植物におけるヘテロ‐オリゴマータンパク質の産生
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有する、ヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードする、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供すること；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターであり、それにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含む、方法。
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードする、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供すること；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターであり、それにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明が属する技術分野
本発明は、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用した、植物体、植物部分または植物細胞培養物におけるヘテロ‐オリゴマータンパク質の産生に関する。本発明に記載の方法およびベクターは、全長抗体、または別のタンパク質もしくはそれらのフラグメントとの融合物を含むそのヘテロ‐オリゴマー合成誘導体のような、高い収率の機能的ヘテロ‐オリゴマー組換えタンパク質を植物細胞に提供する。
【０００２】
発明の背景
植物を基礎にした分子農業は、好ましくは、潜在的に低い生産費用、および工業的生産方法から生み出される動物‐由来タンパク質を除去するためのバイオ医薬品産業による試みのゆえに、ヒトおよび動物の健康分野で使用される予定の組換えタンパク質の産生にとっての魅力的な好機である。なぜなら、これらの産物は牛海綿状脳症（ＢＳＥ）またはクロイツフェルト‐ヤコブ病（ＣＪＤ、ｖＣＪＤ）のようなヒト病原体により汚染されうるからである。しかし、植物細胞における高収率のヘテロオリゴマータンパク質の産生は、以下の理由から、強力な構成的または組織‐特異的プロモーターの使用に基づいた標準発現系の協力により解決することができない難問である：第１に、そのような組換えタンパク質の大多数は植物の成長および発達に対して有害な作用を有し、それゆえ収率を著しく低下させる；第２に組織‐特異的（たとえば、種子‐特異的）プロモーターの使用は、食用になる作物植物（たとえば、イネ、トウモロコシ、コムギ）のゲノムへの医薬タンパク質をコードする遺伝子の安定した組み込みを必要とし、それは露地栽培の場合、トランスジーン流動制御に関する問題を引き起こす可能性がある。また、これらの系は産物の低い収率のため、閉鎖環境（温室）で使用する場合、商業的に実行可能ではない。
【０００３】
植物ウイルスを基礎にした一過性の発現系（総説としては以下を参照されたい：Ｐｏｒｔａ ＆ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５，２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４０，８１−９４；Ｇｌｅｂａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，７，１８２−１８８）は、その技術が成長と産生ステージを分離させるため、植物葉組織における高発現レベルを提供することが可能であり、ある程度までは組換えタンパク質の細胞毒性、および植物発達に対するそれらの有害作用の難問に対処することができる。最も確立され、商業的に実行可能な系は、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター、好ましくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）‐由来ベクター（Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６２２−６２５；ＵＳ５３１６９３１；ＵＳ５５８９３６７；ＵＳ５８６６７８５；ＵＳ５９７７４３８；ＷＯ０２０８８３６９；ＷＯ０２０９７０８０；ＷＯ０２２９０６８；ＵＳ５４９１０７６）に基づく。しかし、これらの系は簡単で、比較的低分子のタンパク質の産生に使用が限定されるという深刻な制限を欠点として持つ。ウイルスベクターが１ｋｂより大きな異種配列を持っている場合、このことはある程度は、それらの不安定性および野生型への高頻度での逆戻りによって引き起こされる。また、技術の深刻な制約は、最も有益な群の組換えタンパク質を代表する治療用モノクローナル抗体およびそれらの誘導体のような、複雑なヘテロオリゴマータンパク質の発現が可能なウイルスベクター系が無いことである。
【０００４】
植物ウイルスベクターを使用した、植物における全長モノクローナル抗体の発現を扱った刊行物は１つしかない（Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２２０，６９−７５）。この論文は、全身葉部におけるモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖発現のための２種のＴＭＶを基礎にした全身ウイルスベクターを使用して、Ｎ．ベンサミアーナ植物体の同時感染時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された上記ベクターの転写物により、異なるベクターから異なる鎖が発現されることを説明する。しかし、上記の系における組換えタンパク質の収率は非常に低いため、集合したモノクローナル抗体の存在は、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡのような感度の高い試験によって確認しなければならない。組換え抗体は収率が非常に低いため、この系は実際の適用に適切ではなく、商業的価値を持たない。感染された植物体の同じ植物組織中には、２種以上のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターは通常存在しない（実施例１を参照されたい）ため、検出された抗原結合活性は、別々の細胞または組織に発現された抗体の重鎖および軽鎖からの分離手順中にｉｎ ｖｉｔｒｏで集合した抗体によるものである可能性がある。機能的抗体は変性し、弱めた抗体成分からｉｎ ｖｉｔｒｏで集められうることが以前に示された（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＆ Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１７，５６３３−５６４１；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，９５−１００）。しかし、そのようなアセンブリーに都合のよい条件が存在しない場合、そのようなアセンブリーの効率は非常に低い。
【０００５】
したがって、菌類または昆虫細胞発現系のような別の大規模発現系と市場で競い合うために十分な収率と効率の、植物における組換えヘテロオリゴマータンパク質の大規模発現系は存在しない。そのような植物発現はできる限り以下の基準を十分に満たさなければならない：
（ｉ）できるだけ多くの植物組織および上記組織の中のできるだけ多くの細胞における、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の発現を含む、高収率；
（ｉｉ）植物の成長に対する組換えタンパク質発現の有害な作用を妨げるための、関心のあるタンパク質または産物の発現は所望する植物の発達段階で開始できるように、一過性（またはスイッチ可能）でなければならない；
（ｉｉｉ）植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の異なるサブユニットをコードするポリタンパク質の最適比を提供し、そうして上記サブユニットからの組換えタンパク質アセンブリーのレベルにおいて組換えタンパク質の高収率を維持すること。
【０００６】
したがって、本発明の目的は植物体、植物部分、または植物細胞培養物における効率的なヘテロオリゴマータンパク質産生の方法を提供することである。別の目的は、ヘテロオリゴマータンパク質を発現することができる高収率植物発現系の提供である。本発明の別の目的は、同じ植物細胞中に１種より多い関心のあるポリペプチドを同時発現させる効率的な方法を提供することである。さらに、植物体、植物部分、または植物細胞培養物に抗体を発現させるための迅速で高収率の方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
発明の一般的説明
本発明は、植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法を提供し、
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターであり；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードする、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供すること
により、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物組織に発現させることを含む。
【０００８】
一態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルスベクターであるという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが同じＲＮＡウイルスに由来しないという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが第１および第２タンパク質サブユニットをコードする配列部分以外の配列部分において異なるという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルス種に属するＲＮＡウイルスに由来するという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルス属に属するＲＮＡウイルスに由来するという点で、非競合的である。
【０００９】
本発明の別の態様は、抗体の重鎖および軽鎖のような、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を植物体、植物組織または植物細胞において産生する方法であって、
（ｉ）第１プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターまたは第２ウイルスベクターは、植物体における第１または第２ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠如し；または
（ｉｉ）少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、ウイルスベクターは全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするＯＲＦを欠如する
ことにより、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む。
【００１０】
本発明はさらに、植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法を提供し、方法は１種以上のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（複数のベクター）由来の少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、特許請求の範囲および以下の説明に記載される。
本発明の発明者らは驚くべくことに、植物ウイルスベクターを使用して植物に高収率でヘテロオリゴマータンパク質を産生する方法を確認している。植物におけるヘテロオリゴマータンパク質の効率的な産生には、同じ植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の異なるタンパク質サブユニットの高収率の産生を必要とする。このようにして、小胞体（ＥＲ）の天然のタンパク質集合能力のような、上記細胞のそのような能力を使用して、上記の少なくとも２種のタンパク質サブユニットを発現している細胞にヘテロオリゴマータンパク質を効率的に集めることができる。したがって上記のヘテロオリゴマータンパク質の非効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアセンブリーは必要でない。本発明はステップ（ｉ）により、またはステップ（ｉｉ）により、またはステップ（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせにより同じ細胞に２種以上のタンパク質の効率的な同時発現を初めて成し遂げている。
【００１２】
第１タンパク質サブユニットは第１異種（核酸）配列によってＲＮＡウイルスベクターにコードされる。第２タンパク質サブユニットは第２異種（核酸）配列によってウイルスベクターにコードされる。これらの異種配列はしたがってウイルスベクター（複数のウイルスベクター）のＲＮＡ配列であり、典型的にはタンパク質サブユニットを発現するために必要な調節配列を含有するか、またはコードする。そのような調節配列の例としては、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、および３′‐非翻訳配列が挙げられる。本明細書では、ある配列がウイルスベクター（複数のウイルスベクター）が由来するウイルスに天然に存在しない場合、その配列は異種配列である。
【００１３】
本発明に従って産生可能なヘテロオリゴマータンパク質は、少なくとも第１および第２サブユニットを有し、第１および第２サブユニットは異なるポリペプチド配列を有する。したがって、第１および第２サブユニットは典型的には異なる異種核酸配列から発現されなければならない。オリゴマータンパク質のサブユニットは会合して４次構造のオリゴマータンパク質を形成する。サブユニットのアセンブリーは典型的にはサブユニット間の非共有結合を包含する。さらに、共有結合、たとえばジスルフィド結合がタンパク質サブユニット間で形成されてもよい。
【００１４】
一態様では、ヘテロオリゴマータンパク質はヘテロ‐二量体タンパク質、すなわち２種の異なるタンパク質サブユニットを有するタンパク質である。別の態様では、ヘテロオリゴマータンパク質は２種より多い異なるサブユニット、たとえば３種または４種の異なるサブユニット（それぞれヘテロトリマーまたはヘテロテトラマータンパク質）を有していてもよい。別の態様では、のヘテロオリゴマータンパク質は２種の異なるサブユニットを有していてもよく、サブユニットの中の１方または両方がヘテロオリゴマータンパク質中に、１回より多く存在してもよい。ヘテロオリゴマータンパク質のサブユニット構成の例としては、ＡａＢｂ、ＡａＢｂＣｃ、ＡａＢｂＣｃＤｄが挙げられ、ここでＡは第１タンパク質サブユニットを表し、Ｂは第２タンパク質サブユニットを表し、そしてＣおよびＤは別のタンパク質サブユニットを表す。それぞれの大文字Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは他のタンパク質サブユニットとは異なるタンパク質サブユニットを表し、そして小文字は少なくとも１の整数を表し、ヘテロオリゴマータンパク質中の個々のタンパク質サブユニットのコピー数を示す。Ａ２Ｂ２のサブユニット構成を有するＩｇＧ抗体が例として挙げられ、ここでＡは第１タンパク質サブユニット（たとえば重鎖）を表し、そしてＢは第２タンパク質サブユニット（たとえば軽鎖）を表す。好ましくは、本発明に従って産生されたヘテロオリゴマータンパク質は２種または３種の異なるタンパク質サブユニットを有し、より好ましくは、それは２種の異なるタンパク質サブユニットを有する。
【００１５】
本発明の方法では、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットは植物体、植物組織、または植物細胞の細胞中に、ステップ（ｉ）または／およびステップ（ｉｉ）によって発現される。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれは、同じ細胞中に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させ、その結果ヘテロオリゴマータンパク質を細胞中に効率的に産生することができる。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、とりわけ３種、４種、またはそれより多い異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質産生のために並行して行うことができる（実施例７を参照されたい）。
【００１６】
本発明のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（複数のウイルスベクター）はまた、本明細書では単に「ウイルスベクター」として表される。典型的には、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターはプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルスに由来する。
【００１７】
ステップ（ｉｉ）では、植物体、植物組織または植物細胞は、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供される。少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするウイルスベクターは、インサートとして第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、その発現は第１サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい。さらに、ウイルスベクターはインサートとして、第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、その発現は第２サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい。第１および第２タンパク質サブユニットの両方がサブゲノムプロモーターの制御下で発現される場合、これらのサブゲノムプロモーターは、好ましくは、植物細胞に望ましくない組換え事象を導くウイルスベクター中の自己相同性を回避するために配列が異なる。そのような異なるサブゲノムプロモーターは異なる株または種の植物ウイルスから採取されてもよく、たとえば１種のサブゲノムプロモーターはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１のコートタンパク質（ＣＰ）サブゲノムプロモーターであってもよく（またはそれに由来してもよく）、そして別のサブゲノムプロモーターは、ＴＭＶ Ｕ５のＣＰサブゲノムプロモーターであってもよく（またはそれに由来してもよく）、またはアブラナ科植物‐感染トバモウイルス（ｃｒ‐ＴＭＶ）に由来してもよい。
【００１８】
第１または第２サブゲノムプロモーターのかわりに、第１または第２タンパク質サブユニットの翻訳がＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）エレメントの制御下にあってもよい。第１および第２タンパク質サブユニット両方の翻訳がＩＲＥＳエレメントの制御下にあってもよいが、少なくともタンパク質サブユニットの１種はサブゲノムプロモーターを使用して発現される。本発明で使用されるＩＲＥＳエレメントはｃｒ‐ＴＭＶのような植物ウイルスまたは他の植物ウイルスから採取されてもよい（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９，５３０１−６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９，２６３，１３９−５４；ＷＯ０３０２０９２７；ＷＯ０２２９０６８）。
【００１９】
ステップ（ｉｉ）のウイルスベクターは、好ましくは植物体または植物組織において全身移行をする能力がない。このことは、たとえばウイルス粒子アセンブリーの機能的起点を削除することにより成し遂げることができる。トバモウイルスではたとえば、ウイルス粒子アセンブリーの起点はＭＰ ＯＲＦに位置する。したがって、ウイルス粒子アセンブリーの起点はウイルスベクターからＭＰ ＯＲＦを完全に、または部分的に欠失することによって削除することができる。ウイルスベクターはしたがって、好ましくは機能的移行タンパク質（ＭＰ）ＯＲＦを持たない。より好ましくは、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質を持たない。この態様では、ウイルスベクターは機能的コートタンパク質ＯＲＦを持たなくてもよく、そして最も好ましくは、ウイルスベクターは機能的移行タンパク質ＯＲＦおよび機能的コートタンパク質ＯＲＦの両方を持たない。ウイルスベクターからＭＰ ＯＲＦおよび／またはＣＰ ＯＲＦを除去することは、ウイルスベクター安定性を低下させずに、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするためのより多くの余地を提供する。この態様では、ウイルスベクターは好ましくは、多くの細胞の感染を成し遂げるために、植物体または植物組織の多くの細胞に提供される。このことはアグロバクテリウムを使用して、Ｔ−ＤＮＡのようなＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を提供することにより最も都合よく成し遂げられてもよい（以下を参照されたい）。
【００２０】
ステップ（ｉｉ）のウイルスベクターが由来するウイルスはいずれかのプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルス、たとえば「詳細な説明」の章で挙げられたものであってもよい。好ましいウイルス群はトバモウイルス、ポテクスウイルス、およびポティウイルスである。最も好ましいウイルスはＴＭＶおよびＰＶＸである。ウイルスベクターは少なくともそれが由来するウイルス由来の、ウイルスベクターの複製に必要なタンパク質をコードするＯＲＦを含有することになる。ウイルスベクターは典型的にはさらに、ウイルス複製のための調節エレメント、および少なくとも１種のサブゲノムプロモーターを含有する。
【００２１】
ステップ（ｉ）では、植物体、植物組織または植物細胞は、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを備える。第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードする。
【００２２】
ステップ（ｉ）は２種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質の産生を可能にする。ステップ（ｉ）はその上、２種より多い異なるサブユニット、たとえば３種または４種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質の産生を可能にする。この場合、植物体、植物組織または植物細胞は、それぞれが上記の異なるタンパク質サブユニットの１種をコードする、第１、第２および第３ウイルスベクターを（そして場合により別のウイルスベクターを）備えてよい。３種または４種の異なるタンパク質サブユニットをステップ（ｉ）で発現しなければならない場合、個々の３種または４種のウイルスベクターは好ましくは、すべてお互いに非競合ウイルスベクターである。３種のウイルスベクターの場合、第１ウイルスベクターはトバモウイルスに由来してもよく、第２ウイルスベクターはポティウイルスに由来してもよく、そして第３ウイルスベクターはポテクスウイルスに由来してもよい。
【００２３】
２種のウイルスベクターは、同じ植物組織中でそれらがコードするタンパク質サブユニットを効率的に発現（同時発現）できる場合、非競合的である。同時発現は少なくとも２種の異なるウイルスベクターがコードする異種配列の実質的な量を発現する前は、それらは複製中にお互いに競合しないことを必要とする。上記の少なくとも２種のウイルスベクターのＲＮＡレベルの配列の違いが大きいほど、それらは同じ植物細胞においていっそう非競合的である。第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターであるため、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターである。
【００２４】
非競合的である場合、ある一般的な態様では、第１および第２ウイルスベクター（上記の２種の非競合ウイルスベクター）は、少なくともタンパク質サブユニットをコードする上記の異種配列以外の配列部分において異なる。好ましくは、上記の異種配列以外の配列部分におけるそのような違いは植物ＲＮＡウイルスに由来する配列部分であり、そのような配列部分は、ウイルス機能、たとえば植物細胞におけるウイルス複製（たとえばレプリカーゼをコードする配列）、ウイルスタンパク質の翻訳（たとえばサブゲノムプロモーター）またはウイルスの細胞間もしくは長距離移行に関与する配列部分である。
【００２５】
非競合的である場合、別の一般的な態様では、第１および第２ウイルスベクター（上記の２種の非競合ウイルスベクター）は異なる植物ウイルスに由来する。この態様の一例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス株のウイルスに由来しない。別の例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス種のウイルスに由来しない。付加的な例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス属のウイルスに由来しない。したがって、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは好ましくは異なる株のウイルス、より好ましくは異なる種のウイルス、最も好ましくは異なる属のウイルスに由来する。
【００２６】
第１ウイルスベクターはポテクスウイルス属に属するウイルスに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはポティウイルス属に属するウイルスに由来してもよい。とりわけ、第１ウイルスベクターはジャガイモウイルスＸに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはジャガイモウイルスＹに由来してもよい。
【００２７】
ポティウイルスベクターの場合、タンパク質サブユニットはウイルスポリタンパク質との融合物として発現してもよく、それによって本発明のタンパク質サブユニットはポティウイルスプロテアーゼ認識部位によりポリタンパク質から分離することができる。
【００２８】
別の態様では、第１ウイルスベクターはポテクスウイルス属に属するウイルスに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはトバモウイルス属に属するウイルスに由来してもよい。とりわけ、第１ウイルスベクターはジャガイモウイルスＸに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはタバコモザイクウイルスに由来してもよい。
【００２９】
「ウイルスに由来している」とは、ウイルスの遺伝エレメントまたは配列部分をそのウイルスに由来するウイルスベクターが含有することを意味する。一態様では、ウイルスベクター（複数のウイルスベクター）はＲＮＡウイルスから採取したレプリカーゼＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含有する。別の態様では、ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来の移行タンパク質ＯＲＦ、そして場合によりさらにレプリカーゼＯＲＦを含有する。ＲＮＡウイルスから採取したウイルス遺伝エレメントは、所望する場合、たとえばウイルスベクターのクローニングに必要な制限部位を導入するために変異してもよい。
【００３０】
第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターが共にタバコモザイクウイルスＴＭＶ３０Ｂに基づいている態様は、本発明の方法のステップ（ｉ）から排除される。なぜなら、この場合、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターではなく、同じウイルスベクターであるからである（参照：Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２０（１９９８）６９−７５）。
【００３１】
第１および第２ウイルスベクターは、好ましくは多くても９０％、より好ましくは多くても８０％、さらにより好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％のＲＮＡレベルの配列相同性を有する。さらにとりわけ、第１ウイルスベクターの任意の１００塩基の配列部分が好ましくは、第２ウイルスベクターの任意の１００塩基の配列部分に多くても９０％、好ましくは多くても８０％、より好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％の配列相同性を有する。
【００３２】
一態様では、第１ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦ（またはレプリカーゼが１種以上のＯＲＦによってコードされる場合、複数のＯＲＦ）と第２ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦ（またはレプリカーゼが１種以上のＯＲＦによってコードされる場合、複数のＯＲＦ）は、多くても９０％、より好ましくは多くても８０％、さらにより好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％の相同性を有する。別の態様では、第１ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦと第２ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦは多くても８５％、より好ましくは多くても７５％、さらにより好ましくは多くても６５％、そして最も好ましくは多くても５５％の同一性を有する。
【００３３】
ステップ（ｉ）では、第１ウイルスベクターは好ましくは、発現が第１サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有する。第２ウイルスベクターは、発現が第２サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有する。サブゲノムプロモーターの１種または両方はＩＲＥＳエレメントによって置換されてもよい。先に記載のステップ（ｉｉ）の場合と同様に、第１および第２タンパク質サブユニットがサブゲノムプロモーターの制御下で発現される場合、植物細胞に望ましくない組換え事象を引き起こすことになる第１および第２（およびいずれか別のウイルスベクター）ウイルスベクター間の相同性を回避するために、これらのサブゲノムプロモーターは好ましくは配列が異なる。そのような異なるサブゲノムプロモーターは異なる株または種の植物ウイルスから採取されてもよく、たとえば１種のサブゲノムプロモーターはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１のコートタンパク質（ＣＰ）サブゲノムプロモーターであってもよく、そして別のサブゲノムプロモーターはＴＭＶ Ｕ５またはアブラナ科植物‐感染トバモウイルス（ｃｒ‐ＴＭＶ）のＣＰサブゲノムプロモーターであってもよい。
【００３４】
細胞間、もしくは長距離移行に必要な植物ウイルスのＯＲＦは本発明のウイルスベクター構築時に削除されてもよいため、上記の非競合ウイルスベクターの関連性はウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦを比較することにより確認してもよい。
【００３５】
第１および第２タンパク質サブユニットをコードする第１および第２異種配列は、それぞれウイルスベクターに付加的な配列として添加されてもよい。異種配列は好ましくは高レベルの発現が成し遂げられるように添加される。この目的のために、異種配列はウイルスの３′末端に添加される。なぜなら３′ＯＲＦはしばしば多くのウイルスで最も高レベルで発現されるＯＲＦであるからである。好ましくは、しかし、異種配列は、ウイルスに生来ある配列、たとえばトバモウイルスのような多くのウイルスにおいてＣＰ ＯＲＦであるウイルスの天然の３′ＯＲＦと入れ替わる。したがって、第１および／または第２ウイルスベクターは好ましくはウイルスベクターの全身移行のためのＯＲＦを欠如する。ウイルスベクターはさらに、トバモウイルスのＭＰ ＯＲＦのような細胞間移行のためのＯＲＦを欠いてもよい。
【００３６】
本発明では、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）は、とりわけヘテロオリゴマータンパク質の３種以上の異なるサブユニットを発現するために組み合わせてもよい。４種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質が産生されることになる場合、２種のタンパク質サブユニットがステップ（ｉ）に従って発現されてもよく、そして２種の付加的なタンパク質サブユニットがステップ（ｉｉ）に従って、植物体または植物組織の細胞中に産生されてもよい。しかし、好ましくは２種のタンパク質サブユニットが第１ウイルスベクターから発現されてもよく、そして２種のタンパク質サブユニットが第１ウイルスベクターに非競合的な第２ウイルスベクターから発現されてもよい。３種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質が産生されることになる場合、上記の３種のタンパク質サブユニットは、ステップ（ｉ）に従って、ステップ（ｉｉ）に関する記載と同様に第１ウイルスベクターから２種のタンパク質を発現し、そして非競合ウイルスベクターから第３のタンパク質サブユニットを発現することにより、発現されてもよい。
【００３７】
本発明のウイルスベクターは、典型的にはＤＮＡレベルで工学的に操作される。ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターのように植物体の細胞または植物組織の細胞に提供される場合、上記ＤＮＡは、たとえばＴ７ポリメラーゼのようなバクテリオファージポリメラーゼを適切なプロモーターと一緒に使用することにより、ＲＮＡウイルスベクターにｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されてもよい。２種の異なるウイルスベクターは好ましくは、植物体の細胞が両方のウイルスベクターを備えることを確実にするために、混合物として植物体に提供される。好ましくは、しかし、植物体または植物組織をＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体により形質転換することにより、本発明のウイルスベクターが植物体の細胞または植物組織の細胞に提供される。ＤＮＡ前駆体は、植物体の細胞中で、ＤＮＡ前駆体の転写によってウイルスベクターを形成することに対して活性な転写プロモーターを有する。最も好ましくは、ＤＮＡ前駆体はアグロバクテリウムＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡである。２種以上のウイルスベクターはその後、植物体をそれぞれの株が特定のウイルスベクターをコードするＴ−ＤＮＡを含有する２種以上のアグロバクテリウム株の混合物（たとえば、懸濁液）で処理することにより植物体または植物組織に提供されてもよい。そのようなアグロバクテリウム懸濁液で植物体の実質的な部分を処置することが、天然の植物ウイルスの全身移行機能および／または細胞間移行機能の代わりとなってもよい。
【００３８】
アグロバクテリウム法を用いたウイルスベクターのＤＮＡ前駆体による植物体、植物組織または植物細胞の一過性トランスフェクションは、本発明において最も好ましい。しかし、ウイルスベクターのＤＮＡ前駆体が植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれてもよい。染色体ＤＮＡからのウイルスベクター（複数のウイルスベクター）の放出は誘導型プロモーターによって制御されてもよい。
【００３９】
ウイルスベクターがＤＮＡ前駆体から植物体に提供される場合、それらが転写される細胞核から、ウイルスベクターが複製する細胞質へのウイルスベクターの移動効率を改善するための処置がとられることが好ましい。このことは、ＷＯ２００５／７１０９０として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０５／０００４９２（これを参照として本明細書に援用する）に詳細に記載されるように、ＤＮＡ前駆体、とりわけウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦにイントロンを包含することにより成し遂げられてもよい。
【００４０】
本発明の方法は、植物ウイルス発現系が存在するか、または将来作り出されることになるいずれかの植物に適用してもよい。植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。双子葉植物の中では、ナス科、アブラナ科、アカザ科、およびマメ科が好ましい。ナス科の中では、Ｎ．タバカムまたはＮ．ベンサミアーナのようなニコチアナ属が好ましい。別の好ましい植物はメディカゴサティバおよびフダンソウのようなフダンソウ種である。
【００４１】
本発明の方法は植物系においてヘテロオリゴマータンパク質を産生するために使用される。好ましいヘテロオリゴマータンパク質は以下のクラスのイムノグロブリン：イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、イムノグロブリンＤ、およびイムノグロブリンＥのようなイムノグロブリンである。これらのイムノグロブリンは少なくとも抗原結合ドメインの一部を含有してもよい。本発明に従って産生されるこれらのイムノグロブリンが少なくとも２種の異なるタンパク質サブユニットを含有するならば、必要に応じて、それらのイムノグロブリンは、生来の動物イムノグロブリンに関連して改変されてもよい。イムノグロブリンはイムノグロブリン重鎖と一緒に保護タンパク質を含有してもよく、ここで保護タンパク質はポリイムノグロブリン受容体の一部を含有する。別の好ましいヘテロオリゴマータンパク質はインスリンである。
【００４２】
本発明のヘテロオリゴマータンパク質は、必要に応じて生来のタンパク質に関連して多くの異なる方法で改変されてもよい。ヘテロオリゴマータンパク質では、生来のヘテロオリゴマータンパク質の１種以上のタンパク質サブユニットの分泌シグナルを形成する生来のリーダー配列が植物‐特異的シグナルペプチドに置換されてもよい。上記の植物‐特異的シグナルペプチドはタバコカルレティキュリンおよび／またはイネアルファ‐アミラーゼに由来してもよい。ヘテロオリゴマータンパク質の少なくとも１種または少なくとも２種以上のサブユニットが植物細胞においてサブユニット由来のヘテロオリゴマータンパク質のアセンブリーを改善するための小胞体保持シグナルＫＤＥＬを含有していてもよい。さらに、タンパク質サブユニットをコードする異種配列が変異してヘテロオリゴマータンパク質からグリコシル化部位を部分的に、または完全に除去してもよい。その上、発現されることになるヘテロオリゴマータンパク質のグリコシル化パターンが、たとえば１種以上のグリコシルトランスフェラーゼのような、植物グリコシル化装置の構成要素を工学的に操作することによって変えられてもよい。
【００４３】
本発明のヘテロオリゴマータンパク質は一般に公知の手順に従って発現後に植物体、植物組織または植物細胞から分離されてもよい。上記のヘテロオリゴマータンパク質はその後実質的に均質に精製されてもよく、そのような状態はクーマシー染色したＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上のヘテロオリゴマータンパク質に起因するバンドが、慣用のゲルリーダーにより測定したレーンの染色の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％を占めると定義されてよい。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明に記載のウイルスベクターは、上記のヘテロオリゴマータンパク質を形成するために必要なすべてのタンパク質サブユニットを単一のベクターがコードするウイルスベクター、または上記の少なくとも２種のウイルスベクターのそれぞれが、上記のヘテロオリゴマータンパク質を形成するために必要な異なるタンパク質サブユニットをコードする、少なくとも２種の異なる非競合ウイルスベクターのいずれかである。上記の非競合ウイルスベクターのそれぞれは、組換えヘテロオリゴマータンパク質の１種より多いサブユニットをコードする１種より多い異種核酸配列を発現することができる。上記のＲＮＡウイルスベクターは植物細胞に一過性に送達されてもよく、あるいはＤＮＡ前駆体（複数の前駆体）として植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれてもよい。
【００４５】
本発明は植物細胞における高収率のヘテロオリゴマータンパク質産生のための方法を提供する。この方法は、たとえば発現されることになる異種配列のサイズ制限、上記ベクターの高い不安定性および同じ植物細胞に異なる核酸配列を同時発現できないこと、のような既存のウイルスベクターを基礎にした発現系の制限を克服する。さらに、系からのウイルスコートタンパク質の除去が感染性ウイルス粒子の形成および野生型ウイルスへの逆戻りを妨げるため、上記方法はよりすぐれた生物学的安全性を提供する。本発明を実施することにより、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の高収率発現系の設計が実質的に任意の植物ＲＮＡウイルス‐由来レプリコンにとって可能であり、レプリコンは、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の異なるサブユニットをコードする、少なくとも２種の関心のある異種配列を発現可能にするためのレプリコンの改変によって、関心のある異種配列の発現に適切になる。あるいは、同じ植物細胞においてウイルスベクターと一緒に同時複製することができる別の非競合ウイルスベクターを見いだすことも可能である。
【００４６】
異なる分類学的群に属するプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルス（本明細書では、簡潔に「ＲＮＡウイルス」とも表す）は、本発明のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（本明細書では、簡潔に「ウイルスベクター」とも表す）を構築するためにふさわしい。本明細書では、ウイルスベクターは植物細胞において複製する：すなわち鋳型としてＲＮＡウイルスベクターを使用して、ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡ重合により別のＲＮＡベクター分子を形成することができるＲＮＡベクターである。好ましくは、本発明のウイルスベクターはＲＮＡウイルス機能を有する、少なくとも１種のウイルス配列エレメント、たとえば、レプリカーゼ、サブゲノムプロモーター、ウイルス粒子アセンブリーの起点、コートタンパク質ＯＲＦ、または移行タンパク質ＯＲＦを含有する。さらに、ウイルスベクターはＲＮＡウイルスＩＲＥＳエレメントを有していてもよい。
【００４７】
ウイルスベクターは、たとえばウイルスに制限部位を導入することにより、それが由来するウイルスから構築してもよく、制限部位は本発明の異種配列を導入するためにふさわしいクローニング部位を表す。当業者は、ＲＮＡウイルスまたはベクターに対する核酸の工学的操作は一般に、それぞれ上記のＲＮＡウイルスまたはベクターのＤＮＡコピーを使用して、ＤＮＡレベルで行われることを理解することになる。したがって、ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡコピーは、ＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーに制限部位を導入することにより、それが由来するＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーから構築することができ、制限部位はＤＮＡレベルで本発明の異種配列のＤＮＡコピーを導入するためにふさわしいクローニング部位を表す、と述べることがより正確である。これらの事柄は当業者には明白であり、一般に本明細書では強調されない。
【００４８】
ＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーがクローニングにふさわしい制限部位（複数の制限部位）を天然に有する場合、ウイルス自体がウイルスベクターであってもよい。本明細書では、「ウイルスベクター」という用語は、異種配列がベクターに存在しない事例か、または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列がベクター中に全く存在しない事例を表す。異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列がウイルスベクターに挿入される事例は、そのようなインサートの存在を明白に特定することにより確認される。
【００４９】
本明細書では、異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列が導入される以前は２種のウイルスベクターの配列が異なる場合、そのようなウイルスベクターは異なると表す。異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列が導入される前は２種のウイルスベクターの配列が同じ配列を有する場合、それらは同じであると表す。したがって、２種のウイルスベクターが異なるか、または同じであるかどうかを確認する場合、異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列は考慮にいれない。
【００５０】
本明細書では、「レプリコン」または「ウイルスレプリコン」という用語は「ウイルスベクター」と同じ意味を有する。
本発明のウイルスベクターを工学的に操作するために使用可能なＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。（イタリック体ではない）引用符に囲まれた分類名は、この分類がＩＣＴＶにより国際的に認可された名称を持たないことを示す。種の名称（通称）は通常の活字体で示す。属または科への正式な帰属のないウイルスが示される。
【００５１】
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：
科：ブロモウイルス科、
属：アルファモウイルス、基準種：アルファルファモザイクウイルス、
属：イラルウイルス、基準種：タバコ条斑ウイルス、
属：ブロモウイルス、基準種：ブロモモザイクウイルス、
属：ククモウイルス、基準種：キュウリモザイクウイルス、
科：クロステロウイルス科、
属：クロステロウイルス、基準種：ビート萎黄ウイルス、
属：クリニウイルス、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、
科：コモウイルス科、
属：コモウイルス、基準種：カウピーモザイクウイルス
属：ファバウイルス、基準種：ソラマメウィルトウイルス１，
属：ネポウイルス、基準種：タバコ輪点ウイルス；科：ポティウイルス科、
属：ポティウイルス、基準種：ジャガイモウイルスＹ、プラムポックスウイルス；タバコエッチウイルス；クローバー葉脈黄化ウイルス；タバコベインモットリングウイルス；
属：リモウイルス、基準種：ライグラスモザイクウイルス
属：ビモウイルス、基準種：オオムギ縞萎縮モザイクウイルス；
科：セキウイルス科、
属：セキウイルス、基準種：パースニップイエローフレックウイルス、
属：ワイカウイルス、基準種：ライスツングロスフェリカルウイルス；
科：トムブスウイルス
属：カルモウイルス、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、
属：ディアンソウイルス、基準種：カーネーションリングスポットウイルス、
属：マクロモウイルス、基準種：メイズクロロティックモットルウイルス、
属：トムブスウイルス、基準種：トマトブッシースタントウイルス、
帰属されていないｓｓＲＮＡウイルスの属、
属：カピロウイルス、基準種：リンゴステムグルービングウイルス；
属：カルラウイルス、基準種：カーネーション潜在ウイルス；
属：エナモウイルス、基準種：ピーエネーションモザイクウイルス、
属：フロウイルス、基準種：ムギ類萎縮ウイルス、
属：ホルディウイルス、基準種：ムギ斑葉モザイクウイルス、
属：イダエオウイルス、基準種：ラズベリーブッシードワルフウイルス；
属：ルテオウイルス、基準種：オオムギ黄萎ウイルス、
属：マラフィウイルス、基準種：マイズラヤドフィノウイルス；
属：ポテクスウイルス、基準種：ジャガイモウイルスＸ；
属：ソベモウイルス、基準種：インゲンマメ南部モザイクウイルス、
属：テヌイウイルス、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス、基準種：タバコ茎えそウイルス、
属：トリコウイルス、基準種：リンゴクロロティックリーフスポットウイルス；
属：ティモウイルス、基準種：ターニップイエローモザイクウイルス；
属：ウムブラウイルス、基準種：キャロットモットルウイルス；
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：シトラブドウイルス、基準種：レタスネクロティックイエローズウイルス、
属：ヌクレオラブドロウイルス、基準種：ポテトイエロードワーフウイルス。
【００５２】
ＲＮＡウイルスベクターは、関心のある遺伝子の発現を提供する異種ＲＮＡの極めて多数のコピーを植物細胞に提供することができる。しかし、そのようなベクターは、異種核酸配列のサイズがある範囲、通常１ｋｂを越えて増大すると、極めて不安定になることが公知である。そのような制約のために、そのようなベクター系の適用は、今まで比較的単純な小〜中程度のサイズのタンパク質に限定されてきた。高分子または複雑なヘテロオリゴマータンパク質のいずれかを発現させる試みは首尾よい結果を導いてこなかった。我々は、驚くべきことに、以前には不可能であった複雑なヘテロオリゴマータンパク質の高収率発現のためにウイルスベクターを首尾よく採用できることを見いだしている。全長モノクローナル抗体を発現させる初期の試み（Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２２０，６９−７５）は、同じ細胞における関心のあるタンパク質の同時発現のために使用されるウイルスベクターの不適合性のために、満足すべき結果を提供しなかった。実施例１で、我々は、単一細胞レベルで、同じ植物ＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）由来のウイルスレプリコンから２種の異なる遺伝子（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の効率的な同時発現が不可能であることを証明している。図１（Ａ‐右パネル）では、レポーター遺伝子‐ＤｓＲｅｄおよびＧＦＰの両方の発現を示すプロトプラストを検出できなかった。右下部パネルの一部のプロトプラストにおけるＤｓＲｅｄの弱い発現パターンは、強いＧＦＰ発現（右上部パネル）と一致し、そしてＤｓＲｅｄ検出に使用されたフィルターの漏出による偽‐陽性の結果である。この漏出は高濃度のＧＦＰを含有するプロトプラストの見かけの弱いＤｓＲｅｄ蛍光を導く。したがって、同一であるか、または広範な相同性領域を共有するＲＮＡレプリコンが異なる組換えタンパク質をコードする異なる異種核酸配列をたとえ持っていても、それらは１つの植物細胞に共存できない。この現象の理由は、今のところ解っていない。可能性のある説明として、１種のウイルスレプリコンのコピー数の急激な増加が、別のウイルスレプリコンを速やかに撃退することが考えられる。選択された細胞において２番目に複製を開始するレプリコンは、第１のレプリコンに追いつくことができず、したがって第１レプリコンを確認する事象は主に統計的特徴を有する。
【００５３】
この問題に取り組むための我々の研究では、２種の異なるサブゲノムプロモーターの制御下で、異なるタンパク質をコードする２種の異なる異種核酸配列が上記のレプリコン中に存在するように、ウイルスレプリコンを工学的に操作してきた。そのようなＲＮＡレプリコンをコードするＴ−ＤＮＡ領域の一般的スキームは図２に示す。そのようなベクターの設計および最適化のために、我々は、便宜上、我々の初期の特許出願に記載のプロベクター法を使用してきた（ＷＯ０２０８８３６９；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７も参照されたい）。この方法は、部位特異的組換えにより、事前に作製されたモジュールに由来する最終ベクターのｉｎ ｐｌａｎｔａでの集合を可能にし、そうしてベクター設計およびベクター最適化を著しくスピードアップさせる。コンストラクトの設計は実施例２に記載し、図式表示は図３に示す。
【００５４】
我々は驚くべきことに、最終レプリコンにおけるインサートの大きなサイズ、および２種の強いサブゲノムプロモーターの存在によるベクターの複雑な構造にもかかわらず、得られたＲＮＡレプリコンは、ｉｎ ｐｌａｎｔａでの高い安定性および同じ植物細胞における２種の異なる組換えタンパク質（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の同時発現を提供する能力を示すことを見いだしている。図４に示すように、同時発現頻度は感染した範囲ではすべての細胞のほとんど１００％にまで到達可能である。そのようなコンストラクト中におけるレポーター遺伝子（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）と、たとえばＩｇＧの軽鎖および重鎖の置換、その上のインフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部における発現は驚くべき結果を生み出した。実施例３で記載するように、ウェスタンブロット解析は見事なほどの高濃度の集合したモノクローナル抗体（レーン６および７；図６）を明らかにした。我々の系によって提供される集合したモノクローナル抗体の収率は、現在の当該技術分野の系の状態によって生み出された収率とは比較にならないほど高い（図６、レーン４）。知る限りでは、これは、植物ウイルスベクターを基にした発現系を使用することによる、抗体のような複雑なヘテロオリゴマータンパク質発現の初めての証拠である。初期のすべての刊行物はモノクローナル抗体の簡単な人工誘導体の発現、たとえばＴＭＶ−ウイルスベクターを使用した（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６，７０３−７０８；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７８，９５−１０４）およびＰＶＸを基礎にした（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４１，３７９−３８２；Ｆｒａｎｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１８９−２０１；Ｈｅｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，１３７−１４６；Ｒｏｇｇｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２２，７０−７４）１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の発現に限定されていた。
【００５５】
本発明では、好ましくは全身ウイルスベクターを使用しない。全身ウイルスベクターのかわりに、好ましくは植物系へのアグロバクテリウム媒介ウイルスベクター前駆体送達により、ウイルスベクターの能力を全身移行するように置換する。このことはウイルスコートタンパク質を、発現されることになる異種配列で置換することを可能にする。この方法は、ウイルスベクターの異種配列への適応性増大の可能性に貢献する。同時に、この方法はこの系の生産性を弱めることになる自発的な異種配列の欠失のために、ウイルスベクターが野生型ウイルスに変換される見込みを排除する。
【００５６】
我々のウイルス‐レプリコンを基礎にした系は、先行技術の系より著しく改善された収率のモノクローナル抗体を産生するが、我々はウイルスレプリコンのサイズを減少させることによりそれ以上の収率増加の可能性を検討した。分泌抗体の２つの鎖を発現するウイルスレプリコンのサイズを減少させる可能性が限定されていることを考慮して、２種の異なるウイルスレプリコンからの抗体の重鎖および軽鎖の発現を試みてきた。同じウイルスを基礎にしたレプリコンは同じ植物細胞において２種の異なる異種配列を発現できない（上記参照、実施例１）ことを考慮して、非相同植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）とジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に由来するウイルスベクターに、ＤｓＲｅｄとＧＦＰ遺伝子を別々にクローニングすることにより、同じ植物細胞に２種の異なる遺伝子を同時発現させる可能性を試験した（実施例４を参照されたい）。ウイルスベクターのｃＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡ領域の図式表示は図７および８（ＰＶＸのみ）に示す。実施例４では、便宜上、部位特異的組換えによりベクターモジュールからｉｎ ｐｌａｎｔａで集合させたＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターを使用した。驚くべくことに、共にインフィルトレーションされた植物葉領域から分離したプロトプラストはＤｓＲｅｄおよびＧＦＰレポーター遺伝子の実質的に１００％の同時発現頻度を示すことを我々は見いだしている（図９）。
【００５７】
最近、異なって標識されたウイルスの空間的分離に関する研究がＤｉｅｔｒｉｃｈとＭａｉｓｓ（２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８４，２８７１−２８７６）によって提示された。この研究では、レポーターとして蛍光タンパク質が発現した。ヘテロオリゴマータンパク質の産生には言及しなかった。さらに、分離したプロトプラストレベルでの同時発現は検討しなかった。レポーター遺伝子産物は原形質連絡を介した拡散により隣接する細胞に拡散できるため、選択されたウイルス対がレポーター遺伝子を、同じ細胞で、または隣接する細胞で発現したかどうかについての情報は全く得られなかった。初期の刊行物は植物の感染時の野生型ウイルス間の相乗作用について述べているが、植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の発現については述べていない。（Ｒｏｃｈｏｗ ＆ Ｒｏｓｓ，１９５５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１，１０−２７；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，１６−２４；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９，３１４−３１８；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，２６３−２７１）。同時感染した植物におけるウイルスの相乗的相互作用に関するこれらの初期の研究（Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｌｏｇｙ，２０６，５８３−５９０；Ｐｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，９，８５９−８６８）のその後の発展は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーの発見を導いた。組換えタンパク質発現系のさらに進んだ発展は、促進された組換えタンパク質産生のためのそのようなＰＴＧＳサプレッサーの研究に向けられた。相乗的ウイルスを基礎にしたウイルス発現系を使用した先行技術にはタンパク質発現に対する手がかりが全く存在しない。
【００５８】
本発明は、非競合ウイルスベクターが植物細胞または植物体におけるヘテロオリゴマータンパク質産生の効率的な手段を表すことを証明する。２種以上のウイルスベクターが同じ植物細胞において複製可能であり、そして上記の複製および別の細胞からのトランスフェクション中にお互いに効力を低下させない場合、上記のウイルスベクターはお互いに非競合的である。効力低下がないとは、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは１００％のトランスフェクションされた植物細胞が共にトランスフェクションされること、すなわち上記の２種以上の異なるウイルスベクターを含有することを意味する。好ましくは、上記のウイルスベクターは異種核酸配列を複製し、発現することが可能である。より好ましくは、上記の異種核酸配列が異なるタンパク質をコードする。よりいっそう好ましくは、上記の異なるタンパク質がヘテロオリゴマータンパク質のサブユニットである。ウイルスベクターが競合的であるか、または非競合的であるかを確認するために、植物細胞の同時トランスフェクションの頻度を測定することができる。このことは以下のプロトコルに従って行うことができる：２種のウイルスベクターは２種の異なるレポーター遺伝子、たとえばＤｓＲｅｄとＧＦＰで標識される。上記の、異なって標識されたベクターは植物葉組織に（たとえばアグロ‐インフィルトレーション法により）同時送達され、３〜６日後、感染した領域から分離したプロトプラストを計数して、１種のレポーター遺伝子だけを発現しているプロトプラスト数に比較した、両方のレポーター遺伝子を同時発現しているプロトプラストの割合を決定することができる。そのような測定値を例示する実験は実施例２および４に記載する（図１Ａおよび９も参照されたい）。通常、非競合ウイルスベクターは相乗的であるウイルスに由来することができ、たとえば、同じ植物宿主に首尾よく同時トランスフェクションすることができる。そのような相乗的ＲＮＡウイルス対の例としては以下のものが挙げられる：
ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）／タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；
ＰＶＸ／タバコベインモットリングウイルス（ＴＶＭＶ）；
ＰＶＸ／タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）；
ＰＶＸ／クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）；
ＰＶＸ／プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）；
ＰＶＸ／ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）。
【００５９】
ウイルスベクターの競合性または非競合性の機構的理由は既知ではない。可能性のある１つの説明としては、相乗的ウイルスベクターに由来するウイルスレプリコンが異なる細胞下コンパートメントにおいてウイルス複製複合体（ＶＲＣ）を形成する（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６２９１−６２９６）ことが挙げられ、したがってそれらはＶＲＣを形成するために必要な空間に対してお互いに競合しない。実験的に証明されているように、非競合ウイルスベクターは、核酸配列レベルが著しく異なる、異なるウイルス種に由来してもよい。上記の非競合ウイルスベクターは、同じ植物宿主に首尾よく同時感染できる相乗的植物ウイルスに由来してもよい。相乗的ウイルスは通常異なる属に属する。たとえば、ＰＶＸはポテクスウイルス属に属するが、それに対して相乗的なウイルス、たとえばＴＶＭＶ、ＴＥＶ、ＰＰＶ、およびＣＩＥＶＶはポティウイルス属に属する。ＰＶＸウイルスに相乗的（非競合的）な別のウイルス、たとえばＴＭＶ、ＴＶＣＶ、およびｃｒＴＭＶはトバモウイルス属に属する。明らかに、異なる属の典型間のゲノム相同性はかなり低く、通常、ＲＮＡレベルで５０％同一性より低い。
【００６０】
異なるウイルスベクター（たとえば、ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたもの）へのモノクローナル抗体重鎖および軽鎖のクローニング、続いて同時感染した植物組織における上記の鎖の付加的な同時発現は実施例５に記載する。ベクターの図式表示は図１０に示す。本発明および別の発現系により産生されたモノクローナル抗体の収率の比較ＥＬＩＳＡ測定は、２種の非競合ウイルスベクターを基礎にした上記の系の最も好ましい成果を示した（図１１）。ウイルスベクター（複数のウイルスベクター）の補助による植物細胞での組換えヘテロオリゴマータンパク質の効率的な発現は先行技術では公知でない。
【００６１】
我々のデータに基づいた場合、ウイルスベクターのウイルスに由来する配列は、上記ウイルスがお互いに関連するとみなすために十分な相同性を示さないことになる。そのようなウイルスの例としては、ＴＭＶとＰＶＸのウイルス対が挙げられ、そしてウイルスベクターはそれに基づく。これらのウイルスベクターはそのような相同性を全く示さない。受容可能なウイルス対を選択するための別の必要条件は、植物宿主に同時感染中の、元の野生型ウイルスの相乗性であってもよい。
【００６２】
上で論じた実験は、植物細胞へのアグロバクテリウムに媒介されたＤＮＡ前駆体送達に基づいた一過性発現系により行われた。しかし、本発明の代わりの適用としては、植物核ヌクレオソームに安定に組み込まれた上記のＲＮＡレプリコン（複数のレプリコン）のＤＮＡ前駆体によるトランスジェニック植物への適用が挙げられる。これは、植物ウイルスベクターを基礎にした系の多くの制約、たとえば、ウイルスベクターが耐えうる異種配列の最大サイズに対する制限を克服する。ＤＮＡ前駆体はトランスジェニック植物のそれぞれの細胞に存在することになるため、ＲＮＡレプリコンの全身移行または細胞間移行（レプリコンスプレッディング）のための絶対的な要求性が存在しない。これは、高い効率の本発明のＲＮＡレプリコン形成および細胞質への輸送によって補われる。しかし、ＲＮＡレプリコン形成がすべての細胞でいつも起こるわけではないので、ベクターの細胞間移行の能力は付加的な価値のものであってもよい。
【００６３】
異なる方法を使用して、植物体、植物組織または植物細胞に異種ＤＮＡを提供してもよい。上記のベクターは、アグロバクテリウム（ＵＳ５，５９１，６１６；ＵＳ４，９４０，８３８；ＵＳ５，４６４，７６３）または粒子もしくはマイクロプロジェクタイルボンバードメント（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）によって運ばれるＴｉ−プラスミドベクターによって、植物細胞を形質転換してよい。別の植物形質転換法、たとえばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）またはプロトプラストのＰＥＧ‐媒介形質転換なども使用することができる。ベクター送達方法の選択は、形質転換されることになる植物種に依存してもよい。たとえば、マイクロプロジェクタイルボンバードメントは一般に単子葉植物の形質転換に好ましいが、双子葉植物には、一般にアグロバクテリウム媒介形質転換がより好ましい結果を示す。
【００６４】
本発明の実施例では、ニコチアナ細胞へのベクター（上記の異種ＤＮＡ）の一過性アグロバクテリウム媒介送達を使用した。しかし、上記ベクターは、関心のある植物種の安定な、または一過性形質転換にふさわしい標準技術のいずれかに従って、植物体に安定に導入されてもよい。双子葉植物のための形質転換技術は当該技術分野で公知であり、アグロバクテリウムを基礎にした技術とアグロバクテリウムを必要としない技術が挙げられる。アグロバクテリウムを使用しない技術には、プロトプラストまたは細胞による直接的な外来遺伝物質の取り込みが挙げられる。これらの技術には、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション媒介取り込み、粒子ボンバードメント‐媒介送達およびマイクロインジェクションが挙げられる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ３，２７１７−２７２２（１９８４）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，１６９−１７７（１９８５）、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）、およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７）に記載される。それぞれの場合、形質転換された細胞は標準技術を使用して、全植物体に再生される。
【００６５】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、その高い形質転換効率と多くの異なる種に対するその広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。通常アグロバクテリウムによって形質転換することができる多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿花、ナタネ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファおよびポプラが挙げられる（ＥＰ０３１７５１１（綿花）、ＥＰ０２４９４３２（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９（ナタネ）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
【００６６】
本発明の実施例では、関心のある遺伝子（複数の遺伝子）の一過性発現にＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム媒介送達（Ｖａｑｕｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１１１２８−１１１３３）が使用された。この方法は、小規模〜中規模の組換えタンパク質産生系にとってだけでなく、大規模発現にとっても極めて有用な手段である。
【００６７】
植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスレプリコン前駆体の放出は、誘導型またはいずれか別の調節された（たとえば発達的に調節された）プロモーターを使用して行うことができる。誘導型プロモーターはそれらの誘導条件に従って、２つのカテゴリーに分類することができる：非生物的因子（温度、ｐＨ、化学物質）によって誘導されるものおよび生物因子、たとえば病原体または害虫攻撃によって誘導されるもの。第１のカテゴリーの例としては、熱‐誘導型（ＵＳ０５１８７２８７）および低温‐誘導型（ＵＳ０５８４７１０２）プロモーター、銅‐誘導系（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０，４５６７−４５７１）、ステロイド‐誘導系（Ａｏｙａｍａ ＆ Ｃｈｕａ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１１，６０５−６１２；Ｍｃｍｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１４，２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５）、エタノール‐誘導系（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４）、およびテトラサイクリン誘導系（Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５，５５９−５６９）が挙げられる。植物の化学的誘導系の分野での最も最近の成果の１つは、グルココルチコイドデキサメタゾンによりスイッチを入れ、テトラサイクリンによりスイッチを切ることができるキメラ化プロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９，８７−９５）。化学的誘導系に関する総説としては以下を参照されたい：Ｚｕｏ ＆ Ｃｈｕａ，（２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．，１１，１４６−１５１）およびＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６，１６９−１７７）。誘導型プロモーターの別の例としては、植物における病原性‐関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、病原菌攻撃に反応する植物シグナリング経路の重要な構成要素であるサリチル酸、またはＰＲ遺伝子発現を引き起こすことが可能な別の化合物（ベンゾー１，２，３−チアジアゾールまたはイソニコチン酸）（ＵＳ０５９４２６６２）による植物の処理によって誘導することができる。
【００６８】
本発明は実施例に記載のＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターに限定されないが、上記ウイルスレプリコンに由来する発現系の確立に役立つ、別の植物ＲＮＡウイルスに由来するレプリコンに適用可能である。同時感染された植物において最も詳しく研究された相乗作用はウイルスのＰＶＸ／ＰＶＹ対に関して公知である（Ｒｏｃｈｏｗ ＆ Ｒｏｓｓ，１９５５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１，１０−２７；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，１６−２４）。おそらく、多くのそれらのウイルスは同じ植物細胞中で共に複製可能である。Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＆ Ｍａｉｓｓ（２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８４，２８７１−２８７６）は、異なって標識されたウイルス対、たとえばプラムポックスウイルス（ＰＰＶ）とジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、タバコベインモットリングウイルス（ＴＶＭＶ）とＰＶＸ、クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）とＰＶＸは、植物組織中の同じ感染領域において異なるレポーター遺伝子を同時発現できることを示している。本発明に記載のストラテジーを使用して、同じ植物細胞中で同時複製可能な、実質的に任意の対の植物プラスセンス１本鎖ＲＮＡウイルス‐由来レプリコンに対する組換えヘテロオリゴマータンパク質発現系が開発可能である。たとえば、アルファモウイルス属のアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）に基づいたウイルスベクターが本発明で使用可能である。
【００６９】
複雑な（ヘテロオリゴマー）タンパク質、それらの（機能的または非機能的）フラグメントならびにそれらの人工誘導体および融合物をコードする関心のある遺伝子は、本発明を使用して、植物体または植物細胞に発現することができる。多くの商業的に価値のあるヘテロオリゴマータンパク質の群は本発明を使用して生産し、精製することができる。それらの群には、工業用および研究用タンパク質、ならびにヒトまたは動物の健康分野における適用のためのタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。しかし、免疫反応タンパク質、とりわけ異なるクラスのイムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤ）から選択されたモノクローナル抗体ならびにそれらの合成誘導体、たとえば変異型および別のタンパク質またはその一部との異なる型の融合体が最も好ましい。
【００７０】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するために提示される。本発明の意図および範囲から逸脱せずに改変および変更を行ってもよい。
【００７１】
実施例１
同じ植物ＲＮＡウイルスに由来する２種のＴＭＶを基礎にしたＲＮＡウイルスベクターからのＧＦＰとＤｓＲｅｄの同時発現の欠如
葉組織は同じ植物ＲＮＡウイルスに由来するが、関心のある２種の異なる遺伝子を含有する、２種のＴＭＶを基礎にしたＲＮＡウイルスベクターに感染された（図１）。ＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターにクローニングした可視マーカー遺伝子ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄを使用して、この方法を試験した。第１コンストラクト、ｐＩＣＨ１７２７２（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３の図１を参照されたい）はＧＦＰを含有し、そしてベクター中のＲｄＲＰコーディング配列が１４個よりむしろ９個の植物イントロンを含有すること以外は、ｐＩＣＨ１８７１１（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０，ＷＯ２００５０４９８３９として公開；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３を参照されたい）に類似する。ｐＩＣＨ１８７２２（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３）はＴＭＶの中の２種の密接に関連した株、ＣｒＴＭＶ（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０，５−８）およびＴＶＣＶ（Ｌａｒｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．１３８，２８７−２９８）の骨格に構築され、コートタンパク質配列が異種配列によって置換されている、植物プロモーターの制御下にあるウイルスゲノムを含有する。ＲｄＲＰおよびＭＰ中の１１個のイントロンの存在は、ベクターの葉組織へのアグロバクテリウム媒介送達後のウイルス複製開始の効率を増し、したがって同じ細胞における２種のウイルスベクターの同時発現の見込みを増大させる。ＧＦＰコーディング配列がＸｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を使用してＤｓＲｅｄのコーディング配列によって置換されていること以外は、ｐＩＣＨ１８５０５は、ｐＩＣＨ１７２７２に類似する（図１）。ｐＩＣＨ１８５０５およびｐＩＣＨ１７２７２のＴ−ＤＮＡ領域の詳細な制限地図は図１Ｃに示す。ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５はアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、先に記載（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）のように、ニコチアナベンサミアーナ葉組織がインフィルトレーションされた。プロトプラストはインフィルトレーション７日後にインフィルトレーション部位から作製し、顕微鏡下、青色または赤色光下で観察した。プロトプラストが数日後にインフィルトレーション部位から作製された場合でも、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの両方を発現したのは非常にわずかのプロトプラストだけであった。このことは細胞が第１のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターにひとたび感染すれば、第２のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターによる再感染は不可能になることを示唆する。
【００７２】
実施例２
単一ウイルスレプリコンからのＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの同時発現
２種の別々のサブゲノムプロモーターの制御下、関心のある２種の遺伝子がＲＮＡウイルスベクターから発現された（図２）。両方のサブゲノムプロモーターは同一であってもよいが、ウイルス複製中におけるコンストラクト中の反復配列間の欠失のリスクを回避するために、関連するＴＭＶ株由来のサブゲノムプロモーターを使用することが好ましく；この場合、第２のサブゲノムプロモーターおよび３′非翻訳領域はＴＭＧＭＶ株Ｕ５に由来する（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５５，３１２−３２３；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）。また、クローニングの便宜上、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄは、完全にアセンブルされたベクターよりむしろ、ウイルスプロベクター（ＷＯ０２／０８８３６９およびＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７に記載）にクローニングされた。２種のプロベクター、ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１５９３３（図３）は、ｉｎ ｐｌａｎｔａで、両方のプロベクターモジュール間の部位特異的組換えにより完全に機能的なＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターに変換された。ｐＩＣＨ１７３８８は、（ｐＩＣＨ１７２７２と同じように）ウイルス配列に１１個のイントロンが存在すること以外はｐＩＣＨＮＯＰ（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）に類似する。ｐＩＣＨ１５９３３は、ＤｓＲｅｄのコーディング配列によってＴＭＧＭＶ Ｕ５のコーディング配列が置換されている以外は、ｐＩＣＨＧＦＰＳＹＳ（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）に相当する。
【００７３】
ｐＩＣＨ１５９３３はアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換され、ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１０８８１（図３）と一緒にニコチアナベンサミアーナにインフィルトレーションした。インフィルトレーション５日後に、すべてのＧＦＰ‐発現部位はＤｓＲｅｄも発現し、同じ植物細胞中における２種の遺伝子の卓越した同時発現を示した（図４）。
【００７４】
実施例３
単一のウイルスレプリコンから抗体の発現
ｐＩＣＨ１５９３３におけるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのコーディング配列は、ＩｇＧ抗体軽鎖および重鎖によってそれぞれ置換され、コンストラクトｐＩＣＨ２０２４１（図５）を得た。対照として、重鎖および軽鎖はＴＭＶを基礎にしたプロベクターにクローニングし、ｐＩＣＨ１７４０のコーディング配列を置換し、コンストラクトｐＩＣＨ２０４２１およびｐＩＣＨ２０４３１（図５）を得た。ｐＩＣＨ２０２４１はｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１０８８１と一緒にニコチアナベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションした（図３）。
【００７５】
インフィルトレーションされた葉部から抽出した全可溶性タンパク質のウェスタンブロット解析は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）により標識した、１：６０００に希釈した抗‐ヒトＩｇＧウサギ抗体により行った。解析の結果は図６Ａに示す。単一のウイルスベクターの補助によって達成された抗体の発現レベル（レーン６＆７、図６）は、ＰＴＧＳサプレッサーＰ１９の存在においてさえ、強力な構成プロモーターの補助により成し遂げられたものより著しく高い（レーン３〜４、図６）。
【００７６】
実施例４
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたウイルスベクターによるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの同時発現
２種の遺伝子の同時発現のための別のストラテジーは、同じ細胞に同時感染し、複製することが可能な、異なるウイルスに基づいて構築された別々のウイルスベクターを使用することである。例として、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づいた発現ベクターはＴＭＶと一緒に同じ細胞に共に存在することができる。２種のそのような非競合ウイルスベクターの図式表示は図７に示す。
【００７７】
ＰＶＸ（ＰＶ００１４株）の接種材料は、感染した乾燥葉材料として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｔｅｓ（ＤＳＭＺ）から得て、ニコチアナベンサミアーナ植物体の接種に使用した。ウイルス症状を示した接種植物の全身葉部は全ＲＮＡ調製に使用した。第１鎖ｃＤＮＡはプライマーｐｖｘｐｒ２、ｐｖｘｐｒ４およびｐｖｘｐｒ６を使用して作製した。３種のｃＤＮＡフラグメントはＰｆｕ−Ｔａｑポリメラーゼミックスを使用して、ＰＣＲによりＰＶＸｃＤＮＡから増幅した：
フラグメント１はプライマー：
【００７８】
【化１】
【００７９】
により増幅した。
フラグメント１はＢｓａＩにより消化した。
フラグメント２はプライマー：
【００８０】
【化２】
【００８１】
により増幅した。
フラグメント２はＥｓｐ３Ｉにより消化した。
フラグメント３はプライマー：
【００８２】
【化３】
【００８３】
により増幅した。
フラグメント３はＢｐｉＩ ＡａｔＩＩにより消化した。
アラビドプシスアクチン２遺伝子プロモーターを含有するフラグメント４（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０，１０７−１２１）はアラビドプシスゲノムＤＮＡからプライマー：
【００８４】
【化４】
【００８５】
により増幅した。
フラグメント４はＭｌｕ１およびＢｓａ１により消化した。
アラビドプシスアクチン２プロモーターの代わりとして、さらにＣａＭＶ３５プロモーターを使用して、ＰＶＸを基礎にしたウイルスベクターの転写を行った（図１０Ｄ、ｐＩＣＨ２０７８８；ｐＩＣＨ２１３８０）。ＰＶＸを基礎にしたベクターを作製する一般的ストラテジーはＢａｕｌｃｏｍｂｅ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，７：１０４５−１０５３）に記載のように使用した。
【００８６】
４種すべてのフラグメントは、Ｍｌｕ１およびＡａｔＩＩにより消化したバイナリーベクター中に一緒にクローニングした。得られたコンストラクトの２０個のクローンはアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換し、それぞれのクローンはニコチアナベンサミアーナ植物体の１枚の葉にインフィルトレーションした。１週間後、ウイルス感染症状の表現型に対してニコチアナベンサミアーナをスクリーニングし、陽性のプラスミドクローンを保存した（ｐＩＣＨＰＶＸ）。
【００８７】
クローニングベクターは、ＣＰサブゲノムプロモーター下流の、関心のある遺伝子をクローニングするためのこの完全に機能的なｃＤＮＡから作製した。ＧＦＰ遺伝子は例としてクローニングした。ＣＰサブゲノム領域中のＡＴＧはＡＧＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ９５５１６中の位置５６５１）に変異させた。ＧＦＰ遺伝子はＮｈｅ１部位の３′（座標５６６２〜５６６７）にクローニングした。ＰＶＸの３′末端（座標５６１８〜６４３５）はＧＦＰ配列の下流にクローニングし、この配列に１２〜２４Ａのストレッチが続いた。このコンストラクト（ｐＩＣＨ０１３０，図８）はニコチアナベンサミアーナ葉部にアグロインフィルトレーションした。ＧＦＰ蛍光はインフィルトレーション後２〜３日目に出現した。ＧＦＰの全身移行は数日後に出現した。
【００８８】
ｐＩＣＨ０１３０はベクターｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１０５８０およびｐＩＣＨ１０８８１（図３）と一緒にニコチアナベンサミアーナ葉部に同時インフィルトレーションし、ＤｓＲｅｄ発現を提供した。同時インフィルトレーション後６日目にインフィルトレーションした領域からプロトプラストを作製し、青色光の下、顕微鏡下で観察した。ほとんどすべてのプロトプラストはＧＦＰおよびＤｓＲｅｄを両方とも発現し、卓越した同時発現レベルを示した（図９）。
【００８９】
実施例５
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによるモノクローナル抗体の発現
ＩｇＧの重鎖および軽鎖はＰＶＸベクターにクローニングし、ｐＩＣ０１３０中のＧＦＰのコーディング配列を置換して、それぞれ重鎖または軽鎖のいずれかを含有する２種のコンストラクト、ｐＩＣＨ２１２４０およびｐＩＣＨ２１３７０を生み出した（図１０Ａ）。また、抗体の軽鎖または重鎖のいずれかを含有するＴＭＶプロベクター部分のクローンが構築された（ｐＩＣＨ２０４３１およびｐＩＣＨ２０４２１，図１０Ａ）。２種の異なる鎖の発現型であるＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターを提供するアグロバクテリウムの混合物はＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、抗体の発現レベルは接種後１０日目にＥＬＩＳＡによって測定した。結果（図１１）は、ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクター由来の重鎖および軽鎖の同時発現の事例における、集合した機能的抗体の極めて高レベルを示す。これらのレベルは両方の鎖を発現しているＴＭＶベクターから得られたものより著しく高かった（実施例３）。
【００９０】
ＩｇＧ１サブクラスに属するさらに別のヒト腫瘍‐特異的モノクローナル抗体、抗癌ｍａｂは以下のように、ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターにサブクローニングした：抗癌ｍａｂ軽鎖コーディング配列を含有する、７３０ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントはＮｏｔｌ部位で平滑化し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩにより開き、Ｘｂａｌ部位で平滑化した、ＴＭＶを基礎にした３′モジュールクローニングベクターｐＩＣＨ１１５９９（図１０Ｂ）にリゲーションし、ｐＩＣＨ２１９１０を得た。同じストラテジーを使用して、抗癌ｍａｂ重鎖コーディング配列を持つ１４２１ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＩＣＨ１１５９９（図１０Ｂ）にサブクローニングし、ｐＩＣＨ２１９２０（図１０Ｂ）コンストラクトを得た。ＧＦＰ発現のためのＰＶＸを基礎にした３′モジュールｐＩＣＨ２１２８２（図１０Ｃ）はＴＭＶを基礎にした３′モジュールクローニングベクターｐＩＣＨ１０９９０（図１０Ｃ）の基部に形成された。それは、ＧＦＰコーディング配列のｐＩＣＨ１０９９０（図１０Ｃ）への挿入および結果として起こるＴＭＶ３′非翻訳領域のＰＶＸ３′非翻訳領域による置換を介したいくつかのクローニングステップにより成し遂げられた。同様に、ＴＭＶを基礎にした３′プロベクターモジュールｐＩＣＨ２１９２０（図１０Ｂ）は、ＴＭＶ３′非翻訳領域をＰＶＸの３′非翻訳領域で置換することにより、ＰＶＸを基礎にした３′プロベクターコンストラクトｐＩＣＨ２２２５０（図１０Ｃ）に変換された。それは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で平滑化された、ｐＩＣＨ２１２８２（図１０Ｃ）の５７５ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩフラグメントと、Ｓａｌｌ部位で平滑化されたｐＩＣＨ２１９２０のＳａＩＩ−ＮｄｅＩフラグメントのリゲーションによって成し遂げられた。抗癌ｍａｂ軽鎖のコーディング配列を含有する７２３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＩＣＨ２２２５０（図１０Ｃ）にサブクローニングし、ｐＩＣＨ２２２４０（図１０Ｃ）を得た。
【００９１】
５′プロベクターｐＩＣＨ２１３８０（図１０Ｄ）は以下のように作製した：コンストラクトｐＩＣＨ１７３８８（図３Ｂ）を鋳型として使用し、プライマーｐｖ５ｐ５Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
【００９２】
【化５】
【００９３】
とｐｖ５ｐ５Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
【００９４】
【化６】
【００９５】
の補助によりフラグメントをＰＣＲ増幅し、Ｎｈｅ１およびＳａｃ１制限酵素により消化し、ｐＩＣＨ２０７８８の大きなＮｈｅ１‐Ｓａｃ１フラグメントとリゲーションし、ＰＶＸベクターの３′部位をイントロンおよびＡｔｔＰ組換え部位の５′末端と置換した。クローニングのスキームは図１０Ｄに示す。部位特異的組換えによりｉｎ ｐｌａｎｔａでウイルスベクターを集合させるために、５′プロベクターと３′プロベクターを使用するストラテジーは、以前に記載されたもののとおりであった（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）。
【００９６】
アグロインフィルトレーション手順
得られたすべてのコンストラクトは、標準エレクトロポレーションプロトコルを使用してアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換し、さらにニコチアナベンサミアーナ葉部のアグロインフィルトレーションに使用した。ＯＤ６００が１．８〜２．５の範囲の、一晩培養したアグロバクテリウム培養物の等しい容量を混合し、６０００ｇで３分間沈殿させた。ペレットは、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）および１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する溶液中に再懸濁し、それぞれ個々の培養物の１０-１希釈物を得た。針の無いシリンジを使用して、温室で６〜８週間育てたニコチアナベンサミアーナ植物体葉部にインフィルトレーションした。アグロインフィルトレーションのためのプロベクターを使用する場合、アグロバクテリウムミックスは通常５種の異なるアグロバクテリウム株を含み、それらのそれぞれが以下の構成要素の中の１種を提供する：レコンビナーゼ（インテグラーゼ）供与源（ｐＩＣＨ１０８８１）；５′ＰＶＸプロベクター（ｐＩＣＨ２１３８０）；１種のＩｇＧ鎖を提供する１種の３′ＰＶＸプロベクター（重鎖のためのｐＩＣＨ２２２５０または軽鎖のためのｐＩＣＨ２２２４０のいずれか、ＴＭＶプロベクターによってどの相補鎖が提供されるかに依存）、；５′ＴＭＶプロベクター（ｐＩＣＨ１７３８８）；１種の３′ＴＭＶプロベクター（軽鎖をコードするｐＩＣＨ２１９１０または重鎖をコードするｐＩＣＨ２１９２０）。
【００９７】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロット
アグロバクテリウムにインフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部の試料１００ｍｇは、３００μｌタンパク質抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）を含む液体窒素中ですりつぶした。葉の粗抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉのバッファー系を使用して１０％（非還元状態）または１２％（還元状態）ポリアクリルアミドゲルに溶解し、その後クーマシーブリリアントブルー染色を行った。ウェスタンブロット解析のために、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ由来のタンパク質は、ブロッテイングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）を使用して、電気泳動的にＨｙｂｏｎｄＰ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）に移した。膜はＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中５％スキムミルクで遮断し、それぞれ２．５％スキムミルク／ＴＢＳ １：１００００および１：５０００で希釈した、ヤギ抗‐ヒトラムダ軽鎖ＨＲＰ‐結合抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）またはヤギ抗‐ヒトガンマ鎖特異的ＨＲＰ‐結合抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）により精査した。結合した抗体はＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使用して検出した。電気泳動による分離およびウェスタンブロット解析の結果は図１１Ｂに示す。ＩｇＧ標準物との比較は植物組織におけるモノクローナル抗体の収率が新鮮な葉生物量１グラムにつき０．２〜０．３５ｍｇに達することを示した。
【００９８】
植物体由来組換えＭａｂの単離
全可溶性タンパク質は１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．０）を含有するバッファーにより、アグロ接種したニコチアナベンサミアーナ葉領域から抽出した。小規模な粗タンパク質抽出物からの抗癌Ｍａｂの分離は、取扱説明書に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）によるワンステップアフィニティー精製を使用して行った。精製した植物体由来Ｍａｂのクーマシー染色ゲルは図１１Ｂに示す（パネルＢ）
【００９９】
実施例６
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによる卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の発現
ウシＦＳＨのアルファ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７３９０１のコーディング配列１０１〜４６３に相当するヌクレオチド）およびベータ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４０６０のコーディング配列７０〜４５９に相当するヌクレオチド）ポリペプチドをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）は制限部位（ＦＳＨ‐アルファおよびベータサブユニットに対して５′Ｎｃｏ１−３′ＥｃｏＲ１）を隣に配置して合成し、ＴＭＶプロベクター（ｐＩＣＨ２０４３１、ｐＩＣＨ１１５９９の誘導体、図１０Ｂ）およびＰＶＸベクター（ｐＩＣＨ２１２４０）にクローニングし、ＩｇＧの重鎖および軽鎖のコーディング配列を置換して、それぞれサブユニットアルファおよびサブユニットベータをコードする配列を含有する２種のコンストラクト、ｐＩＣＨ−ＦＳＨＡおよびｐＩＣＨ−ＦＳＨＢを得た（図１２）。ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターから発現される２種の異なるサブユニットを提供するアグロバクテリウムの混合物を作製し、先に記載のようにＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、ヘテロダイマーＦＳＨの発現レベルは、市販のＦＳＨダイマー特異的（ＦＳＨ１１７）抗体を使用して接種１０日後にＥＬＩＳＡにより測定し、Ｔｒｏｐｉｘ化学ルミネセンスシステム（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により検出した。
【０１００】
実施例７
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによるＩｇＭの発現
ｐＩＣＨ１５９３３におけるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのコーディング配列はそれぞれＩｇＭ軽鎖およびＪ鎖をコードする配列によって置換し、コンストラクトｐＩＣＨ−ＭＬＣＪを得た（図１３）。ＩｇＭ重鎖をコードする配列はＰＶＸベクターにクローニングし（ｐＩＣＨ２１２４０）、ＩｇＧ重鎖のコーディング配列と置換し、コンストラクトｐＩＣＨ−ＭＨＣを得た（図１３）。ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターから発現される３種の異なるＩｇＭ鎖を提供するアグロバクテリウム混合物はＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、ヘテロオリゴマー複合体の発現レベルは、市販のＩｇＭ特異的抗体を使用して接種後１０日目にＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１０１】
欧州特許出願第０５００１８１９．１号および米国特許出願第６０／５９３，６０６号の内容は、その優先権を本特許出願によって主張し、本明細書にそのまま参照として援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】（Ａ）インフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部における２種の異なるＴＭＶを基礎にしたベクター由来のＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの発現分布パターンを示す。左の写真：上部左側の明るいスポットはｐＩＣＨ１７２７２にインフィルトレーションされた領域のＧＦＰ蛍光である。下部の弱く明るいスポットはベクターｐＩＣＨ１８５０５にインフィルトレーションされた領域の赤色蛍光である。左の写真の底部右側の明るいスポットは、ｐＩＣＨ１７２７２＋ｐＩＣＨ１８５０５にインフィルトレーションされた領域である。右側の写真は、２種の異なるベクターに同時インフィルトレーションされた葉部領域から分離されたプロトプラストを示す（上部：ＧＦＰ蛍光検出条件下におけるプロトプラスト；下部パネル：ＤｓＲｅｄ蛍光検出条件下における同じプロトプラスト）。
【図１Ｂ】（Ｂ）ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＲｄＲＰ ウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ‐ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；ＧＯＩ‐関心のある遺伝子。
【図１Ｃ】（Ｃ）ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図の図式表示である。
【図２】異なるサブゲノムプロモーター由来の２種の異なるトランスジーン（ＧＯＩ‐１およびＧＯＩ‐２）の同時発現用に設計されたウイルスベクターのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＲｄＲＰ ウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ−ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；３ＰＫ‐トリプルシュードノット（ｐｓｅｕｄｏ ｋｎｏｔ）領域；Ｕ５ｓｐｇ‐ＴＭＶ‐Ｕ５株のＣＰサブゲノムプロモーター。ＧＯＩ‐関心のある遺伝子。
【図３Ａ】（Ａ）コンストラクトｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１７１２３，ｐＩＣＨ１５９３３、ｐＩＣＨ７４１０、ｐＩＣＨ１０５８０、ｐＩＣＨ１０８８１およびｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。灰色の縦棒はイントロンを表す。
【図３Ｂ】（Ｂ）ｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１７１２３、ｐＩＣＨ１５９３３のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図を表す。
【図３Ｃ】（Ｃ）ｐＩＣＨ７４１０、ｐＩＣＨ１０５８０、ｐＩＣＨ１０８８１およびｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図を表す。
【図４】（Ａ）はＤＮＡ前駆体ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１５９３３をレコンビナーゼ供与源と一緒にアグロバクテリウム送達して６日後のＮ．ベンサミアーナ葉部領域の蛍光顕微鏡写真を示す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。
【図５】抗体の重鎖および軽鎖発現のための異なるベクター系のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。
【図６】ウイルスプロベクター系を使用した、ニコチアナベンサミアーナ葉部におけるＩｇＧ発現のウェスタンブロットを示す。ＴＳＰの電気泳動による分離は非還元条件下、１２％ゲル上で行った。発現したタンパク質の検出は、６ｘ１０３倍希釈した、ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）と結合したウサギ由来の抗‐ヒトＩｇＧ画分により行った。レーン：１‐非感染葉組織；レーン２‐サイトソルに発現したＩｇＧ重鎖（ｐＩＣＨ１７３８８）；レーン３‐ＩｇＧ重鎖および軽鎖、３５Ｓプロモーターコンストラクト（ｐＩＣ０１２３＋ｐＩＣＨ１９８４６）による同時発現；レーン４‐Ｐ１９（ｐＩＣＨ６６９２）を用いる以外は、レーン３と同様；レーン５‐３５ＳプロモーターコンストラクトおよびＰ１９（ｐＩＣＨ５２９０＋ｐＩＣＨ６６９２）により発現したＧＦＰ；レーン６‐バイシストロンコンストラクトｐＩＣＨ１９８６０により同時発現したＩｇＧ重鎖および軽鎖；レーン７‐バイシストロンコンストラクトｐＩＣＨ１９８６０（ＭＰ欠乏５′プロ‐ベクターｐＩＣＨ１７１２３、ＭＰ ｉｎ ｔｒａｎｓ ｐＩＣＨ１０７４５）により同時発現したＩｇＧ重鎖および軽鎖；レーン８‐サイトソルに同時発現したＧＦＰおよびｄｓＲＥＤ、ＭＰはｉｎ ｔｒａｎｓで提供される（ｐＩＣＨ１７１２３＋ｐＩＣＨ１９９１９＋ｐＩＣＨＩ１０７４５）。
【図７】同じ植物細胞において関心のある異なるタンパク質サブユニットの同時発現用に設計された非‐競合ウイルスベクターをコードするＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＴＭＶ ＲｄＲＰ タバコモザイクウイルスのＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＰＶＸ ＲｄＲＰ ジャガイモウイルスＸのウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ‐ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；ＧＯＩ‐関心のあるタンパク質サブユニットをコードする関心のある遺伝子。
【図８】バイナリーベクターｐＩＣ０１３０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図９】ＴＭＶ（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨＩ１０５８０）およびＰＶＸ（ｐＩＣ０１３０）を基礎にしたベクターを使用した、植物細胞におけるＧＦＰおよびｄｓＲＥＤの同時発現を示す：アグロバクテリウムを接種したＮ．ベンサミアーナ葉部から分離したプロトプラストにおけるＧＦＰおよびｄｓＲＥＤの視覚化。
【図１０Ａ】（Ａ）バイナリーベクターｐＩＣＨ１７６２０、ｐＩＣＨ２０４３１、ｐＩＣＨ２１２４０、ｐＩＣＨ２０４２１、およびｐＩＣＨ２１３７０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図１０Ｂ】（Ｂ）バイナリーベクターｐＩＣＨ１１５９９、ｐＩＣＨ２１９１０、およびｐＩＣＨ２１９２０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。
【図１０Ｃ】（Ｃ）バイナリーベクターｐＩＣＨ２１２８２、ｐＩＣＨ１０９９０、ｐＩＣＨ２２２５０、およびｐＩＣＨ２２２４０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。ＬｖおよびＬｃ‐軽鎖の可変および保存領域；ＨｖおよびＨｃ‐重鎖の可変および保存領域。
【図１０Ｄ】（Ｄ）ＰＶＸ‐由来プロベクターｐＩＣＨ２１３８０のクローニングスキームの図式表示である。
【図１１Ａ】（ａ）ＰＶＸおよびｃｒＴＭＶベクターを使用したＩｇＧ軽鎖および重鎖の同時発現レベル測定のためのＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。左側の組織培養プレートのウェルの番号付けは、ヒストグラムの棒の番号付けに相当する。ヒストグラムは４０５ｎｍにおけるウェルのＯＤを示す。１、２−非感染植物組織；３、４、５−ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐重鎖（それぞれｐＩＣＨ２１２４０‐１、５および１４クローン）；６、７、８‐ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧの軽鎖（ＬＣ）（Ｎ‐末端欠失、それぞれｐＩＣＨ２１３７０−１８、１９、３１）；９、１０、１１‐ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖（それぞれｐＩＣＨ２１３７０‐４０、４４、４５）；１２‐ブランクコントロール（植物タンパク質非適用）；１３、１４、１５‐ｃｒＴＭＶにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４３１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）（それぞれｐＩＣＨ２１２４０‐１、５および１４クローン）。１６、１７、１８‐ｃｒＴＭＶにおけるカルレティキュリン‐ＨＣ（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリン‐ＩｇＧのＬＣ（Ｎ‐末端欠失、それぞれｐＩＣＨ２１３７０−１８、１９、３１）。１９、２０、２１‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター中におけるカルレティキュリンＳＰ‐重鎖（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧＬＣ（それぞれｐＩＣＨ２１３７０−４０、４４、４５）。２２‐ＰＶＸにより発現したＧＦＰ（ｐＩＣ０１３０）；２３‐ＰＶＸにより発現したＧＦＰ（ｐＩＣＨ２０７９９）；２４‐ｃｒＴＭＶだけ（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４３１）から発現したカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖；２５‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）から発現したカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ重鎖；２６‐ＰＴＧＳサプレッサーＰ１９の存在下、強力な３５Ｓプロモーター制御下で同時発現したＩｇＧの軽鎖および重鎖２７‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨ１０８８１＝ｐＩＣＨ２０４２１）からのＩｇＧ軽鎖および重鎖同時発現；２８‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨ１０８８１＝ｐＩＣＨ２０４２１）、ｉｎ ｔｒａｎｓで提供されたＭＰ（ｐＩＣＨ１０７４５）からの軽鎖および重鎖の同時発現；＊‐測定可能な値をかなり超えたＯＤ４０５値。
【図１１Ｂ】（ｂ）Ｎ．ベンサミアーナ葉部に発現した抗癌抗体の電気泳動およびウェスタンブロット解析を示す。（Ａ）ＴＭＶとＰＶＸプロベクターが同時感染したニコチアナベンサミアーナ葉部における抗癌抗体の重鎖および軽鎖の蓄積。軽鎖はＰＶＸにより発現し、重鎖はＴＭＶにより発現する。タンパク質は還元条件下、１２％ポリアクリルアミドゲル中で分離する。上部パネルはクーマシー染色を示す；中間パネルはＨＲＰ‐結合ヤギ抗‐ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）によるウェスタンブロットを示す。下部パネルはＨＲＰ‐結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ラムダ鎖‐特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）によるウェスタンブロットを示す。Ｕｎｉｎｆ、非感染組織；２〜１１、接種後の日数；Ｓ、抗癌ｍａｂ（モノクローナル抗体）標準品；ＬＣ、ＴＭＶプロベクターだけにより発現した軽鎖（６ｄｐｉ）；ＨＣ、ＴＭＶプロベクターだけにより発現した重鎖（６ｄｐｉ）。（Ｂ）プロテインＡ磁気ビーズ（ＮＥＢ）を使用した抗癌ｍａｂの精製。（Ａ）クーマシー染色ゲル上、還元条件下、１２％ポリアクリルアミドゲル中で移動する植物‐由来（レーン１）および標準（レーン２）ｍａｂ。（Ｃ）ＨＣを発現するＴＭＶプロベクターおよびＬＣを発現するＰＶＸプロベクターに同時感染したニコチアナベンサミアーナ葉部における集合した抗癌ｍａｂの蓄積。タンパク質は非還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル中で分離する。ウェスタンブロットはヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体により同定した。Ｕｎｉｎｆ、非感染組織；２〜１１、接種後の日数；Ｓ、抗癌ｍａｂ（モノクローナル抗体）標準品；ＬＣ、ＴＭＶプロベクター（６ｄｐｉ）だけにより発現した軽鎖；ＨＣ、ＴＭＶプロベクター（６ｄｐｉ）だけにより発現した重鎖；Ｈ２Ｌ２：２つの重鎖および２つの軽鎖を含有するＩｇＧヘテロテトラマー、Ｈ２Ｌ‐２つの重鎖および１つの軽鎖を含有するＩｇＧヘテロトリマー、Ｈ２‐重鎖ホモダイマー、Ｌ２‐軽鎖ホモダイマー。
【図１２】バイナリーベクターｐＩＣＨ１７６２０、ｐＩＣＨ−ＦＳＨＡおよびｐＩＣＨ−ＦＳＨＢのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図１３】バイナリーベクターｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ−ＭＬＣＪおよびｐＩＣＨ−ＭＨＣのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【発明の開示】
【０００１】
発明が属する技術分野
本発明は、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを使用した、植物体、植物部分または植物細胞培養物におけるヘテロ‐オリゴマータンパク質の産生に関する。本発明に記載の方法およびベクターは、全長抗体、または別のタンパク質もしくはそれらのフラグメントとの融合物を含むそのヘテロ‐オリゴマー合成誘導体のような、高い収率の機能的ヘテロ‐オリゴマー組換えタンパク質を植物細胞に提供する。
【０００２】
発明の背景
植物を基礎にした分子農業は、好ましくは、潜在的に低い生産費用、および工業的生産方法から生み出される動物‐由来タンパク質を除去するためのバイオ医薬品産業による試みのゆえに、ヒトおよび動物の健康分野で使用される予定の組換えタンパク質の産生にとっての魅力的な好機である。なぜなら、これらの産物は牛海綿状脳症（ＢＳＥ）またはクロイツフェルト‐ヤコブ病（ＣＪＤ、ｖＣＪＤ）のようなヒト病原体により汚染されうるからである。しかし、植物細胞における高収率のヘテロオリゴマータンパク質の産生は、以下の理由から、強力な構成的または組織‐特異的プロモーターの使用に基づいた標準発現系の協力により解決することができない難問である：第１に、そのような組換えタンパク質の大多数は植物の成長および発達に対して有害な作用を有し、それゆえ収率を著しく低下させる；第２に組織‐特異的（たとえば、種子‐特異的）プロモーターの使用は、食用になる作物植物（たとえば、イネ、トウモロコシ、コムギ）のゲノムへの医薬タンパク質をコードする遺伝子の安定した組み込みを必要とし、それは露地栽培の場合、トランスジーン流動制御に関する問題を引き起こす可能性がある。また、これらの系は産物の低い収率のため、閉鎖環境（温室）で使用する場合、商業的に実行可能ではない。
【０００３】
植物ウイルスを基礎にした一過性の発現系（総説としては以下を参照されたい：Ｐｏｒｔａ ＆ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５，２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４０，８１−９４；Ｇｌｅｂａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，７，１８２−１８８）は、その技術が成長と産生ステージを分離させるため、植物葉組織における高発現レベルを提供することが可能であり、ある程度までは組換えタンパク質の細胞毒性、および植物発達に対するそれらの有害作用の難問に対処することができる。最も確立され、商業的に実行可能な系は、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター、好ましくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）‐由来ベクター（Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６２２−６２５；ＵＳ５３１６９３１；ＵＳ５５８９３６７；ＵＳ５８６６７８５；ＵＳ５９７７４３８；ＷＯ０２０８８３６９；ＷＯ０２０９７０８０；ＷＯ０２２９０６８；ＵＳ５４９１０７６）に基づく。しかし、これらの系は簡単で、比較的低分子のタンパク質の産生に使用が限定されるという深刻な制限を欠点として持つ。ウイルスベクターが１ｋｂより大きな異種配列を持っている場合、このことはある程度は、それらの不安定性および野生型への高頻度での逆戻りによって引き起こされる。また、技術の深刻な制約は、最も有益な群の組換えタンパク質を代表する治療用モノクローナル抗体およびそれらの誘導体のような、複雑なヘテロオリゴマータンパク質の発現が可能なウイルスベクター系が無いことである。
【０００４】
植物ウイルスベクターを使用した、植物における全長モノクローナル抗体の発現を扱った刊行物は１つしかない（Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２２０，６９−７５）。この論文は、全身葉部におけるモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖発現のための２種のＴＭＶを基礎にした全身ウイルスベクターを使用して、Ｎ．ベンサミアーナ植物体の同時感染時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された上記ベクターの転写物により、異なるベクターから異なる鎖が発現されることを説明する。しかし、上記の系における組換えタンパク質の収率は非常に低いため、集合したモノクローナル抗体の存在は、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡのような感度の高い試験によって確認しなければならない。組換え抗体は収率が非常に低いため、この系は実際の適用に適切ではなく、商業的価値を持たない。感染された植物体の同じ植物組織中には、２種以上のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターは通常存在しない（実施例１を参照されたい）ため、検出された抗原結合活性は、別々の細胞または組織に発現された抗体の重鎖および軽鎖からの分離手順中にｉｎ ｖｉｔｒｏで集合した抗体によるものである可能性がある。機能的抗体は変性し、弱めた抗体成分からｉｎ ｖｉｔｒｏで集められうることが以前に示された（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＆ Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１７，５６３３−５６４１；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，９５−１００）。しかし、そのようなアセンブリーに都合のよい条件が存在しない場合、そのようなアセンブリーの効率は非常に低い。
【０００５】
したがって、菌類または昆虫細胞発現系のような別の大規模発現系と市場で競い合うために十分な収率と効率の、植物における組換えヘテロオリゴマータンパク質の大規模発現系は存在しない。そのような植物発現はできる限り以下の基準を十分に満たさなければならない：
（ｉ）できるだけ多くの植物組織および上記組織の中のできるだけ多くの細胞における、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の発現を含む、高収率；
（ｉｉ）植物の成長に対する組換えタンパク質発現の有害な作用を妨げるための、関心のあるタンパク質または産物の発現は所望する植物の発達段階で開始できるように、一過性（またはスイッチ可能）でなければならない；
（ｉｉｉ）植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の異なるサブユニットをコードするポリタンパク質の最適比を提供し、そうして上記サブユニットからの組換えタンパク質アセンブリーのレベルにおいて組換えタンパク質の高収率を維持すること。
【０００６】
したがって、本発明の目的は植物体、植物部分、または植物細胞培養物における効率的なヘテロオリゴマータンパク質産生の方法を提供することである。別の目的は、ヘテロオリゴマータンパク質を発現することができる高収率植物発現系の提供である。本発明の別の目的は、同じ植物細胞中に１種より多い関心のあるポリペプチドを同時発現させる効率的な方法を提供することである。さらに、植物体、植物部分、または植物細胞培養物に抗体を発現させるための迅速で高収率の方法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
発明の一般的説明
本発明は、植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法を提供し、
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターであり；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードする、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供すること
により、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物組織に発現させることを含む。
【０００８】
一態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルスベクターであるという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが同じＲＮＡウイルスに由来しないという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが第１および第２タンパク質サブユニットをコードする配列部分以外の配列部分において異なるという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルス種に属するＲＮＡウイルスに由来するという点で、非競合的である。別の態様では、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、それらが異なるウイルス属に属するＲＮＡウイルスに由来するという点で、非競合的である。
【０００９】
本発明の別の態様は、抗体の重鎖および軽鎖のような、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を植物体、植物組織または植物細胞において産生する方法であって、
（ｉ）第１プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターまたは第２ウイルスベクターは、植物体における第１または第２ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠如し；または
（ｉｉ）少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、ウイルスベクターは全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするＯＲＦを欠如する
ことにより、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む。
【００１０】
本発明はさらに、植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法を提供し、方法は１種以上のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（複数のベクター）由来の少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、特許請求の範囲および以下の説明に記載される。
本発明の発明者らは驚くべくことに、植物ウイルスベクターを使用して植物に高収率でヘテロオリゴマータンパク質を産生する方法を確認している。植物におけるヘテロオリゴマータンパク質の効率的な産生には、同じ植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の異なるタンパク質サブユニットの高収率の産生を必要とする。このようにして、小胞体（ＥＲ）の天然のタンパク質集合能力のような、上記細胞のそのような能力を使用して、上記の少なくとも２種のタンパク質サブユニットを発現している細胞にヘテロオリゴマータンパク質を効率的に集めることができる。したがって上記のヘテロオリゴマータンパク質の非効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアセンブリーは必要でない。本発明はステップ（ｉ）により、またはステップ（ｉｉ）により、またはステップ（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせにより同じ細胞に２種以上のタンパク質の効率的な同時発現を初めて成し遂げている。
【００１２】
第１タンパク質サブユニットは第１異種（核酸）配列によってＲＮＡウイルスベクターにコードされる。第２タンパク質サブユニットは第２異種（核酸）配列によってウイルスベクターにコードされる。これらの異種配列はしたがってウイルスベクター（複数のウイルスベクター）のＲＮＡ配列であり、典型的にはタンパク質サブユニットを発現するために必要な調節配列を含有するか、またはコードする。そのような調節配列の例としては、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、および３′‐非翻訳配列が挙げられる。本明細書では、ある配列がウイルスベクター（複数のウイルスベクター）が由来するウイルスに天然に存在しない場合、その配列は異種配列である。
【００１３】
本発明に従って産生可能なヘテロオリゴマータンパク質は、少なくとも第１および第２サブユニットを有し、第１および第２サブユニットは異なるポリペプチド配列を有する。したがって、第１および第２サブユニットは典型的には異なる異種核酸配列から発現されなければならない。オリゴマータンパク質のサブユニットは会合して４次構造のオリゴマータンパク質を形成する。サブユニットのアセンブリーは典型的にはサブユニット間の非共有結合を包含する。さらに、共有結合、たとえばジスルフィド結合がタンパク質サブユニット間で形成されてもよい。
【００１４】
一態様では、ヘテロオリゴマータンパク質はヘテロ‐二量体タンパク質、すなわち２種の異なるタンパク質サブユニットを有するタンパク質である。別の態様では、ヘテロオリゴマータンパク質は２種より多い異なるサブユニット、たとえば３種または４種の異なるサブユニット（それぞれヘテロトリマーまたはヘテロテトラマータンパク質）を有していてもよい。別の態様では、のヘテロオリゴマータンパク質は２種の異なるサブユニットを有していてもよく、サブユニットの中の１方または両方がヘテロオリゴマータンパク質中に、１回より多く存在してもよい。ヘテロオリゴマータンパク質のサブユニット構成の例としては、ＡａＢｂ、ＡａＢｂＣｃ、ＡａＢｂＣｃＤｄが挙げられ、ここでＡは第１タンパク質サブユニットを表し、Ｂは第２タンパク質サブユニットを表し、そしてＣおよびＤは別のタンパク質サブユニットを表す。それぞれの大文字Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは他のタンパク質サブユニットとは異なるタンパク質サブユニットを表し、そして小文字は少なくとも１の整数を表し、ヘテロオリゴマータンパク質中の個々のタンパク質サブユニットのコピー数を示す。Ａ２Ｂ２のサブユニット構成を有するＩｇＧ抗体が例として挙げられ、ここでＡは第１タンパク質サブユニット（たとえば重鎖）を表し、そしてＢは第２タンパク質サブユニット（たとえば軽鎖）を表す。好ましくは、本発明に従って産生されたヘテロオリゴマータンパク質は２種または３種の異なるタンパク質サブユニットを有し、より好ましくは、それは２種の異なるタンパク質サブユニットを有する。
【００１５】
本発明の方法では、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットは植物体、植物組織、または植物細胞の細胞中に、ステップ（ｉ）または／およびステップ（ｉｉ）によって発現される。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれは、同じ細胞中に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させ、その結果ヘテロオリゴマータンパク質を細胞中に効率的に産生することができる。ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、とりわけ３種、４種、またはそれより多い異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質産生のために並行して行うことができる（実施例７を参照されたい）。
【００１６】
本発明のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（複数のウイルスベクター）はまた、本明細書では単に「ウイルスベクター」として表される。典型的には、プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターはプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルスに由来する。
【００１７】
ステップ（ｉｉ）では、植物体、植物組織または植物細胞は、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供される。少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするウイルスベクターは、インサートとして第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、その発現は第１サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい。さらに、ウイルスベクターはインサートとして、第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、その発現は第２サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい。第１および第２タンパク質サブユニットの両方がサブゲノムプロモーターの制御下で発現される場合、これらのサブゲノムプロモーターは、好ましくは、植物細胞に望ましくない組換え事象を導くウイルスベクター中の自己相同性を回避するために配列が異なる。そのような異なるサブゲノムプロモーターは異なる株または種の植物ウイルスから採取されてもよく、たとえば１種のサブゲノムプロモーターはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１のコートタンパク質（ＣＰ）サブゲノムプロモーターであってもよく（またはそれに由来してもよく）、そして別のサブゲノムプロモーターは、ＴＭＶ Ｕ５のＣＰサブゲノムプロモーターであってもよく（またはそれに由来してもよく）、またはアブラナ科植物‐感染トバモウイルス（ｃｒ‐ＴＭＶ）に由来してもよい。
【００１８】
第１または第２サブゲノムプロモーターのかわりに、第１または第２タンパク質サブユニットの翻訳がＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）エレメントの制御下にあってもよい。第１および第２タンパク質サブユニット両方の翻訳がＩＲＥＳエレメントの制御下にあってもよいが、少なくともタンパク質サブユニットの１種はサブゲノムプロモーターを使用して発現される。本発明で使用されるＩＲＥＳエレメントはｃｒ‐ＴＭＶのような植物ウイルスまたは他の植物ウイルスから採取されてもよい（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００２，９９，５３０１−６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９，２６３，１３９−５４；ＷＯ０３０２０９２７；ＷＯ０２２９０６８）。
【００１９】
ステップ（ｉｉ）のウイルスベクターは、好ましくは植物体または植物組織において全身移行をする能力がない。このことは、たとえばウイルス粒子アセンブリーの機能的起点を削除することにより成し遂げることができる。トバモウイルスではたとえば、ウイルス粒子アセンブリーの起点はＭＰ ＯＲＦに位置する。したがって、ウイルス粒子アセンブリーの起点はウイルスベクターからＭＰ ＯＲＦを完全に、または部分的に欠失することによって削除することができる。ウイルスベクターはしたがって、好ましくは機能的移行タンパク質（ＭＰ）ＯＲＦを持たない。より好ましくは、ウイルスベクターは、ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質を持たない。この態様では、ウイルスベクターは機能的コートタンパク質ＯＲＦを持たなくてもよく、そして最も好ましくは、ウイルスベクターは機能的移行タンパク質ＯＲＦおよび機能的コートタンパク質ＯＲＦの両方を持たない。ウイルスベクターからＭＰ ＯＲＦおよび／またはＣＰ ＯＲＦを除去することは、ウイルスベクター安定性を低下させずに、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするためのより多くの余地を提供する。この態様では、ウイルスベクターは好ましくは、多くの細胞の感染を成し遂げるために、植物体または植物組織の多くの細胞に提供される。このことはアグロバクテリウムを使用して、Ｔ−ＤＮＡのようなＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を提供することにより最も都合よく成し遂げられてもよい（以下を参照されたい）。
【００２０】
ステップ（ｉｉ）のウイルスベクターが由来するウイルスはいずれかのプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルス、たとえば「詳細な説明」の章で挙げられたものであってもよい。好ましいウイルス群はトバモウイルス、ポテクスウイルス、およびポティウイルスである。最も好ましいウイルスはＴＭＶおよびＰＶＸである。ウイルスベクターは少なくともそれが由来するウイルス由来の、ウイルスベクターの複製に必要なタンパク質をコードするＯＲＦを含有することになる。ウイルスベクターは典型的にはさらに、ウイルス複製のための調節エレメント、および少なくとも１種のサブゲノムプロモーターを含有する。
【００２１】
ステップ（ｉ）では、植物体、植物組織または植物細胞は、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを備える。第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードする。
【００２２】
ステップ（ｉ）は２種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質の産生を可能にする。ステップ（ｉ）はその上、２種より多い異なるサブユニット、たとえば３種または４種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質の産生を可能にする。この場合、植物体、植物組織または植物細胞は、それぞれが上記の異なるタンパク質サブユニットの１種をコードする、第１、第２および第３ウイルスベクターを（そして場合により別のウイルスベクターを）備えてよい。３種または４種の異なるタンパク質サブユニットをステップ（ｉ）で発現しなければならない場合、個々の３種または４種のウイルスベクターは好ましくは、すべてお互いに非競合ウイルスベクターである。３種のウイルスベクターの場合、第１ウイルスベクターはトバモウイルスに由来してもよく、第２ウイルスベクターはポティウイルスに由来してもよく、そして第３ウイルスベクターはポテクスウイルスに由来してもよい。
【００２３】
２種のウイルスベクターは、同じ植物組織中でそれらがコードするタンパク質サブユニットを効率的に発現（同時発現）できる場合、非競合的である。同時発現は少なくとも２種の異なるウイルスベクターがコードする異種配列の実質的な量を発現する前は、それらは複製中にお互いに競合しないことを必要とする。上記の少なくとも２種のウイルスベクターのＲＮＡレベルの配列の違いが大きいほど、それらは同じ植物細胞においていっそう非競合的である。第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターであるため、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは非競合ウイルスベクターである。
【００２４】
非競合的である場合、ある一般的な態様では、第１および第２ウイルスベクター（上記の２種の非競合ウイルスベクター）は、少なくともタンパク質サブユニットをコードする上記の異種配列以外の配列部分において異なる。好ましくは、上記の異種配列以外の配列部分におけるそのような違いは植物ＲＮＡウイルスに由来する配列部分であり、そのような配列部分は、ウイルス機能、たとえば植物細胞におけるウイルス複製（たとえばレプリカーゼをコードする配列）、ウイルスタンパク質の翻訳（たとえばサブゲノムプロモーター）またはウイルスの細胞間もしくは長距離移行に関与する配列部分である。
【００２５】
非競合的である場合、別の一般的な態様では、第１および第２ウイルスベクター（上記の２種の非競合ウイルスベクター）は異なる植物ウイルスに由来する。この態様の一例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス株のウイルスに由来しない。別の例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス種のウイルスに由来しない。付加的な例では、上記の少なくとも２種の非競合ウイルスベクターは同じウイルス属のウイルスに由来しない。したがって、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは好ましくは異なる株のウイルス、より好ましくは異なる種のウイルス、最も好ましくは異なる属のウイルスに由来する。
【００２６】
第１ウイルスベクターはポテクスウイルス属に属するウイルスに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはポティウイルス属に属するウイルスに由来してもよい。とりわけ、第１ウイルスベクターはジャガイモウイルスＸに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはジャガイモウイルスＹに由来してもよい。
【００２７】
ポティウイルスベクターの場合、タンパク質サブユニットはウイルスポリタンパク質との融合物として発現してもよく、それによって本発明のタンパク質サブユニットはポティウイルスプロテアーゼ認識部位によりポリタンパク質から分離することができる。
【００２８】
別の態様では、第１ウイルスベクターはポテクスウイルス属に属するウイルスに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはトバモウイルス属に属するウイルスに由来してもよい。とりわけ、第１ウイルスベクターはジャガイモウイルスＸに由来してもよく、そして第２ウイルスベクターはタバコモザイクウイルスに由来してもよい。
【００２９】
「ウイルスに由来している」とは、ウイルスの遺伝エレメントまたは配列部分をそのウイルスに由来するウイルスベクターが含有することを意味する。一態様では、ウイルスベクター（複数のウイルスベクター）はＲＮＡウイルスから採取したレプリカーゼＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含有する。別の態様では、ウイルスベクターはＲＮＡウイルス由来の移行タンパク質ＯＲＦ、そして場合によりさらにレプリカーゼＯＲＦを含有する。ＲＮＡウイルスから採取したウイルス遺伝エレメントは、所望する場合、たとえばウイルスベクターのクローニングに必要な制限部位を導入するために変異してもよい。
【００３０】
第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターが共にタバコモザイクウイルスＴＭＶ３０Ｂに基づいている態様は、本発明の方法のステップ（ｉ）から排除される。なぜなら、この場合、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターではなく、同じウイルスベクターであるからである（参照：Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２０（１９９８）６９−７５）。
【００３１】
第１および第２ウイルスベクターは、好ましくは多くても９０％、より好ましくは多くても８０％、さらにより好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％のＲＮＡレベルの配列相同性を有する。さらにとりわけ、第１ウイルスベクターの任意の１００塩基の配列部分が好ましくは、第２ウイルスベクターの任意の１００塩基の配列部分に多くても９０％、好ましくは多くても８０％、より好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％の配列相同性を有する。
【００３２】
一態様では、第１ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦ（またはレプリカーゼが１種以上のＯＲＦによってコードされる場合、複数のＯＲＦ）と第２ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦ（またはレプリカーゼが１種以上のＯＲＦによってコードされる場合、複数のＯＲＦ）は、多くても９０％、より好ましくは多くても８０％、さらにより好ましくは多くても７０％、そして最も好ましくは多くても６０％の相同性を有する。別の態様では、第１ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦと第２ウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦは多くても８５％、より好ましくは多くても７５％、さらにより好ましくは多くても６５％、そして最も好ましくは多くても５５％の同一性を有する。
【００３３】
ステップ（ｉ）では、第１ウイルスベクターは好ましくは、発現が第１サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有する。第２ウイルスベクターは、発現が第２サブゲノムプロモーターの制御下にあってもよい第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有する。サブゲノムプロモーターの１種または両方はＩＲＥＳエレメントによって置換されてもよい。先に記載のステップ（ｉｉ）の場合と同様に、第１および第２タンパク質サブユニットがサブゲノムプロモーターの制御下で発現される場合、植物細胞に望ましくない組換え事象を引き起こすことになる第１および第２（およびいずれか別のウイルスベクター）ウイルスベクター間の相同性を回避するために、これらのサブゲノムプロモーターは好ましくは配列が異なる。そのような異なるサブゲノムプロモーターは異なる株または種の植物ウイルスから採取されてもよく、たとえば１種のサブゲノムプロモーターはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１のコートタンパク質（ＣＰ）サブゲノムプロモーターであってもよく、そして別のサブゲノムプロモーターはＴＭＶ Ｕ５またはアブラナ科植物‐感染トバモウイルス（ｃｒ‐ＴＭＶ）のＣＰサブゲノムプロモーターであってもよい。
【００３４】
細胞間、もしくは長距離移行に必要な植物ウイルスのＯＲＦは本発明のウイルスベクター構築時に削除されてもよいため、上記の非競合ウイルスベクターの関連性はウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦを比較することにより確認してもよい。
【００３５】
第１および第２タンパク質サブユニットをコードする第１および第２異種配列は、それぞれウイルスベクターに付加的な配列として添加されてもよい。異種配列は好ましくは高レベルの発現が成し遂げられるように添加される。この目的のために、異種配列はウイルスの３′末端に添加される。なぜなら３′ＯＲＦはしばしば多くのウイルスで最も高レベルで発現されるＯＲＦであるからである。好ましくは、しかし、異種配列は、ウイルスに生来ある配列、たとえばトバモウイルスのような多くのウイルスにおいてＣＰ ＯＲＦであるウイルスの天然の３′ＯＲＦと入れ替わる。したがって、第１および／または第２ウイルスベクターは好ましくはウイルスベクターの全身移行のためのＯＲＦを欠如する。ウイルスベクターはさらに、トバモウイルスのＭＰ ＯＲＦのような細胞間移行のためのＯＲＦを欠いてもよい。
【００３６】
本発明では、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）は、とりわけヘテロオリゴマータンパク質の３種以上の異なるサブユニットを発現するために組み合わせてもよい。４種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質が産生されることになる場合、２種のタンパク質サブユニットがステップ（ｉ）に従って発現されてもよく、そして２種の付加的なタンパク質サブユニットがステップ（ｉｉ）に従って、植物体または植物組織の細胞中に産生されてもよい。しかし、好ましくは２種のタンパク質サブユニットが第１ウイルスベクターから発現されてもよく、そして２種のタンパク質サブユニットが第１ウイルスベクターに非競合的な第２ウイルスベクターから発現されてもよい。３種の異なるタンパク質サブユニットを有するヘテロオリゴマータンパク質が産生されることになる場合、上記の３種のタンパク質サブユニットは、ステップ（ｉ）に従って、ステップ（ｉｉ）に関する記載と同様に第１ウイルスベクターから２種のタンパク質を発現し、そして非競合ウイルスベクターから第３のタンパク質サブユニットを発現することにより、発現されてもよい。
【００３７】
本発明のウイルスベクターは、典型的にはＤＮＡレベルで工学的に操作される。ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターのように植物体の細胞または植物組織の細胞に提供される場合、上記ＤＮＡは、たとえばＴ７ポリメラーゼのようなバクテリオファージポリメラーゼを適切なプロモーターと一緒に使用することにより、ＲＮＡウイルスベクターにｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されてもよい。２種の異なるウイルスベクターは好ましくは、植物体の細胞が両方のウイルスベクターを備えることを確実にするために、混合物として植物体に提供される。好ましくは、しかし、植物体または植物組織をＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体により形質転換することにより、本発明のウイルスベクターが植物体の細胞または植物組織の細胞に提供される。ＤＮＡ前駆体は、植物体の細胞中で、ＤＮＡ前駆体の転写によってウイルスベクターを形成することに対して活性な転写プロモーターを有する。最も好ましくは、ＤＮＡ前駆体はアグロバクテリウムＴｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡである。２種以上のウイルスベクターはその後、植物体をそれぞれの株が特定のウイルスベクターをコードするＴ−ＤＮＡを含有する２種以上のアグロバクテリウム株の混合物（たとえば、懸濁液）で処理することにより植物体または植物組織に提供されてもよい。そのようなアグロバクテリウム懸濁液で植物体の実質的な部分を処置することが、天然の植物ウイルスの全身移行機能および／または細胞間移行機能の代わりとなってもよい。
【００３８】
アグロバクテリウム法を用いたウイルスベクターのＤＮＡ前駆体による植物体、植物組織または植物細胞の一過性トランスフェクションは、本発明において最も好ましい。しかし、ウイルスベクターのＤＮＡ前駆体が植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれてもよい。染色体ＤＮＡからのウイルスベクター（複数のウイルスベクター）の放出は誘導型プロモーターによって制御されてもよい。
【００３９】
ウイルスベクターがＤＮＡ前駆体から植物体に提供される場合、それらが転写される細胞核から、ウイルスベクターが複製する細胞質へのウイルスベクターの移動効率を改善するための処置がとられることが好ましい。このことは、ＷＯ２００５／７１０９０として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０５／０００４９２（これを参照として本明細書に援用する）に詳細に記載されるように、ＤＮＡ前駆体、とりわけウイルスベクターのレプリカーゼＯＲＦにイントロンを包含することにより成し遂げられてもよい。
【００４０】
本発明の方法は、植物ウイルス発現系が存在するか、または将来作り出されることになるいずれかの植物に適用してもよい。植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。双子葉植物の中では、ナス科、アブラナ科、アカザ科、およびマメ科が好ましい。ナス科の中では、Ｎ．タバカムまたはＮ．ベンサミアーナのようなニコチアナ属が好ましい。別の好ましい植物はメディカゴサティバおよびフダンソウのようなフダンソウ種である。
【００４１】
本発明の方法は植物系においてヘテロオリゴマータンパク質を産生するために使用される。好ましいヘテロオリゴマータンパク質は以下のクラスのイムノグロブリン：イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、イムノグロブリンＤ、およびイムノグロブリンＥのようなイムノグロブリンである。これらのイムノグロブリンは少なくとも抗原結合ドメインの一部を含有してもよい。本発明に従って産生されるこれらのイムノグロブリンが少なくとも２種の異なるタンパク質サブユニットを含有するならば、必要に応じて、それらのイムノグロブリンは、生来の動物イムノグロブリンに関連して改変されてもよい。イムノグロブリンはイムノグロブリン重鎖と一緒に保護タンパク質を含有してもよく、ここで保護タンパク質はポリイムノグロブリン受容体の一部を含有する。別の好ましいヘテロオリゴマータンパク質はインスリンである。
【００４２】
本発明のヘテロオリゴマータンパク質は、必要に応じて生来のタンパク質に関連して多くの異なる方法で改変されてもよい。ヘテロオリゴマータンパク質では、生来のヘテロオリゴマータンパク質の１種以上のタンパク質サブユニットの分泌シグナルを形成する生来のリーダー配列が植物‐特異的シグナルペプチドに置換されてもよい。上記の植物‐特異的シグナルペプチドはタバコカルレティキュリンおよび／またはイネアルファ‐アミラーゼに由来してもよい。ヘテロオリゴマータンパク質の少なくとも１種または少なくとも２種以上のサブユニットが植物細胞においてサブユニット由来のヘテロオリゴマータンパク質のアセンブリーを改善するための小胞体保持シグナルＫＤＥＬを含有していてもよい。さらに、タンパク質サブユニットをコードする異種配列が変異してヘテロオリゴマータンパク質からグリコシル化部位を部分的に、または完全に除去してもよい。その上、発現されることになるヘテロオリゴマータンパク質のグリコシル化パターンが、たとえば１種以上のグリコシルトランスフェラーゼのような、植物グリコシル化装置の構成要素を工学的に操作することによって変えられてもよい。
【００４３】
本発明のヘテロオリゴマータンパク質は一般に公知の手順に従って発現後に植物体、植物組織または植物細胞から分離されてもよい。上記のヘテロオリゴマータンパク質はその後実質的に均質に精製されてもよく、そのような状態はクーマシー染色したＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上のヘテロオリゴマータンパク質に起因するバンドが、慣用のゲルリーダーにより測定したレーンの染色の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％を占めると定義されてよい。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明に記載のウイルスベクターは、上記のヘテロオリゴマータンパク質を形成するために必要なすべてのタンパク質サブユニットを単一のベクターがコードするウイルスベクター、または上記の少なくとも２種のウイルスベクターのそれぞれが、上記のヘテロオリゴマータンパク質を形成するために必要な異なるタンパク質サブユニットをコードする、少なくとも２種の異なる非競合ウイルスベクターのいずれかである。上記の非競合ウイルスベクターのそれぞれは、組換えヘテロオリゴマータンパク質の１種より多いサブユニットをコードする１種より多い異種核酸配列を発現することができる。上記のＲＮＡウイルスベクターは植物細胞に一過性に送達されてもよく、あるいはＤＮＡ前駆体（複数の前駆体）として植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれてもよい。
【００４５】
本発明は植物細胞における高収率のヘテロオリゴマータンパク質産生のための方法を提供する。この方法は、たとえば発現されることになる異種配列のサイズ制限、上記ベクターの高い不安定性および同じ植物細胞に異なる核酸配列を同時発現できないこと、のような既存のウイルスベクターを基礎にした発現系の制限を克服する。さらに、系からのウイルスコートタンパク質の除去が感染性ウイルス粒子の形成および野生型ウイルスへの逆戻りを妨げるため、上記方法はよりすぐれた生物学的安全性を提供する。本発明を実施することにより、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の高収率発現系の設計が実質的に任意の植物ＲＮＡウイルス‐由来レプリコンにとって可能であり、レプリコンは、関心のあるヘテロオリゴマータンパク質の異なるサブユニットをコードする、少なくとも２種の関心のある異種配列を発現可能にするためのレプリコンの改変によって、関心のある異種配列の発現に適切になる。あるいは、同じ植物細胞においてウイルスベクターと一緒に同時複製することができる別の非競合ウイルスベクターを見いだすことも可能である。
【００４６】
異なる分類学的群に属するプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルス（本明細書では、簡潔に「ＲＮＡウイルス」とも表す）は、本発明のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター（本明細書では、簡潔に「ウイルスベクター」とも表す）を構築するためにふさわしい。本明細書では、ウイルスベクターは植物細胞において複製する：すなわち鋳型としてＲＮＡウイルスベクターを使用して、ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡ重合により別のＲＮＡベクター分子を形成することができるＲＮＡベクターである。好ましくは、本発明のウイルスベクターはＲＮＡウイルス機能を有する、少なくとも１種のウイルス配列エレメント、たとえば、レプリカーゼ、サブゲノムプロモーター、ウイルス粒子アセンブリーの起点、コートタンパク質ＯＲＦ、または移行タンパク質ＯＲＦを含有する。さらに、ウイルスベクターはＲＮＡウイルスＩＲＥＳエレメントを有していてもよい。
【００４７】
ウイルスベクターは、たとえばウイルスに制限部位を導入することにより、それが由来するウイルスから構築してもよく、制限部位は本発明の異種配列を導入するためにふさわしいクローニング部位を表す。当業者は、ＲＮＡウイルスまたはベクターに対する核酸の工学的操作は一般に、それぞれ上記のＲＮＡウイルスまたはベクターのＤＮＡコピーを使用して、ＤＮＡレベルで行われることを理解することになる。したがって、ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡコピーは、ＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーに制限部位を導入することにより、それが由来するＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーから構築することができ、制限部位はＤＮＡレベルで本発明の異種配列のＤＮＡコピーを導入するためにふさわしいクローニング部位を表す、と述べることがより正確である。これらの事柄は当業者には明白であり、一般に本明細書では強調されない。
【００４８】
ＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーがクローニングにふさわしい制限部位（複数の制限部位）を天然に有する場合、ウイルス自体がウイルスベクターであってもよい。本明細書では、「ウイルスベクター」という用語は、異種配列がベクターに存在しない事例か、または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列がベクター中に全く存在しない事例を表す。異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列がウイルスベクターに挿入される事例は、そのようなインサートの存在を明白に特定することにより確認される。
【００４９】
本明細書では、異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列が導入される以前は２種のウイルスベクターの配列が異なる場合、そのようなウイルスベクターは異なると表す。異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列が導入される前は２種のウイルスベクターの配列が同じ配列を有する場合、それらは同じであると表す。したがって、２種のウイルスベクターが異なるか、または同じであるかどうかを確認する場合、異種配列または本発明のタンパク質サブユニットをコードする配列は考慮にいれない。
【００５０】
本明細書では、「レプリコン」または「ウイルスレプリコン」という用語は「ウイルスベクター」と同じ意味を有する。
本発明のウイルスベクターを工学的に操作するために使用可能なＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。（イタリック体ではない）引用符に囲まれた分類名は、この分類がＩＣＴＶにより国際的に認可された名称を持たないことを示す。種の名称（通称）は通常の活字体で示す。属または科への正式な帰属のないウイルスが示される。
【００５１】
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：
科：ブロモウイルス科、
属：アルファモウイルス、基準種：アルファルファモザイクウイルス、
属：イラルウイルス、基準種：タバコ条斑ウイルス、
属：ブロモウイルス、基準種：ブロモモザイクウイルス、
属：ククモウイルス、基準種：キュウリモザイクウイルス、
科：クロステロウイルス科、
属：クロステロウイルス、基準種：ビート萎黄ウイルス、
属：クリニウイルス、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、
科：コモウイルス科、
属：コモウイルス、基準種：カウピーモザイクウイルス
属：ファバウイルス、基準種：ソラマメウィルトウイルス１，
属：ネポウイルス、基準種：タバコ輪点ウイルス；科：ポティウイルス科、
属：ポティウイルス、基準種：ジャガイモウイルスＹ、プラムポックスウイルス；タバコエッチウイルス；クローバー葉脈黄化ウイルス；タバコベインモットリングウイルス；
属：リモウイルス、基準種：ライグラスモザイクウイルス
属：ビモウイルス、基準種：オオムギ縞萎縮モザイクウイルス；
科：セキウイルス科、
属：セキウイルス、基準種：パースニップイエローフレックウイルス、
属：ワイカウイルス、基準種：ライスツングロスフェリカルウイルス；
科：トムブスウイルス
属：カルモウイルス、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、
属：ディアンソウイルス、基準種：カーネーションリングスポットウイルス、
属：マクロモウイルス、基準種：メイズクロロティックモットルウイルス、
属：トムブスウイルス、基準種：トマトブッシースタントウイルス、
帰属されていないｓｓＲＮＡウイルスの属、
属：カピロウイルス、基準種：リンゴステムグルービングウイルス；
属：カルラウイルス、基準種：カーネーション潜在ウイルス；
属：エナモウイルス、基準種：ピーエネーションモザイクウイルス、
属：フロウイルス、基準種：ムギ類萎縮ウイルス、
属：ホルディウイルス、基準種：ムギ斑葉モザイクウイルス、
属：イダエオウイルス、基準種：ラズベリーブッシードワルフウイルス；
属：ルテオウイルス、基準種：オオムギ黄萎ウイルス、
属：マラフィウイルス、基準種：マイズラヤドフィノウイルス；
属：ポテクスウイルス、基準種：ジャガイモウイルスＸ；
属：ソベモウイルス、基準種：インゲンマメ南部モザイクウイルス、
属：テヌイウイルス、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス、基準種：タバコ茎えそウイルス、
属：トリコウイルス、基準種：リンゴクロロティックリーフスポットウイルス；
属：ティモウイルス、基準種：ターニップイエローモザイクウイルス；
属：ウムブラウイルス、基準種：キャロットモットルウイルス；
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：シトラブドウイルス、基準種：レタスネクロティックイエローズウイルス、
属：ヌクレオラブドロウイルス、基準種：ポテトイエロードワーフウイルス。
【００５２】
ＲＮＡウイルスベクターは、関心のある遺伝子の発現を提供する異種ＲＮＡの極めて多数のコピーを植物細胞に提供することができる。しかし、そのようなベクターは、異種核酸配列のサイズがある範囲、通常１ｋｂを越えて増大すると、極めて不安定になることが公知である。そのような制約のために、そのようなベクター系の適用は、今まで比較的単純な小〜中程度のサイズのタンパク質に限定されてきた。高分子または複雑なヘテロオリゴマータンパク質のいずれかを発現させる試みは首尾よい結果を導いてこなかった。我々は、驚くべきことに、以前には不可能であった複雑なヘテロオリゴマータンパク質の高収率発現のためにウイルスベクターを首尾よく採用できることを見いだしている。全長モノクローナル抗体を発現させる初期の試み（Ｖｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２２０，６９−７５）は、同じ細胞における関心のあるタンパク質の同時発現のために使用されるウイルスベクターの不適合性のために、満足すべき結果を提供しなかった。実施例１で、我々は、単一細胞レベルで、同じ植物ＲＮＡウイルス（ＴＭＶ）由来のウイルスレプリコンから２種の異なる遺伝子（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の効率的な同時発現が不可能であることを証明している。図１（Ａ‐右パネル）では、レポーター遺伝子‐ＤｓＲｅｄおよびＧＦＰの両方の発現を示すプロトプラストを検出できなかった。右下部パネルの一部のプロトプラストにおけるＤｓＲｅｄの弱い発現パターンは、強いＧＦＰ発現（右上部パネル）と一致し、そしてＤｓＲｅｄ検出に使用されたフィルターの漏出による偽‐陽性の結果である。この漏出は高濃度のＧＦＰを含有するプロトプラストの見かけの弱いＤｓＲｅｄ蛍光を導く。したがって、同一であるか、または広範な相同性領域を共有するＲＮＡレプリコンが異なる組換えタンパク質をコードする異なる異種核酸配列をたとえ持っていても、それらは１つの植物細胞に共存できない。この現象の理由は、今のところ解っていない。可能性のある説明として、１種のウイルスレプリコンのコピー数の急激な増加が、別のウイルスレプリコンを速やかに撃退することが考えられる。選択された細胞において２番目に複製を開始するレプリコンは、第１のレプリコンに追いつくことができず、したがって第１レプリコンを確認する事象は主に統計的特徴を有する。
【００５３】
この問題に取り組むための我々の研究では、２種の異なるサブゲノムプロモーターの制御下で、異なるタンパク質をコードする２種の異なる異種核酸配列が上記のレプリコン中に存在するように、ウイルスレプリコンを工学的に操作してきた。そのようなＲＮＡレプリコンをコードするＴ−ＤＮＡ領域の一般的スキームは図２に示す。そのようなベクターの設計および最適化のために、我々は、便宜上、我々の初期の特許出願に記載のプロベクター法を使用してきた（ＷＯ０２０８８３６９；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７も参照されたい）。この方法は、部位特異的組換えにより、事前に作製されたモジュールに由来する最終ベクターのｉｎ ｐｌａｎｔａでの集合を可能にし、そうしてベクター設計およびベクター最適化を著しくスピードアップさせる。コンストラクトの設計は実施例２に記載し、図式表示は図３に示す。
【００５４】
我々は驚くべきことに、最終レプリコンにおけるインサートの大きなサイズ、および２種の強いサブゲノムプロモーターの存在によるベクターの複雑な構造にもかかわらず、得られたＲＮＡレプリコンは、ｉｎ ｐｌａｎｔａでの高い安定性および同じ植物細胞における２種の異なる組換えタンパク質（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の同時発現を提供する能力を示すことを見いだしている。図４に示すように、同時発現頻度は感染した範囲ではすべての細胞のほとんど１００％にまで到達可能である。そのようなコンストラクト中におけるレポーター遺伝子（ＧＦＰとＤｓＲｅｄ）と、たとえばＩｇＧの軽鎖および重鎖の置換、その上のインフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部における発現は驚くべき結果を生み出した。実施例３で記載するように、ウェスタンブロット解析は見事なほどの高濃度の集合したモノクローナル抗体（レーン６および７；図６）を明らかにした。我々の系によって提供される集合したモノクローナル抗体の収率は、現在の当該技術分野の系の状態によって生み出された収率とは比較にならないほど高い（図６、レーン４）。知る限りでは、これは、植物ウイルスベクターを基にした発現系を使用することによる、抗体のような複雑なヘテロオリゴマータンパク質発現の初めての証拠である。初期のすべての刊行物はモノクローナル抗体の簡単な人工誘導体の発現、たとえばＴＭＶ−ウイルスベクターを使用した（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６，７０３−７０８；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７８，９５−１０４）およびＰＶＸを基礎にした（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４１，３７９−３８２；Ｆｒａｎｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１８９−２０１；Ｈｅｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１，１３７−１４６；Ｒｏｇｇｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２２，７０−７４）１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の発現に限定されていた。
【００５５】
本発明では、好ましくは全身ウイルスベクターを使用しない。全身ウイルスベクターのかわりに、好ましくは植物系へのアグロバクテリウム媒介ウイルスベクター前駆体送達により、ウイルスベクターの能力を全身移行するように置換する。このことはウイルスコートタンパク質を、発現されることになる異種配列で置換することを可能にする。この方法は、ウイルスベクターの異種配列への適応性増大の可能性に貢献する。同時に、この方法はこの系の生産性を弱めることになる自発的な異種配列の欠失のために、ウイルスベクターが野生型ウイルスに変換される見込みを排除する。
【００５６】
我々のウイルス‐レプリコンを基礎にした系は、先行技術の系より著しく改善された収率のモノクローナル抗体を産生するが、我々はウイルスレプリコンのサイズを減少させることによりそれ以上の収率増加の可能性を検討した。分泌抗体の２つの鎖を発現するウイルスレプリコンのサイズを減少させる可能性が限定されていることを考慮して、２種の異なるウイルスレプリコンからの抗体の重鎖および軽鎖の発現を試みてきた。同じウイルスを基礎にしたレプリコンは同じ植物細胞において２種の異なる異種配列を発現できない（上記参照、実施例１）ことを考慮して、非相同植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）とジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に由来するウイルスベクターに、ＤｓＲｅｄとＧＦＰ遺伝子を別々にクローニングすることにより、同じ植物細胞に２種の異なる遺伝子を同時発現させる可能性を試験した（実施例４を参照されたい）。ウイルスベクターのｃＤＮＡを含有するＴ−ＤＮＡ領域の図式表示は図７および８（ＰＶＸのみ）に示す。実施例４では、便宜上、部位特異的組換えによりベクターモジュールからｉｎ ｐｌａｎｔａで集合させたＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターを使用した。驚くべくことに、共にインフィルトレーションされた植物葉領域から分離したプロトプラストはＤｓＲｅｄおよびＧＦＰレポーター遺伝子の実質的に１００％の同時発現頻度を示すことを我々は見いだしている（図９）。
【００５７】
最近、異なって標識されたウイルスの空間的分離に関する研究がＤｉｅｔｒｉｃｈとＭａｉｓｓ（２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８４，２８７１−２８７６）によって提示された。この研究では、レポーターとして蛍光タンパク質が発現した。ヘテロオリゴマータンパク質の産生には言及しなかった。さらに、分離したプロトプラストレベルでの同時発現は検討しなかった。レポーター遺伝子産物は原形質連絡を介した拡散により隣接する細胞に拡散できるため、選択されたウイルス対がレポーター遺伝子を、同じ細胞で、または隣接する細胞で発現したかどうかについての情報は全く得られなかった。初期の刊行物は植物の感染時の野生型ウイルス間の相乗作用について述べているが、植物細胞におけるヘテロオリゴマータンパク質の発現については述べていない。（Ｒｏｃｈｏｗ ＆ Ｒｏｓｓ，１９５５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１，１０−２７；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，１６−２４；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９，３１４−３１８；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，２６３−２７１）。同時感染した植物におけるウイルスの相乗的相互作用に関するこれらの初期の研究（Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｌｏｇｙ，２０６，５８３−５９０；Ｐｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，９，８５９−８６８）のその後の発展は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のサプレッサーの発見を導いた。組換えタンパク質発現系のさらに進んだ発展は、促進された組換えタンパク質産生のためのそのようなＰＴＧＳサプレッサーの研究に向けられた。相乗的ウイルスを基礎にしたウイルス発現系を使用した先行技術にはタンパク質発現に対する手がかりが全く存在しない。
【００５８】
本発明は、非競合ウイルスベクターが植物細胞または植物体におけるヘテロオリゴマータンパク質産生の効率的な手段を表すことを証明する。２種以上のウイルスベクターが同じ植物細胞において複製可能であり、そして上記の複製および別の細胞からのトランスフェクション中にお互いに効力を低下させない場合、上記のウイルスベクターはお互いに非競合的である。効力低下がないとは、少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは１００％のトランスフェクションされた植物細胞が共にトランスフェクションされること、すなわち上記の２種以上の異なるウイルスベクターを含有することを意味する。好ましくは、上記のウイルスベクターは異種核酸配列を複製し、発現することが可能である。より好ましくは、上記の異種核酸配列が異なるタンパク質をコードする。よりいっそう好ましくは、上記の異なるタンパク質がヘテロオリゴマータンパク質のサブユニットである。ウイルスベクターが競合的であるか、または非競合的であるかを確認するために、植物細胞の同時トランスフェクションの頻度を測定することができる。このことは以下のプロトコルに従って行うことができる：２種のウイルスベクターは２種の異なるレポーター遺伝子、たとえばＤｓＲｅｄとＧＦＰで標識される。上記の、異なって標識されたベクターは植物葉組織に（たとえばアグロ‐インフィルトレーション法により）同時送達され、３〜６日後、感染した領域から分離したプロトプラストを計数して、１種のレポーター遺伝子だけを発現しているプロトプラスト数に比較した、両方のレポーター遺伝子を同時発現しているプロトプラストの割合を決定することができる。そのような測定値を例示する実験は実施例２および４に記載する（図１Ａおよび９も参照されたい）。通常、非競合ウイルスベクターは相乗的であるウイルスに由来することができ、たとえば、同じ植物宿主に首尾よく同時トランスフェクションすることができる。そのような相乗的ＲＮＡウイルス対の例としては以下のものが挙げられる：
ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）／タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；
ＰＶＸ／タバコベインモットリングウイルス（ＴＶＭＶ）；
ＰＶＸ／タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）；
ＰＶＸ／クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）；
ＰＶＸ／プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）；
ＰＶＸ／ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）。
【００５９】
ウイルスベクターの競合性または非競合性の機構的理由は既知ではない。可能性のある１つの説明としては、相乗的ウイルスベクターに由来するウイルスレプリコンが異なる細胞下コンパートメントにおいてウイルス複製複合体（ＶＲＣ）を形成する（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６２９１−６２９６）ことが挙げられ、したがってそれらはＶＲＣを形成するために必要な空間に対してお互いに競合しない。実験的に証明されているように、非競合ウイルスベクターは、核酸配列レベルが著しく異なる、異なるウイルス種に由来してもよい。上記の非競合ウイルスベクターは、同じ植物宿主に首尾よく同時感染できる相乗的植物ウイルスに由来してもよい。相乗的ウイルスは通常異なる属に属する。たとえば、ＰＶＸはポテクスウイルス属に属するが、それに対して相乗的なウイルス、たとえばＴＶＭＶ、ＴＥＶ、ＰＰＶ、およびＣＩＥＶＶはポティウイルス属に属する。ＰＶＸウイルスに相乗的（非競合的）な別のウイルス、たとえばＴＭＶ、ＴＶＣＶ、およびｃｒＴＭＶはトバモウイルス属に属する。明らかに、異なる属の典型間のゲノム相同性はかなり低く、通常、ＲＮＡレベルで５０％同一性より低い。
【００６０】
異なるウイルスベクター（たとえば、ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたもの）へのモノクローナル抗体重鎖および軽鎖のクローニング、続いて同時感染した植物組織における上記の鎖の付加的な同時発現は実施例５に記載する。ベクターの図式表示は図１０に示す。本発明および別の発現系により産生されたモノクローナル抗体の収率の比較ＥＬＩＳＡ測定は、２種の非競合ウイルスベクターを基礎にした上記の系の最も好ましい成果を示した（図１１）。ウイルスベクター（複数のウイルスベクター）の補助による植物細胞での組換えヘテロオリゴマータンパク質の効率的な発現は先行技術では公知でない。
【００６１】
我々のデータに基づいた場合、ウイルスベクターのウイルスに由来する配列は、上記ウイルスがお互いに関連するとみなすために十分な相同性を示さないことになる。そのようなウイルスの例としては、ＴＭＶとＰＶＸのウイルス対が挙げられ、そしてウイルスベクターはそれに基づく。これらのウイルスベクターはそのような相同性を全く示さない。受容可能なウイルス対を選択するための別の必要条件は、植物宿主に同時感染中の、元の野生型ウイルスの相乗性であってもよい。
【００６２】
上で論じた実験は、植物細胞へのアグロバクテリウムに媒介されたＤＮＡ前駆体送達に基づいた一過性発現系により行われた。しかし、本発明の代わりの適用としては、植物核ヌクレオソームに安定に組み込まれた上記のＲＮＡレプリコン（複数のレプリコン）のＤＮＡ前駆体によるトランスジェニック植物への適用が挙げられる。これは、植物ウイルスベクターを基礎にした系の多くの制約、たとえば、ウイルスベクターが耐えうる異種配列の最大サイズに対する制限を克服する。ＤＮＡ前駆体はトランスジェニック植物のそれぞれの細胞に存在することになるため、ＲＮＡレプリコンの全身移行または細胞間移行（レプリコンスプレッディング）のための絶対的な要求性が存在しない。これは、高い効率の本発明のＲＮＡレプリコン形成および細胞質への輸送によって補われる。しかし、ＲＮＡレプリコン形成がすべての細胞でいつも起こるわけではないので、ベクターの細胞間移行の能力は付加的な価値のものであってもよい。
【００６３】
異なる方法を使用して、植物体、植物組織または植物細胞に異種ＤＮＡを提供してもよい。上記のベクターは、アグロバクテリウム（ＵＳ５，５９１，６１６；ＵＳ４，９４０，８３８；ＵＳ５，４６４，７６３）または粒子もしくはマイクロプロジェクタイルボンバードメント（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）によって運ばれるＴｉ−プラスミドベクターによって、植物細胞を形質転換してよい。別の植物形質転換法、たとえばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）またはプロトプラストのＰＥＧ‐媒介形質転換なども使用することができる。ベクター送達方法の選択は、形質転換されることになる植物種に依存してもよい。たとえば、マイクロプロジェクタイルボンバードメントは一般に単子葉植物の形質転換に好ましいが、双子葉植物には、一般にアグロバクテリウム媒介形質転換がより好ましい結果を示す。
【００６４】
本発明の実施例では、ニコチアナ細胞へのベクター（上記の異種ＤＮＡ）の一過性アグロバクテリウム媒介送達を使用した。しかし、上記ベクターは、関心のある植物種の安定な、または一過性形質転換にふさわしい標準技術のいずれかに従って、植物体に安定に導入されてもよい。双子葉植物のための形質転換技術は当該技術分野で公知であり、アグロバクテリウムを基礎にした技術とアグロバクテリウムを必要としない技術が挙げられる。アグロバクテリウムを使用しない技術には、プロトプラストまたは細胞による直接的な外来遺伝物質の取り込みが挙げられる。これらの技術には、ＰＥＧまたはエレクトロポレーション媒介取り込み、粒子ボンバードメント‐媒介送達およびマイクロインジェクションが挙げられる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ３，２７１７−２７２２（１９８４）、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，１６９−１７７（１９８５）、Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）、およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７，７０−７３（１９８７）に記載される。それぞれの場合、形質転換された細胞は標準技術を使用して、全植物体に再生される。
【００６５】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、その高い形質転換効率と多くの異なる種に対するその広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換に好ましい技術である。通常アグロバクテリウムによって形質転換することができる多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿花、ナタネ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファおよびポプラが挙げられる（ＥＰ０３１７５１１（綿花）、ＥＰ０２４９４３２（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９（ナタネ）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
【００６６】
本発明の実施例では、関心のある遺伝子（複数の遺伝子）の一過性発現にＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム媒介送達（Ｖａｑｕｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１１１２８−１１１３３）が使用された。この方法は、小規模〜中規模の組換えタンパク質産生系にとってだけでなく、大規模発現にとっても極めて有用な手段である。
【００６７】
植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれたウイルスレプリコン前駆体の放出は、誘導型またはいずれか別の調節された（たとえば発達的に調節された）プロモーターを使用して行うことができる。誘導型プロモーターはそれらの誘導条件に従って、２つのカテゴリーに分類することができる：非生物的因子（温度、ｐＨ、化学物質）によって誘導されるものおよび生物因子、たとえば病原体または害虫攻撃によって誘導されるもの。第１のカテゴリーの例としては、熱‐誘導型（ＵＳ０５１８７２８７）および低温‐誘導型（ＵＳ０５８４７１０２）プロモーター、銅‐誘導系（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０，４５６７−４５７１）、ステロイド‐誘導系（Ａｏｙａｍａ ＆ Ｃｈｕａ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１１，６０５−６１２；Ｍｃｍｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１４，２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５）、エタノール‐誘導系（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６，１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４）、およびテトラサイクリン誘導系（Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５，５５９−５６９）が挙げられる。植物の化学的誘導系の分野での最も最近の成果の１つは、グルココルチコイドデキサメタゾンによりスイッチを入れ、テトラサイクリンによりスイッチを切ることができるキメラ化プロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９，８７−９５）。化学的誘導系に関する総説としては以下を参照されたい：Ｚｕｏ ＆ Ｃｈｕａ，（２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．，１１，１４６−１５１）およびＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，６，１６９−１７７）。誘導型プロモーターの別の例としては、植物における病原性‐関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、病原菌攻撃に反応する植物シグナリング経路の重要な構成要素であるサリチル酸、またはＰＲ遺伝子発現を引き起こすことが可能な別の化合物（ベンゾー１，２，３−チアジアゾールまたはイソニコチン酸）（ＵＳ０５９４２６６２）による植物の処理によって誘導することができる。
【００６８】
本発明は実施例に記載のＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターに限定されないが、上記ウイルスレプリコンに由来する発現系の確立に役立つ、別の植物ＲＮＡウイルスに由来するレプリコンに適用可能である。同時感染された植物において最も詳しく研究された相乗作用はウイルスのＰＶＸ／ＰＶＹ対に関して公知である（Ｒｏｃｈｏｗ ＆ Ｒｏｓｓ，１９５５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１，１０−２７；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｒｏｓｓ，１９７４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５８，１６−２４）。おそらく、多くのそれらのウイルスは同じ植物細胞中で共に複製可能である。Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＆ Ｍａｉｓｓ（２００３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８４，２８７１−２８７６）は、異なって標識されたウイルス対、たとえばプラムポックスウイルス（ＰＰＶ）とジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、タバコベインモットリングウイルス（ＴＶＭＶ）とＰＶＸ、クローバー葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）とＰＶＸは、植物組織中の同じ感染領域において異なるレポーター遺伝子を同時発現できることを示している。本発明に記載のストラテジーを使用して、同じ植物細胞中で同時複製可能な、実質的に任意の対の植物プラスセンス１本鎖ＲＮＡウイルス‐由来レプリコンに対する組換えヘテロオリゴマータンパク質発現系が開発可能である。たとえば、アルファモウイルス属のアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）に基づいたウイルスベクターが本発明で使用可能である。
【００６９】
複雑な（ヘテロオリゴマー）タンパク質、それらの（機能的または非機能的）フラグメントならびにそれらの人工誘導体および融合物をコードする関心のある遺伝子は、本発明を使用して、植物体または植物細胞に発現することができる。多くの商業的に価値のあるヘテロオリゴマータンパク質の群は本発明を使用して生産し、精製することができる。それらの群には、工業用および研究用タンパク質、ならびにヒトまたは動物の健康分野における適用のためのタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。しかし、免疫反応タンパク質、とりわけ異なるクラスのイムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤ）から選択されたモノクローナル抗体ならびにそれらの合成誘導体、たとえば変異型および別のタンパク質またはその一部との異なる型の融合体が最も好ましい。
【００７０】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するために提示される。本発明の意図および範囲から逸脱せずに改変および変更を行ってもよい。
【００７１】
実施例１
同じ植物ＲＮＡウイルスに由来する２種のＴＭＶを基礎にしたＲＮＡウイルスベクターからのＧＦＰとＤｓＲｅｄの同時発現の欠如
葉組織は同じ植物ＲＮＡウイルスに由来するが、関心のある２種の異なる遺伝子を含有する、２種のＴＭＶを基礎にしたＲＮＡウイルスベクターに感染された（図１）。ＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターにクローニングした可視マーカー遺伝子ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄを使用して、この方法を試験した。第１コンストラクト、ｐＩＣＨ１７２７２（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３の図１を参照されたい）はＧＦＰを含有し、そしてベクター中のＲｄＲＰコーディング配列が１４個よりむしろ９個の植物イントロンを含有すること以外は、ｐＩＣＨ１８７１１（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０，ＷＯ２００５０４９８３９として公開；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３を参照されたい）に類似する。ｐＩＣＨ１８７２２（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，７１８−７２３）はＴＭＶの中の２種の密接に関連した株、ＣｒＴＭＶ（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０，５−８）およびＴＶＣＶ（Ｌａｒｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．１３８，２８７−２９８）の骨格に構築され、コートタンパク質配列が異種配列によって置換されている、植物プロモーターの制御下にあるウイルスゲノムを含有する。ＲｄＲＰおよびＭＰ中の１１個のイントロンの存在は、ベクターの葉組織へのアグロバクテリウム媒介送達後のウイルス複製開始の効率を増し、したがって同じ細胞における２種のウイルスベクターの同時発現の見込みを増大させる。ＧＦＰコーディング配列がＸｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を使用してＤｓＲｅｄのコーディング配列によって置換されていること以外は、ｐＩＣＨ１８５０５は、ｐＩＣＨ１７２７２に類似する（図１）。ｐＩＣＨ１８５０５およびｐＩＣＨ１７２７２のＴ−ＤＮＡ領域の詳細な制限地図は図１Ｃに示す。ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５はアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、先に記載（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）のように、ニコチアナベンサミアーナ葉組織がインフィルトレーションされた。プロトプラストはインフィルトレーション７日後にインフィルトレーション部位から作製し、顕微鏡下、青色または赤色光下で観察した。プロトプラストが数日後にインフィルトレーション部位から作製された場合でも、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの両方を発現したのは非常にわずかのプロトプラストだけであった。このことは細胞が第１のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターにひとたび感染すれば、第２のＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターによる再感染は不可能になることを示唆する。
【００７２】
実施例２
単一ウイルスレプリコンからのＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの同時発現
２種の別々のサブゲノムプロモーターの制御下、関心のある２種の遺伝子がＲＮＡウイルスベクターから発現された（図２）。両方のサブゲノムプロモーターは同一であってもよいが、ウイルス複製中におけるコンストラクト中の反復配列間の欠失のリスクを回避するために、関連するＴＭＶ株由来のサブゲノムプロモーターを使用することが好ましく；この場合、第２のサブゲノムプロモーターおよび３′非翻訳領域はＴＭＧＭＶ株Ｕ５に由来する（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５５，３１２−３２３；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）。また、クローニングの便宜上、ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄは、完全にアセンブルされたベクターよりむしろ、ウイルスプロベクター（ＷＯ０２／０８８３６９およびＭａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７に記載）にクローニングされた。２種のプロベクター、ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１５９３３（図３）は、ｉｎ ｐｌａｎｔａで、両方のプロベクターモジュール間の部位特異的組換えにより完全に機能的なＴＭＶを基礎にしたウイルスベクターに変換された。ｐＩＣＨ１７３８８は、（ｐＩＣＨ１７２７２と同じように）ウイルス配列に１１個のイントロンが存在すること以外はｐＩＣＨＮＯＰ（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）に類似する。ｐＩＣＨ１５９３３は、ＤｓＲｅｄのコーディング配列によってＴＭＧＭＶ Ｕ５のコーディング配列が置換されている以外は、ｐＩＣＨＧＦＰＳＹＳ（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）に相当する。
【００７３】
ｐＩＣＨ１５９３３はアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換され、ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１０８８１（図３）と一緒にニコチアナベンサミアーナにインフィルトレーションした。インフィルトレーション５日後に、すべてのＧＦＰ‐発現部位はＤｓＲｅｄも発現し、同じ植物細胞中における２種の遺伝子の卓越した同時発現を示した（図４）。
【００７４】
実施例３
単一のウイルスレプリコンから抗体の発現
ｐＩＣＨ１５９３３におけるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのコーディング配列は、ＩｇＧ抗体軽鎖および重鎖によってそれぞれ置換され、コンストラクトｐＩＣＨ２０２４１（図５）を得た。対照として、重鎖および軽鎖はＴＭＶを基礎にしたプロベクターにクローニングし、ｐＩＣＨ１７４０のコーディング配列を置換し、コンストラクトｐＩＣＨ２０４２１およびｐＩＣＨ２０４３１（図５）を得た。ｐＩＣＨ２０２４１はｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１０８８１と一緒にニコチアナベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションした（図３）。
【００７５】
インフィルトレーションされた葉部から抽出した全可溶性タンパク質のウェスタンブロット解析は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）により標識した、１：６０００に希釈した抗‐ヒトＩｇＧウサギ抗体により行った。解析の結果は図６Ａに示す。単一のウイルスベクターの補助によって達成された抗体の発現レベル（レーン６＆７、図６）は、ＰＴＧＳサプレッサーＰ１９の存在においてさえ、強力な構成プロモーターの補助により成し遂げられたものより著しく高い（レーン３〜４、図６）。
【００７６】
実施例４
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたウイルスベクターによるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの同時発現
２種の遺伝子の同時発現のための別のストラテジーは、同じ細胞に同時感染し、複製することが可能な、異なるウイルスに基づいて構築された別々のウイルスベクターを使用することである。例として、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づいた発現ベクターはＴＭＶと一緒に同じ細胞に共に存在することができる。２種のそのような非競合ウイルスベクターの図式表示は図７に示す。
【００７７】
ＰＶＸ（ＰＶ００１４株）の接種材料は、感染した乾燥葉材料として、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｔｅｓ（ＤＳＭＺ）から得て、ニコチアナベンサミアーナ植物体の接種に使用した。ウイルス症状を示した接種植物の全身葉部は全ＲＮＡ調製に使用した。第１鎖ｃＤＮＡはプライマーｐｖｘｐｒ２、ｐｖｘｐｒ４およびｐｖｘｐｒ６を使用して作製した。３種のｃＤＮＡフラグメントはＰｆｕ−Ｔａｑポリメラーゼミックスを使用して、ＰＣＲによりＰＶＸｃＤＮＡから増幅した：
フラグメント１はプライマー：
【００７８】
【化１】
【００７９】
により増幅した。
フラグメント１はＢｓａＩにより消化した。
フラグメント２はプライマー：
【００８０】
【化２】
【００８１】
により増幅した。
フラグメント２はＥｓｐ３Ｉにより消化した。
フラグメント３はプライマー：
【００８２】
【化３】
【００８３】
により増幅した。
フラグメント３はＢｐｉＩ ＡａｔＩＩにより消化した。
アラビドプシスアクチン２遺伝子プロモーターを含有するフラグメント４（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０，１０７−１２１）はアラビドプシスゲノムＤＮＡからプライマー：
【００８４】
【化４】
【００８５】
により増幅した。
フラグメント４はＭｌｕ１およびＢｓａ１により消化した。
アラビドプシスアクチン２プロモーターの代わりとして、さらにＣａＭＶ３５プロモーターを使用して、ＰＶＸを基礎にしたウイルスベクターの転写を行った（図１０Ｄ、ｐＩＣＨ２０７８８；ｐＩＣＨ２１３８０）。ＰＶＸを基礎にしたベクターを作製する一般的ストラテジーはＢａｕｌｃｏｍｂｅ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，７：１０４５−１０５３）に記載のように使用した。
【００８６】
４種すべてのフラグメントは、Ｍｌｕ１およびＡａｔＩＩにより消化したバイナリーベクター中に一緒にクローニングした。得られたコンストラクトの２０個のクローンはアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換し、それぞれのクローンはニコチアナベンサミアーナ植物体の１枚の葉にインフィルトレーションした。１週間後、ウイルス感染症状の表現型に対してニコチアナベンサミアーナをスクリーニングし、陽性のプラスミドクローンを保存した（ｐＩＣＨＰＶＸ）。
【００８７】
クローニングベクターは、ＣＰサブゲノムプロモーター下流の、関心のある遺伝子をクローニングするためのこの完全に機能的なｃＤＮＡから作製した。ＧＦＰ遺伝子は例としてクローニングした。ＣＰサブゲノム領域中のＡＴＧはＡＧＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ９５５１６中の位置５６５１）に変異させた。ＧＦＰ遺伝子はＮｈｅ１部位の３′（座標５６６２〜５６６７）にクローニングした。ＰＶＸの３′末端（座標５６１８〜６４３５）はＧＦＰ配列の下流にクローニングし、この配列に１２〜２４Ａのストレッチが続いた。このコンストラクト（ｐＩＣＨ０１３０，図８）はニコチアナベンサミアーナ葉部にアグロインフィルトレーションした。ＧＦＰ蛍光はインフィルトレーション後２〜３日目に出現した。ＧＦＰの全身移行は数日後に出現した。
【００８８】
ｐＩＣＨ０１３０はベクターｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１０５８０およびｐＩＣＨ１０８８１（図３）と一緒にニコチアナベンサミアーナ葉部に同時インフィルトレーションし、ＤｓＲｅｄ発現を提供した。同時インフィルトレーション後６日目にインフィルトレーションした領域からプロトプラストを作製し、青色光の下、顕微鏡下で観察した。ほとんどすべてのプロトプラストはＧＦＰおよびＤｓＲｅｄを両方とも発現し、卓越した同時発現レベルを示した（図９）。
【００８９】
実施例５
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによるモノクローナル抗体の発現
ＩｇＧの重鎖および軽鎖はＰＶＸベクターにクローニングし、ｐＩＣ０１３０中のＧＦＰのコーディング配列を置換して、それぞれ重鎖または軽鎖のいずれかを含有する２種のコンストラクト、ｐＩＣＨ２１２４０およびｐＩＣＨ２１３７０を生み出した（図１０Ａ）。また、抗体の軽鎖または重鎖のいずれかを含有するＴＭＶプロベクター部分のクローンが構築された（ｐＩＣＨ２０４３１およびｐＩＣＨ２０４２１，図１０Ａ）。２種の異なる鎖の発現型であるＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターを提供するアグロバクテリウムの混合物はＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、抗体の発現レベルは接種後１０日目にＥＬＩＳＡによって測定した。結果（図１１）は、ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクター由来の重鎖および軽鎖の同時発現の事例における、集合した機能的抗体の極めて高レベルを示す。これらのレベルは両方の鎖を発現しているＴＭＶベクターから得られたものより著しく高かった（実施例３）。
【００９０】
ＩｇＧ１サブクラスに属するさらに別のヒト腫瘍‐特異的モノクローナル抗体、抗癌ｍａｂは以下のように、ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターにサブクローニングした：抗癌ｍａｂ軽鎖コーディング配列を含有する、７３０ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントはＮｏｔｌ部位で平滑化し、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩにより開き、Ｘｂａｌ部位で平滑化した、ＴＭＶを基礎にした３′モジュールクローニングベクターｐＩＣＨ１１５９９（図１０Ｂ）にリゲーションし、ｐＩＣＨ２１９１０を得た。同じストラテジーを使用して、抗癌ｍａｂ重鎖コーディング配列を持つ１４２１ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＩＣＨ１１５９９（図１０Ｂ）にサブクローニングし、ｐＩＣＨ２１９２０（図１０Ｂ）コンストラクトを得た。ＧＦＰ発現のためのＰＶＸを基礎にした３′モジュールｐＩＣＨ２１２８２（図１０Ｃ）はＴＭＶを基礎にした３′モジュールクローニングベクターｐＩＣＨ１０９９０（図１０Ｃ）の基部に形成された。それは、ＧＦＰコーディング配列のｐＩＣＨ１０９９０（図１０Ｃ）への挿入および結果として起こるＴＭＶ３′非翻訳領域のＰＶＸ３′非翻訳領域による置換を介したいくつかのクローニングステップにより成し遂げられた。同様に、ＴＭＶを基礎にした３′プロベクターモジュールｐＩＣＨ２１９２０（図１０Ｂ）は、ＴＭＶ３′非翻訳領域をＰＶＸの３′非翻訳領域で置換することにより、ＰＶＸを基礎にした３′プロベクターコンストラクトｐＩＣＨ２２２５０（図１０Ｃ）に変換された。それは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で平滑化された、ｐＩＣＨ２１２８２（図１０Ｃ）の５７５ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩフラグメントと、Ｓａｌｌ部位で平滑化されたｐＩＣＨ２１９２０のＳａＩＩ−ＮｄｅＩフラグメントのリゲーションによって成し遂げられた。抗癌ｍａｂ軽鎖のコーディング配列を含有する７２３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＩＣＨ２２２５０（図１０Ｃ）にサブクローニングし、ｐＩＣＨ２２２４０（図１０Ｃ）を得た。
【００９１】
５′プロベクターｐＩＣＨ２１３８０（図１０Ｄ）は以下のように作製した：コンストラクトｐＩＣＨ１７３８８（図３Ｂ）を鋳型として使用し、プライマーｐｖ５ｐ５Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
【００９２】
【化５】
【００９３】
とｐｖ５ｐ５Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
【００９４】
【化６】
【００９５】
の補助によりフラグメントをＰＣＲ増幅し、Ｎｈｅ１およびＳａｃ１制限酵素により消化し、ｐＩＣＨ２０７８８の大きなＮｈｅ１‐Ｓａｃ１フラグメントとリゲーションし、ＰＶＸベクターの３′部位をイントロンおよびＡｔｔＰ組換え部位の５′末端と置換した。クローニングのスキームは図１０Ｄに示す。部位特異的組換えによりｉｎ ｐｌａｎｔａでウイルスベクターを集合させるために、５′プロベクターと３′プロベクターを使用するストラテジーは、以前に記載されたもののとおりであった（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，６８５２−６８５７）。
【００９６】
アグロインフィルトレーション手順
得られたすべてのコンストラクトは、標準エレクトロポレーションプロトコルを使用してアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に形質転換し、さらにニコチアナベンサミアーナ葉部のアグロインフィルトレーションに使用した。ＯＤ６００が１．８〜２．５の範囲の、一晩培養したアグロバクテリウム培養物の等しい容量を混合し、６０００ｇで３分間沈殿させた。ペレットは、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）および１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する溶液中に再懸濁し、それぞれ個々の培養物の１０-１希釈物を得た。針の無いシリンジを使用して、温室で６〜８週間育てたニコチアナベンサミアーナ植物体葉部にインフィルトレーションした。アグロインフィルトレーションのためのプロベクターを使用する場合、アグロバクテリウムミックスは通常５種の異なるアグロバクテリウム株を含み、それらのそれぞれが以下の構成要素の中の１種を提供する：レコンビナーゼ（インテグラーゼ）供与源（ｐＩＣＨ１０８８１）；５′ＰＶＸプロベクター（ｐＩＣＨ２１３８０）；１種のＩｇＧ鎖を提供する１種の３′ＰＶＸプロベクター（重鎖のためのｐＩＣＨ２２２５０または軽鎖のためのｐＩＣＨ２２２４０のいずれか、ＴＭＶプロベクターによってどの相補鎖が提供されるかに依存）、；５′ＴＭＶプロベクター（ｐＩＣＨ１７３８８）；１種の３′ＴＭＶプロベクター（軽鎖をコードするｐＩＣＨ２１９１０または重鎖をコードするｐＩＣＨ２１９２０）。
【００９７】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロット
アグロバクテリウムにインフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部の試料１００ｍｇは、３００μｌタンパク質抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）を含む液体窒素中ですりつぶした。葉の粗抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉのバッファー系を使用して１０％（非還元状態）または１２％（還元状態）ポリアクリルアミドゲルに溶解し、その後クーマシーブリリアントブルー染色を行った。ウェスタンブロット解析のために、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ由来のタンパク質は、ブロッテイングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）を使用して、電気泳動的にＨｙｂｏｎｄＰ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）に移した。膜はＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中５％スキムミルクで遮断し、それぞれ２．５％スキムミルク／ＴＢＳ １：１００００および１：５０００で希釈した、ヤギ抗‐ヒトラムダ軽鎖ＨＲＰ‐結合抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）またはヤギ抗‐ヒトガンマ鎖特異的ＨＲＰ‐結合抗体（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）により精査した。結合した抗体はＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使用して検出した。電気泳動による分離およびウェスタンブロット解析の結果は図１１Ｂに示す。ＩｇＧ標準物との比較は植物組織におけるモノクローナル抗体の収率が新鮮な葉生物量１グラムにつき０．２〜０．３５ｍｇに達することを示した。
【００９８】
植物体由来組換えＭａｂの単離
全可溶性タンパク質は１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．０）を含有するバッファーにより、アグロ接種したニコチアナベンサミアーナ葉領域から抽出した。小規模な粗タンパク質抽出物からの抗癌Ｍａｂの分離は、取扱説明書に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）によるワンステップアフィニティー精製を使用して行った。精製した植物体由来Ｍａｂのクーマシー染色ゲルは図１１Ｂに示す（パネルＢ）
【００９９】
実施例６
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによる卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の発現
ウシＦＳＨのアルファ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７３９０１のコーディング配列１０１〜４６３に相当するヌクレオチド）およびベータ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４０６０のコーディング配列７０〜４５９に相当するヌクレオチド）ポリペプチドをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）は制限部位（ＦＳＨ‐アルファおよびベータサブユニットに対して５′Ｎｃｏ１−３′ＥｃｏＲ１）を隣に配置して合成し、ＴＭＶプロベクター（ｐＩＣＨ２０４３１、ｐＩＣＨ１１５９９の誘導体、図１０Ｂ）およびＰＶＸベクター（ｐＩＣＨ２１２４０）にクローニングし、ＩｇＧの重鎖および軽鎖のコーディング配列を置換して、それぞれサブユニットアルファおよびサブユニットベータをコードする配列を含有する２種のコンストラクト、ｐＩＣＨ−ＦＳＨＡおよびｐＩＣＨ−ＦＳＨＢを得た（図１２）。ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターから発現される２種の異なるサブユニットを提供するアグロバクテリウムの混合物を作製し、先に記載のようにＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、ヘテロダイマーＦＳＨの発現レベルは、市販のＦＳＨダイマー特異的（ＦＳＨ１１７）抗体を使用して接種１０日後にＥＬＩＳＡにより測定し、Ｔｒｏｐｉｘ化学ルミネセンスシステム（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により検出した。
【０１００】
実施例７
ＴＭＶおよびＰＶＸを基礎にしたベクターによるＩｇＭの発現
ｐＩＣＨ１５９３３におけるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのコーディング配列はそれぞれＩｇＭ軽鎖およびＪ鎖をコードする配列によって置換し、コンストラクトｐＩＣＨ−ＭＬＣＪを得た（図１３）。ＩｇＭ重鎖をコードする配列はＰＶＸベクターにクローニングし（ｐＩＣＨ２１２４０）、ＩｇＧ重鎖のコーディング配列と置換し、コンストラクトｐＩＣＨ−ＭＨＣを得た（図１３）。ＰＶＸおよびＴＭＶを基礎にしたベクターから発現される３種の異なるＩｇＭ鎖を提供するアグロバクテリウム混合物はＮ．ベンサミアーナ葉部にインフィルトレーションし、ヘテロオリゴマー複合体の発現レベルは、市販のＩｇＭ特異的抗体を使用して接種後１０日目にＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１０１】
欧州特許出願第０５００１８１９．１号および米国特許出願第６０／５９３，６０６号の内容は、その優先権を本特許出願によって主張し、本明細書にそのまま参照として援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】（Ａ）インフィルトレーションされたＮ．ベンサミアーナ葉部における２種の異なるＴＭＶを基礎にしたベクター由来のＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの発現分布パターンを示す。左の写真：上部左側の明るいスポットはｐＩＣＨ１７２７２にインフィルトレーションされた領域のＧＦＰ蛍光である。下部の弱く明るいスポットはベクターｐＩＣＨ１８５０５にインフィルトレーションされた領域の赤色蛍光である。左の写真の底部右側の明るいスポットは、ｐＩＣＨ１７２７２＋ｐＩＣＨ１８５０５にインフィルトレーションされた領域である。右側の写真は、２種の異なるベクターに同時インフィルトレーションされた葉部領域から分離されたプロトプラストを示す（上部：ＧＦＰ蛍光検出条件下におけるプロトプラスト；下部パネル：ＤｓＲｅｄ蛍光検出条件下における同じプロトプラスト）。
【図１Ｂ】（Ｂ）ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＲｄＲＰ ウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ‐ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；ＧＯＩ‐関心のある遺伝子。
【図１Ｃ】（Ｃ）ｐＩＣＨ１７２７２およびｐＩＣＨ１８５０５のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図の図式表示である。
【図２】異なるサブゲノムプロモーター由来の２種の異なるトランスジーン（ＧＯＩ‐１およびＧＯＩ‐２）の同時発現用に設計されたウイルスベクターのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＲｄＲＰ ウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ−ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；３ＰＫ‐トリプルシュードノット（ｐｓｅｕｄｏ ｋｎｏｔ）領域；Ｕ５ｓｐｇ‐ＴＭＶ‐Ｕ５株のＣＰサブゲノムプロモーター。ＧＯＩ‐関心のある遺伝子。
【図３Ａ】（Ａ）コンストラクトｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１７１２３，ｐＩＣＨ１５９３３、ｐＩＣＨ７４１０、ｐＩＣＨ１０５８０、ｐＩＣＨ１０８８１およびｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。灰色の縦棒はイントロンを表す。
【図３Ｂ】（Ｂ）ｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ１７１２３、ｐＩＣＨ１５９３３のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図を表す。
【図３Ｃ】（Ｃ）ｐＩＣＨ７４１０、ｐＩＣＨ１０５８０、ｐＩＣＨ１０８８１およびｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域の制限地図を表す。
【図４】（Ａ）はＤＮＡ前駆体ｐＩＣＨ１７３８８およびｐＩＣＨ１５９３３をレコンビナーゼ供与源と一緒にアグロバクテリウム送達して６日後のＮ．ベンサミアーナ葉部領域の蛍光顕微鏡写真を示す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。
【図５】抗体の重鎖および軽鎖発現のための異なるベクター系のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。ＲＳ‐ＰｈｉＣ３１インテグラーゼにより認識される組換え部位。
【図６】ウイルスプロベクター系を使用した、ニコチアナベンサミアーナ葉部におけるＩｇＧ発現のウェスタンブロットを示す。ＴＳＰの電気泳動による分離は非還元条件下、１２％ゲル上で行った。発現したタンパク質の検出は、６ｘ１０３倍希釈した、ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）と結合したウサギ由来の抗‐ヒトＩｇＧ画分により行った。レーン：１‐非感染葉組織；レーン２‐サイトソルに発現したＩｇＧ重鎖（ｐＩＣＨ１７３８８）；レーン３‐ＩｇＧ重鎖および軽鎖、３５Ｓプロモーターコンストラクト（ｐＩＣ０１２３＋ｐＩＣＨ１９８４６）による同時発現；レーン４‐Ｐ１９（ｐＩＣＨ６６９２）を用いる以外は、レーン３と同様；レーン５‐３５ＳプロモーターコンストラクトおよびＰ１９（ｐＩＣＨ５２９０＋ｐＩＣＨ６６９２）により発現したＧＦＰ；レーン６‐バイシストロンコンストラクトｐＩＣＨ１９８６０により同時発現したＩｇＧ重鎖および軽鎖；レーン７‐バイシストロンコンストラクトｐＩＣＨ１９８６０（ＭＰ欠乏５′プロ‐ベクターｐＩＣＨ１７１２３、ＭＰ ｉｎ ｔｒａｎｓ ｐＩＣＨ１０７４５）により同時発現したＩｇＧ重鎖および軽鎖；レーン８‐サイトソルに同時発現したＧＦＰおよびｄｓＲＥＤ、ＭＰはｉｎ ｔｒａｎｓで提供される（ｐＩＣＨ１７１２３＋ｐＩＣＨ１９９１９＋ｐＩＣＨＩ１０７４５）。
【図７】同じ植物細胞において関心のある異なるタンパク質サブユニットの同時発現用に設計された非‐競合ウイルスベクターをコードするＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。Ｐ‐転写プロモーター；Ｔ‐転写停止領域；ＴＭＶ ＲｄＲＰ タバコモザイクウイルスのＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＰＶＸ ＲｄＲＰ ジャガイモウイルスＸのウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ‐ウイルス移行タンパク質；３′ＮＴＲ‐ウイルス３′非翻訳領域；Ｃｒ‐ｓｇｐ‐ｃｒＴＭＶ株のＣＰサブゲノムプロモーター領域；ＧＯＩ‐関心のあるタンパク質サブユニットをコードする関心のある遺伝子。
【図８】バイナリーベクターｐＩＣ０１３０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図９】ＴＭＶ（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨＩ１０５８０）およびＰＶＸ（ｐＩＣ０１３０）を基礎にしたベクターを使用した、植物細胞におけるＧＦＰおよびｄｓＲＥＤの同時発現を示す：アグロバクテリウムを接種したＮ．ベンサミアーナ葉部から分離したプロトプラストにおけるＧＦＰおよびｄｓＲＥＤの視覚化。
【図１０Ａ】（Ａ）バイナリーベクターｐＩＣＨ１７６２０、ｐＩＣＨ２０４３１、ｐＩＣＨ２１２４０、ｐＩＣＨ２０４２１、およびｐＩＣＨ２１３７０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図１０Ｂ】（Ｂ）バイナリーベクターｐＩＣＨ１１５９９、ｐＩＣＨ２１９１０、およびｐＩＣＨ２１９２０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。
【図１０Ｃ】（Ｃ）バイナリーベクターｐＩＣＨ２１２８２、ｐＩＣＨ１０９９０、ｐＩＣＨ２２２５０、およびｐＩＣＨ２２２４０のＴ−ＤＮＡ領域の図式表示である。ＬｖおよびＬｃ‐軽鎖の可変および保存領域；ＨｖおよびＨｃ‐重鎖の可変および保存領域。
【図１０Ｄ】（Ｄ）ＰＶＸ‐由来プロベクターｐＩＣＨ２１３８０のクローニングスキームの図式表示である。
【図１１Ａ】（ａ）ＰＶＸおよびｃｒＴＭＶベクターを使用したＩｇＧ軽鎖および重鎖の同時発現レベル測定のためのＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。左側の組織培養プレートのウェルの番号付けは、ヒストグラムの棒の番号付けに相当する。ヒストグラムは４０５ｎｍにおけるウェルのＯＤを示す。１、２−非感染植物組織；３、４、５−ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐重鎖（それぞれｐＩＣＨ２１２４０‐１、５および１４クローン）；６、７、８‐ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧの軽鎖（ＬＣ）（Ｎ‐末端欠失、それぞれｐＩＣＨ２１３７０−１８、１９、３１）；９、１０、１１‐ＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖（それぞれｐＩＣＨ２１３７０‐４０、４４、４５）；１２‐ブランクコントロール（植物タンパク質非適用）；１３、１４、１５‐ｃｒＴＭＶにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４３１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）（それぞれｐＩＣＨ２１２４０‐１、５および１４クローン）。１６、１７、１８‐ｃｒＴＭＶにおけるカルレティキュリン‐ＨＣ（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリン‐ＩｇＧのＬＣ（Ｎ‐末端欠失、それぞれｐＩＣＨ２１３７０−１８、１９、３１）。１９、２０、２１‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター中におけるカルレティキュリンＳＰ‐重鎖（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）と同時発現したＰＶＸにおけるカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧＬＣ（それぞれｐＩＣＨ２１３７０−４０、４４、４５）。２２‐ＰＶＸにより発現したＧＦＰ（ｐＩＣ０１３０）；２３‐ＰＶＸにより発現したＧＦＰ（ｐＩＣＨ２０７９９）；２４‐ｃｒＴＭＶだけ（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４３１）から発現したカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ軽鎖；２５‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７６２０＋ｐＩＣＨ１０８８１＋ｐＩＣＨ２０４２１）から発現したカルレティキュリンＳＰ‐ＩｇＧ重鎖；２６‐ＰＴＧＳサプレッサーＰ１９の存在下、強力な３５Ｓプロモーター制御下で同時発現したＩｇＧの軽鎖および重鎖２７‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨ１０８８１＝ｐＩＣＨ２０４２１）からのＩｇＧ軽鎖および重鎖同時発現；２８‐ｃｒＴＭＶを基礎にしたベクター（ｐＩＣＨ１７３８８＋ｐＩＣＨ１０８８１＝ｐＩＣＨ２０４２１）、ｉｎ ｔｒａｎｓで提供されたＭＰ（ｐＩＣＨ１０７４５）からの軽鎖および重鎖の同時発現；＊‐測定可能な値をかなり超えたＯＤ４０５値。
【図１１Ｂ】（ｂ）Ｎ．ベンサミアーナ葉部に発現した抗癌抗体の電気泳動およびウェスタンブロット解析を示す。（Ａ）ＴＭＶとＰＶＸプロベクターが同時感染したニコチアナベンサミアーナ葉部における抗癌抗体の重鎖および軽鎖の蓄積。軽鎖はＰＶＸにより発現し、重鎖はＴＭＶにより発現する。タンパク質は還元条件下、１２％ポリアクリルアミドゲル中で分離する。上部パネルはクーマシー染色を示す；中間パネルはＨＲＰ‐結合ヤギ抗‐ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）によるウェスタンブロットを示す。下部パネルはＨＲＰ‐結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ラムダ鎖‐特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）によるウェスタンブロットを示す。Ｕｎｉｎｆ、非感染組織；２〜１１、接種後の日数；Ｓ、抗癌ｍａｂ（モノクローナル抗体）標準品；ＬＣ、ＴＭＶプロベクターだけにより発現した軽鎖（６ｄｐｉ）；ＨＣ、ＴＭＶプロベクターだけにより発現した重鎖（６ｄｐｉ）。（Ｂ）プロテインＡ磁気ビーズ（ＮＥＢ）を使用した抗癌ｍａｂの精製。（Ａ）クーマシー染色ゲル上、還元条件下、１２％ポリアクリルアミドゲル中で移動する植物‐由来（レーン１）および標準（レーン２）ｍａｂ。（Ｃ）ＨＣを発現するＴＭＶプロベクターおよびＬＣを発現するＰＶＸプロベクターに同時感染したニコチアナベンサミアーナ葉部における集合した抗癌ｍａｂの蓄積。タンパク質は非還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル中で分離する。ウェスタンブロットはヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体により同定した。Ｕｎｉｎｆ、非感染組織；２〜１１、接種後の日数；Ｓ、抗癌ｍａｂ（モノクローナル抗体）標準品；ＬＣ、ＴＭＶプロベクター（６ｄｐｉ）だけにより発現した軽鎖；ＨＣ、ＴＭＶプロベクター（６ｄｐｉ）だけにより発現した重鎖；Ｈ２Ｌ２：２つの重鎖および２つの軽鎖を含有するＩｇＧヘテロテトラマー、Ｈ２Ｌ‐２つの重鎖および１つの軽鎖を含有するＩｇＧヘテロトリマー、Ｈ２‐重鎖ホモダイマー、Ｌ２‐軽鎖ホモダイマー。
【図１２】バイナリーベクターｐＩＣＨ１７６２０、ｐＩＣＨ−ＦＳＨＡおよびｐＩＣＨ−ＦＳＨＢのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【図１３】バイナリーベクターｐＩＣＨ１７３８８、ｐＩＣＨ−ＭＬＣＪおよびｐＩＣＨ−ＭＨＣのＴ−ＤＮＡ領域の図式表示を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターであり；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供する
ことにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含む方法。
【請求項２】
植物体、植物組織または植物細胞由来のヘテロ‐オリゴマータンパク質を分離することを次に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列および第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がサブゲノムプロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列および第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がＩＲＥＳエレメントの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスベクターの全身移行のために機能するタンパク質をコードするＯＲＦを欠如する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１ウイルスベクターが第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、第２ウイルスベクターが第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がサブゲノムプロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
第１ウイルスベクターが第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、第２ウイルスベクターが第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がＩＲＥＳエレメントの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするウイルスベクター、第１ウイルスベクター、および／または第２ウイルスベクターが
機能的コートタンパク質ＯＲＦ、
機能的移行タンパク質ＯＲＦ、および／または
ウイルス粒子アセンブリーの機能的起点
を持たない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１ウイルスベクターがポテクスウイルス属に属するウイルスに由来し、第２ウイルスベクターがポティウイルス属に属するウイルスに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１ウイルスベクターがジャガイモウイルスＸに由来し、そして第２ウイルスベクターがジャガイモウイルスＹに由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１ウイルスベクターがポテクスウイルス属に属するウイルスに由来し、そして第２ウイルスベクターがトバモウイルス属に属するウイルスに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第１ウイルスベクターがジャガイモウイルスＸに由来し、そして第２ウイルスベクターがタバコモザイクウイルスに由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１および第２ウイルスベクターが多くても６０％の配列相同性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロオリゴマータンパク質が抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスベクターが植物体、植物組織、または植物細胞に一過性に提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスベクターがアグロバクテリウムトランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に一過性に提供される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体として植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ前駆体由来のＲＮＡウイルスベクターの制御された放出が誘導型プロモーターによって提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも第１または第２タンパク質サブユニットがＥＲ‐ターゲッティングシグナルとしての植物‐特異的シグナルペプチドを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
植物‐特異的シグナルペプチドがタバコカルレティキュリンおよび／イネアルファ‐アミラーゼに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が少なくとも抗原結合ドメインの一部を含有するイムノグロブリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
抗体がポリイムノグロブリン受容体の一部を含有する保護タンパク質をイムノグロブリン重鎖と一緒に含有する、請求項１４または２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体またはその誘導体がイムノグロブリンＧクラス、イムノグロブリンＡクラス、イムノグロブリンＭクラス、イムノグロブリンＤクラス、またはイムノグロブリンＥクラスに属する、請求項１４、２１、または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘテロオリゴマータンパク質がインスリンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つまたは少なくとも２つ以上のヘテロオリゴマータンパク質のサブユニットが小胞体保留シグナルＫＤＥＬを含有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
異種核酸配列が変異して、ヘテロオリゴマータンパク質から部分的に、または完全にグリコシル化部位を除去している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
植物体、植物組織、または植物細胞が工学的に操作されて、ヘテロオリゴマータンパク質のグリコシル化パターンを変化させる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物体が単子葉または双子葉植物である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
双子葉植物がナス科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
双子葉植物がニコチアナ種である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
双子葉植物がニコチアナタバカムまたはニコチアナベンサミアーナである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
双子葉植物がアブラナ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
双子葉植物がマメ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
双子葉植物がメディカゴサティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
双子葉植物がアカザ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
双子葉植物がフダンソウである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
植物体、植物組織、または植物細胞において少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、１種以上のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター由来の少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に同時発現させることを含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を植物体または植物組織において産生する方法であって、
（ｉ）第１プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターまたは第２ウイルスベクターは、植物体における第１または第２ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠如し；または
（ｉｉ）少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、ウイルスベクターは全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするＯＲＦを欠如する
ことにより、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む、方法
【請求項３９】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルスに由来する、方法。
【請求項４０】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、第１または第２タンパク質サブユニットをコードする配列部分以外の配列部分が異なる、方法。
【請求項４１】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、異なる種に属するプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスに由来する、方法。
【請求項４２】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、異なるウイルスベクターである、方法。
【請求項１】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、
（ｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるウイルスベクターであり；または
（ｉｉ）植物体、植物組織または植物細胞に、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供する
ことにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含む方法。
【請求項２】
植物体、植物組織または植物細胞由来のヘテロ‐オリゴマータンパク質を分離することを次に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列および第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がサブゲノムプロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列および第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がＩＲＥＳエレメントの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするＲＮＡウイルスベクターが、ウイルスベクターの全身移行のために機能するタンパク質をコードするＯＲＦを欠如する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１ウイルスベクターが第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、第２ウイルスベクターが第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がサブゲノムプロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
第１ウイルスベクターが第１タンパク質サブユニットをコードする第１異種配列を含有し、第２ウイルスベクターが第２タンパク質サブユニットをコードする第２異種配列を含有し、第１および／または第２タンパク質サブユニットの発現がＩＲＥＳエレメントの制御下にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするウイルスベクター、第１ウイルスベクター、および／または第２ウイルスベクターが
機能的コートタンパク質ＯＲＦ、
機能的移行タンパク質ＯＲＦ、および／または
ウイルス粒子アセンブリーの機能的起点
を持たない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１ウイルスベクターがポテクスウイルス属に属するウイルスに由来し、第２ウイルスベクターがポティウイルス属に属するウイルスに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１ウイルスベクターがジャガイモウイルスＸに由来し、そして第２ウイルスベクターがジャガイモウイルスＹに由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１ウイルスベクターがポテクスウイルス属に属するウイルスに由来し、そして第２ウイルスベクターがトバモウイルス属に属するウイルスに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第１ウイルスベクターがジャガイモウイルスＸに由来し、そして第２ウイルスベクターがタバコモザイクウイルスに由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１および第２ウイルスベクターが多くても６０％の配列相同性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヘテロオリゴマータンパク質が抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスベクターが植物体、植物組織、または植物細胞に一過性に提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスベクターがアグロバクテリウムトランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に一過性に提供される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体として植物染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ前駆体由来のＲＮＡウイルスベクターの制御された放出が誘導型プロモーターによって提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも第１または第２タンパク質サブユニットがＥＲ‐ターゲッティングシグナルとしての植物‐特異的シグナルペプチドを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
植物‐特異的シグナルペプチドがタバコカルレティキュリンおよび／イネアルファ‐アミラーゼに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が少なくとも抗原結合ドメインの一部を含有するイムノグロブリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
抗体がポリイムノグロブリン受容体の一部を含有する保護タンパク質をイムノグロブリン重鎖と一緒に含有する、請求項１４または２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体またはその誘導体がイムノグロブリンＧクラス、イムノグロブリンＡクラス、イムノグロブリンＭクラス、イムノグロブリンＤクラス、またはイムノグロブリンＥクラスに属する、請求項１４、２１、または２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ヘテロオリゴマータンパク質がインスリンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つまたは少なくとも２つ以上のヘテロオリゴマータンパク質のサブユニットが小胞体保留シグナルＫＤＥＬを含有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
異種核酸配列が変異して、ヘテロオリゴマータンパク質から部分的に、または完全にグリコシル化部位を除去している、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
植物体、植物組織、または植物細胞が工学的に操作されて、ヘテロオリゴマータンパク質のグリコシル化パターンを変化させる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
植物体が単子葉または双子葉植物である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
双子葉植物がナス科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
双子葉植物がニコチアナ種である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
双子葉植物がニコチアナタバカムまたはニコチアナベンサミアーナである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
双子葉植物がアブラナ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
双子葉植物がマメ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
双子葉植物がメディカゴサティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
双子葉植物がアカザ科に属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
双子葉植物がフダンソウである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
植物体、植物組織、または植物細胞において少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、１種以上のプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクター由来の少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に同時発現させることを含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を植物体または植物組織において産生する方法であって、
（ｉ）第１プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、少なくとも第１ウイルスベクターまたは第２ウイルスベクターは、植物体における第１または第２ウイルスベクターの全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠如し；または
（ｉｉ）少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットをコードするプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターのＤＮＡ前駆体を、アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより植物体、植物組織、または植物細胞に提供するが、ウイルスベクターは全身移行に必要な機能的タンパク質をコードするＯＲＦを欠如する
ことにより、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを植物細胞に発現させることを含む、方法
【請求項３９】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは異なるプラス‐センス１本鎖植物ＲＮＡウイルスに由来する、方法。
【請求項４０】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、第１または第２タンパク質サブユニットをコードする配列部分以外の配列部分が異なる、方法。
【請求項４１】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニットを含有するヘテロ‐オリゴマータンパク質を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、ここで、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、異なる種に属するプラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスに由来する、方法。
【請求項４２】
植物体、植物組織、または植物細胞において、少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを含有する抗体を産生する方法であって、少なくとも第１および第２プラス‐センス１本鎖ＲＮＡウイルスベクターを植物体、植物組織、または植物細胞に提供することにより、植物細胞に少なくとも第１および第２タンパク質サブユニットを発現させることを含むが、第１ウイルスベクターは少なくとも第１タンパク質サブユニットをコードし、第２ウイルスベクターは少なくとも第２タンパク質サブユニットをコードし、第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターは、異なるウイルスベクターである、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５３５４７３（Ｐ２００８−５３５４７３Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２５８２（Ｐ２００７−５５２５８２）
【出願日】平成１８年１月２７日（２００６．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７９５４６
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５４９９７）アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２７日（２００６．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７９５４６
【国際公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【出願人】（５０７２５４９９７）アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー (5)
【Ｆターム（参考）】
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