植物における生物学的に安全な一過性のタンパク質発現
植物又は植物の葉において目的配列から目的タンパク質を発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションし、レプリコンをコードする配列は、植物ウイルスに由来する、レプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及びレプリコンから発現されるべき目的配列を含有し、ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、ことを含み、アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグロバクテリウムによって標的植物に送達される植物ウイルスベクターに基づいた一過性発現を用いた、植物における生物学的に安全な組換えタンパク質の産生方法に関する。また、本発明は、標的宿主植物又は植物の葉における目的配列の発現方法に関する。本発明は、植物全体又は植物の部分において目的タンパク質の大規模産生を高収率で提供する、ウイルスベクターのアグロバクテリウム介在送達の使用について記載する。本発明の方法は、宿主植物へのアグロバクテリウム介在送達による一過性発現を制限する一方で、望ましくない生物への形質転換を制御する。更に、本発明は、植物又は植物の葉において目的配列を発現させるための生物学的に安全なアグロバクテリウムに関する。本発明は、生物学的安全性が上昇した、植物における高収率の工業的タンパク質産生を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在、植物バイオテクノロジーは、植物において外来遺伝子を送達及び発現するための２つのアプローチ：安定な形質転換と一過性発現に依拠している。後者は、アグロ浸潤又はウイルス感染に基づいて構築することができる（概説として：Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０、１１３−１１６を参照されたい）。一過性発現は、構成的な、例えば３５Ｓプロモーターの制御下で目的遺伝子の発現を駆動する標準の発現カセットを植物組織にアグロ浸潤させることによって（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６、１１１２８−１１１３３）、又は大規模では、植物にウイルスベクターをトランスフェクションすることによって達成することができる。通常、アグロ浸潤は高収率を提供しないが、ｐ１９又はＨｃＰｒｏのような転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサーとの組み合わせにより、タンパク質発現レベルを５０倍まで上昇させることができる（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、３３、５４９−５５６）。依然として、ウイルス発現システムによって達成できる生物学的限界を遙かに下回っている（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）。植物組織において目的組換えタンパク質を一過性発現させるためのアグロ浸潤の使用に基づいたバイオリアクターについての記載は米国特許第６，７４０，５２６号に提供されている。しかしながら、この特許は、発現されるべきタンパク質の収率をいかにして改善するかについての記載がなく、当該技術分野において公知の他の方法に勝るものではない（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６、１１１２８−１１１３３）。一過性発現のより強力なアプローチは、ウイルスベクターの使用である。レポーター遺伝子（ＧＦＰ又はＤｓＲｅｄ）のＴＭＶに基づいた発現は、システムの生物学的な収率限界に達することができ、新鮮な葉のバイオマス１ｇあたり数ｍｇの組換えタンパク質を産生することが示された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）。そのようなシステムの相対収率は、ＴＳＰの８０％まで達することができ、下流処理を著しく容易にし、費用を低下させる。そのような高い相対収率は、ウイルスによって誘導される宿主タンパク質生合成の遮断により可能である。
【０００３】
ウイルスベクターは、アグロ浸潤に用いる慣用のベクターよりも高い発現レベルを提供でき（概説として：Ｐｏｒｔａ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４を参照されたい）、機能ゲノミクス研究の強力なツールである（Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５；Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３）ことは明らかである。当該技術分野における数多くの出版物及び特許がＤＮＡ及びＲＮＡのウイルスベクターに基づいたシステムについて記載している（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５；Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５９８１２３６号；ＷＯ０２／０８８３６９号；ＷＯ０２／０９７０８０号；ＷＯ９８／５４３４２号）。既存のウイルスベクターシステムは、通常、最高性能の点から見ると狭い宿主範囲に限定され、最も好適な宿主におけるそのようなベクターの発現レベルでさえシステムの生物学的な上限を遙かに下回っている。ウイルスに基づいたシステムの重要な問題は、植物細胞へのウイルスレプリコンの送達方法である。大規模産生（例えば農場又は温室において多くの植物で同時に産生すること）に最も広く適用される送達法は、ＲＮＡウイルスベクターの感染性コピーの使用である（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３）。組換えＲＮＡウイルスベクターは複製サイクルのあいだに異種挿入物を喪失する傾向が比較的高いため、この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型の転写を必要とし、したがって非効率的で高価である。
【０００４】
一過性経路は、非常に速いが、ウイルスの低感染性、植物の大部分にトランスフェクションすることができないこと、及び遺伝子サイズの限界のために非常に限定されている。植物細胞へ感染性ウイルスベクターを送達するためのアグロ浸潤の使用（Ｌｉｕ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆ、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５、３４３−３４８）、又はアグロバクテリウムによって送達されるウイルスベクター成分からのウイルスベクターの組み立て（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）について記載する出版物がある。しかしながら、これらの出版物は、アグロ浸潤された植物組織のそれぞれの細胞におけるウイルスレプリコンの効率的な同調形成の問題に取り組んでおらず、更に、ベクターの伝播は細胞間移行及び浸透移行に関するウイルスの能力に依存している。この移行は比較的長期間を必要とし、通常、ウイルスベクターは感染後およそ１０〜１４日で最高の可能なベクター収率を提供する。これは、植物の細胞内プロセスを妨げる組換えタンパク質、特に制限酵素、プロテアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、多くの医薬タンパク質のような非常に細胞傷害性のタンパク質の産生には受け入れられない。逆に、アグロ浸潤によって送達される標準ベクターは、アグロ送達後３〜４日で最高の可能な発現レベルに達するが、そのようなベクターによって提供される収率は容認し難いほど低い。したがって、事実上アグロ浸潤された植物組織の全ての細胞において目的遺伝子の発現を提供するにもかかわらず、目的タンパク質を発現するための構成的プロモーターによって駆動される効率の低い標準の転写ベクターによって引き起こされる問題に直面する。反対に、アグロ送達されたウイルスベクターは高発現レベルを提供可能であるが、複製をほとんど開始せず、そのため大部分の細胞で発現を提供せず、ほんのわずかな画分のみである（アグロ浸潤された全組織の１％未満）。その結果、そのようなウイルスに基づいたベクターは発現を提供するのに著しく（３〜４倍）長期間を必要とするが、システムの生産性は、特に細胞障害性タンパク質の場合に、理論上の生産性よりも依然として低い。これは、アグロ浸潤された組織において同調発現を提供しないため、特に細胞障害性遺伝子を発現させる場合に、収率に影響を及ぼし、一過性発現システムにウイルスベクターを使用する上で重大な欠点である。また、感染した植物宿主はその組織の大部分においてウイルスベクターを含有しないため、産生プロセスから組織を除外する。更に、感染植物に対してウイルスベクターの最高の可能な伝播（及び発現レベル）を達成するのに要する時間は、標準のアグロ浸潤プロトコールと比較して３〜４倍長い。その上、一過性発現のための記載のシステムはいずれも、遺伝子操作された生物の使用を含めた工業的規模のタンパク質産生において重要な要素である、システムの生物学的安全性を高める問題に取り組んでいなかった。
【０００５】
特許化技術を含め、当該技術分野には数多くの出版物があるにもかかわらず、主に２つの主要な理由により、依然として、商業的な高収率産生のために十分な効率と収率をもって作動するウイルスに基づいた大規模産生システムは存在しない：第１に、一過性の植物ウイルスに基づいた発現システムは、通常特定の宿主に制限され、環境因子の影響を受けやすいため大規模培養に好適であり得ない。その上、これらのシステムは、通常植物宿主のある部分に制限されるため、大部分の植物バイオマスを産生プロセスから除外し、その結果、単位植物バイオマスあたりの組換え産物の相対収率を、トランスジェニック植物において慣用の転写プロモーターによって達成可能なレベルに匹敵するレベルまで最小にする；第２に、各細胞に安定に組み込まれたウイルスレプリコン前駆体を有するトランスジェニック植物宿主を作製することによってウイルスに基づいた産生システムを拡大する試みは、特に、そのような位置におけるレプリコンの標準よりも低い働き、レプリコンから発現されるべき目的遺伝子の「漏出性」、そしてベクターの効率的スイッチシステムの欠失により、解決策を提供していない。ＲＮＡレプリコン形成の誘因としてＰＴＧＳサイレンシングのサプレッサーを用いることにより、ＰＶＸに基づいたベクターにおいて多少の進展が達成されたが（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）、このシステムは、ウイルスベクターの複製を誘発するスイッチ（ＰＴＧＳサプレッサー）の効率的制御を提供する解決策がないため、依然として実用的価値に遠く及ばない。しかしながら、このシステムは、この種のシステムでこれまで知られた中で最高である、合計可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の３％に達するＧＵＳ遺伝子の発現レベルを提供したが、依然として強力なプロモーターの制御下の慣用のトランス遺伝子発現システムよりも良好ではない。植物３分節ＲＮＡウイルス、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）に基づいた他の誘導性システム（Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６）は、目的タンパク質の収率が非常に低かった（３〜４μｇ／ｇ新鮮重）。これは標準の転写プロモーターによって提供される収率と匹敵する。
【０００６】
植物発現システムを用いてこれまでに達成された発現レベルの低さが、これらのシステムが細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の発現システムとほとんど競合しない主な理由である。低発現レベルは、植物材料の巨大なバックグラウンドにおけるタンパク質の単離精製のための下流費用を非常に高くする。したがって、単位植物バイオマスあたりの目的タンパク質又は目的産物の収率が増加するにつれて、下流処理費用が急激に減少する。
【０００７】
現在、細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の大規模発現システムを用いた市場で競合するほど収率及び効率が十分に高い植物の大規模な一過性発現システムはない。そのような植物の発現は以下の基準をできるだけ良好に満たす必要があるであろう：
（ｉ）できるだけ多くの植物組織及び組織の多くの細胞における目的タンパク質の発現を含め、高収率であること；
（ｉｉ）植物細胞の生存に対するタンパク質発現の有害な効果を防止するには、目的タンパク質又は目的産物の発現は、処置された植物又は植物組織の全ての植物細胞において同時に開始する必要がある。
【０００８】
典型的には、目的タンパク質又は目的産物は、産物又はタンパク質を産生する各細胞にある時点まで蓄積する。しかしながら、蓄積のあいだ、分解過程が進むことが多く、目的タンパク質若しくは目的産物の収率又は品質が低下する傾向にある。したがって、発現スイッチが入った後、目的産物又は目的タンパク質を収穫すべき最適な時点がある。全体的な工程を効率的で収益性のあるものにするには、この最適な時点は、植物の全ての組織又は細胞において、そして選択したロットの全ての植物において同時に到達すべきである；
（ｉｉｉ）システムは、向上したバイオセイフティー性を組み込み、アグロ浸潤に用いるアグロバクテリウムは、少なくとも１つの以下の特徴を有するであろう：開かれた環境における生存率が低いか又はゼロであり、非標的生物又は非標的植物に対する感染性が低いか又はゼロである。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、大規模応用に拡大可能であり、発現すべきタンパク質の収率が高く、そして同時に、非標的生物を外来ＤＮＡでトランスフェクション又は形質転換する可能性が低い、生物学的に安全な、植物システムにおいてタンパク質を発現させる方法を提供することである。
【発明の開示】
【００１０】
発明の一般的な説明
この目的は、標的植物又は標的植物の葉における目的配列からの目的タンパク質の一過性発現による目的タンパク質の産生方法によって達成され、この方法は：
レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、レプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉を含めた生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている。
【００１１】
更に、本発明は、
（ｉ）上で定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）上で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする植物又はその種子、
を含むキット部品を提供する。
【００１２】
更に、本発明は、
（ｉ）上で定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）上で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする第２のアグロバクテリウム株、
を含む、キット部品を提供する。
【００１３】
更に、本発明は：
（ｉ）補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な細菌の機能を不良にする第１の遺伝子改変を有し、
（ｉｉ）他の細菌へのプラスミド伝達の接合能が不良であり、そして
（ｉｉｉ）アグロバクテリウムの増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性である、
ことを特徴とする、本発明の方法のためのアグロバクテリウム属の細菌を提供する。
【００１４】
自然の一般的原理によれば、１つの特性の改良は他の特性に負に影響する傾向があり、逆も同様であるため、システムの２以上の対立する特性を同時に向上させることは困難である。植物に基づいたタンパク質発現システムでは、発現されるべきタンパク質の高発現レベルを達成することと、高い生物学的安全性を達成することを同時に達成することは、高発現効率はシステムの選択性を低下させ、よって生物学的安全性が低い傾向にあるため困難である。例えば、高率発現システムを達成するために植物の感染に用いるアグロバクテリウム株を非常に感染性にする場合、アグロバクテリウム株は、非標的植物に形質移入する可能性が高く、組換えＴ−ＤＮＡが環境中に伝播する傾向があるが、これは回避しなければならない。一方、アグロバクテリウム株の感染性を低くすることによって生物学的安全性を改善する場合、標的植物における形質移入及び発現効率は劣るであろう。したがって、生物学的安全性と発現効率はそのように対立する特性である。
【００１５】
植物に基づいたタンパク質発現システムへの要求は、システムを大規模応用、即ち多くの植物又は多くの植物の葉における同時発現に適合させる必要がある場合、より複雑になってさえいる。一方、大規模応用における生物学的安全性は、トランスジェニック生物が開放環境に拡張する可能性がより高まるため、より重要である。一方、高タンパク質発現効率及び高収率は、経済的に競合し得る方法を達成するには、大規模応において必須である。
【００１６】
本発明は、目的タンパク質を産生するための、大規模で非常に効率的且つ生物学的に安全な方法を作製するための手段を初めて提供する。
本発明の方法では、目的タンパク質は、植物又は植物の葉において目的配列から一過性に発現される。一過性発現は、植物又は植物の葉の一過性トランスフェクションによって達成される。「一過性トランスフェクション」という用語は、異種ＤＮＡ配列の導入が、植物染色体へ異種ＤＮＡ配列を安定に組み込むためにトランスフェクションされた細胞を選択することなく行われることを意味する。目的配列は目的タンパク質をコードする。目的配列は、外来ＤＮＡを植物細胞へ導入可能なアグロバクテリウム株を用いて植物又は植物の葉へ導入される。目的配列は、レプリコンが由来する植物ウイルスに対して異種である。即ち、本発明の方法は、植物又は植物の葉を野生型植物ウイルスで形質転換する場合を含まない。ＤＮＡ配列は異種目的配列を含有するため異種である。目的配列は、アグロバクテリウム株に対して固有の配列でないことが好ましい。
【００１７】
植物又は植物の葉をアグロバクテリウム株で一過性にトランスフェクションする。植物又は植物の葉は、植物の多くの細胞及び多くの組織が１つの作業工程でトランスフェクションされるようにトランスフェクションされる必要がある。これは、アグロ浸潤によって最高に達成することができるが、植物又は植物の葉の主要部分のトランスフェクションを可能にする他の方法も適用することができる。したがって、植物又は植物の葉にアグロバクテリウム株を浸潤させることによって植物又は植物の葉に一過性にトランスフェクションすることが好ましい。浸潤は、システムの効率に顕著に寄与するため、本発明の重要な要素である。効率が高い程、植物又は植物の細胞のより多くの細胞が目的タンパク質を発現し、さまざまな組織及び細胞において発現開始が良好に同調する。浸潤は、植物又は植物の葉の多くの細胞を１つの作業工程で形質転換することを可能にし、それにより、目的タンパク質の発現がさまざまな植物組織及び植物のさまざまな部分において進む時点が実質的に同調する。更に、浸潤は、かなりの割合の植物又は植物の葉の細胞が形質転換される可能性を実質的に増加させる。したがって、レプリコンの遠隔距離移行の可能性は、全体的な効率を更に増加させることができるが、トランスフェクション及び発現は、植物又は植物の葉におけるレプリコンの遠隔距離移行に依存しない。
【００１８】
本発明の方法は、植物への大規模な応用のため、即ち多くの植物で平行して実施するためにデザインされる。本発明の方法では、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも３０、更により好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１０００の植物にアグロバクテリウム株を平行してトランスフェクションする。
【００１９】
本発明の方法を植物全体で実施する場合、トランスフェクション（好ましくは浸潤）は植物のいくつかの部分で行う。例えば、大部分の葉とトランスフェクションするか浸潤させる。全ての葉をトランスフェクションするか浸潤させることが好ましい。より好ましくは、植物の全ての葉及び茎をトランスフェクションするか浸潤させる。目的タンパク質を単離するためにその後収穫される全ての組織をトランスフェクションするか浸潤させるべきである。根における発現及び収穫はシステムの全体的な効率を更に増加させることができるが、通常、根を浸潤させる必要はない。アグロバクテリウム株の懸濁液中に植物を逆さにしてサッと浸し、真空を適用し、その後真空を急速に開放することによって植物全体又は少なくともその土の上の部分を浸潤させることができる。この手順は、規模を拡大することができ、多くの植物に順々に又は同時に適用することができる。
【００２０】
本発明の方法を植物の葉で行う場合、葉の１以上の領域で浸潤を行う。好ましくは、葉に噴霧するか、アグロバクテリウム株の懸濁液にサッと浸し、好ましくは、その後アグロバクテリウム細胞を葉の組織に押し付けるか又は吸収させる。本発明にしたがい使用する植物の葉は、植物に付いていることが好ましい。本発明の方法は植物組織培養物で行わないことが好ましい。
【００２１】
浸潤又はアグロ浸潤はアグロバクテリウム懸濁液を用いたトランスフェクション法として定義することができ、アグロバクテリウムを植物組織（細胞間隙）に押し付けるために圧力差を用いる。
【００２２】
あるいは、ウイルス粒子を送達するために行ったようにして（Ｐｏｇｕｅら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．、４０、４５−７４）、アグロバクテリウムと研磨剤との混合物を植物へ展開するための高圧噴霧装置を用いてアグロバクテリウムを植物組織へ送達することができる。
【００２３】
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下ではＴ−ＤＮＡの生物への形質移入を不良にする第１の遺伝子改変を提供される。これは、生物学的安全性を向上させるための本発明の必須要素である。この生物は、異種ＤＮＡ配列によるトランスフェクションが望ましくない生物である（「非標的生物」）。非標的生物は、とりわけ、植物及び細菌又は真菌のような微生物である。補完因子の非存在下では、本発明の植物種は非標的生物でもない。補完因子の非存在下では、アグロバクテリウム株は、そのような非標的生物に感染することも形質導入することも不良であり、好ましくは不可能である。
【００２４】
アグロバクテリウム株、植物（又は植物の葉）、及び補完因子は、アグロバクテリウム株による植物の感染時、目的配列のトランスフェクション及び／又は発現を可能にするために選択され、一方で非標的生物のトランスフェクション及び／又は発現は起こりそうにない。非標的生物のトランスフェクションに関するアグロバクテリウム株欠陥、好ましくは不能は、アグロバクテリウム株の以後第１の遺伝子改変を称する遺伝子改変によって達成される。
【００２５】
第１の遺伝子改変は、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にすることが好ましい。これは、標的生物のトランスフェクションに必要な機能をコードするアグロバクテリウム遺伝子を欠失又は分裂させることによって達成することができる。そのような機能は、とりわけ、Ｔｉ−プラスミド上、例えば植物又は植物の葉の細胞へ導入すべきＴ−ＤＮＡを有するＴｉ−プラスミド上にコードされる。そのような遺伝子の例は、アグロバクテリウム遺伝子ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦである。
【００２６】
他の態様では、第１の遺伝子改変は、アグロバクテリウム株を栄養要求性にし、それにより、その増殖を外部から加えられた代謝産物依存性にする。外部から加えられた代謝産物の非存在下では、アグロバクテリウム株は、生物にＴ−ＤＮＡをトランスフェクションすることができない。
【００２７】
更なる態様では、第１の遺伝子改変として、生物のトランスフェクションに必要なアグロバクテリウム株の機能を、化学的に調節された異種プロモーターの制御下に置く。そのような遺伝子の例は、アグロバクテリウム遺伝子ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦであり、例えば、ｌａｃプロモーターの制御下に置くことができる。そのような態様では、補完因子は化学的に調節されたプロモーターを調節可能な小分子化合物である。ｌａｃプロモーターの場合、補完因子はＩＰＴＧ又は乳糖であり得る。したがって、植物又は植物の葉に適用されるアグロバクテリウム懸濁液は、植物の感染、及び好ましくは植物の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入を可能にする、ＩＰＴＧ又は乳糖のような小分子化合物を含有することができる。
【００２８】
他の態様では、第１の遺伝子改変は、アグロバクテリウム株を条件的致死性にし、補完因子は、アグロバクテリウム株の生存に必要な、アグロバクテリウム株の主要代謝産物である。
【００２９】
上記態様は組み合わせることができる。例えば、アグロバクテリウム株が、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な機能が不良である場合、システムの生物学的安全性を高めるために、更に栄養要求性及び／又は条件的致死性であることができる。
【００３０】
補完因子は、第１の遺伝子改変によって不良にされた機能を提供する。補完因子の存在下では、不良のアグロバクテリウム株による植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションが回復する。補完因子は小分子化合物であることができ、又は第１の遺伝子改変に依存して、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸のようなポリマー性化合物であることもできる。アグロバクテリウム株が栄養要求性である場合、補完因子はアグロバクテリウム株の増殖及び感染性を可能にする。アグロバクテリウム株が、第１の遺伝子改変として不良のＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦ遺伝子を有する場合、補完因子はそれぞれＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、又はＶｉｒＦであるか、それらをコードする。アグロバクテリウム株が化学的に調節されたプロモーターの制御下にある場合、補完因子は、化学的に調節されたプロモーターを調節可能な、好ましくは誘導可能な小分子化合物であることができる。
【００３１】
補完因子は、その目的を遂行できるように提供される必要がある。補完因子が小分子化合物である場合、植物又は植物の葉の浸潤に用いるアグロバクテリウム株の水性懸濁液中に存在し得る。補完因子がタンパク質である場合も、この水性懸濁液に加えることができる。しかしながら、タンパク質である補完因子（例えばＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、又はＶｉｒＦ）はＤＮＡにコードされ、浸潤時、植物又は植物の葉に存在するように提供されることが好ましい。１つの態様では、植物又は植物の葉に、補完因子又はそれをコードするＤＮＡを植物又は植物の葉に導入可能な第２のアグロバクテリウム株を浸潤させる。第２のアグロバクテリウム株は、第１の遺伝子改変を有さず、本発明の異種ＤＮＡ配列も有さないアグロバクテリウム株であることが好ましい。本発明のアグロバクテリウム株及び第２のアグロバクテリウム株は、植物又は植物の葉を浸潤させる際、混合物として用いることができる。少量のそのような混合物が（好ましくは含まれている）本発明の方法を実施する環境を逃れるならば、そのようなアグロバクテリウム株の混合物は、２つの株が互いに近接する可能性を迅速に低下させるように迅速に希釈される。したがって、非標的生物は２つのアグロバクテリウム株に同時に触れず、よって、人工核酸も外来核酸も（例えば異種ＤＮＡ配列）そのような非標的生物を形質転換しないであろう。
【００３２】
他のより好ましい態様では、補完因子は植物又は植物の葉で安定に又は一過性に発現する。補完因子の安定な発現が好ましい。この態様では、植物は、補完因子をコードする遺伝子改変（以下及び特許請求の範囲において「第２の遺伝子改変」と称する）を提供される。アグロバクテリウム株は第２の遺伝子改変を有する植物を排他的に形質転換するため、高度な生物学的安全性はこのようにして達成することができる。アグロバクテリウム株が望ましくない生物又は望ましくない植物を形質転換する可能性は、これらの生物は第２の遺伝子改変を欠失しているため、非常に低い。
【００３３】
これまでに記載した方法の生物学的安全性をさまざまな方法で更に向上させることができる。レプリコンをコードする配列部分は、植物又は植物の葉においてレプリコンの伝播を可能にする機能が不良のレプリコンをコードすることができる。当該機能は、レプリコンの遠隔距離移行又は細胞間移行のための機能、例えばそれぞれウイルスコートタンパク質又はウイルス移行タンパク質であり得る。レプリコンは少なくとも遠隔距離移行の可能性を欠失していることが好ましく、それにより、他の植物へのレプリコンの伝播を回避することができる。遠隔距離移行の可能性の欠失は、原理的にはタンパク質発現効率に不都合であり得る。しかしながら、本発明のシステムでは、本発明の他の要素によって、例えば、植物又は植物の葉の主要部分を浸潤させることによって、及び／又は以下に記載するＲＮＡレプリコン形成の改良方法によって、この不都合を補完することができる。
【００３４】
生物学的安全性を更に改良するための他のアプローチは、腫瘍抑制活性タンパク質Ｏｓａ（ＲＥＦ）を発現する植物のトランスフェクションにアグロバクテリウム株を用いること、及びｖｉｒＥ２遺伝子を提供するための第２のアグロバクテリウム株を用いることである。更に、アグロバクテリウム株は、非標的生物へのＴ−ＤＮＡ伝達を低下させるために、遺伝子改変された菌体数感知システム又は病原性誘発調節システムを有することができる。
【００３５】
本発明の方法の生物学的安全性は、アグロバクテリウム株が、プラスミドＤＮＡの他の細菌への接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有するように改良することもできる。接合性伝達は、以下のアグロバクテリウム遺伝子：ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、及びｔｒａＦのうちの少なくとも１つの機能を無効にすることによって達成することができる。
【００３６】
異種ＤＮＡ配列の配列部分はＤＮＡレプリコンをコードしてもＲＮＡレプリコンをコードしてもよい。ＲＮＡレプリコンが好ましく、以下の記載はほとんどＲＮＡレプリコンをコードする配列部分に関係する。
【００３７】
レプリコンをコードする配列部分は、レプリコン形成に必要な配列と、レプリコンから発現されるべき目的配列とを含有する。発現されるべき目的配列は、典型的には目的タンパク質をコードし、レプリコンから、又はＲＮＡレプリコンのサブゲノムＲＮＡから目的タンパク質を翻訳するための調節配列を含有することができる。
【００３８】
レプリコンがＲＮＡレプリコンである場合、レプリコン（ｉ）のＲＮＡレプリコン機能に必要な配列は、とりわけ前者が後者のＤＮＡコピー（例えばｃＤＮＡ）である場合におけるＲＮＡウイルスの配列に相当する。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコン機能に関する配列は、細胞核で複製するための機能を有するＤＮＡレプリコンを提供する；ＤＮＡレプリコンは、異種ＤＮＡ配列又はその部分を鋳型として用いる複製によって異種ＤＮＡ配列から形成することができる。ＲＮＡレプリコンの場合、レプリコン形成に関する配列は、細胞質で複製するための機能を有するＲＮＡレプリコンを提供する。ＲＮＡレプリコン機能に関する配列は、典型的には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ、レプリカーゼ）のような複製に関与する１以上のタンパク質をコードする。レプリコン機能に関する配列は、更に、サブゲノムプロモーター、転写エンハンサー、又は翻訳エンハンサーのようなレプリカーゼの発現に必要な機能であるか又はそれをコードすることができる。植物におけるＲＮＡウイルスの細胞間伝播又は浸透伝播に関与する移行タンパク質又はコートタンパク質のようなタンパク質は、異種ＤＮＡ配列中に存在し得るが、レプリコン機能を有さない。いずれにしても、レプリコンをコードする配列部分は野生型植物ウイルスをコードしない。レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスはレプリコン機能のための容易に接近可能な供給源であるため、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来することが好ましい。ＲＮＡレプリコンの場合、「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列が、ＲＮＡウイルスの対応する配列のＤＮＡコピーであり、ＤＮＡコピーは細胞核に含有される異種ＤＮＡ配列に組み込まれることを意味する。「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの対応するＲＮＡ配列の正確なＤＮＡコピーである必要はないが、以下に記載するように、機能保存的な相違を発揮できるという意味を含む。相違は機能保存的であるため、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスに関してそうであるのと同様に、レプリコン機能を実施可能なタンパク質をコードすることが好ましい。
【００３９】
レプリコンがタバコモザイクウイルスのようなトバモウイルスに基づく態様では、レプリコンはＲｄＲｐを含有するか又はコードする。このレプリコンは移行タンパク質を更にコードすることができる。このレプリコンは、コートタンパク質（ＣＰ）をコードせず、又は含有しないことが好ましい。
【００４０】
更に好ましい態様では、本発明の方法の生物学的安全性は、高度に希釈したアグロバクテリウム株の懸濁液を用いることによって更に改善される。この態様は、アグロバクテリウム株の細胞が環境に広がる可能性を減少させるだけでなく、植物にとって病原体であるアグロバクテリウム株で感染させる際、植物又は植物の葉の露出及びストレスを減少させることによって本発明の方法の効率を改善させる。本発明者らは、驚くべきことに、ある限度内で、本発明の工程（ａ）で用いるアグロバクテリウム懸濁液の濃度の低下とともに方法の効率が増加することを発見した。とりわけ、植物の細胞で産生されたレプリコンの細胞間移行能は、これらアグロバクテリウム懸濁液濃度の低下とともに増加する。この予想外の現象の理由は未だ特定されていない。この現象はアグロバクテリウム感染に対する植物の反応によるものであり、低アグロバクテリウム濃度ではこの反応は起こらない（又はより少ない程度で起こる）と推測される。
【００４１】
この好ましい態様では、６００ｎｍのＯＤ（光学密度）が１．０のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を少なくとも２５倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に希釈することによって得ることが可能なアグロバクテリウム細胞濃度のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液で植物又は植物の葉を浸潤させる。そのような希釈は、６００ｎｍの算出ＯＤ値がそれぞれ高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１のアグロバクテリウム懸濁液をもたらす。
【００４２】
次に、レプリコンがＲＮＡレプリコンである場合、発現効率を顕著に増加させる重要な態様が記載される。この態様では、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる。その相違は、全体的なプロセスのスイッチがいったん入ると、植物細胞におけるレプリコン形成頻度上昇の原因となる（以下を参照されたい）。レプリコン形成頻度上昇と相違とのあいだの因果関係を示す関連性は、相違を有するレプリコン機能に関する配列と相違を有さないレプリコン機能に関する配列とのあいだのレプリコン形成頻度を比較することによって実験的に試験することができる。そのような実験的比較は、実施例に記載するように、例えば目的配列を発現するプロトプラストを計数することによって行うことができる。容易に検出可能な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポータータンパク質をコードする目的配列をこの目的に用いることが好ましい。更に以下に記載するように、細胞間伝播不可能なＲＮＡレプリコンとの実験的比較を行うことも好ましい。
【００４３】
機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置でレプリコン機能に関する配列に導入される。選択された位置は、核で転写されたＲＮＡレプリコンが機能性レプリコンとして細胞質に出現する可能性の低さの原因である植物ＲＮＡウイルスのレプリコン機能に関する配列内に位置する。そのような選択された位置は、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量、即ち高Ａ含量及び／又は高Ｔ含量（ＲＮＡレベルでは高Ｕ含量）を有するか、又は潜在スプライシング部位、即ち核のスプライシング装置によってスプライシング部位として認識される配列部分を有することが好ましい。選択された位置は、以下に例示するように、ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを解析することによってＲＮＡレプリコンが基づくＲＮＡウイルス中に同定することができる。更に、選択された位置は、本発明による相違を発揮しないＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡでトランスフェクションした後、植物細胞で形成されるＲＮＡを解析することによって実験的に同定することができる。この実験的解析は、ＲＴ−ＰＣＲによって、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定とともに行うことができる。このようにして、ＲＮＡレプリコンを破壊するスプライシングイベントを示す望ましくないスプライシング産物を同定することができる。更に、望ましくないスプライシングの正確な部位を同定し、そして機能保存的な相違を選択された位置に導入することによって是正することができる。
【００４４】
機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコン形成頻度に対する選択された位置の有害効果を抑制することによってＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる。機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコンをコードする配列のレプリコン機能に関する配列において高Ａ／Ｔ含量を低下させることによって、ＲＮＡレプリコンにおいて高Ａ／Ｕ含量の低下を含むことができる。高Ａ／Ｕ含量は、相違が機能保存的である限り、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換（例えば遺伝コードの縮重を用いて）によって低下させることができる。更に、植物ＲＮＡウイルス由来配列のＡ／Ｕに富んだ領域に隣接する潜在スプライシング部位は除去することができる。そのような機能保存的な相違は、１つの、好ましくはいくつかの選択された位置に導入することができる。
【００４５】
好ましい機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍又はその中への１以上のイントロンの挿入、最も好ましくは核イントロンの挿入、又は核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む。驚くべきことに、Ａ／Ｕに富んだ位置又はその近傍へのイントロンの導入は、ＲＮＡレプリコン形成頻度の上昇をもたらすことが発見された。いくつかのイントロンを導入することができ、さまざまな数の挿入イントロンに関し、本明細書に例示している。１より多いイントロンの効果は累積的である。更に、イントロンの挿入は、他の選択された位置で他の機能保存的な相違と組み合わせることができる。
【００４６】
図１１は、発現されるべき目的配列内ではあるが、核イントロンを形成可能な配列の導入例を示す。図１１の例では、異種ＤＮＡ配列の一部のリコンビナーゼによって触媒される反転によって２つの半イントロンからイントロンが形成される。この原理もＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列に応用することができる。同一細胞内で２つの異なるＲＮＡレプリコンが形成される態様では、２つの異なるレプリコン間の組換えは、異なるレプリコン上に存在する２つの半イントロンから１つのイントロンを形成することができる。更に、ＲＮＡレプリコンは、いずれもレプリコンではない２つのレプリコン前駆体間の組換えによって形成することができる。この場合も、異なるレプリコン前駆体に由来する２つの半イントロンから１つのイントロンを組み立てることができる。
【００４７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列は、転写がＲＮＡレプリコン形成の必要条件であるため、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。アグロ浸潤させた全ての組織において目的配列の一過性発現を達成するには、転写プロモーターは構成的プロモーターであることが好ましい。構成的プロモーターの例は当該技術分野において公知である。
【００４８】
本発明の１つの態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンを共にコードする１以上のセグメントを有する。即ち、ＲＮＡレプリコンは１つの連続ＤＮＡによってコードされていない。実際、ＲＮＡレプリコンは２以上のセグメントによって不連続にコードされ、それにより、セグメントは同一Ｔ−ＤＮＡ上に好ましくは互いに隣接して存在することができる。次に、ＲＮＡレプリコン形成は、例えば組換えによるセグメントの再配列を必要とすることができる。組換えのためのリコンビナーゼは、追加のアグロバクテリウム株によって、又は遺伝子操作された植物宿主によって提供することができ、よって一過性発現を植物宿主にとどめることができる。例として、レプリコン機能に関する配列の一部（例えばレプリカーゼをコードする配列の一部）が、そのような配列の他の部分に対して反転方向で異種ＤＮＡ配列中に存在することができる。反転部分は組換え部位に隣接することができる。次に、レプリコン機能は提供できないため（例えば転写物は機能性レプリカーゼをコードしないため）、異種ＤＮＡの転写物はレプリコンではないであろう。組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを提供することによってセグメントの１つを反転させ、その結果レプリコンが連続的にコードされる。この態様では、リコンビナーゼを提供することにより、レプリコン形成と目的配列の発現に切り替えるためのスイッチとして機能し（更に以下を参照されたい）、高度な生物学的安全性に寄与することができる。
【００４９】
あるいは、セグメントの１つはアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ上に存在することができ、他の１つは植物染色体に組み込むことができる。次に、ＲＮＡレプリコンの形成は、ＲＮＡレプリコンを組み立てるために、両方のセグメントの転写と、両方の転写物のトランススプライシングを必要とするであろう。この態様は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に詳細に記載されているように、子孫植物又は細胞においてＲＮＡレプリコンを共にコードするセグメントを迅速に分離するために用いることができ、システムの生物学的安全性に寄与することができる。
【００５０】
本発明の方法は、本発明の異種ＤＮＡ配列による植物又は植物の葉の一過性トランスフェクションを含む（工程（ａ））。「一過性トランスフェクション」という用語は、植物染色体に安定に組み込まれた異種ＤＮＡを有する形質転換されたトランスジェニック細胞を選択することなく異種ＤＮＡを導入することを意味する。一過性トランスフェクションは、通常、異種ＤＮＡ配列によってコードされる遺伝子の一過性複製及び／又は一過性発現を提供する。本発明のトランスフェクションは、目的配列の発現を引き起こす。通常、発現は、植物又は植物の葉にアグロ浸潤にて異種ＤＮＡ配列を提供後、自然発生的に起こる。必要に応じて、発現を引き起こすか又はスイッチを入れるさまざまな方法を用いることができる。本発明の方法のスイッチを入れるためにリコンビナーゼを用いる場合、リコンビナーゼは植物又は植物の葉に一過性に提供することができ、その提供が目的タンパク質の発現スイッチとして作用することができる。そのようなリコンビナーゼは植物細胞に安定にコードされ、構成的又はストレス誘導性プロモーターの制御下でリコンビナーゼを発現できることが好ましい。プロモーターの誘導によりリコンビナーゼ発現を誘導することにより、目的配列の発現を引き起こすことができる。
【００５１】
本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）でトランスフェクションした、好ましくは浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離することを含む。目的タンパク質の単離は、発現した目的タンパク質を含有する植物又は植物の葉の均質化を含むことが好ましい。タンパク質を植物から単離するためのさまざまな方法が、本明細書中に援用されるＰＣＴ／ＥＰ０２／０９６０５号、及びそこで引用されている文献に記載されている。
【００５２】
本発明は、原理的には、感染性のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスが存在し、一過性発現を提供するアグロ浸潤が有効であるあらゆる植物に適用することができる。好ましい植物はベンサミアナタバコ及びタバコのようなタバコ種である；タバコ種以外の好ましい植物種は、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、クレス、ルッコラ、マスタード、イチゴ、ホウレンソウ、アカザ、レタス、ヒマワリ、及びキュウリである。
【００５３】
好適な植物／ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスのペアは、以下に示すＤＮＡ及びＲＮＡウイルスのリストに由来することができる。特に、本発明によるＲＮＡレプリコン形成が非常に高率であるため、本発明を実施する際、植物ウイルスの植物種特異性はほとんど目立たない。同様に、本発明は、あらゆるＲＮＡウイルスに基づいたＲＮＡレプリコンにより用いることができる。ＲＮＡウイルスは、通常、宿主植物の細胞核の外部で展開し、レプリコンを細胞核内で産生する場合、そのようなウイルスに基づいたレプリコンを効果のないものにする選択された位置を有するであろう。本発明は、異なる植物ＲＮＡウイルスのあいだで改良レベルがさまざまであり得るが、全てのＲＮＡウイルスに適用することができる。本発明が基づくことができる最も好ましい植物ＲＮＡウイルスは、トバモウイルス、特にタバコモザイクウイルス、及びジャガイモＸウイルスなどのポテックスウイルスである。タバコモザイクウイルスの場合、通常、発現されるべき目的配列によって置換されるコートタンパク質であろう。移行タンパク質は、除去するか、又は発現されるべき目的配列によって置換することもできる。しかしながら、好ましくは、タバコモザイクウイルスに由来するＲＮＡレプリコは、移行タンパク質をコードし、コートタンパク質が目的配列によって置換されている必要がある。
【００５４】
植物とＲＮＡレプリコンが由来するウイルスとの好ましい組み合わせは：タバコ種とトバモウイルス、タバコ種とタバコモザイクウイルスなどである。
ＤＮＡウイルスの中で、最も好ましいウイルスベクターはジェミニウイルスで構築することができる。ビーンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づくウイルス発現ベクターについての記載は、実施例１５に提供されている。
【００５５】
本発明の主要な応用は、目的タンパク質の植物又は植物の葉における産生である。本発明の方法を植物で実施する場合、タバコ種のようにヒト又は動物の食物連鎖に入らない植物が好ましい。アグロ浸潤後の植物全体又は植物の部分は、閉鎖環境、例えば温室又は特別に設計されたチャンバーに、所望の発現レベルを提供するのに必要なインキュベーション時間、閉じ込められるであろう。
【００５６】
本発明の効率は、植物発現システムの新たな局面を達成するようなものである。本発明により達成可能な発現レベルは、下流処理費用（目的タンパク質の分離・精製を含む）が本発明の方法を他の大規模発現システムと競合させるのに十分なほど低いものである。安定に形質転換された植物を用いた先行技術の発現システムでは、細胞の小さな画分でレプリコンを産生するため、ウイルスに基づいたベクターを用いた場合であっても発現レベルは低い。植物中に伝播するレプリコンは、特に遠隔距離に対する伝播が遅いため、この問題を是正することができない。したがって、植物において発現は均一に進行せず、植物のある部分では目的タンパク質の分解が既に起こるが、他ではタンパク質発現が開始してもいない。更に、先行技術のトランスフェクション又はアグロ浸潤に基づいた一過性発現システムは、１つの産生システムで高発現レベルも高い生物学的安全性も提供しない。本発明は、コンピテント植物宿主のアグロ介在送達を介して植物全体でも分離した植物の部分（例えば葉）でも均一に発現を誘引させる。レプリコンを産生しない細胞の小さな画分を、隣接細胞由来のレプリコンによって速やかに感染させることができる。本発明は、大規模で使用できる初めての高収率植物発現システムを提供する。本発明は、一過性発現システムを特異的に遺伝子操作されたコンピテント植物宿主に限定することによって高い生物学的安全性も提供し、それにより非コンピテント（非標的）生物において発現する確立を低下させ、システムの生物学的安全性を増加させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
発明の好ましい態様
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている。
【００５８】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
好ましくはＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって、植物又は植物の葉をトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変を提供されており、そして
植物又は植物の葉は、補完因子をコードし、植物又は植物の葉においてそれを発現する第２の遺伝子改変を有する。
【００５９】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
６００ｎｍの算出光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当する細胞濃度を有する、ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる。
【００６０】
更に好ましい態様を特許請求の範囲に定義する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、土壌細菌であり、有効な媒介生物であるアグロバクテリウムを用いてＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡ前駆体として送達するための、高度に活性な合成鋳型を開発した。本明細書において、この改良「アグロ感染」法を用いて、植物の実質的に全ての成熟した葉において一過性遺伝子増幅及び高レベル発現を同時に開始することができ、そしてそのようなトランスフェクション経路を工業的規模で安価に実施することができるを示す。産生を遺伝子操作された「コンピテント」植物宿主に限定し、産生方法の一部ではない他の植物又は微生物へのアグロバクテリウムの感染能を制限することができるような方法で標的植物宿主生物、アグロバクテリウム、及び／又は植物ウイルスを遺伝子操作することによって、生物学的安全性の問題にも取り組む。この技術は、３つの生物学的システムの利点を組み合わせる：ウイルスの速度と発現レベル／収率、アグロバクテリウムのトランスフェクション効率と浸透送達、及び植物の翻訳後能力と低産生コスト。提案した方法は、目的産物をコードする異種核酸による植物の安定な遺伝子改変を必要としない工業的産生経路を可能にし、より安全で制御され、近年の産業基盤に適合している。
【００６１】
本発明は、ウイルスレプリコン又はその前駆体のアグロバクテリウム介在送達を用いた目的タンパク質の高収率大規模産生のための一過性発現システムについて記載する。レプリコンは目的配列を発現可能であり、システムは組み込まれた生物学的安全性を有し、システムの３つの主要成分のうちの少なくとも２つ（遺伝子操作された植物宿主、アグロバクテリウム、レプリコン）を相互依存にする。
【００６２】
驚くべきことに、システムの主要成分のうちの１つから他の１つへ機能を部分的に委譲することによって生ずるそのような相互依存を、システムの効率に悪影響を及ぼさずに方法全体をよりよく制御し、生物学的安全性を増大させるようになし得ることを発見した。本発明の基本原理を図１（Ａ）に示す。ウイルスレプリコン前駆体のアグロ浸潤に基づいた大規模タンパク質産生方法は、目的タンパク質の発現に必要な機能を実施する際にアグロ浸潤に用いるアグロバクテリウム及び／又はレプリコンを補完するトランスジェニック宿主植物にて実施することができる。ＲＮＡレプリコンに関するそのような補完の１つの例を実施例４に記載する。この実施例では、植物全体を機能性移行タンパク質（ＭＰ）を欠失したＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列（図５）により一過性に形質転換した。このレプリコンは細胞間移行できなず、その結果、ウイルスＭＰを有する発現カセット（ｐＩＣＨ１０７４５、図５）を有さない植物宿主では高収率を提供することができない。
【００６３】
ウイルスレプリコンの活性化若しくは操作、又は一過性トランスフェクションに必要な機能を植物又は他のアグロバクテリウム株によってトランスで提供する場合、核から細胞質へのＲＮＡ放出効率を増加させるための本明細書に記載の基準を用いたとき、発現効率に悪影響は全く見られない。植物イントロンをウイルスＲＮＡレプリコンをコードするある領域へ組み込むことにより、又はレプリコン機能に関する配列内の潜在イントロンの除去若しくは置換により、宿主植物におけるレプリコンの効率を劇的に相加させることができる（少なくとも１０２倍）。そのような効率の増加は少なくとも１つの容易に測定可能なパラメータに反映された：ベクターの複製を示す細胞の相対的割合、即ち、レプリコン形成頻度の上昇。ＲＮＡレプリコン形成開始のそのような最適化は、実質的に植物全体において目的配列の発現スイッチを同時に入れる能力をもたらし、非改変ベクターよりも短時間で目的タンパク質の収率が劇的に増加する。本発明の実施例６〜１４は、核から細胞質へのＲＮＡウイルスベクターの放出効率を増加させるためのベクターの改良アプローチについて記載する。ウイルスベクターの改良に関する詳細な説明は、近年、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ及び同僚らによって公表された（２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３、７１８−７２３）。この改良は、ＲＮＡレプリコン、植物宿主、及びアグロバクテリウムのあいだで機能を効率的にやりとりさせるため、本発明の重要な態様である。興味深いことに、ＴＭＶに基づいたそのような改良ベクターは、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、並びにクレス、ルッコラ、及びマスタードのようなタバコ種以外の植物種において効率的に作用する。最も発現する非ナス科種は、イチゴ、ホウレンソウ、アカザである。レタス（特に苗木）及びヒマワリのようなキク科並びにウリ科のキュウリは、さまざまな植物科由来のいくつかの植物種を、好ましくは更に方法を最適化した後で成功裏に用いることができることを示している。
【００６４】
組換えＤＮＡのコード領域へのイントロンの組み込みによる核のトランス遺伝子発現の増加に関する出版物（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５、９１３−９２０；Ｂｏｕｒｄｏｎら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２、３９４−３９８；Ｒｏｓｅ，ＡＢ．、２００２、ＲＮＡ、８、１４４４−１４５３；ＵＳ５，９５５，３３０号）にもかかわらず、先行技術には、ウイルスＲＮＡレプリコン前駆体へのイントロンの組み込みが、ウイルスレプリコンの形成頻度及びレプリコンからの目的配列の発現レベルに良い効果を与えるであろうことを示す暗示は全くない。この効果は、核のｍＲＮＡ転写とウイルスＲＮＡの複製とは異なる細胞内区画で起こることを考慮すると驚くべきことである。ＲＮＡレプリコンのｃＤＮＡコピーを核内におく場合でさえ、ウイルスレプリコン前駆体の最初のコピーのみが核において産生され、次いで細胞質において核内とは異なる条件下で増幅される。先行技術では、野生型ウイルスｃＤＮＡを用いたクローニングのあいだ、大腸菌におけるウイルス遺伝子の「漏出性」発現の細胞障害効果を妨げるために、イントロンの使用が記載されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｉ．Ｅ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２４００−１２４０５；Ｙａｎｇら、１９９８、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４３、２４４３−２４５１；Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｙａ＆Ｇａｒｃｉａ、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、６８、９９−１０７）。イントロンｉｎｃｌｕｓｉｏｎが、ウイルスｃＤＮＡクローンからのレプリコン形成頻度を上昇させることができることを示す暗示は全くない。
【００６５】
本発明は、ＤＮＡ前駆体の転写によって派生し、目的配列の発現のためにデザインされている、ＲＮＡウイルス由来レプリコンの形成頻度を根本的に増加させる方法を提供する。この方法は、発現されるべき異種配列のサイズの限界やベクターの高度な不安定性のような、既存のウイルスベクターに基づいた発現システムの限界を克服する。更に、この方法は、より良い生物学的安全性を提供し、トランス遺伝子発現に対する漏出検査制御のデザインを可能にする（非誘導状態でゼロ発現レベル）。そのようなデザインは、ＲＮＡウイルス由来レプリコンをデザインするための戦略に統合された部分であるためである。ＲＮＡウイルス由来レプリコンの高頻度形成を提供することによって、本明細書に記載のアプローチは、植物全体、又はＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列を含有する葉のような植物の一部において目的配列の発現を速やかに開始させる。本発明を実施することにより、植物又は植物の葉のアグロ浸潤を介した異種目的配列の発現のためにデザインされた、植物ＲＮＡウイルスに由来する実質的に全てのレプリコンの性能を、レプリコン形成頻度の劇的な上昇によって顕著に向上させることができる。
【００６６】
さまざまな分類群に属するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが、本発明によるＲＮＡレプリコンの構築に好適である。本発明を適用できるＤＮＡ及びＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示している。種名（俗名）を標準体で示す。属又は科について正式に帰属されていないウイルスが示されている：
ＤＮＡウイルス：
環状２本鎖ＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス科、属：バドナウイルス属、基準種：ツユクサ黄斑ウイルス、属：カリモウイルス属、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属：“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズ退緑斑紋ウイルス、属：“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：キャッサバ葉脈モザイクウイルス、属：“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルス、属：“ペチュニア葉脈透化様ウイルス”、基準種：ペチュニア葉脈透化ウイルス；
環状１本鎖ＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス科、属：マストレウイルス属（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：クルトウイルス属（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビートカーリートップウイルス、属：ベゴモウイルス属（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビーンゴールデンモザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグサモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップ黄斑ウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス、科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアンソウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシ黄色斑紋ウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ矮化ウイルス、属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス属、基準種：リンゴステムグルービングウイルス；
属：カーライルウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス、属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ萎縮ウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス、属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス、属：ポテックスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス、属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス、属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジン斑紋ウイルス；マイナスｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄斑病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサ潜在ウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサ潜在ウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ブドウ葉脈ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ウルミアメロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス。
【００６７】
本発明の一般的原理を図１（Ａ）に示す。本発明の実施に多くのさまざまなアプローチを用いることができる。これらのアプローチは一過性発現を提供不可能なアグロバクテリウム変異体の使用に基づくことができ、変異体はトランスジェニック宿主植物又は第２のアグロバクテリウム株によってトランスに補完することができる。
【００６８】
システムの生物学的安全性を高めるために、本発明では感染しやすい植物へのアグロバクテリウムの感染を妨げ、それにより、一過性発現方法に対する制御を高める。植物宿主へのアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ伝達メカニズムに関する包括的な研究があり、これは本発明に成功裏に適用できる。
【００６９】
１つの可能なアプローチは、ウイルスレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列を有するアグロバクテリウム株を遺伝子操作された植物宿主に明確に限定することである。プラスミドｐＳＡのｏｓａ遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ輸送に必要なｖｉｒＥ２タンパク質を抑制することによって一過性発現を抑制し、更に植物の核ＤＮＡへの組み込みを抑制できる腫瘍抑制活性タンパク質をコードする（Ｌｅｅ，Ｌ−Ｙ．ら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、１８６−１９６）。しかしながら、この抑制は、ｏｓａ遺伝子を発現するアグロバクテリウムを野生型ｖｉｒＥ２を有するがｏｓａ遺伝子のないアグロバクテリウムと混合することによって、例えば変異体表現型をトランスで補完することによって逆転することができる。ｖｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物を作製することによって同様の結果を達成することができる。Ｔ−ＤＮＡは、その５’端に共有結合的に結合したＶｉｒＤ２とともに１本鎖中間体として植物細胞へ輸送されるが、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウム変異体は発癌性ではないため、ｖｉｒＥ２はこの方法の重要な成分である。そのような変異体の発癌性は、ｖｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物に接種することによって回復させることができる（Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，Ｖ．ら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１８０２−１８０５）。更に、完全にアセトシリンゴン依存性のアグロバクテリウム変異体がある。本発明の実施例５では、本発明の異種ＤＮＡ配列を有するアグロバクテリウム株の能力がｖｉｒＥ２タンパク質をトランスで補完するための遺伝子操作された植物宿又は野生型アグロバクテリウムに依存する一過性発現方法について記載する。また、アグロバクテリウム・リゾジェネスＧＡＬＬＳタンパク質は、ＶｉｒＥ２の機能を補完することができる（Ｈｏｄｇｅｓら、２００４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８６、３０６５−３０７７）。そのようなシステムは、異種ＤＮＡの伝播制御を顕著に改良し、システムの生物学的安全性を高める。この実施例に記載のように、実際に、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウムによる野生型ベンサミアナタバコ植物のアグロ浸潤後、目的タンパク質（ＧＦＰ）の発現は全く検出されなかった。しかしながら、ｖｉｒＥ２を発現する補完された宿主植物をアグロ浸潤したとき、又はこの第１の遺伝子改変を有するアグロバクテリウム株との混合物中で野生型アグロバクテリウムをアグロ浸潤したとき、ＧＦＰは効率的に発現した。実際に、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウムによるＴ−ＤＮＡ送達効率は、野生型アグロバクテリウムやトランスで補完された変異体アグロバクテリウムと比較して、約１０，０００倍低下した（実施例５、図１７を参照されたい）。
【００７０】
生物学的安全性を高めたシステムを設計するためのアプローチは、ｖｉｒＥ２機能のトランス補完に限定されない。ｖｉｒＦ遺伝子もｖｉｒＥ２と同様に、ｖｉｒＦ欠失アグロバクテリウムを補完することによって一過性発現に適した植物宿主を作製するために用いることができる（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ−Ｔｕｉｎｋ，ＡＪ．＆Ｈｏｏｙｋａａｓ，ＰＪ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、６９−７１）。興味深いことに、ｏｓａタンパク質は、ｖｉｒＥ２タンパク質とｖｉｒＦタンパク質の分泌をともに妨げる（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、７５４５−７５５０）。あるいは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＩｎｃＰ型又はＩｎｃＮ型接合伝達システムを異なる細菌、大腸菌株へ導入することができ、この菌株は、安全化アグロバクテリウム・ツメファシエンス株の存在下でＴ−ＤＮＡ伝達を提供することができる（Ｐａｐｐａｓ，ＫＭ．＆Ｗｉｎａｎｓ，ＳＣ．、２００３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９、６７３１−６７３９）。後者は、コンピテントアクセプター宿主及び当該コンピテント宿主に限定された１種又は複数の細菌ドナー株（例えばドナー株とヘルパー株）を有する、生物学的安全性を高めたシステムを設計するための多くのさまざまな可能性があることを示している。このアプローチは、他の生物への望ましくないＴ−ＤＮＡ伝達の可能性を顕著に制限する。
【００７１】
植物細胞へのアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ伝達能に加えて、アグロバクテリウムは、多くの他の細菌と同様、他の細菌との接合を介して遺伝物質（通常染色体外プラスミドＤＮＡ）を伝達することもできる。工業的アグロバクテリウム株から他のアグロバクテリウム株（例えば野生型アグロバクテリウム）へのそのようなプラスミドＤＮＡ（例えばバイナリーベクター）の伝達能は、環境へのトランス遺伝子放出に対する制御を危険にさらすであろう。多くの場合、そのような接合伝達は、多くのバイナリーベクターは接合伝達に必要な構造要素（例えば伝達起点を表すｏｒｉＴ）を含有せず、したがって、大腸菌から目的アグロバクテリウム株へのバイナリープラスミドの接合伝達に基づいた三親性接合を介さず、直接形質転換によってのみアグロバクテリウム株に導入することができるため、トランス遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ領域を有するバイナリーベクターを安全化Ｔｉプラスミドと組換える場合にのみ可能である。さまざまなバイナリーベクターに関する概説として、Ｈｅｌｌｅｎｓ，Ｒ．、Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ，Ｐｈ．＆Ｋｌｅｅ，Ｈ．（２０００、Ｔｒｅｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、５、４４６−４５１）を参照されたい。しかしながら、バイナリーベクターがｏｒｉＴを含有しない場合でさえ、依然として、バイナリーベクターと居住安全化Ｔｉプラスミドとのあいだで組換わる可能性がある。そのような組換えは、トランス遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ領域を含有するプラスミドの形成をもたらし得、それにより、プラスミドは異なる細菌間で接合伝達可能であり得る。いくつかの遺伝子がアグロバクテリウム細胞間の接合伝達に関与している（Ｃｏｏｋら、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、１２９１−１２９７；Ｂｅｃｋら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１、５２８１−５２８９）。しかしながら、最も必須の領域（ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、ｔｒａＦ）は全て居住Ｔｉプラスミド上に局在している（Ｏｇｅｒ＆Ｆａｒｒａｎｄ、２００２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４、１１２１−１１３１；Ｆａｒｒａｎｄ、Ｈｗａｎｇ＆Ｃｏｏｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７８、４２３３−４２４７；Ｌｉ＆Ｆａｒｒａｎｄ、２０００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２、１７９−１８８）。相同組換えによるこの領域の除去は、居住Ｔｉプラスミドとバイナリーベクターとの相同組換えが起こる場合でさえ、細菌間接合伝達を低下させるであろう。接合伝達に関与する領域を欠失するアグロバクテリウム株のデザインは、上記参考文献及び標準の分子生物学的技術を用いた本発明の実施例１６に提供された記載にしたがい、容易に行うことができる。実施例１６は、接合性プラスミド伝達に関与する遺伝子の欠失が、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達効率に影響を及ぼさないことを示している（図２０も参照されたい）。
【００７２】
本発明による発現システムの発現効率を高めるための更なるアプローチは、アグロバクテリウム感染を限定する宿主細胞因子とアグロバクテリウム因子の使用である。多くのそのような因子が、アグロバクテリウムが介在する安定な植物トランスフェクションに関する概説に記載されている（Ｇｅｌｖｉｎ，ＳＢ．、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１、９５−９８；Ｇｅｌｖｉｎ，ＳＢ．、２００３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６７、１６−３７）。例えば、トランスジェニックタバコ植物においてシロイヌナズナ遺伝子ＶＩＰ１を過剰発現させることにより、アグロバクテリウムによる一過性の及び安定な遺伝子トランスフェクションに対してより顕著に感受性にすることを見出した（Ｔｚｆｉｒａ，Ｔ．、Ｖａｉｄｙａ，Ｍ．＆Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，Ｖ．、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、１０４３５−１０４４０）。植物のトランスフェクション効率を向上させる要因は、アグロバクテリウム病原性遺伝子の構成的発現であり得る。通常、そのような遺伝子は、環境因子又はｖｉｒ遺伝子の発現を誘引するカスケードの制御下にあり、フェノール化合物、糖、ｐＨ変化によってスイッチを入れることができる。これらの因子、ＶｉｒＧ のＶｉｒＡタンパク質介在リン酸化を引き起こし、次いで他のｖｉｒ遺伝子のプロモーターを活性化することができる。ＶｉｒＧ内の単一アミノ酸置換によって起こる突然変異は、ＶｉｒＡとは独立して他のｖｉｒ遺伝子の構成的発現を引き起こすことができる（Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．、Ｄａｓ，Ａ．＆Ｃｈｉｌｔｏｎ，ＭＤ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、７６０３−７６０７）。この文献では、アグロバクテリウムの変異体ＶｉｒＧ株を用いたＧＵＳレポーター遺伝子による一過性発現実験で、タバコ及びトウモロコシの組織においてＧＵＳを発現する焦点数の顕著な増加を検出した。タバコにおいて一過性発現効率を促進するために複数コピーの野生型ＶｉｒＧを用いたとき、同様の効果を観察したが、トウモロコシにおいては実際のところ効果がなかった。著者らは、そのようなＶｉｒＧ変異体株は、扱いにくい植物種の形質転換に有用であり得ることを示唆している。これは、それらが、通常、形質転換が困難な植物種のためのウイルスベクターに基づいた一過性発現システムの開発にも有用であることを意味している。植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達を刺激する、フェノール化合物（Ｍｅｌｃｈｅｒｓら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３、９６９−９７７）、アセトシリンゴン、若しくはオパインなどのさまざまな化学因子とともに、又はそれらとは独立した、上記のようなＶｉｒＧ変異体遺伝子の使用は、一過性発現効率を高めるための有用なアプローチである（Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔら、１９９８、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９、１５３７−１５４８）。
【００７３】
本発明の一過性発現システム及び方法の生物学的安全性を顕著に高めることができる他の要因は、栄養要求性アグロバクテリウム株の使用である。そのような栄養要求性株は開かれた環境で生存する確率が低いためである。Ｘ線処理による栄養要求性アグロバクテリウム株の作製は、Ｄｉｒｋｓ＆Ｐｅｅｔｅｒｓ（ＵＳ６３２３３９６号）に記載されている。この特許にはいくつかのそのような株（メチオニン若しくはシステイン要求株、又はヒスチジン及びアデニン要求株）が記載されている。生長にメチオニンを必要とする変異体の１つは、ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼの機能が欠損している。データベースで完全なアグロバクテリウムゲノム配列を利用可能であることを考慮すると、Ｘ線処理によって得られるあまり予測できない結果にかわり、十分に特徴付けられた（配列決定された）アグロバクテリウム株のそのような変異体を、相同組換えによる遺伝子置換を用いて作製することは直接的である。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８ゲノム配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０５）は、５−メチルテトラヒドロプテロイル−トリグルタミン酸−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ １１３５６９７）を含有する。利用可能な配列情報を用いて変異体型遺伝子を作製し、アグロバクテリウムへ更に送達し、目的の栄養要求性変異体 (例えば、ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ変異体型遺伝子の場合、メチオニン代謝欠損変異体) を選択するために、隣接配列とともに、対抗選択可能マーカー遺伝子ｓａｃＢＲを含有する自殺ベクターへクローニングすることができる（Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７５、１７２３−１７３４）。記載のアプローチ及びさまざまな栄養要求性アグロバクテリウム株に関する公的に利用可能な情報を用いて多くの他の変異体を作製することができる。Ｃｏｌｌｅｎｓ及び同僚ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０（２００４）、８９０−８９６）は、挿入変異によって栄養要求性アグロバクテリウム変異体を作製した。そのような変異体株は、アデニン、ロイシン、システイン、又はチアミンの非存在下では増殖できない。これれらの変異体のいくつかは、Ｔ−ＤＮＡ送達効率が低下しているが、他（ｃｙｓ−３２）は、野生型アグロバクテリウムよりも高くさえある植物細胞へのＴ−ＤＮＡ送達能を有する。影響を受けたことが予想されるアグロバクテリウム遺伝子はおそらくｌｅｕＢ、ｔｈｉＤ並びにｃｙｓＥ及びｃｙｓＫである。当然ながら、栄養要求性株の選択は、植物細胞への効率的Ｔ−ＤＮＡ伝達のためのその適合性に基づくであろう。また、より高い生物学的安全性レベル（野生型への復帰変異頻度が低い）のために、２以上の異なる栄養素供給にたいする栄養要求性株（例えば２以上の変異遺伝子を有する）を作製することができる。栄養要求性アグロバクテリウム株（ＤｌｅｕＢ及びＤｐｙｒＥ）の作製は、実施例１７に記載されている。
【００７４】
要求される機能（例えばＴ−ＤＮＡ伝達）のみを実施し、及び／又はトランス補完因子（例えばｖｉｒＥ２タンパク質、代謝化合物の添加）の存在下でのみ生存できるアグロバクテリウムの変異体株に加えて、細菌細胞の能動生物学的封じ込め（ＡＢＣ）システムに基づいたアプローチを用いることができる。そのようなシステムの例は、Ｒｏｎｃｈｅｌ＆Ｒａｍｏｓによって記載されている（２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７、２６４９−２６５６）。この文献において、著者らは、汚染物質の非存在下で細菌集団の生存又は死を細胞死の誘導を介して自由自在に制御するためにデザインしたＡＢＣシステムについて記載している。このシステムは、大腸菌ｇｅｆ遺伝子によってコードされるポリン誘導タンパク質のような死滅遺伝子の使用に基づいている。この遺伝子は、ｌａｃＩ誘導性プロモーターの制御下に置かれる。このシステムにおけるＬａｃＩ発現は、環境シグナルに依存するプロモーターの制御下にある。ＡＢＣシステムをデザインするための他の死滅遺伝子を使用する類似スキームは、数多くの文献に記載されている（例えば、Ｋｎｕｄｓｅｎら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１、９８５−９９１；Ｒｏｎｃｈｅｌら（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４、４９０４−４９１１；Ｔｏｒｒｅｓら（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９、３５９５−３６０１）。ストレプトアビジンに基づいた封じ込めシステムは、Ｓｚａｆｒａｎｓｋｉ及び同僚ら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、１０５９−１０６３）、並びにＫａｐｌａｎ及び同僚ら（１９９９、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１６、１３５−１４０）によって記載されている。
【００７５】
あるいは、細菌細胞において機能性の誘導性システムを用いて、特定機能に関与する遺伝子の発現を制御することができる（例えばＴ−ＤＮＡ伝達又はアミノ酸などの代謝産物の生合成）。実際に、変異体株（例えば栄養要求性変異体又はｖｉｒＥ２遺伝子機能欠損変異体）を作製するために細菌細胞から遺伝子を削除するかわりに、遺伝子を調節可能プロモーターの制御下に置くことができる。そのような調節可能プロモーターからの目的遺伝子の発現は、この場合テトラサイクリン又はＩＰＴＧのような小分子であり得る補完因子の適用を介して制御することができる。例えば十分に記述されたｔｅｔ及びｌａｃリプレッサーに基づいた細菌の調節可能システムのさまざまな改変を用いて、アグロバクテリウム細胞において目的遺伝子の発現を制御することができる。
【００７６】
アグロバクテリウムに加えて、本発明は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達のために遺伝子操作された他の微生物に拡大適用することができる。例えば、近年、アグロバクテリウム属以外の共生細菌種を改変して、多くの多様な植物への遺伝子伝達を介在することができることが示された（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ、４３３、６２９−６３３）。これらの細菌は、安全化Ｔｉ−プラスミド及びバイナリーベクターを獲得することによって、遺伝子伝達に適任となっている。
【００７７】
植物ＲＮＡウイルス（例外はウイロイド−植物細胞核で増幅する小さな非コードＲＮＡ−である。概説として、Ｄｉｅｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．、１５、２０３−２２０；Ｆｌｏｒｅｓ，Ｒ．、２００１、ＣＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、３２４、９４３−９５２を参照されたい）は細胞核では発生せず、細胞質で発生することが知られている。したがって、ＲＮＡウイルスの配列は、プレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡの前駆体を含めたプロセシングされたＲＮＡの、細胞質内の輸送を含めたプロセシング工程に関与するモチーフの存在により、核のＲＮＡプロセシングに抵抗するように適合されていない。５’端キャッピング、スプライシング、３’端生成、ポリアデニル化、分解、塩基及び糖による修飾、並びにエディティング（プラスチド及びミトコンドリア内）などのプロセシングイべントが集中的に研究されている。しかしながら、そのようなイベントの多くの要素は依然として不明確のままである。核におけるプレｍＲＮＡの最も劇的な変化は、介在ＲＮＡ配列（イントロン）が初期転写産物から除去され、同時にエクソンが連結されるプロセスである、プレｍＲＮＡのスプライシングのあいだに起こる。スプライシングは、ウリジン（uridilate）に富んだ核の小さなリボ核タンパク質粒子を含む複合体構造であるスプライソームによって介在される。スプライソームは２つの連続工程でスプライシング反応を行う：第１工程−上流エクソン／イントロン接合部の５’スプライス部位を切断してラリアート形成し、第２工程−イントロン／下流エクソン接合部の３’スプライス部位を切断して上流と下流のエクソンを連結する（概説として：Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５、３６７−４０９；Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＧＧ．＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９９６、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１−４１を参照されたい）。イントロン配列に隣接する５’及び３’スプライシング部位のジヌクレオチド（５’／ＧＵ；ＡＧ／３’）は高等植物で高度に保存されており、単一Ｇ置換により関与する部位のスプライシング活性を放棄するであろう。驚くべきことに、植物と動物とのあいだでスプライシング部位が高度に保存されているにもかかわらず、植物において異種イントロンは通常スプライシングされないか、又は不正確にスプライシングされる（ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ，ＶＬ．ら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５６、２５３−２６５；Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｊ．、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０４２−２０５１）。植物ウイルスＲＮＡは、核のＲＮＡプロセシング装置に抵抗するための進化的圧力下になかったことを考慮すると、これらのＲＮＡは、いったん核環境に置かれると、スプライシングを含めたそのようなプロセシングの対象となる可能性が非常に高い。この状況は、核遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物とは全く異なる。後者の転写産物は、一連のＲＮＡ修飾が核で起こるにもかかわらず、機能性を保つように進化的に適合しているためである。しかしながら、そのような修飾は、ウイルスＲＮＡレプリコン形成に劇的な結果を招くことができる。異種遺伝子のための発現ベクターを作製するために植物ウイルス遺伝子を再操作すると、ウイルス起源のＲＮＡ配列と相互作用する配列を更に追加するため、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの不安定性が更に増し、複製できない欠損ＲＮＡを産生するであろう。本発明は、発現ベクターをＤＮＡ前駆体として植物又は植物細胞に導入し、一過性発現又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを提供する場合に機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を顕著に上昇させる改変を発現ベクターに施すことによって、こうした問題に取り組んでいる。ウイルス由来配列の改変は、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの効率を高めるための最善策であり得る。改変は、直接的（例えばＲＮＡウイルス由来配列内）でも間接的（例えば非ウイルス起源の配列内）でもよいが、間接的改変は、ウイルス起源の配列に安定効果をもたらし得る。本発明では、ＲＮＡレプリコン形成効率の上昇に不可欠であるため、ＲＮＡウイルス由来配列内の改変に主に焦点をあてる。
【００７８】
驚くべきことに、潜在的に問題のある領域が存在する証拠を発見するための第１の試みは成功した。そして、更に驚くべきことに、予想外にも桁違いの改善を発見したことにより、実験的に確認した。発現ベクターｐＩＣＨ８５４３（実施例１、図２Ａ）のＲＮＡウイルス由来配列を、潜在イントロンとＲＮＡスプライシング部位の存在に関し、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析することにより、核ＲＮＡプロセシング装置によってスプライシングされ得るイントロン様領域の存在が示された（図６の丸で囲んだ領域を参照されたい）。植物ウイルスＲＮＡ配列内で潜在的に問題のある領域（選択された位置）を同定するために使用できるプログラムは、さまざまな生物のためのエクソン／イントロン予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）又はスプライシングシグナル予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｗｗｗｓｐｌｉｃｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）のように、他にも多数存在する。
【００７９】
既存のプログラムは全て理想的ではなく、誤りがちであることを考慮すると、潜在的に問題のある領域は実験的に決定することもできる。これは、ＲＴ−ＰＣＲで（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）、又はさまざまな転写産物の濃度を正確に定量するのに好適な、リアルタイムＰＣＲと呼ばれる進歩したバージョン（Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、９９５−１００１）で、核環境で試験されているＤＮＡベクター由来の転写産物を解析することによって行うことができ、好ましくはＰＣＲ増幅産物の配列決定を伴う。本発明の機能保存的な相違は、例えばＡ／Ｕに富んだ領域（イントロン様）からＧ／Ｃに富んだ領域（エクソン様）への置換を伴うサイレント変異を導入することにより、例えばイントロン様配列をエクソン様配列配列で置換することによって、ＲＮＡプロファイルを劇的に変化させる（図３の丸で囲んだ領域を参照されたい）。植物のイントロンはエクソンと異なり、通常Ａ／Ｕに富んでいる（Ｃｓａｎｋ，Ｃ．ら、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１８、５１３３−５１４１；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３）が、例外がある。例えば単子葉植物では、Ｇ／Ｃに富んだイントロンが発見されている（Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０、２６３５−２６４４）。本発明のこの態様を実施するには、Ａ／Ｕに富んだ領域には、Ａ／Ｕ含量が少なくとも５５％以上の、少なくとも長さ２０ヌクレオチドの配列である長い区間だけでなく、純粋にＡ／Ｕを含有する配列の並びの６〜１９ヌクレオチドの、より短い区間（「アイランド」）も含まれる。本発明におけるＡ／Ｕ内容は、ＵよりもＡに富んだ配列、又はＡのみに富んだ配列、そして逆にこの定義によってカバーされる全ての配列を意味する。実施例６では、Ａ／Ｕに富んだ領域の改変が、ＧＦＰを発現する細胞数を少なくとも１０倍増加させることを立証する。これは、図１０において、ｐＩＣＨ１５４６６（改変ベクター、図２Ａ）でアグロ浸潤させた領域と、ｐＩＣＨ１４８３３（対照ベクター、図２Ａ）でアグロ浸潤させた領域とを比較することによって立証される。移行タンパク質（ＭＰ）の除去は、初期感染部位から隣接細胞への細胞間移行は起こらないため、機能性ＲＮＡレプリコンを有する初代培養細胞の正確な計数を可能にする。実施例７では、多くの潜在スプライス部位（図６Ｂ）を含有し、移行タンパク質（ＭＰ）のサブゲノムプロモーターをカバーする他のＵに富んだイントロン様領域の改変を行った（図８、丸で囲んである）。この改変は、ウイルスベクターｐＩＣＨ１５９００からのレプリコン形成頻度上昇に劇的な効果を及ぼす。プロトプラスト計数実験（実施例７）で立証したように、試験した２つのタバコ種−ベンサミアナタバコ及びタバコに関し、非改変ベクターｐＩＣＨ１４８３３と比較して、およそ１００倍増加した（図１０Ａ、Ｂの対応の浸潤領域を参照されたい）。一般に、本発明に記載のアプローチを用いることにより、ＲＮＡレプリコン形成頻度をおよそ３００倍上昇させ、即ち、機能性レプリコンを有する細胞の割合を約０．２％（対照ベクター）から５０％（改変ベクター）以上に増加させることができた。これは限界ではなく、１００％の頻度に達することも非常に現実的であると考えられる。
【００８０】
そのように高率のレプリコン形成は、同一植物細胞内で２つの異なるＲＮＡレプリコンから２以上の異なる遺伝子を発現させる、例えば植物ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを用いて異なる遺伝子を共発現させる道を開く。同一細胞で同時に２以上のレプリコンの同調した開放を達成することは、「先着順」の原則はウイルスベクターでは特に真実であるため、そのような共発現に重要である。異なるウイルスベクターは通常伝播領域で重ならないため、又はそのような重なりはわずかであるため、浸透移行も細胞間移行も役立たない。単純な計算によって、同一植物細胞において２つのレプリコンから２つの目的配列の共発現を達成するための、本発明に記載の技術の重要性を立証する。機能性レプリコン形成頻度が全細胞の０．２％である非最適化ウイルスベクターの場合、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２つの遺伝子を共発現する細胞の割合は０．２×０．２＝０．０４％であるが、機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇した構築体の場合（全細胞の５０％即ち１／２）、上記細胞の割合は０．５×０．５＝０．２５、即ち２５％であり、例えば約６２５倍高いであろう。最高性能ベクターを用いると（例えばｐＩＣＨ１６１９１、図１０Ｃ）、機能性レプリコンを有する細胞の割合はおよそ９０％に達することもある（図１０Ｃ、右上）。これは、２つの独立したレプリコンから２つの異なる目的配列を発現させるためにそのようなベクターを用いることにより、全細胞の８０％で共発現が起こり得ることを意味している。技術を更に改善し、１００％共発現を達成できる可能性は非常に高いと考えられる。
【００８１】
ＲＮＡレプリコンから発現されるべき異種目的配列における機能保存的な相違は、特にレプリコン機能に関する配列における相違と組み合わせて、ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるために使用し得ることに留意することは重要である。例えば、レプリコンの形成及び／又はプロセシングに必要な改変を目的配列内に導入することができる。
【００８２】
本発明の他の態様では、核イントロンをレプリコン機能に関する配列に挿入することにより、レプリコン形成頻度が改善された（実施例８）。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のコード領域へのイントロンの組み込み（実施例８及び１２）は、改変ベクター（図２Ａ、ＢのｐＩＣＨ１５０３４、ｐＩＣＨ１５０２５、ｐＩＣＨ１５４９９）からのレプリコン形成頻度を顕著に（少なくとも５０倍）上昇させた（図１０Ａ、Ｂ）。シロイヌナズナ由来の６つの挿入イントロンを含有するベクターのＲＮＡプロファイルを図９に示す。他の実施例（実施例１１）では、ＭＰ配列へのイントロンの挿入により、レプリコン形成頻度を少なくとも１００倍上昇させる。
【００８３】
本発明を実施するために多くの核イントロンを用いることができる。そのようなイントロンの例としては、限定されるものではないが、イネｔｐｉ Ａｃｔ１遺伝子及びｓａｌＴ遺伝子由来のイントロン（Ｒｅｔｈｍｅｉｅｒら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、８９５−８９９；Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００、４５９−４６７；ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２、１６３−１７１）；トウモロコシＡｄｈ１遺伝子、ＧａｐＡ１遺伝子、アクチン遺伝子、及びＢｚ１遺伝子由来のイントロン（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、１１８３−１１２００；Ｄｏｎａｔｈら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、６６７−６７６；Ｍａａｓら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１９９−２０７；ＷＥ Ｃｏｈｎ、Ｋ Ｍｏｌｄａｖｅ監修、『核酸研究と分子生物学の進歩』、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ．２２９−２５７中のＳｉｎｉｂａｌｄｉ＆Ｍｅｔｔｌｅｒ、１９９２）；ペチュニア ルビスコ遺伝子ＳＳＵ３０１由来のイントロン（Ｄｅａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１、２０１−２０８）；シロイヌナズナＡ１ ＥＦ１α遺伝子、ＵＢＱ１０遺伝子、ＵＢＱ３遺伝子、ＰＡＴ１遺伝子由来のイントロン（Ｃｕｒｉｅら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８、４２８−４３６；Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１、８９５−９０６；Ｒｏｓｅ＆Ｌａｓｔ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、４５５−４６４）；並びに他の多くのものが挙げられる。合成イントロンも本発明に用いることができる。最小の使用可能イントロン又はそれらの部分は、通常、内部のイントロン配列に隣接する、スプライスドナー部位及びアクセプター部位に限定され得る。好ましくはイントロンのサイズは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは１００〜２００ヌクレオチドである必要があるが、実際にはイントロンのサイズに限定はない。しかしながら、構築体のサイズは遺伝子操作に好適なように維持される必要がある。イントロンの由来、その構造及びサイズは、ベクターの性質に応じて個々に選択することができる。選択したイントロン又は対応のイントロン部分の効率を試験するために一過性発現実験を用いることができる。
【００８４】
上記改変の効果は累積的であり、例えばイントロンの挿入をＭＰサブゲノムプロモーターの改変と組み合わせると、レプリコン形成頻度をおよそ３００倍に上昇させることができる（実施例９）。ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためのイントロン挿入に好ましい領域は、本明細書において選択された領域という。そのような位置は「イントロン様」構造を含有することができる。これは、ＭＰ、実際にはＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある領域の極近傍にイントロンを挿入することによって確認される（実施例１１）。レプリコン形成頻度に１００倍の上昇が観察された。「エクソン様」領域へのイントロンの挿入は、イントロン様領域への挿入のような明白な効果を有さない（実施例１０）。
【００８５】
目的配列の一過性発現に適格な、即ち本発明の欠損アグロバクテリウム株の補完に適格な植物宿主の作製に必要な代理機能を有するトランスジェニック植物宿主を作製するためにさまざまな方法を用いることができる。アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ−プラスミドにより（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、又は粒子銃若しくは微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）により、植物細胞をベクターで形質転換することができる。マイクロインジェクション（ＷＯ０９／２０９６９６号；ＷＯ０９／４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８／７０６６１４Ａ１号）、又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換などのような他の植物形質転換法も用いることができる。ベクター送達方法の選択は、形質転換される植物種に依存し得る。例えば、微粒子銃は通常単子葉植物の形質転換に好ましいが、双子葉植物には、アグロバクテリウム介在形質転換が一般に良好な結果を与える。
【００８６】
以下の実施例では、タバコ細胞へのアグロバクテリウム介在ベクター（異種ＤＮＡ配列）送達を用いた。しかしながら、ベクターは、目的植物種の安定な又は一過性の形質転換又はトランスフェクションに好適な標準技術にしたがい、植物に組み込むことができる。双子葉植物の形質転換技術は当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウムに基づいた技術とアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラスト又は細胞による外来遺伝物質の直接取り込みが含まれる。これらの技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを介在する取り込み、粒子銃介在送達、及びマイクロインジェクションが含まれる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、３、２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９、１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７、７０−７３（１９８７）に記載されている。いずれの場合にも、形質転換細胞は標準技術を用いて完全な植物に再生される。
【００８７】
アグロバクテリウム介在トランスフェクションは、そのトランスフェクション効率の高さと多くのさまざまな種を用いる広範な有用性のために、双子葉植物のトランスフェクションに好ましい技術である。アグロバクテリウムによって日常的に形質転換され得る多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファ、及びポプラが含まれる（ＥＰ ０ ３１７ ５１１号（ワタ）、ＥＰ ０ ２４９ ４３２号（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９号（アブラナ属）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
【００８８】
本発明の例では、目的遺伝子を一過性発現させるためのＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在送達法であるアグロ接種を用いた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１１１２８−１１１３３）。アグロ接種は、小規模から中規模の組換えタンパク質産生システムだけでなく、ベクター最適化の要素としても非常に有用なツールであり、構築体のさまざまな変異体を用いて迅速な結果を得ることが可能である。
【００８９】
アグロ浸潤を実施するには、先行技術に記載のように、通常、アグロバクテリウムの一晩培養物を準備する（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１、６８５３−６８５７）。通常、一晩培養物の光学密度（Ｏ．Ｄ．）は波長６００ｎｍで３〜３．５単位に達し、アグロ浸潤の前に３〜５倍に希釈され、５〜９×１０９コロニー形成単位を生ずる（Ｔｕｒｐｅｎら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４２、２２７−２４０）。発明者らは、１０２倍、１０３倍、及び１０４倍希釈も、特に本明細書に記載のような機能保存的な相違を有するレプリコン機能に関する配列との組み合わせにおいて、非常に効率的に作用することを発見した。驚くべきことに、浸潤させたタバコの葉におけるベクターはその性能を更に向上させ、形質転換アグロバクテリウムの希釈率を上げるとＧＦＰの良好な収率を与えた。例えば、１０３倍希釈は１０２倍希釈よりも良好な結果を与えた。１０２倍希釈は１０倍希釈よりも良好なＧＦＰ収率を生ずる。この現象に対する可能な説明は、おそらく高濃度の病原性細菌に対する植物の応答の結果としての、非常に濃縮したアグロバクテリウム懸濁液の、ウイルスベクターの機能、例えば細胞間移行に対する負の効果である。この現象は、アグロ浸潤を介する組換えタンパク質産生に必要なアグロバクテリウム量を、先行技術の方法と比較して、少なくとも１桁軽減させるため、大規模な工業的タンパク質発現方法に特別な価値がある。
【００９０】
実施例１３では、不活化ウイルスＲＮＡに基づいたレプリコンのＤＮＡ前駆体について示す。レプリコンは本発明にしたがって最適化される。更に、レプリコンは、非コンピテント植物、例えばゲノムＤＮＡに安定に組み込まれたリコンビナーゼを提供する発現カセットを含有しない植物へアグロ送達された場合に目的配列の発現を妨げる構造を含有する。機能性ＲＮＡレプリコンの形成と同様に、発現は、部位特異的組換えにより構築体の一部を反転させることによって誘引することができる。この反転は、２つのイントロンの形成と、機能性目的配列の集合をもたらすことができる。実施例１３に記載のシステムは、ウイルスベクターの最適化だけでなく、工業的タンパク質又は医薬用タンパク質を発現させるための植物発現システムを用いる高度な生物学的安全性基準の達成方法を示している。
【００９１】
リコンビナーゼの転写は、誘導性の又は他の調節された（例えば発生学的に調節された）プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性プロモーターは、その誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるものと、生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるものである。第１のカテゴリーの例は、熱誘導性（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性（ＵＳ０５８４７１０２号）のプロモーター、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９／３２１３３４号）、並びにテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学誘導性システムの分野における最新の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れることができ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的誘導性システムの概説として：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１４６−１５１）及びＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、６、１６９−１７７）を参照されたい。誘導性プロモーターの他の例は、植物の病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、植物を、病原体の攻撃に対する応答における植物シグナル伝達経路の重要成分であるサリチル酸で、又はＰＲ遺伝子発現を誘引可能な他の化学化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）（ＵＳ０５９４２６６２号）で処理することによって誘導することができる。
【００９２】
本発明は、実施例に記載のＴＭＶに基づいたベクターに限定されず、他の植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンにも適用可能である。他の植物ウイルスＲＮＡ配列の解析（実施例１４、図１３、図１４）により、ＴＭＶに関して記載したものと類似の選択された位置及び植物核遺伝子のプレｍＲＮＡの配列を示す（図１２）。これは、本発明に記載のアプローチを用いて、問題のある領域を除去／置換することにより、及び／又は核イントロンを挿入することにより、実際に植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンを解消することができる強力な証拠である。
【００９３】
本発明を用いて植物又は植物細胞において発現させることができる目的タンパク質、それらの断片（機能性又は非機能性）、及びそれらの人工誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合型デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスホリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４と相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はそれらの活性断片若しくは変異体）、オイル修飾酵素（脂肪酸不飽和化酵素、エロンガーゼなどのような）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸、及び多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、不活性プロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における改質繊維、バチルス・スリンギエンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイル アルコール脱水素酵素、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ 還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア・ヘルビコラ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、ポリヒドロキシルアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成機能又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナ属ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポティウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異体ジェミニウイルス レプリカーゼ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物のＣ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、Ｄ６−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、など；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣ脱アミノ酵素、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージ由来の他の多くの酵素。
【００９４】
本発明は、工業的酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼなど）、及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸タンパク質など）を含めた、商業的に価値があり、医薬的に重要なタンパク質の分子農業及び精製のために用いることができる。ヒト又は動物の健常なタンパク質は、本発明で記載したアプローチを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、病原性微生物由来のものを含めた抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカインとその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素学的に活性なリソソーム酵素、線溶性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシン、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型、及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質、トロンビン、ヒト胃リパーゼ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、セルピン、ラクトフェリン、リゾチーム、オレオシン、プロトロンビン、α−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００９５】
本特許出願で優先権を主張する欧州特許出願第０４０１６０１１．１号の内容は、本明細書にその全体が援用される。
実施例
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するために提示するものである。必要に応じて改変や変形を行うことができる。
【実施例１】
【００９６】
ＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性のトバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈透化ウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８．２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡは、ロシアのモスクワ大学のＡｔａｂｅｋｏｖ教授から入手した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターは、いくつかのクローニング工程で作製した。得られた構築体ｐＩＣＨ８５４３（図２Ａ）は、順に：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター由来の７８７ｂｐ断片（ＡＣＴ２、参考文献Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためチミン５６０６がシトシンに変わっている）、配列「ｔａａ ｔｅｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’−非翻訳領域（３’−ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。断片全体を、ＣａｒｂＲ ｐＢＩＮ１９由来のバイナリーベクターであるｐIＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだクローニングした。ｐＩＣＨ８５４３でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。３ｄｐｉで出現したＧＦＰ蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、たとえ浸潤領域の大部分の細胞がウイルスの複製と移行により最終的にＧＦＰを発現しても、ＧＦＰを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、ウイルス複製を開始したのはわずかな画分の細胞のみであった。ベンサミアナタバコの葉に３５Ｓプロモーター制御下のＧＦＰ遺伝子を浸潤させることにより、浸潤領域のほとんど全ての細胞においてＧＦＰが発現するため（図示していない）、限定要因は植物細胞へのＤＮＡ送達でないことが明らかになった。
【００９７】
この観察結果について確認するため、ＭＰに変異を含有するウイルスベクター構築体を作製した。ｐＩＣＨ１４８３３と呼ばれるこの構築体は、ｐＩＣＨ８５４３に類似するが、ＭＰ遺伝子における、ＭＰに存在するＥｃｏＲＩ部位の上流の３８９ｂｐの欠失により異なっている。この欠失を含めたＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を配列番号１として付録に示す。ウイルス構築体全体（ＡＣＴ２プロモーターからＮｏｓターミネーターまで）を、ｐＢＩＮ１９由来ＫａｎＲ バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ４９のＴ−ＤＮＡの左の境界と右の境界とのあいだにクローニングした。ＭＰ内の欠失のために、この構築体から産生されるレプリコンは細胞間移行できないが、細胞内で自律複製可能である。ＭＰを、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターからトランスで提供すると、細胞間移行を回復させることができる。
【００９８】
ＭＰ発現構築体を作製するために、クローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲにてＴＶＣＶ ＭＰ遺伝子を増幅させ、３５Ｓプロモーターの制御下でバイナリーベクターにサブクローニングした。ｐＩＣＨ１０７４５と呼ばれる得られた構築体（図示していない）及びｐＩＣＨ１４８３３でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ１４８３３単独で浸潤させることにより、浸潤領域内にわずかなＧＦＰ発現細胞が出現した。浸潤領域から作製されたプロトプラストを計数することにより、合計５００個プロトプラストのうち、わずか１〜３個のプロトプラストがＧＦＰを発現することを発見した（０．２〜０．６％）。ｐＩＣＨ１４８３３とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、それぞれの初期ＧＦＰ発現細胞から増殖した、ＧＦＰを発現する焦点が形成された。最終的に、細胞間移行により、浸潤領域のかなりの割合の細胞がＧＦＰを発現した（図１０Ａ）。
【００９９】
ロシアのモスクワ大学のＡｔａｂｅｋｏｖ教授から入手した、上記アブラナ科植物感染性のトバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈透化ウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）の同一クローン化ｃＤＮＡを用いて、いくつかの更なるウイルスベクターを構築した。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体ｐＩＣＨ１６７０７（図２Ｃ）は、順に：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター由来の７８７ｂｐ断片（ＡＣＴ２、参考文献Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶの断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためにチミン５６０６がシトシンに変わっている）、配列「ｔａａ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’−非翻訳領域（３’−ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。完全な断片を、ＫａｎＲ ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ２９のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローニングした。ｐＩＣＨ１６７０７でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換した。形質転換アグロバクテリウム株を飽和するまでＬＢ培地中で一晩増殖させた。アグロバクテリウムを増殖させた２００μｌの一晩培養物を、マイクロ遠心機にて８０００ｒｐｍで３分間沈殿させた。沈殿を、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する１ｍｌの溶液に再懸濁させ、ＯＤをおよそ０．７とした。温室栽培ベンサミアナタバコ植物の葉に針の無いシリンジで浸潤させた。浸潤後３日目にＧＦＰ蛍光の焦点が出現した。蛍光の焦点は増殖して数日後にコンフルエントになった。
【０１００】
ＯＤ０．３〜０．４のアグロバクテリウムを有する大量の浸潤溶液（３リットル）を調製した。ポットを用いてベンサミアナタバコ植物全体を逆さにして溶液にサッと浸し、乾燥器に入れ、十分な溶液が葉に浸透するまで１〜２分間真空を施した。次に植物を取り出し、温室に置いて再生させた。浸潤後３〜４日目に、シリンジを用いて手で浸潤させた領域のように、浸潤領域に蛍光の斑点が出現した。写真は、浸潤後１０日目のそのような植物を示す（図３）。
【０１０１】
トバモウイルスなどのＲＮＡウイルスは細胞質で複製し、決して核には入らない。したがって、核のプレｍＲＮＡプロセシング装置に曝露されない環境で展開する。その結果、人工ウイルス構築体から核において産生されるＲＮＡレプリコン転写物は、ＲＮＡプロセシング装置によって認識され正しくプロセシングされることができない。その上、ウイルスベクター由来のＲＮＡレプリコンは非常に大きい：ＴＭＶに基づいたレプリコンの場合およそ７，０００ヌクレオチド。そのように大きなサイズの植物遺伝子は非常にわずかであり、そのような遺伝子の大部分は、プレｍＲＮＡのプロセシングを容易にし、核から輸送し、プロセシングされた転写産物の安定性を向上させるイントロンを含有する。したがって、正確なプロセシングと、正確にプロセシングされた転写産物の核から細胞質への輸送の効率を向上させるプレｍＲＮＡの改変は、ウイルス複製を開始する細胞数の増加をもたらすであろうという仮説を立てた。結局、核へのDNA送達 後、ウイルス複製をより効率的に開始できるＲＮＡウイルスに基づいたベクターを作製するために使用できるアプローチは２つあることがわかる：（１）１つのアプローチは、無用のプロセシングイベント（潜在スプライス部位を用いた選択的スプライシングイベント、又は中途終止イベントなど）を誘導し得る配列特徴の除去である；（２）第２のアプローチは、正しくプロセシングされる転写産物量を増加させ、ＲＮＡの核から細胞質への輸送を改善させ、及び／又は転写物の安定性を向上させるイントロンの付加である。
【実施例２】
【０１０２】
ＴＭＶに基づいた改良ＲＮＡベクターの構築
目的配列が浸潤領域で発現する速度を向上させるために、９１〜４４３ヌクレオチドのサイズの１６のシロイヌナズナ イントロンをベクターの位置１〜１６に付加した：（ＴＶＣＶ配列に対する位置、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７）：１、ｂｐ２０９；２、ｂｐ４２３；３、ｂｐ８２８；４、ｂｐ１１６９；５、ｂｐ１３７８；６、ｂｐ１６２２；７、ｂｐ１８４４；８、ｂｐ２２２８；９、ｂｐ２５８９；１０、ｂｐ２９４４；１１、ｂｐ３１４３；１２、ｂｐ３３８１；１３、ｂｐ３６７２；１４、ｂｐ３８５０；１５、ｂｐ４２９９；１６、ｂｐ４４９７；１７、ｂｐ５０９９；１８、ｂｐ５２８７；１９、ｂｐ５４４４。得られた構築体ｐＩＣＨ１８７１１（図２Ｃ）を、さまざまな段階の（播種後１７〜３５日目）いくつかのベンサミアナタバコ植物の真空浸潤に用いた。ＧＦＰ蛍光は２日後に出現し、浸潤後６日目に非常に強かった。写真は、浸潤後４日目を示す（図４）。ＧＦＰ蛍光は、非改良ベクターｐＩＣＨ１６７０７よりも非常に速く（浸潤後４〜６日）葉領域全体を覆った。改良ウイルスベクターの詳細な説明は、近年公表された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３、７１８−７２３）。
【０１０３】
植物全体の代わりに、ベンサミアナタバコ植物の枝（茎及び葉）を真空浸潤させた。幹の基部を１杯の水の中に入れることによって幹を回復させた。ＧＦＰは３日後に葉に出現し、植物全体ではなく植物の部分を目的遺伝子の発現に用いることができることを示した。
【実施例３】
【０１０４】
アグロバクテリウムによって送達されたウイルスベクターの真空浸潤を用いた薬用タンパク質の発現
医薬的に関心のある２つのタンパク質を、ＧＦＰの代わりに上記改良ベクター中にクローニングした。第１のタンパク質ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（配列 Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１５）のクローニングによりベクターｐＩＣＨ１７９９１を得た（図２Ｃ）。第２のタンパク質ヒトインターフェロンα（配列 Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｖ００５４８）のクローニングによりベクターｐＩＣＨ１９０８１を得た（図２Ｃ）。この構築体では、インターフェロンの最初の１７アミノ酸（ＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＫＳＳＣＳＶＧ）が、シロイヌナズナ カルレティキュリン アポプラスト標的配列（ｍａｔｑｒｒａｎｐｓｓｌｈｌｉｔｖｆｓｌｌｖａｖｖｓａｅｖ）で置換されている。構築体をアグロバクテリウム株 ＧＶ３１０１に挿入し、植物全体の浸潤に用いた。両方のタンパク質に関し、高レベルのタンパク質発現が得られた。ｐＩＣＨ１７９９１に関し、たとえタンパク質の毒性が浸潤領域で細胞死をもたらしても、浸潤葉組織１ｇあたり１ｍｇのｈＧＨという高レベルの発現が得られた。
【実施例４】
【０１０５】
ＭＰを欠失するベクターによる植物全体の浸潤
ｐＩＣＨ１７８１１におけるＭＰの初めのＡｖｒＩＩ部位にフレームシフトを作製し（図２Ｃ）、構築体ｐＩＣＨ１８７２２を得た（図５）。このフレームシフトはＭＰ機能を完全に排除しており、この構築体の浸潤により、個々の細胞のみにおいて複製と発現をもたらす。しかしながら、イントロンの存在のために、多数の細胞が依然としてＧＦＰを発現する。
【０１０６】
ＴＶＣＶのＭＰコード配列を、クローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲにて増幅し、３５Ｓプロモーターの制御下、バイナリーベクターにサブクローニングしてプラスミドｐＩＣＨ１０７４５を得た。ｐＩＣＨ１８７２２とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、少なくともＭＰが一過性に発現しているあいだは細胞間移行が完全に回復する。ｐＩＣＨ１０７４５にてベンサミアナタバコを安定に形質転換した。ＭＰを発現する完全な形質転換体にｐＩＣＨ１８７２２を浸潤させることにより、野生型植物の浸潤はウイルスベクターの細胞間移行をもたらさないが、野生型植物全体にｐＩＣＨ１８７１１を浸潤させた場合と同様のＧＦＰ発現をもたらした（図１６を参照されたい）。
【実施例５】
【０１０７】
目的遺伝子の一過性発現を提供するための変異体アグロバクテリウムの補完
ａ）ＶｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物宿主によるトランス補完
ＶｉｒＥ２遺伝子を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８ Ｔ−ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号ＡＥ００９４３７、ｂ．ｐ６３６８〜８０３８）のＤＮＡ調製物からＰＣＲで増幅し、ＴＶＣＶのＭＰ遺伝子を置換したベクターｐＩＣＨ１０７４５にクローニングした。得られた構築体ｐＩＣＨＶｉｒＥ２（図１５）を、選択剤として５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）、及びベンサミアナタバコ植物のアグロバクテリウム介在葉ディスクトランスフェクションに用いた、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子欠失アグロバクテリウム・ツメファシエンス固定した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。ＭＰにフレームシフトを有する構築体ｐＩＣＨ１８７２２（図５）にてＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を形質転換した。この欠損は、ＶｉｒＥ２遺伝子の欠失により引き起こし、野生型植物とｐＩＣＨ１０７４５で形質転換した植物のアグロ浸潤実験に用いた。
【０１０８】
コンピテント及び野生型宿主を用いて、葉表面の同一領域あたりのＧＦＰ発現細胞数を計数することにより、又は（より正確には）対照及び改変ウイルスベクターを用いたウイルス複製の開始頻度を比較するために図１０Ｃに示すように、コンピテント及び野生型宿主におけるＧＦＰ発現プロトプラストの割合を測定して比較することにより、一過性発現効率の比較を行った。一過性発現を提供するＴ−ＤＮＡ送達のそのような相対頻度は、生物学的安全性を構築していないシステムとの比較において、システムの生物学的安全性レベルの測定として用いることができる。
【０１０９】
ＶｉｒＥ２機能を欠損した他の多くのアグロバクテリウム株、例えばＶｉｒＥ２の挿入変異を有する株（Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、１９８８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０、２６５９−２６６７）又はｖｉｒＥ２機能を抑制するｏｓａ遺伝子を有するプラスミドｐＳＡを有する株（Ｌｅｅ、Ｌ−Ｙら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、１８６−１９６）をこの実験に用いることができる。更に、Ｔｉプラスミド（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０６５；ＮＣ００１２７７）及び染色体ＤＮＡ（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０６３；ＮＣ００３０６３）を含めたアグロバクテリウムゲノム配列情報の利用可能性により、相同組換えによって機能性遺伝子をその変異体型に置換することで、あらゆる種類の変異体を作製することができる。さまざまに希釈した、ＶｉｒＥ２含有及びＶｉｒＥ２欠損アグロバクテリウム株の一晩培養物を比較することによって、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達効率に対するＶｉｒＥ２遺伝子の効果について試験した。アグロバクテリウム株はともにｐＩＣＨ１８７１１ウイルスベクターをバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域内に含有する（図２Ｃ）。そのような比較の結果を図１７に示す。ＶｉｒＥ２欠損アグロバクテリウム株によるＴ−ＤＮＡ伝達効率が、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子含有アグロバクテリウムと比較して、少なくとも１０，００００倍低下していることは写真から明らかである。コンピテント（ｐＩＣＨＶＩＲＥ２で形質転換されている）及び野生型のベンサミアナタバコ植物の葉における一過性発現効率の比較を行い、ｐＩＣＨＶｉｒＥ２で形質転換したトランスジェニック植物からのＶｉｒＥ２遺伝子機能の非常に効率的なトランス補完を示した（図１８）。異なる希釈系列（示していない）を用いて実験することにより、トランスジェニック宿主からのＶｉｒＥ２遺伝子機能のトランス補完効率が、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子を有するアグロバクテリウム株の使用に匹敵することを立証した。
【０１１０】
ｂ）ＶｉｒＥ２を発現する野生型アグロバクテリウム株との混合によるトランス補完
ｐＩＣＨ１８７２２を有するｖｉｒＥ２機能欠損株を、ｖｉｒＥ２機能をトランスで補完するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８と混合することによって、ｖｉｒＥ２機能の補完を達成した以外は、先の実施例に記載の実験を反復した。新たに接種した両アグロバクテリウム株の培養物を光学密度ＯＤ６００が２．５〜３．０になるまで一晩増殖させ、植物組織の浸潤のために等量で混合した。浸潤用最終混合物を５０倍、１００倍、１０００倍、及び１００００倍に希釈した。植物組織の浸潤をベンサミアナタバコ及びタバコの葉にて行った。ｐＩＣＨ１８７１１バイナリーを有するΔＶｉｒＥ２株（機能性ＭＰを有する）を用いて同様の実験を行った。この実験の結果を図１９に示す。ｐＩＣＨ１８７１１バイナリーを有する変異体株（Ｔ−ＤＮＡ＋、ΔＶｉｒＥ２）と野生型株（Ｔ−ＤＮＡ−、ＶｉｒＥ２）との共浸潤は、野生型株によるＴ−ＤＮＡの直接送達（Ｔ−ＤＮＡ＋、ＶｉｒＥ２）よりも、Ｔ−ＤＮＡ送達がまさに効率的であることは明らかである。
【実施例６】
【０１１１】
イントロン様配列の除去により、細胞質におけるウイルスＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇する
ｐＩＣＨ４３５１由来のＲＮＡレプリコンの配列をＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析したところ、選択的スプライシングイベントを誘導し得るいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の１つは、ＲｄＲＰの初めにある、０．６ｋｂのウリジンに富んだ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のヌクレオチド８２７〜１４６２に対応）である（図６Ａ）。ｐＩＣＨ１４８３３において、オリジナル配列とは異なる、ＰＣＲで変異させた配列で、５４ヌクレオチド置換によりこの領域を置換した（付録に配列番号２として示す配列、図７）。５２ヌクレオチド置換は、Ｔに富んだ配列を、よりＧＣに富んだ配列に置換するために行った。ＲｄＲＰのタンパク質配列を変えないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。この変異断片も、推定潜在スプライスドナー部位とアクセプター部位をそれぞれ除去するために導入された２つのヌクレオチド置換（８２９位と１４５９位；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）を含有する。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンｐＩＣＨ１５４６６（図２Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５（トランス移行タンパク質）と共に、又は伴わずに、ベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させた。浸潤後８日目に、ｐＩＣＨ１５４６６を浸潤させた領域において、ＧＦＰ発現細胞数の１０倍増加を観察した（ｐＩＣＨ１４８３３と比較、図１０）。これは、ウイルスレプリコンからイントロン様配列を除去することにより、無用の選択的スプライシングイベントを妨げ、より効率的にウイルス複製を開始することを示唆している。ｐＩＣＨ１５４６６とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、非改変レプリコンと同様の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、ＲＮＡ配列の改変がウイルスベクターの細胞間移行に影響を及ぼさなかったことを示している。
【実施例７】
【０１１２】
ＭＰサブゲノムプロモーターにおけるイントロン様配列の除去
第２の潜在的に問題のある領域はＭＰサブゲノムプロモーターに対応する（図６Ｂ）。この領域は非常にＴに富んでおり、イントロン配列に非常に近似している。その結果、多くの潜在スプライスドナー部位及びアクセプター部位が、イントロン予測プログラムによって隣接配列中に予測される。残念ながら、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなくこの領域を容易に改変することはできない。サブゲノムプロモーターを構わずに全領域を完全に変異させ、ＭＰをトランスで提供し、予想されるＭＰ発現の喪失を補償することにした。この構築体からＭＰは発現しないため、目的遺伝子の発現を駆動するために必要なＣＰサブゲノムプロモーターを含有する３’配列以外は、ＭＰ配列の大部分も削除した。したがって、ｐＩＣＨ１４８３３の３８３ｂｐ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のｂｐ４５８４〜５４５５）を２９７ｂｐ変異断片で置換した。得られた構築体ｐＩＣＨ１５９００（図２Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５と共に、又は伴わずに、ベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させた。興味深いことに、ｐＩＣＨ１４８３３を浸潤させた葉領域と比較して、複製開始細胞数の大幅な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したＧＦＰ発現プロトプラストを計数することにより、この改変で、未改変ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、ウイルス複製開始細胞数が８０〜１００倍増加すると概算している。ｐＩＣＨ１５９００をｐＩＣＨ１０７４５（ｐ３５Ｓ−ＭＰ発現カセット）を共浸潤させ、細胞間移行によるＧＦＰ蛍光の増加を検出した。しかしながら、この増加は、細胞間移行がなくても非常に多くの細胞が既にＧＦＰを発現していたため、非常に限られていた。ｐＩＣＨ１５９００含有アグロバクテリウム懸濁液の１０００倍希釈を、ｐＩＣＨ１０７４５含有アグロバクテリウムの未希釈懸濁液と共浸潤させることにより、分離したＧＦＰ発現焦点を生じさせた。蛍光焦点は、ｐＩＣＨ１４８３３を用いて得た対照焦点と同様の明るさ及び同一サイズであった。これは、ｐＩＣＨ１５９００の改変及びＭＰのトランス送達は、複製レベル、目的配列の発現、及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を傷つけないことを示している。同一構築体（ｐＩＣＨ１４９３３及びｐＩＣＨ１５９００、ｐＩＣＨ１０７４５と共に、又は伴わずに）をタバコの葉に共浸潤させた。ｐＩＣＨ１５９００の改変は、ベンサミアナタバコの場合と同様に複製開始細胞数を増加させた（ｐＩＣＨ１４８３３との比較）。
【実施例８】
【０１１３】
イントロン付加は細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
次に、レプリコンをコードする配列部分へのイントロン付加が複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。２つの構築体ｐＩＣＨ１５０２５及びｐＩＣＨ１５０３４（図２Ａ）を作製した。いずれも、３つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの２つの異なる領域中に含有する。ｐＩＣＨ１５０２５を、ＲｄＲＰの中央にイントロンを含有するようにデザインした。一方、ｐＩＣＨ１５０３４は、ＲｄＲＰの３’端であるＭＰサブゲノムプロモーターの上流にイントロンを含有する。イントロンをシロイヌナズナ ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、予定のイントロン／エクソン接合部が重複するプライマーを用いて、ＰＣＲでウイルス配列に組み込んだ。イントロン含有断片をＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（付録の配列番号４）としてｐＩＣＨ１４８３３にサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０２５を作製するか、又はＰｓｔＩ／Ｎｃｏｌ断片（付録の配列番号５）としてサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０３４を作製した。
【０１１４】
２つの構築体をベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させ、ｐＩＣＨ１４８３３と比較した。２つの構築体はウイルス複製開始細胞数を顕著に増加させた（図１０Ａ）。この増加は、ｐＩＣＨ１４８３３に対して約５０倍の改善であると概算した。また、２つの構築体をＭＰ発現クローンとともに共浸潤させ、細胞間移行はイントロンのないクローンと同じであることがわかった。２つの構築体をタバコにおいても試験し、ベンサミアナタバコと同じ改善を観察した（図１０Ｂ）。
【０１１５】
６つのイントロン全てを含有する第３のクローンｐＩＣＨ１５４９９を作製した（図９、２Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ）。この構築体をベンサミアナタバコ及びタバコにおいて試験した。この構築体は、３つのイントロンを有する個々の構築体よりも効率的であったが、その改善は相加的ではなかった。
【実施例９】
【０１１６】
イントロン付加とイントロン様配列の除去は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる
１つの構築体におけるイントロン様特徴の除去と、追加イントロンの付加は、両タイプの改変がウイルス複製開始の向上に寄与できることを示した。ｐＩＣＨ１５４９９の６つのイントロンを、変異ＭＰサブゲノムプロモーター領域を含有するｐＩＣＨ１５９００へサブクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１５８６０（図２Ｂ）をベンサミアナタバコの葉に浸潤させたところ、ＧＦＰを発現する全てのプロトプラストのおよそ５０％〜９０％の範囲で、それぞれの親クローンよりも顕著に良好に作用することを発見した（図１０）。最高性能の構築体は、ＲｄＲＰ領域と改変ＭＰサブゲノムプロモーター領域にイントロンを含有する（ｐＩＣＨ１６１９１、図１０Ｃ）。未改変クローンとの比較で、これは８０〜３００倍の改善に相当する。また、この構築体を、ＭＰ発現構築体（ｐＩＣＨ１０７４５）と共に共浸潤させたところ、改変が細胞間移行も複製も傷つけないことを発見した。
【実施例１０】
【０１１７】
全てのイントロン付加が細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの出現頻度を上昇させるわけではない
２つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの初めに挿入し、クローンｐＩＣＨ１５４７７を得た（図２Ｂ）（この領域の配列を配列番号７として付録に示す）。この領域の配列は、イントロンを付加する前に、既に非常に「エクソン様」（例えばＧＣに富んでおり、潜在スプライス部位がない）に見える。この構築体で、ウイルス複製の開始に全く改善は見られなかった。したがって、あらゆるイントロン付加がウイルスベクターを改善するわけではない。イントロン挿入又は変異生成のために選択した位置は重要なパラメータであるように見える。例えば、ＭＰサブゲノムプロモーターのような問題のある構造の近傍領域に作製した全てのイントロン挿入又はヌクレオチド置換は大きな改善をもたらしたが、既に「エクソン様」である配列へのイントロン挿入は顕著にウイルス複製開始を改善しなかった。
【実施例１１】
【０１１８】
ＭＰ配列へのイントロン挿入はウイルスレプリコン形成頻度を上昇させる
初めに、制限酵素ＡｖｒＩＩで消化し、充填し、再連結することによって、ＭＰにフレームシフトを作製した。次にＭＰに２つのイントロンを挿入した。得られたクローンｐＩＣＨ１６４２２（図２Ｂ）をベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコン含有細胞数に約１００倍の増加を検出した。
【実施例１２】
【０１１９】
ＭＰ含有ベクターへのイントロン挿入は自律機能性クローンのウイルス複製開始頻度を上昇させる
ｐＩＣＨ１５４９９のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片ｐＩＣＨ８５４３へサブクローニングした。得られたクローン１６７００（図２Ｂ）は、ＲｄＲＰに６つのイントロンを有する完全なウイルスベクターを含有する。このクローンをベンサミアナタバコの葉に浸潤させたところ、効率的に複製を開始した。また、このクローンは、追加ＭＰをトランスで提供ことを必要とせずに細胞間移行可能であって。
【実施例１３】
【０１２０】
遺伝子操作された宿主植物におけるアグロ送達された不活性レプリコンの活性化
イントロン含有ウイルスベクター前駆体をトランスジェニック植物へアグロ浸潤させることも可能である。目的タンパク質の産生を運命付けられていない植物（例えば開放環境の植物）の偶発的感染を回避するために、ベクターの一部をアンチセンス方向に存在させた不活性クローンを作製することができる（図１１）。反転断片の先端に組換え部位とイントロン配列とを組み込むことにより、適切なリコンビナーゼを用いることによってこの断片を正しい方向に「反転」させることが可能である。組換え部位はスプライシングによってレプリコンから完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換えと転写の後、効率的に複製を開始させる。１つの具体例では、組換え部位が、目的遺伝子内であってプロレプリコンの下流に局在する。そのような立体配置は、組換え前の遺伝子発現を妨げる。ＲｄＲＰ中やプロモーターの上流のように、プロレプリコンの他の領域に組換え部位が局在する場合、他の立体配置を検討することができる。組換え部位のイントロン配列は、先に記載したように、組換え部位をレプリコンから完全に除去させる利点を有するだけでなく、ウイルス複製効率を上昇させる。リコンビナーゼ活性を提供するトランスジェニック植物宿主は、遺伝子操作して、不活性ウイルスベクター前駆体を含有するベクターと共にアグロ浸潤に用いることができる。ウイルスベクター前駆体は、遺伝子操作された植物宿主の細胞においてのみ活性化することができる。
【実施例１４】
【０１２１】
植物ウイルスＲＮＡ配列は潜在的に不安定領域を含有する
選択された植物ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを、十分に特徴付けられた植物遺伝子（ＡｔＤＭＣ１）のものと同様に、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析した。ＡｔＤＭＣ１について図１２に示すＲＮＡプロファイルは、先にｃＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列との比較によって同定した１４のイントロンの存在を明確に反映している（丸で囲んである）。２つの植物ウイルスのＲＮＡプロファイルは、植物の核環境に置かれた場合、ＲＮＡの安定性に問題を引き起こし得る領域を有することは明らかである（図１３、図１４を参照されたい）。ブロモモザイクウイルス、異なるＴＭＶ株、及び他の多くのものなど、いくつかの他の代表的植物ＲＮＡウイルス（示していない）のＲＮＡプロファイルを解析した。これらは全て、ＤＮＡ前駆体として植物細胞へ送達された場合に植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成効率を落とし得る、潜在的に問題のある領域を有している。
【実施例１５】
【０１２２】
ジェミニウイルスベクターによる植物全体の浸潤
ビーンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離体ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４に基づいた発現ベクターｐＩＣＨ４３００、ｐＩＣＨ５２０２／３、及びｐＩＣＨ５１７０（図１５）を、ＷＯ０２／０７７２４６号の実施例１０及び１１に記載したように作製した。構築体ｐＩＣＨ５１７０を、実施例５に記載のようにベンサミアナタバコ植物及びタバコ植物の安定な形質転換に用いた。構築体ｐＩＣＨ５２０２／３及びｐＩＣＨ５１７０を、ＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株に固定した。固定化ウイルスレプリコン（ｐＩＣＨ５２０２／３）を有する株を、ｐＩＣＨ５１７０で形質転換したタバコ植物全体のアグロ浸潤に用いた。トランスジェニック植物宿主は、いわゆる共通領域（ＣＲ）に局在するジェミニウイルスの複製起点を有するＧＦＰを有するＤＮＡレプリコンの複製を提供した。ＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム株の場合、非形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８と共にアグロ浸潤を行った。あるいは、ｐＩＣＨＶｉｒＥ２で形質転換したベンサミアナタバコ植物を、ｐＩＣＨ５１７０で形質転換させた植物と交配させた。両構築体由来のＴ−ＤＮＡ領域を含有するＦ１子孫をＰＣＲで選択し、アグロバクテリウム機能を有し、ｐＩＣＨ５２０２／３を有するアグロ浸潤に用いた。
【０１２３】
固定化ウイルスレプリコン（ｐＩＣＨ５１７０）を有する株をタバコ植物全体のアグロ浸潤に用いた。
上記実験の結果は、トランスジェニック宿主植物又はＶｉｒＥ２発現アグロバクテリウムによって機能を補完することなくＶｉｒＥ２機能欠損株を用いた場合、浸潤植物においてＧＦＰを全く発現しないことを示した。しかしながら、ＶｉｒＥ２機能のトランス補完を必要とする実験における発現レベルは、ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８に固定した場合と顕著な差を示さなかった。
【実施例１６】
【０１２４】
細菌プラスミド接合性伝達欠損変異体の作製
ｔｒａ遺伝子及びｔｒｂ遺伝子は、Ｔｉプラスミドの接合性伝達に関与すると記載されている（Ｆａｒｒａｎｄら、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８、４２３３−４２４７；Ｌｉら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、５０３３−４１）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８のＴｉプラスミドからこれらの遺伝子を削除するために、隣接ＤＮＡ領域を含有するベクターを形質転換に用い、２つの連続的組換えイベントにより、欠失を導入した。欠失ベクターは、正の選択マーカーとしてカルベニシリン耐性を、負の選択マーカーとしてショ糖不耐性を引き起こすｓａｃＢ遺伝子を含有するベクターｐＤＮＲ−１ｒ（クローンテック）に基づいている。
【０１２５】
ｔｒａ遺伝子（ｔｒａＧ、ｔｒａＤ、ｔｒａＣ、ｏｒｉＴ、ｔｒａＡ、ｔｒａＦ、ｔｒａＢ、ｔｒａＨ、ｔｒａＭ）を欠失させるために、およそ７００ｂｐの隣接領域をアグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡから、ｏＳＭ５７０プライマー（５’−ｇａｇｇａｔｃｃａａｃｇｔｔｔａｇｇａｇａａｃｃａｇ−３’）＋ｏＳＭ５７１プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａｃｇｇｔａｔａｃｇｃａｃａｃｔｇａａｃａｔｇｃｇ−３’）、及びｏＳＭ５７２プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃ−３’）＋ｏＳＭ５７３プライマー（５’−ａｃｇｔｃｔａｇａｇａｔｃｇｃｇｔｔｃｃａｇａｃｃａａｃ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ断片をＢｓａＩで制限処理した後連結し、追加ヌクレオチドを導入することなくＢｓｔ１１０７１制限部位を作製した；外端にプライマーを用いてＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位を導入した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩで制限処理したベクターｐＤＮＲ−１ｒに２つのＰＣＲ断片を連結した。得られたプラスミドｐＩＣＦ１２７２１を、エレクトロポレーションによるアグロバクテリウム形質転換に用い、初めはカルベニシリンで、その後抗生物質はないが５％ショ糖の存在下で選択し、２重組換えイベントを有する、ベクター骨格を含有しない細胞を対抗選択した。
【０１２６】
ｔｒｂ遺伝子（ｔｒｂＢ、ｔｒｂＣ、ｔｒｂＤ、ｔｒｂＥ、ｔｒｂＪ）を欠失させるために、およそ７００ｂｐの隣接領域を、アグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡから、ｏＳＭ５６６プライマー（５’−ｃｔｇａａｔｔｃａｇｇｃａａａｃｇｃａｃｃｇｔｇａｇａｔｇ−３’）＋ｏＳＭ５６７プライマー（５’−ｔｃａｃｃａｔｇｇｇｔｃａｃｇｃｇｇｃａｃｔｃｃｔｇ−３’）、及びｏＳＭ５６８プライマー（５’−ｔｃａｃｃａｔｇｇｃｃｃａｇｇｃｃｃｇｇｃｇｔｇａａｃ−３’）＋ｏＳＭ５６９プライマー（５’−ａｃａｔｃｔａｇａｔｇｃｃｇｇｃａｔｃｇａａｇａｔｇｔｔｇ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ断片の連結により、追加のヌクレオチドを導入することなくＮｃｏＩ制限部位を作製した；外端にＥｃｏＲＩ部位及びＸｂａＩ部位をプライマーによって導入した。２つのＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩＩ及びＸｂａＩで制限処理したベクターｐＤＮＲ−１ｒに連結した。得られたプラスミドｐＩＣＦ１２７１１を上記のようにアグロバクテリウム形質転換に用いた。
【０１２７】
アグロバクテリウム間の接合伝達を測定するために、オパイン結合リプレッサーをコードするａｃｃＲ遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによって、構成的伝達を示す選択可能Ｔｉプラスミドを構築した。これは、やはりベクターｐＤＮＲ−１ｒに基づき、アグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡからｏＳＭ５５４プライマー（５’−ｇａｇｃｔａｇｃｔｃｃｇｔｃｃｔｔｃａｃｃｔｇｇｇｃ−３’）＋ｏＳＭ５５５プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａｃｃｇｇｃｃｇａｔａｇｃｃａａａａａｃｔｇｃ−３’）、及びｏＳＭ５５６プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃｇｃｃｇｇｃｃａａａｃｔｃｃｇｇｔｔｔｇｃ−３’）＋ｏＳＭ５５７プライマー（５’−ａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｃｇａａｃｇｃａａｔｔｃｃｔｇｔｔｇｃ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた２つの隣接領域、及びそれらのあいだのＸｍａＩＩＩ部位にカナマイシン耐性（ｏＳＭ５８４プライマー（５’−ｃｃｔｃｇｇｃｃｇｃｇａａｃｇｇｃｃｔｃａｃ−３’）及びｏＳＭ５８５プライマー（５’−ｃｔａｃｇｇｃｃｇｃｔｇａｃａｇｃｔａａａａｃａａｔｔｃａｔｃｃ−３’）を用いてバイナリーベクターｐＩＣＨ１８７１１からＰＣＲで増幅させた）を含有するベクターｐＩＣＦ１２７４１でアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８を形質転換することによって作製した。カナマイシン耐性Ｔｉプラスミドを有する株を、染色体リファンピシン耐性を有するがＴｉプラスミドのないアクセプター株ＧＶ３１０１と共に、ニトロセルロースメンブラン上で２８℃にて２時間、Ｐｉｐｅｒ＆Ｆａｒｒａｎｄ（１９９９、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５、２７９８−２８０１）に記載されたのと同様にインキュベーションした。リファンピシンとカナマイシンを添加したプレートでトランス接合個体を選択した。ａｃｅを欠失しているが無傷のｔｒａ遺伝子及びｔｒｂ遺伝子を有するＴｉプラスミドの場合、投入ドナーあたりの接合効率はおよそ３〜４×１０−４トランス接合個体であった。ｔｒａ及びｔｒｂ変異体の場合、接合効率は検出限界以下であった（＜１０−７）。
【０１２８】
ベンサミアナタバコ植物に、ＧＦＰをコードするウイルスベクターｐＩＣＨ１８７１１を含有する細菌を浸潤させることにより、植物へのＤＮＡ伝達に対する変異の影響について試験した。細菌は、葉で単一蛍光スポットを観察できるように、さまざまな希釈率で用いた。植物へのＤＮＡ伝達効率は、ａｃｅ、ｔｒａ、又はｔｒｂ欠失のない細菌と匹敵するものであった。
【実施例１７】
【０１２９】
栄養要求性変異体の作製
栄養要求性アグロバクテリウム株を作製するために、ロイシンの生合成に関与する３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素をコードするｌｅｕＢ遺伝子とウリジンの生合成に関与するオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥを選択した。ｌｅｕＢのコード配列は、アグロバクテリウム染色体の逆鎖に局在する仮想タンパク質ＡＴＵ２７９２の３’と重複するため、完全に欠失させることができない。したがって、染色体１のｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０を、上流配列の７７５ｂｐと下流配列の８３４ｂｐとを、ｌｅｕＢコード配列の５’端に天然に生ずるＢｓｐＨＩ制限部位を介して接続することにより欠失させるために選択した。ベクターｐＤＮＲ−１ｒ（クローンテック）を用いて、アグロバクテリウムの標的遺伝子内に欠失を作製した。
【０１３０】
ｌｅｕＢと同様に、ｐｙｒＥ遺伝子の異化補完は可能ではない。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がアグロバクテリウムに存在するため、ウリジン添加は安価なウラシルで置き換え得る。更に、ｐｙｒＥ欠失は正の選択マーカーとして用いることができる。選択は、野生型アグロバクテリウムは毒性のウラシル類似体である５−フルオロオロチン酸に対して感受性であるが、ｐｙｒＥ変異体は当然耐性であるという事実を利用する。
【０１３１】
ｐｙｒＥの開始コドンは、異なるデータベースにおいて異なって注記されている（ｂｐ３９４７３４−３９５５３４、受託番号ＮＰ＿５３１１０５とｂｐ３９４８３６−３９５５３４、受託番号Ｑ８ＵＩ９８）。しかしながら、他のｐｙｒＥ配列に対する相同性はｂｐ３９４８３６の前からは開始しない。それにもかかわらず、２つの欠損変異体（欠失は１番染色体の３９４７６０位又は３９４８４９位から開始し、いずれも３９５５３１位で終わる）をデザインした。欠失含有断片を、ベクターｐＤＮＲ−１ｒのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＩＣＦ１２６３（ΔｌｅｕＢ ｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０）、ｐＩＣＦ１２６４（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４７６０−３９５５３１）、及びｐＩＣＦ１２６５（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４８４８−３９５５３１）を得た（図２１を参照されたい）。
【０１３２】
アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を、プラスミドｐＩＣＦ１２６３−３（ΔｌｅｕＢ ｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０）、ｐＩＣＦ１２６４−１（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４７６０−３９５５３１）、及びｐＩＣＦ１２６５−１０（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４８４８−３９５５３１）で形質転換した。カルベニシリン含有培地での選択２日目に少量の形質転換体（６〜１０ｃｆｕ／μｇ）を得た。ＬＢ＋リファンピシン液及びＬＢ＋リファンピシン＋サッカロース液中で選択したクローンを連続して増殖させることによって共組換え体を決定した。標的遺伝子に所望の欠失を含有するアグロバクテリウム変異体を、ＬＢ＋リファンピシン＋サッカロース培養物から単離したアグロバクテリウムＤＮＡのＰＣＲ解析によって確認した。
【０１３３】
変異体株１２６３−３−３及び１２６３−３−１０並びに野生型親株ＧＶ３１０１を、３０ｍｇ／ｌ及び１５０ｍｇ／ｌ ロイシンの添加の有無において、ＬＢ富栄養培地及びＭ９最少培地中で増殖させた。変異体株と野生型株とのあいだでＬＢ培地での増殖に差はなかったが、Ｍ９培地では野生型株のみ増殖できた。Ｍ９培地にロイシンを添加した場合、野生型株も変異体株も増殖できた。添加ありと添加なしの培地でのさまざまな変異体株の増殖を図２２及び図２３に示す。ロイシン濃度の増加とともに増殖率が増加した。アグロバクテリウム変異体１２６３−３−３をＧＦＰプラスミドｐＩＣＨ１８７１１で形質転換し、ベンサミアナタバコにおける感染効率について解析した。
【０１３４】
付録
配列番号１（ｐＩＣＨ１４８３３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片）：
【０１３５】
【化１】
配列番号２（ｐＩＣＨ１５４６６の部分）：
【０１３６】
【化２】
配列番号３（ｐＩＣＨ１５９００の部分）：
【０１３７】
【化３】
配列番号４（ｐＩＣＨ１５０２５の部分）：
【０１３８】
【化４】
配列番号５（ｐＩＣＨ１５０３４の部分）：
【０１３９】
【化５】
配列番号６（ｐＩＣＨ１５４７７の断片）：
【０１４０】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】図１Ａは、生物学的安全性の上昇（Ａ）に基づいた、本発明の一般的原理を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＲＮＡウイルスに基づくレプリコン形成頻度の上昇（Ｂ）に基づいた、本発明の一般的原理を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図２Ｃ】図２Ｃは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図３】図３は、ベクターｐＩＣＨ１６７０７のアグロ浸潤後１０日目のベンサミアナタバコ植物をＵＶ光下にて示す。
【図４】図４は、ベクターｐＩＣＨ１８７１１のアグロ浸潤後４日目の、１７日（Ａ）、２２日（Ｂ）、２８日（Ｃ）、及び３５日（Ｄ）齢のベンサミアナタバコ植物をＵＶ光下にて示す。
【図５】図５は、構築体ｐＩＣＨ１８７２２及びｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ｎｏｓＴ−ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域；ｎｏｓＰ−ノパリン合成酵素遺伝子の転写プロモーター；ｏｓｃＴ−オクトピン合成酵素遺伝子の転写終止領域；ＮＰＴＩＩ−ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子のコード配列；ＴＶＣＶ ＭＰ−カブ葉脈透化ウイルスの移行タンパク質。
【図６Ａ】図６は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を横軸に示す。縦軸は、対応の配列／配列領域がコード配列（コード）であるか、ドナー部位（ドナー）若しくはアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。丸で囲んだ部分は、機能保存的な相違を導入すべき選択された位置に相当する。
【図６Ｂ】図６は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を横軸に示す。縦軸は、対応の配列／配列領域がコード配列（コード）であるか、ドナー部位（ドナー）若しくはアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。丸で囲んだ部分は、機能保存的な相違を導入すべき選択された位置に相当する。
【図７】図７は、ベクターｐＩＣＨ１５４６６の転写領域（転写領域の前半の半分）のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は本発明に記載のように改変されている（図６Ａとの比較）。
【図８】図８は、ｐＩＣＨ１５９００の転写領域（転写領域の第２の半分）のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は本発明に記載のように改変されている（図６Ｂとの比較）。
【図９Ａ】図９は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は、６つの挿入された植物核イントロンに相当する。
【図９Ｂ】図９は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は、６つの挿入された植物核イントロンに相当する。
【図１０Ａ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ａ−ベンサミアナタバコ、アグロ浸潤後８日目。
【図１０Ｂ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ｂ−タバコ、アグロ浸潤後８日目。
【図１０Ｃ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ｃ−アグロ浸潤後５日目に単離したベンサミアナタバコのプロトプラスト。右の写真の多くの光点は、非常に高頻度のレプリコン形成及びＧＦＰ発現を示す。
【図１１】図１１は、本発明にしたがいデザインされたＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン前駆体の略図であり、非誘導状態では目的配列（ＧＦＰ、Ｇと示す）の発現レベルがゼロである。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図１２】図１２は、直鎖（＋鎖）を用いたシロイヌナズナ減数分裂特異的遺伝子ＡｔＤＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７６６７０）のイントロン予測プロファイルを示す。イントロンコード領域を丸で囲んである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）の直鎖（＋鎖）内の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）の直鎖（＋鎖）内の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ａ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０３）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０２）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ｃ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ００１６３）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨＶｉｒＥ２、ｐＩＣＨ４３００、ｐＩＣＨ５２０２／３、及びｐＩＣＨ５１７０のＴ−ＤＮＡ領域の略図を示す。
【図１６】図１６は、機能性ＭＰ（移行タンパク質）欠失ウイルスベクターの細胞間移行のトランスジェニック植物宿主（ベンサミアナタバコ）からのトランス補完の効果を示す。上部のラベルは植物を表し、下部のラベルはアグロ浸潤に用いたベクターを示す。左の写真は図示したように処理した植物の典型的な葉を示す。右の写真はトランスジェニック植物の全体を示す。ＷＴ：野生型植物；ｐＩＣＨ１０７４５トランスジェニック：ＴＶＣＶ移行タンパク質（ＭＰ）を発現するトランスジェニック植物；ｐＩＣＨ１８７２２：細胞間移行不良のウイルスベクターによる浸潤；ｐＩＣＨ１８７１１：細胞間移行可能なウイルスベクターによる浸潤。ＧＦＰ発現を検出するために植物をＵＶ光下にて示す。
【図１７】図１７は、バイナリーベクターｐＩＣＨ１８７１１からのＴ−ＤＮＡ伝達効率に対するＶｉｒＥ２遺伝子の効果を示す。ＶｉｒＥ２：機能性ＶｉｒＥ２遺伝子を含有するアグロバクテリウムを浸潤させたベンサミアナタバコの葉；ΔｖｉｒＥ２：ＶｉｒＥ２遺伝子機能不良のアグロバクテリウムを浸潤させたベンサミアナタバコの葉；１０２〜１０７の数は浸潤前のアグロバクテリウムストックの希釈を示す（ΔＶｉｒＥ２株とＶｉｒＥ２株のストックは同一ＯＤ６００）。矢印は同一のＴ−ＤＮＡ伝達頻度を発揮する条件を結び付けており、ΔＶｉｒＥ２株は１０２倍希釈、ＶｉｒＥ２株は１０７倍希釈に相当する。
【図１８】図１８は、野生型（ＷＴ）植物、及びｐＩＣＨ１８７１１バイナリーベクターを含有するΔＶｉｒＥ２アグロバクテリウム株を浸潤させたトランスジェニック（ｐＩＣＨＶｉｒＥ２）植物を示す。写真は、１０ｄｐｉ（浸潤後日数）にＵＶ光下にて撮影した。同一のアグロバクテリウム一晩培養物を、ＷＴの浸潤には１０倍に希釈し、トランスジェニック植物の浸潤には１０００倍に希釈した。
【図１９】図１９は、野生型植物への変異体アグロバクテリウム（機能性ｖｉｒＥ２遺伝子を欠失）と野生型アグロバクテリウム（ＶｉｒＥ２遺伝子機能を維持）との共浸潤によるＶｉｒＥ２遺伝子機能のトランス補完を示す。変異体及び野生型のアグロバクテリウムをさまざまな組み合わせで浸潤させたベンサミアナタバコの葉をＵＶ光下にて示す。四角内のラベルは、アグロバクテリウムの個々の種類を表す。四角のあいだの＋印は、葉の同一の場所に２種類のアグロバクテリウムを共浸潤させたことを示す。「Ｔ−ＤＮＡ」の前の＋印又は−印は、それぞれ、ＧＦＰを有するＴ−ＤＮＡの存在及び不存在を示す。機能性ＶｉｒＥ２の不存在をΔで示す。
【図２０】図２０は、ａｃｅオペロンを欠失したアグロバクテリウムからのＴ−ＤＮＡ伝達効率試験の結果を示す。ＴｉプラスミドｐＭＰ９０（対照）又はｐＴｉＣ５８Δａｃｃ（ａｃｃ欠失）を有するアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を、ＧＦＰをコードするウイルスベクターｐＩＣＨ１８７１１で形質転換し、一晩培養物のさまざまな希釈物を植物の浸潤に用いた。写真は接種後７日目にＵＶ光下にて撮影した。
【図２１】図２１は、アグロバクテリウムのΔｌｅｕＢ変異体及びΔｐｙｒＥ変異体を作製するための戦略を表す。
【図２２】図２２は、補完の有無における、さまざまな培地でのアグロバクテリウム株１２６４（ΔｐｙｒＥ）の増殖速度を示す。ΔｐｙｒＥ変異体株１２６４−１−２及び１２６４−１−８はウラシル含有培地においてのみ増殖する。縦軸上の数値はＯＤ６００を示す。
【図２３】図２３は、補完の有無における、さまざまな培地でのアグロバクテリウム株１２６３（ΔｌｅｕＢ）の増殖速度を示す。ΔｌｅｕＢ変異体株１２６３−３−３及び１２６３−３−１０はロイシン依存性であるが、野生型親株ＧＶ３１０１はロイシン依存性ではない。縦軸上の数値はＯＤ６００を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグロバクテリウムによって標的植物に送達される植物ウイルスベクターに基づいた一過性発現を用いた、植物における生物学的に安全な組換えタンパク質の産生方法に関する。また、本発明は、標的宿主植物又は植物の葉における目的配列の発現方法に関する。本発明は、植物全体又は植物の部分において目的タンパク質の大規模産生を高収率で提供する、ウイルスベクターのアグロバクテリウム介在送達の使用について記載する。本発明の方法は、宿主植物へのアグロバクテリウム介在送達による一過性発現を制限する一方で、望ましくない生物への形質転換を制御する。更に、本発明は、植物又は植物の葉において目的配列を発現させるための生物学的に安全なアグロバクテリウムに関する。本発明は、生物学的安全性が上昇した、植物における高収率の工業的タンパク質産生を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在、植物バイオテクノロジーは、植物において外来遺伝子を送達及び発現するための２つのアプローチ：安定な形質転換と一過性発現に依拠している。後者は、アグロ浸潤又はウイルス感染に基づいて構築することができる（概説として：Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０、１１３−１１６を参照されたい）。一過性発現は、構成的な、例えば３５Ｓプロモーターの制御下で目的遺伝子の発現を駆動する標準の発現カセットを植物組織にアグロ浸潤させることによって（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６、１１１２８−１１１３３）、又は大規模では、植物にウイルスベクターをトランスフェクションすることによって達成することができる。通常、アグロ浸潤は高収率を提供しないが、ｐ１９又はＨｃＰｒｏのような転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）サプレッサーとの組み合わせにより、タンパク質発現レベルを５０倍まで上昇させることができる（Ｖｏｉｎｎｅｔら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、３３、５４９−５５６）。依然として、ウイルス発現システムによって達成できる生物学的限界を遙かに下回っている（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）。植物組織において目的組換えタンパク質を一過性発現させるためのアグロ浸潤の使用に基づいたバイオリアクターについての記載は米国特許第６，７４０，５２６号に提供されている。しかしながら、この特許は、発現されるべきタンパク質の収率をいかにして改善するかについての記載がなく、当該技術分野において公知の他の方法に勝るものではない（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９６、１１１２８−１１１３３）。一過性発現のより強力なアプローチは、ウイルスベクターの使用である。レポーター遺伝子（ＧＦＰ又はＤｓＲｅｄ）のＴＭＶに基づいた発現は、システムの生物学的な収率限界に達することができ、新鮮な葉のバイオマス１ｇあたり数ｍｇの組換えタンパク質を産生することが示された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）。そのようなシステムの相対収率は、ＴＳＰの８０％まで達することができ、下流処理を著しく容易にし、費用を低下させる。そのような高い相対収率は、ウイルスによって誘導される宿主タンパク質生合成の遮断により可能である。
【０００３】
ウイルスベクターは、アグロ浸潤に用いる慣用のベクターよりも高い発現レベルを提供でき（概説として：Ｐｏｒｔａ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４を参照されたい）、機能ゲノミクス研究の強力なツールである（Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２５、２３７−２４５；Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３）ことは明らかである。当該技術分野における数多くの出版物及び特許がＤＮＡ及びＲＮＡのウイルスベクターに基づいたシステムについて記載している（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５；Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５９８１２３６号；ＷＯ０２／０８８３６９号；ＷＯ０２／０９７０８０号；ＷＯ９８／５４３４２号）。既存のウイルスベクターシステムは、通常、最高性能の点から見ると狭い宿主範囲に限定され、最も好適な宿主におけるそのようなベクターの発現レベルでさえシステムの生物学的な上限を遙かに下回っている。ウイルスに基づいたシステムの重要な問題は、植物細胞へのウイルスレプリコンの送達方法である。大規模産生（例えば農場又は温室において多くの植物で同時に産生すること）に最も広く適用される送達法は、ＲＮＡウイルスベクターの感染性コピーの使用である（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１６７９−１６８３）。組換えＲＮＡウイルスベクターは複製サイクルのあいだに異種挿入物を喪失する傾向が比較的高いため、この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型の転写を必要とし、したがって非効率的で高価である。
【０００４】
一過性経路は、非常に速いが、ウイルスの低感染性、植物の大部分にトランスフェクションすることができないこと、及び遺伝子サイズの限界のために非常に限定されている。植物細胞へ感染性ウイルスベクターを送達するためのアグロ浸潤の使用（Ｌｉｕ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆ、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５、３４３−３４８）、又はアグロバクテリウムによって送達されるウイルスベクター成分からのウイルスベクターの組み立て（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、６８５２−６８５７）について記載する出版物がある。しかしながら、これらの出版物は、アグロ浸潤された植物組織のそれぞれの細胞におけるウイルスレプリコンの効率的な同調形成の問題に取り組んでおらず、更に、ベクターの伝播は細胞間移行及び浸透移行に関するウイルスの能力に依存している。この移行は比較的長期間を必要とし、通常、ウイルスベクターは感染後およそ１０〜１４日で最高の可能なベクター収率を提供する。これは、植物の細胞内プロセスを妨げる組換えタンパク質、特に制限酵素、プロテアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、多くの医薬タンパク質のような非常に細胞傷害性のタンパク質の産生には受け入れられない。逆に、アグロ浸潤によって送達される標準ベクターは、アグロ送達後３〜４日で最高の可能な発現レベルに達するが、そのようなベクターによって提供される収率は容認し難いほど低い。したがって、事実上アグロ浸潤された植物組織の全ての細胞において目的遺伝子の発現を提供するにもかかわらず、目的タンパク質を発現するための構成的プロモーターによって駆動される効率の低い標準の転写ベクターによって引き起こされる問題に直面する。反対に、アグロ送達されたウイルスベクターは高発現レベルを提供可能であるが、複製をほとんど開始せず、そのため大部分の細胞で発現を提供せず、ほんのわずかな画分のみである（アグロ浸潤された全組織の１％未満）。その結果、そのようなウイルスに基づいたベクターは発現を提供するのに著しく（３〜４倍）長期間を必要とするが、システムの生産性は、特に細胞障害性タンパク質の場合に、理論上の生産性よりも依然として低い。これは、アグロ浸潤された組織において同調発現を提供しないため、特に細胞障害性遺伝子を発現させる場合に、収率に影響を及ぼし、一過性発現システムにウイルスベクターを使用する上で重大な欠点である。また、感染した植物宿主はその組織の大部分においてウイルスベクターを含有しないため、産生プロセスから組織を除外する。更に、感染植物に対してウイルスベクターの最高の可能な伝播（及び発現レベル）を達成するのに要する時間は、標準のアグロ浸潤プロトコールと比較して３〜４倍長い。その上、一過性発現のための記載のシステムはいずれも、遺伝子操作された生物の使用を含めた工業的規模のタンパク質産生において重要な要素である、システムの生物学的安全性を高める問題に取り組んでいなかった。
【０００５】
特許化技術を含め、当該技術分野には数多くの出版物があるにもかかわらず、主に２つの主要な理由により、依然として、商業的な高収率産生のために十分な効率と収率をもって作動するウイルスに基づいた大規模産生システムは存在しない：第１に、一過性の植物ウイルスに基づいた発現システムは、通常特定の宿主に制限され、環境因子の影響を受けやすいため大規模培養に好適であり得ない。その上、これらのシステムは、通常植物宿主のある部分に制限されるため、大部分の植物バイオマスを産生プロセスから除外し、その結果、単位植物バイオマスあたりの組換え産物の相対収率を、トランスジェニック植物において慣用の転写プロモーターによって達成可能なレベルに匹敵するレベルまで最小にする；第２に、各細胞に安定に組み込まれたウイルスレプリコン前駆体を有するトランスジェニック植物宿主を作製することによってウイルスに基づいた産生システムを拡大する試みは、特に、そのような位置におけるレプリコンの標準よりも低い働き、レプリコンから発現されるべき目的遺伝子の「漏出性」、そしてベクターの効率的スイッチシステムの欠失により、解決策を提供していない。ＲＮＡレプリコン形成の誘因としてＰＴＧＳサイレンシングのサプレッサーを用いることにより、ＰＶＸに基づいたベクターにおいて多少の進展が達成されたが（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）、このシステムは、ウイルスベクターの複製を誘発するスイッチ（ＰＴＧＳサプレッサー）の効率的制御を提供する解決策がないため、依然として実用的価値に遠く及ばない。しかしながら、このシステムは、この種のシステムでこれまで知られた中で最高である、合計可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の３％に達するＧＵＳ遺伝子の発現レベルを提供したが、依然として強力なプロモーターの制御下の慣用のトランス遺伝子発現システムよりも良好ではない。植物３分節ＲＮＡウイルス、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）に基づいた他の誘導性システム（Ｍｏｒｉら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、２７、７９−８６）は、目的タンパク質の収率が非常に低かった（３〜４μｇ／ｇ新鮮重）。これは標準の転写プロモーターによって提供される収率と匹敵する。
【０００６】
植物発現システムを用いてこれまでに達成された発現レベルの低さが、これらのシステムが細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の発現システムとほとんど競合しない主な理由である。低発現レベルは、植物材料の巨大なバックグラウンドにおけるタンパク質の単離精製のための下流費用を非常に高くする。したがって、単位植物バイオマスあたりの目的タンパク質又は目的産物の収率が増加するにつれて、下流処理費用が急激に減少する。
【０００７】
現在、細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の大規模発現システムを用いた市場で競合するほど収率及び効率が十分に高い植物の大規模な一過性発現システムはない。そのような植物の発現は以下の基準をできるだけ良好に満たす必要があるであろう：
（ｉ）できるだけ多くの植物組織及び組織の多くの細胞における目的タンパク質の発現を含め、高収率であること；
（ｉｉ）植物細胞の生存に対するタンパク質発現の有害な効果を防止するには、目的タンパク質又は目的産物の発現は、処置された植物又は植物組織の全ての植物細胞において同時に開始する必要がある。
【０００８】
典型的には、目的タンパク質又は目的産物は、産物又はタンパク質を産生する各細胞にある時点まで蓄積する。しかしながら、蓄積のあいだ、分解過程が進むことが多く、目的タンパク質若しくは目的産物の収率又は品質が低下する傾向にある。したがって、発現スイッチが入った後、目的産物又は目的タンパク質を収穫すべき最適な時点がある。全体的な工程を効率的で収益性のあるものにするには、この最適な時点は、植物の全ての組織又は細胞において、そして選択したロットの全ての植物において同時に到達すべきである；
（ｉｉｉ）システムは、向上したバイオセイフティー性を組み込み、アグロ浸潤に用いるアグロバクテリウムは、少なくとも１つの以下の特徴を有するであろう：開かれた環境における生存率が低いか又はゼロであり、非標的生物又は非標的植物に対する感染性が低いか又はゼロである。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、大規模応用に拡大可能であり、発現すべきタンパク質の収率が高く、そして同時に、非標的生物を外来ＤＮＡでトランスフェクション又は形質転換する可能性が低い、生物学的に安全な、植物システムにおいてタンパク質を発現させる方法を提供することである。
【発明の開示】
【００１０】
発明の一般的な説明
この目的は、標的植物又は標的植物の葉における目的配列からの目的タンパク質の一過性発現による目的タンパク質の産生方法によって達成され、この方法は：
レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、レプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉を含めた生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている。
【００１１】
更に、本発明は、
（ｉ）上で定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）上で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする植物又はその種子、
を含むキット部品を提供する。
【００１２】
更に、本発明は、
（ｉ）上で定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）上で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする第２のアグロバクテリウム株、
を含む、キット部品を提供する。
【００１３】
更に、本発明は：
（ｉ）補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な細菌の機能を不良にする第１の遺伝子改変を有し、
（ｉｉ）他の細菌へのプラスミド伝達の接合能が不良であり、そして
（ｉｉｉ）アグロバクテリウムの増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性である、
ことを特徴とする、本発明の方法のためのアグロバクテリウム属の細菌を提供する。
【００１４】
自然の一般的原理によれば、１つの特性の改良は他の特性に負に影響する傾向があり、逆も同様であるため、システムの２以上の対立する特性を同時に向上させることは困難である。植物に基づいたタンパク質発現システムでは、発現されるべきタンパク質の高発現レベルを達成することと、高い生物学的安全性を達成することを同時に達成することは、高発現効率はシステムの選択性を低下させ、よって生物学的安全性が低い傾向にあるため困難である。例えば、高率発現システムを達成するために植物の感染に用いるアグロバクテリウム株を非常に感染性にする場合、アグロバクテリウム株は、非標的植物に形質移入する可能性が高く、組換えＴ−ＤＮＡが環境中に伝播する傾向があるが、これは回避しなければならない。一方、アグロバクテリウム株の感染性を低くすることによって生物学的安全性を改善する場合、標的植物における形質移入及び発現効率は劣るであろう。したがって、生物学的安全性と発現効率はそのように対立する特性である。
【００１５】
植物に基づいたタンパク質発現システムへの要求は、システムを大規模応用、即ち多くの植物又は多くの植物の葉における同時発現に適合させる必要がある場合、より複雑になってさえいる。一方、大規模応用における生物学的安全性は、トランスジェニック生物が開放環境に拡張する可能性がより高まるため、より重要である。一方、高タンパク質発現効率及び高収率は、経済的に競合し得る方法を達成するには、大規模応において必須である。
【００１６】
本発明は、目的タンパク質を産生するための、大規模で非常に効率的且つ生物学的に安全な方法を作製するための手段を初めて提供する。
本発明の方法では、目的タンパク質は、植物又は植物の葉において目的配列から一過性に発現される。一過性発現は、植物又は植物の葉の一過性トランスフェクションによって達成される。「一過性トランスフェクション」という用語は、異種ＤＮＡ配列の導入が、植物染色体へ異種ＤＮＡ配列を安定に組み込むためにトランスフェクションされた細胞を選択することなく行われることを意味する。目的配列は目的タンパク質をコードする。目的配列は、外来ＤＮＡを植物細胞へ導入可能なアグロバクテリウム株を用いて植物又は植物の葉へ導入される。目的配列は、レプリコンが由来する植物ウイルスに対して異種である。即ち、本発明の方法は、植物又は植物の葉を野生型植物ウイルスで形質転換する場合を含まない。ＤＮＡ配列は異種目的配列を含有するため異種である。目的配列は、アグロバクテリウム株に対して固有の配列でないことが好ましい。
【００１７】
植物又は植物の葉をアグロバクテリウム株で一過性にトランスフェクションする。植物又は植物の葉は、植物の多くの細胞及び多くの組織が１つの作業工程でトランスフェクションされるようにトランスフェクションされる必要がある。これは、アグロ浸潤によって最高に達成することができるが、植物又は植物の葉の主要部分のトランスフェクションを可能にする他の方法も適用することができる。したがって、植物又は植物の葉にアグロバクテリウム株を浸潤させることによって植物又は植物の葉に一過性にトランスフェクションすることが好ましい。浸潤は、システムの効率に顕著に寄与するため、本発明の重要な要素である。効率が高い程、植物又は植物の細胞のより多くの細胞が目的タンパク質を発現し、さまざまな組織及び細胞において発現開始が良好に同調する。浸潤は、植物又は植物の葉の多くの細胞を１つの作業工程で形質転換することを可能にし、それにより、目的タンパク質の発現がさまざまな植物組織及び植物のさまざまな部分において進む時点が実質的に同調する。更に、浸潤は、かなりの割合の植物又は植物の葉の細胞が形質転換される可能性を実質的に増加させる。したがって、レプリコンの遠隔距離移行の可能性は、全体的な効率を更に増加させることができるが、トランスフェクション及び発現は、植物又は植物の葉におけるレプリコンの遠隔距離移行に依存しない。
【００１８】
本発明の方法は、植物への大規模な応用のため、即ち多くの植物で平行して実施するためにデザインされる。本発明の方法では、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも３０、更により好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも１０００の植物にアグロバクテリウム株を平行してトランスフェクションする。
【００１９】
本発明の方法を植物全体で実施する場合、トランスフェクション（好ましくは浸潤）は植物のいくつかの部分で行う。例えば、大部分の葉とトランスフェクションするか浸潤させる。全ての葉をトランスフェクションするか浸潤させることが好ましい。より好ましくは、植物の全ての葉及び茎をトランスフェクションするか浸潤させる。目的タンパク質を単離するためにその後収穫される全ての組織をトランスフェクションするか浸潤させるべきである。根における発現及び収穫はシステムの全体的な効率を更に増加させることができるが、通常、根を浸潤させる必要はない。アグロバクテリウム株の懸濁液中に植物を逆さにしてサッと浸し、真空を適用し、その後真空を急速に開放することによって植物全体又は少なくともその土の上の部分を浸潤させることができる。この手順は、規模を拡大することができ、多くの植物に順々に又は同時に適用することができる。
【００２０】
本発明の方法を植物の葉で行う場合、葉の１以上の領域で浸潤を行う。好ましくは、葉に噴霧するか、アグロバクテリウム株の懸濁液にサッと浸し、好ましくは、その後アグロバクテリウム細胞を葉の組織に押し付けるか又は吸収させる。本発明にしたがい使用する植物の葉は、植物に付いていることが好ましい。本発明の方法は植物組織培養物で行わないことが好ましい。
【００２１】
浸潤又はアグロ浸潤はアグロバクテリウム懸濁液を用いたトランスフェクション法として定義することができ、アグロバクテリウムを植物組織（細胞間隙）に押し付けるために圧力差を用いる。
【００２２】
あるいは、ウイルス粒子を送達するために行ったようにして（Ｐｏｇｕｅら、２００２、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．、４０、４５−７４）、アグロバクテリウムと研磨剤との混合物を植物へ展開するための高圧噴霧装置を用いてアグロバクテリウムを植物組織へ送達することができる。
【００２３】
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下ではＴ−ＤＮＡの生物への形質移入を不良にする第１の遺伝子改変を提供される。これは、生物学的安全性を向上させるための本発明の必須要素である。この生物は、異種ＤＮＡ配列によるトランスフェクションが望ましくない生物である（「非標的生物」）。非標的生物は、とりわけ、植物及び細菌又は真菌のような微生物である。補完因子の非存在下では、本発明の植物種は非標的生物でもない。補完因子の非存在下では、アグロバクテリウム株は、そのような非標的生物に感染することも形質導入することも不良であり、好ましくは不可能である。
【００２４】
アグロバクテリウム株、植物（又は植物の葉）、及び補完因子は、アグロバクテリウム株による植物の感染時、目的配列のトランスフェクション及び／又は発現を可能にするために選択され、一方で非標的生物のトランスフェクション及び／又は発現は起こりそうにない。非標的生物のトランスフェクションに関するアグロバクテリウム株欠陥、好ましくは不能は、アグロバクテリウム株の以後第１の遺伝子改変を称する遺伝子改変によって達成される。
【００２５】
第１の遺伝子改変は、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にすることが好ましい。これは、標的生物のトランスフェクションに必要な機能をコードするアグロバクテリウム遺伝子を欠失又は分裂させることによって達成することができる。そのような機能は、とりわけ、Ｔｉ−プラスミド上、例えば植物又は植物の葉の細胞へ導入すべきＴ−ＤＮＡを有するＴｉ−プラスミド上にコードされる。そのような遺伝子の例は、アグロバクテリウム遺伝子ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦである。
【００２６】
他の態様では、第１の遺伝子改変は、アグロバクテリウム株を栄養要求性にし、それにより、その増殖を外部から加えられた代謝産物依存性にする。外部から加えられた代謝産物の非存在下では、アグロバクテリウム株は、生物にＴ−ＤＮＡをトランスフェクションすることができない。
【００２７】
更なる態様では、第１の遺伝子改変として、生物のトランスフェクションに必要なアグロバクテリウム株の機能を、化学的に調節された異種プロモーターの制御下に置く。そのような遺伝子の例は、アグロバクテリウム遺伝子ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦであり、例えば、ｌａｃプロモーターの制御下に置くことができる。そのような態様では、補完因子は化学的に調節されたプロモーターを調節可能な小分子化合物である。ｌａｃプロモーターの場合、補完因子はＩＰＴＧ又は乳糖であり得る。したがって、植物又は植物の葉に適用されるアグロバクテリウム懸濁液は、植物の感染、及び好ましくは植物の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入を可能にする、ＩＰＴＧ又は乳糖のような小分子化合物を含有することができる。
【００２８】
他の態様では、第１の遺伝子改変は、アグロバクテリウム株を条件的致死性にし、補完因子は、アグロバクテリウム株の生存に必要な、アグロバクテリウム株の主要代謝産物である。
【００２９】
上記態様は組み合わせることができる。例えば、アグロバクテリウム株が、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な機能が不良である場合、システムの生物学的安全性を高めるために、更に栄養要求性及び／又は条件的致死性であることができる。
【００３０】
補完因子は、第１の遺伝子改変によって不良にされた機能を提供する。補完因子の存在下では、不良のアグロバクテリウム株による植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションが回復する。補完因子は小分子化合物であることができ、又は第１の遺伝子改変に依存して、タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸のようなポリマー性化合物であることもできる。アグロバクテリウム株が栄養要求性である場合、補完因子はアグロバクテリウム株の増殖及び感染性を可能にする。アグロバクテリウム株が、第１の遺伝子改変として不良のＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦ遺伝子を有する場合、補完因子はそれぞれＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、又はＶｉｒＦであるか、それらをコードする。アグロバクテリウム株が化学的に調節されたプロモーターの制御下にある場合、補完因子は、化学的に調節されたプロモーターを調節可能な、好ましくは誘導可能な小分子化合物であることができる。
【００３１】
補完因子は、その目的を遂行できるように提供される必要がある。補完因子が小分子化合物である場合、植物又は植物の葉の浸潤に用いるアグロバクテリウム株の水性懸濁液中に存在し得る。補完因子がタンパク質である場合も、この水性懸濁液に加えることができる。しかしながら、タンパク質である補完因子（例えばＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、又はＶｉｒＦ）はＤＮＡにコードされ、浸潤時、植物又は植物の葉に存在するように提供されることが好ましい。１つの態様では、植物又は植物の葉に、補完因子又はそれをコードするＤＮＡを植物又は植物の葉に導入可能な第２のアグロバクテリウム株を浸潤させる。第２のアグロバクテリウム株は、第１の遺伝子改変を有さず、本発明の異種ＤＮＡ配列も有さないアグロバクテリウム株であることが好ましい。本発明のアグロバクテリウム株及び第２のアグロバクテリウム株は、植物又は植物の葉を浸潤させる際、混合物として用いることができる。少量のそのような混合物が（好ましくは含まれている）本発明の方法を実施する環境を逃れるならば、そのようなアグロバクテリウム株の混合物は、２つの株が互いに近接する可能性を迅速に低下させるように迅速に希釈される。したがって、非標的生物は２つのアグロバクテリウム株に同時に触れず、よって、人工核酸も外来核酸も（例えば異種ＤＮＡ配列）そのような非標的生物を形質転換しないであろう。
【００３２】
他のより好ましい態様では、補完因子は植物又は植物の葉で安定に又は一過性に発現する。補完因子の安定な発現が好ましい。この態様では、植物は、補完因子をコードする遺伝子改変（以下及び特許請求の範囲において「第２の遺伝子改変」と称する）を提供される。アグロバクテリウム株は第２の遺伝子改変を有する植物を排他的に形質転換するため、高度な生物学的安全性はこのようにして達成することができる。アグロバクテリウム株が望ましくない生物又は望ましくない植物を形質転換する可能性は、これらの生物は第２の遺伝子改変を欠失しているため、非常に低い。
【００３３】
これまでに記載した方法の生物学的安全性をさまざまな方法で更に向上させることができる。レプリコンをコードする配列部分は、植物又は植物の葉においてレプリコンの伝播を可能にする機能が不良のレプリコンをコードすることができる。当該機能は、レプリコンの遠隔距離移行又は細胞間移行のための機能、例えばそれぞれウイルスコートタンパク質又はウイルス移行タンパク質であり得る。レプリコンは少なくとも遠隔距離移行の可能性を欠失していることが好ましく、それにより、他の植物へのレプリコンの伝播を回避することができる。遠隔距離移行の可能性の欠失は、原理的にはタンパク質発現効率に不都合であり得る。しかしながら、本発明のシステムでは、本発明の他の要素によって、例えば、植物又は植物の葉の主要部分を浸潤させることによって、及び／又は以下に記載するＲＮＡレプリコン形成の改良方法によって、この不都合を補完することができる。
【００３４】
生物学的安全性を更に改良するための他のアプローチは、腫瘍抑制活性タンパク質Ｏｓａ（ＲＥＦ）を発現する植物のトランスフェクションにアグロバクテリウム株を用いること、及びｖｉｒＥ２遺伝子を提供するための第２のアグロバクテリウム株を用いることである。更に、アグロバクテリウム株は、非標的生物へのＴ−ＤＮＡ伝達を低下させるために、遺伝子改変された菌体数感知システム又は病原性誘発調節システムを有することができる。
【００３５】
本発明の方法の生物学的安全性は、アグロバクテリウム株が、プラスミドＤＮＡの他の細菌への接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有するように改良することもできる。接合性伝達は、以下のアグロバクテリウム遺伝子：ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、及びｔｒａＦのうちの少なくとも１つの機能を無効にすることによって達成することができる。
【００３６】
異種ＤＮＡ配列の配列部分はＤＮＡレプリコンをコードしてもＲＮＡレプリコンをコードしてもよい。ＲＮＡレプリコンが好ましく、以下の記載はほとんどＲＮＡレプリコンをコードする配列部分に関係する。
【００３７】
レプリコンをコードする配列部分は、レプリコン形成に必要な配列と、レプリコンから発現されるべき目的配列とを含有する。発現されるべき目的配列は、典型的には目的タンパク質をコードし、レプリコンから、又はＲＮＡレプリコンのサブゲノムＲＮＡから目的タンパク質を翻訳するための調節配列を含有することができる。
【００３８】
レプリコンがＲＮＡレプリコンである場合、レプリコン（ｉ）のＲＮＡレプリコン機能に必要な配列は、とりわけ前者が後者のＤＮＡコピー（例えばｃＤＮＡ）である場合におけるＲＮＡウイルスの配列に相当する。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコン機能に関する配列は、細胞核で複製するための機能を有するＤＮＡレプリコンを提供する；ＤＮＡレプリコンは、異種ＤＮＡ配列又はその部分を鋳型として用いる複製によって異種ＤＮＡ配列から形成することができる。ＲＮＡレプリコンの場合、レプリコン形成に関する配列は、細胞質で複製するための機能を有するＲＮＡレプリコンを提供する。ＲＮＡレプリコン機能に関する配列は、典型的には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ、レプリカーゼ）のような複製に関与する１以上のタンパク質をコードする。レプリコン機能に関する配列は、更に、サブゲノムプロモーター、転写エンハンサー、又は翻訳エンハンサーのようなレプリカーゼの発現に必要な機能であるか又はそれをコードすることができる。植物におけるＲＮＡウイルスの細胞間伝播又は浸透伝播に関与する移行タンパク質又はコートタンパク質のようなタンパク質は、異種ＤＮＡ配列中に存在し得るが、レプリコン機能を有さない。いずれにしても、レプリコンをコードする配列部分は野生型植物ウイルスをコードしない。レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスはレプリコン機能のための容易に接近可能な供給源であるため、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来することが好ましい。ＲＮＡレプリコンの場合、「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列が、ＲＮＡウイルスの対応する配列のＤＮＡコピーであり、ＤＮＡコピーは細胞核に含有される異種ＤＮＡ配列に組み込まれることを意味する。「由来する」とは、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの対応するＲＮＡ配列の正確なＤＮＡコピーである必要はないが、以下に記載するように、機能保存的な相違を発揮できるという意味を含む。相違は機能保存的であるため、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスに関してそうであるのと同様に、レプリコン機能を実施可能なタンパク質をコードすることが好ましい。
【００３９】
レプリコンがタバコモザイクウイルスのようなトバモウイルスに基づく態様では、レプリコンはＲｄＲｐを含有するか又はコードする。このレプリコンは移行タンパク質を更にコードすることができる。このレプリコンは、コートタンパク質（ＣＰ）をコードせず、又は含有しないことが好ましい。
【００４０】
更に好ましい態様では、本発明の方法の生物学的安全性は、高度に希釈したアグロバクテリウム株の懸濁液を用いることによって更に改善される。この態様は、アグロバクテリウム株の細胞が環境に広がる可能性を減少させるだけでなく、植物にとって病原体であるアグロバクテリウム株で感染させる際、植物又は植物の葉の露出及びストレスを減少させることによって本発明の方法の効率を改善させる。本発明者らは、驚くべきことに、ある限度内で、本発明の工程（ａ）で用いるアグロバクテリウム懸濁液の濃度の低下とともに方法の効率が増加することを発見した。とりわけ、植物の細胞で産生されたレプリコンの細胞間移行能は、これらアグロバクテリウム懸濁液濃度の低下とともに増加する。この予想外の現象の理由は未だ特定されていない。この現象はアグロバクテリウム感染に対する植物の反応によるものであり、低アグロバクテリウム濃度ではこの反応は起こらない（又はより少ない程度で起こる）と推測される。
【００４１】
この好ましい態様では、６００ｎｍのＯＤ（光学密度）が１．０のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を少なくとも２５倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に希釈することによって得ることが可能なアグロバクテリウム細胞濃度のアグロバクテリウム株の細胞懸濁液で植物又は植物の葉を浸潤させる。そのような希釈は、６００ｎｍの算出ＯＤ値がそれぞれ高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１のアグロバクテリウム懸濁液をもたらす。
【００４２】
次に、レプリコンがＲＮＡレプリコンである場合、発現効率を顕著に増加させる重要な態様が記載される。この態様では、レプリコン機能に関する配列は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる。その相違は、全体的なプロセスのスイッチがいったん入ると、植物細胞におけるレプリコン形成頻度上昇の原因となる（以下を参照されたい）。レプリコン形成頻度上昇と相違とのあいだの因果関係を示す関連性は、相違を有するレプリコン機能に関する配列と相違を有さないレプリコン機能に関する配列とのあいだのレプリコン形成頻度を比較することによって実験的に試験することができる。そのような実験的比較は、実施例に記載するように、例えば目的配列を発現するプロトプラストを計数することによって行うことができる。容易に検出可能な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポータータンパク質をコードする目的配列をこの目的に用いることが好ましい。更に以下に記載するように、細胞間伝播不可能なＲＮＡレプリコンとの実験的比較を行うことも好ましい。
【００４３】
機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置でレプリコン機能に関する配列に導入される。選択された位置は、核で転写されたＲＮＡレプリコンが機能性レプリコンとして細胞質に出現する可能性の低さの原因である植物ＲＮＡウイルスのレプリコン機能に関する配列内に位置する。そのような選択された位置は、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量、即ち高Ａ含量及び／又は高Ｔ含量（ＲＮＡレベルでは高Ｕ含量）を有するか、又は潜在スプライシング部位、即ち核のスプライシング装置によってスプライシング部位として認識される配列部分を有することが好ましい。選択された位置は、以下に例示するように、ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを解析することによってＲＮＡレプリコンが基づくＲＮＡウイルス中に同定することができる。更に、選択された位置は、本発明による相違を発揮しないＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡでトランスフェクションした後、植物細胞で形成されるＲＮＡを解析することによって実験的に同定することができる。この実験的解析は、ＲＴ−ＰＣＲによって、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定とともに行うことができる。このようにして、ＲＮＡレプリコンを破壊するスプライシングイベントを示す望ましくないスプライシング産物を同定することができる。更に、望ましくないスプライシングの正確な部位を同定し、そして機能保存的な相違を選択された位置に導入することによって是正することができる。
【００４４】
機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコン形成頻度に対する選択された位置の有害効果を抑制することによってＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる。機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコンをコードする配列のレプリコン機能に関する配列において高Ａ／Ｔ含量を低下させることによって、ＲＮＡレプリコンにおいて高Ａ／Ｕ含量の低下を含むことができる。高Ａ／Ｕ含量は、相違が機能保存的である限り、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換（例えば遺伝コードの縮重を用いて）によって低下させることができる。更に、植物ＲＮＡウイルス由来配列のＡ／Ｕに富んだ領域に隣接する潜在スプライシング部位は除去することができる。そのような機能保存的な相違は、１つの、好ましくはいくつかの選択された位置に導入することができる。
【００４５】
好ましい機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍又はその中への１以上のイントロンの挿入、最も好ましくは核イントロンの挿入、又は核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む。驚くべきことに、Ａ／Ｕに富んだ位置又はその近傍へのイントロンの導入は、ＲＮＡレプリコン形成頻度の上昇をもたらすことが発見された。いくつかのイントロンを導入することができ、さまざまな数の挿入イントロンに関し、本明細書に例示している。１より多いイントロンの効果は累積的である。更に、イントロンの挿入は、他の選択された位置で他の機能保存的な相違と組み合わせることができる。
【００４６】
図１１は、発現されるべき目的配列内ではあるが、核イントロンを形成可能な配列の導入例を示す。図１１の例では、異種ＤＮＡ配列の一部のリコンビナーゼによって触媒される反転によって２つの半イントロンからイントロンが形成される。この原理もＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列に応用することができる。同一細胞内で２つの異なるＲＮＡレプリコンが形成される態様では、２つの異なるレプリコン間の組換えは、異なるレプリコン上に存在する２つの半イントロンから１つのイントロンを形成することができる。更に、ＲＮＡレプリコンは、いずれもレプリコンではない２つのレプリコン前駆体間の組換えによって形成することができる。この場合も、異なるレプリコン前駆体に由来する２つの半イントロンから１つのイントロンを組み立てることができる。
【００４７】
ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列は、転写がＲＮＡレプリコン形成の必要条件であるため、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能である。アグロ浸潤させた全ての組織において目的配列の一過性発現を達成するには、転写プロモーターは構成的プロモーターであることが好ましい。構成的プロモーターの例は当該技術分野において公知である。
【００４８】
本発明の１つの態様では、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、ＲＮＡレプリコンを共にコードする１以上のセグメントを有する。即ち、ＲＮＡレプリコンは１つの連続ＤＮＡによってコードされていない。実際、ＲＮＡレプリコンは２以上のセグメントによって不連続にコードされ、それにより、セグメントは同一Ｔ−ＤＮＡ上に好ましくは互いに隣接して存在することができる。次に、ＲＮＡレプリコン形成は、例えば組換えによるセグメントの再配列を必要とすることができる。組換えのためのリコンビナーゼは、追加のアグロバクテリウム株によって、又は遺伝子操作された植物宿主によって提供することができ、よって一過性発現を植物宿主にとどめることができる。例として、レプリコン機能に関する配列の一部（例えばレプリカーゼをコードする配列の一部）が、そのような配列の他の部分に対して反転方向で異種ＤＮＡ配列中に存在することができる。反転部分は組換え部位に隣接することができる。次に、レプリコン機能は提供できないため（例えば転写物は機能性レプリカーゼをコードしないため）、異種ＤＮＡの転写物はレプリコンではないであろう。組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを提供することによってセグメントの１つを反転させ、その結果レプリコンが連続的にコードされる。この態様では、リコンビナーゼを提供することにより、レプリコン形成と目的配列の発現に切り替えるためのスイッチとして機能し（更に以下を参照されたい）、高度な生物学的安全性に寄与することができる。
【００４９】
あるいは、セグメントの１つはアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ上に存在することができ、他の１つは植物染色体に組み込むことができる。次に、ＲＮＡレプリコンの形成は、ＲＮＡレプリコンを組み立てるために、両方のセグメントの転写と、両方の転写物のトランススプライシングを必要とするであろう。この態様は、ＰＣＴ／ＥＰ０３／０２９８６号に詳細に記載されているように、子孫植物又は細胞においてＲＮＡレプリコンを共にコードするセグメントを迅速に分離するために用いることができ、システムの生物学的安全性に寄与することができる。
【００５０】
本発明の方法は、本発明の異種ＤＮＡ配列による植物又は植物の葉の一過性トランスフェクションを含む（工程（ａ））。「一過性トランスフェクション」という用語は、植物染色体に安定に組み込まれた異種ＤＮＡを有する形質転換されたトランスジェニック細胞を選択することなく異種ＤＮＡを導入することを意味する。一過性トランスフェクションは、通常、異種ＤＮＡ配列によってコードされる遺伝子の一過性複製及び／又は一過性発現を提供する。本発明のトランスフェクションは、目的配列の発現を引き起こす。通常、発現は、植物又は植物の葉にアグロ浸潤にて異種ＤＮＡ配列を提供後、自然発生的に起こる。必要に応じて、発現を引き起こすか又はスイッチを入れるさまざまな方法を用いることができる。本発明の方法のスイッチを入れるためにリコンビナーゼを用いる場合、リコンビナーゼは植物又は植物の葉に一過性に提供することができ、その提供が目的タンパク質の発現スイッチとして作用することができる。そのようなリコンビナーゼは植物細胞に安定にコードされ、構成的又はストレス誘導性プロモーターの制御下でリコンビナーゼを発現できることが好ましい。プロモーターの誘導によりリコンビナーゼ発現を誘導することにより、目的配列の発現を引き起こすことができる。
【００５１】
本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）でトランスフェクションした、好ましくは浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離することを含む。目的タンパク質の単離は、発現した目的タンパク質を含有する植物又は植物の葉の均質化を含むことが好ましい。タンパク質を植物から単離するためのさまざまな方法が、本明細書中に援用されるＰＣＴ／ＥＰ０２／０９６０５号、及びそこで引用されている文献に記載されている。
【００５２】
本発明は、原理的には、感染性のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスが存在し、一過性発現を提供するアグロ浸潤が有効であるあらゆる植物に適用することができる。好ましい植物はベンサミアナタバコ及びタバコのようなタバコ種である；タバコ種以外の好ましい植物種は、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、クレス、ルッコラ、マスタード、イチゴ、ホウレンソウ、アカザ、レタス、ヒマワリ、及びキュウリである。
【００５３】
好適な植物／ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスのペアは、以下に示すＤＮＡ及びＲＮＡウイルスのリストに由来することができる。特に、本発明によるＲＮＡレプリコン形成が非常に高率であるため、本発明を実施する際、植物ウイルスの植物種特異性はほとんど目立たない。同様に、本発明は、あらゆるＲＮＡウイルスに基づいたＲＮＡレプリコンにより用いることができる。ＲＮＡウイルスは、通常、宿主植物の細胞核の外部で展開し、レプリコンを細胞核内で産生する場合、そのようなウイルスに基づいたレプリコンを効果のないものにする選択された位置を有するであろう。本発明は、異なる植物ＲＮＡウイルスのあいだで改良レベルがさまざまであり得るが、全てのＲＮＡウイルスに適用することができる。本発明が基づくことができる最も好ましい植物ＲＮＡウイルスは、トバモウイルス、特にタバコモザイクウイルス、及びジャガイモＸウイルスなどのポテックスウイルスである。タバコモザイクウイルスの場合、通常、発現されるべき目的配列によって置換されるコートタンパク質であろう。移行タンパク質は、除去するか、又は発現されるべき目的配列によって置換することもできる。しかしながら、好ましくは、タバコモザイクウイルスに由来するＲＮＡレプリコは、移行タンパク質をコードし、コートタンパク質が目的配列によって置換されている必要がある。
【００５４】
植物とＲＮＡレプリコンが由来するウイルスとの好ましい組み合わせは：タバコ種とトバモウイルス、タバコ種とタバコモザイクウイルスなどである。
ＤＮＡウイルスの中で、最も好ましいウイルスベクターはジェミニウイルスで構築することができる。ビーンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）に基づくウイルス発現ベクターについての記載は、実施例１５に提供されている。
【００５５】
本発明の主要な応用は、目的タンパク質の植物又は植物の葉における産生である。本発明の方法を植物で実施する場合、タバコ種のようにヒト又は動物の食物連鎖に入らない植物が好ましい。アグロ浸潤後の植物全体又は植物の部分は、閉鎖環境、例えば温室又は特別に設計されたチャンバーに、所望の発現レベルを提供するのに必要なインキュベーション時間、閉じ込められるであろう。
【００５６】
本発明の効率は、植物発現システムの新たな局面を達成するようなものである。本発明により達成可能な発現レベルは、下流処理費用（目的タンパク質の分離・精製を含む）が本発明の方法を他の大規模発現システムと競合させるのに十分なほど低いものである。安定に形質転換された植物を用いた先行技術の発現システムでは、細胞の小さな画分でレプリコンを産生するため、ウイルスに基づいたベクターを用いた場合であっても発現レベルは低い。植物中に伝播するレプリコンは、特に遠隔距離に対する伝播が遅いため、この問題を是正することができない。したがって、植物において発現は均一に進行せず、植物のある部分では目的タンパク質の分解が既に起こるが、他ではタンパク質発現が開始してもいない。更に、先行技術のトランスフェクション又はアグロ浸潤に基づいた一過性発現システムは、１つの産生システムで高発現レベルも高い生物学的安全性も提供しない。本発明は、コンピテント植物宿主のアグロ介在送達を介して植物全体でも分離した植物の部分（例えば葉）でも均一に発現を誘引させる。レプリコンを産生しない細胞の小さな画分を、隣接細胞由来のレプリコンによって速やかに感染させることができる。本発明は、大規模で使用できる初めての高収率植物発現システムを提供する。本発明は、一過性発現システムを特異的に遺伝子操作されたコンピテント植物宿主に限定することによって高い生物学的安全性も提供し、それにより非コンピテント（非標的）生物において発現する確立を低下させ、システムの生物学的安全性を増加させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
発明の好ましい態様
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている。
【００５８】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
好ましくはＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって、植物又は植物の葉をトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変を提供されており、そして
植物又は植物の葉は、補完因子をコードし、植物又は植物の葉においてそれを発現する第２の遺伝子改変を有する。
【００５９】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
６００ｎｍの算出光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当する細胞濃度を有する、ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株の細胞懸濁液を補完因子の存在下で植物又は植物の葉に浸潤させることによって植物又は植物の葉にトランスフェクションすることを含み、
レプリコンをコードする配列は、
（−） 植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（−） 発現されるべき目的配列、
を含有し、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、レプリコン形成頻度を上昇させる。
【００６０】
更に好ましい態様を特許請求の範囲に定義する。
発明の詳細な説明
本発明者らは、土壌細菌であり、有効な媒介生物であるアグロバクテリウムを用いてＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡ前駆体として送達するための、高度に活性な合成鋳型を開発した。本明細書において、この改良「アグロ感染」法を用いて、植物の実質的に全ての成熟した葉において一過性遺伝子増幅及び高レベル発現を同時に開始することができ、そしてそのようなトランスフェクション経路を工業的規模で安価に実施することができるを示す。産生を遺伝子操作された「コンピテント」植物宿主に限定し、産生方法の一部ではない他の植物又は微生物へのアグロバクテリウムの感染能を制限することができるような方法で標的植物宿主生物、アグロバクテリウム、及び／又は植物ウイルスを遺伝子操作することによって、生物学的安全性の問題にも取り組む。この技術は、３つの生物学的システムの利点を組み合わせる：ウイルスの速度と発現レベル／収率、アグロバクテリウムのトランスフェクション効率と浸透送達、及び植物の翻訳後能力と低産生コスト。提案した方法は、目的産物をコードする異種核酸による植物の安定な遺伝子改変を必要としない工業的産生経路を可能にし、より安全で制御され、近年の産業基盤に適合している。
【００６１】
本発明は、ウイルスレプリコン又はその前駆体のアグロバクテリウム介在送達を用いた目的タンパク質の高収率大規模産生のための一過性発現システムについて記載する。レプリコンは目的配列を発現可能であり、システムは組み込まれた生物学的安全性を有し、システムの３つの主要成分のうちの少なくとも２つ（遺伝子操作された植物宿主、アグロバクテリウム、レプリコン）を相互依存にする。
【００６２】
驚くべきことに、システムの主要成分のうちの１つから他の１つへ機能を部分的に委譲することによって生ずるそのような相互依存を、システムの効率に悪影響を及ぼさずに方法全体をよりよく制御し、生物学的安全性を増大させるようになし得ることを発見した。本発明の基本原理を図１（Ａ）に示す。ウイルスレプリコン前駆体のアグロ浸潤に基づいた大規模タンパク質産生方法は、目的タンパク質の発現に必要な機能を実施する際にアグロ浸潤に用いるアグロバクテリウム及び／又はレプリコンを補完するトランスジェニック宿主植物にて実施することができる。ＲＮＡレプリコンに関するそのような補完の１つの例を実施例４に記載する。この実施例では、植物全体を機能性移行タンパク質（ＭＰ）を欠失したＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列（図５）により一過性に形質転換した。このレプリコンは細胞間移行できなず、その結果、ウイルスＭＰを有する発現カセット（ｐＩＣＨ１０７４５、図５）を有さない植物宿主では高収率を提供することができない。
【００６３】
ウイルスレプリコンの活性化若しくは操作、又は一過性トランスフェクションに必要な機能を植物又は他のアグロバクテリウム株によってトランスで提供する場合、核から細胞質へのＲＮＡ放出効率を増加させるための本明細書に記載の基準を用いたとき、発現効率に悪影響は全く見られない。植物イントロンをウイルスＲＮＡレプリコンをコードするある領域へ組み込むことにより、又はレプリコン機能に関する配列内の潜在イントロンの除去若しくは置換により、宿主植物におけるレプリコンの効率を劇的に相加させることができる（少なくとも１０２倍）。そのような効率の増加は少なくとも１つの容易に測定可能なパラメータに反映された：ベクターの複製を示す細胞の相対的割合、即ち、レプリコン形成頻度の上昇。ＲＮＡレプリコン形成開始のそのような最適化は、実質的に植物全体において目的配列の発現スイッチを同時に入れる能力をもたらし、非改変ベクターよりも短時間で目的タンパク質の収率が劇的に増加する。本発明の実施例６〜１４は、核から細胞質へのＲＮＡウイルスベクターの放出効率を増加させるためのベクターの改良アプローチについて記載する。ウイルスベクターの改良に関する詳細な説明は、近年、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ及び同僚らによって公表された（２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３、７１８−７２３）。この改良は、ＲＮＡレプリコン、植物宿主、及びアグロバクテリウムのあいだで機能を効率的にやりとりさせるため、本発明の重要な態様である。興味深いことに、ＴＭＶに基づいたそのような改良ベクターは、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、並びにクレス、ルッコラ、及びマスタードのようなタバコ種以外の植物種において効率的に作用する。最も発現する非ナス科種は、イチゴ、ホウレンソウ、アカザである。レタス（特に苗木）及びヒマワリのようなキク科並びにウリ科のキュウリは、さまざまな植物科由来のいくつかの植物種を、好ましくは更に方法を最適化した後で成功裏に用いることができることを示している。
【００６４】
組換えＤＮＡのコード領域へのイントロンの組み込みによる核のトランス遺伝子発現の増加に関する出版物（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５、９１３−９２０；Ｂｏｕｒｄｏｎら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２、３９４−３９８；Ｒｏｓｅ，ＡＢ．、２００２、ＲＮＡ、８、１４４４−１４５３；ＵＳ５，９５５，３３０号）にもかかわらず、先行技術には、ウイルスＲＮＡレプリコン前駆体へのイントロンの組み込みが、ウイルスレプリコンの形成頻度及びレプリコンからの目的配列の発現レベルに良い効果を与えるであろうことを示す暗示は全くない。この効果は、核のｍＲＮＡ転写とウイルスＲＮＡの複製とは異なる細胞内区画で起こることを考慮すると驚くべきことである。ＲＮＡレプリコンのｃＤＮＡコピーを核内におく場合でさえ、ウイルスレプリコン前駆体の最初のコピーのみが核において産生され、次いで細胞質において核内とは異なる条件下で増幅される。先行技術では、野生型ウイルスｃＤＮＡを用いたクローニングのあいだ、大腸菌におけるウイルス遺伝子の「漏出性」発現の細胞障害効果を妨げるために、イントロンの使用が記載されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｉ．Ｅ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２４００−１２４０５；Ｙａｎｇら、１９９８、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４３、２４４３−２４５１；Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｙａ＆Ｇａｒｃｉａ、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、６８、９９−１０７）。イントロンｉｎｃｌｕｓｉｏｎが、ウイルスｃＤＮＡクローンからのレプリコン形成頻度を上昇させることができることを示す暗示は全くない。
【００６５】
本発明は、ＤＮＡ前駆体の転写によって派生し、目的配列の発現のためにデザインされている、ＲＮＡウイルス由来レプリコンの形成頻度を根本的に増加させる方法を提供する。この方法は、発現されるべき異種配列のサイズの限界やベクターの高度な不安定性のような、既存のウイルスベクターに基づいた発現システムの限界を克服する。更に、この方法は、より良い生物学的安全性を提供し、トランス遺伝子発現に対する漏出検査制御のデザインを可能にする（非誘導状態でゼロ発現レベル）。そのようなデザインは、ＲＮＡウイルス由来レプリコンをデザインするための戦略に統合された部分であるためである。ＲＮＡウイルス由来レプリコンの高頻度形成を提供することによって、本明細書に記載のアプローチは、植物全体、又はＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列を含有する葉のような植物の一部において目的配列の発現を速やかに開始させる。本発明を実施することにより、植物又は植物の葉のアグロ浸潤を介した異種目的配列の発現のためにデザインされた、植物ＲＮＡウイルスに由来する実質的に全てのレプリコンの性能を、レプリコン形成頻度の劇的な上昇によって顕著に向上させることができる。
【００６６】
さまざまな分類群に属するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが、本発明によるＲＮＡレプリコンの構築に好適である。本発明を適用できるＤＮＡ及びＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示している。種名（俗名）を標準体で示す。属又は科について正式に帰属されていないウイルスが示されている：
ＤＮＡウイルス：
環状２本鎖ＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス科、属：バドナウイルス属、基準種：ツユクサ黄斑ウイルス、属：カリモウイルス属、基準種：カリフラワーモザイクウイルス、属：“ＳｂＣＭＶ様ウイルス”、基準種：ダイズ退緑斑紋ウイルス、属：“ＣｓＶＭＶ様ウイルス”、基準種：キャッサバ葉脈モザイクウイルス、属：“ＲＴＢＶ様ウイルス”、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍウイルス、属：“ペチュニア葉脈透化様ウイルス”、基準種：ペチュニア葉脈透化ウイルス；
環状１本鎖ＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス科、属：マストレウイルス属（サブグループＩ ジェミニウイルス）、基準種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：クルトウイルス属（サブグループＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビートカーリートップウイルス、属：ベゴモウイルス属（サブグループＩＩＩ ジェミニウイルス）、基準種：ビーンゴールデンモザイクウイルス；
ＲＮＡウイルス：
１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグサモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップ黄斑ウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス、科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアンソウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシ黄色斑紋ウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ矮化ウイルス、属が未分類の１本鎖ＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス属、基準種：リンゴステムグルービングウイルス；
属：カーライルウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス、属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ萎縮ウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス、属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏウイルス、属：ポテックスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔウイルス、属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス、属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジン斑紋ウイルス；マイナスｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス目、科：ラブドウイルス科、属：サイトラブドウイルス属、基準種：レタス壊死性黄斑病ウイルス、属：ヌクレオラブドウイルス属、基準種：ジャガイモ黄萎ウイルス；
マイナス１本鎖ＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス科、属：トスポウイルス属、基準種：トマト黄化壊疽ウイルス；
２本鎖ＲＮＡウイルス：科：パーティティウイルス科、属：アルファクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサ潜在ウイルス１、属：ベータクリプトウイルス属、基準種：シロツメクサ潜在ウイルス２、科：レオウイルス科、属：フィジーウイルス属、基準種：フィジー病ウイルス、属：ファイトレオウイルス属、基準種：創傷腫瘍ウイルス、属：オリザウイルス属、基準種：イネｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔウイルス；
未分類ウイルス：
ゲノム：１本鎖ＲＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ブドウ葉脈ｆｌｅｃｋウイルス、種：トウモロコシｗｈｉｔｅ ｌｉｎｅモザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ウルミアメロンウイルス、種：ペラルゴニウムｚｏｎａｔｅ ｓｐｏｔウイルス。
【００６７】
本発明の一般的原理を図１（Ａ）に示す。本発明の実施に多くのさまざまなアプローチを用いることができる。これらのアプローチは一過性発現を提供不可能なアグロバクテリウム変異体の使用に基づくことができ、変異体はトランスジェニック宿主植物又は第２のアグロバクテリウム株によってトランスに補完することができる。
【００６８】
システムの生物学的安全性を高めるために、本発明では感染しやすい植物へのアグロバクテリウムの感染を妨げ、それにより、一過性発現方法に対する制御を高める。植物宿主へのアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ伝達メカニズムに関する包括的な研究があり、これは本発明に成功裏に適用できる。
【００６９】
１つの可能なアプローチは、ウイルスレプリコンをコードする異種ＤＮＡ配列を有するアグロバクテリウム株を遺伝子操作された植物宿主に明確に限定することである。プラスミドｐＳＡのｏｓａ遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ輸送に必要なｖｉｒＥ２タンパク質を抑制することによって一過性発現を抑制し、更に植物の核ＤＮＡへの組み込みを抑制できる腫瘍抑制活性タンパク質をコードする（Ｌｅｅ，Ｌ−Ｙ．ら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、１８６−１９６）。しかしながら、この抑制は、ｏｓａ遺伝子を発現するアグロバクテリウムを野生型ｖｉｒＥ２を有するがｏｓａ遺伝子のないアグロバクテリウムと混合することによって、例えば変異体表現型をトランスで補完することによって逆転することができる。ｖｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物を作製することによって同様の結果を達成することができる。Ｔ−ＤＮＡは、その５’端に共有結合的に結合したＶｉｒＤ２とともに１本鎖中間体として植物細胞へ輸送されるが、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウム変異体は発癌性ではないため、ｖｉｒＥ２はこの方法の重要な成分である。そのような変異体の発癌性は、ｖｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物に接種することによって回復させることができる（Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，Ｖ．ら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１８０２−１８０５）。更に、完全にアセトシリンゴン依存性のアグロバクテリウム変異体がある。本発明の実施例５では、本発明の異種ＤＮＡ配列を有するアグロバクテリウム株の能力がｖｉｒＥ２タンパク質をトランスで補完するための遺伝子操作された植物宿又は野生型アグロバクテリウムに依存する一過性発現方法について記載する。また、アグロバクテリウム・リゾジェネスＧＡＬＬＳタンパク質は、ＶｉｒＥ２の機能を補完することができる（Ｈｏｄｇｅｓら、２００４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８６、３０６５−３０７７）。そのようなシステムは、異種ＤＮＡの伝播制御を顕著に改良し、システムの生物学的安全性を高める。この実施例に記載のように、実際に、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウムによる野生型ベンサミアナタバコ植物のアグロ浸潤後、目的タンパク質（ＧＦＰ）の発現は全く検出されなかった。しかしながら、ｖｉｒＥ２を発現する補完された宿主植物をアグロ浸潤したとき、又はこの第１の遺伝子改変を有するアグロバクテリウム株との混合物中で野生型アグロバクテリウムをアグロ浸潤したとき、ＧＦＰは効率的に発現した。実際に、ｖｉｒＥ２を欠失するアグロバクテリウムによるＴ−ＤＮＡ送達効率は、野生型アグロバクテリウムやトランスで補完された変異体アグロバクテリウムと比較して、約１０，０００倍低下した（実施例５、図１７を参照されたい）。
【００７０】
生物学的安全性を高めたシステムを設計するためのアプローチは、ｖｉｒＥ２機能のトランス補完に限定されない。ｖｉｒＦ遺伝子もｖｉｒＥ２と同様に、ｖｉｒＦ欠失アグロバクテリウムを補完することによって一過性発現に適した植物宿主を作製するために用いることができる（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ−Ｔｕｉｎｋ，ＡＪ．＆Ｈｏｏｙｋａａｓ，ＰＪ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、６９−７１）。興味深いことに、ｏｓａタンパク質は、ｖｉｒＥ２タンパク質とｖｉｒＦタンパク質の分泌をともに妨げる（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、７５４５−７５５０）。あるいは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＩｎｃＰ型又はＩｎｃＮ型接合伝達システムを異なる細菌、大腸菌株へ導入することができ、この菌株は、安全化アグロバクテリウム・ツメファシエンス株の存在下でＴ−ＤＮＡ伝達を提供することができる（Ｐａｐｐａｓ，ＫＭ．＆Ｗｉｎａｎｓ，ＳＣ．、２００３、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９、６７３１−６７３９）。後者は、コンピテントアクセプター宿主及び当該コンピテント宿主に限定された１種又は複数の細菌ドナー株（例えばドナー株とヘルパー株）を有する、生物学的安全性を高めたシステムを設計するための多くのさまざまな可能性があることを示している。このアプローチは、他の生物への望ましくないＴ−ＤＮＡ伝達の可能性を顕著に制限する。
【００７１】
植物細胞へのアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ伝達能に加えて、アグロバクテリウムは、多くの他の細菌と同様、他の細菌との接合を介して遺伝物質（通常染色体外プラスミドＤＮＡ）を伝達することもできる。工業的アグロバクテリウム株から他のアグロバクテリウム株（例えば野生型アグロバクテリウム）へのそのようなプラスミドＤＮＡ（例えばバイナリーベクター）の伝達能は、環境へのトランス遺伝子放出に対する制御を危険にさらすであろう。多くの場合、そのような接合伝達は、多くのバイナリーベクターは接合伝達に必要な構造要素（例えば伝達起点を表すｏｒｉＴ）を含有せず、したがって、大腸菌から目的アグロバクテリウム株へのバイナリープラスミドの接合伝達に基づいた三親性接合を介さず、直接形質転換によってのみアグロバクテリウム株に導入することができるため、トランス遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ領域を有するバイナリーベクターを安全化Ｔｉプラスミドと組換える場合にのみ可能である。さまざまなバイナリーベクターに関する概説として、Ｈｅｌｌｅｎｓ，Ｒ．、Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ，Ｐｈ．＆Ｋｌｅｅ，Ｈ．（２０００、Ｔｒｅｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、５、４４６−４５１）を参照されたい。しかしながら、バイナリーベクターがｏｒｉＴを含有しない場合でさえ、依然として、バイナリーベクターと居住安全化Ｔｉプラスミドとのあいだで組換わる可能性がある。そのような組換えは、トランス遺伝子を有するＴ−ＤＮＡ領域を含有するプラスミドの形成をもたらし得、それにより、プラスミドは異なる細菌間で接合伝達可能であり得る。いくつかの遺伝子がアグロバクテリウム細胞間の接合伝達に関与している（Ｃｏｏｋら、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９、１２９１−１２９７；Ｂｅｃｋら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１、５２８１−５２８９）。しかしながら、最も必須の領域（ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、ｔｒａＦ）は全て居住Ｔｉプラスミド上に局在している（Ｏｇｅｒ＆Ｆａｒｒａｎｄ、２００２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４、１１２１−１１３１；Ｆａｒｒａｎｄ、Ｈｗａｎｇ＆Ｃｏｏｋ、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７８、４２３３−４２４７；Ｌｉ＆Ｆａｒｒａｎｄ、２０００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２、１７９−１８８）。相同組換えによるこの領域の除去は、居住Ｔｉプラスミドとバイナリーベクターとの相同組換えが起こる場合でさえ、細菌間接合伝達を低下させるであろう。接合伝達に関与する領域を欠失するアグロバクテリウム株のデザインは、上記参考文献及び標準の分子生物学的技術を用いた本発明の実施例１６に提供された記載にしたがい、容易に行うことができる。実施例１６は、接合性プラスミド伝達に関与する遺伝子の欠失が、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達効率に影響を及ぼさないことを示している（図２０も参照されたい）。
【００７２】
本発明による発現システムの発現効率を高めるための更なるアプローチは、アグロバクテリウム感染を限定する宿主細胞因子とアグロバクテリウム因子の使用である。多くのそのような因子が、アグロバクテリウムが介在する安定な植物トランスフェクションに関する概説に記載されている（Ｇｅｌｖｉｎ，ＳＢ．、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１、９５−９８；Ｇｅｌｖｉｎ，ＳＢ．、２００３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６７、１６−３７）。例えば、トランスジェニックタバコ植物においてシロイヌナズナ遺伝子ＶＩＰ１を過剰発現させることにより、アグロバクテリウムによる一過性の及び安定な遺伝子トランスフェクションに対してより顕著に感受性にすることを見出した（Ｔｚｆｉｒａ，Ｔ．、Ｖａｉｄｙａ，Ｍ．＆Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，Ｖ．、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、１０４３５−１０４４０）。植物のトランスフェクション効率を向上させる要因は、アグロバクテリウム病原性遺伝子の構成的発現であり得る。通常、そのような遺伝子は、環境因子又はｖｉｒ遺伝子の発現を誘引するカスケードの制御下にあり、フェノール化合物、糖、ｐＨ変化によってスイッチを入れることができる。これらの因子、ＶｉｒＧ のＶｉｒＡタンパク質介在リン酸化を引き起こし、次いで他のｖｉｒ遺伝子のプロモーターを活性化することができる。ＶｉｒＧ内の単一アミノ酸置換によって起こる突然変異は、ＶｉｒＡとは独立して他のｖｉｒ遺伝子の構成的発現を引き起こすことができる（Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．、Ｄａｓ，Ａ．＆Ｃｈｉｌｔｏｎ，ＭＤ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、７６０３−７６０７）。この文献では、アグロバクテリウムの変異体ＶｉｒＧ株を用いたＧＵＳレポーター遺伝子による一過性発現実験で、タバコ及びトウモロコシの組織においてＧＵＳを発現する焦点数の顕著な増加を検出した。タバコにおいて一過性発現効率を促進するために複数コピーの野生型ＶｉｒＧを用いたとき、同様の効果を観察したが、トウモロコシにおいては実際のところ効果がなかった。著者らは、そのようなＶｉｒＧ変異体株は、扱いにくい植物種の形質転換に有用であり得ることを示唆している。これは、それらが、通常、形質転換が困難な植物種のためのウイルスベクターに基づいた一過性発現システムの開発にも有用であることを意味している。植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達を刺激する、フェノール化合物（Ｍｅｌｃｈｅｒｓら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３、９６９−９７７）、アセトシリンゴン、若しくはオパインなどのさまざまな化学因子とともに、又はそれらとは独立した、上記のようなＶｉｒＧ変異体遺伝子の使用は、一過性発現効率を高めるための有用なアプローチである（Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔら、１９９８、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９、１５３７−１５４８）。
【００７３】
本発明の一過性発現システム及び方法の生物学的安全性を顕著に高めることができる他の要因は、栄養要求性アグロバクテリウム株の使用である。そのような栄養要求性株は開かれた環境で生存する確率が低いためである。Ｘ線処理による栄養要求性アグロバクテリウム株の作製は、Ｄｉｒｋｓ＆Ｐｅｅｔｅｒｓ（ＵＳ６３２３３９６号）に記載されている。この特許にはいくつかのそのような株（メチオニン若しくはシステイン要求株、又はヒスチジン及びアデニン要求株）が記載されている。生長にメチオニンを必要とする変異体の１つは、ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼの機能が欠損している。データベースで完全なアグロバクテリウムゲノム配列を利用可能であることを考慮すると、Ｘ線処理によって得られるあまり予測できない結果にかわり、十分に特徴付けられた（配列決定された）アグロバクテリウム株のそのような変異体を、相同組換えによる遺伝子置換を用いて作製することは直接的である。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８ゲノム配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０５）は、５−メチルテトラヒドロプテロイル−トリグルタミン酸−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（遺伝子ＩＤ １１３５６９７）を含有する。利用可能な配列情報を用いて変異体型遺伝子を作製し、アグロバクテリウムへ更に送達し、目的の栄養要求性変異体 (例えば、ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ変異体型遺伝子の場合、メチオニン代謝欠損変異体) を選択するために、隣接配列とともに、対抗選択可能マーカー遺伝子ｓａｃＢＲを含有する自殺ベクターへクローニングすることができる（Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、１９９３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７５、１７２３−１７３４）。記載のアプローチ及びさまざまな栄養要求性アグロバクテリウム株に関する公的に利用可能な情報を用いて多くの他の変異体を作製することができる。Ｃｏｌｌｅｎｓ及び同僚ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０（２００４）、８９０−８９６）は、挿入変異によって栄養要求性アグロバクテリウム変異体を作製した。そのような変異体株は、アデニン、ロイシン、システイン、又はチアミンの非存在下では増殖できない。これれらの変異体のいくつかは、Ｔ−ＤＮＡ送達効率が低下しているが、他（ｃｙｓ−３２）は、野生型アグロバクテリウムよりも高くさえある植物細胞へのＴ−ＤＮＡ送達能を有する。影響を受けたことが予想されるアグロバクテリウム遺伝子はおそらくｌｅｕＢ、ｔｈｉＤ並びにｃｙｓＥ及びｃｙｓＫである。当然ながら、栄養要求性株の選択は、植物細胞への効率的Ｔ−ＤＮＡ伝達のためのその適合性に基づくであろう。また、より高い生物学的安全性レベル（野生型への復帰変異頻度が低い）のために、２以上の異なる栄養素供給にたいする栄養要求性株（例えば２以上の変異遺伝子を有する）を作製することができる。栄養要求性アグロバクテリウム株（ＤｌｅｕＢ及びＤｐｙｒＥ）の作製は、実施例１７に記載されている。
【００７４】
要求される機能（例えばＴ−ＤＮＡ伝達）のみを実施し、及び／又はトランス補完因子（例えばｖｉｒＥ２タンパク質、代謝化合物の添加）の存在下でのみ生存できるアグロバクテリウムの変異体株に加えて、細菌細胞の能動生物学的封じ込め（ＡＢＣ）システムに基づいたアプローチを用いることができる。そのようなシステムの例は、Ｒｏｎｃｈｅｌ＆Ｒａｍｏｓによって記載されている（２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７、２６４９−２６５６）。この文献において、著者らは、汚染物質の非存在下で細菌集団の生存又は死を細胞死の誘導を介して自由自在に制御するためにデザインしたＡＢＣシステムについて記載している。このシステムは、大腸菌ｇｅｆ遺伝子によってコードされるポリン誘導タンパク質のような死滅遺伝子の使用に基づいている。この遺伝子は、ｌａｃＩ誘導性プロモーターの制御下に置かれる。このシステムにおけるＬａｃＩ発現は、環境シグナルに依存するプロモーターの制御下にある。ＡＢＣシステムをデザインするための他の死滅遺伝子を使用する類似スキームは、数多くの文献に記載されている（例えば、Ｋｎｕｄｓｅｎら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１、９８５−９９１；Ｒｏｎｃｈｅｌら（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４、４９０４−４９１１；Ｔｏｒｒｅｓら（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４９、３５９５−３６０１）。ストレプトアビジンに基づいた封じ込めシステムは、Ｓｚａｆｒａｎｓｋｉ及び同僚ら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、１０５９−１０６３）、並びにＫａｐｌａｎ及び同僚ら（１９９９、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１６、１３５−１４０）によって記載されている。
【００７５】
あるいは、細菌細胞において機能性の誘導性システムを用いて、特定機能に関与する遺伝子の発現を制御することができる（例えばＴ−ＤＮＡ伝達又はアミノ酸などの代謝産物の生合成）。実際に、変異体株（例えば栄養要求性変異体又はｖｉｒＥ２遺伝子機能欠損変異体）を作製するために細菌細胞から遺伝子を削除するかわりに、遺伝子を調節可能プロモーターの制御下に置くことができる。そのような調節可能プロモーターからの目的遺伝子の発現は、この場合テトラサイクリン又はＩＰＴＧのような小分子であり得る補完因子の適用を介して制御することができる。例えば十分に記述されたｔｅｔ及びｌａｃリプレッサーに基づいた細菌の調節可能システムのさまざまな改変を用いて、アグロバクテリウム細胞において目的遺伝子の発現を制御することができる。
【００７６】
アグロバクテリウムに加えて、本発明は、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達のために遺伝子操作された他の微生物に拡大適用することができる。例えば、近年、アグロバクテリウム属以外の共生細菌種を改変して、多くの多様な植物への遺伝子伝達を介在することができることが示された（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓら、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ、４３３、６２９−６３３）。これらの細菌は、安全化Ｔｉ−プラスミド及びバイナリーベクターを獲得することによって、遺伝子伝達に適任となっている。
【００７７】
植物ＲＮＡウイルス（例外はウイロイド−植物細胞核で増幅する小さな非コードＲＮＡ−である。概説として、Ｄｉｅｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．、１５、２０３−２２０；Ｆｌｏｒｅｓ，Ｒ．、２００１、ＣＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、３２４、９４３−９５２を参照されたい）は細胞核では発生せず、細胞質で発生することが知られている。したがって、ＲＮＡウイルスの配列は、プレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡの前駆体を含めたプロセシングされたＲＮＡの、細胞質内の輸送を含めたプロセシング工程に関与するモチーフの存在により、核のＲＮＡプロセシングに抵抗するように適合されていない。５’端キャッピング、スプライシング、３’端生成、ポリアデニル化、分解、塩基及び糖による修飾、並びにエディティング（プラスチド及びミトコンドリア内）などのプロセシングイべントが集中的に研究されている。しかしながら、そのようなイベントの多くの要素は依然として不明確のままである。核におけるプレｍＲＮＡの最も劇的な変化は、介在ＲＮＡ配列（イントロン）が初期転写産物から除去され、同時にエクソンが連結されるプロセスである、プレｍＲＮＡのスプライシングのあいだに起こる。スプライシングは、ウリジン（uridilate）に富んだ核の小さなリボ核タンパク質粒子を含む複合体構造であるスプライソームによって介在される。スプライソームは２つの連続工程でスプライシング反応を行う：第１工程−上流エクソン／イントロン接合部の５’スプライス部位を切断してラリアート形成し、第２工程−イントロン／下流エクソン接合部の３’スプライス部位を切断して上流と下流のエクソンを連結する（概説として：Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５、３６７−４０９；Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＧＧ．＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９９６、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１−４１を参照されたい）。イントロン配列に隣接する５’及び３’スプライシング部位のジヌクレオチド（５’／ＧＵ；ＡＧ／３’）は高等植物で高度に保存されており、単一Ｇ置換により関与する部位のスプライシング活性を放棄するであろう。驚くべきことに、植物と動物とのあいだでスプライシング部位が高度に保存されているにもかかわらず、植物において異種イントロンは通常スプライシングされないか、又は不正確にスプライシングされる（ｖａｎ Ｓａｎｔｅｎ，ＶＬ．ら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５６、２５３−２６５；Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｊ．、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０４２−２０５１）。植物ウイルスＲＮＡは、核のＲＮＡプロセシング装置に抵抗するための進化的圧力下になかったことを考慮すると、これらのＲＮＡは、いったん核環境に置かれると、スプライシングを含めたそのようなプロセシングの対象となる可能性が非常に高い。この状況は、核遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物とは全く異なる。後者の転写産物は、一連のＲＮＡ修飾が核で起こるにもかかわらず、機能性を保つように進化的に適合しているためである。しかしながら、そのような修飾は、ウイルスＲＮＡレプリコン形成に劇的な結果を招くことができる。異種遺伝子のための発現ベクターを作製するために植物ウイルス遺伝子を再操作すると、ウイルス起源のＲＮＡ配列と相互作用する配列を更に追加するため、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの不安定性が更に増し、複製できない欠損ＲＮＡを産生するであろう。本発明は、発現ベクターをＤＮＡ前駆体として植物又は植物細胞に導入し、一過性発現又は植物染色体ＤＮＡへの安定な組み込みを提供する場合に機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を顕著に上昇させる改変を発現ベクターに施すことによって、こうした問題に取り組んでいる。ウイルス由来配列の改変は、ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの効率を高めるための最善策であり得る。改変は、直接的（例えばＲＮＡウイルス由来配列内）でも間接的（例えば非ウイルス起源の配列内）でもよいが、間接的改変は、ウイルス起源の配列に安定効果をもたらし得る。本発明では、ＲＮＡレプリコン形成効率の上昇に不可欠であるため、ＲＮＡウイルス由来配列内の改変に主に焦点をあてる。
【００７８】
驚くべきことに、潜在的に問題のある領域が存在する証拠を発見するための第１の試みは成功した。そして、更に驚くべきことに、予想外にも桁違いの改善を発見したことにより、実験的に確認した。発現ベクターｐＩＣＨ８５４３（実施例１、図２Ａ）のＲＮＡウイルス由来配列を、潜在イントロンとＲＮＡスプライシング部位の存在に関し、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析することにより、核ＲＮＡプロセシング装置によってスプライシングされ得るイントロン様領域の存在が示された（図６の丸で囲んだ領域を参照されたい）。植物ウイルスＲＮＡ配列内で潜在的に問題のある領域（選択された位置）を同定するために使用できるプログラムは、さまざまな生物のためのエクソン／イントロン予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）又はスプライシングシグナル予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｗｗｗｓｐｌｉｃｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）のように、他にも多数存在する。
【００７９】
既存のプログラムは全て理想的ではなく、誤りがちであることを考慮すると、潜在的に問題のある領域は実験的に決定することもできる。これは、ＲＴ−ＰＣＲで（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）、又はさまざまな転写産物の濃度を正確に定量するのに好適な、リアルタイムＰＣＲと呼ばれる進歩したバージョン（Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、９９５−１００１）で、核環境で試験されているＤＮＡベクター由来の転写産物を解析することによって行うことができ、好ましくはＰＣＲ増幅産物の配列決定を伴う。本発明の機能保存的な相違は、例えばＡ／Ｕに富んだ領域（イントロン様）からＧ／Ｃに富んだ領域（エクソン様）への置換を伴うサイレント変異を導入することにより、例えばイントロン様配列をエクソン様配列配列で置換することによって、ＲＮＡプロファイルを劇的に変化させる（図３の丸で囲んだ領域を参照されたい）。植物のイントロンはエクソンと異なり、通常Ａ／Ｕに富んでいる（Ｃｓａｎｋ，Ｃ．ら、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１８、５１３３−５１４１；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３）が、例外がある。例えば単子葉植物では、Ｇ／Ｃに富んだイントロンが発見されている（Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０、２６３５−２６４４）。本発明のこの態様を実施するには、Ａ／Ｕに富んだ領域には、Ａ／Ｕ含量が少なくとも５５％以上の、少なくとも長さ２０ヌクレオチドの配列である長い区間だけでなく、純粋にＡ／Ｕを含有する配列の並びの６〜１９ヌクレオチドの、より短い区間（「アイランド」）も含まれる。本発明におけるＡ／Ｕ内容は、ＵよりもＡに富んだ配列、又はＡのみに富んだ配列、そして逆にこの定義によってカバーされる全ての配列を意味する。実施例６では、Ａ／Ｕに富んだ領域の改変が、ＧＦＰを発現する細胞数を少なくとも１０倍増加させることを立証する。これは、図１０において、ｐＩＣＨ１５４６６（改変ベクター、図２Ａ）でアグロ浸潤させた領域と、ｐＩＣＨ１４８３３（対照ベクター、図２Ａ）でアグロ浸潤させた領域とを比較することによって立証される。移行タンパク質（ＭＰ）の除去は、初期感染部位から隣接細胞への細胞間移行は起こらないため、機能性ＲＮＡレプリコンを有する初代培養細胞の正確な計数を可能にする。実施例７では、多くの潜在スプライス部位（図６Ｂ）を含有し、移行タンパク質（ＭＰ）のサブゲノムプロモーターをカバーする他のＵに富んだイントロン様領域の改変を行った（図８、丸で囲んである）。この改変は、ウイルスベクターｐＩＣＨ１５９００からのレプリコン形成頻度上昇に劇的な効果を及ぼす。プロトプラスト計数実験（実施例７）で立証したように、試験した２つのタバコ種−ベンサミアナタバコ及びタバコに関し、非改変ベクターｐＩＣＨ１４８３３と比較して、およそ１００倍増加した（図１０Ａ、Ｂの対応の浸潤領域を参照されたい）。一般に、本発明に記載のアプローチを用いることにより、ＲＮＡレプリコン形成頻度をおよそ３００倍上昇させ、即ち、機能性レプリコンを有する細胞の割合を約０．２％（対照ベクター）から５０％（改変ベクター）以上に増加させることができた。これは限界ではなく、１００％の頻度に達することも非常に現実的であると考えられる。
【００８０】
そのように高率のレプリコン形成は、同一植物細胞内で２つの異なるＲＮＡレプリコンから２以上の異なる遺伝子を発現させる、例えば植物ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを用いて異なる遺伝子を共発現させる道を開く。同一細胞で同時に２以上のレプリコンの同調した開放を達成することは、「先着順」の原則はウイルスベクターでは特に真実であるため、そのような共発現に重要である。異なるウイルスベクターは通常伝播領域で重ならないため、又はそのような重なりはわずかであるため、浸透移行も細胞間移行も役立たない。単純な計算によって、同一植物細胞において２つのレプリコンから２つの目的配列の共発現を達成するための、本発明に記載の技術の重要性を立証する。機能性レプリコン形成頻度が全細胞の０．２％である非最適化ウイルスベクターの場合、２つの異なるＲＮＡレプリコンから２つの遺伝子を共発現する細胞の割合は０．２×０．２＝０．０４％であるが、機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇した構築体の場合（全細胞の５０％即ち１／２）、上記細胞の割合は０．５×０．５＝０．２５、即ち２５％であり、例えば約６２５倍高いであろう。最高性能ベクターを用いると（例えばｐＩＣＨ１６１９１、図１０Ｃ）、機能性レプリコンを有する細胞の割合はおよそ９０％に達することもある（図１０Ｃ、右上）。これは、２つの独立したレプリコンから２つの異なる目的配列を発現させるためにそのようなベクターを用いることにより、全細胞の８０％で共発現が起こり得ることを意味している。技術を更に改善し、１００％共発現を達成できる可能性は非常に高いと考えられる。
【００８１】
ＲＮＡレプリコンから発現されるべき異種目的配列における機能保存的な相違は、特にレプリコン機能に関する配列における相違と組み合わせて、ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるために使用し得ることに留意することは重要である。例えば、レプリコンの形成及び／又はプロセシングに必要な改変を目的配列内に導入することができる。
【００８２】
本発明の他の態様では、核イントロンをレプリコン機能に関する配列に挿入することにより、レプリコン形成頻度が改善された（実施例８）。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のコード領域へのイントロンの組み込み（実施例８及び１２）は、改変ベクター（図２Ａ、ＢのｐＩＣＨ１５０３４、ｐＩＣＨ１５０２５、ｐＩＣＨ１５４９９）からのレプリコン形成頻度を顕著に（少なくとも５０倍）上昇させた（図１０Ａ、Ｂ）。シロイヌナズナ由来の６つの挿入イントロンを含有するベクターのＲＮＡプロファイルを図９に示す。他の実施例（実施例１１）では、ＭＰ配列へのイントロンの挿入により、レプリコン形成頻度を少なくとも１００倍上昇させる。
【００８３】
本発明を実施するために多くの核イントロンを用いることができる。そのようなイントロンの例としては、限定されるものではないが、イネｔｐｉ Ａｃｔ１遺伝子及びｓａｌＴ遺伝子由来のイントロン（Ｒｅｔｈｍｅｉｅｒら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１２、８９５−８９９；Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００、４５９−４６７；ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２、１６３−１７１）；トウモロコシＡｄｈ１遺伝子、ＧａｐＡ１遺伝子、アクチン遺伝子、及びＢｚ１遺伝子由来のイントロン（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、１１８３−１１２００；Ｄｏｎａｔｈら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、６６７−６７６；Ｍａａｓら、１９９１、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１９９−２０７；ＷＥ Ｃｏｈｎ、Ｋ Ｍｏｌｄａｖｅ監修、『核酸研究と分子生物学の進歩』、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ．２２９−２５７中のＳｉｎｉｂａｌｄｉ＆Ｍｅｔｔｌｅｒ、１９９２）；ペチュニア ルビスコ遺伝子ＳＳＵ３０１由来のイントロン（Ｄｅａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１、２０１−２０８）；シロイヌナズナＡ１ ＥＦ１α遺伝子、ＵＢＱ１０遺伝子、ＵＢＱ３遺伝子、ＰＡＴ１遺伝子由来のイントロン（Ｃｕｒｉｅら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８、４２８−４３６；Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１、８９５−９０６；Ｒｏｓｅ＆Ｌａｓｔ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、４５５−４６４）；並びに他の多くのものが挙げられる。合成イントロンも本発明に用いることができる。最小の使用可能イントロン又はそれらの部分は、通常、内部のイントロン配列に隣接する、スプライスドナー部位及びアクセプター部位に限定され得る。好ましくはイントロンのサイズは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは１００〜２００ヌクレオチドである必要があるが、実際にはイントロンのサイズに限定はない。しかしながら、構築体のサイズは遺伝子操作に好適なように維持される必要がある。イントロンの由来、その構造及びサイズは、ベクターの性質に応じて個々に選択することができる。選択したイントロン又は対応のイントロン部分の効率を試験するために一過性発現実験を用いることができる。
【００８４】
上記改変の効果は累積的であり、例えばイントロンの挿入をＭＰサブゲノムプロモーターの改変と組み合わせると、レプリコン形成頻度をおよそ３００倍に上昇させることができる（実施例９）。ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためのイントロン挿入に好ましい領域は、本明細書において選択された領域という。そのような位置は「イントロン様」構造を含有することができる。これは、ＭＰ、実際にはＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある領域の極近傍にイントロンを挿入することによって確認される（実施例１１）。レプリコン形成頻度に１００倍の上昇が観察された。「エクソン様」領域へのイントロンの挿入は、イントロン様領域への挿入のような明白な効果を有さない（実施例１０）。
【００８５】
目的配列の一過性発現に適格な、即ち本発明の欠損アグロバクテリウム株の補完に適格な植物宿主の作製に必要な代理機能を有するトランスジェニック植物宿主を作製するためにさまざまな方法を用いることができる。アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ−プラスミドにより（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、又は粒子銃若しくは微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）により、植物細胞をベクターで形質転換することができる。マイクロインジェクション（ＷＯ０９／２０９６９６号；ＷＯ０９／４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８／７０６６１４Ａ１号）、又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換などのような他の植物形質転換法も用いることができる。ベクター送達方法の選択は、形質転換される植物種に依存し得る。例えば、微粒子銃は通常単子葉植物の形質転換に好ましいが、双子葉植物には、アグロバクテリウム介在形質転換が一般に良好な結果を与える。
【００８６】
以下の実施例では、タバコ細胞へのアグロバクテリウム介在ベクター（異種ＤＮＡ配列）送達を用いた。しかしながら、ベクターは、目的植物種の安定な又は一過性の形質転換又はトランスフェクションに好適な標準技術にしたがい、植物に組み込むことができる。双子葉植物の形質転換技術は当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウムに基づいた技術とアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラスト又は細胞による外来遺伝物質の直接取り込みが含まれる。これらの技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを介在する取り込み、粒子銃介在送達、及びマイクロインジェクションが含まれる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、３、２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９、１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７、７０−７３（１９８７）に記載されている。いずれの場合にも、形質転換細胞は標準技術を用いて完全な植物に再生される。
【００８７】
アグロバクテリウム介在トランスフェクションは、そのトランスフェクション効率の高さと多くのさまざまな種を用いる広範な有用性のために、双子葉植物のトランスフェクションに好ましい技術である。アグロバクテリウムによって日常的に形質転換され得る多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファ、及びポプラが含まれる（ＥＰ ０ ３１７ ５１１号（ワタ）、ＥＰ ０ ２４９ ４３２号（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９号（アブラナ属）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
【００８８】
本発明の例では、目的遺伝子を一過性発現させるためのＴ−ＤＮＡのアグロバクテリウム介在送達法であるアグロ接種を用いた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１１１２８−１１１３３）。アグロ接種は、小規模から中規模の組換えタンパク質産生システムだけでなく、ベクター最適化の要素としても非常に有用なツールであり、構築体のさまざまな変異体を用いて迅速な結果を得ることが可能である。
【００８９】
アグロ浸潤を実施するには、先行技術に記載のように、通常、アグロバクテリウムの一晩培養物を準備する（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１０１、６８５３−６８５７）。通常、一晩培養物の光学密度（Ｏ．Ｄ．）は波長６００ｎｍで３〜３．５単位に達し、アグロ浸潤の前に３〜５倍に希釈され、５〜９×１０９コロニー形成単位を生ずる（Ｔｕｒｐｅｎら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４２、２２７−２４０）。発明者らは、１０２倍、１０３倍、及び１０４倍希釈も、特に本明細書に記載のような機能保存的な相違を有するレプリコン機能に関する配列との組み合わせにおいて、非常に効率的に作用することを発見した。驚くべきことに、浸潤させたタバコの葉におけるベクターはその性能を更に向上させ、形質転換アグロバクテリウムの希釈率を上げるとＧＦＰの良好な収率を与えた。例えば、１０３倍希釈は１０２倍希釈よりも良好な結果を与えた。１０２倍希釈は１０倍希釈よりも良好なＧＦＰ収率を生ずる。この現象に対する可能な説明は、おそらく高濃度の病原性細菌に対する植物の応答の結果としての、非常に濃縮したアグロバクテリウム懸濁液の、ウイルスベクターの機能、例えば細胞間移行に対する負の効果である。この現象は、アグロ浸潤を介する組換えタンパク質産生に必要なアグロバクテリウム量を、先行技術の方法と比較して、少なくとも１桁軽減させるため、大規模な工業的タンパク質発現方法に特別な価値がある。
【００９０】
実施例１３では、不活化ウイルスＲＮＡに基づいたレプリコンのＤＮＡ前駆体について示す。レプリコンは本発明にしたがって最適化される。更に、レプリコンは、非コンピテント植物、例えばゲノムＤＮＡに安定に組み込まれたリコンビナーゼを提供する発現カセットを含有しない植物へアグロ送達された場合に目的配列の発現を妨げる構造を含有する。機能性ＲＮＡレプリコンの形成と同様に、発現は、部位特異的組換えにより構築体の一部を反転させることによって誘引することができる。この反転は、２つのイントロンの形成と、機能性目的配列の集合をもたらすことができる。実施例１３に記載のシステムは、ウイルスベクターの最適化だけでなく、工業的タンパク質又は医薬用タンパク質を発現させるための植物発現システムを用いる高度な生物学的安全性基準の達成方法を示している。
【００９１】
リコンビナーゼの転写は、誘導性の又は他の調節された（例えば発生学的に調節された）プロモーターの制御下に置くことができる。誘導性プロモーターは、その誘導条件によって２つのカテゴリーに分けることができる：非生物的因子（温度、光、化学物質）によって誘導されるものと、生物的因子、例えば病原体又は害虫の攻撃によって誘導できるものである。第１のカテゴリーの例は、熱誘導性（ＵＳ０５１８７２８７号）及び低温誘導性（ＵＳ０５８４７１０２号）のプロモーター、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５号）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、１７７−１８０；ＷＯ０９／３２１３３４号）、並びにテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、５５９−５６９）である。植物の化学誘導性システムの分野における最新の発展の１つは、グルココルチコイド デキサメサゾンによってスイッチを入れることができ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１９、８７−９５）。化学的誘導性システムの概説として：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１４６−１５１）及びＰａｄｉｄａｍ，Ｍ（２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、６、１６９−１７７）を参照されたい。誘導性プロモーターの他の例は、植物の病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、植物を、病原体の攻撃に対する応答における植物シグナル伝達経路の重要成分であるサリチル酸で、又はＰＲ遺伝子発現を誘引可能な他の化学化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）（ＵＳ０５９４２６６２号）で処理することによって誘導することができる。
【００９２】
本発明は、実施例に記載のＴＭＶに基づいたベクターに限定されず、他の植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンにも適用可能である。他の植物ウイルスＲＮＡ配列の解析（実施例１４、図１３、図１４）により、ＴＭＶに関して記載したものと類似の選択された位置及び植物核遺伝子のプレｍＲＮＡの配列を示す（図１２）。これは、本発明に記載のアプローチを用いて、問題のある領域を除去／置換することにより、及び／又は核イントロンを挿入することにより、実際に植物ＲＮＡウイルス由来レプリコンを解消することができる強力な証拠である。
【００９３】
本発明を用いて植物又は植物細胞において発現させることができる目的タンパク質、それらの断片（機能性又は非機能性）、及びそれらの人工誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合型デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース ピロホスホリラーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４と相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はそれらの活性断片若しくは変異体）、オイル修飾酵素（脂肪酸不飽和化酵素、エロンガーゼなどのような）、イソペンテニル トランスフェラーゼ、Ｓｃａ Ｍ５（ダイズ カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸、及び多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、不活性プロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における改質繊維、バチルス・スリンギエンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイル アルコール脱水素酵素、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ 還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア・ヘルビコラ リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、ポリヒドロキシルアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成機能又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール ジオキシゲナーゼ、カテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナ属ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポティウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異体ジェミニウイルス レプリカーゼ、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物のＣ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、Ｄ６−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、など；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣ脱アミノ酵素、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ モノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージ由来の他の多くの酵素。
【００９４】
本発明は、工業的酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼなど）、及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸タンパク質など）を含めた、商業的に価値があり、医薬的に重要なタンパク質の分子農業及び精製のために用いることができる。ヒト又は動物の健常なタンパク質は、本発明で記載したアプローチを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、病原性微生物由来のものを含めた抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカインとその受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素学的に活性なリソソーム酵素、線溶性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシン、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、並びに上記タンパク質の融合体、変異体型、及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質、トロンビン、ヒト胃リパーゼ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＭＦ）、セルピン、ラクトフェリン、リゾチーム、オレオシン、プロトロンビン、α−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００９５】
本特許出願で優先権を主張する欧州特許出願第０４０１６０１１．１号の内容は、本明細書にその全体が援用される。
実施例
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するために提示するものである。必要に応じて改変や変形を行うことができる。
【実施例１】
【００９６】
ＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性のトバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈透化ウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８．２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡは、ロシアのモスクワ大学のＡｔａｂｅｋｏｖ教授から入手した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターは、いくつかのクローニング工程で作製した。得られた構築体ｐＩＣＨ８５４３（図２Ａ）は、順に：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター由来の７８７ｂｐ断片（ＡＣＴ２、参考文献Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためチミン５６０６がシトシンに変わっている）、配列「ｔａａ ｔｅｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’−非翻訳領域（３’−ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。断片全体を、ＣａｒｂＲ ｐＢＩＮ１９由来のバイナリーベクターであるｐIＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだクローニングした。ｐＩＣＨ８５４３でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。３ｄｐｉで出現したＧＦＰ蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、たとえ浸潤領域の大部分の細胞がウイルスの複製と移行により最終的にＧＦＰを発現しても、ＧＦＰを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、ウイルス複製を開始したのはわずかな画分の細胞のみであった。ベンサミアナタバコの葉に３５Ｓプロモーター制御下のＧＦＰ遺伝子を浸潤させることにより、浸潤領域のほとんど全ての細胞においてＧＦＰが発現するため（図示していない）、限定要因は植物細胞へのＤＮＡ送達でないことが明らかになった。
【００９７】
この観察結果について確認するため、ＭＰに変異を含有するウイルスベクター構築体を作製した。ｐＩＣＨ１４８３３と呼ばれるこの構築体は、ｐＩＣＨ８５４３に類似するが、ＭＰ遺伝子における、ＭＰに存在するＥｃｏＲＩ部位の上流の３８９ｂｐの欠失により異なっている。この欠失を含めたＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を配列番号１として付録に示す。ウイルス構築体全体（ＡＣＴ２プロモーターからＮｏｓターミネーターまで）を、ｐＢＩＮ１９由来ＫａｎＲ バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ４９のＴ−ＤＮＡの左の境界と右の境界とのあいだにクローニングした。ＭＰ内の欠失のために、この構築体から産生されるレプリコンは細胞間移行できないが、細胞内で自律複製可能である。ＭＰを、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターからトランスで提供すると、細胞間移行を回復させることができる。
【００９８】
ＭＰ発現構築体を作製するために、クローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲにてＴＶＣＶ ＭＰ遺伝子を増幅させ、３５Ｓプロモーターの制御下でバイナリーベクターにサブクローニングした。ｐＩＣＨ１０７４５と呼ばれる得られた構築体（図示していない）及びｐＩＣＨ１４８３３でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ１４８３３単独で浸潤させることにより、浸潤領域内にわずかなＧＦＰ発現細胞が出現した。浸潤領域から作製されたプロトプラストを計数することにより、合計５００個プロトプラストのうち、わずか１〜３個のプロトプラストがＧＦＰを発現することを発見した（０．２〜０．６％）。ｐＩＣＨ１４８３３とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、それぞれの初期ＧＦＰ発現細胞から増殖した、ＧＦＰを発現する焦点が形成された。最終的に、細胞間移行により、浸潤領域のかなりの割合の細胞がＧＦＰを発現した（図１０Ａ）。
【００９９】
ロシアのモスクワ大学のＡｔａｂｅｋｏｖ教授から入手した、上記アブラナ科植物感染性のトバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈透化ウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）の同一クローン化ｃＤＮＡを用いて、いくつかの更なるウイルスベクターを構築した。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体ｐＩＣＨ１６７０７（図２Ｃ）は、順に：シロイヌナズナ アクチン２プロモーター由来の７８７ｂｐ断片（ＡＣＴ２、参考文献Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶの断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためにチミン５６０６がシトシンに変わっている）、配列「ｔａａ ｔｃｇ ａｔａ ａｃｔ ｃｇａ ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ ３’−非翻訳領域（３’−ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。完全な断片を、ＫａｎＲ ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ２９のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローニングした。ｐＩＣＨ１６７０７でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換した。形質転換アグロバクテリウム株を飽和するまでＬＢ培地中で一晩増殖させた。アグロバクテリウムを増殖させた２００μｌの一晩培養物を、マイクロ遠心機にて８０００ｒｐｍで３分間沈殿させた。沈殿を、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する１ｍｌの溶液に再懸濁させ、ＯＤをおよそ０．７とした。温室栽培ベンサミアナタバコ植物の葉に針の無いシリンジで浸潤させた。浸潤後３日目にＧＦＰ蛍光の焦点が出現した。蛍光の焦点は増殖して数日後にコンフルエントになった。
【０１００】
ＯＤ０．３〜０．４のアグロバクテリウムを有する大量の浸潤溶液（３リットル）を調製した。ポットを用いてベンサミアナタバコ植物全体を逆さにして溶液にサッと浸し、乾燥器に入れ、十分な溶液が葉に浸透するまで１〜２分間真空を施した。次に植物を取り出し、温室に置いて再生させた。浸潤後３〜４日目に、シリンジを用いて手で浸潤させた領域のように、浸潤領域に蛍光の斑点が出現した。写真は、浸潤後１０日目のそのような植物を示す（図３）。
【０１０１】
トバモウイルスなどのＲＮＡウイルスは細胞質で複製し、決して核には入らない。したがって、核のプレｍＲＮＡプロセシング装置に曝露されない環境で展開する。その結果、人工ウイルス構築体から核において産生されるＲＮＡレプリコン転写物は、ＲＮＡプロセシング装置によって認識され正しくプロセシングされることができない。その上、ウイルスベクター由来のＲＮＡレプリコンは非常に大きい：ＴＭＶに基づいたレプリコンの場合およそ７，０００ヌクレオチド。そのように大きなサイズの植物遺伝子は非常にわずかであり、そのような遺伝子の大部分は、プレｍＲＮＡのプロセシングを容易にし、核から輸送し、プロセシングされた転写産物の安定性を向上させるイントロンを含有する。したがって、正確なプロセシングと、正確にプロセシングされた転写産物の核から細胞質への輸送の効率を向上させるプレｍＲＮＡの改変は、ウイルス複製を開始する細胞数の増加をもたらすであろうという仮説を立てた。結局、核へのDNA送達 後、ウイルス複製をより効率的に開始できるＲＮＡウイルスに基づいたベクターを作製するために使用できるアプローチは２つあることがわかる：（１）１つのアプローチは、無用のプロセシングイベント（潜在スプライス部位を用いた選択的スプライシングイベント、又は中途終止イベントなど）を誘導し得る配列特徴の除去である；（２）第２のアプローチは、正しくプロセシングされる転写産物量を増加させ、ＲＮＡの核から細胞質への輸送を改善させ、及び／又は転写物の安定性を向上させるイントロンの付加である。
【実施例２】
【０１０２】
ＴＭＶに基づいた改良ＲＮＡベクターの構築
目的配列が浸潤領域で発現する速度を向上させるために、９１〜４４３ヌクレオチドのサイズの１６のシロイヌナズナ イントロンをベクターの位置１〜１６に付加した：（ＴＶＣＶ配列に対する位置、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７）：１、ｂｐ２０９；２、ｂｐ４２３；３、ｂｐ８２８；４、ｂｐ１１６９；５、ｂｐ１３７８；６、ｂｐ１６２２；７、ｂｐ１８４４；８、ｂｐ２２２８；９、ｂｐ２５８９；１０、ｂｐ２９４４；１１、ｂｐ３１４３；１２、ｂｐ３３８１；１３、ｂｐ３６７２；１４、ｂｐ３８５０；１５、ｂｐ４２９９；１６、ｂｐ４４９７；１７、ｂｐ５０９９；１８、ｂｐ５２８７；１９、ｂｐ５４４４。得られた構築体ｐＩＣＨ１８７１１（図２Ｃ）を、さまざまな段階の（播種後１７〜３５日目）いくつかのベンサミアナタバコ植物の真空浸潤に用いた。ＧＦＰ蛍光は２日後に出現し、浸潤後６日目に非常に強かった。写真は、浸潤後４日目を示す（図４）。ＧＦＰ蛍光は、非改良ベクターｐＩＣＨ１６７０７よりも非常に速く（浸潤後４〜６日）葉領域全体を覆った。改良ウイルスベクターの詳細な説明は、近年公表された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３、７１８−７２３）。
【０１０３】
植物全体の代わりに、ベンサミアナタバコ植物の枝（茎及び葉）を真空浸潤させた。幹の基部を１杯の水の中に入れることによって幹を回復させた。ＧＦＰは３日後に葉に出現し、植物全体ではなく植物の部分を目的遺伝子の発現に用いることができることを示した。
【実施例３】
【０１０４】
アグロバクテリウムによって送達されたウイルスベクターの真空浸潤を用いた薬用タンパク質の発現
医薬的に関心のある２つのタンパク質を、ＧＦＰの代わりに上記改良ベクター中にクローニングした。第１のタンパク質ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（配列 Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５１５）のクローニングによりベクターｐＩＣＨ１７９９１を得た（図２Ｃ）。第２のタンパク質ヒトインターフェロンα（配列 Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｖ００５４８）のクローニングによりベクターｐＩＣＨ１９０８１を得た（図２Ｃ）。この構築体では、インターフェロンの最初の１７アミノ酸（ＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＫＳＳＣＳＶＧ）が、シロイヌナズナ カルレティキュリン アポプラスト標的配列（ｍａｔｑｒｒａｎｐｓｓｌｈｌｉｔｖｆｓｌｌｖａｖｖｓａｅｖ）で置換されている。構築体をアグロバクテリウム株 ＧＶ３１０１に挿入し、植物全体の浸潤に用いた。両方のタンパク質に関し、高レベルのタンパク質発現が得られた。ｐＩＣＨ１７９９１に関し、たとえタンパク質の毒性が浸潤領域で細胞死をもたらしても、浸潤葉組織１ｇあたり１ｍｇのｈＧＨという高レベルの発現が得られた。
【実施例４】
【０１０５】
ＭＰを欠失するベクターによる植物全体の浸潤
ｐＩＣＨ１７８１１におけるＭＰの初めのＡｖｒＩＩ部位にフレームシフトを作製し（図２Ｃ）、構築体ｐＩＣＨ１８７２２を得た（図５）。このフレームシフトはＭＰ機能を完全に排除しており、この構築体の浸潤により、個々の細胞のみにおいて複製と発現をもたらす。しかしながら、イントロンの存在のために、多数の細胞が依然としてＧＦＰを発現する。
【０１０６】
ＴＶＣＶのＭＰコード配列を、クローン化ＴＶＣＶ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）からＰＣＲにて増幅し、３５Ｓプロモーターの制御下、バイナリーベクターにサブクローニングしてプラスミドｐＩＣＨ１０７４５を得た。ｐＩＣＨ１８７２２とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、少なくともＭＰが一過性に発現しているあいだは細胞間移行が完全に回復する。ｐＩＣＨ１０７４５にてベンサミアナタバコを安定に形質転換した。ＭＰを発現する完全な形質転換体にｐＩＣＨ１８７２２を浸潤させることにより、野生型植物の浸潤はウイルスベクターの細胞間移行をもたらさないが、野生型植物全体にｐＩＣＨ１８７１１を浸潤させた場合と同様のＧＦＰ発現をもたらした（図１６を参照されたい）。
【実施例５】
【０１０７】
目的遺伝子の一過性発現を提供するための変異体アグロバクテリウムの補完
ａ）ＶｉｒＥ２を発現するトランスジェニック植物宿主によるトランス補完
ＶｉｒＥ２遺伝子を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８ Ｔ−ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ受託番号ＡＥ００９４３７、ｂ．ｐ６３６８〜８０３８）のＤＮＡ調製物からＰＣＲで増幅し、ＴＶＣＶのＭＰ遺伝子を置換したベクターｐＩＣＨ１０７４５にクローニングした。得られた構築体ｐＩＣＨＶｉｒＥ２（図１５）を、選択剤として５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）、及びベンサミアナタバコ植物のアグロバクテリウム介在葉ディスクトランスフェクションに用いた、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子欠失アグロバクテリウム・ツメファシエンス固定した（Ｈｏｒｓｈら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）。ＭＰにフレームシフトを有する構築体ｐＩＣＨ１８７２２（図５）にてＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム・ツメファシエンス株を形質転換した。この欠損は、ＶｉｒＥ２遺伝子の欠失により引き起こし、野生型植物とｐＩＣＨ１０７４５で形質転換した植物のアグロ浸潤実験に用いた。
【０１０８】
コンピテント及び野生型宿主を用いて、葉表面の同一領域あたりのＧＦＰ発現細胞数を計数することにより、又は（より正確には）対照及び改変ウイルスベクターを用いたウイルス複製の開始頻度を比較するために図１０Ｃに示すように、コンピテント及び野生型宿主におけるＧＦＰ発現プロトプラストの割合を測定して比較することにより、一過性発現効率の比較を行った。一過性発現を提供するＴ−ＤＮＡ送達のそのような相対頻度は、生物学的安全性を構築していないシステムとの比較において、システムの生物学的安全性レベルの測定として用いることができる。
【０１０９】
ＶｉｒＥ２機能を欠損した他の多くのアグロバクテリウム株、例えばＶｉｒＥ２の挿入変異を有する株（Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、１９８８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０、２６５９−２６６７）又はｖｉｒＥ２機能を抑制するｏｓａ遺伝子を有するプラスミドｐＳＡを有する株（Ｌｅｅ、Ｌ−Ｙら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、１８６−１９６）をこの実験に用いることができる。更に、Ｔｉプラスミド（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０６５；ＮＣ００１２７７）及び染色体ＤＮＡ（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＣ００３０６３；ＮＣ００３０６３）を含めたアグロバクテリウムゲノム配列情報の利用可能性により、相同組換えによって機能性遺伝子をその変異体型に置換することで、あらゆる種類の変異体を作製することができる。さまざまに希釈した、ＶｉｒＥ２含有及びＶｉｒＥ２欠損アグロバクテリウム株の一晩培養物を比較することによって、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ伝達効率に対するＶｉｒＥ２遺伝子の効果について試験した。アグロバクテリウム株はともにｐＩＣＨ１８７１１ウイルスベクターをバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域内に含有する（図２Ｃ）。そのような比較の結果を図１７に示す。ＶｉｒＥ２欠損アグロバクテリウム株によるＴ−ＤＮＡ伝達効率が、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子含有アグロバクテリウムと比較して、少なくとも１０，００００倍低下していることは写真から明らかである。コンピテント（ｐＩＣＨＶＩＲＥ２で形質転換されている）及び野生型のベンサミアナタバコ植物の葉における一過性発現効率の比較を行い、ｐＩＣＨＶｉｒＥ２で形質転換したトランスジェニック植物からのＶｉｒＥ２遺伝子機能の非常に効率的なトランス補完を示した（図１８）。異なる希釈系列（示していない）を用いて実験することにより、トランスジェニック宿主からのＶｉｒＥ２遺伝子機能のトランス補完効率が、機能性ＶｉｒＥ２遺伝子を有するアグロバクテリウム株の使用に匹敵することを立証した。
【０１１０】
ｂ）ＶｉｒＥ２を発現する野生型アグロバクテリウム株との混合によるトランス補完
ｐＩＣＨ１８７２２を有するｖｉｒＥ２機能欠損株を、ｖｉｒＥ２機能をトランスで補完するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８と混合することによって、ｖｉｒＥ２機能の補完を達成した以外は、先の実施例に記載の実験を反復した。新たに接種した両アグロバクテリウム株の培養物を光学密度ＯＤ６００が２．５〜３．０になるまで一晩増殖させ、植物組織の浸潤のために等量で混合した。浸潤用最終混合物を５０倍、１００倍、１０００倍、及び１００００倍に希釈した。植物組織の浸潤をベンサミアナタバコ及びタバコの葉にて行った。ｐＩＣＨ１８７１１バイナリーを有するΔＶｉｒＥ２株（機能性ＭＰを有する）を用いて同様の実験を行った。この実験の結果を図１９に示す。ｐＩＣＨ１８７１１バイナリーを有する変異体株（Ｔ−ＤＮＡ＋、ΔＶｉｒＥ２）と野生型株（Ｔ−ＤＮＡ−、ＶｉｒＥ２）との共浸潤は、野生型株によるＴ−ＤＮＡの直接送達（Ｔ−ＤＮＡ＋、ＶｉｒＥ２）よりも、Ｔ−ＤＮＡ送達がまさに効率的であることは明らかである。
【実施例６】
【０１１１】
イントロン様配列の除去により、細胞質におけるウイルスＲＮＡレプリコン形成頻度が上昇する
ｐＩＣＨ４３５１由来のＲＮＡレプリコンの配列をＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析したところ、選択的スプライシングイベントを誘導し得るいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の１つは、ＲｄＲＰの初めにある、０．６ｋｂのウリジンに富んだ領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のヌクレオチド８２７〜１４６２に対応）である（図６Ａ）。ｐＩＣＨ１４８３３において、オリジナル配列とは異なる、ＰＣＲで変異させた配列で、５４ヌクレオチド置換によりこの領域を置換した（付録に配列番号２として示す配列、図７）。５２ヌクレオチド置換は、Ｔに富んだ配列を、よりＧＣに富んだ配列に置換するために行った。ＲｄＲＰのタンパク質配列を変えないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。この変異断片も、推定潜在スプライスドナー部位とアクセプター部位をそれぞれ除去するために導入された２つのヌクレオチド置換（８２９位と１４５９位；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）を含有する。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンｐＩＣＨ１５４６６（図２Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５（トランス移行タンパク質）と共に、又は伴わずに、ベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させた。浸潤後８日目に、ｐＩＣＨ１５４６６を浸潤させた領域において、ＧＦＰ発現細胞数の１０倍増加を観察した（ｐＩＣＨ１４８３３と比較、図１０）。これは、ウイルスレプリコンからイントロン様配列を除去することにより、無用の選択的スプライシングイベントを妨げ、より効率的にウイルス複製を開始することを示唆している。ｐＩＣＨ１５４６６とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤は、非改変レプリコンと同様の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、ＲＮＡ配列の改変がウイルスベクターの細胞間移行に影響を及ぼさなかったことを示している。
【実施例７】
【０１１２】
ＭＰサブゲノムプロモーターにおけるイントロン様配列の除去
第２の潜在的に問題のある領域はＭＰサブゲノムプロモーターに対応する（図６Ｂ）。この領域は非常にＴに富んでおり、イントロン配列に非常に近似している。その結果、多くの潜在スプライスドナー部位及びアクセプター部位が、イントロン予測プログラムによって隣接配列中に予測される。残念ながら、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなくこの領域を容易に改変することはできない。サブゲノムプロモーターを構わずに全領域を完全に変異させ、ＭＰをトランスで提供し、予想されるＭＰ発現の喪失を補償することにした。この構築体からＭＰは発現しないため、目的遺伝子の発現を駆動するために必要なＣＰサブゲノムプロモーターを含有する３’配列以外は、ＭＰ配列の大部分も削除した。したがって、ｐＩＣＨ１４８３３の３８３ｂｐ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のｂｐ４５８４〜５４５５）を２９７ｂｐ変異断片で置換した。得られた構築体ｐＩＣＨ１５９００（図２Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５と共に、又は伴わずに、ベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させた。興味深いことに、ｐＩＣＨ１４８３３を浸潤させた葉領域と比較して、複製開始細胞数の大幅な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したＧＦＰ発現プロトプラストを計数することにより、この改変で、未改変ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、ウイルス複製開始細胞数が８０〜１００倍増加すると概算している。ｐＩＣＨ１５９００をｐＩＣＨ１０７４５（ｐ３５Ｓ−ＭＰ発現カセット）を共浸潤させ、細胞間移行によるＧＦＰ蛍光の増加を検出した。しかしながら、この増加は、細胞間移行がなくても非常に多くの細胞が既にＧＦＰを発現していたため、非常に限られていた。ｐＩＣＨ１５９００含有アグロバクテリウム懸濁液の１０００倍希釈を、ｐＩＣＨ１０７４５含有アグロバクテリウムの未希釈懸濁液と共浸潤させることにより、分離したＧＦＰ発現焦点を生じさせた。蛍光焦点は、ｐＩＣＨ１４８３３を用いて得た対照焦点と同様の明るさ及び同一サイズであった。これは、ｐＩＣＨ１５９００の改変及びＭＰのトランス送達は、複製レベル、目的配列の発現、及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を傷つけないことを示している。同一構築体（ｐＩＣＨ１４９３３及びｐＩＣＨ１５９００、ｐＩＣＨ１０７４５と共に、又は伴わずに）をタバコの葉に共浸潤させた。ｐＩＣＨ１５９００の改変は、ベンサミアナタバコの場合と同様に複製開始細胞数を増加させた（ｐＩＣＨ１４８３３との比較）。
【実施例８】
【０１１３】
イントロン付加は細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
次に、レプリコンをコードする配列部分へのイントロン付加が複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。２つの構築体ｐＩＣＨ１５０２５及びｐＩＣＨ１５０３４（図２Ａ）を作製した。いずれも、３つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの２つの異なる領域中に含有する。ｐＩＣＨ１５０２５を、ＲｄＲＰの中央にイントロンを含有するようにデザインした。一方、ｐＩＣＨ１５０３４は、ＲｄＲＰの３’端であるＭＰサブゲノムプロモーターの上流にイントロンを含有する。イントロンをシロイヌナズナ ゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、予定のイントロン／エクソン接合部が重複するプライマーを用いて、ＰＣＲでウイルス配列に組み込んだ。イントロン含有断片をＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（付録の配列番号４）としてｐＩＣＨ１４８３３にサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０２５を作製するか、又はＰｓｔＩ／Ｎｃｏｌ断片（付録の配列番号５）としてサブクローニングしてｐＩＣＨ１５０３４を作製した。
【０１１４】
２つの構築体をベンサミアナタバコの葉にアグロ浸潤させ、ｐＩＣＨ１４８３３と比較した。２つの構築体はウイルス複製開始細胞数を顕著に増加させた（図１０Ａ）。この増加は、ｐＩＣＨ１４８３３に対して約５０倍の改善であると概算した。また、２つの構築体をＭＰ発現クローンとともに共浸潤させ、細胞間移行はイントロンのないクローンと同じであることがわかった。２つの構築体をタバコにおいても試験し、ベンサミアナタバコと同じ改善を観察した（図１０Ｂ）。
【０１１５】
６つのイントロン全てを含有する第３のクローンｐＩＣＨ１５４９９を作製した（図９、２Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ）。この構築体をベンサミアナタバコ及びタバコにおいて試験した。この構築体は、３つのイントロンを有する個々の構築体よりも効率的であったが、その改善は相加的ではなかった。
【実施例９】
【０１１６】
イントロン付加とイントロン様配列の除去は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる
１つの構築体におけるイントロン様特徴の除去と、追加イントロンの付加は、両タイプの改変がウイルス複製開始の向上に寄与できることを示した。ｐＩＣＨ１５４９９の６つのイントロンを、変異ＭＰサブゲノムプロモーター領域を含有するｐＩＣＨ１５９００へサブクローニングした。得られたクローンｐＩＣＨ１５８６０（図２Ｂ）をベンサミアナタバコの葉に浸潤させたところ、ＧＦＰを発現する全てのプロトプラストのおよそ５０％〜９０％の範囲で、それぞれの親クローンよりも顕著に良好に作用することを発見した（図１０）。最高性能の構築体は、ＲｄＲＰ領域と改変ＭＰサブゲノムプロモーター領域にイントロンを含有する（ｐＩＣＨ１６１９１、図１０Ｃ）。未改変クローンとの比較で、これは８０〜３００倍の改善に相当する。また、この構築体を、ＭＰ発現構築体（ｐＩＣＨ１０７４５）と共に共浸潤させたところ、改変が細胞間移行も複製も傷つけないことを発見した。
【実施例１０】
【０１１７】
全てのイントロン付加が細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの出現頻度を上昇させるわけではない
２つの異なるシロイヌナズナ イントロンをＲｄＲＰの初めに挿入し、クローンｐＩＣＨ１５４７７を得た（図２Ｂ）（この領域の配列を配列番号７として付録に示す）。この領域の配列は、イントロンを付加する前に、既に非常に「エクソン様」（例えばＧＣに富んでおり、潜在スプライス部位がない）に見える。この構築体で、ウイルス複製の開始に全く改善は見られなかった。したがって、あらゆるイントロン付加がウイルスベクターを改善するわけではない。イントロン挿入又は変異生成のために選択した位置は重要なパラメータであるように見える。例えば、ＭＰサブゲノムプロモーターのような問題のある構造の近傍領域に作製した全てのイントロン挿入又はヌクレオチド置換は大きな改善をもたらしたが、既に「エクソン様」である配列へのイントロン挿入は顕著にウイルス複製開始を改善しなかった。
【実施例１１】
【０１１８】
ＭＰ配列へのイントロン挿入はウイルスレプリコン形成頻度を上昇させる
初めに、制限酵素ＡｖｒＩＩで消化し、充填し、再連結することによって、ＭＰにフレームシフトを作製した。次にＭＰに２つのイントロンを挿入した。得られたクローンｐＩＣＨ１６４２２（図２Ｂ）をベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコン含有細胞数に約１００倍の増加を検出した。
【実施例１２】
【０１１９】
ＭＰ含有ベクターへのイントロン挿入は自律機能性クローンのウイルス複製開始頻度を上昇させる
ｐＩＣＨ１５４９９のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片ｐＩＣＨ８５４３へサブクローニングした。得られたクローン１６７００（図２Ｂ）は、ＲｄＲＰに６つのイントロンを有する完全なウイルスベクターを含有する。このクローンをベンサミアナタバコの葉に浸潤させたところ、効率的に複製を開始した。また、このクローンは、追加ＭＰをトランスで提供ことを必要とせずに細胞間移行可能であって。
【実施例１３】
【０１２０】
遺伝子操作された宿主植物におけるアグロ送達された不活性レプリコンの活性化
イントロン含有ウイルスベクター前駆体をトランスジェニック植物へアグロ浸潤させることも可能である。目的タンパク質の産生を運命付けられていない植物（例えば開放環境の植物）の偶発的感染を回避するために、ベクターの一部をアンチセンス方向に存在させた不活性クローンを作製することができる（図１１）。反転断片の先端に組換え部位とイントロン配列とを組み込むことにより、適切なリコンビナーゼを用いることによってこの断片を正しい方向に「反転」させることが可能である。組換え部位はスプライシングによってレプリコンから完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換えと転写の後、効率的に複製を開始させる。１つの具体例では、組換え部位が、目的遺伝子内であってプロレプリコンの下流に局在する。そのような立体配置は、組換え前の遺伝子発現を妨げる。ＲｄＲＰ中やプロモーターの上流のように、プロレプリコンの他の領域に組換え部位が局在する場合、他の立体配置を検討することができる。組換え部位のイントロン配列は、先に記載したように、組換え部位をレプリコンから完全に除去させる利点を有するだけでなく、ウイルス複製効率を上昇させる。リコンビナーゼ活性を提供するトランスジェニック植物宿主は、遺伝子操作して、不活性ウイルスベクター前駆体を含有するベクターと共にアグロ浸潤に用いることができる。ウイルスベクター前駆体は、遺伝子操作された植物宿主の細胞においてのみ活性化することができる。
【実施例１４】
【０１２１】
植物ウイルスＲＮＡ配列は潜在的に不安定領域を含有する
選択された植物ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを、十分に特徴付けられた植物遺伝子（ＡｔＤＭＣ１）のものと同様に、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて解析した。ＡｔＤＭＣ１について図１２に示すＲＮＡプロファイルは、先にｃＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列との比較によって同定した１４のイントロンの存在を明確に反映している（丸で囲んである）。２つの植物ウイルスのＲＮＡプロファイルは、植物の核環境に置かれた場合、ＲＮＡの安定性に問題を引き起こし得る領域を有することは明らかである（図１３、図１４を参照されたい）。ブロモモザイクウイルス、異なるＴＭＶ株、及び他の多くのものなど、いくつかの他の代表的植物ＲＮＡウイルス（示していない）のＲＮＡプロファイルを解析した。これらは全て、ＤＮＡ前駆体として植物細胞へ送達された場合に植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン形成効率を落とし得る、潜在的に問題のある領域を有している。
【実施例１５】
【０１２２】
ジェミニウイルスベクターによる植物全体の浸潤
ビーンゴールデンモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）単離体ＤＳＭＺ ＰＶ−００９４に基づいた発現ベクターｐＩＣＨ４３００、ｐＩＣＨ５２０２／３、及びｐＩＣＨ５１７０（図１５）を、ＷＯ０２／０７７２４６号の実施例１０及び１１に記載したように作製した。構築体ｐＩＣＨ５１７０を、実施例５に記載のようにベンサミアナタバコ植物及びタバコ植物の安定な形質転換に用いた。構築体ｐＩＣＨ５２０２／３及びｐＩＣＨ５１７０を、ＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８株に固定した。固定化ウイルスレプリコン（ｐＩＣＨ５２０２／３）を有する株を、ｐＩＣＨ５１７０で形質転換したタバコ植物全体のアグロ浸潤に用いた。トランスジェニック植物宿主は、いわゆる共通領域（ＣＲ）に局在するジェミニウイルスの複製起点を有するＧＦＰを有するＤＮＡレプリコンの複製を提供した。ＶｉｒＥ２機能欠損アグロバクテリウム株の場合、非形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８と共にアグロ浸潤を行った。あるいは、ｐＩＣＨＶｉｒＥ２で形質転換したベンサミアナタバコ植物を、ｐＩＣＨ５１７０で形質転換させた植物と交配させた。両構築体由来のＴ−ＤＮＡ領域を含有するＦ１子孫をＰＣＲで選択し、アグロバクテリウム機能を有し、ｐＩＣＨ５２０２／３を有するアグロ浸潤に用いた。
【０１２３】
固定化ウイルスレプリコン（ｐＩＣＨ５１７０）を有する株をタバコ植物全体のアグロ浸潤に用いた。
上記実験の結果は、トランスジェニック宿主植物又はＶｉｒＥ２発現アグロバクテリウムによって機能を補完することなくＶｉｒＥ２機能欠損株を用いた場合、浸潤植物においてＧＦＰを全く発現しないことを示した。しかしながら、ＶｉｒＥ２機能のトランス補完を必要とする実験における発現レベルは、ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８に固定した場合と顕著な差を示さなかった。
【実施例１６】
【０１２４】
細菌プラスミド接合性伝達欠損変異体の作製
ｔｒａ遺伝子及びｔｒｂ遺伝子は、Ｔｉプラスミドの接合性伝達に関与すると記載されている（Ｆａｒｒａｎｄら、１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８、４２３３−４２４７；Ｌｉら、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１、５０３３−４１）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８のＴｉプラスミドからこれらの遺伝子を削除するために、隣接ＤＮＡ領域を含有するベクターを形質転換に用い、２つの連続的組換えイベントにより、欠失を導入した。欠失ベクターは、正の選択マーカーとしてカルベニシリン耐性を、負の選択マーカーとしてショ糖不耐性を引き起こすｓａｃＢ遺伝子を含有するベクターｐＤＮＲ−１ｒ（クローンテック）に基づいている。
【０１２５】
ｔｒａ遺伝子（ｔｒａＧ、ｔｒａＤ、ｔｒａＣ、ｏｒｉＴ、ｔｒａＡ、ｔｒａＦ、ｔｒａＢ、ｔｒａＨ、ｔｒａＭ）を欠失させるために、およそ７００ｂｐの隣接領域をアグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡから、ｏＳＭ５７０プライマー（５’−ｇａｇｇａｔｃｃａａｃｇｔｔｔａｇｇａｇａａｃｃａｇ−３’）＋ｏＳＭ５７１プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａｃｇｇｔａｔａｃｇｃａｃａｃｔｇａａｃａｔｇｃｇ−３’）、及びｏＳＭ５７２プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｇｔｔｔｇｔｃｔｃ−３’）＋ｏＳＭ５７３プライマー（５’−ａｃｇｔｃｔａｇａｇａｔｃｇｃｇｔｔｃｃａｇａｃｃａａｃ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ断片をＢｓａＩで制限処理した後連結し、追加ヌクレオチドを導入することなくＢｓｔ１１０７１制限部位を作製した；外端にプライマーを用いてＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位を導入した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩで制限処理したベクターｐＤＮＲ−１ｒに２つのＰＣＲ断片を連結した。得られたプラスミドｐＩＣＦ１２７２１を、エレクトロポレーションによるアグロバクテリウム形質転換に用い、初めはカルベニシリンで、その後抗生物質はないが５％ショ糖の存在下で選択し、２重組換えイベントを有する、ベクター骨格を含有しない細胞を対抗選択した。
【０１２６】
ｔｒｂ遺伝子（ｔｒｂＢ、ｔｒｂＣ、ｔｒｂＤ、ｔｒｂＥ、ｔｒｂＪ）を欠失させるために、およそ７００ｂｐの隣接領域を、アグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡから、ｏＳＭ５６６プライマー（５’−ｃｔｇａａｔｔｃａｇｇｃａａａｃｇｃａｃｃｇｔｇａｇａｔｇ−３’）＋ｏＳＭ５６７プライマー（５’−ｔｃａｃｃａｔｇｇｇｔｃａｃｇｃｇｇｃａｃｔｃｃｔｇ−３’）、及びｏＳＭ５６８プライマー（５’−ｔｃａｃｃａｔｇｇｃｃｃａｇｇｃｃｃｇｇｃｇｔｇａａｃ−３’）＋ｏＳＭ５６９プライマー（５’−ａｃａｔｃｔａｇａｔｇｃｃｇｇｃａｔｃｇａａｇａｔｇｔｔｇ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ断片の連結により、追加のヌクレオチドを導入することなくＮｃｏＩ制限部位を作製した；外端にＥｃｏＲＩ部位及びＸｂａＩ部位をプライマーによって導入した。２つのＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩＩ及びＸｂａＩで制限処理したベクターｐＤＮＲ−１ｒに連結した。得られたプラスミドｐＩＣＦ１２７１１を上記のようにアグロバクテリウム形質転換に用いた。
【０１２７】
アグロバクテリウム間の接合伝達を測定するために、オパイン結合リプレッサーをコードするａｃｃＲ遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによって、構成的伝達を示す選択可能Ｔｉプラスミドを構築した。これは、やはりベクターｐＤＮＲ−１ｒに基づき、アグロバクテリウムＣ５８ ＤＮＡからｏＳＭ５５４プライマー（５’−ｇａｇｃｔａｇｃｔｃｃｇｔｃｃｔｔｃａｃｃｔｇｇｇｃ−３’）＋ｏＳＭ５５５プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃａｃｃｇｇｃｃｇａｔａｇｃｃａａａａａｃｔｇｃ−３’）、及びｏＳＭ５５６プライマー（５’−ｔｔｇｇｔｃｔｃｇｃｃｇｇｃｃａａａｃｔｃｃｇｇｔｔｔｇｃ−３’）＋ｏＳＭ５５７プライマー（５’−ａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｃｇａａｃｇｃａａｔｔｃｃｔｇｔｔｇｃ−３’）を用いてＰＣＲで増幅させた２つの隣接領域、及びそれらのあいだのＸｍａＩＩＩ部位にカナマイシン耐性（ｏＳＭ５８４プライマー（５’−ｃｃｔｃｇｇｃｃｇｃｇａａｃｇｇｃｃｔｃａｃ−３’）及びｏＳＭ５８５プライマー（５’−ｃｔａｃｇｇｃｃｇｃｔｇａｃａｇｃｔａａａａｃａａｔｔｃａｔｃｃ−３’）を用いてバイナリーベクターｐＩＣＨ１８７１１からＰＣＲで増幅させた）を含有するベクターｐＩＣＦ１２７４１でアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８を形質転換することによって作製した。カナマイシン耐性Ｔｉプラスミドを有する株を、染色体リファンピシン耐性を有するがＴｉプラスミドのないアクセプター株ＧＶ３１０１と共に、ニトロセルロースメンブラン上で２８℃にて２時間、Ｐｉｐｅｒ＆Ｆａｒｒａｎｄ（１９９９、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５、２７９８−２８０１）に記載されたのと同様にインキュベーションした。リファンピシンとカナマイシンを添加したプレートでトランス接合個体を選択した。ａｃｅを欠失しているが無傷のｔｒａ遺伝子及びｔｒｂ遺伝子を有するＴｉプラスミドの場合、投入ドナーあたりの接合効率はおよそ３〜４×１０−４トランス接合個体であった。ｔｒａ及びｔｒｂ変異体の場合、接合効率は検出限界以下であった（＜１０−７）。
【０１２８】
ベンサミアナタバコ植物に、ＧＦＰをコードするウイルスベクターｐＩＣＨ１８７１１を含有する細菌を浸潤させることにより、植物へのＤＮＡ伝達に対する変異の影響について試験した。細菌は、葉で単一蛍光スポットを観察できるように、さまざまな希釈率で用いた。植物へのＤＮＡ伝達効率は、ａｃｅ、ｔｒａ、又はｔｒｂ欠失のない細菌と匹敵するものであった。
【実施例１７】
【０１２９】
栄養要求性変異体の作製
栄養要求性アグロバクテリウム株を作製するために、ロイシンの生合成に関与する３−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素をコードするｌｅｕＢ遺伝子とウリジンの生合成に関与するオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥを選択した。ｌｅｕＢのコード配列は、アグロバクテリウム染色体の逆鎖に局在する仮想タンパク質ＡＴＵ２７９２の３’と重複するため、完全に欠失させることができない。したがって、染色体１のｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０を、上流配列の７７５ｂｐと下流配列の８３４ｂｐとを、ｌｅｕＢコード配列の５’端に天然に生ずるＢｓｐＨＩ制限部位を介して接続することにより欠失させるために選択した。ベクターｐＤＮＲ−１ｒ（クローンテック）を用いて、アグロバクテリウムの標的遺伝子内に欠失を作製した。
【０１３０】
ｌｅｕＢと同様に、ｐｙｒＥ遺伝子の異化補完は可能ではない。ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がアグロバクテリウムに存在するため、ウリジン添加は安価なウラシルで置き換え得る。更に、ｐｙｒＥ欠失は正の選択マーカーとして用いることができる。選択は、野生型アグロバクテリウムは毒性のウラシル類似体である５−フルオロオロチン酸に対して感受性であるが、ｐｙｒＥ変異体は当然耐性であるという事実を利用する。
【０１３１】
ｐｙｒＥの開始コドンは、異なるデータベースにおいて異なって注記されている（ｂｐ３９４７３４−３９５５３４、受託番号ＮＰ＿５３１１０５とｂｐ３９４８３６−３９５５３４、受託番号Ｑ８ＵＩ９８）。しかしながら、他のｐｙｒＥ配列に対する相同性はｂｐ３９４８３６の前からは開始しない。それにもかかわらず、２つの欠損変異体（欠失は１番染色体の３９４７６０位又は３９４８４９位から開始し、いずれも３９５５３１位で終わる）をデザインした。欠失含有断片を、ベクターｐＤＮＲ−１ｒのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＩＣＦ１２６３（ΔｌｅｕＢ ｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０）、ｐＩＣＦ１２６４（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４７６０−３９５５３１）、及びｐＩＣＦ１２６５（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４８４８−３９５５３１）を得た（図２１を参照されたい）。
【０１３２】
アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を、プラスミドｐＩＣＦ１２６３−３（ΔｌｅｕＢ ｂｐ２７９２３８４−２７９３４７０）、ｐＩＣＦ１２６４−１（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４７６０−３９５５３１）、及びｐＩＣＦ１２６５−１０（ΔｐｙｒＥ ｂｐ３９４８４８−３９５５３１）で形質転換した。カルベニシリン含有培地での選択２日目に少量の形質転換体（６〜１０ｃｆｕ／μｇ）を得た。ＬＢ＋リファンピシン液及びＬＢ＋リファンピシン＋サッカロース液中で選択したクローンを連続して増殖させることによって共組換え体を決定した。標的遺伝子に所望の欠失を含有するアグロバクテリウム変異体を、ＬＢ＋リファンピシン＋サッカロース培養物から単離したアグロバクテリウムＤＮＡのＰＣＲ解析によって確認した。
【０１３３】
変異体株１２６３−３−３及び１２６３−３−１０並びに野生型親株ＧＶ３１０１を、３０ｍｇ／ｌ及び１５０ｍｇ／ｌ ロイシンの添加の有無において、ＬＢ富栄養培地及びＭ９最少培地中で増殖させた。変異体株と野生型株とのあいだでＬＢ培地での増殖に差はなかったが、Ｍ９培地では野生型株のみ増殖できた。Ｍ９培地にロイシンを添加した場合、野生型株も変異体株も増殖できた。添加ありと添加なしの培地でのさまざまな変異体株の増殖を図２２及び図２３に示す。ロイシン濃度の増加とともに増殖率が増加した。アグロバクテリウム変異体１２６３−３−３をＧＦＰプラスミドｐＩＣＨ１８７１１で形質転換し、ベンサミアナタバコにおける感染効率について解析した。
【０１３４】
付録
配列番号１（ｐＩＣＨ１４８３３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片）：
【０１３５】
【化１】
配列番号２（ｐＩＣＨ１５４６６の部分）：
【０１３６】
【化２】
配列番号３（ｐＩＣＨ１５９００の部分）：
【０１３７】
【化３】
配列番号４（ｐＩＣＨ１５０２５の部分）：
【０１３８】
【化４】
配列番号５（ｐＩＣＨ１５０３４の部分）：
【０１３９】
【化５】
配列番号６（ｐＩＣＨ１５４７７の断片）：
【０１４０】
【化６】
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】図１Ａは、生物学的安全性の上昇（Ａ）に基づいた、本発明の一般的原理を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＲＮＡウイルスに基づくレプリコン形成頻度の上昇（Ｂ）に基づいた、本発明の一般的原理を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図２Ｂ】図２Ｂは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図２Ｃ】図２Ｃは、未改変の及び本発明にしたがい改変したウイルス構築体を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；インターフェロン−ヒトインターフェロンα ２ｂ；ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン；ｎｏｓ−ノパリン合成酵素遺伝の転写終止領域。
【図３】図３は、ベクターｐＩＣＨ１６７０７のアグロ浸潤後１０日目のベンサミアナタバコ植物をＵＶ光下にて示す。
【図４】図４は、ベクターｐＩＣＨ１８７１１のアグロ浸潤後４日目の、１７日（Ａ）、２２日（Ｂ）、２８日（Ｃ）、及び３５日（Ｄ）齢のベンサミアナタバコ植物をＵＶ光下にて示す。
【図５】図５は、構築体ｐＩＣＨ１８７２２及びｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域を図式的に示す。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ｎｏｓＴ−ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域；ｎｏｓＰ−ノパリン合成酵素遺伝子の転写プロモーター；ｏｓｃＴ−オクトピン合成酵素遺伝子の転写終止領域；ＮＰＴＩＩ−ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子のコード配列；ＴＶＣＶ ＭＰ−カブ葉脈透化ウイルスの移行タンパク質。
【図６Ａ】図６は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を横軸に示す。縦軸は、対応の配列／配列領域がコード配列（コード）であるか、ドナー部位（ドナー）若しくはアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。丸で囲んだ部分は、機能保存的な相違を導入すべき選択された位置に相当する。
【図６Ｂ】図６は、ベクターｐＩＣＨ８５４３の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。ヌクレオチド番号を横軸に示す。縦軸は、対応の配列／配列領域がコード配列（コード）であるか、ドナー部位（ドナー）若しくはアクセプター部位（アクセプター）として作用する確率を示す。丸で囲んだ部分は、機能保存的な相違を導入すべき選択された位置に相当する。
【図７】図７は、ベクターｐＩＣＨ１５４６６の転写領域（転写領域の前半の半分）のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は本発明に記載のように改変されている（図６Ａとの比較）。
【図８】図８は、ｐＩＣＨ１５９００の転写領域（転写領域の第２の半分）のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は本発明に記載のように改変されている（図６Ｂとの比較）。
【図９Ａ】図９は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は、６つの挿入された植物核イントロンに相当する。
【図９Ｂ】図９は、ｐＩＣＨ１５４９９の転写領域のイントロン予測プロファイルを示す。丸で囲んだ領域は、６つの挿入された植物核イントロンに相当する。
【図１０Ａ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ａ−ベンサミアナタバコ、アグロ浸潤後８日目。
【図１０Ｂ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ｂ−タバコ、アグロ浸潤後８日目。
【図１０Ｃ】図１０は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域におけるベクター同定番号を示す。Ｃ−アグロ浸潤後５日目に単離したベンサミアナタバコのプロトプラスト。右の写真の多くの光点は、非常に高頻度のレプリコン形成及びＧＦＰ発現を示す。
【図１１】図１１は、本発明にしたがいデザインされたＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン前駆体の略図であり、非誘導状態では目的配列（ＧＦＰ、Ｇと示す）の発現レベルがゼロである。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図１２】図１２は、直鎖（＋鎖）を用いたシロイヌナズナ減数分裂特異的遺伝子ＡｔＤＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７６６７０）のイントロン予測プロファイルを示す。イントロンコード領域を丸で囲んである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）の直鎖（＋鎖）内の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１７２２５９）の直鎖（＋鎖）内の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ａ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０３）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２７０２）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１４Ｃ】図１４は、アルファルファモザイクウイルスゲノムＲＮＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ００１６３）の直鎖（＋鎖）の潜在的に問題のある領域（丸で囲んである）の予測プロファイルを示す。
【図１５】図１５は、構築体ｐＩＣＨＶｉｒＥ２、ｐＩＣＨ４３００、ｐＩＣＨ５２０２／３、及びｐＩＣＨ５１７０のＴ−ＤＮＡ領域の略図を示す。
【図１６】図１６は、機能性ＭＰ（移行タンパク質）欠失ウイルスベクターの細胞間移行のトランスジェニック植物宿主（ベンサミアナタバコ）からのトランス補完の効果を示す。上部のラベルは植物を表し、下部のラベルはアグロ浸潤に用いたベクターを示す。左の写真は図示したように処理した植物の典型的な葉を示す。右の写真はトランスジェニック植物の全体を示す。ＷＴ：野生型植物；ｐＩＣＨ１０７４５トランスジェニック：ＴＶＣＶ移行タンパク質（ＭＰ）を発現するトランスジェニック植物；ｐＩＣＨ１８７２２：細胞間移行不良のウイルスベクターによる浸潤；ｐＩＣＨ１８７１１：細胞間移行可能なウイルスベクターによる浸潤。ＧＦＰ発現を検出するために植物をＵＶ光下にて示す。
【図１７】図１７は、バイナリーベクターｐＩＣＨ１８７１１からのＴ−ＤＮＡ伝達効率に対するＶｉｒＥ２遺伝子の効果を示す。ＶｉｒＥ２：機能性ＶｉｒＥ２遺伝子を含有するアグロバクテリウムを浸潤させたベンサミアナタバコの葉；ΔｖｉｒＥ２：ＶｉｒＥ２遺伝子機能不良のアグロバクテリウムを浸潤させたベンサミアナタバコの葉；１０２〜１０７の数は浸潤前のアグロバクテリウムストックの希釈を示す（ΔＶｉｒＥ２株とＶｉｒＥ２株のストックは同一ＯＤ６００）。矢印は同一のＴ−ＤＮＡ伝達頻度を発揮する条件を結び付けており、ΔＶｉｒＥ２株は１０２倍希釈、ＶｉｒＥ２株は１０７倍希釈に相当する。
【図１８】図１８は、野生型（ＷＴ）植物、及びｐＩＣＨ１８７１１バイナリーベクターを含有するΔＶｉｒＥ２アグロバクテリウム株を浸潤させたトランスジェニック（ｐＩＣＨＶｉｒＥ２）植物を示す。写真は、１０ｄｐｉ（浸潤後日数）にＵＶ光下にて撮影した。同一のアグロバクテリウム一晩培養物を、ＷＴの浸潤には１０倍に希釈し、トランスジェニック植物の浸潤には１０００倍に希釈した。
【図１９】図１９は、野生型植物への変異体アグロバクテリウム（機能性ｖｉｒＥ２遺伝子を欠失）と野生型アグロバクテリウム（ＶｉｒＥ２遺伝子機能を維持）との共浸潤によるＶｉｒＥ２遺伝子機能のトランス補完を示す。変異体及び野生型のアグロバクテリウムをさまざまな組み合わせで浸潤させたベンサミアナタバコの葉をＵＶ光下にて示す。四角内のラベルは、アグロバクテリウムの個々の種類を表す。四角のあいだの＋印は、葉の同一の場所に２種類のアグロバクテリウムを共浸潤させたことを示す。「Ｔ−ＤＮＡ」の前の＋印又は−印は、それぞれ、ＧＦＰを有するＴ−ＤＮＡの存在及び不存在を示す。機能性ＶｉｒＥ２の不存在をΔで示す。
【図２０】図２０は、ａｃｅオペロンを欠失したアグロバクテリウムからのＴ−ＤＮＡ伝達効率試験の結果を示す。ＴｉプラスミドｐＭＰ９０（対照）又はｐＴｉＣ５８Δａｃｃ（ａｃｃ欠失）を有するアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を、ＧＦＰをコードするウイルスベクターｐＩＣＨ１８７１１で形質転換し、一晩培養物のさまざまな希釈物を植物の浸潤に用いた。写真は接種後７日目にＵＶ光下にて撮影した。
【図２１】図２１は、アグロバクテリウムのΔｌｅｕＢ変異体及びΔｐｙｒＥ変異体を作製するための戦略を表す。
【図２２】図２２は、補完の有無における、さまざまな培地でのアグロバクテリウム株１２６４（ΔｐｙｒＥ）の増殖速度を示す。ΔｐｙｒＥ変異体株１２６４−１−２及び１２６４−１−８はウラシル含有培地においてのみ増殖する。縦軸上の数値はＯＤ６００を示す。
【図２３】図２３は、補完の有無における、さまざまな培地でのアグロバクテリウム株１２６３（ΔｌｅｕＢ）の増殖速度を示す。ΔｌｅｕＢ変異体株１２６３−３−３及び１２６３−３−１０はロイシン依存性であるが、野生型親株ＧＶ３１０１はロイシン依存性ではない。縦軸上の数値はＯＤ６００を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、レプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている、前記方法。
【請求項２】
第１の遺伝子改変が、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
補完因子が、アグロバクテリウム株による植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションに必要な機能を提供する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションに必要な機能が、ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦから成る群より選択される遺伝子又はタンパク質によって提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の遺伝子改変として、生物へのトランスフェクションに必要なアグロバクテリウム株の機能が、化学的に調節された異種プロモーターの制御下に置かれており；補完因子が、化学的に調節されたプロモーターを調節可能な小分子化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
補完因子が、第２のアグロバクテリウム株によって植物又は植物の葉に提供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物に、補完因子であるか又は補完因子をコードする第２の遺伝子改変を提供する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アグロバクテリウム株が栄養要求性であり、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物の存在下で植物又は植物の葉に提供される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の遺伝子改変がアグロバクテリウム株を栄養要求性にし、補完因子が、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要なアグロバクテリウム株の主要代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アグロバクテリウム株が条件的致死性であり、アグロバクテリウム株の生存に必要な代謝産物の存在下で増殖し、及び／又は植物又は植物の葉に提供される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の遺伝子改変がアグロバクテリウム株を条件的致死性にし、補完因子が、アグロバクテリウム株の生存に必要なアグロバクテリウム株の主要代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アグロバクテリウム株が、アグロバクテリウムから又はアグロバクテリウムへのプラスミドの接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
接合性伝達の不良が、以下の遺伝子：ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、及びｔｒａＦのうちの少なくとも１つの機能を欠失することによって起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
レプリコンをコードする配列部分が、植物又は植物の葉におけるレプリコンの伝播に必要な機能を欠損したレプリコンをコードする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
配列部分が、レプリコンの遠隔距離移行又は細胞間移行に必要な機能を欠損したレプリコンをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
レプリコンの伝播に必要な機能が、植物又は植物の葉において異種ＤＮＡ配列以外の核酸配列から機能を発現させることによって植物又は植物の葉に提供される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
アグロバクテリウム株が腫瘍抑制活性タンパク質Ｏｓａを発現する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
アグロバクテリウム株が、非標的生物へのＴ−ＤＮＡ伝達を減少させるための、遺伝子改変された菌体数感知システム又は病原性誘導調節システムを有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
補完因子が、植物又は植物の葉において２つのＲＮＡ配列のトランススプライシングによって提供され、２つのＲＮＡ配列のうちの多くても１つがアグロバクテリウム株にコードされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
レプリコンがＤＮＡレプリコンである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
レプリコンがＲＮＡレプリコンであり、ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分が転写プロモーターに機能可能に連結している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
レプリコン機能に必要な配列が、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接する潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
機能保存的な相違が、レプリコン形成に必要な配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍又はその中に１以上の核イントロン又は核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
レプリコンが、植物又は植物の葉において細胞間移行不良である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
植物ウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルスである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アグロバクテリウム株がアグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはアグロバクテリウム・リゾゲネス、又はアグロバクテリウム由来機能性Ｔ−ＤＮＡ伝達発生装置を含有するように操作された他の微生物である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子改変が細菌染色体及び／又はプラスミド染色体上になされる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
植物又は植物の葉を、工程（ａ）において、６００ｎｍの算出光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウム株の細胞濃度を有するアグロバクテリウム株の懸濁液に浸潤させ、算出光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
植物又は植物の葉が以下の種：ベンサミアナタバコ、タバコ、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、クレス、ルッコラ、マスタード、イチゴ、ホウレンソウ、アカザ、レタス、ヒマワリ、及びキュウリのうちの１つに属する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物又は植物の葉を浸潤させることによってトランスフェクションを行う、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる、前記方法。
【請求項３３】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は１以上の核イントロンを含有する、前記方法。
【請求項３４】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
アグロバクテリウム株は、他の細菌へのプラスミドＤＮＡの接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有する、前記方法。
【請求項３５】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして、
アグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性である、前記方法。
【請求項３６】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって:
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、
アグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性であり、そして
レプリコン機能に必要な配列は１以上の核イントロンを含有する、前記方法。
【請求項３７】
（ｉ）請求項１に定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）請求項１に定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする植物又はその種子、
を含む、キット部品。
【請求項３８】
（ｉ）請求項１に定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）請求項１で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする第２のアグロバクテリウム株、
を含む、キット部品。
【請求項３９】
（ｉ）補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な細菌の機能を欠損した第１の遺伝子改変を有し、
（ｉｉ）他の細菌へのプラスミド伝達の接合能を欠損しており、そして
（ｉｉｉ）栄養要求性である、
ことを特徴とする、アグロバクテリウム属の細菌。
【請求項４０】
アグロバクテリウムが、レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有し、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ウイルスに由来する、植物のレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ） 細菌を適用した植物において発現されるべき目的配列、
を含有する、請求項３９に記載の細菌。
【請求項１】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、レプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されている、前記方法。
【請求項２】
第１の遺伝子改変が、植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
補完因子が、アグロバクテリウム株による植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションに必要な機能を提供する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションに必要な機能が、ＶｉｒＥ２、ＧＡＬＬＳ、及びＶｉｒＦから成る群より選択される遺伝子又はタンパク質によって提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の遺伝子改変として、生物へのトランスフェクションに必要なアグロバクテリウム株の機能が、化学的に調節された異種プロモーターの制御下に置かれており；補完因子が、化学的に調節されたプロモーターを調節可能な小分子化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
補完因子が、第２のアグロバクテリウム株によって植物又は植物の葉に提供される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物に、補完因子であるか又は補完因子をコードする第２の遺伝子改変を提供する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アグロバクテリウム株が栄養要求性であり、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物の存在下で植物又は植物の葉に提供される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の遺伝子改変がアグロバクテリウム株を栄養要求性にし、補完因子が、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要なアグロバクテリウム株の主要代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アグロバクテリウム株が条件的致死性であり、アグロバクテリウム株の生存に必要な代謝産物の存在下で増殖し、及び／又は植物又は植物の葉に提供される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の遺伝子改変がアグロバクテリウム株を条件的致死性にし、補完因子が、アグロバクテリウム株の生存に必要なアグロバクテリウム株の主要代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アグロバクテリウム株が、アグロバクテリウムから又はアグロバクテリウムへのプラスミドの接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
接合性伝達の不良が、以下の遺伝子：ｏｒｉＴ、ｔｒａＧ、及びｔｒａＦのうちの少なくとも１つの機能を欠失することによって起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
レプリコンをコードする配列部分が、植物又は植物の葉におけるレプリコンの伝播に必要な機能を欠損したレプリコンをコードする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
配列部分が、レプリコンの遠隔距離移行又は細胞間移行に必要な機能を欠損したレプリコンをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
レプリコンの伝播に必要な機能が、植物又は植物の葉において異種ＤＮＡ配列以外の核酸配列から機能を発現させることによって植物又は植物の葉に提供される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
アグロバクテリウム株が腫瘍抑制活性タンパク質Ｏｓａを発現する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
アグロバクテリウム株が、非標的生物へのＴ−ＤＮＡ伝達を減少させるための、遺伝子改変された菌体数感知システム又は病原性誘導調節システムを有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
補完因子が、植物又は植物の葉において２つのＲＮＡ配列のトランススプライシングによって提供され、２つのＲＮＡ配列のうちの多くても１つがアグロバクテリウム株にコードされる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
レプリコンがＤＮＡレプリコンである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
レプリコンがＲＮＡレプリコンであり、ＲＮＡレプリコンをコードする配列部分が転写プロモーターに機能可能に連結している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
レプリコン機能に必要な配列が、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
機能保存的な相違が、Ａ／Ｕに富んだ領域に隣接する潜在スプライシング部位の除去を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
機能保存的な相違が、レプリコン形成に必要な配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍又はその中に１以上の核イントロン又は核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
レプリコンが、植物又は植物の葉において細胞間移行不良である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
植物ウイルスがトバモウイルスであり、好ましくはタバコモザイクウイルスである、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アグロバクテリウム株がアグロバクテリウム・ツメファシエンス若しくはアグロバクテリウム・リゾゲネス、又はアグロバクテリウム由来機能性Ｔ−ＤＮＡ伝達発生装置を含有するように操作された他の微生物である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子改変が細菌染色体及び／又はプラスミド染色体上になされる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
植物又は植物の葉を、工程（ａ）において、６００ｎｍの算出光学密度が高くても０．０４、好ましくは高くても０．０１、より好ましくは高くても０．００４、最も好ましくは高くても０．００１に相当するアグロバクテリウム株の細胞濃度を有するアグロバクテリウム株の懸濁液に浸潤させ、算出光学密度は、６００ｎｍのＯＤが１．０のアグロバクテリウム懸濁液のそれぞれ少なくとも２５倍希釈、好ましくは少なくとも１００倍希釈、より好ましくは少なくとも２５０倍希釈、最も好ましくは少なくとも１０００倍希釈によって規定される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
植物又は植物の葉が以下の種：ベンサミアナタバコ、タバコ、ペチュニア、アブラナ、カラシナ、クレス、ルッコラ、マスタード、イチゴ、ホウレンソウ、アカザ、レタス、ヒマワリ、及びキュウリのうちの１つに属する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
植物又は植物の葉を浸潤させることによってトランスフェクションを行う、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は、選択された位置で、植物ＲＮＡウイルスとの機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる、前記方法。
【請求項３３】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では生物へのＴ−ＤＮＡのトランスフェクションを不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
レプリコン機能に必要な配列は１以上の核イントロンを含有する、前記方法。
【請求項３４】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして
アグロバクテリウム株は、他の細菌へのプラスミドＤＮＡの接合性伝達を不良にする更なる遺伝子改変を有する、前記方法。
【請求項３５】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって：
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、そして、
アグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性である、前記方法。
【請求項３６】
目的配列を植物又は植物の葉において発現させることによって目的タンパク質を産生する方法であって:
（ａ）レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有するアグロバクテリウム株を補完因子の存在下又は非存在下で植物又は植物の葉にトランスフェクションし、ＲＮＡレプリコンをコードする配列は、
（ｉ）植物ウイルスに由来する、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ）発現されるべき目的配列、
を含有し、
（ｂ）場合により、工程（ａ）で浸潤させた植物又は植物の葉から目的タンパク質を単離する、
ことを含み、
アグロバクテリウム株は、補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要なアグロバクテリウム株の機能を不良にする第１の遺伝子改変が提供されており、
アグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム株の栄養要求性増殖に必要な主要代謝産物に対して栄養要求性であり、そして
レプリコン機能に必要な配列は１以上の核イントロンを含有する、前記方法。
【請求項３７】
（ｉ）請求項１に定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）請求項１に定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする植物又はその種子、
を含む、キット部品。
【請求項３８】
（ｉ）請求項１に定義した通りのアグロバクテリウム株、及び
（ｉｉ）請求項１で定義したアグロバクテリウム株の欠陥を補完可能な補完因子をコードする第２のアグロバクテリウム株、
を含む、キット部品。
【請求項３９】
（ｉ）補完因子の非存在下では植物又は植物の葉の細胞へのＴ−ＤＮＡの導入に必要な細菌の機能を欠損した第１の遺伝子改変を有し、
（ｉｉ）他の細菌へのプラスミド伝達の接合能を欠損しており、そして
（ｉｉｉ）栄養要求性である、
ことを特徴とする、アグロバクテリウム属の細菌。
【請求項４０】
アグロバクテリウムが、レプリコンをコードする配列部分を有する異種ＤＮＡ配列をＴ−ＤＮＡ中に含有し、レプリコンをコードする配列は、
（ｉ） 植物ウイルスに由来する、植物のレプリコンのレプリコン機能に必要な配列、及び
（ｉｉ） 細菌を適用した植物において発現されるべき目的配列、
を含有する、請求項３９に記載の細菌。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００８−５０５６２２（Ｐ２００８−５０５６２２Ａ）
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９７２７（Ｐ２００７−５１９７２７）
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７３６１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００３０１８
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０４４０２９９１）アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７３６１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００３０１８
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０４４０２９９１）アイコン ジェネティクス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
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