植物における脂肪酸代謝の改変
【課題】新規のポリマーを作製するのために植物における脂肪酸の生合成および酸化を改変するための方法および系を提供する。
【解決手段】２つの酵素が必須である：Ｄ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅから得られるヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いくつかの植物は、その植物がこのヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。実施例は、トランスジェニック植物におけるこれらの酵素の発現によるポリマーの生成を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植物の表現型を変化させ得、これにより、種子生産を減少させるか無くす、そして緑色植物の生物体量を増加する、ならびにポリヒドロキシアルカノエートを生成することを実証する。
【解決手段】２つの酵素が必須である：Ｄ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅから得られるヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いくつかの植物は、その植物がこのヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。実施例は、トランスジェニック植物におけるこれらの酵素の発現によるポリマーの生成を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植物の表現型を変化させ得、これにより、種子生産を減少させるか無くす、そして緑色植物の生物体量を増加する、ならびにポリヒドロキシアルカノエートを生成することを実証する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、一般的に、ポリヒドロキシアルカノエート物質の産生のためのトランスジェニック植物系、トリグリセリドおよび脂肪酸の改変、ならびに植物での種子生産を変更するための方法の分野に関する。
【０００２】
作物栽培学的な作物についての安定なトランスジェニック植物を産生するための方法が、ここ最近１５年にわたって開発されてきた。作物は、投入量および産出量の両方の形質を改良するために遺伝的に改変された。前者の形質において、特定の農薬に対する耐性が作物中で操作され、そして特定の天然の殺虫剤（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｅｓｉｓの毒素）が、植物中で直接発現された。ハイブリッド植物を産生するための、雄性不稔系の開発における有意な進歩もまた存在する。産出量の形質に関して、作物は、生産物、一般的には、植物の種子、穀粒または繊維の価値を増すために改変される。重要な代謝標的としては、デンプン、脂肪酸および油の生合成経路の改変が挙げられる。
【０００３】
植物作物における微生物のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）バイオポリマーの産生においてかなりの商業的な興味が存在する。例えば、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｂｒｉｇｈｔらに対する米国特許第５，５０２，２７３号；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，５３４，４３２号；Ｊｏｈｎに対する米国特許第５，６０２，３２１号；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅらに対する米国特許第５，６１０，０４１号；ＰＣＴ ＷＯ９１／００９１７；ＰＣＴ ＷＯ９２／１９７４７；ＰＣＴ ＷＯ９３／０２１８７；ＰＣＴ ＷＯ９３／０２１９４；ＰＣＴ ＷＯ９４／１２０１４；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−２３（１９９２）；ｖａｎ ｄｅｒ ＬｅｉｊおよびＷｉｔｈｏｌｔ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−３８（１９９５）；ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（Ｅｇｇｉｎｋら編）Ｄａｖｏｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９６年８月１８〜２３日）；ならびにＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６）を参照のこと。ＰＨＡは、天然の、熱可塑性ポリエステルであり、そして非常に多くの適用（消費者包装、使い捨てダイアパーの裏地およびごみ袋、食物、ならびに医療製品を含む）に使用するための伝統的なポリマー技術により加工され得る。
【０００４】
実験的な植物系であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの葉緑体でのポリヒドロキシ酪酸の産生における初期研究により、ＰＨＢとして、葉の乾燥重量で１４％までの蓄積を生じた（Ｎａｗｒａｔｈら、１９９３）。しかし、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、作物栽培学的価値を有さない。さらに、作物栽培学的作物において経済的にＰＨＡを産生するために、種子におけるＰＨＡの産生が所望され、その結果、種子の収穫および加工のための現在の基幹施設が利用され得る。植物の種子からのＰＨＡの回収（ＰＣＴ ＷＯ９７／１５６８１）および最終用途の適用（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６））の選択肢は、ポリマーの組成によって有意に影響を受ける。それゆえ、きちんと規定された組成を有するＰＨＡポリマーを産生するトランスジェニック植物系を開発することは有利である。
【０００５】
それらの基質特異性に基づいたＰＨＡ生合成酵素の慎重な選択は、トランスジェニック系において規定された組成のＰＨＡポリマーの産生を可能にする（米国特許第５，２２９，２７９号；同第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号；同第５，６６１，０２６号；および同第５，６６３，０６３号）。
【０００６】
細菌において、各ＰＨＡ基は、特異的な経路により産生される。短いペンダント基ＰＨＡの場合では、以下の３つの酵素が関与する：β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ。例えば、ホモポリマーＰＨＢは、アセチル補酵素Ａの２つの分子の縮合により産生され、アセトアセチル補酵素Ａを生じる。次いで、後者は、レダクターゼによりキラル中間体Ｒ−３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａに還元され、続いて、ＰＨＡシンターゼ酵素により重合される。ＰＨＡシンターゼは、４−ヒドロキシ酸ユニットおよび５−ヒドロキシ酸ユニットを両方とも含むＣ３〜Ｃ５ヒドロキシ酸モノマーの重合化を可能にする比較的広範な基質特異性を特に有する。この生合成経路は、多くの細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉおよびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）において見出される。長いペンダント基ＰＨＡは、例えば、多くの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌により産生される。これらの生合成は、ヒドロキシアシル補酵素Ａモノマー単位への経路として脂肪酸のβ−酸化および脂肪酸合成を含む。次いで、後者は、より大きなＣ６〜Ｃ１４モノマー単位に有利な基質特異性を有するＰＨＡシンターゼにより変換される（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９９０）。
【０００７】
脂肪酸での細胞増殖から通常産生されるＰＨＢ−コ−ＨＸコポリマーの場合、これらの経路の組み合わせは、異なるモノマー単位の形成を担い得る。実際に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（これは、コポリマーであるＰＨＢ−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートを産生する）におけるＰＨＡシンターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ遺伝子座の分析を使用して、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよびＤ−β−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ単位の産生を担うＤ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を同定した（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７）；Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−７３（１９９８））。このようなヒドラターゼ遺伝子および酵素の他の供給源としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍが挙げられる。
【０００８】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおいて短いペンダント基ＰＨＡを産生する酵素である、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびβ−ケトチオラーゼは、ｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を含むオペロンによってコードされる（Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９８７；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物において、長いペンダント基ＰＨＡの産生を担うＰＨＡシンターゼは、ｐｈａ遺伝子座上に、特にｐｈａＡ遺伝子およびｐｈａＣ遺伝子によりコードされることが見出されている（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１））。これらの初期研究により、ある範囲のＰＨＡ生合成遺伝子が、単離および特徴づけされるか、またはゲノム配列決定プロジェクトから同定された。公知のＰＨＡ生合成遺伝子の例は、以下の参考文献に開示される：Ａｅｒｏｎｏｍａｓ ｃａｖｉａｅ（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，５１２，６６９号；および同第５，６６１，０２６号；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−０３（１９８９））；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８：１４５−５２（１９９４）；Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ（ＬｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１３５−５０（１９９２）））；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３０９−１７（１９９３））；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧＥＮＢＡＮＫ 受託番号ＡＦ０１９９６４；Ｈａｌｌら、１９９８、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−６９）；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７７４−７９（１９９６）；Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０−７２：３４１−５２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３（Ｍａｔｓｕｓａｋｉら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４５９−６７）；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＴｉｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２））；Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１６４６−５４（１９９６））；Ｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５））；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ−ＦｕｒｓｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：７３−７９（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９：２１７−３０（１９９２））；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３）；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９−３６（１９９６））；Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４９３−５０１（１９９３））およびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９７−１０２（１９８７））；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３：３４９−５７（１９８９））。これらの遺伝子または公開されたＤＮＡ配列の利用可能性は、ＰＨＡ産生のためのある範囲の選択肢を提供するはずである。
【０００９】
１〜９９％ＨＨモノマーを含むＰＨＢ−コ−ＨＨコポリマーを産生するための適切なＰＨＡシンターゼは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅ ｖｉｏｌａｃｅａ、およびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子によりコードされる。Ｒ−３−ヒドロキシブチレートに加えて、６〜１２の炭素原子の３−ヒドロキシ酸の取り込みのために有用な（すなわち、化学的に合成されたコポリマー（ＰＣＴ ＷＯ９５／２０６１４、ＰＣＴ ＷＯ９５／２０６１５およびＰＣＴ ＷＯ９５／２０６２１に記載される）に等価な生物学的ポリマーを産生するための）ＰＨＡシンターゼは、多くのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびほかの細菌において同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）；Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７（１９９６））。そして、それらは、米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号に記載されるように容易に単離され得る。Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡシンターゼ（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１））は、長いペンダント基ＰＨＡの産生に適切である。β−ケトチオラーゼをコードする植物遺伝子もまた、同定されている（ＶｏｌｌａｃｋおよびＢａｃｈ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０９７−１０７（１９９６））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，２４５，０２３号
【特許文献２】米国特許第５，２５０，４３０号
【特許文献３】米国特許第５，５０２，２７３号
【特許文献４】米国特許第５，５３４，４３２号
【特許文献５】米国特許第５，６０２，３２１号
【特許文献６】米国特許第５，６１０，０４１号
【特許文献７】国際公開第９１／００９１７号
【特許文献８】国際公開第９２／１９７４７号
【特許文献９】国際公開第９３／０２１８７号
【特許文献１０】国際公開第９３／０２１９４号
【特許文献１１】国際公開第９４／１２０１４号
【特許文献１２】国際公開第９７／１５６８１号
【特許文献１３】米国特許第５，２２９，２７９号
【特許文献１４】米国特許第５，２４５，０２３号
【特許文献１５】米国特許第５，４８０，７９４号
【特許文献１６】米国特許第５，５１２，６６９号
【特許文献１７】米国特許第５，６６１，０２６号
【特許文献１８】米国特許第５，６６３，０６３号
【特許文献１９】米国特許第５，２４５，０２３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−２３（１９９２）
【非特許文献２】ｖａｎ ｄｅｒ ＬｅｉｊおよびＷｉｔｈｏｌｔ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−３８（１９９５）
【非特許文献３】ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（Ｅｇｇｉｎｋら編）Ｄａｖｏｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９６年８月１８〜２３日）
【非特許文献４】ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６）
【非特許文献５】ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７）
【非特許文献６】Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−７３（１９９８）
【非特許文献７】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献８】ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０
【非特許文献９】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−０３（１９８９）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８：１４５−５２（１９９４）
【非特許文献１１】ＬｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１３５−５０（１９９２）
【非特許文献１２】ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３０９−１７（１９９３）
【非特許文献１３】Ｈａｌｌら、１９９８、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−６９
【非特許文献１４】Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７７４−７９（１９９６）
【非特許文献１５】Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５）
【非特許文献１６】Ｕｍｅｄａら、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０−７２：３４１−５２）
【非特許文献１７】Ｍａｔｓｕｓａｋｉら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４５９−６７
【非特許文献１８】ＴｉｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２）
【非特許文献１９】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献２０】Ｃｅｖａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１６４６−５４（１９９６）
【非特許文献２１】Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５）
【非特許文献２２】Ｐｉｅｐｅｒ−ＦｕｒｓｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：７３−７９（１９９２）
【非特許文献２３】Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２）
【非特許文献２４】Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９：２１７−３０（１９９２）
【非特許文献２５】Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３）
【非特許文献２６】Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９−３６（１９９６）
【非特許文献２７】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４９３−５０１（１９９３）
【非特許文献２８】Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９７−１０２（１９８７）
【非特許文献２９】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３：３４９−５７（１９８９）
【非特許文献３０】ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（１９９２）
【非特許文献３１】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）
【非特許文献３２】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４）
【非特許文献３３】Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９（１９９５）
【非特許文献３４】Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）
【非特許文献３５】Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）
【非特許文献３６】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７（１９９６）
【非特許文献３７】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献３８】ＶｏｌｌａｃｋおよびＢａｃｈ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０９７−１０７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
合成および基質の選択によりモノマー組成を改変する能力にもかかわらず、脂肪酸代謝に関する生合成のようなポリマー生合成の他の特徴を改変することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の目的は、植物の細胞代謝を操作するための脂肪酸酸化酵素系を導入するための方法およびＤＮＡ構築物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、植物において、好ましくは、その脂肪種子においてＰＨＡの産生を増強するための方法を提供することである。
【００１５】
（発明の要旨）
新規なポリマーを作製するための、植物において脂肪酸生合成および酸化を改変するための方法および系が、記載される。２つの酵素が、必須である：Ｄ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅから得られたヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いくつかの植物は、植物が、ヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。
【００１６】
実施例は、トランスジェニック植物において、これらの酵素の発現によりポリマーの産生を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植物の表現型を変化させ得、これにより種子産生を減少または排除する、および緑色植物生物体量を増加させる、ならびにＰＨＡを産生することを実証する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを産生するための、脂肪酸β−酸化経路の模式図である。
【図２】図２は、プラスミド構築物ｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２０２５を示す模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
発生中の脂肪種子または緑色組織の細胞質またはプラスチドに脂肪酸酸化酵素系を導入することによって植物の細胞性代謝を操作するための方法およびＤＮＡ構築物が提供される。脂肪酸酸化系は、代表的には、広範囲のβ−ケトアシル−ＣｏＡ基質を利用するβ−ケトチオラーゼ酵素活性を含むいくつかの酵素活性を含む。
【００１９】
驚くべきことに、豆のファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーターからの少なくとも１つのこれらの導入遺伝子の発現が、雄性不稔をもたらすことが見出された。興味深いことに、これらの植物は、種子をつけず、その代わりに正常よりも高いレベルの生物体量（例えば、葉、茎、柄）を生成した。それゆえ、本明細書中に記載される方法および構築物をまた用いて、例えば、ハイブリッド生成のために雄性不稔植物を作製し得るか、またはまぐさ（例えば、アルファルファまたはタバコ）の生物体量の生成を増加させ得る。これらの方法およびＤＮＡ構築物を用いて作製された植物は、ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマーを生成するため、または新規な油組成物を生成するために有用である。
【００２０】
本明細書中に記載される方法は、さらなる導入遺伝子、特に、脂肪酸酸化またはポリイヒドロキシアルカノエート生合成に関与するさらなる酵素をコードする導入遺伝子のその後の取り込みを含む。ポリヒドロキシアルカノエート生合成については、この方法は、本明細書中に記載の方法およびＤＮＡ構築物を用いて、または伝統的な植物育種法によって生成されたトランスジェニック植物の続く形質転換による、酵素（例えば、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨアセトアセチル−補酵素Ａレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡエピメラーゼ、δ３−シス−δ２−トランスエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ）をコードする導入遺伝子の取り込みを含む。
【００２１】
（Ｉ．植物発現系）
好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモーターから発現され、そしてタンパク質は、発生中の脂肪種子の細胞質において発現される。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモーターから発現され、そして発現されたタンパク質は、プラスチド標的化シグナルを用いてプラスチドに指向される。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、プラスチド染色体から直接発現され、ここで、これらは相同組換えによって取り込まれる。脂肪酸酸化導入遺伝子はまた、構成性プロモーターから、植物組織全体を通して発現され得る。圃場において作物への農薬または他の活性成分の適用後に活性化され得るプロモーターを用いることにより、これらの導入遺伝子の発現を制御し得ることもまた有用である。本明細書中に記載される方法により含まれるこれらの遺伝子の発現のさらなる制御としては、植物染色体の特異的染色体部位への導入遺伝子の標的化挿入についての組換え酵素技術の使用、またはこの導入遺伝子の発現の調節が挙げられる。
【００２２】
本明細書中に記載される方法としては、以下を含むゲノムを有する植物種子が挙げられる：（ａ）第１のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作動可能に連結されたプロモーター（この第１のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペプチドをコードする）、そして必要に応じて（ｂ）第２のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作動可能に連結されたプロモーター（この第２のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペプチドをコードする）。２つの導入遺伝子の発現は、細胞質、またはペルオキシソームもしくはグリオキシソーム以外のプラスチドにおいて少なくともβ−ケトチオラーゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、およびヒドラターゼ活性を有する機能的脂肪酸β酸化系を植物に提供する。第１のＤＮＡ配列および／または第２のＤＮＡ配列は、細菌、酵母、真菌、藻類、植物、または動物から単離され得る。少なくとも１つのＤＮＡ配列が、少なくとも２つ、そして好ましくは３つの酵素活性を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。
【００２３】
（形質転換ベクター）
本明細書中に記載される方法において有用なＤＮＡ構築物としては、植物へ導入遺伝子を導入し得る形質転換ベクターが挙げられる。いくつかの植物形質転換ベクターの選択肢が利用可能であり、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）に記載されるベクターが含まれる。植物形質転換ベクターは、一般に、５’調節配列および３’調節配列（プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む）の転写制御下の目的の１以上のコード配列、ならびに選択マーカー遺伝子もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。５’調節配列についての通常の必要条件は、プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む。単一の転写物からの２以上のポリペプチドの発現のために、さらなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボザイム配列が構築物中に操作され得る（米国特許第５，５１９，１６４号）。このアプローチは、複数の導入遺伝子を単一の遺伝子座に局在化するという利点を有する。これは、続いての植物育種の試みにおいて有利である。さらなるアプローチは、相同組換えによって植物プラスチド染色体を特異的に形質転換するためのベクターを使用すること（米国特許第５，５４５，８１８号）であり、この場合、プラスチドゲノムの原核生物の性質を利用し、そして多数の導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能である。
【００２４】
（プロモーター）
多数の植物プロモーターが公知であり、そして目的の遺伝子の構成的発現、または環境によってもしくは発生によって調節される発現のいずれかをもたらす。植物プロモーターを選択して、異なる植物組織または細胞小器官における導入遺伝子の発現を制御し得る。これらのための方法は全て、当業者に公知である（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３−９９（１９８９））。導入遺伝子の５’末端は、導入遺伝子とインフレームで連結された、プラスチドまたは他の細胞内小器官標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作され得る。適切な構成性植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモーター（Ｏｄｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５））、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−７１（１９９０））、ＡｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−３９（１９９０）；Ｋｙｏｚｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８（１９９１））、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウ硝酸誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）プロモーターの小サブユニット、および化学誘導性プロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙらに対する米国特許第５，３６４，７８０号）が挙げられる。
【００２５】
本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、導入遺伝子は、発生中の種子においてのみ発現される。この目的のために適切なプロモーターとしては、ナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１８９７−１９０１（１９８３））、オレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）プロモーター（Ｐｌａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５（１９９４）；Ｒｏｗｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１−４（１９９７）；米国特許第５，６５０，５５４号；およびＰＣＴ ＷＯ ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、およびデンプン分枝酵素プロモーターが挙げられる。
【００２６】
これらのベクターを用いる適切な作物栽培植物宿主の形質転換は、種々の方法および植物組織を用いて達成され得る。本明細書中に開示される方法において有用な代表的な植物としては、ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ、ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａおよびｊｕｎｃｅａを含むＢｒａｓｓｉｃａ科；トウモロコシ；ダイズ；ワタの実；ヒマワリ；ヤシ；ココヤシ；ベニバナ；ラッカセイ；Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａを含むカラシ；およびアマが挙げられる。生物体量（例えば、サイレージトウモロコシ、アルファルファ、またはタバコ）として収穫される作物もまた、本明細書中に開示される方法について有用である。これらのベクターを用いる形質転換のための代表的な組織としては、プロトプラスト、細胞、カルス組織、リーフディスク、花粉、および分裂組織が挙げられる。代表的な形質転換手順としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、バイオリスチック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、リポソーム媒介形質転換、およびケイ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））が挙げられる。
【００２７】
（ＩＩ．トランスジェニック植物を作製し、そしてスクリーニングするための方法）
本明細書中に記載される構築物を用いてトランスジェニック植物を作製するために、以下の手順を用いて、形質転換後に導入遺伝子を発現する、形質転換された植物を入手し得る：選択培地上で形質転換された植物細胞を選択する；形質転換された植物細胞を再生して、分化した植物を生成する；所望のポリペプチドが所望の組織および細胞の位置において得られるようなレベルで導入遺伝子を発現する、形質転換された植物を選択する。
【００２８】
記載された方法を実施するために有用な特定の作物について、形質転換手順が、例えば、以下に記載されるように、確立されている：「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）。
【００２９】
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、例えば、米国特許第５，１８８，９５８号および同第５，４６３，１７４号に記載される通りに形質転換され得る。他のＢｒａｓｓｉｃａ（例えば、ｒａｐｐａ、ｃａｒｉｎａｔａ、およびｊｕｎｃｅａ）ならびにＳｉｎａｐｉｓ ａｌｂａは、Ｍｏｌｏｎｅｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−４２（１９８９）に記載される通りに形質転換され得る。ダイズは、多数の報告された手順（米国特許第５，０１５，５８０号；同第５，０１５，９４４号；同第５，０２４，９４４号；同第５，３２２，７８３号；同第５，４１６，０１１号；および同第５，１６９，７７０号）によって形質転換され得る。いくつかの形質転換手順（花粉の形質転換（米国特許第５，６２９，１８３号）、ケイ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）、プロトプラストのエレクトロポレーション（米国特許第５，２３１，０１９号；同第５，４７２，８６９号；および同第５，３８４，２５３号）、遺伝子銃（米国特許第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号）、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（ＥＰ ０ ６０４ ６６２ Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ ９４／００９７７）を含む）が、トランスジェニックトウモロコシ植物の生成について報告されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介手順は、特に好ましい。なぜなら、導入遺伝子構築物の単一の組み込み事象が、この手順を用いて、より容易に得られ、そしてこのことは、その後の植物育種を大いに容易にするからである。ワタは、粒子ボンバードメント（米国特許第５，００４，８６３号および同第５，１５９，１３５号）によって形質転換され得る。ヒマワリは、粒子ボンバードメントとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染との組合せを用いて形質転換され得る（ＥＰ ０ ４８６ ２３３ Ａ２；米国特許第５，０３０，５７２号）。アマは、粒子ボンバードメントまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のいずれかによって形質転換され得る。組換え酵素技術としては、ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、およびＧｉｎ系が挙げられる。これらの技術を利用する方法は、例えば、Ｈｏｄｇｅｓらに対する米国特許第５，５２７，６９５号；ＤａｌｅおよびＯｗ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５５８−６２（１９９１）；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４８５−９０（１９９５）に記載される。
【００３０】
（選択マーカー遺伝子）
本明細書中に記載される方法を実施する際に有用な選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号および同第５，５３０，１９６号）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が挙げられる。ＥＰ ０ ５３０ １２９ Ａ１は、増殖培地に添加された不活性な化合物を活性化する酵素をコードする導入遺伝子を発現することにより、形質転換された植物が、非形質転換系統から成長して抜け出すのを可能にするポジティブ選択系を記載する。本明細書中の方法において有用なスクリーニング可能マーカー遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−０７（１９８７）；米国特許第５，２６８，４６３号）およびネイティブなグリーン蛍光タンパク質遺伝子または改変されたグリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０：４４８−５５（１９９５）；Ｐａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００（１９９６））が挙げられる。これらのマーカーのうちのいくつかは、形質（例えば、除草剤耐性）を目的の植物に導入し、それによって、投入側にさらなる作物栽培的価値を提供するという付加的な利点を有する。
【００３１】
本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、１より多くの遺伝子産物が植物中で発現される。この発現は、以下を含む、多数の異なる方法を介して達成され得る：（１）単一の形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法であって、ここで全ての必要なＤＮＡが単一のベクター上に存在する、方法；（２）同時形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法であって、ここで全ての必要なＤＮＡが別個のベクター上に存在するが、同時に植物細胞に導入される、方法；（３）独立した形質転換事象によって連続的に植物細胞にコードＤＮＡを導入する方法（すなわち、さらなるＤＮＡ構築物を用いての１以上のコードＤＮＡを発現するトランスジェニック植物細胞の形質転換）；ならびに（４）別個の形質転換事象による、必要とされるＤＮＡ構築物の各々の形質転換によって、個々のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を得、そして伝統的な植物育種法を用いて全ての経路を単一の植物に組み込む方法。
【００３２】
（ＩＩＩ．β酸化酵素経路）
植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの産生は、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルをＰＨＡシンターゼについての基質として産生し得る酵素の細胞質ゾル局在化を必要とする。真核生物および原核生物の両方が、脂肪アシルＣｏＡチオエステルをアセチルＣｏＡへと変換する一連の酵素からなる脂肪酸分解についてのβ酸化経路を有する。これらの経路は、中間体３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して進行するが、この中間体の立体配置は生物間で異なる。例えば、細菌のβ酸化経路および高等真核生物のペルオキシソーム経路は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡへと分解する（Ｓｃｈｕｌｔｚ，「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら編）１０１〜０６頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９１））。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、β酸化多機能酵素複合体によってコードされるエピメラーゼ活性は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換し得る。酵母は、中間体Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して進行するペルオキシソームに局在した脂肪酸分解経路を保有し（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６６４６−５３（１９９２）；Ｆｉｌｐｐｕｌａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４５３−５７（１９９５））、その結果、ＰＨＡを生成するためにエピメラーゼ活性は必要とされない。
【００３３】
植物は、他の高等真核生物と同様に、ペルオキシソーム中に細胞下に局在した脂肪酸分解のためのβ酸化経路を有する（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，「Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ［α ａｎｄ β Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ］」、Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（Ｍｏｏｒｅ，Ｊｒ．編）５２７−６５頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ １９９３））。それゆえ、植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの生成は、正確な鎖長のＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの脂肪酸の変換のために、β酸化経路の細胞質ゾルでの発現、ならびにＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをポリマーへと重合させるために適切なＰＨＡシンターゼの細胞質ゾル発現を必要とする。
【００３４】
脂肪酸は、植物のプラスチドにおいて飽和アシル−ＡＣＰチオエステルとして合成される（Ｈａｒｔｗｏｏｄ，「Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら編）２３７−７２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９７））。プラスチドから細胞質ゾルへの輸送の前に、大多数の脂肪酸は、Δ９デサチュラーゼを介して脱飽和される。大部分の脂肪種子作物における新たに合成された脂肪酸のプールは、主に、オレイン酸（シス９−オクタデセン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、およびパルミチン酸（ヘキサデカン酸）からなる。しかし、いくつかの植物（例えば、ココヤシおよびパーム核）は、より短い鎖の脂肪酸（Ｃ８〜１４）を合成する。この脂肪酸は、ＡＣＰからチオエステラーゼを介して放出され、続いてプラスチド膜に局在するアシルＣｏＡシンテターゼを介してアシルＣｏＡチオエステルへと変換される（Ａｎｄｒｅｗｓら，「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄｅｎｎｉｓら編）３４５−４６頁（Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ １９９０）；Ｈａｒｗｏｏｄ，「Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら編）２４６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９７））。
【００３５】
脂肪酸分解経路を介する、新たに合成されたアシルＣｏＡチオエステルのプールの細胞質ゾル変換、およびＰＨＡシンターゼについてのＲ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質へのこれらの一連の反応由来の中間体の変換は、図１に概説した酵素反応を介して達成され得る。ＰＨＡシンターゼ基質はＣ４〜Ｃ１６ Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡである。飽和脂肪アシルＣｏＡについては、脂肪酸分解経路を用いてのＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの変換は、以下の一連の反応を必要とする：トランス−２−エノイル−ＣｏＡへのアシルＣｏＡチオエステルの変換（反応１）、Ｒ−３−ヒドロキシ（ｈｙｄｄｒｏｘｙ）アシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの水和（反応２ａ、例えば、酵母系は、この経路を通して作動し、そしてＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ Ｄ特異的ヒドラターゼはＣ４〜Ｃ７ Ｒ−３ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生じる）、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの水和（反応２ｂ）、およびＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡのエピマー化（反応５、例えば、キュウリ四機能タンパク質、細菌系）。３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、ＰＨＡを形成するＰＨＡシンターゼによって重合されない場合、これは、残りのβ酸化経路を通して以下の通りに進行し得る：β−ケトアシルＣｏＡを形成する、３−ヒドロキシアシルＣｏＡの酸化（反応３）、続いてアセチルＣｏＡおよび２炭素単位分短い飽和アシルＣｏＡチオエステルを生じるＣｏＡ存在下でのチオ開裂（反応４）。反応４において生成されるアシルＣｏＡチオエステルは、反応１のβ酸化経路に自由に再度侵入し、そして生成されたアセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼ（反応７）およびＮＡＤＨアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼまたはＮＡＤＰＨアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（反応６）の作用によってＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換され得る。この後者の経路は、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、Ｒ−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ、およびＲ−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを生成するために有用である。この一連の酵素反応によって生成される４〜１６炭素原子のＲ−３−ヒドロキシ酸は、導入遺伝子（または２つのサブユニットシンターゼ酵素の場合は複数の導入遺伝子）から発現されるＰＨＡシンターゼによってＰＨＡポリマーへと重合され得る。
【００３６】
Δ９不飽和脂肪アシルＣｏＡについては、記載される種々の一連の反応が必要とされる。図１に詳述されるように、３サイクルのβ酸化は、６個の炭素単位を除去して、３位にシス二重結合を有する不飽和アシルＣｏＡチオエステルを生じる。Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼによって触媒される、２位でのトランス二重結合への３位でのシス二重結合の変換は、図１に概説した一連のβ酸化反応が進行するのを可能にする。この酵素活性は、微生物のβ酸化複合体および植物の四機能タンパク質に存在するが、酵母ｆｏｘ１には存在しない。
【００３７】
アシルＣｏＡチオエステルはまた、分解されてβ−ケトアシルＣｏＡになり、そしてＮＡＤＨ依存性レダクターゼまたはＮＡＣＰＨ依存性レダクターゼを介してＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換され得る（反応６）。
【００３８】
Ｓ特異的ヒドラターゼ活性、Ｓ特異的デヒドロゲナーゼ活性、β−ケトチオラーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性をコードする多機能性酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１９８４））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｉｍｍｕｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４−８９（１９９０））のような細菌において見出されている。多機能性酵素複合体は、触媒的に活性なタンパク質がヘテロテトラマーを形成するような、２コピーの各々２つのサブユニットからなる。ヒドラターゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性は、一方のサブユニット上に存在し、一方、チオラーゼは別のサブユニットに存在する。生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１９８４））；ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６４５９−６８（１９９０））およびＰ．ｆｒａｇｉ（Ｓａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：８−１５（１９９２））由来の酵素をコードする遺伝子は、単離および配列決定されており、そして本明細書中に記載される方法を実施するために適切である。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素系は、個々の酵素活性に重要なアミノ酸残基を同定するために部位特異的変異誘発分析に供されている（ＨｅおよびＹａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６２５−３０（１９９６）；Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６６４１−４７（１９９５）；ＨｅおよびＹａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１１０４４−４９（１９９７）；Ｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２６１−６８（１９９７）；ＹａｎｇおよびＥｌｚｉｎｇａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６５８８−９２（１９９３））。これらの変異遺伝子はまた、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施態様において用いられ得る。
【００３９】
ラットのような哺乳動物は、それらのペルオキシソーム中に、ヒドラターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を含む、３機能性のβ−酸化酵素を有する。３機能性の酵素は、ラットの肝臓から単離され、そして７８ｋＤａの分子量を有する単量体であることが見出された（Ｐａｌｏｓａａｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２４４６〜４９（１９９０））。細菌系と異なり、チオラーゼ活性は、多酵素タンパク質の一部ではない（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１））。ラットにおけるエピマー化は、２つの異なるヒドラターゼの活性の組み合わせによって生じ、その１つは、Ｒ−３ヒドロキシアシルＣｏＡをトランス−２−エノイルＣｏＡに転換し、そして別の１つは、トランス−２−エノイルＣｏＡをＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換する（Ｓｍｅｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６０：９８８〜９２（１９８９））。哺乳動物はまた、中間体Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡに分解する、β−酸化経路をそれらのミトコンドリアに有する（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９６頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１）））。ミトコンドリアβ−酸化活性をコードする遺伝子は、いくつかの動物から単離されており、これらには、ラットミトコンドリア長鎖アシルＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１６４７８）およびラットミトコンドリアチオラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１３９２１およびＤ００５１１）が含まれる。
【００４０】
酵母は、多機能酵素であるＦｏｘ２を有し、これは、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡの代わりにＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ中間体を介して進行するという点で、細菌および高等真核生物のβ−酸化複合体とは異なる（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６６４６〜５３（１９９２））。Ｆｏｘ２は、Ｒ−特異的ヒドラターゼ酵素活性およびＲ−特異的デヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。この酵素は、Δ９−シス−ヒドロキシアシルＣｏＡを分解してＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを形成するのに必要な、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を有さない。ｆｏｘ２をコードする酵母由来のこの遺伝子は単離され、そして配列決定されており、そして９００アミノ酸タンパク質をコードする。この構造遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示される。
【００４１】
植物は、酵母Ｆｏｘ２に類似するがまた、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性もコードする、４機能タンパク質を有する（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０４７５〜８１（１９９４））。このｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３および配列番号４に示される。
【００４２】
（ＩＶ．脂肪種子作物の細胞質への酵素の標的化）
植物の細胞質中のＰＨＡ産生を操作することは、植物の細胞質へのβ−酸化の発現を指示する工程を必要とする。ｆａｏＡＢのような細菌系においては標的化シグナルは存在しない。真菌、酵母、植物、および哺乳動物においては、β−酸化は、細胞下オルガネラにおいて起こる。代表的には、その遺伝子は、核の染色体において発現され、そして細胞質において合成されるポリペプチドは、特定のアミノ酸配列の存在によってこれらのオルガネラに指向される。真核生物供給源から単離された遺伝子（例えば、酵母、真菌、植物、および哺乳動物のような真核生物供給源由来の脂肪酸酸化酵素）を使用して、本明細書に記載される方法を実行するために、細胞下標的化シグナルの除去または改変が、この酵素を細胞質ゾルに指向させるために必要である。タンパク質を小胞体に指向させるためのシグナルを付加することが有用であり得る。このプロセスにおいて有用なペプチドは、当該分野で周知である。一般的なアプローチは、小胞体に標的化するペプチド配列に特定化したＤＮＡ配列を挿入してキメラ遺伝子を形成することによって、導入遺伝子を改変することである。
【００４３】
真核生物アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび他のミトコンドリアタンパク質は、通常２０〜６０アミノ酸長であるタンパク質のＮ−末端のリーダーペプチドを介してミトコンドリアに標的化される（Ｈｏｒｗｉｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：６２５〜３３（１９９０））。ミトコンドリア移入リーダーペプチドについての明白なコンセンサス配列の欠如にもかかわらず、リーダー配列において鍵となる残基の変異誘発は、ミトコンドリアタンパク質の移入を妨害することが実証された。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの移入は、そのリーダー配列の変異誘発によって妨害され、これは、細胞質における改変された前駆体タンパク質の蓄積を生じた（Ｂｅｄｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１０１４〜２５（１９８９））。
【００４４】
３つの真核生物ペルオキシソーム標的化シグナルが報告されている（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９）；Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１３：１２１３〜２１（１９９７））。トリペプチド標的化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌは、多くのペルオキシソームタンパク質のＣ−末端に生じる（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９））。この配列の変異誘発は、ペルオキシソームへのタンパク質の移入を妨害することが示されてきた。いくつかのペルオキシソームタンパク質は、そのタンパク質のＣ−末端にこのトリペプチドを含まない。これらのタンパク質では、タンパク質配列中の内部の位置のトリペプチドを介してか（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９））、または未知の、無関係の配列を介して（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１９９７））、標的化が生じることが示唆されている。Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のアシルＣｏＡオキシダーゼのフラグメントを用いる、インビトロでのペルオキシダーゼ標的化実験の結果は、後者の理論を支持するようであり、そしてポリペプチドの内部アミノ酸配列中に２つの別個の標的化シグナルが存在することを示唆する（Ｓｍａｌｌら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：１１６７〜７３（１９８８））。前述の研究において、標的化シグナルは、長さにおいて１１８アミノ酸の２つの領域に局在し、そしていずれの領域も標的化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌを含むことが見出されなかった。少数のペルオキシソームのタンパク質は、ペルオキシソームに移入するためのアミノ末端リーダー配列を含むようである（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１９９７））。これらの標的化シグナルは、部位特異的変異誘発によって欠失させ得るか、または変更され得る。
【００４５】
（Ｖ．トランスジェニック植物の培養および収穫）
トランスジェニック植物は、標準的な培養技術を使用して生育され得る。植物または植物部分はまた、標準的な装置および方法を使用して回収され得る。ＰＨＡは、植物または植物部分から、公知の技術（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９７／１５６８１に記載されるような、伝統的な播種プロセス技術と組み合わせた溶媒抽出）を使用して回収され得るか、または、例えば、動物の食物として、直接的に使用され得る。ここでは、植物生物体量からのＰＨＡを抽出することは不要である。
【００４６】
種子を産生しなかったいくつかの系統は、はるかにより高いレベルの生物体量を産生した。従って、この表現型は、牧草、飼料、または他の生物体量作物について、１エーカーあたりに産生される緑の生物体量の量を増加させる手段として有用であり得る。末端の使用は、動物の餌のための、または電気的な動力を生成するためのエネルギー作物としての、飼料作物の最もコスト的に効果的な産生、を含む。他の使用は、工業製品の引き続く回収（例えば、抽出によるＰＨＡ）のために、作物（例えば、アルファルファまたはタバコ）の生物体量レベルを増加させる工程を含む。
【００４７】
本明細書中に記載される組成物およびその調製方法およびその使用方法は、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。
【実施例】
【００４８】
（実施例１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢ遺伝子およびＦａｏ酵素の単離および特徴付け）
ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換、およびプラスミド精製を含む。すべてのＤＮＡ操作を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載されるような標準的な方法を用いて行った。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｆａｏＡＢをコードする遺伝子を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ由来のｆａｏＢ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：８−１５（１９９２））に相同性を有するプライマー１および２を使用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡから生成されたプローブを用いて単離した。
プライマー１：５’−ｇａｔ ｇｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ｃａａ ｇｇｇ ｔｇｇ−３’（配列番号５）
プライマー２：５’−ｃａａ ｃｃｃ ｇａａ ｇｇｔ ｇｃｃ ｇｃｃ ａｔｔ−３’（配列番号６）。
【００４９】
１．１ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応から精製し、そしてλＺＡＰ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｐＢＫＣＭＶプラスミドに構築されたＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ポジティブクローンから選択し、そしてｆａｏＡＢ遺伝子を含むインサートのＤＮＡ配列および隣接配列を決定した。この配列を配列番号７に示す。以下のように、ｆａｏＡＢを含むフラグメントを、ネイティブなＰ．ｐｕｔｉｄａリボソーム結合部位を用いてインタクトに、発現ベクターｐＴＲＣＮにサブクローニングして、プラスミドｐＭＦＸ３を形成した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ＢｓｒＧ１を用いて消化した。得られる突出末端をクレノウで平滑化した。ＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化は、ＦａｏＡＢをコードする、３．３９ｋｂの平滑末端／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを産生した。発現ベクターｐＴＲＣＮを、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そしてｆａｏＡＢフラグメントを用いて連結し、７．５７ｋｂのプラスミドｐＭＦＸ３を形成した。
【００５０】
ＦａｏＡＢ多酵素複合体の酵素を、以下のようにアッセイした。ヒドラターゼ活性を、アッセイがＣｏＡの存在下で行われた以外は、以前に記載されたように（Ｆｉｌｐｐｕｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４５３〜５７（１９９５））、カップリング酵素Ｌ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを使用して、ＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングすることによってアッセイした。カップリング酵素の激しい生成物阻害が、ＣｏＡの非存在下で観察された。このアッセイは、（最終容量１ｍＬに）６０μＭ クロトニル（ｃｒｏｔｏｎｙｌ）ＣｏＡ、５０μＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮＡＤ、７μｇ／ｍｌ ブタ心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシルＣｏＡ デヒドロゲナーゼ、および０．２５ｍＭ ＣｏＡを含んだ。このアッセイは、アッセイ混合液中へのＦａｏＡＢの添加で開始された。コントロールアッセイを、生成されるヒドラターゼ産物、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡの非存在下でＮＡＤの消費速度を決定するために、基質なしで行った。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５１】
ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてアセトアセチルＣｏＡを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨからＮＡＤへの転換をモニタリングすることにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））、逆方向でアッセイした。このアッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ＰＨ７、０．２ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、および３３μＭ アセトアセチルＣｏＡを含んだ。このアッセイを、アッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加で開始した。必要な場合、酵素サンプルを、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に希釈した。コントロールアッセイを、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素による粗サンプル中のＮＡＤＨの消費速度を検出するために、基質アセトアセチルＣｏＡなしで実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤＨの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５２】
ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてクロトニルＣｏＡを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングすることにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））、正方向でアッセイした。このアッセイ混合液は、（最終容量１ｍＬ中に）０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ＰＨ８、０．３ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ＣｏＡ、３０μＭ クロトニルＣｏＡ、およびＦａｏＡＢのアリコートを含んだ。反応を、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡのインサイチュでの形成を可能にするために数分間プレインキュベーションした。次いで、このアッセイを、ＮＡＤ（０．４５ｍＭ）の添加によって開始した。コントロールアッセイを、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素によるＮＡＤの消費速度を検出するために、基質なしで実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５３】
チオラーゼ活性を、いくつかの改変を伴って、以前に記載されたように（Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１〜７（１９９１））、基質アセトアセチルＣｏＡの消費による３０４ｎｍにおける吸収の減少をモニタリングすることによって決定した。アッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）６２．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．１、４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、６２．５μＭ ＣｏＡ、および６２．５μＭアセトアセチルＣｏＡを含んだ。このアッセイは、アッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加によって開始した。酵素を有さないコントロールサンプルを、酵素の非存在下でｐＨ８．１の基質分解速度を検出するために、各々のアッセイについて実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりの基質アセトアセチルＣｏＡの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝１６９００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５４】
エピメラーゼ活性を、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルを、Ｄ，Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ混合物の代わりに使用する以外は、以前に記載されたように（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））アッセイした。このアッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）３０μＭ Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ、１５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、０．３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、０．１ｍＭ ＣｏＡ、および７μｇ／ｍＬ ブタ心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを含んだ。このアッセイは、ＦａｏＡＢの添加によって開始した。
【００５５】
ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａｏＡＢの発現のために、培養物を２×ＴＹ培地中で３０℃で増殖させた。２×ＴＹ培地は、（１リットルあたり）１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母、および５ｇＮａＣｌを含む。スターター培養を、一晩増殖させ、そして新鮮な培地（小規模増殖では２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中に１００ｍＬ；大規模増殖には、２．８Ｌフラスコ中に１．５Ｌ）に接種（１％接種材料）するために使用した。６００ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６の範囲に達した場合、細胞を０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。収穫に先立ち、細胞をさらに４時間培養した。細胞を超音波処理によって溶菌し、そして遠心分離によって不溶性物質を可溶性タンパク質から取り除いた。アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を、ＦａｏＡサブユニット（配列番号３１）の活性を保証するために逆方向でモニタリングし、そしてチオラーゼ活性をＦａｏサブユニットの活性を決定するためにアッセイした。ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａｏＡＢは、それぞれ、４．３Ｕ／ｍｇおよび０．９９Ｕ／ｍｇの値のデヒドロゲナーゼ活性およびチオラーゼ活性を含んだ。これは、コントロール株ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮにおいてデヒドロゲナーゼおよびチオラーゼについて観察された、それぞれ０．００７４Ｕ／ｍｇおよび０．００３３Ｕ／ｍｇよりも顕著に高かった。
【００５６】
ＦａｏＡＢを、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ由来のＦａｏＡＢの精製について以前に記載された改変された手順（Ｉｍａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４〜８９（１９９０））を用いて、ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３から精製した。チオラーゼ活性（正方向においてアッセイされた）およびデヒドロゲナーゼ活性（逆方向においてアッセイされた）を、精製の全体を通じてモニタリングした。３リットルのＤＨ５α／ｐＭＦＸ３細胞（２．８Ｌのエーレンマイヤーフラスコ中２×１．５Ｌアリコート）を、酵素活性分析のために調製された細胞について以前に記載された細胞増殖手順を用いて、２×ＴＹ培地中で増殖させた。細胞（１５．８ｇ）を、３２ｍＬの１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に再懸濁し、そして超音波処理によって溶菌した。可溶性タンパク質を、遠心分離（１８，０００ＲＰＭ、３０分間、４℃）によって不溶性の細胞の破片から除去した。可溶性の抽出物を、５０％アセトン中で作製し、そして沈澱したタンパク質を、遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に再溶解した。このサンプルを、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて３３％飽和に調整し、そして可溶性および不溶性のタンパク質を、遠心分離によって分離した。得られた上清を、（ＮＨ４）２ＳＯ４で５６％飽和に調整し、そして不溶性ペレットを遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に溶解した。このサンプルを、５０℃で３０分間加熱し、そして可溶性タンパク質を遠心分離によって単離し、そして６０００〜８０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７において透析した（２×３Ｌ；２０時間）。このサンプルを、あらかじめ１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏ Ｊｏｚｏ ＤＥＡＥ ＦＰＬＣカラム（３ｃｍ×１４ｃｍ）上にロードした。このタンパク質を、直線勾配（１００ｍＬずつ；１０ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、流速３ｍＬ／分で溶出した。ＦａｏＡＢは、３００と３２５ｍＭ ＮａＣｌとの間に溶出した。このサンプルを、事前に１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７で平衡化したマクロ−プレップ ハイドロキシアパタイト１８／３０（Ｂｉｏｒａｄ）ＦＰＬＣカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）にロードする前に、５０，０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７において透析した（１×２Ｌ；１５時間）。タンパク質を、３ｍＬ／分の流速で、直線勾配（２５０ｍＬずつ；１０〜５００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７）を用いて溶出した。ＦａｏＡＢは、７０と１３０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４との間に溶出した。活性を含む画分を、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭ１００，０００分子量カットオフ濃縮器を用いて９ｍＬまで濃縮した。緩衝液を、２０％ショ糖を含む１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７を用いて３回交換し、そして−７０℃で凍結した。ハイドロキシアパタイト精製画分の酵素活性を、基質の範囲を用いてアッセイした。結果を、以下の表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（実施例２：ＦａｏＡＢおよびＦａｏＡＢポリペプチドに対する抗体の産生）
実施例１に記載されるようなＦａｏＡＢタンパク質の精製後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＦａｏＡ（配列番号３１）およびＦａｏＢ（配列番号２６）に対応するタンパク質バンドを切り出し、そしてフロイント完全アジュバントを用いてニュージーランド白ウサギを免疫した。追加免疫を、フロイント不完全アジュバントを用いて３週間間隔で行った。抗体を、血清からプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティークロマトグラフィーによって回収し、ウェスタンブロッティング手順によって抗原に対して試験した。Ｂｒａｓｓｉｃａ種子のコントロール抽出物を使用して、植物タンパク質に対する交差反応について試験した。交差反応は検出されなかった。
【００５９】
（実施例３：トランスジェニック脂肪種子におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄｏ ｆａｏＡＢ遺伝子の発現のためのプラスミドの構築）
（ｐＳＢＳ２０２４の構築）
マメのファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーター（配列番号１０；Ｓｌｉｇｈｔｏｍら、１９８３）の５’−および３’−末端（下線を付した）それぞれに隣接する配列に相同な、 オリゴヌクレオチドプライマーＧＶＲ４７１
【００６０】
【化１】
およびＧＶＲ４７２
【００６１】
【化２】
を、それぞれ、ＧＶＲ４７１およびＧＶＲ４７２の５’−末端にＫｐｎＩ（斜字体、配列番号８のヌクレオチド１〜７）およびＳｗａＩ（斜字体、配列番号９のヌクレオチド１〜９）を付加するように設計した。これらの制限部位を、クローニングを容易にするために組み込んだ。これらのプライマーを使用して、１．４ｋｂファゼオリンプロモーターを増幅した。このプロモーターを、平滑末端連結によってｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。命名されたプラスミド、ｐＣＰＰＩ（図２を参照のこと）を、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し、そしてＳａｌＩ／ＳｗａＩファゼオリンターミネーター（配列番号２７）に連結した。ポリアデニル化シグナルを含むマメのファゼオリンターミネーター配列を、以下のＰＣＲプライマーを使用して増幅した：ＧＶＲ３９６：５’−ＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２２）
およびＧＶＲ３９７５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２３）
そして１．２ｋｂフラグメント（配列番号２７）をｐＣＣＰ１のＳａｌＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＳＢＳ２０２４を得た（図２）。クローニングのための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、得られるプラスミドを、ｐＳＢＳ２０２４と命名した（図２）。
【００６２】
（ｐＳＢＳ２０２４の構築）
ダイズオレオシンプロモーターフラグメント（配列番号１１；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７）を、ＤＮＡ配列に隣接するプライマーを用いて簡易化した。
【００６３】
プライマーＪＡ４０８
【００６４】
【化３】
は、５’末端（下線を付した）に相補的な配列を含む。
プライマーｎｐ１
【００６５】
【化４】
は、プロモーターフラグメントの３’末端（下線を付した）に相同な配列を含む。制限部位ＸｂａＩ（斜字体）およびＳｗａＩ（斜字体）を、クローニングを容易にするために、ＪＡ４０８およびｎｐＩの５’末端にそれぞれ組み込んだ。プライマーを、９７５ｂｐプロモーターフラグメントを増幅するために使用し、次いでｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした（図２を参照のこと）。得られるプラスミド、ｐＣＳＰＩを、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し、そしてダイズターミネーター（配列番号２８）に連結した。ダイズオレオシンターミネーターを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した：ＪＡ４１０：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２９）
およびＪＡ４１１：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号３０）
そして、２２５ｂｐフラグメントをｐＣＳＰＩのＳａｌＩ−ＳｗａＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＳＢＳ２０２５（図６）を得た。命名されたプラスミド、ｐＳＢＳ２０２５は、クローニングのための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する（図２）。
【００６６】
（プロモーターコード配列融合体の構築）
以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆｌ（ｆａｏＡ、配列番号２４）の５’隣接配列のヌクレオチド５５３〜５５７に相同なｎｐ２
【００６７】
【化５】
および３’末端に隣接するヌクレオチド２７００〜２６８３に相補的なｎｐ３
【００６８】
【化６】
クローニングを容易にするために、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリック体）部位を、プライマーｎｐ２およびｎｐ３の５’末端に導入した。さらに、植物の翻訳開始コドンを包囲するより有利な配列を得るために、３ｂｐのＡＡＡ配列（太字）を組み込んだ。プライマーｎｐ２およびｎｐ３を使用して、フラグメントを増幅し、そしてｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。生じたプラスミドをｐＣｍｆＩ（図３Ａおよび３Ｂ）と称した。プラスミドｐＢｍｆ２を、同様のプロセスで構築した（図５Ａおよび５Ｂ）。クローニングのために、ｍｆ２（ｆａｏＢ）遺伝子（配列番号２５）の５’および３’末端で、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリック体）を生じるために、合成プライマーの第二のセットを設計した。
【００６９】
プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆ２（ｆａｏＢ、配列番号２５）の５’（ヌクレオチド２７３２〜２７５２ｂｐ）に相補的なプライマーｎｐ４
【００７０】
【化７】
および３’（ヌクレオチド３９０７〜３８８６ｂｐ）配列に相同なプライマーｎｐ５
【００７１】
【化８】
をＰＣＲ反応に使用して、１．１７ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅した。生じたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶにクローニングした。このプラスミドを、ｐＢｍｆ２と称した。
【００７２】
両方のプラスミドを個々にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてそれらの挿入体を、同じ制限酵素で予め直線化したプラスミドｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２０２５にクローニングした。その結果、以下のプラスミドを生成した：ｐｍｆ１２４およびｐｍｆ１２５（図３Ａおよび３Ｂ）ならびにｐｍｆ２２４およびｐｍｆ２２５（図５Ａおよび５Ｂ）。これらは、ファゼオリンまたはダイズプロモーターのいずれかで融合されたＦａｏ遺伝子（ｍｆ１およびｍｆ２）を含む。ＤＮＡ配列分析により、ｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ２２５について正しいプロモーター−コード配列−終結配列融合体が確認された。
【００７３】
（実施例４：プロモーター−コード配列融合体の植物形質転換ベクターへのアセンブリ）
プラスミドｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ２２５を得た後に、プロモーター−コード配列融合体を、二成分ベクターｐＣＧＮ１５５９（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９０）（これは、ＮＰＴＩＩ遺伝子（抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える）の発現を駆動するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む）およびｐＳＢＳ２００４（これは、除草剤フォスフィノスリシンに対する耐性を与えるＰＰＴ遺伝子を駆動するパセリユビキチンプロモーターを含む）に別々にクローニングした。種々の選択マーカーを有するこの目的に適した二成分ベクターは、いくつかの供給源から入手され得る。
【００７４】
ファゼオリン−ｍｆ２１融合カセットを、ＸｂａＩで親プラスミドから放出し、そして同じ制限酵素で直線化したｐＣＧＮ１５５９と連結した。得られたプラスミドをｐＣＧｍｆ１２４と命名した（図３Ａおよび３Ｂ）。ダイズ−ｍｆ１融合体を含むプラスミドｐＣＧｍｆ１２５を、ｐｍｆ１２５およびｐＣＧＮ１５５９の両方を連結前にＢａｍＨＩで切断したことを除き、同様の方法で構築した（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００７５】
（ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４の構築）
プラスミドｐＳＢＳ２００４を、ダイズ−ｍｆ１融合体を含むＢａｍＨＩフラグメントと共に直線化した。このプラスミドをｐｍｆ１２５４と命名した（図４Ａおよび４Ｂ）。同様に、ＸｂａＩファゼオリン−ｍｆ１融合フラグメントを、同じ制限酵素で直線化したｐＳＢＳ２００４と連結した。得られたプラスミドをｐｍｆ１２４９と命名した（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００７６】
（ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５の構築）
ファゼオリン−ｍｆ２およびダイズ−ｍｆ２融合体を、ＢａｍＨＩまたはＸｂａＩのいずれかで切断することによってベクターから融合体を切り出すことにより構築し、そしていずれかの制限酵素で直線化しておいたｐＣＧＮ１５５９にクローニングした（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００７７】
（ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓの構築）
プロモーター−コード配列融合体を含む２つの発現カセットを、以下のように同じ二成分ベクター上でアセンブルした。：ファゼオリン−ｍｆ１融合体を含むプラスミドｐｍｆ１２４をＢａｍＨＩで切断し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＣＧｍｆＢ１２４を作製した。次いで、このプラスミドをＸｂａＩで直線化し、そしてダイズ−ｍｆ２融合体を含むｐｍｆ２２５のＸｂａＩフラグメントに連結した。最終プラスミドを、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓと命名した（図６Ａおよび６Ｂ）。プラスミドｐＣＧｍＦ２Ｐ１Ｓを、同様の様式でアセンブルした。ファゼオリン−ｍｆ２融合体をＢａｍＨＩで切断することによりｐｍｆ２２４から放出し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａｍＨＩ部位でクローニングした。得られたプラスミドｐＣＧｍｆＢ２２４をＸｂａＩで直線化し、そしてダイズ−ｍｆ１融合体を含むｐｍｆ１２５のＸｂａＩフラグメントに連結した（図６Ａおよび６Ｂ）。
【００７８】
（実施例５：Ｂｒａｓｓｉｃａの形質転換）
Ｂｒａｓｓｉｃａ種子を、１０％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。その種子を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）を含む発芽培地（ｐＨ５．８）中に、プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃で、かつ６０〜８０μＥｍ−２ｓ−１の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の光周期で、４〜５日間維持した。
【００７９】
各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉａｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６））内にエレクトロポレーションにより導入した。子葉の葉柄の形質転換前に、各々の構築物を有するＥＨＡ１０１株の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培地中、２８℃で４８時間増殖させた。１ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを１ｍｌの最小培地中に再懸濁した。
【００８０】
形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてただちに同時培養培地（３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガーを含み、そして２０μＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配置し、そして同じ生長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次いで子葉を、３％（ｗ／ｖ）スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン（ｔｉｍｅｎｔｉｎｉｎ）、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを補充したＭＳ培地を含む再生培地に移した。
【００８１】
２〜３週間後、得られた再生苗条を切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８））上で維持した。伸長した苗条を、「発根」培地（ＭＳ培地、３％スクロース、２ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む）に移した。根が出現した後、小植物をポッティングミックス（Ｒｅｄｉ Ｅａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏ．）に移した。植物を、噴霧チャンバー（７５％の相対湿度）中で同じ生長条件下で維持した。生長２〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−４２（１９８９））のために採取した。
【００８２】
ＦａｏＡおよびＦａｏＢトランスジェニック系統由来の種子を、抗ＦａｏＡ抗体および抗ＦａｏＢ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって、脂肪酸酸化ポリペプチドの発現について分析し得る。ＦａｏＢポリペプチド（配列番号２６）は、ＦａｏＡ遺伝子産物の非存在下で機能的でない；しかしＦａｏＡＢ遺伝子産物は酵素活性を有する。
【００８３】
ＦａｏＡおよびＦａｏＢ複合体を発現するトランスジェニック系統を、個々のポリペプチドを発現するＦａｏＡトランスジェニック系統およびＦａｏＢトランスジェニック系統を交雑して獲得し、そして種子を、記載されるようなウエスタンブロッティングおよび酵素アッセイにより分析する。
【００８４】
（実施例６：Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの形質転換およびトランスジェニック系統の分析）
（形質転換）
使用するプロトコルは、Ｍｏｌｏｎｅｙら（１９８９）に記載される手順から採用した。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。その種子を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含む発芽培地（ｐＨ５．８）中に、プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃で、かつ６０〜８０μＥｍ−２ｓ−１の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の光周期で、４〜５日間維持した。
【００８５】
各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐＣＧｍｆ２２５、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、１９８６）内にエレクトロポレーションにより導入した。子葉の葉柄の形質転換前に、各々の構築物を有する株ＥＨＡ１０１の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培地中、２８℃で４８時間増殖させた。１ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを１ｍｌの最小培地で再懸濁した。
【００８６】
形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてただちに同時培養培地（３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含み、そして２０μｌＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配置し、そして同じ生長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次いで子葉を、３％スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンで補充したＭＳ培地を含む再生培地に移した。
【００８７】
２〜３週間後、再生苗条を獲得し、切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン、０．７％フィトアガー、および２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８））上で維持した。次いで、伸長した苗条を、「発根」培地（３％スクロース、２ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地）に移した。根が出現した後、小植物をポッティングミックス（Ｒｅｄｉ Ｅａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏ．Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）に移した。植物を、噴霧チャンバー（７５％のＲＨ）中で同じ生長条件下で維持した。生長２〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、１９８９）のために採取した。結果を以下の表２に示す。データは形質転換されたことが確認された植物の数を示す。
【００８８】
【表２】
【００８９】
形質転換ＤＮＡの発生運命を１６の無作為に選択したトランスジェニック系統について調査した。サザンＤＮＡハイブリダイゼーション分析により、ＦａｏＡおよび／またはＦａｏＢが、試験したトランスジェニック系統のゲノムに組込まれたことが示された。
【００９０】
ＦａｏＡ遺伝子が強力なマメファゼオリンプロモーターから発現される、約８０％のｐｍｆ１２４のトランスジェニック植物は、雄性不稔であることが観察された。このプロモーターからのＦａｏＡ遺伝子の明らかな高レベルの発現は、ＦａｏＡ遺伝子産物の機能的発現を生じ、これは種子および／または花粉の発達を障害する。この結果は、非常に予想外のことであった。なぜなら、その植物細胞は、細胞質ゾル中のβ−酸化経路の第一段階を行うことが可能であることが予測されなかったからである。しかし、この結果は、ハイブリッド産生のための雄性不稔のために、または種子の産生を妨げるために、植物におけるβ−酸化遺伝子の発現のためのさらなる適用を提供する。正常なトランスジェニック系統との並行した比較において、ｐｍｆ１２４株は、おそらく種子発達の排除に起因して、さらに高いレベルの生物体量を生成することもまた留意された。従って、この表現型は、サイレージ、飼料、または他の生物体量作物についての１エーカーあたりに産生される緑色の生物体量の量を増加するための手段として有用であり得る。ここで、誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術の使用が定植のための種子を生成するために使用され得る。これら不稔植物の７つが、ｐｍｆ２２５トランスジェニック系統由来の花粉で首尾良く他家受粉され、そして種子を生じた。
【００９１】
ファゼオリンプロモーター−ＦａｏＢ構築物を含むｐｍｆ２２４株からの種子由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、コントロールを除く試験した全てのサンプルにおいて、予期された１．２ｋｂの転写物を示すシグナルが示された。弱いダイズオレオシン（ｏｌｅｏｌｓｉｎ）プロモーター−ＦａｏＡ構築物を含むｐｍｆ１２５株からの種子由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、２．１ｋｂの予期された大きさの転写物が明らかにされた。ＦａｏＡ遺伝子が比較的弱いダイズオレオシンプロモーターから発現される、ｐｍｆ１２５植物の約８０％の種子由来の３００〜５００μｇのタンパク質についてのウエスタンブロッティングは、結論付けには到らなかったが、弱いシグナルが１つのトランスジェニック系統において検出された。
【００９２】
（脂肪酸分析）
種子において強力なマメファゼオリンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現することの強力な代謝効果を示した予想外の結果が与えられたため、弱いダイズオレオシンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現するトランスジェニック系統からの種子の脂肪酸プロフィールを分析した。マメファゼオリンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子のみを発現する種子またはＦａｏＢ遺伝子も発現する種子を試験した。分析は、Ｍｉｌｌａｒら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：１８８９−９０２（１９９８）に記載されるように行った。種子の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）を、Ｂ．ｎａｐｕｓの１０個の種子を１５×４５−ｍｍねじ口ガラス管に配置し、そして０．７５ｍＬの１Ｎメタノール性（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ）ＨＣｌ試薬（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＰＡ）および１０μＬの１ｍｇ／ｍＬの１７：０メチルエステル（内部標準）中、８０℃で一晩加熱することによって調製した。そのサンプルを冷却後、ＦＡＭＥＳを、０．３ｍＬのヘキサンおよび０．５ｍＬの０．９％ＮａＣｌで激しくボルテックスすることにより抽出した。そのサンプルを、相を分離するために静置させ、そして３００μＬの有機相を抽出し、そしてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄガスクロマトグラフィー上で分析した。
【００９３】
脂肪酸プロフィール分析により、その脂質プロフィールにおけるさらなる成分または増強された成分の存在が、ＦａｏＡ遺伝子（配列番号２４）を発現する全てのトランスジェニック植物において示され、これらはコントロール植物には存在しなかった。この結果はまた、ＦａｏＡ遺伝子が転写されて、そして翻訳されたこと、およびＦａｏＡポリペプチド（配列番号２７）が、触媒活性を有することを結論的に証明する。このピークはまた、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ遺伝子、ＰｈａＰ−ＦａｏＡ−ＳｏｙＰ−ＦａｏＢ遺伝子、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ−ＰｈａＰ−ＦａｏＢ遺伝子を有するさらなる１１のトランスジェニック植物およびＳｏｙＰ−ＦａｏＢで他家受粉された不稔（ＰｈａＰ−ＦａｏＡ）植物において観察された。これらのデータは、ＦａｏＡ遺伝子の機能的発現、およびたとえ非常に低レベルの発現でもその種子の脂質プロフィールを変化するのに十分であることを明らかに実証する。本明細書中で記載される方法を適応することにより、当業者は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｏｌｅｏｓｉｎプロモーター、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター、またはクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）プロモーターのような他のプロモーターを使用して、ファゼオリンプロモーターとダイズオレオシンプロモーターとの間で得られるレベルの中間のレベルでこれらの遺伝子を発現し得、そして誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術を使用して、脂肪酸酸化の導入遺伝子が発現される時期を制御し得る。
【００９４】
（実施例７：酵母のβ−酸化の多機能酵素複合体）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、細菌および高等真核生物において観察されるＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡよりもむしろＲ−ヒドロキシアシルＣｏＡを経て進行するβ−酸化経路を含む。酵母由来のｆｏｘ２遺伝子は、ヒドラターゼ（これはトランス−２−エノイル−ＣｏＡからＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを生成する）およびデヒドロゲナーゼ（これは、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを利用してβ−ケトアシルＣｏＡを生成する）をコードする。
【００９５】
ｆｏｘ２遺伝子（配列番号１に示される配列）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡからＰＣＲにより２つの小片で単離した。プライマーＮ−ｆｏｘ２ｂおよびＮ−ｂａｍｆｏｘ２ｂを利用して、Ｆｏｘ２のＮ末端領域をコードする１．１ｋｂのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲし、そしてプライマーＣ−ｆｏｘ２およびＣ−ｂａｍｆｏｘ２を利用して、Ｃ末端Ｆｏｘ２領域をコードする１．６ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをＰＣＲした。全長ｆｏｘ２遺伝子を、ベクターｐＴＲＣＮへのサブクローニングを経て再構築した。
【００９６】
【化９】
【００９７】
しかし、ｆｏｘ１遺伝子は、β−ケトチオラーゼ活性を保持せず、そしてこの活性は第二の導入遺伝子により供給されなければならない。このような遺伝子の代表的な供給源としては、藻類、細菌、酵母、植物および哺乳動物が挙げられる。細菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは、本明細書中に記載される方法における使用に適切な広い特異性のβ−ケトチオラーゼ遺伝子を有する。それは、Ｐｅｏｐｌｅｓらに対する米国特許第５，６６１，０２６号に記載のように、ハイブリダイゼーションプローブとしてアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を使用して容易に単離され得る。この酵素はまた精製されており（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．５２：９１（１９８８））、そしてその精製酵素は、抗体の調製または遺伝子単離のための基礎としてのタンパク質配列情報を決定するために有用である。
【００９８】
（実施例８：植物のβ−酸化遺伝子）
β−酸化の４官能性タンパク質をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号４に示される）は、Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０４７５−８１（１９９４）に記載されるように単離され得る。等価な遺伝子は、類似の手順を使用するか、またはゲノムライブラリー（これらの多くは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．から市販されている）をスクリーニングすることにより、他の植物種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ダイズ、ヒマワリ、およびトウモロコシを含む）から単離され得る。ペルオキシソーム標的配列Ｐ−Ｒ−Ｍは、このタンパク質のカルボキシ末端で同定された。植物の細胞質ゾル中での発現に適切な構築物は、この配列を欠失するよう設計されたプライマーを使用する、この遺伝子のＰＣＲ増幅により調製され得る。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、一般的に、ポリヒドロキシアルカノエート物質の産生のためのトランスジェニック植物系、トリグリセリドおよび脂肪酸の改変、ならびに植物での種子生産を変更するための方法の分野に関する。
【０００２】
作物栽培学的な作物についての安定なトランスジェニック植物を産生するための方法が、ここ最近１５年にわたって開発されてきた。作物は、投入量および産出量の両方の形質を改良するために遺伝的に改変された。前者の形質において、特定の農薬に対する耐性が作物中で操作され、そして特定の天然の殺虫剤（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｅｓｉｓの毒素）が、植物中で直接発現された。ハイブリッド植物を産生するための、雄性不稔系の開発における有意な進歩もまた存在する。産出量の形質に関して、作物は、生産物、一般的には、植物の種子、穀粒または繊維の価値を増すために改変される。重要な代謝標的としては、デンプン、脂肪酸および油の生合成経路の改変が挙げられる。
【０００３】
植物作物における微生物のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）バイオポリマーの産生においてかなりの商業的な興味が存在する。例えば、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｂｒｉｇｈｔらに対する米国特許第５，５０２，２７３号；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙに対する米国特許第５，５３４，４３２号；Ｊｏｈｎに対する米国特許第５，６０２，３２１号；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅらに対する米国特許第５，６１０，０４１号；ＰＣＴ ＷＯ９１／００９１７；ＰＣＴ ＷＯ９２／１９７４７；ＰＣＴ ＷＯ９３／０２１８７；ＰＣＴ ＷＯ９３／０２１９４；ＰＣＴ ＷＯ９４／１２０１４；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−２３（１９９２）；ｖａｎ ｄｅｒ ＬｅｉｊおよびＷｉｔｈｏｌｔ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−３８（１９９５）；ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（Ｅｇｇｉｎｋら編）Ｄａｖｏｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９６年８月１８〜２３日）；ならびにＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６）を参照のこと。ＰＨＡは、天然の、熱可塑性ポリエステルであり、そして非常に多くの適用（消費者包装、使い捨てダイアパーの裏地およびごみ袋、食物、ならびに医療製品を含む）に使用するための伝統的なポリマー技術により加工され得る。
【０００４】
実験的な植物系であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの葉緑体でのポリヒドロキシ酪酸の産生における初期研究により、ＰＨＢとして、葉の乾燥重量で１４％までの蓄積を生じた（Ｎａｗｒａｔｈら、１９９３）。しかし、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、作物栽培学的価値を有さない。さらに、作物栽培学的作物において経済的にＰＨＡを産生するために、種子におけるＰＨＡの産生が所望され、その結果、種子の収穫および加工のための現在の基幹施設が利用され得る。植物の種子からのＰＨＡの回収（ＰＣＴ ＷＯ９７／１５６８１）および最終用途の適用（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６））の選択肢は、ポリマーの組成によって有意に影響を受ける。それゆえ、きちんと規定された組成を有するＰＨＡポリマーを産生するトランスジェニック植物系を開発することは有利である。
【０００５】
それらの基質特異性に基づいたＰＨＡ生合成酵素の慎重な選択は、トランスジェニック系において規定された組成のＰＨＡポリマーの産生を可能にする（米国特許第５，２２９，２７９号；同第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；同第５，５３４，４３２号；同第５，６６１，０２６号；および同第５，６６３，０６３号）。
【０００６】
細菌において、各ＰＨＡ基は、特異的な経路により産生される。短いペンダント基ＰＨＡの場合では、以下の３つの酵素が関与する：β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびＰＨＡシンターゼ。例えば、ホモポリマーＰＨＢは、アセチル補酵素Ａの２つの分子の縮合により産生され、アセトアセチル補酵素Ａを生じる。次いで、後者は、レダクターゼによりキラル中間体Ｒ−３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａに還元され、続いて、ＰＨＡシンターゼ酵素により重合される。ＰＨＡシンターゼは、４−ヒドロキシ酸ユニットおよび５−ヒドロキシ酸ユニットを両方とも含むＣ３〜Ｃ５ヒドロキシ酸モノマーの重合化を可能にする比較的広範な基質特異性を特に有する。この生合成経路は、多くの細菌（例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．ｌａｔｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｌａｎｄｉｉおよびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）において見出される。長いペンダント基ＰＨＡは、例えば、多くの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌により産生される。これらの生合成は、ヒドロキシアシル補酵素Ａモノマー単位への経路として脂肪酸のβ−酸化および脂肪酸合成を含む。次いで、後者は、より大きなＣ６〜Ｃ１４モノマー単位に有利な基質特異性を有するＰＨＡシンターゼにより変換される（ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９９０）。
【０００７】
脂肪酸での細胞増殖から通常産生されるＰＨＢ−コ−ＨＸコポリマーの場合、これらの経路の組み合わせは、異なるモノマー単位の形成を担い得る。実際に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（これは、コポリマーであるＰＨＢ−コ−３−ヒドロキシヘキサノエートを産生する）におけるＰＨＡシンターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ遺伝子座の分析を使用して、Ｄ−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡおよびＤ−β−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡ単位の産生を担うＤ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子を同定した（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７）；Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−７３（１９９８））。このようなヒドラターゼ遺伝子および酵素の他の供給源としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍが挙げられる。
【０００８】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにおいて短いペンダント基ＰＨＡを産生する酵素である、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、およびβ−ケトチオラーゼは、ｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を含むオペロンによってコードされる（Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９８７；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ生物において、長いペンダント基ＰＨＡの産生を担うＰＨＡシンターゼは、ｐｈａ遺伝子座上に、特にｐｈａＡ遺伝子およびｐｈａＣ遺伝子によりコードされることが見出されている（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１））。これらの初期研究により、ある範囲のＰＨＡ生合成遺伝子が、単離および特徴づけされるか、またはゲノム配列決定プロジェクトから同定された。公知のＰＨＡ生合成遺伝子の例は、以下の参考文献に開示される：Ａｅｒｏｎｏｍａｓ ｃａｖｉａｅ（ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，５１２，６６９号；および同第５，６６１，０２６号；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−０３（１９８９））；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８：１４５−５２（１９９４）；Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ（ＬｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１３５−５０（１９９２）））；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３０９−１７（１９９３））；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ＧＥＮＢＡＮＫ 受託番号ＡＦ０１９９６４；Ｈａｌｌら、１９９８、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−６９）；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７７４−７９（１９９６）；Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ（Ｕｍｅｄａら、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０−７２：３４１−５２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３（Ｍａｔｓｕｓａｋｉら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４５９−６７）；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＴｉｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２））；Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ（Ｃｅｖａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１６４６−５４（１９９６））；Ｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５））；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ−ＦｕｒｓｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：７３−７９（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２））；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９：２１７−３０（１９９２））；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３）；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９−３６（１９９６））；Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅ ｖｉｏｌａｃｅａ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４９３−５０１（１９９３））およびＺｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９７−１０２（１９８７））；ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３：３４９−５７（１９８９））。これらの遺伝子または公開されたＤＮＡ配列の利用可能性は、ＰＨＡ産生のためのある範囲の選択肢を提供するはずである。
【０００９】
１〜９９％ＨＨモノマーを含むＰＨＢ−コ−ＨＨコポリマーを産生するための適切なＰＨＡシンターゼは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｈｉｏｃａｐｓｉａｅ ｖｉｏｌａｃｅａ、およびＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子によりコードされる。Ｒ−３−ヒドロキシブチレートに加えて、６〜１２の炭素原子の３−ヒドロキシ酸の取り込みのために有用な（すなわち、化学的に合成されたコポリマー（ＰＣＴ ＷＯ９５／２０６１４、ＰＣＴ ＷＯ９５／２０６１５およびＰＣＴ ＷＯ９５／２０６２１に記載される）に等価な生物学的ポリマーを産生するための）ＰＨＡシンターゼは、多くのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびほかの細菌において同定されている（ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４）；Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９（１９９５）；Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）；Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）；Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７（１９９６））。そして、それらは、米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号に記載されるように容易に単離され得る。Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のＰＨＡシンターゼ（米国特許第５，２４５，０２３号および同第５，２５０，４３０号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１））は、長いペンダント基ＰＨＡの産生に適切である。β−ケトチオラーゼをコードする植物遺伝子もまた、同定されている（ＶｏｌｌａｃｋおよびＢａｃｈ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０９７−１０７（１９９６））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，２４５，０２３号
【特許文献２】米国特許第５，２５０，４３０号
【特許文献３】米国特許第５，５０２，２７３号
【特許文献４】米国特許第５，５３４，４３２号
【特許文献５】米国特許第５，６０２，３２１号
【特許文献６】米国特許第５，６１０，０４１号
【特許文献７】国際公開第９１／００９１７号
【特許文献８】国際公開第９２／１９７４７号
【特許文献９】国際公開第９３／０２１８７号
【特許文献１０】国際公開第９３／０２１９４号
【特許文献１１】国際公開第９４／１２０１４号
【特許文献１２】国際公開第９７／１５６８１号
【特許文献１３】米国特許第５，２２９，２７９号
【特許文献１４】米国特許第５，２４５，０２３号
【特許文献１５】米国特許第５，４８０，７９４号
【特許文献１６】米国特許第５，５１２，６６９号
【特許文献１７】米国特許第５，６６１，０２６号
【特許文献１８】米国特許第５，６６３，０６３号
【特許文献１９】米国特許第５，２４５，０２３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：５２０−２３（１９９２）
【非特許文献２】ｖａｎ ｄｅｒ ＬｅｉｊおよびＷｉｔｈｏｌｔ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（補遺）：２２２−３８（１９９５）
【非特許文献３】ＮａｗｒａｔｈおよびＰｏｉｒｉｅｒ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（Ｅｇｇｉｎｋら編）Ｄａｖｏｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９６年８月１８〜２３日）
【非特許文献４】ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８−４４（１９９６）
【非特許文献５】ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７）
【非特許文献６】Ｆｕｋｕｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−７３（１９９８）
【非特許文献７】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献８】ＦｕｋｕｉおよびＤｏｉ、１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０
【非特許文献９】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−０３（１９８９）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｅｍｂｒｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１８：１４５−５２（１９９４）
【非特許文献１１】ＬｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１３５−５０（１９９２）
【非特許文献１２】ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：３０９−１７（１９９３）
【非特許文献１３】Ｈａｌｌら、１９９８、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−６９
【非特許文献１４】Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：７７４−７９（１９９６）
【非特許文献１５】Ｙａｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３３：８５−９０（１９９５）
【非特許文献１６】Ｕｍｅｄａら、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０−７２：３４１−５２）
【非特許文献１７】Ｍａｔｓｕｓａｋｉら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６４５９−６７
【非特許文献１８】ＴｉｍｍおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２）
【非特許文献１９】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献２０】Ｃｅｖａｌｌｏｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１６４６−５４（１９９６）
【非特許文献２１】Ｔｏｍｂｏｌｉｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：２５５３−５９（１９９５）
【非特許文献２２】Ｐｉｅｐｅｒ−ＦｕｒｓｔおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：７３−７９（１９９２）
【非特許文献２３】Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９３：２８５−９０（１９９２）
【非特許文献２４】Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．９：２１７−３０（１９９２）
【非特許文献２５】Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５：７０９−１４（１９９３）
【非特許文献２６】Ｈｕｓｔｅｄｅら、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＤＮＡ Ｒｅｓ．３：１０９−３６（１９９６）
【非特許文献２７】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４９３−５０１（１９９３）
【非特許文献２８】Ｐｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９７−１０２（１９８７）
【非特許文献２９】ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３：３４９−５７（１９８９）
【非特許文献３０】ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：６９１−９７（１９９２）
【非特許文献３１】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−１４（１９９２）
【非特許文献３２】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：７１０−１６（１９９４）
【非特許文献３３】Ｌｅｅら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−０９（１９９５）
【非特許文献３４】Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−７０（１９９６）
【非特許文献３５】Ａｂｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６：１１５−１９（１９９４）
【非特許文献３６】Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２６１−６７（１９９６）
【非特許文献３７】Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（４）：２１９１−９８（１９９１）
【非特許文献３８】ＶｏｌｌａｃｋおよびＢａｃｈ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０９７−１０７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
合成および基質の選択によりモノマー組成を改変する能力にもかかわらず、脂肪酸代謝に関する生合成のようなポリマー生合成の他の特徴を改変することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の目的は、植物の細胞代謝を操作するための脂肪酸酸化酵素系を導入するための方法およびＤＮＡ構築物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、植物において、好ましくは、その脂肪種子においてＰＨＡの産生を増強するための方法を提供することである。
【００１５】
（発明の要旨）
新規なポリマーを作製するための、植物において脂肪酸生合成および酸化を改変するための方法および系が、記載される。２つの酵素が、必須である：Ｄ特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼのようなヒドラターゼ（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅから得られたヒドラターゼ）およびβ−酸化酵素系。いくつかの植物は、植物が、ヒドラターゼを発現するように操作される場合、ポリマー合成を改変するのに十分なβ−酸化酵素系を有する。
【００１６】
実施例は、トランスジェニック植物において、これらの酵素の発現によりポリマーの産生を実証する。実施例はまた、脂肪酸生合成における改変を使用して植物の表現型を変化させ得、これにより種子産生を減少または排除する、および緑色植物生物体量を増加させる、ならびにＰＨＡを産生することを実証する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ポリヒドロキシアルカノエートモノマーを産生するための、脂肪酸β−酸化経路の模式図である。
【図２】図２は、プラスミド構築物ｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２０２５を示す模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１２４およびｐＣＧｍｆ１２５を示す模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、プラスミド構築物ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４を示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、プラスミド構築物ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
発生中の脂肪種子または緑色組織の細胞質またはプラスチドに脂肪酸酸化酵素系を導入することによって植物の細胞性代謝を操作するための方法およびＤＮＡ構築物が提供される。脂肪酸酸化系は、代表的には、広範囲のβ−ケトアシル−ＣｏＡ基質を利用するβ−ケトチオラーゼ酵素活性を含むいくつかの酵素活性を含む。
【００１９】
驚くべきことに、豆のファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーターからの少なくとも１つのこれらの導入遺伝子の発現が、雄性不稔をもたらすことが見出された。興味深いことに、これらの植物は、種子をつけず、その代わりに正常よりも高いレベルの生物体量（例えば、葉、茎、柄）を生成した。それゆえ、本明細書中に記載される方法および構築物をまた用いて、例えば、ハイブリッド生成のために雄性不稔植物を作製し得るか、またはまぐさ（例えば、アルファルファまたはタバコ）の生物体量の生成を増加させ得る。これらの方法およびＤＮＡ構築物を用いて作製された植物は、ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマーを生成するため、または新規な油組成物を生成するために有用である。
【００２０】
本明細書中に記載される方法は、さらなる導入遺伝子、特に、脂肪酸酸化またはポリイヒドロキシアルカノエート生合成に関与するさらなる酵素をコードする導入遺伝子のその後の取り込みを含む。ポリヒドロキシアルカノエート生合成については、この方法は、本明細書中に記載の方法およびＤＮＡ構築物を用いて、または伝統的な植物育種法によって生成されたトランスジェニック植物の続く形質転換による、酵素（例えば、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨアセトアセチル−補酵素Ａレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡエピメラーゼ、δ３−シス−δ２−トランスエノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ）をコードする導入遺伝子の取り込みを含む。
【００２１】
（Ｉ．植物発現系）
好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモーターから発現され、そしてタンパク質は、発生中の脂肪種子の細胞質において発現される。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、種子特異的プロモーターから発現され、そして発現されたタンパク質は、プラスチド標的化シグナルを用いてプラスチドに指向される。別の好ましい実施態様では、脂肪酸酸化導入遺伝子は、プラスチド染色体から直接発現され、ここで、これらは相同組換えによって取り込まれる。脂肪酸酸化導入遺伝子はまた、構成性プロモーターから、植物組織全体を通して発現され得る。圃場において作物への農薬または他の活性成分の適用後に活性化され得るプロモーターを用いることにより、これらの導入遺伝子の発現を制御し得ることもまた有用である。本明細書中に記載される方法により含まれるこれらの遺伝子の発現のさらなる制御としては、植物染色体の特異的染色体部位への導入遺伝子の標的化挿入についての組換え酵素技術の使用、またはこの導入遺伝子の発現の調節が挙げられる。
【００２２】
本明細書中に記載される方法としては、以下を含むゲノムを有する植物種子が挙げられる：（ａ）第１のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作動可能に連結されたプロモーター（この第１のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペプチドをコードする）、そして必要に応じて（ｂ）第２のＤＮＡ配列および３’非翻訳領域に作動可能に連結されたプロモーター（この第２のＤＮＡ配列は、脂肪酸酸化ポリペプチドをコードする）。２つの導入遺伝子の発現は、細胞質、またはペルオキシソームもしくはグリオキシソーム以外のプラスチドにおいて少なくともβ−ケトチオラーゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、およびヒドラターゼ活性を有する機能的脂肪酸β酸化系を植物に提供する。第１のＤＮＡ配列および／または第２のＤＮＡ配列は、細菌、酵母、真菌、藻類、植物、または動物から単離され得る。少なくとも１つのＤＮＡ配列が、少なくとも２つ、そして好ましくは３つの酵素活性を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。
【００２３】
（形質転換ベクター）
本明細書中に記載される方法において有用なＤＮＡ構築物としては、植物へ導入遺伝子を導入し得る形質転換ベクターが挙げられる。いくつかの植物形質転換ベクターの選択肢が利用可能であり、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）に記載されるベクターが含まれる。植物形質転換ベクターは、一般に、５’調節配列および３’調節配列（プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む）の転写制御下の目的の１以上のコード配列、ならびに選択マーカー遺伝子もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。５’調節配列についての通常の必要条件は、プロモーター、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む。単一の転写物からの２以上のポリペプチドの発現のために、さらなるＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボザイム配列が構築物中に操作され得る（米国特許第５，５１９，１６４号）。このアプローチは、複数の導入遺伝子を単一の遺伝子座に局在化するという利点を有する。これは、続いての植物育種の試みにおいて有利である。さらなるアプローチは、相同組換えによって植物プラスチド染色体を特異的に形質転換するためのベクターを使用すること（米国特許第５，５４５，８１８号）であり、この場合、プラスチドゲノムの原核生物の性質を利用し、そして多数の導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能である。
【００２４】
（プロモーター）
多数の植物プロモーターが公知であり、そして目的の遺伝子の構成的発現、または環境によってもしくは発生によって調節される発現のいずれかをもたらす。植物プロモーターを選択して、異なる植物組織または細胞小器官における導入遺伝子の発現を制御し得る。これらのための方法は全て、当業者に公知である（ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３−９９（１９８９））。導入遺伝子の５’末端は、導入遺伝子とインフレームで連結された、プラスチドまたは他の細胞内小器官標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作され得る。適切な構成性植物プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ）および増強されたＣａＭＶプロモーター（Ｏｄｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０（１９８５））、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−７１（１９９０））、ＡｄｈＩプロモーター（Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−３９（１９９０）；Ｋｙｏｚｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：４０−４８（１９９１））、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウ硝酸誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）プロモーターの小サブユニット、および化学誘導性プロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙらに対する米国特許第５，３６４，７８０号）が挙げられる。
【００２５】
本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、導入遺伝子は、発生中の種子においてのみ発現される。この目的のために適切なプロモーターとしては、ナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼプロモーター（米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号）、２Ｓアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１８９７−１９０１（１９８３））、オレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）プロモーター（Ｐｌａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３−２０５（１９９４）；Ｒｏｗｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１−４（１９９７）；米国特許第５，６５０，５５４号；およびＰＣＴ ＷＯ ９３／２０２１６）、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、およびデンプン分枝酵素プロモーターが挙げられる。
【００２６】
これらのベクターを用いる適切な作物栽培植物宿主の形質転換は、種々の方法および植物組織を用いて達成され得る。本明細書中に開示される方法において有用な代表的な植物としては、ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ、ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａおよびｊｕｎｃｅａを含むＢｒａｓｓｉｃａ科；トウモロコシ；ダイズ；ワタの実；ヒマワリ；ヤシ；ココヤシ；ベニバナ；ラッカセイ；Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａを含むカラシ；およびアマが挙げられる。生物体量（例えば、サイレージトウモロコシ、アルファルファ、またはタバコ）として収穫される作物もまた、本明細書中に開示される方法について有用である。これらのベクターを用いる形質転換のための代表的な組織としては、プロトプラスト、細胞、カルス組織、リーフディスク、花粉、および分裂組織が挙げられる。代表的な形質転換手順としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、バイオリスチック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、リポソーム媒介形質転換、およびケイ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））が挙げられる。
【００２７】
（ＩＩ．トランスジェニック植物を作製し、そしてスクリーニングするための方法）
本明細書中に記載される構築物を用いてトランスジェニック植物を作製するために、以下の手順を用いて、形質転換後に導入遺伝子を発現する、形質転換された植物を入手し得る：選択培地上で形質転換された植物細胞を選択する；形質転換された植物細胞を再生して、分化した植物を生成する；所望のポリペプチドが所望の組織および細胞の位置において得られるようなレベルで導入遺伝子を発現する、形質転換された植物を選択する。
【００２８】
記載された方法を実施するために有用な特定の作物について、形質転換手順が、例えば、以下に記載されるように、確立されている：「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｏｗｅｎら編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」（Ｍａｌｉｇａら編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）。
【００２９】
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓは、例えば、米国特許第５，１８８，９５８号および同第５，４６３，１７４号に記載される通りに形質転換され得る。他のＢｒａｓｓｉｃａ（例えば、ｒａｐｐａ、ｃａｒｉｎａｔａ、およびｊｕｎｃｅａ）ならびにＳｉｎａｐｉｓ ａｌｂａは、Ｍｏｌｏｎｅｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−４２（１９８９）に記載される通りに形質転換され得る。ダイズは、多数の報告された手順（米国特許第５，０１５，５８０号；同第５，０１５，９４４号；同第５，０２４，９４４号；同第５，３２２，７８３号；同第５，４１６，０１１号；および同第５，１６９，７７０号）によって形質転換され得る。いくつかの形質転換手順（花粉の形質転換（米国特許第５，６２９，１８３号）、ケイ素繊維媒介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）、プロトプラストのエレクトロポレーション（米国特許第５，２３１，０１９号；同第５，４７２，８６９号；および同第５，３８４，２５３号）、遺伝子銃（米国特許第５，５３８，８７７号および同第５，５３８，８８０号）、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（ＥＰ ０ ６０４ ６６２ Ａ１；ＰＣＴ ＷＯ ９４／００９７７）を含む）が、トランスジェニックトウモロコシ植物の生成について報告されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介手順は、特に好ましい。なぜなら、導入遺伝子構築物の単一の組み込み事象が、この手順を用いて、より容易に得られ、そしてこのことは、その後の植物育種を大いに容易にするからである。ワタは、粒子ボンバードメント（米国特許第５，００４，８６３号および同第５，１５９，１３５号）によって形質転換され得る。ヒマワリは、粒子ボンバードメントとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染との組合せを用いて形質転換され得る（ＥＰ ０ ４８６ ２３３ Ａ２；米国特許第５，０３０，５７２号）。アマは、粒子ボンバードメントまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のいずれかによって形質転換され得る。組換え酵素技術としては、ｃｒｅ−ｌｏｘ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、およびＧｉｎ系が挙げられる。これらの技術を利用する方法は、例えば、Ｈｏｄｇｅｓらに対する米国特許第５，５２７，６９５号；ＤａｌｅおよびＯｗ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５５８−６２（１９９１）；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４８５−９０（１９９５）に記載される。
【００３０】
（選択マーカー遺伝子）
本明細書中に記載される方法を実施する際に有用な選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号および同第５，５３０，１９６号）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、ホスフィノトリシンに対する耐性をコードするｂａｒ遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）が挙げられる。ＥＰ ０ ５３０ １２９ Ａ１は、増殖培地に添加された不活性な化合物を活性化する酵素をコードする導入遺伝子を発現することにより、形質転換された植物が、非形質転換系統から成長して抜け出すのを可能にするポジティブ選択系を記載する。本明細書中の方法において有用なスクリーニング可能マーカー遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−０７（１９８７）；米国特許第５，２６８，４６３号）およびネイティブなグリーン蛍光タンパク質遺伝子または改変されたグリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０：４４８−５５（１９９５）；Ｐａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００（１９９６））が挙げられる。これらのマーカーのうちのいくつかは、形質（例えば、除草剤耐性）を目的の植物に導入し、それによって、投入側にさらなる作物栽培的価値を提供するという付加的な利点を有する。
【００３１】
本明細書中に記載される方法の好ましい実施態様では、１より多くの遺伝子産物が植物中で発現される。この発現は、以下を含む、多数の異なる方法を介して達成され得る：（１）単一の形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法であって、ここで全ての必要なＤＮＡが単一のベクター上に存在する、方法；（２）同時形質転換事象においてコードＤＮＡを導入する方法であって、ここで全ての必要なＤＮＡが別個のベクター上に存在するが、同時に植物細胞に導入される、方法；（３）独立した形質転換事象によって連続的に植物細胞にコードＤＮＡを導入する方法（すなわち、さらなるＤＮＡ構築物を用いての１以上のコードＤＮＡを発現するトランスジェニック植物細胞の形質転換）；ならびに（４）別個の形質転換事象による、必要とされるＤＮＡ構築物の各々の形質転換によって、個々のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を得、そして伝統的な植物育種法を用いて全ての経路を単一の植物に組み込む方法。
【００３２】
（ＩＩＩ．β酸化酵素経路）
植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの産生は、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルをＰＨＡシンターゼについての基質として産生し得る酵素の細胞質ゾル局在化を必要とする。真核生物および原核生物の両方が、脂肪アシルＣｏＡチオエステルをアセチルＣｏＡへと変換する一連の酵素からなる脂肪酸分解についてのβ酸化経路を有する。これらの経路は、中間体３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して進行するが、この中間体の立体配置は生物間で異なる。例えば、細菌のβ酸化経路および高等真核生物のペルオキシソーム経路は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡへと分解する（Ｓｃｈｕｌｔｚ，「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら編）１０１〜０６頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９１））。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、β酸化多機能酵素複合体によってコードされるエピメラーゼ活性は、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換し得る。酵母は、中間体Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して進行するペルオキシソームに局在した脂肪酸分解経路を保有し（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６６４６−５３（１９９２）；Ｆｉｌｐｐｕｌａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４５３−５７（１９９５））、その結果、ＰＨＡを生成するためにエピメラーゼ活性は必要とされない。
【００３３】
植物は、他の高等真核生物と同様に、ペルオキシソーム中に細胞下に局在した脂肪酸分解のためのβ酸化経路を有する（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，「Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ［α ａｎｄ β Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ］」、Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ（Ｍｏｏｒｅ，Ｊｒ．編）５２７−６５頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ １９９３））。それゆえ、植物の細胞質ゾルにおけるＰＨＡの生成は、正確な鎖長のＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの脂肪酸の変換のために、β酸化経路の細胞質ゾルでの発現、ならびにＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをポリマーへと重合させるために適切なＰＨＡシンターゼの細胞質ゾル発現を必要とする。
【００３４】
脂肪酸は、植物のプラスチドにおいて飽和アシル−ＡＣＰチオエステルとして合成される（Ｈａｒｔｗｏｏｄ，「Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら編）２３７−７２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９７））。プラスチドから細胞質ゾルへの輸送の前に、大多数の脂肪酸は、Δ９デサチュラーゼを介して脱飽和される。大部分の脂肪種子作物における新たに合成された脂肪酸のプールは、主に、オレイン酸（シス９−オクタデセン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、およびパルミチン酸（ヘキサデカン酸）からなる。しかし、いくつかの植物（例えば、ココヤシおよびパーム核）は、より短い鎖の脂肪酸（Ｃ８〜１４）を合成する。この脂肪酸は、ＡＣＰからチオエステラーゼを介して放出され、続いてプラスチド膜に局在するアシルＣｏＡシンテターゼを介してアシルＣｏＡチオエステルへと変換される（Ａｎｄｒｅｗｓら，「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄｅｎｎｉｓら編）３４５−４６頁（Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ １９９０）；Ｈａｒｗｏｏｄ，「Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｄｅｙら編）２４６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ １９９７））。
【００３５】
脂肪酸分解経路を介する、新たに合成されたアシルＣｏＡチオエステルのプールの細胞質ゾル変換、およびＰＨＡシンターゼについてのＲ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ基質へのこれらの一連の反応由来の中間体の変換は、図１に概説した酵素反応を介して達成され得る。ＰＨＡシンターゼ基質はＣ４〜Ｃ１６ Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡである。飽和脂肪アシルＣｏＡについては、脂肪酸分解経路を用いてのＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルへの変換は、以下の一連の反応を必要とする：トランス−２−エノイル−ＣｏＡへのアシルＣｏＡチオエステルの変換（反応１）、Ｒ−３−ヒドロキシ（ｈｙｄｄｒｏｘｙ）アシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの水和（反応２ａ、例えば、酵母系は、この経路を通して作動し、そしてＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ Ｄ特異的ヒドラターゼはＣ４〜Ｃ７ Ｒ−３ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生じる）、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのトランス−２−エノイル−ＣｏＡの水和（反応２ｂ）、およびＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへのＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡのエピマー化（反応５、例えば、キュウリ四機能タンパク質、細菌系）。３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、ＰＨＡを形成するＰＨＡシンターゼによって重合されない場合、これは、残りのβ酸化経路を通して以下の通りに進行し得る：β−ケトアシルＣｏＡを形成する、３−ヒドロキシアシルＣｏＡの酸化（反応３）、続いてアセチルＣｏＡおよび２炭素単位分短い飽和アシルＣｏＡチオエステルを生じるＣｏＡ存在下でのチオ開裂（反応４）。反応４において生成されるアシルＣｏＡチオエステルは、反応１のβ酸化経路に自由に再度侵入し、そして生成されたアセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼ（反応７）およびＮＡＤＨアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼまたはＮＡＤＰＨアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（反応６）の作用によってＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換され得る。この後者の経路は、Ｒ−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、Ｒ−３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡ、およびＲ−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを生成するために有用である。この一連の酵素反応によって生成される４〜１６炭素原子のＲ−３−ヒドロキシ酸は、導入遺伝子（または２つのサブユニットシンターゼ酵素の場合は複数の導入遺伝子）から発現されるＰＨＡシンターゼによってＰＨＡポリマーへと重合され得る。
【００３６】
Δ９不飽和脂肪アシルＣｏＡについては、記載される種々の一連の反応が必要とされる。図１に詳述されるように、３サイクルのβ酸化は、６個の炭素単位を除去して、３位にシス二重結合を有する不飽和アシルＣｏＡチオエステルを生じる。Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼによって触媒される、２位でのトランス二重結合への３位でのシス二重結合の変換は、図１に概説した一連のβ酸化反応が進行するのを可能にする。この酵素活性は、微生物のβ酸化複合体および植物の四機能タンパク質に存在するが、酵母ｆｏｘ１には存在しない。
【００３７】
アシルＣｏＡチオエステルはまた、分解されてβ−ケトアシルＣｏＡになり、そしてＮＡＤＨ依存性レダクターゼまたはＮＡＣＰＨ依存性レダクターゼを介してＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡへと変換され得る（反応６）。
【００３８】
Ｓ特異的ヒドラターゼ活性、Ｓ特異的デヒドロゲナーゼ活性、β−ケトチオラーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性をコードする多機能性酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１９８４））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ（Ｉｍｍｕｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４−８９（１９９０））のような細菌において見出されている。多機能性酵素複合体は、触媒的に活性なタンパク質がヘテロテトラマーを形成するような、２コピーの各々２つのサブユニットからなる。ヒドラターゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、エピメラーゼ活性、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性は、一方のサブユニット上に存在し、一方、チオラーゼは別のサブユニットに存在する。生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｐｒａｔｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：５３５−４２（１９８４））；ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６４５９−６８（１９９０））およびＰ．ｆｒａｇｉ（Ｓａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：８−１５（１９９２））由来の酵素をコードする遺伝子は、単離および配列決定されており、そして本明細書中に記載される方法を実施するために適切である。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素系は、個々の酵素活性に重要なアミノ酸残基を同定するために部位特異的変異誘発分析に供されている（ＨｅおよびＹａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６２５−３０（１９９６）；Ｙａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６６４１−４７（１９９５）；ＨｅおよびＹａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１１０４４−４９（１９９７）；Ｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２６１−６８（１９９７）；ＹａｎｇおよびＥｌｚｉｎｇａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６５８８−９２（１９９３））。これらの変異遺伝子はまた、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施態様において用いられ得る。
【００３９】
ラットのような哺乳動物は、それらのペルオキシソーム中に、ヒドラターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびΔ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を含む、３機能性のβ−酸化酵素を有する。３機能性の酵素は、ラットの肝臓から単離され、そして７８ｋＤａの分子量を有する単量体であることが見出された（Ｐａｌｏｓａａｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２４４６〜４９（１９９０））。細菌系と異なり、チオラーゼ活性は、多酵素タンパク質の一部ではない（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１））。ラットにおけるエピマー化は、２つの異なるヒドラターゼの活性の組み合わせによって生じ、その１つは、Ｒ−３ヒドロキシアシルＣｏＡをトランス−２−エノイルＣｏＡに転換し、そして別の１つは、トランス−２−エノイルＣｏＡをＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに転換する（Ｓｍｅｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６０：９８８〜９２（１９８９））。哺乳動物はまた、中間体Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを介して脂肪酸をアセチルＣｏＡに分解する、β−酸化経路をそれらのミトコンドリアに有する（Ｓｃｈｕｌｔｚ、「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ｖａｎｃｅら、編）９６頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９１）））。ミトコンドリアβ−酸化活性をコードする遺伝子は、いくつかの動物から単離されており、これらには、ラットミトコンドリア長鎖アシルＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１６４７８）およびラットミトコンドリアチオラーゼ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｄ１３９２１およびＤ００５１１）が含まれる。
【００４０】
酵母は、多機能酵素であるＦｏｘ２を有し、これは、Ｓ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡの代わりにＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ中間体を介して進行するという点で、細菌および高等真核生物のβ−酸化複合体とは異なる（Ｈｉｌｔｕｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６６４６〜５３（１９９２））。Ｆｏｘ２は、Ｒ−特異的ヒドラターゼ酵素活性およびＲ−特異的デヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。この酵素は、Δ９−シス−ヒドロキシアシルＣｏＡを分解してＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを形成するのに必要な、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性を有さない。ｆｏｘ２をコードする酵母由来のこの遺伝子は単離され、そして配列決定されており、そして９００アミノ酸タンパク質をコードする。この構造遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示される。
【００４１】
植物は、酵母Ｆｏｘ２に類似するがまた、Δ３−シス−Δ２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性もコードする、４機能タンパク質を有する（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０４７５〜８１（１９９４））。このｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３および配列番号４に示される。
【００４２】
（ＩＶ．脂肪種子作物の細胞質への酵素の標的化）
植物の細胞質中のＰＨＡ産生を操作することは、植物の細胞質へのβ−酸化の発現を指示する工程を必要とする。ｆａｏＡＢのような細菌系においては標的化シグナルは存在しない。真菌、酵母、植物、および哺乳動物においては、β−酸化は、細胞下オルガネラにおいて起こる。代表的には、その遺伝子は、核の染色体において発現され、そして細胞質において合成されるポリペプチドは、特定のアミノ酸配列の存在によってこれらのオルガネラに指向される。真核生物供給源から単離された遺伝子（例えば、酵母、真菌、植物、および哺乳動物のような真核生物供給源由来の脂肪酸酸化酵素）を使用して、本明細書に記載される方法を実行するために、細胞下標的化シグナルの除去または改変が、この酵素を細胞質ゾルに指向させるために必要である。タンパク質を小胞体に指向させるためのシグナルを付加することが有用であり得る。このプロセスにおいて有用なペプチドは、当該分野で周知である。一般的なアプローチは、小胞体に標的化するペプチド配列に特定化したＤＮＡ配列を挿入してキメラ遺伝子を形成することによって、導入遺伝子を改変することである。
【００４３】
真核生物アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび他のミトコンドリアタンパク質は、通常２０〜６０アミノ酸長であるタンパク質のＮ−末端のリーダーペプチドを介してミトコンドリアに標的化される（Ｈｏｒｗｉｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：６２５〜３３（１９９０））。ミトコンドリア移入リーダーペプチドについての明白なコンセンサス配列の欠如にもかかわらず、リーダー配列において鍵となる残基の変異誘発は、ミトコンドリアタンパク質の移入を妨害することが実証された。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの移入は、そのリーダー配列の変異誘発によって妨害され、これは、細胞質における改変された前駆体タンパク質の蓄積を生じた（Ｂｅｄｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１０１４〜２５（１９８９））。
【００４４】
３つの真核生物ペルオキシソーム標的化シグナルが報告されている（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９）；Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１３：１２１３〜２１（１９９７））。トリペプチド標的化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌは、多くのペルオキシソームタンパク質のＣ−末端に生じる（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９））。この配列の変異誘発は、ペルオキシソームへのタンパク質の移入を妨害することが示されてきた。いくつかのペルオキシソームタンパク質は、そのタンパク質のＣ−末端にこのトリペプチドを含まない。これらのタンパク質では、タンパク質配列中の内部の位置のトリペプチドを介してか（Ｇｏｕｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７〜６４（１９８９））、または未知の、無関係の配列を介して（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１９９７））、標的化が生じることが示唆されている。Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来のアシルＣｏＡオキシダーゼのフラグメントを用いる、インビトロでのペルオキシダーゼ標的化実験の結果は、後者の理論を支持するようであり、そしてポリペプチドの内部アミノ酸配列中に２つの別個の標的化シグナルが存在することを示唆する（Ｓｍａｌｌら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：１１６７〜７３（１９８８））。前述の研究において、標的化シグナルは、長さにおいて１１８アミノ酸の２つの領域に局在し、そしていずれの領域も標的化シグナルＳ／Ａ／Ｃ−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌを含むことが見出されなかった。少数のペルオキシソームのタンパク質は、ペルオキシソームに移入するためのアミノ末端リーダー配列を含むようである（Ｂｒｉｃｋｎｅｒら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１３：１２１３〜２１（１９９７））。これらの標的化シグナルは、部位特異的変異誘発によって欠失させ得るか、または変更され得る。
【００４５】
（Ｖ．トランスジェニック植物の培養および収穫）
トランスジェニック植物は、標準的な培養技術を使用して生育され得る。植物または植物部分はまた、標準的な装置および方法を使用して回収され得る。ＰＨＡは、植物または植物部分から、公知の技術（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９７／１５６８１に記載されるような、伝統的な播種プロセス技術と組み合わせた溶媒抽出）を使用して回収され得るか、または、例えば、動物の食物として、直接的に使用され得る。ここでは、植物生物体量からのＰＨＡを抽出することは不要である。
【００４６】
種子を産生しなかったいくつかの系統は、はるかにより高いレベルの生物体量を産生した。従って、この表現型は、牧草、飼料、または他の生物体量作物について、１エーカーあたりに産生される緑の生物体量の量を増加させる手段として有用であり得る。末端の使用は、動物の餌のための、または電気的な動力を生成するためのエネルギー作物としての、飼料作物の最もコスト的に効果的な産生、を含む。他の使用は、工業製品の引き続く回収（例えば、抽出によるＰＨＡ）のために、作物（例えば、アルファルファまたはタバコ）の生物体量レベルを増加させる工程を含む。
【００４７】
本明細書中に記載される組成物およびその調製方法およびその使用方法は、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。
【実施例】
【００４８】
（実施例１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢ遺伝子およびＦａｏ酵素の単離および特徴付け）
ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換、およびプラスミド精製を含む。すべてのＤＮＡ操作を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載されるような標準的な方法を用いて行った。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｆａｏＡＢをコードする遺伝子を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ由来のｆａｏＢ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：８−１５（１９９２））に相同性を有するプライマー１および２を使用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡから生成されたプローブを用いて単離した。
プライマー１：５’−ｇａｔ ｇｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ｃａａ ｇｇｇ ｔｇｇ−３’（配列番号５）
プライマー２：５’−ｃａａ ｃｃｃ ｇａａ ｇｇｔ ｇｃｃ ｇｃｃ ａｔｔ−３’（配列番号６）。
【００４９】
１．１ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応から精製し、そしてλＺＡＰ発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ｐＢＫＣＭＶプラスミドに構築されたＰ．ｐｕｔｉｄａゲノムライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ポジティブクローンから選択し、そしてｆａｏＡＢ遺伝子を含むインサートのＤＮＡ配列および隣接配列を決定した。この配列を配列番号７に示す。以下のように、ｆａｏＡＢを含むフラグメントを、ネイティブなＰ．ｐｕｔｉｄａリボソーム結合部位を用いてインタクトに、発現ベクターｐＴＲＣＮにサブクローニングして、プラスミドｐＭＦＸ３を形成した。プラスミドｐＭＦＸ１を、ＢｓｒＧ１を用いて消化した。得られる突出末端をクレノウで平滑化した。ＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化は、ＦａｏＡＢをコードする、３．３９ｋｂの平滑末端／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを産生した。発現ベクターｐＴＲＣＮを、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そしてｆａｏＡＢフラグメントを用いて連結し、７．５７ｋｂのプラスミドｐＭＦＸ３を形成した。
【００５０】
ＦａｏＡＢ多酵素複合体の酵素を、以下のようにアッセイした。ヒドラターゼ活性を、アッセイがＣｏＡの存在下で行われた以外は、以前に記載されたように（Ｆｉｌｐｐｕｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４５３〜５７（１９９５））、カップリング酵素Ｌ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを使用して、ＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングすることによってアッセイした。カップリング酵素の激しい生成物阻害が、ＣｏＡの非存在下で観察された。このアッセイは、（最終容量１ｍＬに）６０μＭ クロトニル（ｃｒｏｔｏｎｙｌ）ＣｏＡ、５０μＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮＡＤ、７μｇ／ｍｌ ブタ心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシルＣｏＡ デヒドロゲナーゼ、および０．２５ｍＭ ＣｏＡを含んだ。このアッセイは、アッセイ混合液中へのＦａｏＡＢの添加で開始された。コントロールアッセイを、生成されるヒドラターゼ産物、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡの非存在下でＮＡＤの消費速度を決定するために、基質なしで行った。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５１】
ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてアセトアセチルＣｏＡを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨからＮＡＤへの転換をモニタリングすることにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））、逆方向でアッセイした。このアッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ＰＨ７、０．２ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、および３３μＭ アセトアセチルＣｏＡを含んだ。このアッセイを、アッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加で開始した。必要な場合、酵素サンプルを、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に希釈した。コントロールアッセイを、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素による粗サンプル中のＮＡＤＨの消費速度を検出するために、基質アセトアセチルＣｏＡなしで実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤＨの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５２】
ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを、基質としてクロトニルＣｏＡを用いて、３４０ｎｍにおけるＮＡＤからＮＡＤＨへの転換をモニタリングすることにより（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））、正方向でアッセイした。このアッセイ混合液は、（最終容量１ｍＬ中に）０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、ＰＨ８、０．３ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭ ＣｏＡ、３０μＭ クロトニルＣｏＡ、およびＦａｏＡＢのアリコートを含んだ。反応を、Ｓ−ヒドロキシブチリルＣｏＡのインサイチュでの形成を可能にするために数分間プレインキュベーションした。次いで、このアッセイを、ＮＡＤ（０．４５ｍＭ）の添加によって開始した。コントロールアッセイを、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外の酵素によるＮＡＤの消費速度を検出するために、基質なしで実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりのＮＡＤの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５３】
チオラーゼ活性を、いくつかの改変を伴って、以前に記載されたように（Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１〜７（１９９１））、基質アセトアセチルＣｏＡの消費による３０４ｎｍにおける吸収の減少をモニタリングすることによって決定した。アッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）６２．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．１、４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、６２．５μＭ ＣｏＡ、および６２．５μＭアセトアセチルＣｏＡを含んだ。このアッセイは、アッセイ混合液へのＦａｏＡＢの添加によって開始した。酵素を有さないコントロールサンプルを、酵素の非存在下でｐＨ８．１の基質分解速度を検出するために、各々のアッセイについて実行した。活性の１ユニットは、１分間あたりの基質アセトアセチルＣｏＡの１μモルの消費として定義される（ε３４０＝１６９００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００５４】
エピメラーゼ活性を、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡチオエステルを、Ｄ，Ｌ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ混合物の代わりに使用する以外は、以前に記載されたように（Ｂｉｎｓｔｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７１：４０３（１９８１））アッセイした。このアッセイは、（最終容量１ｍＬ中に）３０μＭ Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡ、１５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、０．３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、０．１ｍＭ ＣｏＡ、および７μｇ／ｍＬ ブタ心臓由来Ｌ−特異的β−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを含んだ。このアッセイは、ＦａｏＡＢの添加によって開始した。
【００５５】
ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａｏＡＢの発現のために、培養物を２×ＴＹ培地中で３０℃で増殖させた。２×ＴＹ培地は、（１リットルあたり）１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母、および５ｇＮａＣｌを含む。スターター培養を、一晩増殖させ、そして新鮮な培地（小規模増殖では２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中に１００ｍＬ；大規模増殖には、２．８Ｌフラスコ中に１．５Ｌ）に接種（１％接種材料）するために使用した。６００ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６の範囲に達した場合、細胞を０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。収穫に先立ち、細胞をさらに４時間培養した。細胞を超音波処理によって溶菌し、そして遠心分離によって不溶性物質を可溶性タンパク質から取り除いた。アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を、ＦａｏＡサブユニット（配列番号３１）の活性を保証するために逆方向でモニタリングし、そしてチオラーゼ活性をＦａｏサブユニットの活性を決定するためにアッセイした。ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３におけるＦａｏＡＢは、それぞれ、４．３Ｕ／ｍｇおよび０．９９Ｕ／ｍｇの値のデヒドロゲナーゼ活性およびチオラーゼ活性を含んだ。これは、コントロール株ＤＨ５α／ｐＴＲＣＮにおいてデヒドロゲナーゼおよびチオラーゼについて観察された、それぞれ０．００７４Ｕ／ｍｇおよび０．００３３Ｕ／ｍｇよりも顕著に高かった。
【００５６】
ＦａｏＡＢを、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ由来のＦａｏＡＢの精製について以前に記載された改変された手順（Ｉｍａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１８４〜８９（１９９０））を用いて、ＤＨ５α／ｐＭＦＸ３から精製した。チオラーゼ活性（正方向においてアッセイされた）およびデヒドロゲナーゼ活性（逆方向においてアッセイされた）を、精製の全体を通じてモニタリングした。３リットルのＤＨ５α／ｐＭＦＸ３細胞（２．８Ｌのエーレンマイヤーフラスコ中２×１．５Ｌアリコート）を、酵素活性分析のために調製された細胞について以前に記載された細胞増殖手順を用いて、２×ＴＹ培地中で増殖させた。細胞（１５．８ｇ）を、３２ｍＬの１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に再懸濁し、そして超音波処理によって溶菌した。可溶性タンパク質を、遠心分離（１８，０００ＲＰＭ、３０分間、４℃）によって不溶性の細胞の破片から除去した。可溶性の抽出物を、５０％アセトン中で作製し、そして沈澱したタンパク質を、遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に再溶解した。このサンプルを、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて３３％飽和に調整し、そして可溶性および不溶性のタンパク質を、遠心分離によって分離した。得られた上清を、（ＮＨ４）２ＳＯ４で５６％飽和に調整し、そして不溶性ペレットを遠心分離によって単離し、そして１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中に溶解した。このサンプルを、５０℃で３０分間加熱し、そして可溶性タンパク質を遠心分離によって単離し、そして６０００〜８０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７において透析した（２×３Ｌ；２０時間）。このサンプルを、あらかじめ１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏ Ｊｏｚｏ ＤＥＡＥ ＦＰＬＣカラム（３ｃｍ×１４ｃｍ）上にロードした。このタンパク質を、直線勾配（１００ｍＬずつ；１０ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７中、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、流速３ｍＬ／分で溶出した。ＦａｏＡＢは、３００と３２５ｍＭ ＮａＣｌとの間に溶出した。このサンプルを、事前に１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７で平衡化したマクロ−プレップ ハイドロキシアパタイト１８／３０（Ｂｉｏｒａｄ）ＦＰＬＣカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）にロードする前に、５０，０００分子量カットオフメンブレン中で、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７において透析した（１×２Ｌ；１５時間）。タンパク質を、３ｍＬ／分の流速で、直線勾配（２５０ｍＬずつ；１０〜５００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７）を用いて溶出した。ＦａｏＡＢは、７０と１３０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４との間に溶出した。活性を含む画分を、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭ１００，０００分子量カットオフ濃縮器を用いて９ｍＬまで濃縮した。緩衝液を、２０％ショ糖を含む１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７を用いて３回交換し、そして−７０℃で凍結した。ハイドロキシアパタイト精製画分の酵素活性を、基質の範囲を用いてアッセイした。結果を、以下の表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（実施例２：ＦａｏＡＢおよびＦａｏＡＢポリペプチドに対する抗体の産生）
実施例１に記載されるようなＦａｏＡＢタンパク質の精製後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＦａｏＡ（配列番号３１）およびＦａｏＢ（配列番号２６）に対応するタンパク質バンドを切り出し、そしてフロイント完全アジュバントを用いてニュージーランド白ウサギを免疫した。追加免疫を、フロイント不完全アジュバントを用いて３週間間隔で行った。抗体を、血清からプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティークロマトグラフィーによって回収し、ウェスタンブロッティング手順によって抗原に対して試験した。Ｂｒａｓｓｉｃａ種子のコントロール抽出物を使用して、植物タンパク質に対する交差反応について試験した。交差反応は検出されなかった。
【００５９】
（実施例３：トランスジェニック脂肪種子におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄｏ ｆａｏＡＢ遺伝子の発現のためのプラスミドの構築）
（ｐＳＢＳ２０２４の構築）
マメのファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーター（配列番号１０；Ｓｌｉｇｈｔｏｍら、１９８３）の５’−および３’−末端（下線を付した）それぞれに隣接する配列に相同な、 オリゴヌクレオチドプライマーＧＶＲ４７１
【００６０】
【化１】
およびＧＶＲ４７２
【００６１】
【化２】
を、それぞれ、ＧＶＲ４７１およびＧＶＲ４７２の５’−末端にＫｐｎＩ（斜字体、配列番号８のヌクレオチド１〜７）およびＳｗａＩ（斜字体、配列番号９のヌクレオチド１〜９）を付加するように設計した。これらの制限部位を、クローニングを容易にするために組み込んだ。これらのプライマーを使用して、１．４ｋｂファゼオリンプロモーターを増幅した。このプロモーターを、平滑末端連結によってｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。命名されたプラスミド、ｐＣＰＰＩ（図２を参照のこと）を、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し、そしてＳａｌＩ／ＳｗａＩファゼオリンターミネーター（配列番号２７）に連結した。ポリアデニル化シグナルを含むマメのファゼオリンターミネーター配列を、以下のＰＣＲプライマーを使用して増幅した：ＧＶＲ３９６：５’−ＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２２）
およびＧＶＲ３９７５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＣＴＡ−３’（配列番号２３）
そして１．２ｋｂフラグメント（配列番号２７）をｐＣＣＰ１のＳａｌＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＳＢＳ２０２４を得た（図２）。クローニングのための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む、得られるプラスミドを、ｐＳＢＳ２０２４と命名した（図２）。
【００６２】
（ｐＳＢＳ２０２４の構築）
ダイズオレオシンプロモーターフラグメント（配列番号１１；Ｒｏｗｌｅｙら、１９９７）を、ＤＮＡ配列に隣接するプライマーを用いて簡易化した。
【００６３】
プライマーＪＡ４０８
【００６４】
【化３】
は、５’末端（下線を付した）に相補的な配列を含む。
プライマーｎｐ１
【００６５】
【化４】
は、プロモーターフラグメントの３’末端（下線を付した）に相同な配列を含む。制限部位ＸｂａＩ（斜字体）およびＳｗａＩ（斜字体）を、クローニングを容易にするために、ＪＡ４０８およびｎｐＩの５’末端にそれぞれ組み込んだ。プライマーを、９７５ｂｐプロモーターフラグメントを増幅するために使用し、次いでｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした（図２を参照のこと）。得られるプラスミド、ｐＣＳＰＩを、ＳａｌＩおよびＳｗａＩを用いて切断し、そしてダイズターミネーター（配列番号２８）に連結した。ダイズオレオシンターミネーターを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した：ＪＡ４１０：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号２９）
およびＪＡ４１１：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号３０）
そして、２２５ｂｐフラグメントをｐＣＳＰＩのＳａｌＩ−ＳｗａＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＳＢＳ２０２５（図６）を得た。命名されたプラスミド、ｐＳＢＳ２０２５は、クローニングのための独特のＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する（図２）。
【００６６】
（プロモーターコード配列融合体の構築）
以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆｌ（ｆａｏＡ、配列番号２４）の５’隣接配列のヌクレオチド５５３〜５５７に相同なｎｐ２
【００６７】
【化５】
および３’末端に隣接するヌクレオチド２７００〜２６８３に相補的なｎｐ３
【００６８】
【化６】
クローニングを容易にするために、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリック体）部位を、プライマーｎｐ２およびｎｐ３の５’末端に導入した。さらに、植物の翻訳開始コドンを包囲するより有利な配列を得るために、３ｂｐのＡＡＡ配列（太字）を組み込んだ。プライマーｎｐ２およびｎｐ３を使用して、フラグメントを増幅し、そしてｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングした。生じたプラスミドをｐＣｍｆＩ（図３Ａおよび３Ｂ）と称した。プラスミドｐＢｍｆ２を、同様のプロセスで構築した（図５Ａおよび５Ｂ）。クローニングのために、ｍｆ２（ｆａｏＢ）遺伝子（配列番号２５）の５’および３’末端で、ＨｉｎｄＩＩＩ（イタリック体）を生じるために、合成プライマーの第二のセットを設計した。
【００６９】
プラスミドｐｍｆｘ３のｍｆ２（ｆａｏＢ、配列番号２５）の５’（ヌクレオチド２７３２〜２７５２ｂｐ）に相補的なプライマーｎｐ４
【００７０】
【化７】
および３’（ヌクレオチド３９０７〜３８８６ｂｐ）配列に相同なプライマーｎｐ５
【００７１】
【化８】
をＰＣＲ反応に使用して、１．１７ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅した。生じたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶにクローニングした。このプラスミドを、ｐＢｍｆ２と称した。
【００７２】
両方のプラスミドを個々にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてそれらの挿入体を、同じ制限酵素で予め直線化したプラスミドｐＳＢＳ２０２４およびｐＳＢＳ２０２５にクローニングした。その結果、以下のプラスミドを生成した：ｐｍｆ１２４およびｐｍｆ１２５（図３Ａおよび３Ｂ）ならびにｐｍｆ２２４およびｐｍｆ２２５（図５Ａおよび５Ｂ）。これらは、ファゼオリンまたはダイズプロモーターのいずれかで融合されたＦａｏ遺伝子（ｍｆ１およびｍｆ２）を含む。ＤＮＡ配列分析により、ｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ２２５について正しいプロモーター−コード配列−終結配列融合体が確認された。
【００７３】
（実施例４：プロモーター−コード配列融合体の植物形質転換ベクターへのアセンブリ）
プラスミドｐｍｆ１２４、ｐｍｆ１２５、ｐｍｆ２２４、およびｐｍｆ２２５を得た後に、プロモーター−コード配列融合体を、二成分ベクターｐＣＧＮ１５５９（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９０）（これは、ＮＰＴＩＩ遺伝子（抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える）の発現を駆動するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む）およびｐＳＢＳ２００４（これは、除草剤フォスフィノスリシンに対する耐性を与えるＰＰＴ遺伝子を駆動するパセリユビキチンプロモーターを含む）に別々にクローニングした。種々の選択マーカーを有するこの目的に適した二成分ベクターは、いくつかの供給源から入手され得る。
【００７４】
ファゼオリン−ｍｆ２１融合カセットを、ＸｂａＩで親プラスミドから放出し、そして同じ制限酵素で直線化したｐＣＧＮ１５５９と連結した。得られたプラスミドをｐＣＧｍｆ１２４と命名した（図３Ａおよび３Ｂ）。ダイズ−ｍｆ１融合体を含むプラスミドｐＣＧｍｆ１２５を、ｐｍｆ１２５およびｐＣＧＮ１５５９の両方を連結前にＢａｍＨＩで切断したことを除き、同様の方法で構築した（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００７５】
（ｐｍｆ１２４９およびｐｍｆ１２５４の構築）
プラスミドｐＳＢＳ２００４を、ダイズ−ｍｆ１融合体を含むＢａｍＨＩフラグメントと共に直線化した。このプラスミドをｐｍｆ１２５４と命名した（図４Ａおよび４Ｂ）。同様に、ＸｂａＩファゼオリン−ｍｆ１融合フラグメントを、同じ制限酵素で直線化したｐＳＢＳ２００４と連結した。得られたプラスミドをｐｍｆ１２４９と命名した（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００７６】
（ｐＣＧｍｆ２２４およびｐＣＧｍｆ２２５の構築）
ファゼオリン−ｍｆ２およびダイズ−ｍｆ２融合体を、ＢａｍＨＩまたはＸｂａＩのいずれかで切断することによってベクターから融合体を切り出すことにより構築し、そしていずれかの制限酵素で直線化しておいたｐＣＧＮ１５５９にクローニングした（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００７７】
（ｐＣＧｍｆ１Ｐ２ＳおよびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓの構築）
プロモーター−コード配列融合体を含む２つの発現カセットを、以下のように同じ二成分ベクター上でアセンブルした。：ファゼオリン−ｍｆ１融合体を含むプラスミドｐｍｆ１２４をＢａｍＨＩで切断し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＣＧｍｆＢ１２４を作製した。次いで、このプラスミドをＸｂａＩで直線化し、そしてダイズ−ｍｆ２融合体を含むｐｍｆ２２５のＸｂａＩフラグメントに連結した。最終プラスミドを、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓと命名した（図６Ａおよび６Ｂ）。プラスミドｐＣＧｍＦ２Ｐ１Ｓを、同様の様式でアセンブルした。ファゼオリン−ｍｆ２融合体をＢａｍＨＩで切断することによりｐｍｆ２２４から放出し、そしてｐＣＧＮ１５５９のＢａｍＨＩ部位でクローニングした。得られたプラスミドｐＣＧｍｆＢ２２４をＸｂａＩで直線化し、そしてダイズ−ｍｆ１融合体を含むｐｍｆ１２５のＸｂａＩフラグメントに連結した（図６Ａおよび６Ｂ）。
【００７８】
（実施例５：Ｂｒａｓｓｉｃａの形質転換）
Ｂｒａｓｓｉｃａ種子を、１０％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。その種子を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）を含む発芽培地（ｐＨ５．８）中に、プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃で、かつ６０〜８０μＥｍ−２ｓ−１の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の光周期で、４〜５日間維持した。
【００７９】
各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉａｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６））内にエレクトロポレーションにより導入した。子葉の葉柄の形質転換前に、各々の構築物を有するＥＨＡ１０１株の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培地中、２８℃で４８時間増殖させた。１ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを１ｍｌの最小培地中に再懸濁した。
【００８０】
形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてただちに同時培養培地（３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガーを含み、そして２０μＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配置し、そして同じ生長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次いで子葉を、３％（ｗ／ｖ）スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン（ｔｉｍｅｎｔｉｎｉｎ）、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを補充したＭＳ培地を含む再生培地に移した。
【００８１】
２〜３週間後、得られた再生苗条を切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、０．７％（ｗ／ｖ）フィトアガー、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８））上で維持した。伸長した苗条を、「発根」培地（ＭＳ培地、３％スクロース、２ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む）に移した。根が出現した後、小植物をポッティングミックス（Ｒｅｄｉ Ｅａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏ．）に移した。植物を、噴霧チャンバー（７５％の相対湿度）中で同じ生長条件下で維持した。生長２〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−４２（１９８９））のために採取した。
【００８２】
ＦａｏＡおよびＦａｏＢトランスジェニック系統由来の種子を、抗ＦａｏＡ抗体および抗ＦａｏＢ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって、脂肪酸酸化ポリペプチドの発現について分析し得る。ＦａｏＢポリペプチド（配列番号２６）は、ＦａｏＡ遺伝子産物の非存在下で機能的でない；しかしＦａｏＡＢ遺伝子産物は酵素活性を有する。
【００８３】
ＦａｏＡおよびＦａｏＢ複合体を発現するトランスジェニック系統を、個々のポリペプチドを発現するＦａｏＡトランスジェニック系統およびＦａｏＢトランスジェニック系統を交雑して獲得し、そして種子を、記載されるようなウエスタンブロッティングおよび酵素アッセイにより分析する。
【００８４】
（実施例６：Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの形質転換およびトランスジェニック系統の分析）
（形質転換）
使用するプロトコルは、Ｍｏｌｏｎｅｙら（１９８９）に記載される手順から採用した。Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの種子を、１０％の市販の漂白剤（Ｊａｖｅｘ，Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．）中で３０分間、穏やかに振盪して、表面滅菌した。その種子を滅菌蒸留水中で３回洗浄した。種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）塩およびビタミン、３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含む発芽培地（ｐＨ５．８）中に、プレートあたり２０個の密度で配置し、そして２４℃で、かつ６０〜８０μＥｍ−２ｓ−１の光強度での１６時間の明期／８時間の暗期の光周期で、４〜５日間維持した。
【００８５】
各々の構築物、ｐＣＧｍｆ１２４、ｐＣＧｍｆ１２５、ｐＣＧｍｆ２２４、ｐＣＧｍｆ２２５、ｐＣＧｍｆ１Ｐ２Ｓ、およびｐＣＧｍｆ２Ｐ１Ｓを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄら、１９８６）内にエレクトロポレーションにより導入した。子葉の葉柄の形質転換前に、各々の構築物を有する株ＥＨＡ１０１の単一コロニーを、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを補充した５ｍｌの最小培地中、２８℃で４８時間増殖させた。１ｍｌの細菌懸濁液を微量遠心管中で１分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを１ｍｌの最小培地で再懸濁した。
【００８６】
形質転換のために、子葉を、その基部に約２ｍｍの葉柄を含むように、４日齢（いくつかの場合においては、５日齢）の実生から切り取った。それらの葉柄の切断表面を有する個々の子葉を、希釈した細菌懸濁液に１秒間浸けて、そしてただちに同時培養培地（３％スクロースおよび０．７％フィトアガーを含み、そして２０μｌＭのベンジルアデニンを富化したＭＳ培地）中に約２ｍｍの深さに包理した。接種した子葉を、プレートあたり１０個の密度で配置し、そして同じ生長条件下で４８時間インキュベートした。同時培養後、次いで子葉を、３％スクロース、２０μＭベンジルアデニン、０．７％フィトアガー（ｐＨ５．８）、３００ｍｇ／ｌのチメンチニン、および２０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンで補充したＭＳ培地を含む再生培地に移した。
【００８７】
２〜３週間後、再生苗条を獲得し、切断し、そしてＭａｇｅｎｔａジャー中の「苗条伸長」培地（３％スクロース、３００ｍｇ／ｌのチメンチン、０．７％フィトアガー、および２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ培地（ｐＨ５．８））上で維持した。次いで、伸長した苗条を、「発根」培地（３％スクロース、２ｍｇ／ｌのインドール酪酸、０．７％フィトアガー、および５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地）に移した。根が出現した後、小植物をポッティングミックス（Ｒｅｄｉ Ｅａｒｔｈ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ａｎｄ Ｃｏ．Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）に移した。植物を、噴霧チャンバー（７５％のＲＨ）中で同じ生長条件下で維持した。生長２〜３週間後、葉のサンプルを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）アッセイ（Ｍｏｌｏｎｅｙら、１９８９）のために採取した。結果を以下の表２に示す。データは形質転換されたことが確認された植物の数を示す。
【００８８】
【表２】
【００８９】
形質転換ＤＮＡの発生運命を１６の無作為に選択したトランスジェニック系統について調査した。サザンＤＮＡハイブリダイゼーション分析により、ＦａｏＡおよび／またはＦａｏＢが、試験したトランスジェニック系統のゲノムに組込まれたことが示された。
【００９０】
ＦａｏＡ遺伝子が強力なマメファゼオリンプロモーターから発現される、約８０％のｐｍｆ１２４のトランスジェニック植物は、雄性不稔であることが観察された。このプロモーターからのＦａｏＡ遺伝子の明らかな高レベルの発現は、ＦａｏＡ遺伝子産物の機能的発現を生じ、これは種子および／または花粉の発達を障害する。この結果は、非常に予想外のことであった。なぜなら、その植物細胞は、細胞質ゾル中のβ−酸化経路の第一段階を行うことが可能であることが予測されなかったからである。しかし、この結果は、ハイブリッド産生のための雄性不稔のために、または種子の産生を妨げるために、植物におけるβ−酸化遺伝子の発現のためのさらなる適用を提供する。正常なトランスジェニック系統との並行した比較において、ｐｍｆ１２４株は、おそらく種子発達の排除に起因して、さらに高いレベルの生物体量を生成することもまた留意された。従って、この表現型は、サイレージ、飼料、または他の生物体量作物についての１エーカーあたりに産生される緑色の生物体量の量を増加するための手段として有用であり得る。ここで、誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術の使用が定植のための種子を生成するために使用され得る。これら不稔植物の７つが、ｐｍｆ２２５トランスジェニック系統由来の花粉で首尾良く他家受粉され、そして種子を生じた。
【００９１】
ファゼオリンプロモーター−ＦａｏＢ構築物を含むｐｍｆ２２４株からの種子由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、コントロールを除く試験した全てのサンプルにおいて、予期された１．２ｋｂの転写物を示すシグナルが示された。弱いダイズオレオシン（ｏｌｅｏｌｓｉｎ）プロモーター−ＦａｏＡ構築物を含むｐｍｆ１２５株からの種子由来のＲＮＡについてのノーザン分析により、２．１ｋｂの予期された大きさの転写物が明らかにされた。ＦａｏＡ遺伝子が比較的弱いダイズオレオシンプロモーターから発現される、ｐｍｆ１２５植物の約８０％の種子由来の３００〜５００μｇのタンパク質についてのウエスタンブロッティングは、結論付けには到らなかったが、弱いシグナルが１つのトランスジェニック系統において検出された。
【００９２】
（脂肪酸分析）
種子において強力なマメファゼオリンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現することの強力な代謝効果を示した予想外の結果が与えられたため、弱いダイズオレオシンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子を発現するトランスジェニック系統からの種子の脂肪酸プロフィールを分析した。マメファゼオリンプロモーターからＦａｏＡ遺伝子のみを発現する種子またはＦａｏＢ遺伝子も発現する種子を試験した。分析は、Ｍｉｌｌａｒら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：１８８９−９０２（１９９８）に記載されるように行った。種子の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）を、Ｂ．ｎａｐｕｓの１０個の種子を１５×４５−ｍｍねじ口ガラス管に配置し、そして０．７５ｍＬの１Ｎメタノール性（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ）ＨＣｌ試薬（Ｓｕｐｅｌｃｏ，ＰＡ）および１０μＬの１ｍｇ／ｍＬの１７：０メチルエステル（内部標準）中、８０℃で一晩加熱することによって調製した。そのサンプルを冷却後、ＦＡＭＥＳを、０．３ｍＬのヘキサンおよび０．５ｍＬの０．９％ＮａＣｌで激しくボルテックスすることにより抽出した。そのサンプルを、相を分離するために静置させ、そして３００μＬの有機相を抽出し、そしてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄガスクロマトグラフィー上で分析した。
【００９３】
脂肪酸プロフィール分析により、その脂質プロフィールにおけるさらなる成分または増強された成分の存在が、ＦａｏＡ遺伝子（配列番号２４）を発現する全てのトランスジェニック植物において示され、これらはコントロール植物には存在しなかった。この結果はまた、ＦａｏＡ遺伝子が転写されて、そして翻訳されたこと、およびＦａｏＡポリペプチド（配列番号２７）が、触媒活性を有することを結論的に証明する。このピークはまた、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ遺伝子、ＰｈａＰ−ＦａｏＡ−ＳｏｙＰ−ＦａｏＢ遺伝子、ＳｏｙＰ−ＦａｏＡ−ＰｈａＰ−ＦａｏＢ遺伝子を有するさらなる１１のトランスジェニック植物およびＳｏｙＰ−ＦａｏＢで他家受粉された不稔（ＰｈａＰ−ＦａｏＡ）植物において観察された。これらのデータは、ＦａｏＡ遺伝子の機能的発現、およびたとえ非常に低レベルの発現でもその種子の脂質プロフィールを変化するのに十分であることを明らかに実証する。本明細書中で記載される方法を適応することにより、当業者は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｏｌｅｏｓｉｎプロモーター、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター、またはクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）プロモーターのような他のプロモーターを使用して、ファゼオリンプロモーターとダイズオレオシンプロモーターとの間で得られるレベルの中間のレベルでこれらの遺伝子を発現し得、そして誘導性プロモーター系またはリコンビナーゼ技術を使用して、脂肪酸酸化の導入遺伝子が発現される時期を制御し得る。
【００９４】
（実施例７：酵母のβ−酸化の多機能酵素複合体）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、細菌および高等真核生物において観察されるＳ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡよりもむしろＲ−ヒドロキシアシルＣｏＡを経て進行するβ−酸化経路を含む。酵母由来のｆｏｘ２遺伝子は、ヒドラターゼ（これはトランス−２−エノイル−ＣｏＡからＲ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを生成する）およびデヒドロゲナーゼ（これは、Ｒ−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを利用してβ−ケトアシルＣｏＡを生成する）をコードする。
【００９５】
ｆｏｘ２遺伝子（配列番号１に示される配列）を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡからＰＣＲにより２つの小片で単離した。プライマーＮ−ｆｏｘ２ｂおよびＮ−ｂａｍｆｏｘ２ｂを利用して、Ｆｏｘ２のＮ末端領域をコードする１．１ｋｂのＳｍａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲし、そしてプライマーＣ−ｆｏｘ２およびＣ−ｂａｍｆｏｘ２を利用して、Ｃ末端Ｆｏｘ２領域をコードする１．６ｋｂのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントをＰＣＲした。全長ｆｏｘ２遺伝子を、ベクターｐＴＲＣＮへのサブクローニングを経て再構築した。
【００９６】
【化９】
【００９７】
しかし、ｆｏｘ１遺伝子は、β−ケトチオラーゼ活性を保持せず、そしてこの活性は第二の導入遺伝子により供給されなければならない。このような遺伝子の代表的な供給源としては、藻類、細菌、酵母、植物および哺乳動物が挙げられる。細菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは、本明細書中に記載される方法における使用に適切な広い特異性のβ−ケトチオラーゼ遺伝子を有する。それは、Ｐｅｏｐｌｅｓらに対する米国特許第５，６６１，０２６号に記載のように、ハイブリダイゼーションプローブとしてアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を使用して容易に単離され得る。この酵素はまた精製されており（Ｈａｙｗｏｏｄら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．５２：９１（１９８８））、そしてその精製酵素は、抗体の調製または遺伝子単離のための基礎としてのタンパク質配列情報を決定するために有用である。
【００９８】
（実施例８：植物のβ−酸化遺伝子）
β−酸化の４官能性タンパク質をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号４に示される）は、Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０４７５−８１（１９９４）に記載されるように単離され得る。等価な遺伝子は、類似の手順を使用するか、またはゲノムライブラリー（これらの多くは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ．から市販されている）をスクリーニングすることにより、他の植物種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、ダイズ、ヒマワリ、およびトウモロコシを含む）から単離され得る。ペルオキシソーム標的配列Ｐ−Ｒ−Ｍは、このタンパク質のカルボキシ末端で同定された。植物の細胞質ゾル中での発現に適切な構築物は、この配列を欠失するよう設計されたプライマーを使用する、この遺伝子のＰＣＲ増幅により調製され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の代謝を操作するための方法であって、該植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする導入遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物および哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍからなる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする、細菌、真菌、酵母、植物、または動物起源の遺伝子を発現する工程をさらに含み、ここで、これらの遺伝子によってコードされる該酵素が、前記植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアに対して指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞の代謝を操作する方法において使用するためのＤＮＡ構築物であって、
（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配列；および
（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、該非翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコードする、３’非翻訳領域、を同じ相で含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、種子特異的プロモーターである、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモーター、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタンパク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、増強されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
トランスジェニック植物において、ポリヒドロキシアルカノエートの生物学的生成を増強するための方法であって、該植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて異種の脂肪酸β−酸化酵素をコードする遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウモロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、カラシ、アマ、タバコ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素をコードする異種の遺伝子を含む、トランスジェニック植物またはその一部。
【請求項１４】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物、および哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１５】
前記脂肪酸酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、およびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍからなる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１６】
前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢである、請求項１５に記載の植物またはその一部。
【請求項１７】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ レダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡ ヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１８】
前記植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウモロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、カラシ、アマ、タバコ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１９】
（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配列；および
（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、ここで該非翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコードする、３’非翻訳領域、を同じ相で含むＤＮＡ構築物を含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項２０】
前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２１】
前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモーター、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタンパク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２２】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２３】
前記プロモーターが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、増強されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２４】
植物における種子生産を、予防または抑制する方法であって、該植物の細胞質ゾル、またはペルオキシソーム、グリオキシソーム以外のプラスチド、またはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素をコードする異種の遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【請求項１】
植物の代謝を操作するための方法であって、該植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする導入遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物および哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓおよびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍからなる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする、細菌、真菌、酵母、植物、または動物起源の遺伝子を発現する工程をさらに含み、ここで、これらの遺伝子によってコードされる該酵素が、前記植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアに対して指向される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞の代謝を操作する方法において使用するためのＤＮＡ構築物であって、
（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配列；および
（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、該非翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコードする、３’非翻訳領域、を同じ相で含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、種子特異的プロモーターである、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモーター、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタンパク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、増強されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
トランスジェニック植物において、ポリヒドロキシアルカノエートの生物学的生成を増強するための方法であって、該植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて異種の脂肪酸β−酸化酵素をコードする遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記トランスジェニック植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウモロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、カラシ、アマ、タバコ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物の細胞質ゾル、ペルオキシソームまたはグリオキシソーム以外のプラスチド、あるいはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素をコードする異種の遺伝子を含む、トランスジェニック植物またはその一部。
【請求項１４】
前記脂肪酸β−酸化酵素が、細菌、酵母、真菌、植物、および哺乳動物からなる群から選択される遺伝子から発現される、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１５】
前記脂肪酸酸化酵素が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、およびＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍからなる群から選択される細菌由来の遺伝子から発現される、請求項１４に記載の植物またはその一部。
【請求項１６】
前記遺伝子が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｆａｏＡＢである、請求項１５に記載の植物またはその一部。
【請求項１７】
ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、アセトアセチル−ＣｏＡ レダクターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡ チオラーゼ、およびエノイル−ＣｏＡ ヒドラターゼからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１８】
前記植物が、Ｂｒａｓｓｉｃａ、トウモロコシ、ダイズ、綿実、ヒマワリ、ヤシ、ココヤシ、ベニバナ、ラッカセイ、カラシ、アマ、タバコ、およびアルファルファからなる群から選択される、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項１９】
（ａ）植物において機能的なプロモーター領域；
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸β−酸化酵素活性をコードする構造的ＤＮＡ配列；および
（ｃ）植物において天然に発現される遺伝子の３’非翻訳領域であって、ここで該非翻訳領域が、ｍＲＮＡのポリアデニル化についてのシグナル配列をコードする、３’非翻訳領域、を同じ相で含むＤＮＡ構築物を含む、請求項１３に記載の植物またはその一部。
【請求項２０】
前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２１】
前記種子特異的プロモーターが、ナピンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、オレオシンプロモーター、２Ｓアルブミンプロモーター、ゼインプロモーター、β−コングリシニンプロモーター、アシルキャリアタンパク質プロモーター、および脂肪酸デサチュラーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２２】
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１９に記載の植物またはその一部。
【請求項２３】
前記プロモーターが、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、増強されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびユビキチンプロモーターからなる群から選択される、請求項２０に記載の植物またはその一部。
【請求項２４】
植物における種子生産を、予防または抑制する方法であって、該植物の細胞質ゾル、またはペルオキシソーム、グリオキシソーム以外のプラスチド、またはミトコンドリアにおいて脂肪酸β−酸化酵素をコードする異種の遺伝子を発現する工程を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公開番号】特開２００９−２９１２０４（Ｐ２００９−２９１２０４Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８１２５５（Ｐ２００９−１８１２５５）
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【分割の表示】特願２０００−５３４６５３（Ｐ２０００−５３４６５３）の分割
【原出願日】平成１１年３月５日（１９９９．３．５）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【分割の表示】特願２０００−５３４６５３（Ｐ２０００−５３４６５３）の分割
【原出願日】平成１１年３月５日（１９９９．３．５）
【出願人】（３９８０５５２３３）メタボリックス，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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