核酸配列決定のためのプローブおよび使用方法
核酸分子の配列決定のためのナノプローブおよびナノプローブを使用するための方法を提供する。特定の例において、該プローブは、重合剤と、標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと特異的に結合することによって、リンカーから分離することなく、核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる化学的部分を有する、１つまたは複数の分子リンカーとを含む。標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との可逆的な結合は、相補的ヌクレオチドとリンカー上の化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される。かかる化学的部分の１つの例は、非加水分解性ヌクレオチド類似体である。特定の例において、重合剤および化学的部分は、化学的部分の特定の型を特徴とする供与体フルオロフォア、および受容体フルオロフォアなどのタグに関連する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を配列決定するためのプローブであって、
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる、活性部位を有する重合剤と、
前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、前記リンカーのうちの１つ以上は、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく、前記標的核酸分子に可逆的に結合することができる化学的部分を有しており、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との特異的結合は、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される、１つまたは複数の分子リンカー
とを含む、プローブ。
【請求項２】
前記化学的部分がヌクレオチド類似体を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド類似体が非加水分解性ヌクレオチド類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
前記非加水分解性ヌクレオチド類似体が、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項５】
前記非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体が、非加水分解性であるα−β結合を有する非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項４記載のプローブ。
【請求項６】
前記化学的部分がモノヌクレオチドである、請求項１記載のプローブ。
【請求項７】
前記モノヌクレオチドが、塩基、３’リボース炭素、２’リボース炭素、またはαリン酸上の前記リンカーに結合される、請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、少なくとも４つの独立したリンカーを含み、それぞれが、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる、異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の分子リンカーが分岐構造を形成し、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１０】
前記分岐構造が少なくとも４つの分岐を含み、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項９記載のプローブ。
【請求項１１】
前記重合剤がタグに関連し、前記ヌクレオチド類似体のそれぞれが、前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグとの相互作用が、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとの前記リンカー上の前記ヌクレオチド類似体の対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１２】
前記重合剤に関連する前記タグが、それぞれのヌクレオチド類似体に関連する前記タグにより供与体−受容体の対を形成し、それによって、前記供与体−受容体の対の相互作用が、前記特性シグナルの放出を刺激する、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１３】
前記供与体−受容体の対が、前記受容体が反応して前記特性シグナルを放出する刺激を放出する外部刺激を与えることによって刺激される供与体を含む、請求項１２記載のプローブ。
【請求項１４】
それぞれのタグがフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１５】
前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別する前記タグのそれぞれが、一意的な放出シグナルを放出する１つまたは複数のフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の分子リンカーが４つの分子リンカーを含み、それぞれが、前記リンカーから分離することなく前記標的核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる化学的部分と、それぞれの化学的部分に関連する受容体タグとを有し、ここで前記受容体タグが、前記リンカーが有する前記特定の化学的部分を識別し、前記重合剤が供与体タグに関連し、前記標的核酸分子への前記化学的部分の可逆的結合が、前記リンカーが有する前記化学的部分の識別性を示す前記受容体タグの特性シグナルの放出を誘発するように、前記供与体および受容体タグを十分に接近させる、請求項１記載のプローブ。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記分子リンカーの絡み合いを抑制するために十分な距離をおいて前記重合剤の周囲に離間し、前記分子リンカーが、前記重合剤の前記活性部位に到達するほど十分に長い、請求項１記載のプローブ。
【請求項１８】
前記分子リンカーが線状ポリマーを含む、請求項１７記載のプローブ。
【請求項１９】
前記ポリマーが核酸を含む、請求項１８記載のプローブ。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤および前記化学的部分との実質上の絡み合いを回避するように、前記重合剤および前記化学的部分を互いに十分な距離をおいて維持する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２１】
前記分子リンカーの少なくとも一部は、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２２】
前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する前記分子リンカーの少なくとも一部が、分子ロッドを含む、請求項２１記載のプローブ。
【請求項２３】
前記分子リンカーが、テザー（ｔｅｔｈｅｒ）、分子ロッド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項２４】
前記分子ロッドが、少なくとも１０ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２５】
十分な剛性を有する前記分子リンカーが、分子ロッドによって連結される少なくとも２つのテザーを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項２６】
前記テザーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２７】
前記テザーがＥＧから成る、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２８】
前記テザーが長さが１８７Å未満である、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２９】
前記分子ロッドが４０ヌクレオチドのｄｓＤＮＡ分子を含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３０】
前記ｄｓＤＮＡ分子が１０〜１５０のヌクレオチドを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３１】
前記重合剤が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、または逆転写酵素を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３２】
前記重合剤が、供与体フルオロフォアに関連する逆転写酵素を含む、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３３】
前記標的核酸分子がＤＮＡであり、かつ前記重合剤がＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３４】
前記標的核酸分子がＲＮＡであり、かつ前記重合剤が逆転写酵素である、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３５】
前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３６】
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位と、
絡み合いを抑制するために前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、それぞれのリンカーが、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる非加水分解性ヌクレオチド類似体を有している、１つまたは複数の分子リンカーと、
核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別するそれぞれの非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連するタグと、
前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別する特性シグナルを放出するために、前記非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連する前記タグと相互に作用する前記ポリメラーゼに関連するタグ
とを含む、重合剤。
【請求項３７】
標的核酸分子の核酸配列を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドプライマーと、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとハイブリダイズし、前記鋳型核酸分子に可逆的に結合する前記化学的部分を置換することによって、伸長している核酸分子に組み込むことができる加水分解性ヌクレオチドの混合物との存在下で、前記標的核酸分子を請求項１記載のプローブに曝露する工程と、
相補的ヌクレオチドと前記分子リンカー上の前記化学的部分との対合を示す複数の前記特性シグナルの放出を含む、一連のシグナルの放出を検出する工程
とを含む、方法。
【請求項３８】
前記重合剤がタグに関連し、前記化学的部分のそれぞれもまた、前記リンカーが有する特定の化学的部分を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記化学的部分に関連する前記タグとの相互作用が、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記重合剤に関連する前記タグが、供与体フルオロフォアを含み、特定の化学的部分を識別する前記タグが、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含み、前記重合剤と、前記標的核酸分子内の前記相補的ヌクレオチドに特異的に結合する前記化学的部分との相互作用が、供与体フルオロフォアによって前記受容体フルオロフォアの励起が可能となるように、前記受容体フルオロフォアを前記供与体フルオロフォアに接近させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナルを検出する工程が、前記受容体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナルを検出する工程を含むか、または前記供与体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナル内の減少を検出する工程を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
一連のシグナルの前記放出が核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
一連のシグナルの前記放出が発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって生成される、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルを放出するために、前記供与体フルオロフォアを励起して前記１つまたは複数の受容体フルオロフォアを励起するシグナルを放出する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記供与体フルオロフォアが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記受容体フルオロフォアが、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはそれらの誘導体である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記供与体フルオロフォアが発光分子によって励起される、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
前記供与体フルオロフォアがＧＦＰであり、かつ前記発光分子が化学発光エクオリンである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記供与体フルオロフォアが発光分子である、請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
前記発光分子がエクオリンである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記重合剤がＧＦＰ−ポリメラーゼである、請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
前記重合剤がリンカーによって前記基板に固定されている、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーが、ストレプトアビジン−ビオチン、ヒスチジン−Ｎｉ、Ｓ−タグ−Ｓ−タンパク質、またはグルタチオン−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸分子または前記オリゴヌクレオチドプライマーが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５５】
実質上同時に複数の配列決定反応を行う工程と、前記複数の配列決定反応から一連のシグナルを検出する工程とを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項５６】
複数の重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、所定のパターンで前記基板に直接的または間接的に固定され、一連のシグナルを検出する工程が、そのようなパターン内の所定の位置に対応する核酸分子と前記シグナルとを相関させる工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、規則的なアレイにエッチングされたチャネル内で、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、基板上に液滴をマイクロピペットで滴下することによって、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
基板上に液滴をマイクロピペットで滴下する前記工程が、手動または自動アレイヤーを使用して行われる、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
一連のシグナルが電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、前記核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項６１】
一連のシグナルがコンピュータ可読媒体に保存される、請求項３７記載の方法。
【請求項６２】
前記標的核酸分子が、対象から取得された生体試料に存在している、請求項３７記載の方法。
【請求項６３】
前記標的核酸分子が細胞内に存在し、前記鋳型核酸分子をオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブに曝露する工程が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が対象内に存在し、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの対象への投与を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記標的核酸鎖が、疾病に関連する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６６】
高ストリンジェンシー条件下で前記標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーをさらに含むプローブであって、前記プライマーが、分子リンカーを介して前記重合剤に結合される、請求項１記載のプローブ。
【請求項６７】
前記重合剤が重合剤−Ｔｕｓ融合タンパク質を含み、前記分子リンカーがｔｅｒ配列を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項６８】
前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグが、エラーの検出および修正を可能にする、コード化したフルオロフォアの集まりである、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１】
核酸分子を配列決定するためのプローブであって、
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる、活性部位を有する重合剤と、
前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、前記リンカーのうちの１つ以上は、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく、前記標的核酸分子に可逆的に結合することができる化学的部分を有しており、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との特異的結合は、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す特性シグナルの放出によって示される、１つまたは複数の分子リンカー
とを含む、プローブ。
【請求項２】
前記化学的部分がヌクレオチド類似体を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド類似体が非加水分解性ヌクレオチド類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
前記非加水分解性ヌクレオチド類似体が、非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項２記載のプローブ。
【請求項５】
前記非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体が、非加水分解性であるα−β結合を有する非加水分解性ヌクレオチド三リン酸類似体を含む、請求項４記載のプローブ。
【請求項６】
前記化学的部分がモノヌクレオチドである、請求項１記載のプローブ。
【請求項７】
前記モノヌクレオチドが、塩基、３’リボース炭素、２’リボース炭素、またはαリン酸上の前記リンカーに結合される、請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、少なくとも４つの独立したリンカーを含み、それぞれが、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる、異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の分子リンカーが分岐構造を形成し、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１０】
前記分岐構造が少なくとも４つの分岐を含み、それぞれの分岐が、前記標的核酸分子内の異なるヌクレオチドに特異的に結合することができる異なるヌクレオチド類似体を有する、請求項９記載のプローブ。
【請求項１１】
前記重合剤がタグに関連し、前記ヌクレオチド類似体のそれぞれが、前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグとの相互作用が、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとの前記リンカー上の前記ヌクレオチド類似体の対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項２記載のプローブ。
【請求項１２】
前記重合剤に関連する前記タグが、それぞれのヌクレオチド類似体に関連する前記タグにより供与体−受容体の対を形成し、それによって、前記供与体−受容体の対の相互作用が、前記特性シグナルの放出を刺激する、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１３】
前記供与体−受容体の対が、前記受容体が反応して前記特性シグナルを放出する刺激を放出する外部刺激を与えることによって刺激される供与体を含む、請求項１２記載のプローブ。
【請求項１４】
それぞれのタグがフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１５】
前記リンカーが有する特定のヌクレオチド類似体を識別する前記タグのそれぞれが、一意的な放出シグナルを放出する１つまたは複数のフルオロフォアを含む、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の分子リンカーが４つの分子リンカーを含み、それぞれが、前記リンカーから分離することなく前記標的核酸分子の鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる化学的部分と、それぞれの化学的部分に関連する受容体タグとを有し、ここで前記受容体タグが、前記リンカーが有する前記特定の化学的部分を識別し、前記重合剤が供与体タグに関連し、前記標的核酸分子への前記化学的部分の可逆的結合が、前記リンカーが有する前記化学的部分の識別性を示す前記受容体タグの特性シグナルの放出を誘発するように、前記供与体および受容体タグを十分に接近させる、請求項１記載のプローブ。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記分子リンカーの絡み合いを抑制するために十分な距離をおいて前記重合剤の周囲に離間し、前記分子リンカーが、前記重合剤の前記活性部位に到達するほど十分に長い、請求項１記載のプローブ。
【請求項１８】
前記分子リンカーが線状ポリマーを含む、請求項１７記載のプローブ。
【請求項１９】
前記ポリマーが核酸を含む、請求項１８記載のプローブ。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の分子リンカーが、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤および前記化学的部分との実質上の絡み合いを回避するように、前記重合剤および前記化学的部分を互いに十分な距離をおいて維持する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２１】
前記分子リンカーの少なくとも一部は、前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する、請求項１記載のプローブ。
【請求項２２】
前記標的核酸分子の非存在下で、前記重合剤と前記化学的部分との相互作用を減少させるように十分な剛性を有する前記分子リンカーの少なくとも一部が、分子ロッドを含む、請求項２１記載のプローブ。
【請求項２３】
前記分子リンカーが、テザー（ｔｅｔｈｅｒ）、分子ロッド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項２４】
前記分子ロッドが、少なくとも１０ヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２５】
十分な剛性を有する前記分子リンカーが、分子ロッドによって連結される少なくとも２つのテザーを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項２６】
前記テザーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２３記載のプローブ。
【請求項２７】
前記テザーがＥＧから成る、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２８】
前記テザーが長さが１８７Å未満である、請求項２６記載のプローブ。
【請求項２９】
前記分子ロッドが４０ヌクレオチドのｄｓＤＮＡ分子を含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３０】
前記ｄｓＤＮＡ分子が１０〜１５０のヌクレオチドを含む、請求項２４記載のプローブ。
【請求項３１】
前記重合剤が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、または逆転写酵素を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項３２】
前記重合剤が、供与体フルオロフォアに関連する逆転写酵素を含む、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３３】
前記標的核酸分子がＤＮＡであり、かつ前記重合剤がＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３４】
前記標的核酸分子がＲＮＡであり、かつ前記重合剤が逆転写酵素である、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３５】
前記重合剤がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントである、請求項３１記載のプローブ。
【請求項３６】
標的核酸分子に結合すること、および相補的ヌクレオチドが相補的核酸分子に組み込まれるように、伸長する前記相補的核酸分子の合成を促進することができる活性部位と、
絡み合いを抑制するために前記重合剤上で離間している１つまたは複数の分子リンカーであって、それぞれのリンカーが、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記リンカーから分離することなく核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる異なる非加水分解性ヌクレオチド類似体を有している、１つまたは複数の分子リンカーと、
核酸分子の前記鋳型鎖に可逆的に結合することができる前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別するそれぞれの非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連するタグと、
前記リンカーが有する前記非加水分解性ヌクレオチド類似体を識別する特性シグナルを放出するために、前記非加水分解性ヌクレオチド類似体に関連する前記タグと相互に作用する前記ポリメラーゼに関連するタグ
とを含む、重合剤。
【請求項３７】
標的核酸分子の核酸配列を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドプライマーと、前記標的核酸分子内の相補的ヌクレオチドとハイブリダイズし、前記鋳型核酸分子に可逆的に結合する前記化学的部分を置換することによって、伸長している核酸分子に組み込むことができる加水分解性ヌクレオチドの混合物との存在下で、前記標的核酸分子を請求項１記載のプローブに曝露する工程と、
相補的ヌクレオチドと前記分子リンカー上の前記化学的部分との対合を示す複数の前記特性シグナルの放出を含む、一連のシグナルの放出を検出する工程
とを含む、方法。
【請求項３８】
前記重合剤がタグに関連し、前記化学的部分のそれぞれもまた、前記リンカーが有する特定の化学的部分を識別するタグに関連し、前記重合剤に関連する前記タグと、前記化学的部分に関連する前記タグとの相互作用が、相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルの放出を誘発する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記重合剤に関連する前記タグが、供与体フルオロフォアを含み、特定の化学的部分を識別する前記タグが、１つまたは複数の受容体フルオロフォアを含み、前記重合剤と、前記標的核酸分子内の前記相補的ヌクレオチドに特異的に結合する前記化学的部分との相互作用が、供与体フルオロフォアによって前記受容体フルオロフォアの励起が可能となるように、前記受容体フルオロフォアを前記供与体フルオロフォアに接近させる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナルを検出する工程が、前記受容体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナルを検出する工程を含むか、または前記供与体フルオロフォアから放出される蛍光性シグナル内の減少を検出する工程を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
一連のシグナルの前記放出が核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
一連のシグナルの前記放出が発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって生成される、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
相補的ヌクレオチドと前記リンカー上の前記化学的部分との対合を示す前記特性シグナルを放出するために、前記供与体フルオロフォアを励起して前記１つまたは複数の受容体フルオロフォアを励起するシグナルを放出する工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記供与体フルオロフォアが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記受容体フルオロフォアが、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、またはそれらの誘導体である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記供与体フルオロフォアが発光分子によって励起される、請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
前記供与体フルオロフォアがＧＦＰであり、かつ前記発光分子が化学発光エクオリンである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記供与体フルオロフォアが発光分子である、請求項３９記載の方法。
【請求項４９】
前記発光分子がエクオリンである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記重合剤がＧＦＰ−ポリメラーゼである、請求項３９記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
前記重合剤がリンカーによって前記基板に固定されている、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーが、ストレプトアビジン−ビオチン、ヒスチジン−Ｎｉ、Ｓ−タグ−Ｓ−タンパク質、またはグルタチオン−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸分子または前記オリゴヌクレオチドプライマーが基板に固定されている、請求項３７記載の方法。
【請求項５５】
実質上同時に複数の配列決定反応を行う工程と、前記複数の配列決定反応から一連のシグナルを検出する工程とを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項５６】
複数の重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、所定のパターンで前記基板に直接的または間接的に固定され、一連のシグナルを検出する工程が、そのようなパターン内の所定の位置に対応する核酸分子と前記シグナルとを相関させる工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、規則的なアレイにエッチングされたチャネル内で、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記重合剤、標的核酸分子、またはオリゴヌクレオチドプライマーが、基板上に液滴をマイクロピペットで滴下することによって、前記所定のパターンで前記基板に固定される、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
基板上に液滴をマイクロピペットで滴下する前記工程が、手動または自動アレイヤーを使用して行われる、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
一連のシグナルが電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、前記核酸配列に変換される、請求項３７記載の方法。
【請求項６１】
一連のシグナルがコンピュータ可読媒体に保存される、請求項３７記載の方法。
【請求項６２】
前記標的核酸分子が、対象から取得された生体試料に存在している、請求項３７記載の方法。
【請求項６３】
前記標的核酸分子が細胞内に存在し、前記鋳型核酸分子をオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブに曝露する工程が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が対象内に存在し、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの前記細胞への導入が、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記プローブの対象への投与を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記標的核酸鎖が、疾病に関連する１つまたは複数の突然変異を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項６６】
高ストリンジェンシー条件下で前記標的核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマーをさらに含むプローブであって、前記プライマーが、分子リンカーを介して前記重合剤に結合される、請求項１記載のプローブ。
【請求項６７】
前記重合剤が重合剤−Ｔｕｓ融合タンパク質を含み、前記分子リンカーがｔｅｒ配列を含む、請求項１記載のプローブ。
【請求項６８】
前記ヌクレオチド類似体に関連する前記タグが、エラーの検出および修正を可能にする、コード化したフルオロフォアの集まりである、請求項１１記載のプローブ。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１９０４１（Ｐ２００９−５１９０４１Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５７６８（Ｐ２００８−５４５７６８）
【出願日】平成１８年１２月１２日（２００６．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７５３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７０５７２
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
２．ＪＡＶＡ
【出願人】（５０６１６１５２２）アメリカ合衆国 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１２日（２００６．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７５３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７０５７２
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
２．ＪＡＶＡ
【出願人】（５０６１６１５２２）アメリカ合衆国 (4)
【Ｆターム（参考）】
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