発されている。
【０００５】
このＭＰＥＸ法は、基板上で酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）によるＤＮＡ伸長反応を利用した遺伝子検査方法で、遺伝子変異解析、一塩基遺伝子変異SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）解析、微生物同定にも使用される方法である。リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、標的核酸配列を投入後、２本鎖ＤＮＡは基板上で熱変性させ１本鎖にし、それを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を行う際、全体もしくは一部の塩基にリガンドを修飾することで伸長反応産物（増幅ＤＮＡ）に取り込み、最後にリガンドに対する活性物質を投入、反応させることで、高感度な遺伝子検出を可能とする方法である。
【非特許文献１】K. Kinoshita et al., Multiple primer extension by DNA polymerase on a novel plastic DNA array coated with a biocompatible polymer, Nucleic Acid Research, Vol.35, No.1, 2007, pp.e3
【特許文献１】特開２００６−１７４７８８号公報
【特許文献２】特開２００７−２２２０１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発色色素は蛍光物質に比べて検出シグナルの増幅感度が劣るため、例えばノロウイルス、クリプトスポリジウム等のように、水（検体サンプル）中に極微量のオーダでしか存在せず、しかも培養により増殖できない病原微生物を、ＭＰＥＸ法を用いて検出するには、高感度な検出ができないという課題がある。
【０００７】
ＭＰＥＸ法により高感度で検出するには標識を増やす必要があり、そのためにはＰＣＲ法等により標的核酸配列の濃度を高める工程が必要となるため、結果が得られるまでに長時間を要するという欠点がある。
【０００８】
したがって、ノロウイルス、クリプトスポリジウム等のように、水中に極微量のオーダでしか存在せず、しかも培養により増殖できない病原微生物を、ＭＰＥＸ法を用いて検出するには更なる改良が必要となる。
【０００９】
また、たとえ蛍光物質を使用したとしても、上記の病原微生物のように検出すべき特定の遺伝子が極めて微量である場合には、検出感度の不安定化を招き、精度のよい検出ができない。
【００１０】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度な検出が可能であり、しかも低コスト・短時間での検出が可能である核酸配列の検出方法及びその方法を用いた核酸配列検出基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、基板上に、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより複数の前記オリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、前記複数のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所の相補的部分を結合させることによって架橋状態の多数の架橋構造体を形成し、前記基板上に前記架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００１２】
ここで標的核酸配列とは、検出標的の塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡをいう。
【００１３】
本発明の請求項１によれば、基板表面にオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端を固定化して立設し、固定化したオリゴヌクレオチド鎖と相補的な配列を有する標的核酸配列（１本鎖）を少なくとも二箇所で結合させ、基板上に架橋状態の架橋構造体を形成させることにより微細な網目状空間を作り出し、この網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用で取り込み、リガンドに反応する活性物質で発色させるようにした。
【００１４】
このように、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には、基板上に網目状空間が形成されるようにし、この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で取り込まれるようにしたので、発色関係物質の構成成分でリガンドに反応する活性物質を投入することで、発色形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度に検出できる。また、伸長反応を必要としないので、検出に要する時間を短時間で行うことができる。更には、蛍光色素とは異なり、発色色素を使用することができるため、高価な検出装置等が必要なくなるので、低コストでの検出を行うことができる。
【００１５】
なお、オリゴヌクレオチド鎖は、標的核酸配列の少なくとも２箇所に対して相補的な核酸配列を有するものを予め設計するとよい。ここで、標的核酸配列の情報は、ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ）等を利用してインターネット等により知ることができる。したがって、標的核酸配列の２箇所の部位において検体固有の核酸配列を探し出し、２つの固有核酸配列を、第１のオリゴヌクレオチド鎖と第２のオリゴヌクレオチド鎖とにそれぞれ割り当てればよい。
【００１６】
請求項２に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、基板上に、多数のオリゴヌクレオチド鎖を固定化し、その後、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルを投入すると共に、発色関係物質の構成成分であるリガンドを投入し、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性し一本鎖になる温度にし、その後、前記反応系の温度を前記オリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所とが相補的に結合するハイブリダイゼーション温度にし、その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応させ、前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００１７】
請求項２は、請求項１が発明をメカニズム的な特徴からとらえたのに対して、操作手順の特徴として発明をとらえたものである。
【００１８】
請求項２によれば、発色関係物質の構成成分であるリガンドを含む反応系においてハイブリダイゼーション反応を行うことにより、請求項１に示す架橋構造体が多数形成される。そして、この架橋構造体にリガンドが物理的な吸着作用により多数取り込まれることにより、強い発色シグナルを発色することができ、高感度な検出が可能となる。
【００１９】
請求項３は請求項１又は２において、前記オリゴヌクレオチド鎖として、前記標的核酸配列の少なくとも二箇所に対して相補的な核酸配列を有する一対の組み合わせを、前記固定化の前に予め設計し、該設定した一対のオリゴヌクレオチド鎖を多数組、前記基板上に固定化することを特徴とする。
【００２０】
請求項４に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応をさせて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計する設計工程と、基板上に、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端を固定化することにより前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とを相補的に結合して前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として第１の伸長反応をさせる第１の伸長反応工程と、前記標的核酸配列から前記第１の伸長反応工程で伸長した第１の伸長反応産物を解離させる第１の解離工程と、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第１の伸長反応産物を結合して前記第１と第２のオリゴヌクレオチド鎖の間に架橋構造を形成する第１の架橋工程と、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記第１の伸長反応産物を鋳型として第２の伸長反応をさせる第２の伸長反応工程と、前記第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物を解離させる第２の解離工程と、多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖について前記第１の伸長反応工程から前記第２の解離工程までを行い、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第２の伸長反応産物を結合して前記第２と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第２の架橋工程と、多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１と第２の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、前記繰返し架橋工程により、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００２１】
本発明の請求項４は、網目状空間を請求項１とは別の方法で形成するようにしたものである。即ち、本発明の請求項４によれば、基板表面に５’末端を固定化した第１のオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列とを相補的に結合させた後、第１のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなると共に標的核酸配列を鋳型として伸長反応することにより形成され、標的核酸配列と相補的な核酸配列である第１の伸長反応鎖が解離する。そして、解離した第１の伸長反応産物と、基板表面に一方の末端を固定化した第２のオリゴヌクレオチド鎖とを相補的に結合させた後、第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物を鋳型として伸長反応させることにより第２の伸長反応鎖を形成し、第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物を解離させる。
【００２２】
これにより、基板上には、伸長反応及び解離反応によって核酸配列による架橋構造が多数形成され、この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより、基板上に網目状空間を形成することができる。
【００２３】
ここで、標的核酸配列の情報は、ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratory）、ＧｅｎＢａｎｋ）等を利用してインターネット等により知ることができる。したがって、標的核酸配列において検体固有の核酸配列を探し出し、第１のオリゴヌクレオチド鎖とする。また、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、第１の伸長反応産物と相補的な核酸配列となるように設計する。また、請求項４の場合には、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖は異なる核酸配列に設計することになる。
【００２４】
本発明の請求項４は、網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用で取り込み、リガンドに反応する活性物質で発色させるようにしている。このように、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には、基板上に網目状空間が形成されるようにし、この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で取り込まれるようにし、このリガンドに対しする活性物質を投入することで、発色形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度に検出できる。また、発色シグナル量は伸長反応量に大きく依存しない為、検出に要する時間を短時間で行うことができ、高価な検出装置等が必要なくなるので、低コストでの検出を行うことができる。
【００２５】
請求項５は請求項４において、前記第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物が、前記第２の伸長反応産物と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合して、第３のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、前記第２の伸長反応産物を鋳型とした第３の伸長反応工程と、第２の伸長反応産物と前記第３の伸長反応工程で伸長した第３の伸長反応産物を解離させる第３の解離工程と、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第３の伸長反応産物を結合して前記第３と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第３の架橋工程と、多数の前記第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１、第２と第３の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、を備えたことを特徴とする。
【００２６】
請求項５は、３個のオリゴヌクレオチド鎖を用いる場合であり、結合反応→伸長反応→解離反応を繰り返すことで、解離した伸長反応産物を次々に利用して網目状空間を形成することができるので、標的核酸配列の濃度が更に小さい場合でも高感度の検出が可能となる。また、仮に第1のオリゴヌクレオチド鎖が標的核酸配列に結合できなくとも、変わりに第３のオリゴヌクレオチド鎖が結合できれば反応は進行するため、検出感度の安定化が図れる。尚、請求項５では、３個のオリゴヌクレオチド鎖を用いる場合であるが、４個以上であれば更に好ましい。したがって、検体サンプル中に存在する標的核酸配列の濃度に応じて、濃度が小さい場合には、設計するオリゴヌクレオチド鎖を多くすれば、より高い感度での検出が可能となる。
【００２７】
請求項６は請求項４又は５において、前記繰返し架橋工程後において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にするハイブリダイゼーション工程を備えたことを特徴とする。
【００２８】
これにより、前記繰返し架橋工程後において、架橋反応できていない伸長反応産物を基板上に５’末端固定したオリゴヌクレオチド鎖と結合させ、より多くの架橋構造が多数形成され、この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより、より高い感度での検出が可能となる。
【００２９】
請求項７に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応させて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計し、基板上に、前記設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を多数固定化し、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンドとを混合した混合液を調製し、前記混合液を基板に投入すると共に、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性する熱変性温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とが相補的に結合して第１の伸長反応を行う第１の伸長反応温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第１の伸長反応により形成された第１の伸長反応鎖から第１の伸長反応産物が解離する第１の解離温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記解離した第１の伸長反応産物反と前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合して第２の伸長反応を行う第２の伸長反応温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第２の伸長反応により形成された第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物が解離する第２の解離温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記解離した第２の伸長反応産物反と前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合する温度にし、その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応する温度にし、前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００３０】
請求項７は、請求項４が発明をメカニズム的な特徴からとらえたのに対して、操作手順の特徴として発明をとらえたものである。
【００３１】
請求項８は請求項１〜７の何れか１において、前記リガンドが、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３２】
請求項８は、リガンドとして好ましい具体例を挙げたものである。
【００３３】
請求項９は請求項１〜７の何れか１において、前記リガンドが、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３４】
請求項９は、リガンドとして好ましい更に別の具体例を挙げたものである。
【００３５】
請求項１０は請求項１〜９の何れか１において、前記活性物質が、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３６】
請求項１０は、活性物質として好ましい具体例を挙げたものである。
【００３７】
請求項１１は請求項１〜９の何れか１において、前記基板表面には、親水性ポリマーからなる層と、及びアミノ基と反応する官能基とを有することを特徴とする。
【００３８】
請求項１１によれば、これにより、オリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する性質と、オリゴヌクレオチド鎖を基板上に強固に固定化することができる。
【００３９】
本発明の請求項１２は、前記目的を達成するために、請求項１〜１１の何れか１の核酸配列の検出方法を行うための核酸配列検出基板であって、前記基板上にオリゴヌクレオチド鎖がスポットされていることを特徴とする核酸配列検出基板を提供する。
【００４０】
本発明の請求項１２によれば、標的核酸配列を検出するための検体サンプルを、本発明の核酸配列検出基板にスポット（滴下）させ、反応させることにより、目視により、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。
【発明の効果】
【００４１】
以上説明したように、本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板によれば、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度な検出が可能であり、しかも低コスト・短時間での検出が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、添付図面に従って本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板の好ましい実施の形態について詳説する。
【００４３】
［本発明の第１の実施の形態］
図１は、本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図である。
【００４４】
図１におけるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、核酸配列を構成する塩基を示し、Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミンである。
【００４５】
本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態は、主として、設計工程と、固定化工程と、架橋工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、発色工程と、検出工程とで構成される。なお、設計工程は、標的核酸配列ごとに行う工程であり、標的核酸配列が予め分かっている場合には省略してもよい。また、本実施形態では、架橋工程と網目状空間形成工程とを別々に説明するが、同時に行われる一つの工程(網目状空間形成工程)としてもよい。
【００４６】
予め、検体サンプル中の検出標的である標的核酸配列（例えば標的ＤＮＡ）１０を一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に架橋させるためのオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の核酸配列の設計を行う（設計工程）。ここで、架橋される標的核酸配列１０は、熱変性により２本鎖から１本鎖になったものを指す。
【００４７】
即ち、インターネット等によりＤＮＡデータバンクに保管されている情報の中から、検出しようとする標的核酸配列１０の核酸配列を予め調べておき、その核酸配列の２箇所の部位と一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４とがそれぞれ相補的に結合するように一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の核酸配列を設計する。
【００４８】
図１（Ａ）の左側のオリゴヌクレオチド鎖１２の核酸配列を基板１６側から３’-ＴＡＧＧＣＡ-５’として、標的核酸配列１０の一方端の配列部分５’-ＡＴＣＣＧＴ-３’と相補性を有するように設計する。また、図１（Ａ）の右側のオリゴヌクレオチド鎖１４の核酸配列を基板１６側から５’-ＴＣＴＧＴＣ-３’として、標的核酸配列１０の他方端の配列部分３’-ＡＧＡＣＡＧ-５’と相補性を有するように設計する。即ち、標的核酸配列１０の２箇所の部位において相補性を有する核酸配列を、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４にそれぞれ割り当てる。尚、設計するオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の塩基数は、６〜３０の範囲であることが好ましい。
【００４９】
オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の設計において、検体サンプル中に含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列（例えば、動物、植物、人等のＤＮＡ）が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に結合されないように、標的核酸配列１０固有の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を設計する。
【００５０】
一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４は、核酸配列が同じものでもよく、あるいは異なっていてもよいが、標的核酸配列１０が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４、標的核酸配列１０の間で架橋を形成可能なように、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に対応する標的核酸配列１０の２箇所の部位が離れていることが必要である。但し、２箇所の部位が標的核酸配列１０の両端に位置する必要はない。
【００５１】
次に、図１（Ａ）に示すように、基板１６上に、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を基板上に立たせる（固定化工程）。図１（Ａ）では、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４のみを示したが、基板１６上には一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４が多数組立設される。尚、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４が多数組とは、オリゴヌクレオチド鎖１２とオリゴヌクレオチド鎖１４とが完全に等量関係にあることを意味するものではない。
【００５２】
上記の如く準備された基板１６上に、標的核酸配列１０を含む検体サンプルをスポット（滴下して投入）して、架橋工程〜検出工程までを行う。即ち、図１（Ｂ）に示すように、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４のそれぞれと、標的核酸配列１０の相補的部分が結合し、架橋状態の架橋構造体１８を形成する。
【００５３】
この架橋工程において、検体サンプルに含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列は、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４と相補的な関係にはないので、架橋構造体１８を形成することはない。
【００５４】
この一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の多数組について架橋工程を行うことにより、基板１６上には、図２に示すように、架橋構造体１８が多数複雑に絡み合った微細な網目状空間２０を形成する（網目状空間形成工程）。尚、図２では分かり易いように、網目状空間１８を簡素化して図示したが、実際には架橋構造体１８が複雑に絡み合って密集した網目状空間２０となる。網目状空間２０が形成されることは、例えば電子顕微鏡で直接的に確認可能であると推察される。また、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４について、標的核酸配列１０と相補性を小さくするように核酸配列を設計することで、発色工程での発色シグナルが小さくなり、オリゴヌクレオチド鎖のどちらか一方を排除すると、発色シグナルが得られないことから、間接的に確認することができる。
【００５５】
この網目状空間２０に、図１（Ｃ）に示すように、発色関係物質の構成成分である多数のリガンド２２を物理的な吸着作用により取り込むことができる（取込み工程）。尚、図１（Ｃ）では分かり易いように、１つの架橋構造体１８で示してあるが、実際には図２に示したように、多数の架橋構造体１８が複雑に絡み合った網目状空間２０にリガンド２２が物理的な吸着作用で取り込まれる。ここで物理的な吸着作用とは、小さい孔には小さな化学物質が入り込み易いことを利用したもので、特定の化学物質に特定の化学物質が結合し易いのとは異なり、非特異的な作用を意味する。
【００５６】
したがって、取り込んだ多数のリガンド２２に対して、該リガンド２２に反応する発色関係物質の構成成分である活性物質（図示せず）を用いて発色させ（発色工程）、発色した発色シグナルを検出すれば、高感度の検出を行うことができる。また、発色シグナルの検出は、吸光度装置、イメージスキャナ等の汎用装置を使用することができるだけでなく、発色色素により可視化されることで目視により簡便に検出することができる。
【００５７】
リガンド２２としては、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかを好ましく使用できる。更に、リガンドとして、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかを使用することができる。また、活性物質としては、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかを好ましく使用することができる。
【００５８】
発色工程を、リガンドとしてビオチンを用い、リガンドと反応する活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジンを用いた例で説明すると、ビオチンはアビジンと反応（ビオチン反応）して、特異的に強固な結合を形成する。したがって、網目状空間２０にビオチンを取り込み、アルカリフォスファターゼ標識アジビンをビオチンに反応させることで、たくさんのアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）がビオチンに結合する。アジビン１に対してビオチン４の割合で結合する。そして、アルカリフォスファターゼは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴという基質に反応（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応）して青紫色になるので、この色を検出する。
【００５９】
ＢＣＩＰ:５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルリン酸
ＮＢＴ:ニトロブルーテトラゾリウム
したがって、本発明のように網目状空間２０にリガンド２２であるビオチンを多量に取り込むことで、ビオチン反応と、アルカリフォスファターゼに対するＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応とが増幅され、強い発色シグナルが形成される。
【００６０】
ビオチンの代わりに、薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いる方法もある。この場合アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にＢＣＩＰ／ＮＢＴで青紫色に発色させる。これにより、高感度な検出が可能になる。
【００６１】
本発明の実施の形態において使用される基板１６表面には、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。親水性ポリマーからなる層は、主としてオリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する役割を果たし、アミノ基と反応する官能基はオリゴヌクレオチド鎖を化学的に基板上に固定化する役割を果たす。特に、オリゴヌクレオチド鎖は、アミノ基と反応する官能基の部位で共有結合することによって、当該基板１６の表面に強固に固定化される。
【００６２】
本実施の形態で使用する親水性ポリマーとしては、親水性基を主鎖又は側鎖に有する高分子物質が挙げられ、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリアクリルアミド、及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものであることが好ましい。特にポリアクリルアミドを光架橋性化合物等で３次元架橋した網目構造を有するポリアクリルアミドゲルが好ましい。
【００６３】
また、本実施の形態に使用するアミノ基と反応する官能基としては、アルデヒド基、活性エステル基等が挙げられるが、活性エステル基が好ましい。活性エステル基は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、例えば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基、等が好ましく、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。
【００６４】
アミノ基と反応する官能基は、基板表面に直接導入されていても良いし、親水性ポリマー構造の主鎖又は側鎖に有していても良い。
【００６５】
（第１の実施の形態の検出方法を行う操作手順）
次に、図３のフローチャートにより、第１の実施の形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚、基板１６は、基板表面に、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。
【００６６】
ステップ１では、上記したように、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の間に標的核酸配列１０が架橋するように、標的核酸配列１０の２箇所の部位に対して、それぞれ相補的な関係を有する一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を設計する。
【００６７】
次に、ステップ２において、基板１６上に一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化する。固定化する方法としては、基板１６上の表面に存在する、又は親水性ポリマーに含まれるアミノ基と反応する官能基のうち、少なくとも一部のアミノ基と反応する官能基とオリゴヌクレオチド鎖１２、１４とを反応させて共有結合を形成させることにより、基板１６表面でオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化する。続いて、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基を不活性化する。即ち、残りのアミノ基と反応する官能基を不活性化することにより、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４を基板１６の表面に固定することができる。基板１６表面に固定化されなかったオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。洗浄後はオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００６８】
ステップ３では、標的核酸配列１０を含む検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン）とを混合した混合液を調製する。
【００６９】
次に、ステップ４では、標的核酸配列が一本鎖か、二本鎖かが判断され、ＮＯであれば、ステップ５において、検体サンプルを投入した反応系の温度を、標的核酸配列１０の融解温度（melting temperature:Tm）以上、例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより、２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また、一本鎖であっても、複雑な二次構造等を形成している場合は、熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば、ステップ６へ進む。
【００７０】
ステップ６では、基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液をハイブリダイゼーション温度に調節して、混合液を基板へ投入（滴下）する。ハイブリダイゼーション温度は、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の融解温度（Ｔｍ）の２〜８℃低い値が好ましい。
【００７１】
ステップ７では、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の融解温度（Ｔｍ）の２〜８℃低い温度でハイブリダイゼーション反応を行う。反応時間としては、６０分以上であることが好ましい。これにより、上記の如く設計された一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４と、標的核酸配列１０の相補的部分（２箇所）とがそれぞれ相補的に結合し、架橋状態の架橋構造体１８を形成する。かかる架橋構造体１８が多数形成され、複雑に絡み合うことで網目状空間２０が形成される。そして、この網目状空間２０に投入したリガンド２２が物理的な吸着作用で取り込まれることにより、多数のリガンド２２を取り込むことができる。
【００７２】
次に、ステップ８では、基板１６反応液を捨てて、基板１６を洗浄液、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。
【００７３】
次に、ステップ９では、活性物質（例えばアルカリフォスファターゼ標識アビジン）を基板１６上に投入して、網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２との反応により結合させる。反応温度及び反応時間としては、反応温度が２０〜４０℃の範囲が好ましく、反応時間が５〜６０分の範囲が好ましい。
【００７４】
次のステップ１０では、前記したステップ９の反応を更に続けるか否かが判断され、反応が十分であり、ＮＯであれば次のステップ１１に進み、反応が未だ不十分であり、ＹＥＳであればステップ８に戻り、洗浄工程を経て、ステップ９で、活性物質（例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を基板１６上に投入して、網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２と反応した活性物質に、更に反応させる。反応温度及び反応時間としては、反応温度が２０〜４０℃の範囲が好ましく、反応時間が５〜６０分の範囲が好ましい。
【００７５】
ステップ１１では、再び基板１６の洗浄を行い、ステップ１２で発色シグナルの検出を行う。例えば、リガンド２２としてビオチンを用い、活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン用いた場合には、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬中に基板１６を浸漬して青紫色のスポットを発色させる。発色させた発色シグナルは、目視で検出してもよく、あるいは発色画像をイメージスキャナでパソコンに取り込んで解析してもよく、更には吸光度測定装置で発色度合いを測定してもよい。
【００７６】
このように、検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には、網目状空間２０が形成され、網目状空間２０に発色関係物質に構成成分であるリガンド２２が多数保持されることになるので、強い発色シグナルを発色することが可能になる。これにより、検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には、高感度な検出が可能となる。
【００７７】
［本発明の第２の実施の形態］
図４は、本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図であり、網目状空間２０を第１の実施の形態とは別の方法で形成する。尚、第１の実施の形態と同じものについては同符号を付して説明する。
【００７８】
本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態は、主として、設計工程と、固定化工程と、第１の伸長反応工程と、第１の解離工程と、第１の架橋工程と、第２の伸長反応工程と、第２の解離工程と、第２の架橋工程と、繰返し架橋工程と、ハイブリダイゼーション工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、発色工程と、検出工程とで構成される。
【００７９】
予め、標的核酸配列１９と、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において、伸長反応により産出された伸長反応産物２８、３６が架橋構造を形成するように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の核酸配列を設計する（設計工程）。即ち、標的核酸配列１９と第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とが相補的に結合した後に、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとすると共に標的核酸配列１９を鋳型として第１の伸長反応をさせて形成される第１の伸長反応鎖３０が標的核酸配列１９から解離して、相補的な核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合できるように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を設計する。標的核酸配列１９の核酸配列については、第１の実施の形態と同様にＤＮＡデータバンクから情報を得ることができる。
【００８０】
図４（Ａ）の左側の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４の核酸配列を基板１６側から５’-ＴＡＧＧＣＡ-３’として、標的核酸配列１９の片端の配列部分３’-ＡＴＣＣＧＴ-５’と相補性を有するように設計する。また、図４（Ａ）の右側の第２のオリゴヌクレオチド鎖２６の核酸配列を基板１６側から５’-ＡＧＡＣＡＧ-３’として、第１の伸長反応産物２８の片端の配列部分３’-ＵＣＵＧＵＣ-５’と相補性を有するように設計する。尚、伸長反応に使用された塩基Ｕ（ウラシル）にはビオチンが付けられた場合で示してある。ビオチン非標識時は塩基Ｔを使用。塩基のＵは、本来ＲＮＡを構成する塩基だが、ビオチンを標識とすることで化学構造的に塩基のＴに近くなるため、ＤＮＡポリメラーゼでの伸長反応が可能となる。
【００８１】
次に、図４（Ａ）に示すように、基板１６上に、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の５’末端を固定化することにより、一対のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を基板上に立たせる（固定化工程）。
【００８２】
図４（Ａ）では、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６をそれぞれ１本ずつのみを示したが、基板１６上には第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６が多数立設される。
【００８３】
上記の如く準備された基板１６上に、標的核酸配列１９を含む検体サンプルをスポット（滴下により投入）し、第１の伸長反応工程〜検出工程までを行う。即ち、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、熱変性により解離した１本鎖の標的核酸配列１９の相補的部分が結合した後、標的核酸配列１９を鋳型とし、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行うと、従来のＭＰＥＸ法と同様に図４（Ｂ）のような二本鎖核酸配列が形成される（第１の伸長反応工程）。しかし、伸長反応を第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６のＴｍ（融解温度）温度領域で行った場合、伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６と相補的な領域は、常に一本鎖に解離する可能性があり、また、基板１６上には、伸長反応産物２８と相補的に結合するよう予め設計された第２のオリゴヌクレオチド鎖２６が固定化されているため、伸長反応産物２８の一部は、標的核酸配列１９と解離した後に（第１の解離工程）、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合し、架橋状態を形成する（第１の架橋工程）。
【００８４】
即ち、第１の伸長反応により伸長する第１の伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６と相補的な領域は、Ｔｍ温度領域という不安定なエネルギー状態において、分子構造的に安定した状態を目指すため、図４（Ｃ）に示すように、相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合することとなる。図４（Ｃ）に記載した「ブリッジング」との用語は、２つ以上の一端が固定化されたオリゴヌクレオチド間を標的核酸配列が架橋することを意味する。そうした意味で、第１の実施の形態のように一対のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６に標的核酸配列１０が架橋することもブリッジングと言える。
【００８５】
尚、検体サンプルに含まれる標的核酸配列１９以外の核酸配列のものは、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と相補的な関係にはないので、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４に結合して伸長反応を行うことはない。
【００８６】
第１の伸長反応の際、使用する酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、双方を混合したものが含まれる。
【００８７】
次に、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として図４（Ｄ）に示すような伸長反応が起こる（第２の伸長反応工程）。尚、図４（Ｄ）では、図を簡素化するために、標的核酸配列１９は図示していないが、このとき標的核酸配列１９は第１のオリゴヌクレオチド鎖２４から解離し、別の第１のオリゴヌクレオチド鎖と結合する。
【００８８】
第２以降の伸長反応の際、酵素はＤＮＡポリメラーゼを使用する。この時、ＤＮＡポリメラーゼはpolI型のもの（例えば、Ｔａｑ（タカラバイオ））でも可能だが、耐熱性α型のもの（例えば、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ））が好ましく、鎖置換活性を有するものを使用することがより好ましい。鎖置換活性を有することにより、鋳型ＤＮＡもしくはｃＤＮＡに二本鎖を形成している箇所が存在しても、水素結合を切断しながら伸長反応を進めることが容易となる。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、Klenow Fragment、phi29 DNA polymerase、BcaBEST DNA polymerase、Bst DNA polymerase等が上げられる。反応温度は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６のＴｍ値以上、６５℃未満が好ましく、反応時間は２０〜９０分が好ましい。
【００８９】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６は多数を基板１６上に固定化している。そこで、第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６が、第１の伸長反応産物２８から解離し（第２の解離工程）、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり、かつ、同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合し、架橋状態を形成する（第２の架橋工程）。この状態から、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４がプライマーとなるため、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６、の間で第１と第２の架橋工程が繰り返されることとなる（繰返し架橋工程）。その後、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にすることで（ハイブリダイゼーション工程）、基板１６上に、より多くの架橋構造体を形成させることとなる。ハイブリダイゼーション温度は、オリゴヌクレオチド鎖２４、２６の融解温度（Ｔｍ）から２〜８℃低い温度が好ましい。
【００９０】
これにより、図５に示すように、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成され（網目状空間形成工程）、第１の実施の形態と同様に、網目状空間２０に取り込んだ多数のリガンド２２に対して（取込み工程）、該リガンド２２に反応する活性物質を用いて発色させ（発色工程）、発色した発色シグナルを検出すれば、高感度の検出を行うことができる。
【００９１】
（第２の実施の形態の検出方法を行う操作手順）
次に、図６のフローチャートにより、第２の実施の形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚、基板１６は、基板表面に、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。
【００９２】
ステップ１では、上記したように、標的核酸配列１９と、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において、伸長反応により産出された第１の伸長反応産物２８、３６が架橋構造を形成するように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の核酸配列を設計する。
【００９３】
ステップ２では、基板１６上に、設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を固定化する。固定化する方法としては第１の実施の形態で説明したので省略する。
【００９４】
ステップ３では、標的核酸配列１９を含む検体サンプルと、発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン標識ｄＵＴＰ）とを混合した混合液を調製する。
【００９５】
次に、ステップ４では、標的核酸配列が一本鎖か、二本鎖かが判断され、ＮＯであれば、ステップ５において、検体サンプルを投入した反応系の温度を、標的核酸配列１０の融解温度（melting temperature:Tm）以上、例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより、２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また、一本鎖であっても、複雑な二次構造等を形成している場合は、熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば、ステップ６へ進む。
【００９６】
ステップ６では、基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液を基板へ投入（滴下）する。
【００９７】
次に、ステップ７では、第１の伸長反応工程と、第１の解離工程と、第１の架橋工程と、第２の伸長反応工程と、第２の解離工程と、第２の架橋工程と、繰返し架橋工程と、ハイブリダイゼーション工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、を実施する。
【００９８】
即ち、第１の伸長反応工程において、標的核酸配列１９を鋳型とし、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行い、第１の解離工程において、伸長反応産物２８を、標的核酸配列１９と解離させ、第１の架橋工程において、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合させ、架橋状態を形成させる。
【００９９】
次に、第２の伸長反応工程において、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として伸長反応させ、第２の解離工程において、第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６を、第１の伸長反応産物２８から解離させ、第２の架橋工程において、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり、かつ、同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合させ、架橋状態を形成させる。
【０１００】
その後、繰返し架橋工程において、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６、の間で第１と第２の架橋工程が繰り返させ、その後、ハイブリダイゼーション工程において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にし、基板１６上に、より多くの架橋構造体を形成させる。これにより、基板１６上に架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成される（網目状空間形成工程）。
【０１０１】
網目状空間２０が形成された後は、第１の実施の形態と同様に、ステップ８〜ステップ１２を実施することで、標的核酸配列１９を高感度に検出することができる。
【０１０２】
尚、ステップ３において、標的核酸配列１９とリガンド２２の混合液を調製したが、リガンド２２はステップ６とステップ７との間で投入してもよい。
【０１０３】
［本発明の第２の実施の形態の変形例］
上記説明した本発明の第２の実施の形態では、第１及び第２の、２種類のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を用いることで説明したが、３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖を使用することもできる。
【０１０４】
例えば、３種類のオリゴヌクレオチド鎖の例で説明すると、第２の実施の形態における第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物３６が、該第２の伸長反応産物３６と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合する。結合した後は、同様に伸長反応させ、伸長反応産物を解離し、第１のオリゴヌクレオチド鎖に結合し、基板１６上に、架橋構造を形成する。これら第１から第３の繰返し架橋工程を経て微細な網目状空間を形成させる。
【０１０５】
したがって、次々に解離される伸長反応産物と相補的な関係のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計することで３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖についても本発明の第２の実施の形態を適用することができる。
【０１０６】
第２の実施の形態において、基板１６表面には、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。これにより、伸長反応による２本鎖の伸長反応鎖が熱変性処理により解離し、解離した伸長反応産物が別のオリゴヌクレオチド鎖と結合して再び伸長反応する。
【０１０７】
［核酸配列検出基板］
上述した第１及び第２の実施の形態において、オリゴヌクレオチド鎖を基板に固定化した核酸配列検出基板を製作し、この核酸配列検出基板に、例えば標的核酸配列を含む検体サンプルをスポット（投入）するだけで、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。
【実施例】
【０１０８】
［実施例１］
次に、本発明の第１の実施の形態の検出方法の実施例を説明する。標的核酸配列としては、ノロウイスル固有の核酸配列を用い、この標的核酸配列を検出する例で説明する。
【０１０９】
即ち、以下の手法にて、標的核酸配列に対して相補的な一対のオリゴヌクレオチド鎖をプラスチック基板表面に固定化することで、検体サンプルとして標的核酸配列を投入した際に、基板上の一対のオリゴヌクレオチド鎖と結合し架橋状態の核酸配列構造を形成させ、その構造下に微細な網目状空間を作り出した。そして、その網目状空間に発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で多量に取り込むことができ、これによって、標的核酸配列を高感度に検出した。
【０１１０】
即ち、標的核酸配列を、ノロウイルスｃＤＮＡのＰＣＲ産物として実験を行った。このＰＣＲ産物は、ノロウイルスの構造蛋白質であるカプシド蛋白質をコードしている領域ＯＲＦ２を対象とした。また、ノロウイルスはＧ１とＧ２の２つのグループに分けられるため、ＰＣＲ産物は、Ｇ１とＧ２の２種類を準備して実験を行った。
【０１１１】
（標的核酸配列の調整）
糞便をリン酸緩衝液に溶解し、１０％乳剤を作製し、１２,０００ｒｐｍで冷却遠心後、遠心上清からＲＮＡの抽出を行った。遠心上清を室温に戻し、ＲＮＡ抽出精製キット（QIAamp Viral RNA Mini Kit （QIAGEN））を用いＲＮＡ抽出精製後、ＲＮＡ抽出液２４μLに対し５倍濃縮したRT-PCR用Buffer３μL、滅菌水１μL、DNase （1U/μL）２μL（DNase I（タカラバイオ））を加え、３７℃−３０分、７５℃−５分を経て氷冷した。得られたＲＮＡをランダムプライマー（Random Primer Hexamer（Amersham Pharmacia））とRT反応キット（SuperScript II Reverse Transcriptase Rnase H- Reverse Transcriptase（Invitrogen））を用いｃＤＮＡへ逆転写し（４２℃−1時間（1サイクル）、９９℃−５分（1サイクル）、４℃）、そのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１（２５μM）とプライマー２（２５μM）、プライマー３（２５μM）、プライマー４（２５μM）と、ＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq（タカバイオ））とを用いたＰＣＲ反応（９４℃−3分（1サイクル）、９４℃−１分、５０℃−1分、７２℃−２分（４０サイクル）、７２℃−１５分（１サイクル））によりＧ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し、電気泳動で増幅を確認し精製後、標的核酸配列として実験に用いた。
【０１１２】
（使用したプラスチック基板）
市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製S-BIO(R) PrimeSurface(R)）を実験に用いた。この基板は、実施の形態で述べた親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。図７に示すように、横４（１〜４）×縦６（Ａ〜Ｆ）の合計２４箇所のスポット領域があり、各スポット領域で、各核酸配列の有無を評価した。本実験では、Ｇ１のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所、Ｇ２のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所のプラスチック基板を作製して使用した。
【０１１３】
（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
Ｇ１のＰＣＲ産物検出のため、下記に示す核酸配列で構成された一対のオリゴヌクレオチド鎖１及びオリゴヌクレオチド鎖２を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１、２は、Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖１は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１４】
一方、オリゴヌクレオチド鎖２は、３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１５】
そして、オリゴヌクレオチド鎖１の溶液と、オリゴヌクレオチド鎖２の溶液とを混合し、スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち、図７（Ｃ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ａ〜Ｃで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１〜１２）。そして、オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１１６】
また、Ｇ２のＰＣＲ産物検出のため、下記に示す核酸配列のオリゴヌクレオチド鎖３及びオリゴヌクレオチド鎖４を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖３、４は、Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖３は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１７】
一方、オリゴヌクレオチド鎖４は、３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２３塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１８】
そして、オリゴヌクレオチド鎖３の溶液と、オリゴヌクレオチド鎖４の溶液とを混合し、スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち、図７（Ｂ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ｄ〜Ｆで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１３〜２４）。そして、オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１１９】
上記したＧ１及びＧ２のＰＣＲ産物を調製したときのプライマー１〜４の核酸配列、及びプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖１〜４の核酸配列は次のとおりである。
・プライマー１（COG1F）：5’-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3’
・プライマー２（G1-SKR）：5’-CCAACCCARCCATTRTACA-3’
・プライマー３（COG2F）： 5’-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG -3’
・プライマー４（G2-SKR）：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’
・オリゴヌクレオチド鎖１（G1SKF）：5’-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3’
・オリゴヌクレオチド鎖２（G1-1’）： 5’-CCAACAAACATGGATGGCAC-3’
・オリゴヌクレオチド鎖３（RING2AL-TP）： 5’-TGGGAGGGSGATCGCRATCT-3’
・オリゴヌクレオチド鎖４（G2SKRrc）5’-ATGTAYAAYGGDYATGCNGGYGG-3’
IUB Codes(Code of international Union of Biochemistry). R=A or G ; B=C, G or T ; Y=C or T ; D=A, G or T ; K=G or T ; H=A, C or T ; M=A. or C ; V=A, C or G ; S=G or C ; W=A or T ; N=any base.
（ハイブリダイゼーション）
上記の如く一対のオリゴヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖１とオリゴヌクレオチド鎖２の一対、オリゴヌクレオチド鎖３とオリゴヌクレオチド鎖４の一対）を固定化したプラスチック基板に、準備した標的核酸配列を５９μｍと、ハイブリバッファーを１３μLと、８μLのビオチンを混合した混合液を投入した。
【０１２０】
尚、図7（Ａ）の基板は、上記の如く各オリゴヌクレオチド鎖を固定化した基板に、標的核酸配列を含まない検体サンプルを投入した場合である。
【０１２１】
そして、基板上の反応系を９５℃、８分間の加熱条件で加熱することにより、標的核酸配列の２本鎖を熱変性して解離させて１本鎖にし、更に反応系を５４℃で９０分間ハイブリダイズさせた。
【０１２２】
次に、洗浄後、０．０１ｍｇ／ｍLのアルカリフォスファターゼ標識ストレフトアビジンを基板上へ投入し、カバーガラスで覆い、反応系を３７℃で３０分反応させた。その後、洗浄を行い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（BCIP／NBT Phosphatase Substrate（1-Component System）（KPL））発色試薬中に基板を浸漬し、３７℃で３０分間反応させて洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。発色画像を図7に示す。また、数値化結果の平均Ｓ／Ｎ比（Signal to Noise Ratio）を下記の式１から求め、図8の表１に示す。
【０１２３】
Ｓ／Ｎ比＝１×Ｓ／（Ｓ＋Ｎ）…式１
Ｓ／Ｎ：非測定時に対する測定時の発色強度の比率：最大値１．０
Ｓ：測定時の発色シグナルの強度
Ｎ：非測定時の発色シグナルの強度
その結果、Ｇ１のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合、図7（Ｃ）から分かるように、スポット領域１〜１２のみが発色した。一方、Ｇ２のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合、図7（Ｂ）から分かるように、スポット領域１３〜２４のみが発色した。
【０１２４】
比較対象としてＰＣＲ産物（標的核酸配列）を加えなかった場合は、図7（Ａ）から分かるように、オリゴヌクレオチド鎖１、２を固定化した場合、及びオリゴヌクレオチド鎖３、４を固定化した場合のいずれについても発色が得られなかった。
【０１２５】
尚、図示しなかったが、ＤＮＡアレイプラスチック基板のオリゴヌクレオチドの固定において、Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖１のみ（スポット領域１〜６）、オリゴヌクレオチド鎖２のみ（スポット領域７〜１２）、Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖３のみ（スポット領域１３〜１８）、オリゴヌクレオチド鎖４のみ（スポット領域１９〜２４）のものを１８枚作製した。そして、Ｇ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ６枚ずつ前記方法でハイブリダイズさせ、同時にビオチンを投入し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識アビジンを基板上へ投入し、カバーガラスで覆い３７℃で３０分放置した後、洗浄を行い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色試薬中に基板を浸漬し、３７℃で３０分間反応させ洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。
【０１２６】
発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。
【０１２７】
その結果、スポット領域１〜２４のいずれにおいても発色は確認されず、比較対象としてＰＣＲ産物を加えなかった６枚のＤＮＡアレイプラスチック基板においても、発色が得られなかった。
【０１２８】
また、図８の表１から分かるように、図７（Ｃ）のスポット１〜１２に示したＧ１のＰＣＲ産物の発色シグナル強度（Ｓ）の平均値と、図７（Ａ）での発色ノイズ強度（Ｎ）の平均値との、Ｓ／Ｎ比は０．９７と極めて高感度な検出を行うことができた。
【０１２９】
同様に、図７（Ｂ）のスポット１３〜２４に示したＧ２のＰＣＲ産物の発色シグナル強度（Ｓ）の平均値と、図７（Ａ）での発色ノイズ強度（Ｎ）の平均値とのＳ／Ｎ比は０．９８と極めて高感度な検出を行うことができた。
【０１３０】
［実施例２］
次に、本発明の第２の実施の形態の検出方法の実施例を説明する。標的核酸配列としては、実施例１と同様に、ノロウイスル固有の核酸配列を標的核酸配列として検出する例で説明する。
【０１３１】
即ち、以下の手法にて、基板表面に固定化した第１のオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列が相補的に結合後、第１のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなり、標的核酸配列を鋳型として伸長反応し、解離反応により標的核酸配列と相補的な配列である伸長反応産物が解離する。
【０１３２】
そして、解離した第１の伸長反応産物が、基板表面に固定化した別の第２のオリゴヌクレオチド鎖と相補的に結合後、第２のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなり、第１の伸長反応産物を鋳型として伸長反応し、解離反応により第１の伸長反応産物と相補的な配列の伸長反応産物が解離する。
【０１３３】
これを繰り返すことで基板上に微細な網目状空間を作り出し、該網目状空間にリガンドを物理的な吸着効果により取り込み、リガンドに反応する活性物質を用いることで、標的核酸配列を検出した。
【０１３４】
（標的核酸配列の調整）
実施例１で示したノロウイルスｃＤＮＡのＧ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し精製後、０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８ copies／μLとなるよう濃度調整し、標的核酸配列として実験に用いた。バックグラウンドとしては滅菌水を添加したもので評価した。
【０１３５】
（プラスチック基板）
実施例１で示したプラスチック基板（住友ベークライト製S-BIO(R) PrimeSurface(R)）のＭＰＥＸ（Multiple Primers EXtension）法対応基板を使用し、基板表面へ各種オリゴヌクレオチド鎖の一端を固定化し、実験に用いた。
【０１３６】
ＭＰＥＸ法は、従来技術において非特許文献１、特許文献１、特許文献２で説明した通りであるが、本実施例２の比較対照としては、基板上に固定化するオリゴヌクレオチド鎖が１種類のみで、伸長反応産物が架橋構造を形成しないＭＰＥＸ法を実施することにより、標的核酸配列の検出を行った。また、バックグラウンドとしては、滅菌水を添加したもので実施した。
【０１３７】
（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
実施例２では、Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為、下記に示すオリゴヌクレオチド鎖５及びオリゴヌクレオチド鎖６を合成した。オリゴヌクレオチド鎖５は、Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また、オリゴヌクレオチド鎖５は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１３８】
一方、オリゴヌクレオチド鎖６も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（１９塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１３９】
実施例２では、これらオリゴヌクレオチド鎖５及びオリゴヌクレオチド鎖６の溶液を混合し、スポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域１〜４）。尚、実施例２は、図７のように基板の図は示さないが、同様である。
【０１４０】
一方、上記した比較対照実験として、１μＭのオリゴヌクレオチド鎖５と６のうちの１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを基板のスポット領域に別々にスポットした（スポット領域５〜８、９〜１２）。
【０１４１】
そして、実施例２の基板及び比較対照の基板のそれぞれを、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１４２】
また、実施例２では、Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為、オリゴヌクレオチド鎖７及びオリゴヌクレオチド鎖８を合成した。オリゴヌクレオチド鎖７は、Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また、オリゴヌクレオチド鎖７は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２６塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１４３】
一方、オリゴヌクレオチド鎖８も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１４４】
そして、実施例２では、これらのオリゴヌクレオチド鎖７とオリゴヌクレオチド鎖８の溶液を混合し、スポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域１３〜１６）。
【０１４５】
一方、上記した比較対照実験では、１μＭのオリゴヌクレオチド鎖７と８のうちの１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを基板上のスポット領域に別々にスポットした（スポット領域１７〜２０、２１〜２４）。
【０１４６】
そして、実施例２の基板及び比較対照の基板のそれぞれを、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１４７】
上記したプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖５〜８の核酸配列は次のとおりである。
・オリゴヌクレオチド鎖５（RING1-TP(a)）：5’-AGATYGCGATCYCCTGTCCA -3’
・オリゴヌクレオチド鎖６（G1SKR）：5’-CCAACCCARCCATTRTACA-3’
・オリゴヌクレオチド鎖７（COG2F）：5’-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3’
・オリゴヌクレオチド鎖８（RING2AL-TP rc）：5’-AGATYGCGATCWCCCTCCCA-3’
IUB Codes(Code of international Union of Biochemistry). R=A or G ; B=C, G or T ; Y=C or T ; D=A, G or T ; K=G or T ; H=A, C or T ; M=A. or C ; V=A, C or G ; S=G or C ; W=A or T ; N=any base.
そして、実施例２の基板上に、標的核酸配列を５９μL、10×MPEX バッファーＡを８.０μL、10×ＫＯＤ-Plusバッファー（ＴＯＹＯＢＯ）を８.０μL、０．１mMビオチン標識dUTPを０．８０μL、０.１mM dATPを０．８μL、０.１mM dCTPを０．８μL、０．１mM dGTPを０．８μL、ＫＯＤ-Plus （ＴＯＹＯＢＯ）を２μLを混合した混合液を投入し、基板上の反応系を、９５℃で８分間加熱し、核酸配列の２重鎖を熱変性で解離させ１本鎖にした。
【０１４８】
次に、基板上にカバーガラスをかけ、２００μLの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において、５６℃で９０分間反応させた。
【０１４９】
次に、カバーガラスをはずして洗浄後、０．０１ｍｇ／ｍL濃度のアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを８μL、10×ＭＰＥＸバッファーＡを８．０μL、2×ＭＰＥＸバッファーＢを４０μL、滅菌水を２４μLの割合で混合した混合液をプラスチック基板へ投入した。
【０１５０】
次に、カバーガラスをかけ、２００μLの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において、３７℃で３０分間反応させた。それから基板を洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（BCIP／NBT Phosphatase Substrate（1-Component System）（KPL））に浸漬し、３７℃で３０分間反応させてから基板を洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。
【０１５１】
発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。
【０１５２】
実施例２について、上記検出実験を、標的核酸配列の濃度が０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８copies／μL の７水準の濃度について実施した。同様に、１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを固定化した比較対照実験についても、標的核酸配列の濃度が０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８copies／μL の７水準の濃度について実施した。
【０１５３】
そして、実施例２と比較対照実験での上記各濃度における発色シグナル量を比較した。比較結果を図９に示す。その結果、図９から分かるように、オリゴヌクレオチド鎖が１種類のみである比較対照実験は、標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１０６ copies／μL以上必要であった。
【０１５４】
これに対して、実施例２の、オリゴヌクレオチドが２種類で伸長反応産物から架橋構造を形成する場合、標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１００ copies／μL以上あれば十分であり、極めて低濃度の標的核酸配列であっても検出が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図
【図２】本発明の第１の実施の形態で形成される網目状空間の概念図
【図３】本発明の第１の実施の形態の操作手順を示すフローチャート
【図４】本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図
【図５】本発明の第２の実施の形態で形成される網目状空間の概念図
【図６】本発明の第２の実施の形態の操作手順を示すフローチャート
【図７】実施例における基板上に発色した発色画像の説明図
【図８】第１の実施例において発色画像を数値化した結果の平均Ｓ／Ｎ比を示す表図
【図９】第２実施例における結果を示すグラフ
【符号の説明】
【０１５６】
１０…標的核酸配列、１２…オリゴヌクレオチド鎖、１４…オリゴヌクレオチド鎖、１６…基板、１８…架橋構造体、１９…標的核酸配列、２０…網目状空間、２２…リガンド、２４…第１のオリゴヌクレオチド鎖、２６…第２のオリゴヌクレオチド鎖、２８…第１の伸長反応産物、３０…第１の伸長反応鎖（２本鎖）、３４…第２の伸長反応鎖（２本鎖）、３６…第２の伸長反応産物
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板に係り、特に検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で、しかも簡易かつ低コストで検出するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、検体固有の核酸配列を標的として検出する方法としては、基板上に固定化させたオリゴヌクレオチド鎖に標的核酸配列を結合させ、結合した標的核酸配列に蛍光物質を標識した異なるオリゴヌクレオチド鎖を結合させる。そして、特定波長の光（レーザー光等）を当てることで、標識蛍光物質の反射光シグナルを検出・増幅することで特定の核酸配列が検体サンプル中に存在するかを検出する。別の検出方法としては、基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖に、標的核酸配列を結合させ、オリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、結合した標的核酸配列を鋳型として伸長反応させ、その際に取り込まれる塩基物
質に蛍光物質を標識する。そして、特定波長の光（レーザー光等）を当てることで、標識蛍光物質の反射光シグナルを検出・増幅する。
【０００３】
しかし、これらの検出方法は、蛍光物質を検出しなくてはならないため、特定波長光を出す特殊な検出装置を必要とするため検出装置が高価であり、一部の研究期間や大学機関等に使用が限定されている状況である。したがって、例えば水処理現場等において、水（検体サンプル）中におけるノロウイルス、クリプトスポリジウム等の病原微生物を簡易に検出する手法としては、操作が繁雑なうえ分析装置が高価な為、採用できないという問題がある。
【０００４】
このような背景から、例えば水処理等の検出を行う現場において低コストで簡便に特定の核酸配列を標的として検出する方法として、非特許文献１、特許文献１、特許文献２に記載されるＭＰＥＸ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＥＸｔｅｎｓｉｏｎ 法）が開発されている。
【０００５】
このＭＰＥＸ法は、基板上で酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）によるＤＮＡ伸長反応を利用した遺伝子検査方法で、遺伝子変異解析、一塩基遺伝子変異SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）解析、微生物同定にも使用される方法である。リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、標的核酸配列を投入後、２本鎖ＤＮＡは基板上で熱変性させ１本鎖にし、それを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を行う際、全体もしくは一部の塩基にリガンドを修飾することで伸長反応産物（増幅ＤＮＡ）に取り込み、最後にリガンドに対する活性物質を投入、反応させることで、高感度な遺伝子検出を可能とする方法である。
【非特許文献１】K. Kinoshita et al., Multiple primer extension by DNA polymerase on a novel plastic DNA array coated with a biocompatible polymer, Nucleic Acid Research, Vol.35, No.1, 2007, pp.e3
【特許文献１】特開２００６−１７４７８８号公報
【特許文献２】特開２００７−２２２０１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発色色素は蛍光物質に比べて検出シグナルの増幅感度が劣るため、例えばノロウイルス、クリプトスポリジウム等のように、水（検体サンプル）中に極微量のオーダでしか存在せず、しかも培養により増殖できない病原微生物を、ＭＰＥＸ法を用いて検出するには、高感度な検出ができないという課題がある。
【０００７】
ＭＰＥＸ法により高感度で検出するには標識を増やす必要があり、そのためにはＰＣＲ法等により標的核酸配列の濃度を高める工程が必要となるため、結果が得られるまでに長時間を要するという欠点がある。
【０００８】
したがって、ノロウイルス、クリプトスポリジウム等のように、水中に極微量のオーダでしか存在せず、しかも培養により増殖できない病原微生物を、ＭＰＥＸ法を用いて検出するには更なる改良が必要となる。
【０００９】
また、たとえ蛍光物質を使用したとしても、上記の病原微生物のように検出すべき特定の遺伝子が極めて微量である場合には、検出感度の不安定化を招き、精度のよい検出ができない。
【００１０】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度な検出が可能であり、しかも低コスト・短時間での検出が可能である核酸配列の検出方法及びその方法を用いた核酸配列検出基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、基板上に、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより複数の前記オリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、前記複数のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所の相補的部分を結合させることによって架橋状態の多数の架橋構造体を形成し、前記基板上に前記架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００１２】
ここで標的核酸配列とは、検出標的の塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡをいう。
【００１３】
本発明の請求項１によれば、基板表面にオリゴヌクレオチド鎖の一方の末端を固定化して立設し、固定化したオリゴヌクレオチド鎖と相補的な配列を有する標的核酸配列（１本鎖）を少なくとも二箇所で結合させ、基板上に架橋状態の架橋構造体を形成させることにより微細な網目状空間を作り出し、この網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用で取り込み、リガンドに反応する活性物質で発色させるようにした。
【００１４】
このように、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には、基板上に網目状空間が形成されるようにし、この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で取り込まれるようにしたので、発色関係物質の構成成分でリガンドに反応する活性物質を投入することで、発色形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度に検出できる。また、伸長反応を必要としないので、検出に要する時間を短時間で行うことができる。更には、蛍光色素とは異なり、発色色素を使用することができるため、高価な検出装置等が必要なくなるので、低コストでの検出を行うことができる。
【００１５】
なお、オリゴヌクレオチド鎖は、標的核酸配列の少なくとも２箇所に対して相補的な核酸配列を有するものを予め設計するとよい。ここで、標的核酸配列の情報は、ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ）等を利用してインターネット等により知ることができる。したがって、標的核酸配列の２箇所の部位において検体固有の核酸配列を探し出し、２つの固有核酸配列を、第１のオリゴヌクレオチド鎖と第２のオリゴヌクレオチド鎖とにそれぞれ割り当てればよい。
【００１６】
請求項２に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、基板上に、多数のオリゴヌクレオチド鎖を固定化し、その後、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルを投入すると共に、発色関係物質の構成成分であるリガンドを投入し、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性し一本鎖になる温度にし、その後、前記反応系の温度を前記オリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所とが相補的に結合するハイブリダイゼーション温度にし、その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応させ、前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００１７】
請求項２は、請求項１が発明をメカニズム的な特徴からとらえたのに対して、操作手順の特徴として発明をとらえたものである。
【００１８】
請求項２によれば、発色関係物質の構成成分であるリガンドを含む反応系においてハイブリダイゼーション反応を行うことにより、請求項１に示す架橋構造体が多数形成される。そして、この架橋構造体にリガンドが物理的な吸着作用により多数取り込まれることにより、強い発色シグナルを発色することができ、高感度な検出が可能となる。
【００１９】
請求項３は請求項１又は２において、前記オリゴヌクレオチド鎖として、前記標的核酸配列の少なくとも二箇所に対して相補的な核酸配列を有する一対の組み合わせを、前記固定化の前に予め設計し、該設定した一対のオリゴヌクレオチド鎖を多数組、前記基板上に固定化することを特徴とする。
【００２０】
請求項４に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応をさせて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計する設計工程と、基板上に、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端を固定化することにより前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とを相補的に結合して前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として第１の伸長反応をさせる第１の伸長反応工程と、前記標的核酸配列から前記第１の伸長反応工程で伸長した第１の伸長反応産物を解離させる第１の解離工程と、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第１の伸長反応産物を結合して前記第１と第２のオリゴヌクレオチド鎖の間に架橋構造を形成する第１の架橋工程と、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記第１の伸長反応産物を鋳型として第２の伸長反応をさせる第２の伸長反応工程と、前記第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物を解離させる第２の解離工程と、多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖について前記第１の伸長反応工程から前記第２の解離工程までを行い、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第２の伸長反応産物を結合して前記第２と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第２の架橋工程と、多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１と第２の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、前記繰返し架橋工程により、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００２１】
本発明の請求項４は、網目状空間を請求項１とは別の方法で形成するようにしたものである。即ち、本発明の請求項４によれば、基板表面に５’末端を固定化した第１のオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列とを相補的に結合させた後、第１のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなると共に標的核酸配列を鋳型として伸長反応することにより形成され、標的核酸配列と相補的な核酸配列である第１の伸長反応鎖が解離する。そして、解離した第１の伸長反応産物と、基板表面に一方の末端を固定化した第２のオリゴヌクレオチド鎖とを相補的に結合させた後、第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物を鋳型として伸長反応させることにより第２の伸長反応鎖を形成し、第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物を解離させる。
【００２２】
これにより、基板上には、伸長反応及び解離反応によって核酸配列による架橋構造が多数形成され、この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより、基板上に網目状空間を形成することができる。
【００２３】
ここで、標的核酸配列の情報は、ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratory）、ＧｅｎＢａｎｋ）等を利用してインターネット等により知ることができる。したがって、標的核酸配列において検体固有の核酸配列を探し出し、第１のオリゴヌクレオチド鎖とする。また、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、第１の伸長反応産物と相補的な核酸配列となるように設計する。また、請求項４の場合には、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖は異なる核酸配列に設計することになる。
【００２４】
本発明の請求項４は、網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用で取り込み、リガンドに反応する活性物質で発色させるようにしている。このように、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在する場合には、基板上に網目状空間が形成されるようにし、この網目状空間に発色させるため発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で取り込まれるようにし、このリガンドに対しする活性物質を投入することで、発色形成物質を網目状空間に高濃度に取り込むことができる。これにより、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度に検出できる。また、発色シグナル量は伸長反応量に大きく依存しない為、検出に要する時間を短時間で行うことができ、高価な検出装置等が必要なくなるので、低コストでの検出を行うことができる。
【００２５】
請求項５は請求項４において、前記第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物が、前記第２の伸長反応産物と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合して、第３のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、前記第２の伸長反応産物を鋳型とした第３の伸長反応工程と、第２の伸長反応産物と前記第３の伸長反応工程で伸長した第３の伸長反応産物を解離させる第３の解離工程と、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第３の伸長反応産物を結合して前記第３と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第３の架橋工程と、多数の前記第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１、第２と第３の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、を備えたことを特徴とする。
【００２６】
請求項５は、３個のオリゴヌクレオチド鎖を用いる場合であり、結合反応→伸長反応→解離反応を繰り返すことで、解離した伸長反応産物を次々に利用して網目状空間を形成することができるので、標的核酸配列の濃度が更に小さい場合でも高感度の検出が可能となる。また、仮に第1のオリゴヌクレオチド鎖が標的核酸配列に結合できなくとも、変わりに第３のオリゴヌクレオチド鎖が結合できれば反応は進行するため、検出感度の安定化が図れる。尚、請求項５では、３個のオリゴヌクレオチド鎖を用いる場合であるが、４個以上であれば更に好ましい。したがって、検体サンプル中に存在する標的核酸配列の濃度に応じて、濃度が小さい場合には、設計するオリゴヌクレオチド鎖を多くすれば、より高い感度での検出が可能となる。
【００２７】
請求項６は請求項４又は５において、前記繰返し架橋工程後において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にするハイブリダイゼーション工程を備えたことを特徴とする。
【００２８】
これにより、前記繰返し架橋工程後において、架橋反応できていない伸長反応産物を基板上に５’末端固定したオリゴヌクレオチド鎖と結合させ、より多くの架橋構造が多数形成され、この多数の架橋構造体が複雑に絡み合うことにより、より高い感度での検出が可能となる。
【００２９】
請求項７に記載の発明は、前記目的を達成するために、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応させて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計し、基板上に、前記設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を多数固定化し、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンドとを混合した混合液を調製し、前記混合液を基板に投入すると共に、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性する熱変性温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とが相補的に結合して第１の伸長反応を行う第１の伸長反応温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第１の伸長反応により形成された第１の伸長反応鎖から第１の伸長反応産物が解離する第１の解離温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記解離した第１の伸長反応産物反と前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合して第２の伸長反応を行う第２の伸長反応温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記第２の伸長反応により形成された第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物が解離する第２の解離温度にし、その後、前記反応系の温度を、前記解離した第２の伸長反応産物反と前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合する温度にし、その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応する温度にし、前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法を提供する。
【００３０】
請求項７は、請求項４が発明をメカニズム的な特徴からとらえたのに対して、操作手順の特徴として発明をとらえたものである。
【００３１】
請求項８は請求項１〜７の何れか１において、前記リガンドが、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３２】
請求項８は、リガンドとして好ましい具体例を挙げたものである。
【００３３】
請求項９は請求項１〜７の何れか１において、前記リガンドが、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３４】
請求項９は、リガンドとして好ましい更に別の具体例を挙げたものである。
【００３５】
請求項１０は請求項１〜９の何れか１において、前記活性物質が、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする。
【００３６】
請求項１０は、活性物質として好ましい具体例を挙げたものである。
【００３７】
請求項１１は請求項１〜９の何れか１において、前記基板表面には、親水性ポリマーからなる層と、及びアミノ基と反応する官能基とを有することを特徴とする。
【００３８】
請求項１１によれば、これにより、オリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する性質と、オリゴヌクレオチド鎖を基板上に強固に固定化することができる。
【００３９】
本発明の請求項１２は、前記目的を達成するために、請求項１〜１１の何れか１の核酸配列の検出方法を行うための核酸配列検出基板であって、前記基板上にオリゴヌクレオチド鎖がスポットされていることを特徴とする核酸配列検出基板を提供する。
【００４０】
本発明の請求項１２によれば、標的核酸配列を検出するための検体サンプルを、本発明の核酸配列検出基板にスポット（滴下）させ、反応させることにより、目視により、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。
【発明の効果】
【００４１】
以上説明したように、本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板によれば、検出すべき特定の標的核酸配列の濃度が極めて微量である場合であっても、高感度な検出が可能であり、しかも低コスト・短時間での検出が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、添付図面に従って本発明に係る核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板の好ましい実施の形態について詳説する。
【００４３】
［本発明の第１の実施の形態］
図１は、本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図である。
【００４４】
図１におけるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、核酸配列を構成する塩基を示し、Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミンである。
【００４５】
本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態は、主として、設計工程と、固定化工程と、架橋工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、発色工程と、検出工程とで構成される。なお、設計工程は、標的核酸配列ごとに行う工程であり、標的核酸配列が予め分かっている場合には省略してもよい。また、本実施形態では、架橋工程と網目状空間形成工程とを別々に説明するが、同時に行われる一つの工程(網目状空間形成工程)としてもよい。
【００４６】
予め、検体サンプル中の検出標的である標的核酸配列（例えば標的ＤＮＡ）１０を一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に架橋させるためのオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の核酸配列の設計を行う（設計工程）。ここで、架橋される標的核酸配列１０は、熱変性により２本鎖から１本鎖になったものを指す。
【００４７】
即ち、インターネット等によりＤＮＡデータバンクに保管されている情報の中から、検出しようとする標的核酸配列１０の核酸配列を予め調べておき、その核酸配列の２箇所の部位と一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４とがそれぞれ相補的に結合するように一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の核酸配列を設計する。
【００４８】
図１（Ａ）の左側のオリゴヌクレオチド鎖１２の核酸配列を基板１６側から３’-ＴＡＧＧＣＡ-５’として、標的核酸配列１０の一方端の配列部分５’-ＡＴＣＣＧＴ-３’と相補性を有するように設計する。また、図１（Ａ）の右側のオリゴヌクレオチド鎖１４の核酸配列を基板１６側から５’-ＴＣＴＧＴＣ-３’として、標的核酸配列１０の他方端の配列部分３’-ＡＧＡＣＡＧ-５’と相補性を有するように設計する。即ち、標的核酸配列１０の２箇所の部位において相補性を有する核酸配列を、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４にそれぞれ割り当てる。尚、設計するオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の塩基数は、６〜３０の範囲であることが好ましい。
【００４９】
オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の設計において、検体サンプル中に含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列（例えば、動物、植物、人等のＤＮＡ）が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に結合されないように、標的核酸配列１０固有の核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を設計する。
【００５０】
一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４は、核酸配列が同じものでもよく、あるいは異なっていてもよいが、標的核酸配列１０が一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４、標的核酸配列１０の間で架橋を形成可能なように、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１２、１４に対応する標的核酸配列１０の２箇所の部位が離れていることが必要である。但し、２箇所の部位が標的核酸配列１０の両端に位置する必要はない。
【００５１】
次に、図１（Ａ）に示すように、基板１６上に、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を基板上に立たせる（固定化工程）。図１（Ａ）では、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４のみを示したが、基板１６上には一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４が多数組立設される。尚、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４が多数組とは、オリゴヌクレオチド鎖１２とオリゴヌクレオチド鎖１４とが完全に等量関係にあることを意味するものではない。
【００５２】
上記の如く準備された基板１６上に、標的核酸配列１０を含む検体サンプルをスポット（滴下して投入）して、架橋工程〜検出工程までを行う。即ち、図１（Ｂ）に示すように、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４のそれぞれと、標的核酸配列１０の相補的部分が結合し、架橋状態の架橋構造体１８を形成する。
【００５３】
この架橋工程において、検体サンプルに含まれる標的核酸配列１０以外の核酸配列は、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４と相補的な関係にはないので、架橋構造体１８を形成することはない。
【００５４】
この一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の多数組について架橋工程を行うことにより、基板１６上には、図２に示すように、架橋構造体１８が多数複雑に絡み合った微細な網目状空間２０を形成する（網目状空間形成工程）。尚、図２では分かり易いように、網目状空間１８を簡素化して図示したが、実際には架橋構造体１８が複雑に絡み合って密集した網目状空間２０となる。網目状空間２０が形成されることは、例えば電子顕微鏡で直接的に確認可能であると推察される。また、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４について、標的核酸配列１０と相補性を小さくするように核酸配列を設計することで、発色工程での発色シグナルが小さくなり、オリゴヌクレオチド鎖のどちらか一方を排除すると、発色シグナルが得られないことから、間接的に確認することができる。
【００５５】
この網目状空間２０に、図１（Ｃ）に示すように、発色関係物質の構成成分である多数のリガンド２２を物理的な吸着作用により取り込むことができる（取込み工程）。尚、図１（Ｃ）では分かり易いように、１つの架橋構造体１８で示してあるが、実際には図２に示したように、多数の架橋構造体１８が複雑に絡み合った網目状空間２０にリガンド２２が物理的な吸着作用で取り込まれる。ここで物理的な吸着作用とは、小さい孔には小さな化学物質が入り込み易いことを利用したもので、特定の化学物質に特定の化学物質が結合し易いのとは異なり、非特異的な作用を意味する。
【００５６】
したがって、取り込んだ多数のリガンド２２に対して、該リガンド２２に反応する発色関係物質の構成成分である活性物質（図示せず）を用いて発色させ（発色工程）、発色した発色シグナルを検出すれば、高感度の検出を行うことができる。また、発色シグナルの検出は、吸光度装置、イメージスキャナ等の汎用装置を使用することができるだけでなく、発色色素により可視化されることで目視により簡便に検出することができる。
【００５７】
リガンド２２としては、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかを好ましく使用できる。更に、リガンドとして、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかを使用することができる。また、活性物質としては、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかを好ましく使用することができる。
【００５８】
発色工程を、リガンドとしてビオチンを用い、リガンドと反応する活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジンを用いた例で説明すると、ビオチンはアビジンと反応（ビオチン反応）して、特異的に強固な結合を形成する。したがって、網目状空間２０にビオチンを取り込み、アルカリフォスファターゼ標識アジビンをビオチンに反応させることで、たくさんのアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）がビオチンに結合する。アジビン１に対してビオチン４の割合で結合する。そして、アルカリフォスファターゼは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴという基質に反応（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応）して青紫色になるので、この色を検出する。
【００５９】
ＢＣＩＰ:５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルリン酸
ＮＢＴ:ニトロブルーテトラゾリウム
したがって、本発明のように網目状空間２０にリガンド２２であるビオチンを多量に取り込むことで、ビオチン反応と、アルカリフォスファターゼに対するＢＣＩＰ／ＮＢＴ反応とが増幅され、強い発色シグナルが形成される。
【００６０】
ビオチンの代わりに、薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いる方法もある。この場合アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にＢＣＩＰ／ＮＢＴで青紫色に発色させる。これにより、高感度な検出が可能になる。
【００６１】
本発明の実施の形態において使用される基板１６表面には、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。親水性ポリマーからなる層は、主としてオリゴヌクレオチド鎖の非特異的結合を抑制する役割を果たし、アミノ基と反応する官能基はオリゴヌクレオチド鎖を化学的に基板上に固定化する役割を果たす。特に、オリゴヌクレオチド鎖は、アミノ基と反応する官能基の部位で共有結合することによって、当該基板１６の表面に強固に固定化される。
【００６２】
本実施の形態で使用する親水性ポリマーとしては、親水性基を主鎖又は側鎖に有する高分子物質が挙げられ、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリアクリルアミド、及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものであることが好ましい。特にポリアクリルアミドを光架橋性化合物等で３次元架橋した網目構造を有するポリアクリルアミドゲルが好ましい。
【００６３】
また、本実施の形態に使用するアミノ基と反応する官能基としては、アルデヒド基、活性エステル基等が挙げられるが、活性エステル基が好ましい。活性エステル基は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、例えば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基、等が好ましく、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がより好ましい。
【００６４】
アミノ基と反応する官能基は、基板表面に直接導入されていても良いし、親水性ポリマー構造の主鎖又は側鎖に有していても良い。
【００６５】
（第１の実施の形態の検出方法を行う操作手順）
次に、図３のフローチャートにより、第１の実施の形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚、基板１６は、基板表面に、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。
【００６６】
ステップ１では、上記したように、一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４の間に標的核酸配列１０が架橋するように、標的核酸配列１０の２箇所の部位に対して、それぞれ相補的な関係を有する一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を設計する。
【００６７】
次に、ステップ２において、基板１６上に一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化する。固定化する方法としては、基板１６上の表面に存在する、又は親水性ポリマーに含まれるアミノ基と反応する官能基のうち、少なくとも一部のアミノ基と反応する官能基とオリゴヌクレオチド鎖１２、１４とを反応させて共有結合を形成させることにより、基板１６表面でオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化する。続いて、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基を不活性化する。即ち、残りのアミノ基と反応する官能基を不活性化することにより、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４を基板１６の表面に固定することができる。基板１６表面に固定化されなかったオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。洗浄後はオリゴヌクレオチド鎖１２、１４を固定化した以外の基板１６表面のアミノ基と反応する官能基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００６８】
ステップ３では、標的核酸配列１０を含む検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン）とを混合した混合液を調製する。
【００６９】
次に、ステップ４では、標的核酸配列が一本鎖か、二本鎖かが判断され、ＮＯであれば、ステップ５において、検体サンプルを投入した反応系の温度を、標的核酸配列１０の融解温度（melting temperature:Tm）以上、例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより、２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また、一本鎖であっても、複雑な二次構造等を形成している場合は、熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば、ステップ６へ進む。
【００７０】
ステップ６では、基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液をハイブリダイゼーション温度に調節して、混合液を基板へ投入（滴下）する。ハイブリダイゼーション温度は、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の融解温度（Ｔｍ）の２〜８℃低い値が好ましい。
【００７１】
ステップ７では、オリゴヌクレオチド鎖１２、１４の融解温度（Ｔｍ）の２〜８℃低い温度でハイブリダイゼーション反応を行う。反応時間としては、６０分以上であることが好ましい。これにより、上記の如く設計された一対のオリゴヌクレオチド鎖１２、１４と、標的核酸配列１０の相補的部分（２箇所）とがそれぞれ相補的に結合し、架橋状態の架橋構造体１８を形成する。かかる架橋構造体１８が多数形成され、複雑に絡み合うことで網目状空間２０が形成される。そして、この網目状空間２０に投入したリガンド２２が物理的な吸着作用で取り込まれることにより、多数のリガンド２２を取り込むことができる。
【００７２】
次に、ステップ８では、基板１６反応液を捨てて、基板１６を洗浄液、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄する。
【００７３】
次に、ステップ９では、活性物質（例えばアルカリフォスファターゼ標識アビジン）を基板１６上に投入して、網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２との反応により結合させる。反応温度及び反応時間としては、反応温度が２０〜４０℃の範囲が好ましく、反応時間が５〜６０分の範囲が好ましい。
【００７４】
次のステップ１０では、前記したステップ９の反応を更に続けるか否かが判断され、反応が十分であり、ＮＯであれば次のステップ１１に進み、反応が未だ不十分であり、ＹＥＳであればステップ８に戻り、洗浄工程を経て、ステップ９で、活性物質（例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を基板１６上に投入して、網目状空間２０に取り込まれたリガンド２２と反応した活性物質に、更に反応させる。反応温度及び反応時間としては、反応温度が２０〜４０℃の範囲が好ましく、反応時間が５〜６０分の範囲が好ましい。
【００７５】
ステップ１１では、再び基板１６の洗浄を行い、ステップ１２で発色シグナルの検出を行う。例えば、リガンド２２としてビオチンを用い、活性物質としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン用いた場合には、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬中に基板１６を浸漬して青紫色のスポットを発色させる。発色させた発色シグナルは、目視で検出してもよく、あるいは発色画像をイメージスキャナでパソコンに取り込んで解析してもよく、更には吸光度測定装置で発色度合いを測定してもよい。
【００７６】
このように、検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には、網目状空間２０が形成され、網目状空間２０に発色関係物質に構成成分であるリガンド２２が多数保持されることになるので、強い発色シグナルを発色することが可能になる。これにより、検体サンプル中に標的核酸配列１０が存在する場合には、高感度な検出が可能となる。
【００７７】
［本発明の第２の実施の形態］
図４は、本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図であり、網目状空間２０を第１の実施の形態とは別の方法で形成する。尚、第１の実施の形態と同じものについては同符号を付して説明する。
【００７８】
本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態は、主として、設計工程と、固定化工程と、第１の伸長反応工程と、第１の解離工程と、第１の架橋工程と、第２の伸長反応工程と、第２の解離工程と、第２の架橋工程と、繰返し架橋工程と、ハイブリダイゼーション工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、発色工程と、検出工程とで構成される。
【００７９】
予め、標的核酸配列１９と、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において、伸長反応により産出された伸長反応産物２８、３６が架橋構造を形成するように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の核酸配列を設計する（設計工程）。即ち、標的核酸配列１９と第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とが相補的に結合した後に、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとすると共に標的核酸配列１９を鋳型として第１の伸長反応をさせて形成される第１の伸長反応鎖３０が標的核酸配列１９から解離して、相補的な核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合できるように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を設計する。標的核酸配列１９の核酸配列については、第１の実施の形態と同様にＤＮＡデータバンクから情報を得ることができる。
【００８０】
図４（Ａ）の左側の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４の核酸配列を基板１６側から５’-ＴＡＧＧＣＡ-３’として、標的核酸配列１９の片端の配列部分３’-ＡＴＣＣＧＴ-５’と相補性を有するように設計する。また、図４（Ａ）の右側の第２のオリゴヌクレオチド鎖２６の核酸配列を基板１６側から５’-ＡＧＡＣＡＧ-３’として、第１の伸長反応産物２８の片端の配列部分３’-ＵＣＵＧＵＣ-５’と相補性を有するように設計する。尚、伸長反応に使用された塩基Ｕ（ウラシル）にはビオチンが付けられた場合で示してある。ビオチン非標識時は塩基Ｔを使用。塩基のＵは、本来ＲＮＡを構成する塩基だが、ビオチンを標識とすることで化学構造的に塩基のＴに近くなるため、ＤＮＡポリメラーゼでの伸長反応が可能となる。
【００８１】
次に、図４（Ａ）に示すように、基板１６上に、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の５’末端を固定化することにより、一対のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を基板上に立たせる（固定化工程）。
【００８２】
図４（Ａ）では、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６をそれぞれ１本ずつのみを示したが、基板１６上には第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６が多数立設される。
【００８３】
上記の如く準備された基板１６上に、標的核酸配列１９を含む検体サンプルをスポット（滴下により投入）し、第１の伸長反応工程〜検出工程までを行う。即ち、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、熱変性により解離した１本鎖の標的核酸配列１９の相補的部分が結合した後、標的核酸配列１９を鋳型とし、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行うと、従来のＭＰＥＸ法と同様に図４（Ｂ）のような二本鎖核酸配列が形成される（第１の伸長反応工程）。しかし、伸長反応を第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６のＴｍ（融解温度）温度領域で行った場合、伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６と相補的な領域は、常に一本鎖に解離する可能性があり、また、基板１６上には、伸長反応産物２８と相補的に結合するよう予め設計された第２のオリゴヌクレオチド鎖２６が固定化されているため、伸長反応産物２８の一部は、標的核酸配列１９と解離した後に（第１の解離工程）、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合し、架橋状態を形成する（第１の架橋工程）。
【００８４】
即ち、第１の伸長反応により伸長する第１の伸長反応産物２８のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６と相補的な領域は、Ｔｍ温度領域という不安定なエネルギー状態において、分子構造的に安定した状態を目指すため、図４（Ｃ）に示すように、相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合することとなる。図４（Ｃ）に記載した「ブリッジング」との用語は、２つ以上の一端が固定化されたオリゴヌクレオチド間を標的核酸配列が架橋することを意味する。そうした意味で、第１の実施の形態のように一対のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６に標的核酸配列１０が架橋することもブリッジングと言える。
【００８５】
尚、検体サンプルに含まれる標的核酸配列１９以外の核酸配列のものは、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と相補的な関係にはないので、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４に結合して伸長反応を行うことはない。
【００８６】
第１の伸長反応の際、使用する酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、双方を混合したものが含まれる。
【００８７】
次に、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として図４（Ｄ）に示すような伸長反応が起こる（第２の伸長反応工程）。尚、図４（Ｄ）では、図を簡素化するために、標的核酸配列１９は図示していないが、このとき標的核酸配列１９は第１のオリゴヌクレオチド鎖２４から解離し、別の第１のオリゴヌクレオチド鎖と結合する。
【００８８】
第２以降の伸長反応の際、酵素はＤＮＡポリメラーゼを使用する。この時、ＤＮＡポリメラーゼはpolI型のもの（例えば、Ｔａｑ（タカラバイオ））でも可能だが、耐熱性α型のもの（例えば、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ））が好ましく、鎖置換活性を有するものを使用することがより好ましい。鎖置換活性を有することにより、鋳型ＤＮＡもしくはｃＤＮＡに二本鎖を形成している箇所が存在しても、水素結合を切断しながら伸長反応を進めることが容易となる。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、Klenow Fragment、phi29 DNA polymerase、BcaBEST DNA polymerase、Bst DNA polymerase等が上げられる。反応温度は前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６のＴｍ値以上、６５℃未満が好ましく、反応時間は２０〜９０分が好ましい。
【００８９】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６は多数を基板１６上に固定化している。そこで、第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６が、第１の伸長反応産物２８から解離し（第２の解離工程）、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり、かつ、同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合し、架橋状態を形成する（第２の架橋工程）。この状態から、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４がプライマーとなるため、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６、の間で第１と第２の架橋工程が繰り返されることとなる（繰返し架橋工程）。その後、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にすることで（ハイブリダイゼーション工程）、基板１６上に、より多くの架橋構造体を形成させることとなる。ハイブリダイゼーション温度は、オリゴヌクレオチド鎖２４、２６の融解温度（Ｔｍ）から２〜８℃低い温度が好ましい。
【００９０】
これにより、図５に示すように、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成され（網目状空間形成工程）、第１の実施の形態と同様に、網目状空間２０に取り込んだ多数のリガンド２２に対して（取込み工程）、該リガンド２２に反応する活性物質を用いて発色させ（発色工程）、発色した発色シグナルを検出すれば、高感度の検出を行うことができる。
【００９１】
（第２の実施の形態の検出方法を行う操作手順）
次に、図６のフローチャートにより、第２の実施の形態の検出方法を行う操作手順のフローを説明する。尚、基板１６は、基板表面に、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在する場合で説明する。
【００９２】
ステップ１では、上記したように、標的核酸配列１９と、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６との各核酸配列の関係において、伸長反応により産出された第１の伸長反応産物２８、３６が架橋構造を形成するように、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６の核酸配列を設計する。
【００９３】
ステップ２では、基板１６上に、設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を固定化する。固定化する方法としては第１の実施の形態で説明したので省略する。
【００９４】
ステップ３では、標的核酸配列１９を含む検体サンプルと、発色関係物質の構成成分であるリガンド２２（例えばビオチン標識ｄＵＴＰ）とを混合した混合液を調製する。
【００９５】
次に、ステップ４では、標的核酸配列が一本鎖か、二本鎖かが判断され、ＮＯであれば、ステップ５において、検体サンプルを投入した反応系の温度を、標的核酸配列１０の融解温度（melting temperature:Tm）以上、例えば９０〜９５℃に上昇させる。加熱時間は１〜１０分程度が好ましい。これにより、２本鎖の標的核酸配列１０を解離して１本鎖の標的核酸配列１０にする。また、一本鎖であっても、複雑な二次構造等を形成している場合は、熱変性処理を行う。ＹＥＳであれば、ステップ６へ進む。
【００９６】
ステップ６では、基板１６及び検体サンプルとリガンドの混合液を基板へ投入（滴下）する。
【００９７】
次に、ステップ７では、第１の伸長反応工程と、第１の解離工程と、第１の架橋工程と、第２の伸長反応工程と、第２の解離工程と、第２の架橋工程と、繰返し架橋工程と、ハイブリダイゼーション工程と、網目状空間形成工程と、取込み工程と、を実施する。
【００９８】
即ち、第１の伸長反応工程において、標的核酸配列１９を鋳型とし、第１のオリゴヌクレオチド鎖２４をプライマーとして伸長反応を行い、第１の解離工程において、伸長反応産物２８を、標的核酸配列１９と解離させ、第１の架橋工程において、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６と結合させ、架橋状態を形成させる。
【００９９】
次に、第２の伸長反応工程において、第２のオリゴヌクレオチド鎖２６をプライマーとすると共に第１の伸長反応産物２８を鋳型として伸長反応させ、第２の解離工程において、第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物３６を、第１の伸長反応産物２８から解離させ、第２の架橋工程において、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖２４とは別であり、かつ、同じ核酸配列の第１のオリゴヌクレオチド鎖２４と結合させ、架橋状態を形成させる。
【０１００】
その後、繰返し架橋工程において、第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６、の間で第１と第２の架橋工程が繰り返させ、その後、ハイブリダイゼーション工程において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にし、基板１６上に、より多くの架橋構造体を形成させる。これにより、基板１６上に架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間２０が形成される（網目状空間形成工程）。
【０１０１】
網目状空間２０が形成された後は、第１の実施の形態と同様に、ステップ８〜ステップ１２を実施することで、標的核酸配列１９を高感度に検出することができる。
【０１０２】
尚、ステップ３において、標的核酸配列１９とリガンド２２の混合液を調製したが、リガンド２２はステップ６とステップ７との間で投入してもよい。
【０１０３】
［本発明の第２の実施の形態の変形例］
上記説明した本発明の第２の実施の形態では、第１及び第２の、２種類のオリゴヌクレオチド鎖２４、２６を用いることで説明したが、３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖を使用することもできる。
【０１０４】
例えば、３種類のオリゴヌクレオチド鎖の例で説明すると、第２の実施の形態における第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物３６が、該第２の伸長反応産物３６と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合する。結合した後は、同様に伸長反応させ、伸長反応産物を解離し、第１のオリゴヌクレオチド鎖に結合し、基板１６上に、架橋構造を形成する。これら第１から第３の繰返し架橋工程を経て微細な網目状空間を形成させる。
【０１０５】
したがって、次々に解離される伸長反応産物と相補的な関係のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計することで３種類以上のオリゴヌクレオチド鎖についても本発明の第２の実施の形態を適用することができる。
【０１０６】
第２の実施の形態において、基板１６表面には、親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基が存在することが好ましい。これにより、伸長反応による２本鎖の伸長反応鎖が熱変性処理により解離し、解離した伸長反応産物が別のオリゴヌクレオチド鎖と結合して再び伸長反応する。
【０１０７】
［核酸配列検出基板］
上述した第１及び第２の実施の形態において、オリゴヌクレオチド鎖を基板に固定化した核酸配列検出基板を製作し、この核酸配列検出基板に、例えば標的核酸配列を含む検体サンプルをスポット（投入）するだけで、検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを高感度で検出することができる。
【実施例】
【０１０８】
［実施例１］
次に、本発明の第１の実施の形態の検出方法の実施例を説明する。標的核酸配列としては、ノロウイスル固有の核酸配列を用い、この標的核酸配列を検出する例で説明する。
【０１０９】
即ち、以下の手法にて、標的核酸配列に対して相補的な一対のオリゴヌクレオチド鎖をプラスチック基板表面に固定化することで、検体サンプルとして標的核酸配列を投入した際に、基板上の一対のオリゴヌクレオチド鎖と結合し架橋状態の核酸配列構造を形成させ、その構造下に微細な網目状空間を作り出した。そして、その網目状空間に発色関係物質の構成成分であるリガンドを物理的な吸着作用で多量に取り込むことができ、これによって、標的核酸配列を高感度に検出した。
【０１１０】
即ち、標的核酸配列を、ノロウイルスｃＤＮＡのＰＣＲ産物として実験を行った。このＰＣＲ産物は、ノロウイルスの構造蛋白質であるカプシド蛋白質をコードしている領域ＯＲＦ２を対象とした。また、ノロウイルスはＧ１とＧ２の２つのグループに分けられるため、ＰＣＲ産物は、Ｇ１とＧ２の２種類を準備して実験を行った。
【０１１１】
（標的核酸配列の調整）
糞便をリン酸緩衝液に溶解し、１０％乳剤を作製し、１２,０００ｒｐｍで冷却遠心後、遠心上清からＲＮＡの抽出を行った。遠心上清を室温に戻し、ＲＮＡ抽出精製キット（QIAamp Viral RNA Mini Kit （QIAGEN））を用いＲＮＡ抽出精製後、ＲＮＡ抽出液２４μLに対し５倍濃縮したRT-PCR用Buffer３μL、滅菌水１μL、DNase （1U/μL）２μL（DNase I（タカラバイオ））を加え、３７℃−３０分、７５℃−５分を経て氷冷した。得られたＲＮＡをランダムプライマー（Random Primer Hexamer（Amersham Pharmacia））とRT反応キット（SuperScript II Reverse Transcriptase Rnase H- Reverse Transcriptase（Invitrogen））を用いｃＤＮＡへ逆転写し（４２℃−1時間（1サイクル）、９９℃−５分（1サイクル）、４℃）、そのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１（２５μM）とプライマー２（２５μM）、プライマー３（２５μM）、プライマー４（２５μM）と、ＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq（タカバイオ））とを用いたＰＣＲ反応（９４℃−3分（1サイクル）、９４℃−１分、５０℃−1分、７２℃−２分（４０サイクル）、７２℃−１５分（１サイクル））によりＧ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し、電気泳動で増幅を確認し精製後、標的核酸配列として実験に用いた。
【０１１２】
（使用したプラスチック基板）
市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製S-BIO(R) PrimeSurface(R)）を実験に用いた。この基板は、実施の形態で述べた親水性ポリマーからなる層、及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。図７に示すように、横４（１〜４）×縦６（Ａ〜Ｆ）の合計２４箇所のスポット領域があり、各スポット領域で、各核酸配列の有無を評価した。本実験では、Ｇ１のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所、Ｇ２のＰＣＲ産物検出用スポット領域を１２箇所のプラスチック基板を作製して使用した。
【０１１３】
（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
Ｇ１のＰＣＲ産物検出のため、下記に示す核酸配列で構成された一対のオリゴヌクレオチド鎖１及びオリゴヌクレオチド鎖２を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１、２は、Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖１は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１４】
一方、オリゴヌクレオチド鎖２は、３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１５】
そして、オリゴヌクレオチド鎖１の溶液と、オリゴヌクレオチド鎖２の溶液とを混合し、スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち、図７（Ｃ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ａ〜Ｃで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１〜１２）。そして、オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１１６】
また、Ｇ２のＰＣＲ産物検出のため、下記に示す核酸配列のオリゴヌクレオチド鎖３及びオリゴヌクレオチド鎖４を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチド鎖３、４は、Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。オリゴヌクレオチド鎖３は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１７】
一方、オリゴヌクレオチド鎖４は、３’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２３塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）で溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１１８】
そして、オリゴヌクレオチド鎖３の溶液と、オリゴヌクレオチド鎖４の溶液とを混合し、スポッタ（日立ソフトウェア−エンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。即ち、図７（Ｂ）に示すプラスチック基板の横１〜４×縦Ｄ〜Ｆで区画される１２個のスポット領域にスポットした（スポット領域１３〜２４）。そして、オリゴヌクレオチド鎖をスポットした各基板を、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１１９】
上記したＧ１及びＧ２のＰＣＲ産物を調製したときのプライマー１〜４の核酸配列、及びプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖１〜４の核酸配列は次のとおりである。
・プライマー１（COG1F）：5’-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3’
・プライマー２（G1-SKR）：5’-CCAACCCARCCATTRTACA-3’
・プライマー３（COG2F）： 5’-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG -3’
・プライマー４（G2-SKR）：5’-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3’
・オリゴヌクレオチド鎖１（G1SKF）：5’-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3’
・オリゴヌクレオチド鎖２（G1-1’）： 5’-CCAACAAACATGGATGGCAC-3’
・オリゴヌクレオチド鎖３（RING2AL-TP）： 5’-TGGGAGGGSGATCGCRATCT-3’
・オリゴヌクレオチド鎖４（G2SKRrc）5’-ATGTAYAAYGGDYATGCNGGYGG-3’
IUB Codes(Code of international Union of Biochemistry). R=A or G ; B=C, G or T ; Y=C or T ; D=A, G or T ; K=G or T ; H=A, C or T ; M=A. or C ; V=A, C or G ; S=G or C ; W=A or T ; N=any base.
（ハイブリダイゼーション）
上記の如く一対のオリゴヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖１とオリゴヌクレオチド鎖２の一対、オリゴヌクレオチド鎖３とオリゴヌクレオチド鎖４の一対）を固定化したプラスチック基板に、準備した標的核酸配列を５９μｍと、ハイブリバッファーを１３μLと、８μLのビオチンを混合した混合液を投入した。
【０１２０】
尚、図7（Ａ）の基板は、上記の如く各オリゴヌクレオチド鎖を固定化した基板に、標的核酸配列を含まない検体サンプルを投入した場合である。
【０１２１】
そして、基板上の反応系を９５℃、８分間の加熱条件で加熱することにより、標的核酸配列の２本鎖を熱変性して解離させて１本鎖にし、更に反応系を５４℃で９０分間ハイブリダイズさせた。
【０１２２】
次に、洗浄後、０．０１ｍｇ／ｍLのアルカリフォスファターゼ標識ストレフトアビジンを基板上へ投入し、カバーガラスで覆い、反応系を３７℃で３０分反応させた。その後、洗浄を行い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（BCIP／NBT Phosphatase Substrate（1-Component System）（KPL））発色試薬中に基板を浸漬し、３７℃で３０分間反応させて洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。発色画像を図7に示す。また、数値化結果の平均Ｓ／Ｎ比（Signal to Noise Ratio）を下記の式１から求め、図8の表１に示す。
【０１２３】
Ｓ／Ｎ比＝１×Ｓ／（Ｓ＋Ｎ）…式１
Ｓ／Ｎ：非測定時に対する測定時の発色強度の比率：最大値１．０
Ｓ：測定時の発色シグナルの強度
Ｎ：非測定時の発色シグナルの強度
その結果、Ｇ１のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合、図7（Ｃ）から分かるように、スポット領域１〜１２のみが発色した。一方、Ｇ２のＰＣＲ産物を標的核酸配列とした場合、図7（Ｂ）から分かるように、スポット領域１３〜２４のみが発色した。
【０１２４】
比較対象としてＰＣＲ産物（標的核酸配列）を加えなかった場合は、図7（Ａ）から分かるように、オリゴヌクレオチド鎖１、２を固定化した場合、及びオリゴヌクレオチド鎖３、４を固定化した場合のいずれについても発色が得られなかった。
【０１２５】
尚、図示しなかったが、ＤＮＡアレイプラスチック基板のオリゴヌクレオチドの固定において、Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖１のみ（スポット領域１〜６）、オリゴヌクレオチド鎖２のみ（スポット領域７〜１２）、Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為のスポットがオリゴヌクレオチド鎖３のみ（スポット領域１３〜１８）、オリゴヌクレオチド鎖４のみ（スポット領域１９〜２４）のものを１８枚作製した。そして、Ｇ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ６枚ずつ前記方法でハイブリダイズさせ、同時にビオチンを投入し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識アビジンを基板上へ投入し、カバーガラスで覆い３７℃で３０分放置した後、洗浄を行い、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色試薬中に基板を浸漬し、３７℃で３０分間反応させ洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。
【０１２６】
発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。
【０１２７】
その結果、スポット領域１〜２４のいずれにおいても発色は確認されず、比較対象としてＰＣＲ産物を加えなかった６枚のＤＮＡアレイプラスチック基板においても、発色が得られなかった。
【０１２８】
また、図８の表１から分かるように、図７（Ｃ）のスポット１〜１２に示したＧ１のＰＣＲ産物の発色シグナル強度（Ｓ）の平均値と、図７（Ａ）での発色ノイズ強度（Ｎ）の平均値との、Ｓ／Ｎ比は０．９７と極めて高感度な検出を行うことができた。
【０１２９】
同様に、図７（Ｂ）のスポット１３〜２４に示したＧ２のＰＣＲ産物の発色シグナル強度（Ｓ）の平均値と、図７（Ａ）での発色ノイズ強度（Ｎ）の平均値とのＳ／Ｎ比は０．９８と極めて高感度な検出を行うことができた。
【０１３０】
［実施例２］
次に、本発明の第２の実施の形態の検出方法の実施例を説明する。標的核酸配列としては、実施例１と同様に、ノロウイスル固有の核酸配列を標的核酸配列として検出する例で説明する。
【０１３１】
即ち、以下の手法にて、基板表面に固定化した第１のオリゴヌクレオチド鎖と標的核酸配列が相補的に結合後、第１のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなり、標的核酸配列を鋳型として伸長反応し、解離反応により標的核酸配列と相補的な配列である伸長反応産物が解離する。
【０１３２】
そして、解離した第１の伸長反応産物が、基板表面に固定化した別の第２のオリゴヌクレオチド鎖と相補的に結合後、第２のオリゴヌクレオチド鎖がプライマーとなり、第１の伸長反応産物を鋳型として伸長反応し、解離反応により第１の伸長反応産物と相補的な配列の伸長反応産物が解離する。
【０１３３】
これを繰り返すことで基板上に微細な網目状空間を作り出し、該網目状空間にリガンドを物理的な吸着効果により取り込み、リガンドに反応する活性物質を用いることで、標的核酸配列を検出した。
【０１３４】
（標的核酸配列の調整）
実施例１で示したノロウイルスｃＤＮＡのＧ１のＰＣＲ産物、Ｇ２のＰＣＲ産物をそれぞれ準備し精製後、０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８ copies／μLとなるよう濃度調整し、標的核酸配列として実験に用いた。バックグラウンドとしては滅菌水を添加したもので評価した。
【０１３５】
（プラスチック基板）
実施例１で示したプラスチック基板（住友ベークライト製S-BIO(R) PrimeSurface(R)）のＭＰＥＸ（Multiple Primers EXtension）法対応基板を使用し、基板表面へ各種オリゴヌクレオチド鎖の一端を固定化し、実験に用いた。
【０１３６】
ＭＰＥＸ法は、従来技術において非特許文献１、特許文献１、特許文献２で説明した通りであるが、本実施例２の比較対照としては、基板上に固定化するオリゴヌクレオチド鎖が１種類のみで、伸長反応産物が架橋構造を形成しないＭＰＥＸ法を実施することにより、標的核酸配列の検出を行った。また、バックグラウンドとしては、滅菌水を添加したもので実施した。
【０１３７】
（オリゴヌクレオチド鎖の固定）
実施例２では、Ｇ１のＰＣＲ産物検出の為、下記に示すオリゴヌクレオチド鎖５及びオリゴヌクレオチド鎖６を合成した。オリゴヌクレオチド鎖５は、Ｇ１のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また、オリゴヌクレオチド鎖５は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１３８】
一方、オリゴヌクレオチド鎖６も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（１９塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１３９】
実施例２では、これらオリゴヌクレオチド鎖５及びオリゴヌクレオチド鎖６の溶液を混合し、スポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域１〜４）。尚、実施例２は、図７のように基板の図は示さないが、同様である。
【０１４０】
一方、上記した比較対照実験として、１μＭのオリゴヌクレオチド鎖５と６のうちの１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを基板のスポット領域に別々にスポットした（スポット領域５〜８、９〜１２）。
【０１４１】
そして、実施例２の基板及び比較対照の基板のそれぞれを、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１４２】
また、実施例２では、Ｇ２のＰＣＲ産物検出の為、オリゴヌクレオチド鎖７及びオリゴヌクレオチド鎖８を合成した。オリゴヌクレオチド鎖７は、Ｇ２のＰＣＲ産物と相補的な配列となるようにした。また、オリゴヌクレオチド鎖７は、５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２６塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１４３】
一方、オリゴヌクレオチド鎖８も５’末端がアミノ基で修飾されたヌクレオチド（２０塩基鎖）であり、これを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【０１４４】
そして、実施例２では、これらのオリゴヌクレオチド鎖７とオリゴヌクレオチド鎖８の溶液を混合し、スポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした（スポット領域１３〜１６）。
【０１４５】
一方、上記した比較対照実験では、１μＭのオリゴヌクレオチド鎖７と８のうちの１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを基板上のスポット領域に別々にスポットした（スポット領域１７〜２０、２１〜２４）。
【０１４６】
そして、実施例２の基板及び比較対照の基板のそれぞれを、８０℃で１時間加熱して、各オリゴヌクレオチド鎖を固定化させた。
【０１４７】
上記したプラスチック基板に固定化したオリゴヌクレオチド鎖５〜８の核酸配列は次のとおりである。
・オリゴヌクレオチド鎖５（RING1-TP(a)）：5’-AGATYGCGATCYCCTGTCCA -3’
・オリゴヌクレオチド鎖６（G1SKR）：5’-CCAACCCARCCATTRTACA-3’
・オリゴヌクレオチド鎖７（COG2F）：5’-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3’
・オリゴヌクレオチド鎖８（RING2AL-TP rc）：5’-AGATYGCGATCWCCCTCCCA-3’
IUB Codes(Code of international Union of Biochemistry). R=A or G ; B=C, G or T ; Y=C or T ; D=A, G or T ; K=G or T ; H=A, C or T ; M=A. or C ; V=A, C or G ; S=G or C ; W=A or T ; N=any base.
そして、実施例２の基板上に、標的核酸配列を５９μL、10×MPEX バッファーＡを８.０μL、10×ＫＯＤ-Plusバッファー（ＴＯＹＯＢＯ）を８.０μL、０．１mMビオチン標識dUTPを０．８０μL、０.１mM dATPを０．８μL、０.１mM dCTPを０．８μL、０．１mM dGTPを０．８μL、ＫＯＤ-Plus （ＴＯＹＯＢＯ）を２μLを混合した混合液を投入し、基板上の反応系を、９５℃で８分間加熱し、核酸配列の２重鎖を熱変性で解離させ１本鎖にした。
【０１４８】
次に、基板上にカバーガラスをかけ、２００μLの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において、５６℃で９０分間反応させた。
【０１４９】
次に、カバーガラスをはずして洗浄後、０．０１ｍｇ／ｍL濃度のアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを８μL、10×ＭＰＥＸバッファーＡを８．０μL、2×ＭＰＥＸバッファーＢを４０μL、滅菌水を２４μLの割合で混合した混合液をプラスチック基板へ投入した。
【０１５０】
次に、カバーガラスをかけ、２００μLの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中において、３７℃で３０分間反応させた。それから基板を洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（BCIP／NBT Phosphatase Substrate（1-Component System）（KPL））に浸漬し、３７℃で３０分間反応させてから基板を洗浄し、青紫色のスポットを発色させた。
【０１５１】
発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製、PIXUS MP470）でパソコンへ取り込み、画像解析ソフト（住友ベークライト製、誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。
【０１５２】
実施例２について、上記検出実験を、標的核酸配列の濃度が０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８copies／μL の７水準の濃度について実施した。同様に、１種類のオリゴヌクレオチド鎖のみを固定化した比較対照実験についても、標的核酸配列の濃度が０、１００、１０１、１０２、１０４、１０６、１０８copies／μL の７水準の濃度について実施した。
【０１５３】
そして、実施例２と比較対照実験での上記各濃度における発色シグナル量を比較した。比較結果を図９に示す。その結果、図９から分かるように、オリゴヌクレオチド鎖が１種類のみである比較対照実験は、標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１０６ copies／μL以上必要であった。
【０１５４】
これに対して、実施例２の、オリゴヌクレオチドが２種類で伸長反応産物から架橋構造を形成する場合、標的核酸配列を検出する為には標的核酸配列濃度が１００ copies／μL以上あれば十分であり、極めて低濃度の標的核酸配列であっても検出が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】本発明の核酸配列の検出方法の第１の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図
【図２】本発明の第１の実施の形態で形成される網目状空間の概念図
【図３】本発明の第１の実施の形態の操作手順を示すフローチャート
【図４】本発明の核酸配列の検出方法の第２の実施の形態のメカニズムを概念的に示した概念図
【図５】本発明の第２の実施の形態で形成される網目状空間の概念図
【図６】本発明の第２の実施の形態の操作手順を示すフローチャート
【図７】実施例における基板上に発色した発色画像の説明図
【図８】第１の実施例において発色画像を数値化した結果の平均Ｓ／Ｎ比を示す表図
【図９】第２実施例における結果を示すグラフ
【符号の説明】
【０１５６】
１０…標的核酸配列、１２…オリゴヌクレオチド鎖、１４…オリゴヌクレオチド鎖、１６…基板、１８…架橋構造体、１９…標的核酸配列、２０…網目状空間、２２…リガンド、２４…第１のオリゴヌクレオチド鎖、２６…第２のオリゴヌクレオチド鎖、２８…第１の伸長反応産物、３０…第１の伸長反応鎖（２本鎖）、３４…第２の伸長反応鎖（２本鎖）、３６…第２の伸長反応産物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
基板上に、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより複数の前記オリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、
前記複数のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所の相補的部分を結合させることによって架橋状態の多数の架橋構造体を形成し、前記基板上に前記架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、
前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、
前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、
前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項２】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
基板上に、多数のオリゴヌクレオチド鎖を固定化し、
その後、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルを投入すると共に、発色関係物質の構成成分であるリガンドを投入し、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性し一本鎖になる温度にし、
その後、前記反応系の温度を前記オリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所とが相補的に結合するハイブリダイゼーション温度にし、
その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応させ、
前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖として、前記標的核酸配列の少なくとも二箇所に対して相補的な核酸配列を有する一対の組み合わせを、前記固定化の前に予め設計し、
該設定した一対のオリゴヌクレオチド鎖を多数組、前記基板上に固定化することを特徴とする請求項１又は２の核酸配列の検出方法。
【請求項４】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応をさせて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計する設計工程と、
基板上に、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端を固定化することにより前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とを相補的に結合して前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として第１の伸長反応をさせる第１の伸長反応工程と、
前記標的核酸配列から前記第１の伸長反応工程で伸長した第１の伸長反応産物を解離させる第１の解離工程と、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第１の伸長反応産物を結合して前記第１と第２のオリゴヌクレオチド鎖の間に架橋構造を形成する第１の架橋工程と、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記第１の伸長反応産物を鋳型として第２の伸長反応をさせる第２の伸長反応工程と、
前記第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物を解離させる第２の解離工程と、
多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖について前記第１の伸長反応工程から前記第２の解離工程までを行い、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第２の伸長反応産物を結合して前記第２と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第２の架橋工程と、
多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１と第２の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、
前記繰返し架橋工程により、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、
前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、
前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項５】
前記第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物が、前記第２の伸長反応産物と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合して、第３のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、前記第２の伸長反応産物を鋳型とした第３の伸長反応工程と、
第２の伸長反応産物と前記第３の伸長反応工程で伸長した第３の伸長反応産物を解離させる第３の解離工程と、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第３の伸長反応産物を結合して前記第３と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第３の架橋工程と、
多数の前記第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１、第２と第３の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、
を備えたことを特徴とする請求項４の核酸配列の検出方法。
【請求項６】
前記繰返し架橋工程後において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にするハイブリダイゼーション工程を備えたことを特徴とする請求項４又は５の核酸配列の検出方法。
【請求項７】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応させて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計し、
基板上に、前記設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を多数固定化し、
前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンドとを混合した混合液を調製し、
前記混合液を基板に投入すると共に、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性する熱変性温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とが相補的に結合して第１の伸長反応を行う第１の伸長反応温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第１の伸長反応により形成された第１の伸長反応鎖から第１の伸長反応産物が解離する第１の解離温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記解離した第１の伸長反応産物反と前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合して第２の伸長反応を行う第２の伸長反応温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第２の伸長反応により形成された第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物が解離する第２の解離温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記解離した第２の伸長反応産物反と前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合する温度にし、
その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応する温度にし、
前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項８】
前記リガンドが、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項９】
前記リガンドが、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１０】
前記活性物質が、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１１】
前記基板表面には、親水性ポリマーからなる層と、及びアミノ基と反応する官能基とを有することを特徴とする請求項１〜１０の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１の核酸配列の検出方法を行うための核酸配列検出基板であって、
前記基板上にオリゴヌクレオチド鎖がスポットされていることを特徴とする核酸配列検出基板。
【請求項１】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
基板上に、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端のうちの一方の末端を固定化することにより複数の前記オリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、
前記複数のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所の相補的部分を結合させることによって架橋状態の多数の架橋構造体を形成し、前記基板上に前記架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、
前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、
前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、
前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項２】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
基板上に、多数のオリゴヌクレオチド鎖を固定化し、
その後、前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルを投入すると共に、発色関係物質の構成成分であるリガンドを投入し、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性し一本鎖になる温度にし、
その後、前記反応系の温度を前記オリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列の少なくとも二箇所とが相補的に結合するハイブリダイゼーション温度にし、
その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応させ、
前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖として、前記標的核酸配列の少なくとも二箇所に対して相補的な核酸配列を有する一対の組み合わせを、前記固定化の前に予め設計し、
該設定した一対のオリゴヌクレオチド鎖を多数組、前記基板上に固定化することを特徴とする請求項１又は２の核酸配列の検出方法。
【請求項４】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応をさせて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計する設計工程と、
基板上に、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端を固定化することにより前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチド鎖を前記基板上に立たせる固定化工程と、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とを相補的に結合して前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として第１の伸長反応をさせる第１の伸長反応工程と、
前記標的核酸配列から前記第１の伸長反応工程で伸長した第１の伸長反応産物を解離させる第１の解離工程と、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第１の伸長反応産物を結合して前記第１と第２のオリゴヌクレオチド鎖の間に架橋構造を形成する第１の架橋工程と、
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記第１の伸長反応産物を鋳型として第２の伸長反応をさせる第２の伸長反応工程と、
前記第２の伸長反応工程で伸長した第２の伸長反応産物を解離させる第２の解離工程と、
多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖について前記第１の伸長反応工程から前記第２の解離工程までを行い、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第２の伸長反応産物を結合して前記第２と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第２の架橋工程と、
多数の前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１と第２の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、
前記繰返し架橋工程により、架橋構造体が多数絡み合った微細な網目状空間を形成する網目状空間形成工程と、
前記網目状空間にリガンドを物理的な吸着作用により取り込む取込み工程と、前記取り込んだリガンドに対して、該リガンドに反応する活性物質を用いて発色させる発色工程と、
前記発色した発色シグナルを検出することにより前記標的核酸配列を検出する検出工程と、を備えたことを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項５】
前記第２の解離工程で解離した第２の伸長反応産物が、前記第２の伸長反応産物と相補的な核酸配列を有するように設計された第３のオリゴヌクレオチド鎖に結合して、第３のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとし、前記第２の伸長反応産物を鋳型とした第３の伸長反応工程と、
第２の伸長反応産物と前記第３の伸長反応工程で伸長した第３の伸長反応産物を解離させる第３の解離工程と、
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とは別の第１のオリゴヌクレオチド鎖に前記解離した第３の伸長反応産物を結合して前記第３と１のオリゴヌクレオチド鎖間に架橋構造を形成する第３の架橋工程と、
多数の前記第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチド鎖の間で第１、第２と第３の架橋工程を繰り返す、繰返し架橋工程と、
を備えたことを特徴とする請求項４の核酸配列の検出方法。
【請求項６】
前記繰返し架橋工程後において、設定温度をオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション温度にするハイブリダイゼーション工程を備えたことを特徴とする請求項４又は５の核酸配列の検出方法。
【請求項７】
検体サンプル中に検出標的とする特定の標的核酸配列が存在するかを検出する核酸配列の検出方法において、
前記標的核酸配列と第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合した後に、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすると共に前記標的核酸配列を鋳型として伸長反応させて形成される伸長反応鎖から解離した伸長反応産物に対して第２のオリゴヌクレオチド鎖が相補的な核酸配列を有するように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を予め設計し、
基板上に、前記設計した第１及び第２のオリゴヌクレオチド鎖を多数固定化し、
前記標的核酸配列を含む前記検体サンプルと発色関係物質の構成成分であるリガンドとを混合した混合液を調製し、
前記混合液を基板に投入すると共に、投入した反応系の温度を前記標的核酸配列が熱変性する熱変性温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖と前記標的核酸配列とが相補的に結合して第１の伸長反応を行う第１の伸長反応温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第１の伸長反応により形成された第１の伸長反応鎖から第１の伸長反応産物が解離する第１の解離温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記解離した第１の伸長反応産物反と前記第２のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合して第２の伸長反応を行う第２の伸長反応温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記第２の伸長反応により形成された第２の伸長反応鎖から第２の伸長反応産物が解離する第２の解離温度にし、
その後、前記反応系の温度を、前記解離した第２の伸長反応産物反と前記第１のオリゴヌクレオチド鎖とが相補的に結合する温度にし、
その後、前記基板上に、発色関係物質の構成成分である活性物質を投入して前記リガンドと反応する温度にし、
前記発色関係物質により発色した発色シグナルを検出することを特徴とする核酸配列の検出方法。
【請求項８】
前記リガンドが、ビオチン、アビジン、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項９】
前記リガンドが、ビオチン化酵素、アビジン化酵素、ストレプトアビジン化酵素、酵素標識体、酵素標識オリゴヌクレオチドよりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１０】
前記活性物質が、酵素標識レセプター、蛍光物質標識レセプター、基質よりなる群から選ばれた何れかであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１１】
前記基板表面には、親水性ポリマーからなる層と、及びアミノ基と反応する官能基とを有することを特徴とする請求項１〜１０の何れか１の核酸配列の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１の核酸配列の検出方法を行うための核酸配列検出基板であって、
前記基板上にオリゴヌクレオチド鎖がスポットされていることを特徴とする核酸配列検出基板。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
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【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【公開番号】特開２００９−１７８１５９（Ｐ２００９−１７８１５９Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７４２１４（Ｐ２００８−２７４２１４）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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