植物の鉄輸送能を強化する遺伝子
【課題】カドミウム等の金属存在下においても、これらに阻害されることなく鉄を特異的に輸送可能な担体タンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子により形質転換してカドミウム等の金属存在下においても生育に十分な鉄を吸収して健全に生育し、カドミウム蓄積量が低減された植物体を得る。当該形質転換植物体により環境修復を行う方法を提供する。
【解決手段】ヘビノネゴザ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子により植物を形質転換する。また、カドミウム蓄積能を有する植物を当該遺伝子により形質転換し、ハイパーアキュームレーターを得て、環境修復を行う。
【解決手段】ヘビノネゴザ由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子により植物を形質転換する。また、カドミウム蓄積能を有する植物を当該遺伝子により形質転換し、ハイパーアキュームレーターを得て、環境修復を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の鉄輸送能を強化する遺伝子に関する。さらに詳述すると、本発明は、ヘビノネゴザ由来の鉄輸送担体タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することにより鉄輸送能が強化された植物体並びにこれを利用した環境修復方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、広範囲に拡散した比較的低濃度の様々な汚染物質を、長期間にわたり低コストで穏やかに処理できる新しい技術としてファイトリメディエーション（植物による環境修復）が注目されている。理論的にはハイパーアキュームレーター（特定元素高濃度蓄積種）と呼ばれる数種類の既存の植物を用いて重金属の吸収・除去が可能であると考えられており、実用化に向けて様々な汚染物質に対する適用植物種の拡大、処理能力の向上を目的とした研究、特に、従来の育種法では困難な全く別の形質を付与しうる遺伝子組換え技術を用いた様々な研究が行われている。
【０００３】
例えば特許文献１では、ＡＢＣトランスポーターに属する輸送体タンパク質の一つであるＭＲＰ１（multidrug resistance-associated protein １）をコードする遺伝子を植物内に導入することにより、植物に重金属化合物や細胞毒有機化合物耐性を与えて、該耐性付与植物を汚染環境中で生育させることにより汚染環境中から重金属化合物や細胞毒有機化合物を回収する技術が開示されている。また、特許文献２では、酵母由来のｚｒｃｌ遺伝子を導入して重金属の蓄積能を強化した植物体により、重金属に汚染された土壌を浄化する技術が開示されている。
【０００４】
一方、近年の分子生物学的な研究の進展により、重金属の中でも特に河川・土壌等の拡散量と人体への健康への影響が大きいカドミウムについて、植物への吸収機構に関する様々な報告がなされている。例えば、一般的な植物ではカドミウムにより鉄の吸収が阻害されて鉄欠乏状態に陥る（カドミウム誘導性鉄欠乏）ことが報告されている（非特許文献１）。また、鉄輸送担体遺伝子の一つであるＩＲＴやＮｒａｍｐがコードする鉄輸送担体タンパク質が、植物の生育に必須な元素である鉄と共にカドミウムも吸収することが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。
【特許文献１】特開２００３−２１００５７
【特許文献２】特開２００４−２７５０５１
【非特許文献１】Marschner H (1995) Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd edn, Academic press, London, UK
【非特許文献２】Korshnova YO et al. (1999) Plant Mol Biol 40 p37-44
【非特許文献３】Thomine S et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 p4991-4996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１及び特許文献２に開示された技術により、カドミウム等の重金属耐性・蓄積能を植物体に付与することは可能である。しかしながら、植物の生育にとって必須である鉄を十分に取り込めなければ、植物は鉄欠乏状態に陥ってしまい、その生育状態に悪影響が及ぼされる。
【０００６】
また、ＩＲＴやＮｒａｍｐがコードする鉄輸送担体タンパク質が、植物の生育に必須な元素である鉄と共にカドミウムも吸収することにより、生育に十分な量の鉄を取り込めなくなり、生育状態に悪影響が及ぼされる虞がある。
【０００７】
そこで、本発明は、カドミウム等の陽イオン金属存在下においても、これらに阻害されることなく鉄を特異的に輸送可能な担体タンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子により形質転換してカドミウム等の金属存在下においても生育に十分な鉄を吸収して健全に生育し、カドミウム蓄積量が低減された植物体を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに本発明は、形質転換植物体により環境修復を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる目的を達成するため、本願発明者は、高カドミウム耐性を有するヘビノネゴザ（Athyrium yokoscense）について、組織培養法を確立し、その機能を解明するために鋭意研究を重ねた。その結果、ヘビノネゴザの高カドミウム耐性は、その鉄輸送担体タンパク質が鉄に対して特異的に親和することにより、カドミウムを吸収する確率が非常に低くなるという機構に起因するものであることを知見した。
【００１０】
本発明は係る知見に基づくものであって、請求項１に記載の発明は、
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
をコードする遺伝子である。
【００１１】
ここで、「鉄と特異的に親和する」とは、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属に曝露された条件下であっても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する輸送担体として機能することを意味している。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
である。
【００１３】
上記タンパク質は、鉄輸送担体として機能し、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、
（ｃ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ、または
（ｄ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ若しくはこれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる遺伝子である。
【００１５】
上記遺伝子は、鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする。したがって、本遺伝子を持つ植物は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する輸送担体を有するようになり、必須元素である鉄を取り込みやすくなる。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、請求項１又は３に記載の遺伝子を含有する形質転換された植物細胞である。当該植物細胞から、請求項５に記載の植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫が得られる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、生育に十分な量の鉄を取り込んで良好な生育状態を保ち、人体にとって非常に有害な元素であるカドミウムの蓄積量が少ない植物を提供することが可能となる。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、環境汚染物質蓄積能をさらに有することを特徴とする植物細胞であり、当該植物細胞から、請求項７に記載の植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫が得られる。
【００１８】
環境汚染物質蓄積能のみを有していても、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下では必須元素である鉄を十分に取り込むことが出来なくなり、生育不良に陥る虞があるが、本発明の遺伝子を含有することで、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても鉄と特異的に親和する輸送担体が機能し、植物の生育に十分な量の鉄を取り込むことが可能となる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても良好な生育状態を保ち、しかも環境汚染物質蓄積能をも有する植物を提供することが可能となる。
【００１９】
ここで、環境汚染物質とは、カドミウム、コバルト、ニッケル、銅、鉛、亜鉛、水銀、クロム、ヒ素、マンガン、セレン、スズ、アンチモンである。
【００２０】
請求項８に記載の発明は、請求項１又は３に記載の遺伝子を組み込んだベクターで形質転換してなる宿主細胞を培養し、培養物中に蓄積されるタンパク質を採取するというものである。これにより、請求項２に記載のタンパク質を得ることが出来る。
【００２１】
請求項９に記載の発明は、請求項７に記載の植物を用いて、土壌から環境汚染物質を除去することを特徴とする環境修復方法である。上記したように、請求項７に記載の植物は環境汚染物質蓄積能及びカドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下であっても植物の生育に十分な鉄を取り込む機能を有する植物であり、この植物をハイパーアキュームレーターとして用いることで、効率よくファイトリメディエーションを行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても鉄と特異的に親和して、これらとほとんど親和することのない輸送担体タンパク質をコードする遺伝子を提供することが可能となる。また、当該遺伝子を含有する形質転換された植物体は、土壌中にカドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても植物にとって必須元素である鉄の吸収が阻害されない。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下にあっても良好な生育状態を保ち、しかも人体にとって非常に有害な元素であるカドミウムの蓄積量が少ない植物を提供することが可能となる。さらに、環境汚染物質蓄積能を有し、且つ本発明の遺伝子を含有する形質転換された植物体は、その生育に十分な量の鉄を吸収しつつ、環境汚染物質も吸収するので、優れたハイパーアキュームレータとなり、当該ハイパーアキュームレーターにより、土壌から環境汚染物質を効率よく除去することが可能となる。
【００２３】
また、本発明の鉄輸送担体タンパク質は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても、鉄と特異的に親和するので、鉄濃度を測定するセンサーや鉄濃度による分子スイッチ（イオンコンデンサー）として利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、ヘビノネゴザから得られる、（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２６】
ここで、上記「数個」とは、配列番号２においては、好ましくは２０４個以下、より好ましくは１２８個以下、さらに好ましくは５１個以下、特に好ましくは１０個以下である。配列番号４においては、好ましくは１５４個以下、より好ましくは９６個以下、さらに好ましくは３９個以下、特に好ましくは１０個以下である。配列番号６においては、好ましくは２７個以下、より好ましくは１７個以下、特に好ましくは７個以下である。配列番号８においては２７個以下、より好ましくは１７個以下、特に好ましくは７個以下である。
【００２７】
ここで、（ａ）のタンパク質は鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質であり、（ｂ）のタンパク質は（ａ）のタンパク質の１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもののうち、鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質であることを意味している。
【００２８】
上記タンパク質は、これらをコードする遺伝子や、配列番号１，３，５又は７の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、その遺伝子を大腸菌、酵母、昆虫細胞などの適当な宿主中で発現させることにより、生産することができる。ここで、使用するベクタ−システムとしては、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＹＥＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＩＺＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＶｉｒａＰｏｗｅｒアデノウィルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。宿主としては、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＩＮＶＳｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｆ９（Ｎｏｖａｇｅｎ）などが挙げられる。また、別のタンパク質生産方法として、無細胞タンパク質発現系が挙げられる。無細胞タンパク質発現系の例としては、例えば、ラピッドトランスレーションシステム（ロッシュ社）などを挙げることができる。
【００２９】
このようにして得られたタンパク質は、人工基盤や膜上に固定することで、鉄の濃度を測定するセンサー、鉄濃度による分子スイッチ（イオンコンデンサー）として利用可能である。
【００３０】
次に、本発明の遺伝子は例えば以下の様にして得ることが可能である。まず、ヘビノネゴザ或いはヘビノネゴザカルスからｔｏｔａｌＲＮＡ抽出を行い、これを用いてｍＲＮＡを精製した後、市販のキットによりｃＤＮＡライブラリ−を構築する。ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法としては、例えばＣＴＡＢとＰＶＰを用いたＪａａｋｏｌａらの多糖質の材料からの高品質ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法（Jaakola L. et al. (2001) Mol Biotechnol. 19 p201-3）が挙げられるが、これに限られるものではない。一方、配列番号１、３、５又は７の塩基配列に基づいて、市販のキットにより、ＤＩＧプローブまたは放射性プローブを作製し、ストリンジェントな条件でコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。
【００３１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件を言い、相同性が高いＤＮＡ同士、即ち６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。具体的には、塩類等を含む一般的なハイブリダイゼーション用バッファーの存在下において５０℃〜７０℃の条件とすればよく、好ましくは５５℃〜７０℃、さらに好ましくは６０℃〜７０℃の条件が挙げられる。
【００３２】
次に、本発明の遺伝子を含有する形質転換された植物体を得る方法について説明する。
【００３３】
本発明の遺伝子を発現させるための発現調節エレメントであるプロモーター或いはエンハンサーとして、植物細胞において本発明の遺伝子を発現しうる任意のもの、例えばアグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植物細胞内で発現する遺伝子を含む植物、植物ウイルス、細菌由来のプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの例として、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来のプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、桂皮アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、Ｎｏｓプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、植物由来のアクチンやヒストン等のプロモーター或いはエンハンサーおよび公知である種々の植物遺伝子からのその他の転写開始領域が包含される。例えば、植物由来のプロモーター或いはエンハンサーを適宜選択することにより、本発明の遺伝子を植物全体、または特定の器官、例えば、葉や根などにおいて発現させることができる。
【００３４】
また、本発明の遺伝子を効率よく発現させるために、遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドコーディング領域の３′末端にポリ(Ａ)＋配列を包含させるのが好ましい。ポリ(Ａ)＋配列は、種々の植物遺伝子またはＴ−ＤＮＡ由来のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、所望の遺伝子を高レベルにて発現させるのに有用な他の配列、例えば特定の遺伝子のイントロン配列、５′不翻訳領域の配列などを組換え発現ベクターに包含させることができる。
【００３５】
組換え発現ベクターには、選択マーカー遺伝子として種々の抗生物質耐性遺伝子や他のマーカー遺伝子をコードする配列を包含させるのが好ましい。マーカー遺伝子の例には、抗スペクチノマイシン遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（SPT）遺伝子）、カナマイシンまたはジェネティシン耐性のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子、ハイグロマイシン耐性のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）遺伝子、アセト乳酸合成酵素（ALS）を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子、グルタミン合成酵素を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子（例えばbar 遺伝子）、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が包含される。
【００３６】
また、高等植物の遺伝子発現に有用な代表的なベクターは当該技術分野においてよく知られており、 Rogers et al., Methods Enzymol., 153: pp.253-277 (1987)に記載されるAgrobacterium tumefaciensのＴｉプラスミド由来のベクターなどのベクターＤＮＡの一部を植物細胞に導入した際に宿主植物のゲノムに組込みうるベクター、例えばＴｉプラスミド由来のｐＫＹＬＸ６、ｐＫＹＬＸ７、ｐＢＩ１０１、ｐＢＨ２１１３、ｐＢＩ１２１（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）およびこれらから当該技術分野における標準的技術を用いて誘導し得る組換えプラスミドが含まれる。
【００３７】
組換え発現ベクターは、外来性遺伝子を植物細胞に導入するための公知の方法、例えばパーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などの微生物媒介トランスフェクション法を用いて所望の植物細胞に導入することができる。植物細胞においては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法およびアグロバクテリウム法が好ましく、アグロバクテリウム法が特に好ましい（Bechtold N. & Pelletier G., Methods Mol. Biol. 82, pp.259-266, 1998）。
【００３８】
上述のように植物に導入された本発明の遺伝子は、宿主の植物細胞のゲノムに組み込まれ、後の世代まで安定的に保持される。故に、本発明は、上記植物細胞から再生される植物体とその部分並びにその繁殖体（例えば種子や無性生殖体）および子孫を包含する。
【００３９】
また、別の形質転換方法として、細胞融合が挙げられる。この場合には、ヘビノネゴザ細胞と融合させたい植物細胞の細胞壁を酵素により分解し、プロトプラスト化する。次に、細胞融合促進剤としてポリエチレングリコールを加えて、二つのプロトプラストを効率よく融合させることにより、二つの細胞核も融合して一つになる。これにより、ヘビノネゴザ及び融合させたい植物細胞の遺伝子を併せ持つ核が生じて、この融合細胞を培養、生育することにより、所望の植物体が得られる。
【００４０】
尚、遺伝子組み換えや細胞融合を用いずとも、ヘビノネゴザを他の近親の植物と交配させ、最終的に所望の植物と交配させるようにすることで、遺伝子組み換えを用いることなく、ヘビノネゴザ由来の鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子を含有する植物体を得るようにしても良い。
【００４１】
上述の方法により形質転換された植物は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属に阻害されることなく、生育に十分な量の鉄を吸収することができる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下存在下でもこれらの影響を受けずに生育に十分な量の鉄を吸収して良好な生育状態を保つ植物体を得ることが可能となる。しかも、人体にとって非常に有害な元素であるカドミウム蓄積量が減少するので、カドミウム汚染された土地を浄化することなく、農地等として採用してもカドミウムの蓄積量が少ない作物の作出して食用に供することが可能となる。さらに、植物体の特定の部分のみのカドミウム蓄積量を減少させることも可能であり、例えば、可食部のカドミウム蓄積量を減少させるといったことも可能である。
【００４２】
また、上記植物体を環境汚染土壌で生育することで、汚染された土壌の飛散を防いで環境汚染物質の拡散を防ぐことも可能である。さらに、環境汚染土壌を緑で覆うことにより、景観を良好なものに保って、人々に安心感を与えることもできる。
【００４３】
次に、環境汚染物質蓄積能を有し、且つ本発明の遺伝子を含有する植物体について説明する。
【００４４】
環境汚染物質蓄積能を有する植物は、例えば、本願発明者が先に出願した特願２００４−２６００９１のファイトリメディエーション用植物種の選抜方法や、Yoshihara, T., Shoji K., Goto F., Screening for the Cd hyperaccumulator/ Ultra-low-accumulator from major herbal angiosperms in Japan. In: Plant nutrition for food security, human health and environmental protection (Eds. Li, CJ et al., Proc. 2005 IPNC, Beijing, China) pp.750-751.に記載の方法、電中研報告書U03521（吉原利一、後藤文之、庄子和博、カドミウムやホウ素に耐性・蓄積能をもつ草本性被子植物の探索）に記載の方法により選抜することができる。
【００４５】
具体的には、種々の植物の種子を、植物の生育に必要な栄養塩、環境汚染物質の吸収・蓄積に影響を及ぼすと考えられる微量金属元素およびほとんどの植物において成長を阻害される濃度の前記環境汚染物質を含む培地または土壌、並びに植物の生育に必要な栄養塩、環境汚染物質の吸収・蓄積に影響を及ぼすと考えられる微量金属元素を含む培地または土壌にそれぞれ播種し、発芽生育後、植物の地上部および根部について環境汚染物質の蓄積量を測定し、環境汚染物質を含む場合と含まない場合における環境汚染物質の植物の地上部および根部における蓄積量の比から環境汚染物質の蓄積能を評価して選抜する。
【００４６】
環境汚染物質がカドミウムの場合について例を挙げると、上記選抜方法により、地上部に高いカドミウム蓄積能力を有する種はアキノノゲシなどのキク科植物であり、根部に高いカドミウム蓄積能力を有する種はイグサであることが確認されているが、これらの植物はカドミウム耐性が低いことも確認されている。したがって、これら植物を本発明の遺伝子を含有するよう上述の方法で形質転換することにより、多量のカドミウムを吸収しつつ、しかも、生育に必須な鉄をも十分に吸収して生育状態を良好に保つ非常に優れたハイパーアキュームレーターを得ることが可能となる。
【００４７】
また、本願発明者が先に出願した特開２００４−０１６１３０に開示の技術を用いてもよい。具体的には、環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子を構築し、これを用いてトランスジェニック植物を作製することにより、高い環境汚染物質蓄積能を有する植物体を得ることができる。環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドとしては、メタロチオイネン、フェリチン、トランスフェリン、ポリヒスチジン、ニッケリン、ファイトキレーチン、Ｚα４人工ペプチド、ほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質およびこれらの金属結合性フラグメントが挙げられる。
【００４８】
したがって、上記植物体を本発明の遺伝子を含有するようにさらに形質転換することにより、或いは本発明の遺伝子を含有するように形質転換された植物体を環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子によりさらに形質転換することにより、環境汚染物質を多量に吸収しつつ、しかも、生育に必須な鉄をも十分に吸収して生育状態を良好に保つ非常に優れたハイパーアキュームレーターを得ることが可能となる。
【００４９】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、環境汚染物質蓄積能を有する植物は、上記以外の方法により得るようにしても良い。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
＜１：カルス及び再分化植物体培養＞
ヘビノネゴザ（Athyrium yokoscense）は、栃木県足尾町の足尾銅山跡において採集したものを供試植物とした。また、対照植物として、カドミウムに対する耐性・蓄積能に関して一般的な性質を持つと考えられているタバコ（Nicotiana tabacum L. BY-2）を用いた。
【００５２】
供試植物であるヘビノネゴザは、カルスを誘導した後、２００１年９月以来液体振とう培養により継代を続けているもの、あるいは誘導したカルスから再び植物体に再分化させたものを用いた（Yoshihara, T. et al. (2005a) Plant Cell Rep 23 p579-585 ）。対照植物であるタバコは、植物体を滅菌後、５ｍｍ角程度の葉片をＭＳ固形培地に定置して約１ヶ月間培養することによってカルスを誘導した後、ゲランガムを除いたＭＳ液体培地（増殖用ＭＳ培地）を用いて振とう培養（100rpm）により増殖させたものを用いた。尚、培養環境条件は全て周期光照射（約4000lux、12時間明期/12時間暗期）、温度は２５±１℃とした。また、培地は約１０日〜２週間に１回の頻度で交換した。尚、ＭＳ固形培地には、カイネチン０．１ｐｐｍ、２,４−Ｄ １ｐｐｍ、３％シュークロースと０．２％ゲランガムを添加し、ｐＨ６．０としたものを用いた（Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Plant 15 p473-497）。
【００５３】
＜２：カドミウム曝露下におけるカルス生育＞
上述の培養方法により得られたヘビノネゴザカルスとタバコカルスを、０μＭ、１００μＭの２種類のＣｄＳＯ４添加増殖用ＭＳ培地によりそれぞれ６週間培養し、その増殖量を調査した結果を図１に示す。培養開始時のカルス量は、ヘビノネゴザカルスについては生鮮重量として３ｇ均一、タバコカルスについては極端に軟弱で水分含有量が多いため容積として２０ｍｌ均一とした。増殖量の算定は、ヘビノネゴザカルスは生鮮重量として秤量、タバコカルスは１５０００ｇの遠心操作により容積として、あるいは吸引濾過後により生鮮重量として秤量するとともに、得られたカルスについて６５℃、３日間の乾燥後、乾燥重量として再度秤量した。培養環境条件は上述したものと同様とした。
【００５４】
図１において、◇はヘビノネゴザカルス、■はタバコカルスの相対的生育量を示す。ここで、相対的生育量とはカドミウムを添加しない増殖用ＭＳ培地で生育した量を１として換算した場合の生育量を意味する。尚、本実施例におけるデータは、それぞれ平均値と標準偏差を求め、各実験区間の差異についてStudentのt検定法、Tukeyの多重比較検定法のいずれかの方法により有意性を判定した。これらの計算には統計形算用ソフトウェア（KyplotR ver.3.0, （株）カイエンス）を用いた。対照に用いたタバコカルスはカドミウム曝露により増殖が著しく抑制され、６週間後には相対的生育量が０．２、つまり、カドミウム曝露を行わない場合に比べて２０％程度しか増殖しなかった。一方、ヘビノネゴザカルスは、６週間後においても、カドミウム曝露を行わない場合と変わらない生育量を示した。したがって、誘導、増殖させたヘビノネゴザカルスは、その生育において、カドミウムの影響を全く受けていないことが確認された。
【００５５】
＜３：ファイトキレーチン合成酵素（ＰＣＳ）遺伝子の発現に及ぼすカドミウムの影響＞
１００μＭのＣｄＳＯ４を添加した培地において０日、１日、３日、５日、７日および１２日生育させたヘビノネゴザカルスおよびタバコカルス、あるいは０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのＣｄＳＯ４をそれぞれ添加した培地において１週間生育させたヘビノネゴザカルスおよびタバコカルスからｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってファイトキレーチン合成酵素（ＰＣＳ）遺伝子の発現に及ぼすカドミウムの影響を調べた。尚、ファイトキレーチンは、カドミウムをキレート化可能な低分子の非タンパク質性ポリペプチドであり、カドミウム耐性に関与するポリペプチドである。ヘビノネゴザカルスのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出は、ＣＴＡＢとＰＶＰを用いたＪａａｋｏｌａらの多糖質の材料からの高品質ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法より行った（Jaakola L. et al. (2001) Mol Biotechnol. 19 p201-3）。タバコカルスのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出は、市販のＴｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen、USA）により行った。これらのｔｏｔａｌＲＮＡとＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いて、市販のキット（Rever-tra Ace kit、TOYOBO）により逆転写反応を行い、それぞれのｃＤＮＡを得て、これらｃＤＮＡとＧｅｎＢａｎｋに登録されている既知の配列であるAY235426、AB057412から設計したそれぞれのＰＣＳ遺伝子に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、発現量の解析に用いた。発現量の解析には、画像解析装置（Image Reader LAS-2000、FUJIFILM）を用いた。尚、別途同様にそれぞれのアクチン（ACT）遺伝子の発現量を解析しておき、ＰＣＳ遺伝子の発現量を標準化した。以下にそれぞれのＰＣＳ遺伝子、ＡＣＴ遺伝子の発現量を解析するための特異プライマーセットの配列を列挙する。
AyPCs1F 5'-GCAAGGTTGCTGCCAAGGTG-3'（配列番号９）
AyPCs1R 5'-CTAGGTTTCCTCACTGCATGACC-3'（配列番号１０）
NtPCs1F 5'-GCTTTTCGCCCTAATCATAGTA-3'（配列番号１１）
NtPCs1R 5'-TGACCCAACTCTCATGTTTA-3'（配列番号１２）
AyAc1F 5'-CGACATACAGGTGTGATGGGT-3'（配列番号１３）
AyAc1R 5'-GCTTGAATAGCGACATACAT-3'（配列番号１４）
NtAc1F 5'-TCAGAAAGATGCCTATGTGGGA-3'（配列番号１５）
NtAc1R 5'-TGGCAACGTACATAGCTGGG-3'（配列番号１６）
【００５６】
図２にヘビノネゴザカルス及びタバコカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現に及ぼすカドミウム（１００μＭ）の影響を示す。図２において、（Ｂ）は画像解析装置によりえられた発現量データであり、（Ａ）は（Ｂ）の画像に基づいて数値化したデータである。□はタバコカルス、◆はヘビノネゴザカルスのＡＣＴ遺伝子発現量を１としたときのＰＣＳ発現量（相対的ＰＣＳ発現量）を表す。１００μＭのカドミウム曝露条件下においてヘビノネゴザカルスではほとんどＰＣＳ遺伝子の発現量に変化が認められなかったのに対して、タバコカルスでは曝露開始後１日目にＰＣＳ遺伝子の発現量が２倍以上に増加した後、漸減して１２日目にはほぼ元の発現量に戻るという変化を示した。
【００５７】
図３に０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのカドミウム曝露条件下で１週間培養したヘビノネゴザカルスのＰＣＳ遺伝子の発現量を示す。０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのカドミウム曝露条件下で１週間培養した場合にも、ヘビノネゴザではＰＣＳ遺伝子の発現量にはほとんど変化が認められなかった。したがってヘビノネゴザではＰＣＳがカドミウムの耐性に関与している可能性は低く、カドミウム耐性をＰＣＳ以外の別の機構により得ていることが考えられた。
【００５８】
＜４：カドミウム曝露下におけるカルス中必須金属元素の含有量＞
上述の方法により培養したヘビノネゴザカルスとタバコカルスを、０μＭ（ＭＳ）、１０μＭ（Ｃｄ１０）、１００μＭ（Ｃｄ１００）のＣｄＳＯ４添加増殖用ＭＳ培地、Ｆｅ無添加（ΔＦｅ）増殖用ＭＳ培地にてそれぞれ１週間生育させたヘビノネゴザカルス及びタバコカルスの必須金属元素（カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛）の含有量を、ＩＣＰ（P4000、Hitachi、Japan）を用いて分析した結果を図４に示す。尚、培養環境条件は上述した条件と同様とした。また、ＩＣＰ測定用試料液は、上述した条件下で育成したカルスをそれぞれ６５℃／３昼夜以上乾燥して、乾燥重量を測定後に湿式灰化を行い（吉原ら、U97042）、灰化試料を蒸発乾固後して得られた残査に１５ｍＬの１Ｎ塩酸を加えて溶解して作製した。
【００５９】
図４において、縦軸の相対濃度とは、各々カドミウムを含まない培地（ＭＳ）で増殖したカルスにおける値を１として計算した値である。また、（ａ）はカルシウム、（ｂ）は銅、（ｃ）は鉄、（ｄ）はマグネシウム、（ｅ）はマンガン、（ｆ）は亜鉛の結果を示している。ヘビノネゴザカルスでは、カドミウム曝露によって（ａ）カルシウム、（ｄ）マグネシウム、（ｅ）マンガン含有量が有意に低下したのに対し、タバコカルスでは、（ｃ）鉄含有量だけが有意な低下を示し、カドミウム曝露によって影響を受ける元素が異なることが明らかとなった。すなわち、ヘビノネゴザカルスでは（ａ）カルシウムが約２０〜２５％、（ｄ）マグネシウムが約１５〜２５％、（ｅ）マンガンが約３０〜３５％低下したのに対して、タバコカルスでは（ｃ）鉄だけが約５０〜６０％低下した。一般的な植物ではカドミウムにより鉄の吸収が阻害されて鉄欠乏に陥る（カドミウム誘導性鉄欠乏）ことが報告されており（Marschner H (1995) Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd edn, Academic press, London, UK）、タバコカルスの鉄含有量の低下はこれを顕著に物語っている。しかし、ヘビノネゴザカルスではカドミウム曝露によって鉄ではなく、カルシウム、マグネシウムおよびマンガンの含有量が低下した。これは、ヘビノネゴザカルスにおいては、カドミウムによりマグネシウム、カルシウムおよびマンガンの吸収が阻害されることを示唆している。ただし、カドミウムの有無にかかわらずヘビノネゴザカルスは旺盛に生育したことから、これらの元素の欠乏症に陥るほど吸収は阻害されない。したがって、ヘビノネゴザカルスにおける鉄輸送担体は、他の植物の鉄輸送担体に比べて鉄に対する特異性が非常に高く、カドミウム存在下においても、カドミウムに阻害されることなく、生育に十分な量の鉄を吸収できることが判明した。
【００６０】
＜５：ヘビノネゴザ鉄吸収関連遺伝子の単離と発現に及ぼすカドミウムの影響＞
ヘビノネゴザカルスからｔｏｔａｌＲＮＡを抽出してｃＤＮＡ化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ヘビノネゴザｔｏｔａｌＲＮＡは、鉄分を除いた培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルスより、先に示したＪａａｋｏｌａらのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法に従って抽出し、逆転写反応を行って各遺伝子ホモログの部分シークエンス単離用のｃＤＮＡを得た。また、各遺伝子ホモログの完全長シークエンスを単離するために、別途同様にして得られたヘビノネゴザｔｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。尚、ｃＤＮＡライブラリーの作製には、得られたｔｏｔａｌＲＮＡよりＭＡＣＳ Ｃｏｌｕｍｎ Ｔｙｐｅμ（第一化学薬品）を用いてｍＲＮＡを精製した後、Ｃｒｅａｔｏｒ ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリー作製キット（BD Bioscience Clontech）を使用した。
【００６１】
次に、アラビドプシスなどにおいて既に配列の知られている鉄とカドミウム双方の輸送に関連しているとの報告があるＧｅｎＢａｎｋに登録されている元素輸送担体遺伝子の既知の配列（IRT；NM_118089、AF065444、AF246266、AB126086、AB126087、AB070226、AJ320253： Nramp；L41217、NM_106731、NM_103618、NM_101464、AY196091： YSL；AY515566、AY515565、AY515560、AY512583、AP003936、CA758396）に、それぞれ特異的な共通配列を探索し、ディジェネレートプライマーを設計・作製した。以下にそのディジェネレートプライマーを列挙して示す。
degAyIRTF 5'-CCKTGGYMTAARTTYCCTTTYBCBGG-3'（配列番号１７）
degAyIRTR 5'-GARTGWRMYAHRATBCCAASYTCCARNACC-3'（配列番号１８）
degAyNrampF 5'-ATGCCBCAYAAYVTSTWYYTVCAYTCRGC-3’（配列番号１９）
degAyNrampR 5'-ATVGTVSWRCTCTGHCCMGMWGC-3’（配列番号２０）
degAyYSLF 5'-MMRCCNTTYACWMRNCARGAGAAYAC-3'（配列番号２１）
degAyYSLR 5'-CWGTDGCNRWWCCACTNGGRTA-3'（配列番号２２）
【００６２】
これらのプライマーと先に示した部分シークエンス単離用のｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＴＡクローニングキット(Invitrogen)によりｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られた断片は、部分シークエンスとしてＤＮＡシーケンサー（ABIモデル3100）によって配列を解析した後、既知の遺伝子と比較してシークエンスに類似性が認められたものをヘビノネゴザにおける各遺伝子ホモログの部分シークエンスとしてｃＤＮＡライブラリーからの完全長シークエンス単離のためのプローブ作製に用いた。完全長シークエンス単離のためのプローブは、先に示した部分シークエンスから設計し直したプライマーを用いてＰＣＲ−ＤＩＧラベル法により作製した（DIG DNA Labeling and Detection Kit、Roche）。プローブ用、ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲによる発現解析用プライマーの位置（配列）は、各完全長配列中に示した。図５〜図８において、１Ｆと１ＲはリアルタイムＰＣＲ用プライマー、２Ｆと２Ｒはプローブ作成およびＲＴ−ＰＣＲ用プライマーである。また、図５〜図６において、四角で囲んだ部分は開始コドン及び終始コドンであり、陰付きの四角で囲んだ部分は鉄の輸送に関連すると考えられている共通配列を示している。ｃＤＮＡライブラリーからの完全長ｃＤＮＡの単離はこのプローブを用いて定法にしたがって行った（真壁和裕(1997) バイオ実験イラストレイテッド 第4巻 苦労なしのクローニング、秀潤社）。得られたクローンはＤＮＡシーケンサー（ABIモデル3100）によって配列の解析を行い、先に示した既知のホモログとの比較を行った。
【００６３】
ヘビノネゴザから単離した３種類の元素輸送担体遺伝子ホモログについてＲＴ−ＰＣＲ法、あるいはリアルタイムＰＣＲ法を用いてカドミウム曝露条件下における発現解析を行った。具体的には、１００μＭあるいは４００μＭの２種類のＣｄＳＯ４を添加した培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルス、および成植物体からｔｏｔａｌＲＮＡをカルス、根、地上部の部分毎に上述のＪａａｋｏｌａらのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法に従って抽出し、逆転写反応によって得たｃＤＮＡをテンプレートに用いた。また、別途鉄欠乏培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルス、および成植物体より得たｔｏｔａｌＲＮＡを用いて同様の操作を行い、カドミウム曝露条件下におけるこれらの遺伝子の発現と比較した。
【００６４】
単離したホモログのうち、ＡｙＮｒａｍｐ１（配列番号１：全長1903bp、ORF1530bp、510AA）、ＡｙＩＲＴ１（配列番号３：全長1878bp、ORF1152bp、384AA）の２種類については完全長遺伝子であった。ＡｙＹＳＬ１（配列番号５：全長301bp）、ＡｙＹＳＬ２（配列番号７：全長295bp）についてはいずれもＯＲＦの部分遺伝子と考えられた。これらのうち、特に完全長を単離できたＡｙＩＲＴ１、およびＡｙＮｒａｍｐ１について、それぞれアラビドプシスにおいて配列が明かとなっているホモログＡｔＩＲＴ１、およびＡｔＮｒａｍｐ３とアミノ酸配列の相同性を比較した。その結果を図９〜図１１に示す。図９において、（ａ）はヘビノネゴザＡｙＩＲＴ１のタンパク質膜構造、（ｂ）はアラビドプシスＡｔＩＲＴ１タンパク質膜構造を示す。図１０において、（ａ）はヘビノネゴザＡｙＮｒａｍｐ１のタンパク質膜構造、（ｂ）はアラビドプシスＡｔＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造を示す。また、図１１において、（Ａ）は植物由来のＮｒａｍｐとの比較、（Ｂ）は動物由来のＮｒａｍｐとの比較を示す。尚、図１１において、ＧｍＤＭＴはダイズ、ＬｅＮｒａｍｐはトマト、ＯｓＮｒａｍｐはイネ、ＨｓＤＭＴはヒト、ＭｍＮｒａｍｐはマウス、ＯｍＮｒａｍｐはニジマス、ＴｒＤＭＴはトラフグである。ＡｔＩＲＴ１のアミノ酸配列とＡｙＩＲＴ１のアミノ酸配列の相同性は４４．０％、ＡｔＮｒａｍｐ１のアミノ酸配列とＡｙＮｒａｍｐ１のアミノ酸配列の相同性は６７．３％であり、相同性はそれほど高くはなかったが、アラビドプシスにおけるＤ１００、Ｅ１０３及びＣ１０９を除いて、いずれにおいてもアラビドプシス（Rogers EE et al. (2000) PNAS 97 p12356-12360）やマウス（Lam-Yuk-Tseung et al. (2003) BLOOD 101 p3699-3707）において示されている鉄吸収に強く関連したアミノ酸配列が全て保存されていた。また、図１１に示すように、ＡｙＮｒａｍｐ１については、そのアミノ酸配列が植物におけるものよりも動物におけるものに類似しており、図１１中の矢印で示されるように、これまで配列が明らかにされている植物のＮｒａｍｐにおいては全てイソロイシンであるアミノ酸が、ヘビノネゴザでは動物と同じメチオニンに変わっていた。
【００６５】
次に、タンパク質膜構造については、図９に示すアラビドプシスＡｔＩＲＴ１タンパク質膜構造においては、８ヶ所の膜貫通領域があるのに対し、ヘビノネゴザＡｙＩＲＴ１タンパク質膜構造における膜貫通領域は２ヶ所少ない６ヶ所であった。図１０に示すアラビドプシスＡｔＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造においては、１１ヶ所の膜貫通領域があるのに対し、ヘビノネゴザＡｙＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造における膜貫通領域は２ヶ所少ない９ヶ所であった。尚、図９及び図１０において、１は膜外領域、２は膜貫通領域、３は膜内領域を示している。また、上記の「保存されている鉄吸収に強く関連したアミノ酸配列」に着目すると、例えば、ＡｙＩＲＴのＨ２３６、Ｓ２３７、Ｈ２６３、Ｅ２６７とＡｔＩＲＴのＨ１９７、Ｓ１９８、Ｈ２２４、Ｅ２２８において示されるように膜の内外における存在を反対にしているものも多かった。
【００６６】
次に、ヘビノネゴザカルスおよび成植物体を鉄欠乏処理、カドミウム曝露し、単離したこれらの４つの遺伝子について発現変化を調べた。結果を図１２〜図１４に示す。図１２に示すように、ヘビノネゴザカルスにおいては、いずれの遺伝子においても強い鉄欠乏処理によって（２週間の鉄欠乏処理）有意な発現の増加が認められた。即ち、鉄欠乏応答性があることが確認された。尚、図１２において、（ａ）は通常の増殖用ＭＳ培地で増殖させた場合、（ｂ）は増殖用ＭＳ培地から鉄を除いて１週間増殖させた場合、（ｃ）は増殖用ＭＳ培地から鉄を除いて２週間増殖させた場合である。次に、図１３に示すように、カドミウムを曝露した場合にもＡｙＹＳＬ１、ＡｙＹＳＬ２については発現の増加が認められたが、ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１については有意な発現の増加は認められなかった。尚、図１３において、（ａ）は通常の増殖用ＭＳ培地で増殖させた場合、（ｂ）はカドミウムを１００μＭ添加した培地で１週間増殖させた場合、（ｃ）はカドミウムを４００μＭ添加した培地で１週間増殖させた場合である。また、図１４に示すように、成植物体を用いた実験では、全ての遺伝子において根、植物体地上部ともに1週間の鉄欠乏処理（ΔＦｅ）、あるいはカドミウム曝露（＋Ｃｄ）によって有意な発現の変化は認められなかった。尚、図１４において、（ａ）ＡｙＩＲＴ１、（ｂ）はＡｙＹＳＬ１、（ｃ）はＡｙＹＳＬ２、（ｄ）はＡｙＮｒａｍｐ１である。
【００６７】
＜６：ヘビノネゴザ鉄吸収関連遺伝子を過剰発現した形質転換酵母におけるカドミウム耐性の向上＞
ヘビノネゴザから全長を単離することができた２つの遺伝子（ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１）のＯＲＦ部分をＰＣＲによって増幅し、配列を確認後、酵母発現ベクター（pYES2.1vector/Invtrogen）を介して酵母（BY4741株）に導入した。酵母の形質転換は、Dohlmanの示す方法に従った（Dohlman HG (2002) "Lazy Bones" Plasmid Transformation, A quick method for plasmid transformation into yeast. http://www.med.unc.edu/~hdohlman/lazybones.html）。具体的には、酵母をＳＤ寒天培地（BD bioscience・Clonetech）にて培養して単菌株を単離し、キャリアーＤＮＡと単離した遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、および形質転換溶液（４０％ ポリエチレングリコール、０．１Ｍ 酢酸リチウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を混合して一晩静置した後、４２℃でヒートショックを行い形質転換した。さらにこの混合液を、ウラシルを除いたＳＤ寒天培地において培養し、得られた菌株についてコロニーＰＣＲ法によって導入遺伝子の確認を行った。尚、プライマーはＲＴ−ＰＣＲ法で用いたものと同じ配列のものを用いた。
【００６８】
上記により得られた菌株（AyIRT1、AyNramp1）と非形質転換株(WT)のカドミウム耐性を調査した。カドミウム耐性の検定には、ウラシルを除いたＳＤ寒天培地を基本培地として、これに０μＭ、３０μＭのＣｄＳＯ４を添加した培地を用い、１／１、１／１０、１／１００及び１／１０００に希釈した株（希釈率は６００ｎｍの吸光度により確認）を滴下して、３０℃において２〜５日間の培養の後、コロニーの形成状態を非形質転換系統と比較した。また、蓄積能については、３０μＭのＣｄＳＯ４を添加した同組成の液体培地（１００ｍｌ培地を５００ｍｌコルベンに分注、振とう強度１４０ｒｐｍ、３０℃において５日間培養）においてこれらの形質転換酵母系統を増殖させ、集菌後５００μＭ ＣａＣｌ２バッファーに顕濁・洗浄後、遠心操作により再集菌して、ＩＣＰ（P4000、 Hitachi、 Japan）による金属濃度の分析のためのサンプルとした。
【００６９】
上記により得られた形質転換株（ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１）と非形質転換株（ＷＴ）とをそれぞれ数株ずつカドミウムを含む培地に接種し、その生育を調べた結果を図１５に示す。（ａ）はカドミウム無添加培地で２日間生育させた結果、（ｂ）はカドミウムを３０μＭ添加した培地で５日間生育させた結果である。いずれの形質転換株においても形質転換しない酵母株に比べて明らかに生育が良好であった。また、これらの株におけるカドミウム、および鉄含有量を調べた結果を図１６に示す（ａ）は鉄濃度（含有量）、（ｂ）はカドミウム濃度（含有量）、（ｃ）は鉄に対するカドミウム量をモル比で表した図である。尚、図１５及び図１６において、ＷＴ５はｐＹＥＳ酵母形質転換用ベクターのみ導入したコントロール系統、ＡｙＩＲＴ１−５はＡｙＩＲＴ１を用いて形質転換した系統、ＡｙＮｒａｍｐ１−５はＡｙＮｒａｍｐ１を用いて形質転換した系統を表している。カドミウム含有量はＡｙＩＲＴ１−５形質転換株では約９０μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株では約２０μｇ／ｇ−ＦＷであるのに対し、非形質転換株であるＷＴ５では約２００μｇ／ｇ−ＦＷであった。鉄含有量はＷＴ５で８μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＩＲＴ１−５形質転換株で７μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株で１０μｇ／ｇ−ＦＷであり、形質転換株と非形質転換株とで鉄の吸収量にそれほど大きな差異は認められなかった。これは、本実施例で用いた培地中に鉄が十分に存在したため、鉄の供給量が十分であったことによるものであると考えられる。また、Ｃｄ／Ｆｅ値に関しては、形質転換株の方が小さかった。すなわち、いずれの形質転換株においても１分子の鉄を得るために混入するカドミウム分子の数が非形質転換株よりも少ないことが明らかとなった。この傾向はＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株において特に顕著であった。以上より、ＡｙＮｒａｍｐ１、ＡｙＩＲＴ１により形質転換することで、カドミウム存在下においても生育に必須な鉄と特異的に親和するようになって、良好に生育する。即ち、植物体のカドミウム耐性を強化することが可能である。さらには、カドミウムの蓄積量も低減される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】カドミウム（１００μＭ）曝露条件下におけるヘビノネゴザカルスとタバコカルスの生育を示す図である。◇はヘビノネゴザカルスの相対的生育量、■はタバコの相対的生育量を示す。
【図２】ヘビノネゴザカルスとタバコカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現に及ぼすカドミウム（１００μＭ）の影響を示す図である。
【図３】種々のカドミウム曝露条件下において生育したヘビノネゴザカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現を示す。
【図４】ヘビノネゴザカルスとタバコカルスにおけるカドミウム曝露による金属元素の含有量変化を示す図である。（ａ）はカルシウム、（ｂ）は銅、（ｃ）は鉄、（ｄ）はマグネシウム、（ｅ）はマンガン、（ｆ）は亜鉛についての結果である。
【図５】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＮｒａｍｐ１：配列番号１）の配列である。
【図６】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＩＲＴ１：配列番号３）の配列である。
【図７】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＹＳＬ１：配列番号５）の配列である。
【図８】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＹＳＬ２：配列番号７）の配列である。
【図９】ＩＲＴタンパク質膜構造比較を示す図である。
【図１０】Ｎｒａｍｐタンパク質膜構造比較を示す図である。
【図１１】種々の生物のＮｒａｍｐにおけるアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１２】ヘビノネゴザカルスにおける鉄欠乏条件下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１３】ヘビノネゴザカルスにおけるカドミウム曝露下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１４】ヘビノネゴザ成植物体におけるカドミウム曝露下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１５】ＡｙＩＲＴ１及びＡｙＮｒａｍｐ１により形質転換した酵母におけるカドミウム耐性を示す図である。
【図１６】ＡｙＩＲＴ１及びＡｙＮｒａｍｐ１により形質転換した酵母における（ａ）鉄濃度、（ｂ）カドミウム濃度、（ｃ）Ｃｄ／Ｆｅ（ｍｏｌ比）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の鉄輸送能を強化する遺伝子に関する。さらに詳述すると、本発明は、ヘビノネゴザ由来の鉄輸送担体タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することにより鉄輸送能が強化された植物体並びにこれを利用した環境修復方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、広範囲に拡散した比較的低濃度の様々な汚染物質を、長期間にわたり低コストで穏やかに処理できる新しい技術としてファイトリメディエーション（植物による環境修復）が注目されている。理論的にはハイパーアキュームレーター（特定元素高濃度蓄積種）と呼ばれる数種類の既存の植物を用いて重金属の吸収・除去が可能であると考えられており、実用化に向けて様々な汚染物質に対する適用植物種の拡大、処理能力の向上を目的とした研究、特に、従来の育種法では困難な全く別の形質を付与しうる遺伝子組換え技術を用いた様々な研究が行われている。
【０００３】
例えば特許文献１では、ＡＢＣトランスポーターに属する輸送体タンパク質の一つであるＭＲＰ１（multidrug resistance-associated protein １）をコードする遺伝子を植物内に導入することにより、植物に重金属化合物や細胞毒有機化合物耐性を与えて、該耐性付与植物を汚染環境中で生育させることにより汚染環境中から重金属化合物や細胞毒有機化合物を回収する技術が開示されている。また、特許文献２では、酵母由来のｚｒｃｌ遺伝子を導入して重金属の蓄積能を強化した植物体により、重金属に汚染された土壌を浄化する技術が開示されている。
【０００４】
一方、近年の分子生物学的な研究の進展により、重金属の中でも特に河川・土壌等の拡散量と人体への健康への影響が大きいカドミウムについて、植物への吸収機構に関する様々な報告がなされている。例えば、一般的な植物ではカドミウムにより鉄の吸収が阻害されて鉄欠乏状態に陥る（カドミウム誘導性鉄欠乏）ことが報告されている（非特許文献１）。また、鉄輸送担体遺伝子の一つであるＩＲＴやＮｒａｍｐがコードする鉄輸送担体タンパク質が、植物の生育に必須な元素である鉄と共にカドミウムも吸収することが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。
【特許文献１】特開２００３−２１００５７
【特許文献２】特開２００４−２７５０５１
【非特許文献１】Marschner H (1995) Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd edn, Academic press, London, UK
【非特許文献２】Korshnova YO et al. (1999) Plant Mol Biol 40 p37-44
【非特許文献３】Thomine S et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 p4991-4996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１及び特許文献２に開示された技術により、カドミウム等の重金属耐性・蓄積能を植物体に付与することは可能である。しかしながら、植物の生育にとって必須である鉄を十分に取り込めなければ、植物は鉄欠乏状態に陥ってしまい、その生育状態に悪影響が及ぼされる。
【０００６】
また、ＩＲＴやＮｒａｍｐがコードする鉄輸送担体タンパク質が、植物の生育に必須な元素である鉄と共にカドミウムも吸収することにより、生育に十分な量の鉄を取り込めなくなり、生育状態に悪影響が及ぼされる虞がある。
【０００７】
そこで、本発明は、カドミウム等の陽イオン金属存在下においても、これらに阻害されることなく鉄を特異的に輸送可能な担体タンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子により形質転換してカドミウム等の金属存在下においても生育に十分な鉄を吸収して健全に生育し、カドミウム蓄積量が低減された植物体を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに本発明は、形質転換植物体により環境修復を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる目的を達成するため、本願発明者は、高カドミウム耐性を有するヘビノネゴザ（Athyrium yokoscense）について、組織培養法を確立し、その機能を解明するために鋭意研究を重ねた。その結果、ヘビノネゴザの高カドミウム耐性は、その鉄輸送担体タンパク質が鉄に対して特異的に親和することにより、カドミウムを吸収する確率が非常に低くなるという機構に起因するものであることを知見した。
【００１０】
本発明は係る知見に基づくものであって、請求項１に記載の発明は、
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
をコードする遺伝子である。
【００１１】
ここで、「鉄と特異的に親和する」とは、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属に曝露された条件下であっても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する輸送担体として機能することを意味している。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
である。
【００１３】
上記タンパク質は、鉄輸送担体として機能し、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、
（ｃ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ、または
（ｄ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ若しくはこれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる遺伝子である。
【００１５】
上記遺伝子は、鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする。したがって、本遺伝子を持つ植物は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、これらとほとんど親和することなく鉄と特異的に親和する輸送担体を有するようになり、必須元素である鉄を取り込みやすくなる。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、請求項１又は３に記載の遺伝子を含有する形質転換された植物細胞である。当該植物細胞から、請求項５に記載の植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫が得られる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても、生育に十分な量の鉄を取り込んで良好な生育状態を保ち、人体にとって非常に有害な元素であるカドミウムの蓄積量が少ない植物を提供することが可能となる。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、環境汚染物質蓄積能をさらに有することを特徴とする植物細胞であり、当該植物細胞から、請求項７に記載の植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫が得られる。
【００１８】
環境汚染物質蓄積能のみを有していても、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下では必須元素である鉄を十分に取り込むことが出来なくなり、生育不良に陥る虞があるが、本発明の遺伝子を含有することで、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても鉄と特異的に親和する輸送担体が機能し、植物の生育に十分な量の鉄を取り込むことが可能となる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても良好な生育状態を保ち、しかも環境汚染物質蓄積能をも有する植物を提供することが可能となる。
【００１９】
ここで、環境汚染物質とは、カドミウム、コバルト、ニッケル、銅、鉛、亜鉛、水銀、クロム、ヒ素、マンガン、セレン、スズ、アンチモンである。
【００２０】
請求項８に記載の発明は、請求項１又は３に記載の遺伝子を組み込んだベクターで形質転換してなる宿主細胞を培養し、培養物中に蓄積されるタンパク質を採取するというものである。これにより、請求項２に記載のタンパク質を得ることが出来る。
【００２１】
請求項９に記載の発明は、請求項７に記載の植物を用いて、土壌から環境汚染物質を除去することを特徴とする環境修復方法である。上記したように、請求項７に記載の植物は環境汚染物質蓄積能及びカドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下であっても植物の生育に十分な鉄を取り込む機能を有する植物であり、この植物をハイパーアキュームレーターとして用いることで、効率よくファイトリメディエーションを行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても鉄と特異的に親和して、これらとほとんど親和することのない輸送担体タンパク質をコードする遺伝子を提供することが可能となる。また、当該遺伝子を含有する形質転換された植物体は、土壌中にカドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属が存在しても植物にとって必須元素である鉄の吸収が阻害されない。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下にあっても良好な生育状態を保ち、しかも人体にとって非常に有害な元素であるカドミウムの蓄積量が少ない植物を提供することが可能となる。さらに、環境汚染物質蓄積能を有し、且つ本発明の遺伝子を含有する形質転換された植物体は、その生育に十分な量の鉄を吸収しつつ、環境汚染物質も吸収するので、優れたハイパーアキュームレータとなり、当該ハイパーアキュームレーターにより、土壌から環境汚染物質を効率よく除去することが可能となる。
【００２３】
また、本発明の鉄輸送担体タンパク質は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下においても、鉄と特異的に親和するので、鉄濃度を測定するセンサーや鉄濃度による分子スイッチ（イオンコンデンサー）として利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、ヘビノネゴザから得られる、（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２６】
ここで、上記「数個」とは、配列番号２においては、好ましくは２０４個以下、より好ましくは１２８個以下、さらに好ましくは５１個以下、特に好ましくは１０個以下である。配列番号４においては、好ましくは１５４個以下、より好ましくは９６個以下、さらに好ましくは３９個以下、特に好ましくは１０個以下である。配列番号６においては、好ましくは２７個以下、より好ましくは１７個以下、特に好ましくは７個以下である。配列番号８においては２７個以下、より好ましくは１７個以下、特に好ましくは７個以下である。
【００２７】
ここで、（ａ）のタンパク質は鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質であり、（ｂ）のタンパク質は（ａ）のタンパク質の１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもののうち、鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質であることを意味している。
【００２８】
上記タンパク質は、これらをコードする遺伝子や、配列番号１，３，５又は７の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、その遺伝子を大腸菌、酵母、昆虫細胞などの適当な宿主中で発現させることにより、生産することができる。ここで、使用するベクタ−システムとしては、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＹＥＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｐＩＺＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＶｉｒａＰｏｗｅｒアデノウィルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。宿主としては、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＩＮＶＳｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｆ９（Ｎｏｖａｇｅｎ）などが挙げられる。また、別のタンパク質生産方法として、無細胞タンパク質発現系が挙げられる。無細胞タンパク質発現系の例としては、例えば、ラピッドトランスレーションシステム（ロッシュ社）などを挙げることができる。
【００２９】
このようにして得られたタンパク質は、人工基盤や膜上に固定することで、鉄の濃度を測定するセンサー、鉄濃度による分子スイッチ（イオンコンデンサー）として利用可能である。
【００３０】
次に、本発明の遺伝子は例えば以下の様にして得ることが可能である。まず、ヘビノネゴザ或いはヘビノネゴザカルスからｔｏｔａｌＲＮＡ抽出を行い、これを用いてｍＲＮＡを精製した後、市販のキットによりｃＤＮＡライブラリ−を構築する。ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法としては、例えばＣＴＡＢとＰＶＰを用いたＪａａｋｏｌａらの多糖質の材料からの高品質ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法（Jaakola L. et al. (2001) Mol Biotechnol. 19 p201-3）が挙げられるが、これに限られるものではない。一方、配列番号１、３、５又は７の塩基配列に基づいて、市販のキットにより、ＤＩＧプローブまたは放射性プローブを作製し、ストリンジェントな条件でコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。
【００３１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件を言い、相同性が高いＤＮＡ同士、即ち６０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。具体的には、塩類等を含む一般的なハイブリダイゼーション用バッファーの存在下において５０℃〜７０℃の条件とすればよく、好ましくは５５℃〜７０℃、さらに好ましくは６０℃〜７０℃の条件が挙げられる。
【００３２】
次に、本発明の遺伝子を含有する形質転換された植物体を得る方法について説明する。
【００３３】
本発明の遺伝子を発現させるための発現調節エレメントであるプロモーター或いはエンハンサーとして、植物細胞において本発明の遺伝子を発現しうる任意のもの、例えばアグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植物細胞内で発現する遺伝子を含む植物、植物ウイルス、細菌由来のプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの例として、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡ由来のプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、桂皮アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、Ｎｏｓプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーター、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、植物由来のアクチンやヒストン等のプロモーター或いはエンハンサーおよび公知である種々の植物遺伝子からのその他の転写開始領域が包含される。例えば、植物由来のプロモーター或いはエンハンサーを適宜選択することにより、本発明の遺伝子を植物全体、または特定の器官、例えば、葉や根などにおいて発現させることができる。
【００３４】
また、本発明の遺伝子を効率よく発現させるために、遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドコーディング領域の３′末端にポリ(Ａ)＋配列を包含させるのが好ましい。ポリ(Ａ)＋配列は、種々の植物遺伝子またはＴ−ＤＮＡ由来のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、所望の遺伝子を高レベルにて発現させるのに有用な他の配列、例えば特定の遺伝子のイントロン配列、５′不翻訳領域の配列などを組換え発現ベクターに包含させることができる。
【００３５】
組換え発現ベクターには、選択マーカー遺伝子として種々の抗生物質耐性遺伝子や他のマーカー遺伝子をコードする配列を包含させるのが好ましい。マーカー遺伝子の例には、抗スペクチノマイシン遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（SPT）遺伝子）、カナマイシンまたはジェネティシン耐性のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子、ハイグロマイシン耐性のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）遺伝子、アセト乳酸合成酵素（ALS）を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子、グルタミン合成酵素を阻害する除草剤に対する耐性遺伝子（例えばbar 遺伝子）、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が包含される。
【００３６】
また、高等植物の遺伝子発現に有用な代表的なベクターは当該技術分野においてよく知られており、 Rogers et al., Methods Enzymol., 153: pp.253-277 (1987)に記載されるAgrobacterium tumefaciensのＴｉプラスミド由来のベクターなどのベクターＤＮＡの一部を植物細胞に導入した際に宿主植物のゲノムに組込みうるベクター、例えばＴｉプラスミド由来のｐＫＹＬＸ６、ｐＫＹＬＸ７、ｐＢＩ１０１、ｐＢＨ２１１３、ｐＢＩ１２１（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）およびこれらから当該技術分野における標準的技術を用いて誘導し得る組換えプラスミドが含まれる。
【００３７】
組換え発現ベクターは、外来性遺伝子を植物細胞に導入するための公知の方法、例えばパーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などの微生物媒介トランスフェクション法を用いて所望の植物細胞に導入することができる。植物細胞においては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法およびアグロバクテリウム法が好ましく、アグロバクテリウム法が特に好ましい（Bechtold N. & Pelletier G., Methods Mol. Biol. 82, pp.259-266, 1998）。
【００３８】
上述のように植物に導入された本発明の遺伝子は、宿主の植物細胞のゲノムに組み込まれ、後の世代まで安定的に保持される。故に、本発明は、上記植物細胞から再生される植物体とその部分並びにその繁殖体（例えば種子や無性生殖体）および子孫を包含する。
【００３９】
また、別の形質転換方法として、細胞融合が挙げられる。この場合には、ヘビノネゴザ細胞と融合させたい植物細胞の細胞壁を酵素により分解し、プロトプラスト化する。次に、細胞融合促進剤としてポリエチレングリコールを加えて、二つのプロトプラストを効率よく融合させることにより、二つの細胞核も融合して一つになる。これにより、ヘビノネゴザ及び融合させたい植物細胞の遺伝子を併せ持つ核が生じて、この融合細胞を培養、生育することにより、所望の植物体が得られる。
【００４０】
尚、遺伝子組み換えや細胞融合を用いずとも、ヘビノネゴザを他の近親の植物と交配させ、最終的に所望の植物と交配させるようにすることで、遺伝子組み換えを用いることなく、ヘビノネゴザ由来の鉄輸送担体として機能するタンパク質をコードする遺伝子を含有する植物体を得るようにしても良い。
【００４１】
上述の方法により形質転換された植物は、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属に阻害されることなく、生育に十分な量の鉄を吸収することができる。したがって、カドミウム、ニッケル、マンガン、亜鉛、銅などの金属存在下存在下でもこれらの影響を受けずに生育に十分な量の鉄を吸収して良好な生育状態を保つ植物体を得ることが可能となる。しかも、人体にとって非常に有害な元素であるカドミウム蓄積量が減少するので、カドミウム汚染された土地を浄化することなく、農地等として採用してもカドミウムの蓄積量が少ない作物の作出して食用に供することが可能となる。さらに、植物体の特定の部分のみのカドミウム蓄積量を減少させることも可能であり、例えば、可食部のカドミウム蓄積量を減少させるといったことも可能である。
【００４２】
また、上記植物体を環境汚染土壌で生育することで、汚染された土壌の飛散を防いで環境汚染物質の拡散を防ぐことも可能である。さらに、環境汚染土壌を緑で覆うことにより、景観を良好なものに保って、人々に安心感を与えることもできる。
【００４３】
次に、環境汚染物質蓄積能を有し、且つ本発明の遺伝子を含有する植物体について説明する。
【００４４】
環境汚染物質蓄積能を有する植物は、例えば、本願発明者が先に出願した特願２００４−２６００９１のファイトリメディエーション用植物種の選抜方法や、Yoshihara, T., Shoji K., Goto F., Screening for the Cd hyperaccumulator/ Ultra-low-accumulator from major herbal angiosperms in Japan. In: Plant nutrition for food security, human health and environmental protection (Eds. Li, CJ et al., Proc. 2005 IPNC, Beijing, China) pp.750-751.に記載の方法、電中研報告書U03521（吉原利一、後藤文之、庄子和博、カドミウムやホウ素に耐性・蓄積能をもつ草本性被子植物の探索）に記載の方法により選抜することができる。
【００４５】
具体的には、種々の植物の種子を、植物の生育に必要な栄養塩、環境汚染物質の吸収・蓄積に影響を及ぼすと考えられる微量金属元素およびほとんどの植物において成長を阻害される濃度の前記環境汚染物質を含む培地または土壌、並びに植物の生育に必要な栄養塩、環境汚染物質の吸収・蓄積に影響を及ぼすと考えられる微量金属元素を含む培地または土壌にそれぞれ播種し、発芽生育後、植物の地上部および根部について環境汚染物質の蓄積量を測定し、環境汚染物質を含む場合と含まない場合における環境汚染物質の植物の地上部および根部における蓄積量の比から環境汚染物質の蓄積能を評価して選抜する。
【００４６】
環境汚染物質がカドミウムの場合について例を挙げると、上記選抜方法により、地上部に高いカドミウム蓄積能力を有する種はアキノノゲシなどのキク科植物であり、根部に高いカドミウム蓄積能力を有する種はイグサであることが確認されているが、これらの植物はカドミウム耐性が低いことも確認されている。したがって、これら植物を本発明の遺伝子を含有するよう上述の方法で形質転換することにより、多量のカドミウムを吸収しつつ、しかも、生育に必須な鉄をも十分に吸収して生育状態を良好に保つ非常に優れたハイパーアキュームレーターを得ることが可能となる。
【００４７】
また、本願発明者が先に出願した特開２００４−０１６１３０に開示の技術を用いてもよい。具体的には、環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子を構築し、これを用いてトランスジェニック植物を作製することにより、高い環境汚染物質蓄積能を有する植物体を得ることができる。環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドとしては、メタロチオイネン、フェリチン、トランスフェリン、ポリヒスチジン、ニッケリン、ファイトキレーチン、Ｚα４人工ペプチド、ほ乳類プラズマ金属輸送タンパク質およびこれらの金属結合性フラグメントが挙げられる。
【００４８】
したがって、上記植物体を本発明の遺伝子を含有するようにさらに形質転換することにより、或いは本発明の遺伝子を含有するように形質転換された植物体を環境汚染物質に対して結合能を有するオリゴまたはポリペプチドおよびアポプラズマ輸送シグナルを含むポリペプチドをコードする核酸分子によりさらに形質転換することにより、環境汚染物質を多量に吸収しつつ、しかも、生育に必須な鉄をも十分に吸収して生育状態を良好に保つ非常に優れたハイパーアキュームレーターを得ることが可能となる。
【００４９】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、環境汚染物質蓄積能を有する植物は、上記以外の方法により得るようにしても良い。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
＜１：カルス及び再分化植物体培養＞
ヘビノネゴザ（Athyrium yokoscense）は、栃木県足尾町の足尾銅山跡において採集したものを供試植物とした。また、対照植物として、カドミウムに対する耐性・蓄積能に関して一般的な性質を持つと考えられているタバコ（Nicotiana tabacum L. BY-2）を用いた。
【００５２】
供試植物であるヘビノネゴザは、カルスを誘導した後、２００１年９月以来液体振とう培養により継代を続けているもの、あるいは誘導したカルスから再び植物体に再分化させたものを用いた（Yoshihara, T. et al. (2005a) Plant Cell Rep 23 p579-585 ）。対照植物であるタバコは、植物体を滅菌後、５ｍｍ角程度の葉片をＭＳ固形培地に定置して約１ヶ月間培養することによってカルスを誘導した後、ゲランガムを除いたＭＳ液体培地（増殖用ＭＳ培地）を用いて振とう培養（100rpm）により増殖させたものを用いた。尚、培養環境条件は全て周期光照射（約4000lux、12時間明期/12時間暗期）、温度は２５±１℃とした。また、培地は約１０日〜２週間に１回の頻度で交換した。尚、ＭＳ固形培地には、カイネチン０．１ｐｐｍ、２,４−Ｄ １ｐｐｍ、３％シュークロースと０．２％ゲランガムを添加し、ｐＨ６．０としたものを用いた（Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Plant 15 p473-497）。
【００５３】
＜２：カドミウム曝露下におけるカルス生育＞
上述の培養方法により得られたヘビノネゴザカルスとタバコカルスを、０μＭ、１００μＭの２種類のＣｄＳＯ４添加増殖用ＭＳ培地によりそれぞれ６週間培養し、その増殖量を調査した結果を図１に示す。培養開始時のカルス量は、ヘビノネゴザカルスについては生鮮重量として３ｇ均一、タバコカルスについては極端に軟弱で水分含有量が多いため容積として２０ｍｌ均一とした。増殖量の算定は、ヘビノネゴザカルスは生鮮重量として秤量、タバコカルスは１５０００ｇの遠心操作により容積として、あるいは吸引濾過後により生鮮重量として秤量するとともに、得られたカルスについて６５℃、３日間の乾燥後、乾燥重量として再度秤量した。培養環境条件は上述したものと同様とした。
【００５４】
図１において、◇はヘビノネゴザカルス、■はタバコカルスの相対的生育量を示す。ここで、相対的生育量とはカドミウムを添加しない増殖用ＭＳ培地で生育した量を１として換算した場合の生育量を意味する。尚、本実施例におけるデータは、それぞれ平均値と標準偏差を求め、各実験区間の差異についてStudentのt検定法、Tukeyの多重比較検定法のいずれかの方法により有意性を判定した。これらの計算には統計形算用ソフトウェア（KyplotR ver.3.0, （株）カイエンス）を用いた。対照に用いたタバコカルスはカドミウム曝露により増殖が著しく抑制され、６週間後には相対的生育量が０．２、つまり、カドミウム曝露を行わない場合に比べて２０％程度しか増殖しなかった。一方、ヘビノネゴザカルスは、６週間後においても、カドミウム曝露を行わない場合と変わらない生育量を示した。したがって、誘導、増殖させたヘビノネゴザカルスは、その生育において、カドミウムの影響を全く受けていないことが確認された。
【００５５】
＜３：ファイトキレーチン合成酵素（ＰＣＳ）遺伝子の発現に及ぼすカドミウムの影響＞
１００μＭのＣｄＳＯ４を添加した培地において０日、１日、３日、５日、７日および１２日生育させたヘビノネゴザカルスおよびタバコカルス、あるいは０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのＣｄＳＯ４をそれぞれ添加した培地において１週間生育させたヘビノネゴザカルスおよびタバコカルスからｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってファイトキレーチン合成酵素（ＰＣＳ）遺伝子の発現に及ぼすカドミウムの影響を調べた。尚、ファイトキレーチンは、カドミウムをキレート化可能な低分子の非タンパク質性ポリペプチドであり、カドミウム耐性に関与するポリペプチドである。ヘビノネゴザカルスのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出は、ＣＴＡＢとＰＶＰを用いたＪａａｋｏｌａらの多糖質の材料からの高品質ｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法より行った（Jaakola L. et al. (2001) Mol Biotechnol. 19 p201-3）。タバコカルスのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出は、市販のＴｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen、USA）により行った。これらのｔｏｔａｌＲＮＡとＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いて、市販のキット（Rever-tra Ace kit、TOYOBO）により逆転写反応を行い、それぞれのｃＤＮＡを得て、これらｃＤＮＡとＧｅｎＢａｎｋに登録されている既知の配列であるAY235426、AB057412から設計したそれぞれのＰＣＳ遺伝子に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、発現量の解析に用いた。発現量の解析には、画像解析装置（Image Reader LAS-2000、FUJIFILM）を用いた。尚、別途同様にそれぞれのアクチン（ACT）遺伝子の発現量を解析しておき、ＰＣＳ遺伝子の発現量を標準化した。以下にそれぞれのＰＣＳ遺伝子、ＡＣＴ遺伝子の発現量を解析するための特異プライマーセットの配列を列挙する。
AyPCs1F 5'-GCAAGGTTGCTGCCAAGGTG-3'（配列番号９）
AyPCs1R 5'-CTAGGTTTCCTCACTGCATGACC-3'（配列番号１０）
NtPCs1F 5'-GCTTTTCGCCCTAATCATAGTA-3'（配列番号１１）
NtPCs1R 5'-TGACCCAACTCTCATGTTTA-3'（配列番号１２）
AyAc1F 5'-CGACATACAGGTGTGATGGGT-3'（配列番号１３）
AyAc1R 5'-GCTTGAATAGCGACATACAT-3'（配列番号１４）
NtAc1F 5'-TCAGAAAGATGCCTATGTGGGA-3'（配列番号１５）
NtAc1R 5'-TGGCAACGTACATAGCTGGG-3'（配列番号１６）
【００５６】
図２にヘビノネゴザカルス及びタバコカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現に及ぼすカドミウム（１００μＭ）の影響を示す。図２において、（Ｂ）は画像解析装置によりえられた発現量データであり、（Ａ）は（Ｂ）の画像に基づいて数値化したデータである。□はタバコカルス、◆はヘビノネゴザカルスのＡＣＴ遺伝子発現量を１としたときのＰＣＳ発現量（相対的ＰＣＳ発現量）を表す。１００μＭのカドミウム曝露条件下においてヘビノネゴザカルスではほとんどＰＣＳ遺伝子の発現量に変化が認められなかったのに対して、タバコカルスでは曝露開始後１日目にＰＣＳ遺伝子の発現量が２倍以上に増加した後、漸減して１２日目にはほぼ元の発現量に戻るという変化を示した。
【００５７】
図３に０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのカドミウム曝露条件下で１週間培養したヘビノネゴザカルスのＰＣＳ遺伝子の発現量を示す。０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよび３０００μＭのカドミウム曝露条件下で１週間培養した場合にも、ヘビノネゴザではＰＣＳ遺伝子の発現量にはほとんど変化が認められなかった。したがってヘビノネゴザではＰＣＳがカドミウムの耐性に関与している可能性は低く、カドミウム耐性をＰＣＳ以外の別の機構により得ていることが考えられた。
【００５８】
＜４：カドミウム曝露下におけるカルス中必須金属元素の含有量＞
上述の方法により培養したヘビノネゴザカルスとタバコカルスを、０μＭ（ＭＳ）、１０μＭ（Ｃｄ１０）、１００μＭ（Ｃｄ１００）のＣｄＳＯ４添加増殖用ＭＳ培地、Ｆｅ無添加（ΔＦｅ）増殖用ＭＳ培地にてそれぞれ１週間生育させたヘビノネゴザカルス及びタバコカルスの必須金属元素（カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛）の含有量を、ＩＣＰ（P4000、Hitachi、Japan）を用いて分析した結果を図４に示す。尚、培養環境条件は上述した条件と同様とした。また、ＩＣＰ測定用試料液は、上述した条件下で育成したカルスをそれぞれ６５℃／３昼夜以上乾燥して、乾燥重量を測定後に湿式灰化を行い（吉原ら、U97042）、灰化試料を蒸発乾固後して得られた残査に１５ｍＬの１Ｎ塩酸を加えて溶解して作製した。
【００５９】
図４において、縦軸の相対濃度とは、各々カドミウムを含まない培地（ＭＳ）で増殖したカルスにおける値を１として計算した値である。また、（ａ）はカルシウム、（ｂ）は銅、（ｃ）は鉄、（ｄ）はマグネシウム、（ｅ）はマンガン、（ｆ）は亜鉛の結果を示している。ヘビノネゴザカルスでは、カドミウム曝露によって（ａ）カルシウム、（ｄ）マグネシウム、（ｅ）マンガン含有量が有意に低下したのに対し、タバコカルスでは、（ｃ）鉄含有量だけが有意な低下を示し、カドミウム曝露によって影響を受ける元素が異なることが明らかとなった。すなわち、ヘビノネゴザカルスでは（ａ）カルシウムが約２０〜２５％、（ｄ）マグネシウムが約１５〜２５％、（ｅ）マンガンが約３０〜３５％低下したのに対して、タバコカルスでは（ｃ）鉄だけが約５０〜６０％低下した。一般的な植物ではカドミウムにより鉄の吸収が阻害されて鉄欠乏に陥る（カドミウム誘導性鉄欠乏）ことが報告されており（Marschner H (1995) Mineral Nutrition of Higher Plants, 2nd edn, Academic press, London, UK）、タバコカルスの鉄含有量の低下はこれを顕著に物語っている。しかし、ヘビノネゴザカルスではカドミウム曝露によって鉄ではなく、カルシウム、マグネシウムおよびマンガンの含有量が低下した。これは、ヘビノネゴザカルスにおいては、カドミウムによりマグネシウム、カルシウムおよびマンガンの吸収が阻害されることを示唆している。ただし、カドミウムの有無にかかわらずヘビノネゴザカルスは旺盛に生育したことから、これらの元素の欠乏症に陥るほど吸収は阻害されない。したがって、ヘビノネゴザカルスにおける鉄輸送担体は、他の植物の鉄輸送担体に比べて鉄に対する特異性が非常に高く、カドミウム存在下においても、カドミウムに阻害されることなく、生育に十分な量の鉄を吸収できることが判明した。
【００６０】
＜５：ヘビノネゴザ鉄吸収関連遺伝子の単離と発現に及ぼすカドミウムの影響＞
ヘビノネゴザカルスからｔｏｔａｌＲＮＡを抽出してｃＤＮＡ化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ヘビノネゴザｔｏｔａｌＲＮＡは、鉄分を除いた培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルスより、先に示したＪａａｋｏｌａらのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法に従って抽出し、逆転写反応を行って各遺伝子ホモログの部分シークエンス単離用のｃＤＮＡを得た。また、各遺伝子ホモログの完全長シークエンスを単離するために、別途同様にして得られたヘビノネゴザｔｏｔａｌＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。尚、ｃＤＮＡライブラリーの作製には、得られたｔｏｔａｌＲＮＡよりＭＡＣＳ Ｃｏｌｕｍｎ Ｔｙｐｅμ（第一化学薬品）を用いてｍＲＮＡを精製した後、Ｃｒｅａｔｏｒ ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリー作製キット（BD Bioscience Clontech）を使用した。
【００６１】
次に、アラビドプシスなどにおいて既に配列の知られている鉄とカドミウム双方の輸送に関連しているとの報告があるＧｅｎＢａｎｋに登録されている元素輸送担体遺伝子の既知の配列（IRT；NM_118089、AF065444、AF246266、AB126086、AB126087、AB070226、AJ320253： Nramp；L41217、NM_106731、NM_103618、NM_101464、AY196091： YSL；AY515566、AY515565、AY515560、AY512583、AP003936、CA758396）に、それぞれ特異的な共通配列を探索し、ディジェネレートプライマーを設計・作製した。以下にそのディジェネレートプライマーを列挙して示す。
degAyIRTF 5'-CCKTGGYMTAARTTYCCTTTYBCBGG-3'（配列番号１７）
degAyIRTR 5'-GARTGWRMYAHRATBCCAASYTCCARNACC-3'（配列番号１８）
degAyNrampF 5'-ATGCCBCAYAAYVTSTWYYTVCAYTCRGC-3’（配列番号１９）
degAyNrampR 5'-ATVGTVSWRCTCTGHCCMGMWGC-3’（配列番号２０）
degAyYSLF 5'-MMRCCNTTYACWMRNCARGAGAAYAC-3'（配列番号２１）
degAyYSLR 5'-CWGTDGCNRWWCCACTNGGRTA-3'（配列番号２２）
【００６２】
これらのプライマーと先に示した部分シークエンス単離用のｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＴＡクローニングキット(Invitrogen)によりｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られた断片は、部分シークエンスとしてＤＮＡシーケンサー（ABIモデル3100）によって配列を解析した後、既知の遺伝子と比較してシークエンスに類似性が認められたものをヘビノネゴザにおける各遺伝子ホモログの部分シークエンスとしてｃＤＮＡライブラリーからの完全長シークエンス単離のためのプローブ作製に用いた。完全長シークエンス単離のためのプローブは、先に示した部分シークエンスから設計し直したプライマーを用いてＰＣＲ−ＤＩＧラベル法により作製した（DIG DNA Labeling and Detection Kit、Roche）。プローブ用、ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲによる発現解析用プライマーの位置（配列）は、各完全長配列中に示した。図５〜図８において、１Ｆと１ＲはリアルタイムＰＣＲ用プライマー、２Ｆと２Ｒはプローブ作成およびＲＴ−ＰＣＲ用プライマーである。また、図５〜図６において、四角で囲んだ部分は開始コドン及び終始コドンであり、陰付きの四角で囲んだ部分は鉄の輸送に関連すると考えられている共通配列を示している。ｃＤＮＡライブラリーからの完全長ｃＤＮＡの単離はこのプローブを用いて定法にしたがって行った（真壁和裕(1997) バイオ実験イラストレイテッド 第4巻 苦労なしのクローニング、秀潤社）。得られたクローンはＤＮＡシーケンサー（ABIモデル3100）によって配列の解析を行い、先に示した既知のホモログとの比較を行った。
【００６３】
ヘビノネゴザから単離した３種類の元素輸送担体遺伝子ホモログについてＲＴ−ＰＣＲ法、あるいはリアルタイムＰＣＲ法を用いてカドミウム曝露条件下における発現解析を行った。具体的には、１００μＭあるいは４００μＭの２種類のＣｄＳＯ４を添加した培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルス、および成植物体からｔｏｔａｌＲＮＡをカルス、根、地上部の部分毎に上述のＪａａｋｏｌａらのｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法に従って抽出し、逆転写反応によって得たｃＤＮＡをテンプレートに用いた。また、別途鉄欠乏培地において３週間生育させたヘビノネゴザカルス、および成植物体より得たｔｏｔａｌＲＮＡを用いて同様の操作を行い、カドミウム曝露条件下におけるこれらの遺伝子の発現と比較した。
【００６４】
単離したホモログのうち、ＡｙＮｒａｍｐ１（配列番号１：全長1903bp、ORF1530bp、510AA）、ＡｙＩＲＴ１（配列番号３：全長1878bp、ORF1152bp、384AA）の２種類については完全長遺伝子であった。ＡｙＹＳＬ１（配列番号５：全長301bp）、ＡｙＹＳＬ２（配列番号７：全長295bp）についてはいずれもＯＲＦの部分遺伝子と考えられた。これらのうち、特に完全長を単離できたＡｙＩＲＴ１、およびＡｙＮｒａｍｐ１について、それぞれアラビドプシスにおいて配列が明かとなっているホモログＡｔＩＲＴ１、およびＡｔＮｒａｍｐ３とアミノ酸配列の相同性を比較した。その結果を図９〜図１１に示す。図９において、（ａ）はヘビノネゴザＡｙＩＲＴ１のタンパク質膜構造、（ｂ）はアラビドプシスＡｔＩＲＴ１タンパク質膜構造を示す。図１０において、（ａ）はヘビノネゴザＡｙＮｒａｍｐ１のタンパク質膜構造、（ｂ）はアラビドプシスＡｔＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造を示す。また、図１１において、（Ａ）は植物由来のＮｒａｍｐとの比較、（Ｂ）は動物由来のＮｒａｍｐとの比較を示す。尚、図１１において、ＧｍＤＭＴはダイズ、ＬｅＮｒａｍｐはトマト、ＯｓＮｒａｍｐはイネ、ＨｓＤＭＴはヒト、ＭｍＮｒａｍｐはマウス、ＯｍＮｒａｍｐはニジマス、ＴｒＤＭＴはトラフグである。ＡｔＩＲＴ１のアミノ酸配列とＡｙＩＲＴ１のアミノ酸配列の相同性は４４．０％、ＡｔＮｒａｍｐ１のアミノ酸配列とＡｙＮｒａｍｐ１のアミノ酸配列の相同性は６７．３％であり、相同性はそれほど高くはなかったが、アラビドプシスにおけるＤ１００、Ｅ１０３及びＣ１０９を除いて、いずれにおいてもアラビドプシス（Rogers EE et al. (2000) PNAS 97 p12356-12360）やマウス（Lam-Yuk-Tseung et al. (2003) BLOOD 101 p3699-3707）において示されている鉄吸収に強く関連したアミノ酸配列が全て保存されていた。また、図１１に示すように、ＡｙＮｒａｍｐ１については、そのアミノ酸配列が植物におけるものよりも動物におけるものに類似しており、図１１中の矢印で示されるように、これまで配列が明らかにされている植物のＮｒａｍｐにおいては全てイソロイシンであるアミノ酸が、ヘビノネゴザでは動物と同じメチオニンに変わっていた。
【００６５】
次に、タンパク質膜構造については、図９に示すアラビドプシスＡｔＩＲＴ１タンパク質膜構造においては、８ヶ所の膜貫通領域があるのに対し、ヘビノネゴザＡｙＩＲＴ１タンパク質膜構造における膜貫通領域は２ヶ所少ない６ヶ所であった。図１０に示すアラビドプシスＡｔＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造においては、１１ヶ所の膜貫通領域があるのに対し、ヘビノネゴザＡｙＮｒａｍｐ１タンパク質膜構造における膜貫通領域は２ヶ所少ない９ヶ所であった。尚、図９及び図１０において、１は膜外領域、２は膜貫通領域、３は膜内領域を示している。また、上記の「保存されている鉄吸収に強く関連したアミノ酸配列」に着目すると、例えば、ＡｙＩＲＴのＨ２３６、Ｓ２３７、Ｈ２６３、Ｅ２６７とＡｔＩＲＴのＨ１９７、Ｓ１９８、Ｈ２２４、Ｅ２２８において示されるように膜の内外における存在を反対にしているものも多かった。
【００６６】
次に、ヘビノネゴザカルスおよび成植物体を鉄欠乏処理、カドミウム曝露し、単離したこれらの４つの遺伝子について発現変化を調べた。結果を図１２〜図１４に示す。図１２に示すように、ヘビノネゴザカルスにおいては、いずれの遺伝子においても強い鉄欠乏処理によって（２週間の鉄欠乏処理）有意な発現の増加が認められた。即ち、鉄欠乏応答性があることが確認された。尚、図１２において、（ａ）は通常の増殖用ＭＳ培地で増殖させた場合、（ｂ）は増殖用ＭＳ培地から鉄を除いて１週間増殖させた場合、（ｃ）は増殖用ＭＳ培地から鉄を除いて２週間増殖させた場合である。次に、図１３に示すように、カドミウムを曝露した場合にもＡｙＹＳＬ１、ＡｙＹＳＬ２については発現の増加が認められたが、ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１については有意な発現の増加は認められなかった。尚、図１３において、（ａ）は通常の増殖用ＭＳ培地で増殖させた場合、（ｂ）はカドミウムを１００μＭ添加した培地で１週間増殖させた場合、（ｃ）はカドミウムを４００μＭ添加した培地で１週間増殖させた場合である。また、図１４に示すように、成植物体を用いた実験では、全ての遺伝子において根、植物体地上部ともに1週間の鉄欠乏処理（ΔＦｅ）、あるいはカドミウム曝露（＋Ｃｄ）によって有意な発現の変化は認められなかった。尚、図１４において、（ａ）ＡｙＩＲＴ１、（ｂ）はＡｙＹＳＬ１、（ｃ）はＡｙＹＳＬ２、（ｄ）はＡｙＮｒａｍｐ１である。
【００６７】
＜６：ヘビノネゴザ鉄吸収関連遺伝子を過剰発現した形質転換酵母におけるカドミウム耐性の向上＞
ヘビノネゴザから全長を単離することができた２つの遺伝子（ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１）のＯＲＦ部分をＰＣＲによって増幅し、配列を確認後、酵母発現ベクター（pYES2.1vector/Invtrogen）を介して酵母（BY4741株）に導入した。酵母の形質転換は、Dohlmanの示す方法に従った（Dohlman HG (2002) "Lazy Bones" Plasmid Transformation, A quick method for plasmid transformation into yeast. http://www.med.unc.edu/~hdohlman/lazybones.html）。具体的には、酵母をＳＤ寒天培地（BD bioscience・Clonetech）にて培養して単菌株を単離し、キャリアーＤＮＡと単離した遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、および形質転換溶液（４０％ ポリエチレングリコール、０．１Ｍ 酢酸リチウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を混合して一晩静置した後、４２℃でヒートショックを行い形質転換した。さらにこの混合液を、ウラシルを除いたＳＤ寒天培地において培養し、得られた菌株についてコロニーＰＣＲ法によって導入遺伝子の確認を行った。尚、プライマーはＲＴ−ＰＣＲ法で用いたものと同じ配列のものを用いた。
【００６８】
上記により得られた菌株（AyIRT1、AyNramp1）と非形質転換株(WT)のカドミウム耐性を調査した。カドミウム耐性の検定には、ウラシルを除いたＳＤ寒天培地を基本培地として、これに０μＭ、３０μＭのＣｄＳＯ４を添加した培地を用い、１／１、１／１０、１／１００及び１／１０００に希釈した株（希釈率は６００ｎｍの吸光度により確認）を滴下して、３０℃において２〜５日間の培養の後、コロニーの形成状態を非形質転換系統と比較した。また、蓄積能については、３０μＭのＣｄＳＯ４を添加した同組成の液体培地（１００ｍｌ培地を５００ｍｌコルベンに分注、振とう強度１４０ｒｐｍ、３０℃において５日間培養）においてこれらの形質転換酵母系統を増殖させ、集菌後５００μＭ ＣａＣｌ２バッファーに顕濁・洗浄後、遠心操作により再集菌して、ＩＣＰ（P4000、 Hitachi、 Japan）による金属濃度の分析のためのサンプルとした。
【００６９】
上記により得られた形質転換株（ＡｙＩＲＴ１、ＡｙＮｒａｍｐ１）と非形質転換株（ＷＴ）とをそれぞれ数株ずつカドミウムを含む培地に接種し、その生育を調べた結果を図１５に示す。（ａ）はカドミウム無添加培地で２日間生育させた結果、（ｂ）はカドミウムを３０μＭ添加した培地で５日間生育させた結果である。いずれの形質転換株においても形質転換しない酵母株に比べて明らかに生育が良好であった。また、これらの株におけるカドミウム、および鉄含有量を調べた結果を図１６に示す（ａ）は鉄濃度（含有量）、（ｂ）はカドミウム濃度（含有量）、（ｃ）は鉄に対するカドミウム量をモル比で表した図である。尚、図１５及び図１６において、ＷＴ５はｐＹＥＳ酵母形質転換用ベクターのみ導入したコントロール系統、ＡｙＩＲＴ１−５はＡｙＩＲＴ１を用いて形質転換した系統、ＡｙＮｒａｍｐ１−５はＡｙＮｒａｍｐ１を用いて形質転換した系統を表している。カドミウム含有量はＡｙＩＲＴ１−５形質転換株では約９０μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株では約２０μｇ／ｇ−ＦＷであるのに対し、非形質転換株であるＷＴ５では約２００μｇ／ｇ−ＦＷであった。鉄含有量はＷＴ５で８μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＩＲＴ１−５形質転換株で７μｇ／ｇ−ＦＷ、ＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株で１０μｇ／ｇ−ＦＷであり、形質転換株と非形質転換株とで鉄の吸収量にそれほど大きな差異は認められなかった。これは、本実施例で用いた培地中に鉄が十分に存在したため、鉄の供給量が十分であったことによるものであると考えられる。また、Ｃｄ／Ｆｅ値に関しては、形質転換株の方が小さかった。すなわち、いずれの形質転換株においても１分子の鉄を得るために混入するカドミウム分子の数が非形質転換株よりも少ないことが明らかとなった。この傾向はＡｙＮｒａｍｐ１−５形質転換株において特に顕著であった。以上より、ＡｙＮｒａｍｐ１、ＡｙＩＲＴ１により形質転換することで、カドミウム存在下においても生育に必須な鉄と特異的に親和するようになって、良好に生育する。即ち、植物体のカドミウム耐性を強化することが可能である。さらには、カドミウムの蓄積量も低減される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】カドミウム（１００μＭ）曝露条件下におけるヘビノネゴザカルスとタバコカルスの生育を示す図である。◇はヘビノネゴザカルスの相対的生育量、■はタバコの相対的生育量を示す。
【図２】ヘビノネゴザカルスとタバコカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現に及ぼすカドミウム（１００μＭ）の影響を示す図である。
【図３】種々のカドミウム曝露条件下において生育したヘビノネゴザカルスにおけるＰＣＳ遺伝子の発現を示す。
【図４】ヘビノネゴザカルスとタバコカルスにおけるカドミウム曝露による金属元素の含有量変化を示す図である。（ａ）はカルシウム、（ｂ）は銅、（ｃ）は鉄、（ｄ）はマグネシウム、（ｅ）はマンガン、（ｆ）は亜鉛についての結果である。
【図５】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＮｒａｍｐ１：配列番号１）の配列である。
【図６】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＩＲＴ１：配列番号３）の配列である。
【図７】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＹＳＬ１：配列番号５）の配列である。
【図８】ヘビノネゴザ鉄輸送担体遺伝子（ＡｙＹＳＬ２：配列番号７）の配列である。
【図９】ＩＲＴタンパク質膜構造比較を示す図である。
【図１０】Ｎｒａｍｐタンパク質膜構造比較を示す図である。
【図１１】種々の生物のＮｒａｍｐにおけるアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１２】ヘビノネゴザカルスにおける鉄欠乏条件下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１３】ヘビノネゴザカルスにおけるカドミウム曝露下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１４】ヘビノネゴザ成植物体におけるカドミウム曝露下での鉄輸送担体遺伝子の発現を示す図である。
【図１５】ＡｙＩＲＴ１及びＡｙＮｒａｍｐ１により形質転換した酵母におけるカドミウム耐性を示す図である。
【図１６】ＡｙＩＲＴ１及びＡｙＮｒａｍｐ１により形質転換した酵母における（ａ）鉄濃度、（ｂ）カドミウム濃度、（ｃ）Ｃｄ／Ｆｅ（ｍｏｌ比）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ若しくはこれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項１又は３に記載の遺伝子を含有する形質転換された植物細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の植物細胞から得られる植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫。
【請求項６】
環境汚染物質蓄積能をさらに有することを特徴とする請求項４に記載の植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の植物細胞から得られる植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫。
【請求項８】
請求項１又は３に記載の遺伝子を組み込んだベクターで形質転換してなる宿主細胞を培養し、培養物中に蓄積されるタンパク質を採取することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
請求項７に記載の植物体を用いて、土壌から環境汚染物質を除去することを特徴とする環境修復方法。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５又は７の塩基配列からなるＤＮＡ若しくはこれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ鉄と特異的に親和する輸送担体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項１又は３に記載の遺伝子を含有する形質転換された植物細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の植物細胞から得られる植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫。
【請求項６】
環境汚染物質蓄積能をさらに有することを特徴とする請求項４に記載の植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の植物細胞から得られる植物体とその部分並びにその繁殖体及び子孫。
【請求項８】
請求項１又は３に記載の遺伝子を組み込んだベクターで形質転換してなる宿主細胞を培養し、培養物中に蓄積されるタンパク質を採取することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
請求項７に記載の植物体を用いて、土壌から環境汚染物質を除去することを特徴とする環境修復方法。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図１４】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
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【図１１】
【図１４】
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【図２】
【図３】
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【図１２】
【図１３】
【図１５】
【公開番号】特開２００７−２１５４０２（Ｐ２００７−２１５４０２Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３０８２１（Ｐ２００５−３３０８２１）
【出願日】平成１７年１１月１５日（２００５．１１．１５）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１５日（２００５．１１．１５）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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