植物ストレス軽減剤およびそれを用いた植物ストレス軽減法
【課題】植物のストレス、特に無機亜鉛等のミネラルによる薬害ストレスに対して有効な、植物ストレス軽減剤、及び同植物ストレス軽減剤を用いて植物ストレスを軽減する方法を提供する。
【解決手段】硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物、例えば無機硫酸化合物、無機アンモニウム化合物、又は、硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤を植物に施用することにより、植物のストレスを軽減する。
【解決手段】硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物、例えば無機硫酸化合物、無機アンモニウム化合物、又は、硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤を植物に施用することにより、植物のストレスを軽減する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物を有効成分として含有する、植物のストレス軽減剤と植物のストレス軽減方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
農園芸作物栽培においては、土壌で不足する栄養成分を補給するため、あるいは病害虫防除等のために、種々の栄養剤や薬剤の葉面散布が行われている。これらの栄養剤や薬剤には、ミネラル類を含むものも少なくない。しかし、ミネラル類、例えば無機亜鉛剤、無機銅剤等の散布は植物にストレスを与え、その結果薬害が発生することがある。
ミネラル類の薬害軽減策として、一般的に炭酸カルシウムが使用されているが、高濃度炭酸カルシウムによる汚染が問題となっている。また無機銅剤の薬害軽減剤としてはリン脂質（例えば、特許文献１参照）が知られているが、硫酸化合物、及びアンモニウム化合物が、薬害などのストレスを軽減できることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平6-234609号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、植物のストレス、特に無機亜鉛等のミネラルによる薬害ストレスに対して有効な、植物ストレス軽減剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ミネラル類による植物ストレス軽減物質を探索したところ、硫酸化合物、及びアンモニウム化合物に高いストレス軽減効果があることを発見した。すなわち、これらの化合物を植物に散布することで、無機亜鉛のようなミネラル類によって誘導されるストレス応答性遺伝子発現誘導の抑制が認められ、薬害が顕著に軽減されることを見出した。また、無機銅、無機鉄に対しても、高いストレス軽減効果を有することを見出した。以上の知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤。
（２）植物ストレスが植物薬害ストレスであることを特徴とする、前記植物ストレス軽減剤。
（３）前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、前記植物ストレス軽減剤。
（４）硫酸化合物が無機硫酸化合物である、前記植物ストレス軽減剤。
（５）アンモニウム化合物が無機アンモニウム化合物である、前記植物ストレス軽減剤。（６）硫酸化合物及びアンニモウム化合物の両方を含む、前記植物ストレス軽減剤。
（７）無機硫酸化合物又は無機アンモニウム化合物が、硫酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、又は塩化アンモニウムである、前記植物ストレス軽減剤。
（８）硫酸化合物及びアンモニウム化合物が、硫酸アンモニウム、又は硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物であることを特徴とする、前記植物ストレス軽減剤。（９）植物薬害ストレスが、亜鉛化合物、銅化合物、又は鉄化合物による薬害ストレスである、前記植物ストレス軽減剤。
（１０）硫酸化合物及びアンモニウム化合物を、硫酸基及びアンモニウム基換算で、各々1mM〜100mM含有する、前記植物ストレス軽減剤。
（１１）さらに、植物ストレスの原因となるミネラルを含む、前記植物ストレス軽減剤。（１２）植物の葉、花、根、又は果実に施用される、前記植物ストレス軽減剤。
（１３）葉面散布により植物に施用される、前記植物ストレス軽減剤。
（１４）前記植物ストレス軽減剤を植物に施用することを特徴とする、植物のストレスを軽減する方法。
（１５）前記植物ストレスが、植物薬害ストレスであることを特徴とする、前記方法。
（１６）前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、前記方法。
（１７）前記ストレス軽減剤を、葉面散布により植物に施用することを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、植物のストレス、特に無機亜鉛、無機銅、無機鉄等のミネラルにより引き起される傷害ストレスを軽減させることができる。本発明の植物ストレス軽減剤は、無機亜鉛等のミネラルと同時に植物に適用しても、それらのミネラルの補給効果を損わない。
また、本発明の一形態では、本発明の植物ストレス軽減剤の有効成分として、アミノ酸発酵等の発酵副産物を用いた場合は、大量調製が容易であり、また、経済的である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対する硫酸アンモニウムの効果を示す図。バーは＋標準誤差を示す（以下の図でも同様）。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液、２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
【図２】塩化亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対するアンモニウム化合物と硫酸化合物の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 塩化亜鉛水溶液２：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：1.53mM 塩化亜鉛、7.6mM 塩化アンモニウム水溶液４：1.53mM 塩化亜鉛、76mM 塩化アンモニウム水溶液５：1.53mM 塩化亜鉛、7.6mM 硝酸アンモニウム水溶液６：1.53mM 塩化亜鉛、76mM 硝酸アンモニウム水溶液７：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸マグネシウム水溶液８：1.53mM 塩化亜鉛、38mM 硫酸マグネシウム水溶液
【図３】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ薬害（クロロシス）に対する硫酸アンモニウムの効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液２：7.65mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：7.65mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸アンモニウム水溶液
【図４】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液２：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図５】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ薬害（クロロシス）に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液２：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液３：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
【図６】硫酸亜鉛と塩化亜鉛によるシロイヌナズナストレス応答性遺伝子誘導に対する硫酸アンモニウムとグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液４：1.53mM 塩化亜鉛水溶液５：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液６：1.53mM 塩化亜鉛、グルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図７】硫酸銅とFe(III)-EDTAによるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子誘導に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。（Ａ）Ｃ：対照（水）１：0.159mM硫酸銅水溶液２：0.159mM硫酸銅を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液３：0.635mM硫酸銅水溶液４：0.635mM硫酸銅を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液（Ｂ）Ｃ：対照区（水処理）１：0.279mM Fe(III)-EDT水溶液２：0.279mM Fe(III)-EDTAを含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図８】Glu発酵副生液による硫酸亜鉛薬害軽減効果を示す図（生物の形態を示す写真）。Ａ：シロイヌナズナＢ：ハクサイＣ：キャベツＤ：ハツカダイコンＥ：トウガラシＦ：ダイズ 上段は15.3mM 硫酸亜鉛水溶液処理区 下段は15.3mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液 バーは1cm
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の植物ストレス軽減剤は、硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する。
【００１０】
本発明において、硫酸化合物とは、硫酸基を有する化合物であれば特に制限されないが、無機硫酸化合物、好ましくは硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム等の無機硫酸塩が挙げられる。
【００１１】
アンモニウム化合物とは、アンモニウム基（NH4+）を有する化合物であれば特に制限されないが、無機アンモニウム化合物、好ましくは硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機アンモニウム塩が挙げられる。
【００１２】
硫酸アンモニウムは硫酸化合物でもあり、アンモニウム化合物でもあって、「硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方」に含まれる。
【００１３】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物は、精製品であってもよいが、本発明の効果を損わない限り、これらの化合物を含む組成物であってもよい。このような組成物としては、硫酸アンモニウムを含有する発酵副生物、例えばＬ−グルタミン酸等のアミノ酸発酵で得られる発酵副生液が挙げられる。発酵に用いる微生物、発酵の目的物質等は特に制限されない。発酵副生物は、硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物を含む限り、培地から目的物質を分離した発酵液、その濃縮液もしくは乾固物、又はそれらの分画物等のいずれであってもよい。
【００１４】
植物ストレス軽減剤は、硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物以外に、任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、前記化合物の溶解を促すためのpH調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、肥効を高めるための肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、本発明の効果を損わない限り、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
【００１５】
溶媒としては、水、アルコール等が挙げられる。担体としては、炭酸カルシウム、珪藻土、パーライト等の鉱物系担体や植物系担体が挙げられる。
【００１６】
また、使用に際して、固体状又は粉体状の植物ストレス軽減剤を、水等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。
植物ストレス軽減剤における硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物の含量は特に制限されず、後述の施用量に応じて適宜設定することができる。例えば、植物ストレス軽減剤における硫酸化合物単独の場合の含量は、硫酸基換算で、通常1〜100mM、好ましくは30mM〜100mMである。また、アンモニウム化合物単独の場合の含量は、アンモニウム基換算で、通常1〜100mM、好ましくは5mM〜90mMである。植物ストレス軽減剤が硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方を含む場合は、硫酸基化合物及びアンモニウム化合物の含量は、硫酸基化合物の含量は硫酸基換算で、通常1〜100mM 、好ましくは3mM〜50mM、アンモニウム化合物はアンモニウム基換算で、通常1〜100mM 、好ましくは5〜90mMが好ましい。尚、前記濃度は、植物ストレス軽減剤が固形又は粉体状の場合は、使用時に溶液にしたときの濃度である。発酵副生液を用いる場合は、硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物の含量が上記範囲となるように適宜希釈することができる。
【００１７】
植物ストレスとしては、本発明の植物ストレス軽減剤により低減され得るストレスであれば特に制限されず、例えば、薬害ストレス、すなわちミネラル類、農薬等の化学物質の曝露によるストレス、高温もしくは低温、乾燥等の環境ストレス、又は昆虫による食害等の物理的な傷害によるストレスが挙げられる。また、植物ストレスには、PR4、PDF1.2などの傷害応答性遺伝子発現、HSPなどのストレス応答性遺伝子発現、クロロシス（クロロフィル（葉緑素）減少）、ネクロシス（細胞死）に代表されるストレス応答を生じさせるストレスが含まれる。植物ストレスは、実施例記載の方法に従い、PR4、PDF1.2、もしくはHSP17.6遺伝子の発現解析、又はクロロフィル定量等により、評価することが可能である。実施例に示すように、本発明の植物ストレス軽減剤により、ミネラルによるストレスが低減されることが示された。また、植物ストレス軽減剤により、HSPのようなストレス応答性遺伝子の発現が抑制されたことから、薬害のみならず、種々のストレスに対しても効果を有すると考えられる。
【００１８】
本発明のストレス軽減剤の対象となる植物は特に制限されず、栽培植物一般を対象とすることができるが、例えば、アブラナ科植物（ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、ナノハナ、チンゲンサイ、シロイヌナズナなど）、及びマメ科植物（エンドウ、ダイズ
、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、ソラマメなど）などが挙げられる。
【００１９】
植物ストレス軽減剤を、植物に施用することにより、植物ストレスを軽減させることができる。施用の方法は特に制限されないが、植物体への散布、又は土壌への表面散布又は潅注が挙げられる。これらの中では、植物体への散布、例えば葉面、花、又は果実への散布が好ましく、葉面散布がより好ましい。栄養剤や農薬等の薬剤の植物への散布がストレスの原因となる場合は、これらの薬剤の施用と同時に、植物ストレス軽減剤を施用することが好ましい。しかしながら、前記薬剤の施用と前後して植物ストレス軽減剤を施用してもよい。また、ストレスの原因となる薬剤が施用される場合は、これらの薬剤を植物ストレス軽減剤と混合して施用してもよい。また、植物ストレス軽減剤自体が、前記ストレスの原因となる薬剤を含んでいてもよい。
【００２０】
ストレスの原因となる薬剤としては、ミネラル類、例えば無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅等が挙げられる。ストレスの原因が薬剤の場合は、本発明の植物ストレス軽減剤は、薬害軽減剤でもある。植物ストレス軽減剤の使用により薬害が軽減される無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅の濃度は、例えば、それぞれ0.1％ (Zn w/v)以下、0〜0.05％ (Fe w/v)以下、及び0〜10ppm (Cu w/v)以下が挙げられるが、これらの濃度には制限されない。また、無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅の種類は限定されず、例えば硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、キレート鉄（Fe(III)-EDTAなど）、塩化鉄(II)、塩化鉄(III)、硫酸鉄(I)、硫酸鉄(II)等が挙げられる。尚、硫酸亜鉛は、無機亜鉛であるが、植物ストレス軽減剤の有効成分の一部でもあり得る。
【００２１】
植物ストレス軽減剤の施用量は、有効成分の濃度、施用時期、施用回数、植物の種類、栽培密度、生育段階等によっても異なり得る。施用量は、例えば、硫酸化合物単独の場合は、硫酸基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは30mM〜100mMを1000L〜2000L／ヘクタールであり、アンモニア化合物単独の場合はアンモニア基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは5mM〜90mMを500〜1000L／ヘクタールとなる量が好ましい。
【００２２】
また、植物ストレス軽減剤が硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方を含む場合は、硫酸基化合物は硫酸基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは3mM〜50mMを1000L〜2000L／ヘクタールであり、アンモニア化合物はアンモニア基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは5mM〜90mMを500〜1000L／ヘクタールとなる量が好ましい。
【００２３】
尚、ストレスの原因となる薬剤が無機金属の硫酸化合物の場合は、この硫酸化合物に由来する硫酸基の量も、上記施用量に含まれる。
【００２４】
施用時期は、植物がストレスに曝される時期が好ましいが、多少前後してもよい。また、一度に前記範囲の量を施用してもよく、同日に複数回に分けて施用してもよい。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明の実施例を示すが、本発明の要旨を超えない限り、以下の実施例に制約されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕遺伝子発現を指標とした硫酸アンモニウムによる植物ストレス応答性遺伝子誘導抑制の評価
（１）植物体の栽培と処理方法
シロイヌナズナは、野生型株（Col-0）を用いた。栽培には寒天培地を用い、OptMS無機塩類培養液Zn1/100 （表１）に1%スクロース、0.8%寒天を加えた培地に種子を播種し、２
週間栽培した。シャーレは、10cm径の深底シャーレ（テルモ）を用い、シャーレあたり14株を栽培した。日周は16時間明期で光強度はおよそ70μmol m-2 s-1、23℃で栽培した。下記の各試料を、13日間栽培した幼植物１個体の４枚の本葉に、5μlずつ滴下処理した。各試料は、各々６個体の植物に適用した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）。「アプローチ」は同社の登録商標である。)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００２７】
試料１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：1.53mM 硫酸亜鉛、7.6mM 塩化アンモニウム水溶液
試料４：1.53mM 硫酸亜鉛、76mM 塩化アンモニウム水溶液
試料５：1.53mM 硫酸亜鉛、7.6mM 硝酸アンモニウム水溶液
試料６：1.53mM 硫酸亜鉛、76mM 硝酸アンモニウム水溶液
試料７：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸マグネシウム水溶液
試料８：1.53mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸マグネシウム水溶液
【００２８】
【表１】
【００２９】
（２）RT-PCRによる遺伝子発現解析
遺伝子発現解析は、定量的PCRによって実施した。各試料による処理から5〜24時間後に、各々の植物（６個体づつ）の地上部全体からRNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて全RNAを抽出した。６個体を１サンプルとして、N=3で実験を行った。全RNAをRNase free DNase Set (QIAGEN)を用いてDNase処理した後、逆転写酵素High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて逆転写を行ない、合成した一本鎖cDNAを鋳型として定量PCRを行なった。
【００３０】
定量PCRはABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) を用い、反応条件は95℃ 15秒、60℃
60秒を、40サイクルで行った。試薬はPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いた。各遺伝子発現解析用プライマーは表２に記載したものを用いた。各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるACT2の発現で標準化した相対的発現量で示した。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（３）硫酸アンモニウムによるシロイヌナズナの傷害ストレス抑制効果
試料１及び２で処理したシロイヌナズナにおける、PR4、PDF1.2、HSP17.6遺伝子の発現を図１に示す。硫酸亜鉛処理後５時間でHSP17.6の発現が、24時間でPR4、PDF1.2遺伝子の発現が誘導されたが、硫酸アンモニウム混合区においては顕著に抑制された。これらの結果により、硫酸アンモニウムが植物の傷害ストレスを抑制することが示された。
【００３３】
また、試料１〜８で処理したシロイヌナズナにおける、PR4、PDF4.2遺伝子の発現を図２に示す。硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムにも硫酸アンモニウムと同様の効果が見られた。また、硫酸マグネシウムも38mM濃度ではストレス応答性遺伝子の発現を抑制した。硫酸化合物とアンモニウム化合物いずれによっても硫酸亜鉛傷害ストレスを抑制できることが示された。
【００３４】
〔実施例２〕硫酸アンモニウムによるシロイヌナズナZn薬害軽減効果
（１）植物体の栽培と処理方法
実施例１と同様にして、イロイヌナズナ野生型株（Col-0）を栽培した。下記の試料１〜３を、11日間栽培した幼植物１個体の２枚の葉に7.5μlずつ滴下処理した。各試料は、各々10個体の植物に適用した。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００３５】
試料１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：7.65mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：7.65mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸アンモニウム水溶液
【００３６】
（２）クロロフィル濃度測定
クロロフィル濃度測定は、Porraら（Porra R. J. et al, Biochim. Biophys. Acta, 1989, 975:384-394）の方法に準じた。各試料による処理から３日後に、各々の植物（10個体づつ）の葉（一個体２葉（第一第二本葉））を2mlチューブに入れて破砕したのち、ミリQ水を200μl入れ、軽くボルテックスミキサにより攪拌した。２枚×10個体(20枚)を１サンプルとし、N=3で実験を行った。次に、アセトン800μlを加え、破砕物をよく懸濁させた。遮光下で24時間静置後、3000rpm、室温で5分遠心分離した。上清を適宜希釈し(約1
0倍）、分光測定器を用いて、663.6nmと646.6nmの二波長での吸光度をそれぞれ測定した。次式によりクロロフィル（Chls a+b）濃度を計算した。
Chls a + b = 19.54*A646.6 + 8.29*A663.6 (μM)
【００３７】
上記評価結果を図３に示す。硫酸亜鉛処理後３日で亜鉛による薬害（クロロシス）が引き起こされたが、硫酸アンモニウム混合区においては、薬害が抑制された。同効果には濃度依存性が見られ、3.8mMから38mMまで効果が増加した。
【００３８】
〔実施例３〕Ｌ−グルタミン酸発酵副生液によるシロイヌナズナのストレス応答性遺伝子誘導抑制効果と薬害軽減効果
（１）実施例１と同様にして、イロイヌナズナ野生型株（Col-0）を栽培した。500倍希釈したグルタミン酸発酵副生液（硫酸アンモニウム3.8mMを含む）に硫酸亜鉛を1.53mMになるように混合し、13日間栽培した幼植物１個体の４枚の葉に5μlずつ滴下処理した。グルタミン酸発酵副生液は、６個体の植物に適用した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBIR(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００３９】
前記グルタミン酸発酵副生液は、微生物としてCorynebacterium glutamicumを使用し、CM-Dex培地を用いて培養を行ったものから、WO2006/054566に記載の方法に準じて調製した。このグルタミン酸発酵副生液の原液は硫酸アンモニウムを約1.9M含有している。
【００４０】
試料による処理から5〜24時間後に、各々の植物（６個体ずつ）の葉（一個体４枚）から実施例１と同様にしてRNAを抽出し、ストレス応答性遺伝子誘導抑制効果を検証した。４枚×６個体(24枚)を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４１】
図４に示す通り、グルタミン酸発酵副生液は硫酸亜鉛によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制した。
【００４２】
（２）また、下記試料を、上記と同様にして栽培した幼植物１個体の２枚の葉に7.5μlずつ滴下処理し、実施例２と同様にしてクロロフィル濃度を測定した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。２枚を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４３】
試料１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
試料３：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
【００４４】
結果を図５に示す。いずれの濃度でも、グルタミン酸発酵副生液は、硫酸亜鉛による薬害（クロロシス）を顕著に抑制することが示された。
【００４５】
（３）下記試料を、上記と同様にして栽培した幼植物１個体の４枚の葉に5μlずつ滴下処理し、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。４枚を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４６】
試料１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
試料４：1.53mM 塩化亜鉛水溶液
試料５：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料６：1.53mM 塩化亜鉛、グルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
結果を図６に示す。効果は硫酸亜鉛に限定されることなく、塩化亜鉛に対しても同様であることが示された。
【００４７】
（４）試料を下記試料に変えた以外は、上記と同様にして、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００４８】
試料１：0.039mM硫酸銅(II)五水和物水溶液
試料２：0.039mM硫酸銅(II)五水和物を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
試料３：0.157mM硫酸銅(II)五水和物水溶液
試料４：0.157mM硫酸銅(II)五水和物を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【００４９】
結果を図７Ａに示す。効果は亜鉛に限定されることなく、銅（硫酸銅）によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制することが示された。
【００５０】
（５）試料を下記試料に変えた以外は、上記と同様にして、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBIR(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。硫酸銅、Fe(III)-EDTAの濃度（ppm）は、銅又は鉄換算の濃度である。
【００５１】
試料１：8.95mM Fe(III)-EDTA水溶液
試料２：8.95mM Fe(III)-EDTAを含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【００５２】
結果を図７Ｂに示す。効果は亜鉛に限定されることなく、鉄（Fe(III)-EDTA）によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制することが示された。
【００５３】
〔実施例４〕各種作物におけるグルタミン酸発酵副生液による薬害軽減効果評価
（１）作物の栽培と葉面処理
アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン）、ナス科（トウガラシ）、キク科（シュンギク）、及びマメ科（ダイズ）の植物について、グルタミン酸発酵副生液の薬害軽減効果を調べた。
【００５４】
各植物は、5cm角のロックウール（日東紡社製、サイズV 50x50x50mm、ポリエチレンフィルムカバー無し）を用いて栽培した。肥料として通常の25%濃度のOptMS無機塩類培養液（表１）を栽培開始時および開始後週１回与え、施肥と別の日に水を週１〜２回与えた。閉鎖系温室において自然光の下で栽培した。播種後第２週と第３週目の各種作物の第１、第２本葉に、0.1%硫酸亜鉛水溶液、又は0.1%硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液をスプレー処理したのち、薬害が生じたタイミングで薬害判定を行った。
【００５５】
（２）薬害判定
薬害の程度に応じてインデックスを各実験回で規定し、5段階評価を行った（最も軽度が０、最も重度が４）。評価結果を平均し、数値ごとに4段階に分類した。0〜1.4は（-）、1.5〜4は（+）、4.1〜6.0は（++）、6.1〜8.0は（+++）と表記した。
表３及び図８に示すとおり、アブラナ科植物やマメ科植物において顕著な薬害軽減効果が確認できた。
【００５６】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物を有効成分として含有する、植物のストレス軽減剤と植物のストレス軽減方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
農園芸作物栽培においては、土壌で不足する栄養成分を補給するため、あるいは病害虫防除等のために、種々の栄養剤や薬剤の葉面散布が行われている。これらの栄養剤や薬剤には、ミネラル類を含むものも少なくない。しかし、ミネラル類、例えば無機亜鉛剤、無機銅剤等の散布は植物にストレスを与え、その結果薬害が発生することがある。
ミネラル類の薬害軽減策として、一般的に炭酸カルシウムが使用されているが、高濃度炭酸カルシウムによる汚染が問題となっている。また無機銅剤の薬害軽減剤としてはリン脂質（例えば、特許文献１参照）が知られているが、硫酸化合物、及びアンモニウム化合物が、薬害などのストレスを軽減できることは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平6-234609号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、植物のストレス、特に無機亜鉛等のミネラルによる薬害ストレスに対して有効な、植物ストレス軽減剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ミネラル類による植物ストレス軽減物質を探索したところ、硫酸化合物、及びアンモニウム化合物に高いストレス軽減効果があることを発見した。すなわち、これらの化合物を植物に散布することで、無機亜鉛のようなミネラル類によって誘導されるストレス応答性遺伝子発現誘導の抑制が認められ、薬害が顕著に軽減されることを見出した。また、無機銅、無機鉄に対しても、高いストレス軽減効果を有することを見出した。以上の知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤。
（２）植物ストレスが植物薬害ストレスであることを特徴とする、前記植物ストレス軽減剤。
（３）前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、前記植物ストレス軽減剤。
（４）硫酸化合物が無機硫酸化合物である、前記植物ストレス軽減剤。
（５）アンモニウム化合物が無機アンモニウム化合物である、前記植物ストレス軽減剤。（６）硫酸化合物及びアンニモウム化合物の両方を含む、前記植物ストレス軽減剤。
（７）無機硫酸化合物又は無機アンモニウム化合物が、硫酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、又は塩化アンモニウムである、前記植物ストレス軽減剤。
（８）硫酸化合物及びアンモニウム化合物が、硫酸アンモニウム、又は硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物であることを特徴とする、前記植物ストレス軽減剤。（９）植物薬害ストレスが、亜鉛化合物、銅化合物、又は鉄化合物による薬害ストレスである、前記植物ストレス軽減剤。
（１０）硫酸化合物及びアンモニウム化合物を、硫酸基及びアンモニウム基換算で、各々1mM〜100mM含有する、前記植物ストレス軽減剤。
（１１）さらに、植物ストレスの原因となるミネラルを含む、前記植物ストレス軽減剤。（１２）植物の葉、花、根、又は果実に施用される、前記植物ストレス軽減剤。
（１３）葉面散布により植物に施用される、前記植物ストレス軽減剤。
（１４）前記植物ストレス軽減剤を植物に施用することを特徴とする、植物のストレスを軽減する方法。
（１５）前記植物ストレスが、植物薬害ストレスであることを特徴とする、前記方法。
（１６）前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、前記方法。
（１７）前記ストレス軽減剤を、葉面散布により植物に施用することを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、植物のストレス、特に無機亜鉛、無機銅、無機鉄等のミネラルにより引き起される傷害ストレスを軽減させることができる。本発明の植物ストレス軽減剤は、無機亜鉛等のミネラルと同時に植物に適用しても、それらのミネラルの補給効果を損わない。
また、本発明の一形態では、本発明の植物ストレス軽減剤の有効成分として、アミノ酸発酵等の発酵副産物を用いた場合は、大量調製が容易であり、また、経済的である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対する硫酸アンモニウムの効果を示す図。バーは＋標準誤差を示す（以下の図でも同様）。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液、２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
【図２】塩化亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対するアンモニウム化合物と硫酸化合物の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 塩化亜鉛水溶液２：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：1.53mM 塩化亜鉛、7.6mM 塩化アンモニウム水溶液４：1.53mM 塩化亜鉛、76mM 塩化アンモニウム水溶液５：1.53mM 塩化亜鉛、7.6mM 硝酸アンモニウム水溶液６：1.53mM 塩化亜鉛、76mM 硝酸アンモニウム水溶液７：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸マグネシウム水溶液８：1.53mM 塩化亜鉛、38mM 硫酸マグネシウム水溶液
【図３】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ薬害（クロロシス）に対する硫酸アンモニウムの効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液２：7.65mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：7.65mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸アンモニウム水溶液
【図４】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子またはストレス応答性遺伝子誘導に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液２：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図５】硫酸亜鉛によるシロイヌナズナ薬害（クロロシス）に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液２：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液３：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
【図６】硫酸亜鉛と塩化亜鉛によるシロイヌナズナストレス応答性遺伝子誘導に対する硫酸アンモニウムとグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。Ｃ：対照（水）１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液３：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液４：1.53mM 塩化亜鉛水溶液５：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液６：1.53mM 塩化亜鉛、グルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図７】硫酸銅とFe(III)-EDTAによるシロイヌナズナ傷害応答性遺伝子誘導に対するグルタミン酸発酵副生液の効果を示す図。（Ａ）Ｃ：対照（水）１：0.159mM硫酸銅水溶液２：0.159mM硫酸銅を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液３：0.635mM硫酸銅水溶液４：0.635mM硫酸銅を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液（Ｂ）Ｃ：対照区（水処理）１：0.279mM Fe(III)-EDT水溶液２：0.279mM Fe(III)-EDTAを含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【図８】Glu発酵副生液による硫酸亜鉛薬害軽減効果を示す図（生物の形態を示す写真）。Ａ：シロイヌナズナＢ：ハクサイＣ：キャベツＤ：ハツカダイコンＥ：トウガラシＦ：ダイズ 上段は15.3mM 硫酸亜鉛水溶液処理区 下段は15.3mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液 バーは1cm
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の植物ストレス軽減剤は、硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する。
【００１０】
本発明において、硫酸化合物とは、硫酸基を有する化合物であれば特に制限されないが、無機硫酸化合物、好ましくは硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム等の無機硫酸塩が挙げられる。
【００１１】
アンモニウム化合物とは、アンモニウム基（NH4+）を有する化合物であれば特に制限されないが、無機アンモニウム化合物、好ましくは硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機アンモニウム塩が挙げられる。
【００１２】
硫酸アンモニウムは硫酸化合物でもあり、アンモニウム化合物でもあって、「硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方」に含まれる。
【００１３】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物は、精製品であってもよいが、本発明の効果を損わない限り、これらの化合物を含む組成物であってもよい。このような組成物としては、硫酸アンモニウムを含有する発酵副生物、例えばＬ−グルタミン酸等のアミノ酸発酵で得られる発酵副生液が挙げられる。発酵に用いる微生物、発酵の目的物質等は特に制限されない。発酵副生物は、硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物を含む限り、培地から目的物質を分離した発酵液、その濃縮液もしくは乾固物、又はそれらの分画物等のいずれであってもよい。
【００１４】
植物ストレス軽減剤は、硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物以外に、任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、前記化合物の溶解を促すためのpH調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、肥効を高めるための肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、本発明の効果を損わない限り、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
【００１５】
溶媒としては、水、アルコール等が挙げられる。担体としては、炭酸カルシウム、珪藻土、パーライト等の鉱物系担体や植物系担体が挙げられる。
【００１６】
また、使用に際して、固体状又は粉体状の植物ストレス軽減剤を、水等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。
植物ストレス軽減剤における硫酸化合物又は／及びアンモニウム化合物の含量は特に制限されず、後述の施用量に応じて適宜設定することができる。例えば、植物ストレス軽減剤における硫酸化合物単独の場合の含量は、硫酸基換算で、通常1〜100mM、好ましくは30mM〜100mMである。また、アンモニウム化合物単独の場合の含量は、アンモニウム基換算で、通常1〜100mM、好ましくは5mM〜90mMである。植物ストレス軽減剤が硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方を含む場合は、硫酸基化合物及びアンモニウム化合物の含量は、硫酸基化合物の含量は硫酸基換算で、通常1〜100mM 、好ましくは3mM〜50mM、アンモニウム化合物はアンモニウム基換算で、通常1〜100mM 、好ましくは5〜90mMが好ましい。尚、前記濃度は、植物ストレス軽減剤が固形又は粉体状の場合は、使用時に溶液にしたときの濃度である。発酵副生液を用いる場合は、硫酸化合物及び／又はアンモニウム化合物の含量が上記範囲となるように適宜希釈することができる。
【００１７】
植物ストレスとしては、本発明の植物ストレス軽減剤により低減され得るストレスであれば特に制限されず、例えば、薬害ストレス、すなわちミネラル類、農薬等の化学物質の曝露によるストレス、高温もしくは低温、乾燥等の環境ストレス、又は昆虫による食害等の物理的な傷害によるストレスが挙げられる。また、植物ストレスには、PR4、PDF1.2などの傷害応答性遺伝子発現、HSPなどのストレス応答性遺伝子発現、クロロシス（クロロフィル（葉緑素）減少）、ネクロシス（細胞死）に代表されるストレス応答を生じさせるストレスが含まれる。植物ストレスは、実施例記載の方法に従い、PR4、PDF1.2、もしくはHSP17.6遺伝子の発現解析、又はクロロフィル定量等により、評価することが可能である。実施例に示すように、本発明の植物ストレス軽減剤により、ミネラルによるストレスが低減されることが示された。また、植物ストレス軽減剤により、HSPのようなストレス応答性遺伝子の発現が抑制されたことから、薬害のみならず、種々のストレスに対しても効果を有すると考えられる。
【００１８】
本発明のストレス軽減剤の対象となる植物は特に制限されず、栽培植物一般を対象とすることができるが、例えば、アブラナ科植物（ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、ナノハナ、チンゲンサイ、シロイヌナズナなど）、及びマメ科植物（エンドウ、ダイズ
、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、ソラマメなど）などが挙げられる。
【００１９】
植物ストレス軽減剤を、植物に施用することにより、植物ストレスを軽減させることができる。施用の方法は特に制限されないが、植物体への散布、又は土壌への表面散布又は潅注が挙げられる。これらの中では、植物体への散布、例えば葉面、花、又は果実への散布が好ましく、葉面散布がより好ましい。栄養剤や農薬等の薬剤の植物への散布がストレスの原因となる場合は、これらの薬剤の施用と同時に、植物ストレス軽減剤を施用することが好ましい。しかしながら、前記薬剤の施用と前後して植物ストレス軽減剤を施用してもよい。また、ストレスの原因となる薬剤が施用される場合は、これらの薬剤を植物ストレス軽減剤と混合して施用してもよい。また、植物ストレス軽減剤自体が、前記ストレスの原因となる薬剤を含んでいてもよい。
【００２０】
ストレスの原因となる薬剤としては、ミネラル類、例えば無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅等が挙げられる。ストレスの原因が薬剤の場合は、本発明の植物ストレス軽減剤は、薬害軽減剤でもある。植物ストレス軽減剤の使用により薬害が軽減される無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅の濃度は、例えば、それぞれ0.1％ (Zn w/v)以下、0〜0.05％ (Fe w/v)以下、及び0〜10ppm (Cu w/v)以下が挙げられるが、これらの濃度には制限されない。また、無機亜鉛、無機鉄、及び無機銅の種類は限定されず、例えば硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、キレート鉄（Fe(III)-EDTAなど）、塩化鉄(II)、塩化鉄(III)、硫酸鉄(I)、硫酸鉄(II)等が挙げられる。尚、硫酸亜鉛は、無機亜鉛であるが、植物ストレス軽減剤の有効成分の一部でもあり得る。
【００２１】
植物ストレス軽減剤の施用量は、有効成分の濃度、施用時期、施用回数、植物の種類、栽培密度、生育段階等によっても異なり得る。施用量は、例えば、硫酸化合物単独の場合は、硫酸基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは30mM〜100mMを1000L〜2000L／ヘクタールであり、アンモニア化合物単独の場合はアンモニア基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは5mM〜90mMを500〜1000L／ヘクタールとなる量が好ましい。
【００２２】
また、植物ストレス軽減剤が硫酸化合物及びアンモニウム化合物の両方を含む場合は、硫酸基化合物は硫酸基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは3mM〜50mMを1000L〜2000L／ヘクタールであり、アンモニア化合物はアンモニア基換算で、通常1〜100mMを100L〜2000L／ヘクタール、好ましくは5mM〜90mMを500〜1000L／ヘクタールとなる量が好ましい。
【００２３】
尚、ストレスの原因となる薬剤が無機金属の硫酸化合物の場合は、この硫酸化合物に由来する硫酸基の量も、上記施用量に含まれる。
【００２４】
施用時期は、植物がストレスに曝される時期が好ましいが、多少前後してもよい。また、一度に前記範囲の量を施用してもよく、同日に複数回に分けて施用してもよい。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明の実施例を示すが、本発明の要旨を超えない限り、以下の実施例に制約されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕遺伝子発現を指標とした硫酸アンモニウムによる植物ストレス応答性遺伝子誘導抑制の評価
（１）植物体の栽培と処理方法
シロイヌナズナは、野生型株（Col-0）を用いた。栽培には寒天培地を用い、OptMS無機塩類培養液Zn1/100 （表１）に1%スクロース、0.8%寒天を加えた培地に種子を播種し、２
週間栽培した。シャーレは、10cm径の深底シャーレ（テルモ）を用い、シャーレあたり14株を栽培した。日周は16時間明期で光強度はおよそ70μmol m-2 s-1、23℃で栽培した。下記の各試料を、13日間栽培した幼植物１個体の４枚の本葉に、5μlずつ滴下処理した。各試料は、各々６個体の植物に適用した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）。「アプローチ」は同社の登録商標である。)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００２７】
試料１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：1.53mM 硫酸亜鉛、7.6mM 塩化アンモニウム水溶液
試料４：1.53mM 硫酸亜鉛、76mM 塩化アンモニウム水溶液
試料５：1.53mM 硫酸亜鉛、7.6mM 硝酸アンモニウム水溶液
試料６：1.53mM 硫酸亜鉛、76mM 硝酸アンモニウム水溶液
試料７：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸マグネシウム水溶液
試料８：1.53mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸マグネシウム水溶液
【００２８】
【表１】
【００２９】
（２）RT-PCRによる遺伝子発現解析
遺伝子発現解析は、定量的PCRによって実施した。各試料による処理から5〜24時間後に、各々の植物（６個体づつ）の地上部全体からRNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて全RNAを抽出した。６個体を１サンプルとして、N=3で実験を行った。全RNAをRNase free DNase Set (QIAGEN)を用いてDNase処理した後、逆転写酵素High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて逆転写を行ない、合成した一本鎖cDNAを鋳型として定量PCRを行なった。
【００３０】
定量PCRはABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) を用い、反応条件は95℃ 15秒、60℃
60秒を、40サイクルで行った。試薬はPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いた。各遺伝子発現解析用プライマーは表２に記載したものを用いた。各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるACT2の発現で標準化した相対的発現量で示した。
【００３１】
【表２】
【００３２】
（３）硫酸アンモニウムによるシロイヌナズナの傷害ストレス抑制効果
試料１及び２で処理したシロイヌナズナにおける、PR4、PDF1.2、HSP17.6遺伝子の発現を図１に示す。硫酸亜鉛処理後５時間でHSP17.6の発現が、24時間でPR4、PDF1.2遺伝子の発現が誘導されたが、硫酸アンモニウム混合区においては顕著に抑制された。これらの結果により、硫酸アンモニウムが植物の傷害ストレスを抑制することが示された。
【００３３】
また、試料１〜８で処理したシロイヌナズナにおける、PR4、PDF4.2遺伝子の発現を図２に示す。硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムにも硫酸アンモニウムと同様の効果が見られた。また、硫酸マグネシウムも38mM濃度ではストレス応答性遺伝子の発現を抑制した。硫酸化合物とアンモニウム化合物いずれによっても硫酸亜鉛傷害ストレスを抑制できることが示された。
【００３４】
〔実施例２〕硫酸アンモニウムによるシロイヌナズナZn薬害軽減効果
（１）植物体の栽培と処理方法
実施例１と同様にして、イロイヌナズナ野生型株（Col-0）を栽培した。下記の試料１〜３を、11日間栽培した幼植物１個体の２枚の葉に7.5μlずつ滴下処理した。各試料は、各々10個体の植物に適用した。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００３５】
試料１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：7.65mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：7.65mM 硫酸亜鉛、38mM 硫酸アンモニウム水溶液
【００３６】
（２）クロロフィル濃度測定
クロロフィル濃度測定は、Porraら（Porra R. J. et al, Biochim. Biophys. Acta, 1989, 975:384-394）の方法に準じた。各試料による処理から３日後に、各々の植物（10個体づつ）の葉（一個体２葉（第一第二本葉））を2mlチューブに入れて破砕したのち、ミリQ水を200μl入れ、軽くボルテックスミキサにより攪拌した。２枚×10個体(20枚)を１サンプルとし、N=3で実験を行った。次に、アセトン800μlを加え、破砕物をよく懸濁させた。遮光下で24時間静置後、3000rpm、室温で5分遠心分離した。上清を適宜希釈し(約1
0倍）、分光測定器を用いて、663.6nmと646.6nmの二波長での吸光度をそれぞれ測定した。次式によりクロロフィル（Chls a+b）濃度を計算した。
Chls a + b = 19.54*A646.6 + 8.29*A663.6 (μM)
【００３７】
上記評価結果を図３に示す。硫酸亜鉛処理後３日で亜鉛による薬害（クロロシス）が引き起こされたが、硫酸アンモニウム混合区においては、薬害が抑制された。同効果には濃度依存性が見られ、3.8mMから38mMまで効果が増加した。
【００３８】
〔実施例３〕Ｌ−グルタミン酸発酵副生液によるシロイヌナズナのストレス応答性遺伝子誘導抑制効果と薬害軽減効果
（１）実施例１と同様にして、イロイヌナズナ野生型株（Col-0）を栽培した。500倍希釈したグルタミン酸発酵副生液（硫酸アンモニウム3.8mMを含む）に硫酸亜鉛を1.53mMになるように混合し、13日間栽培した幼植物１個体の４枚の葉に5μlずつ滴下処理した。グルタミン酸発酵副生液は、６個体の植物に適用した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBIR(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００３９】
前記グルタミン酸発酵副生液は、微生物としてCorynebacterium glutamicumを使用し、CM-Dex培地を用いて培養を行ったものから、WO2006/054566に記載の方法に準じて調製した。このグルタミン酸発酵副生液の原液は硫酸アンモニウムを約1.9M含有している。
【００４０】
試料による処理から5〜24時間後に、各々の植物（６個体ずつ）の葉（一個体４枚）から実施例１と同様にしてRNAを抽出し、ストレス応答性遺伝子誘導抑制効果を検証した。４枚×６個体(24枚)を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４１】
図４に示す通り、グルタミン酸発酵副生液は硫酸亜鉛によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制した。
【００４２】
（２）また、下記試料を、上記と同様にして栽培した幼植物１個体の２枚の葉に7.5μlずつ滴下処理し、実施例２と同様にしてクロロフィル濃度を測定した。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。２枚を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４３】
試料１：7.65mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
試料３：7.65mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
【００４４】
結果を図５に示す。いずれの濃度でも、グルタミン酸発酵副生液は、硫酸亜鉛による薬害（クロロシス）を顕著に抑制することが示された。
【００４５】
（３）下記試料を、上記と同様にして栽培した幼植物１個体の４枚の葉に5μlずつ滴下処理し、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。４枚を１サンプルとし、N=3で実験を行った。
【００４６】
試料１：1.53mM 硫酸亜鉛水溶液
試料２：1.53mM 硫酸亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料３：1.53mM 硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液
試料４：1.53mM 塩化亜鉛水溶液
試料５：1.53mM 塩化亜鉛、3.8mM 硫酸アンモニウム水溶液
試料６：1.53mM 塩化亜鉛、グルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
結果を図６に示す。効果は硫酸亜鉛に限定されることなく、塩化亜鉛に対しても同様であることが示された。
【００４７】
（４）試料を下記試料に変えた以外は、上記と同様にして、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBI(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。
【００４８】
試料１：0.039mM硫酸銅(II)五水和物水溶液
試料２：0.039mM硫酸銅(II)五水和物を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
試料３：0.157mM硫酸銅(II)五水和物水溶液
試料４：0.157mM硫酸銅(II)五水和物を含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【００４９】
結果を図７Ａに示す。効果は亜鉛に限定されることなく、銅（硫酸銅）によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制することが示された。
【００５０】
（５）試料を下記試料に変えた以外は、上記と同様にして、ストレス応答性遺伝子の発現を調べた。対照として、水を用いた。各試料には、展着剤アプローチBIR(花王（株）)を終濃度0.1%になるように添加した。硫酸銅、Fe(III)-EDTAの濃度（ppm）は、銅又は鉄換算の濃度である。
【００５１】
試料１：8.95mM Fe(III)-EDTA水溶液
試料２：8.95mM Fe(III)-EDTAを含むグルタミン酸発酵副生液500倍希釈液
【００５２】
結果を図７Ｂに示す。効果は亜鉛に限定されることなく、鉄（Fe(III)-EDTA）によるストレス応答性遺伝子誘導を抑制することが示された。
【００５３】
〔実施例４〕各種作物におけるグルタミン酸発酵副生液による薬害軽減効果評価
（１）作物の栽培と葉面処理
アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ハクサイ、ダイコン）、ナス科（トウガラシ）、キク科（シュンギク）、及びマメ科（ダイズ）の植物について、グルタミン酸発酵副生液の薬害軽減効果を調べた。
【００５４】
各植物は、5cm角のロックウール（日東紡社製、サイズV 50x50x50mm、ポリエチレンフィルムカバー無し）を用いて栽培した。肥料として通常の25%濃度のOptMS無機塩類培養液（表１）を栽培開始時および開始後週１回与え、施肥と別の日に水を週１〜２回与えた。閉鎖系温室において自然光の下で栽培した。播種後第２週と第３週目の各種作物の第１、第２本葉に、0.1%硫酸亜鉛水溶液、又は0.1%硫酸亜鉛を含むグルタミン酸発酵副生液50倍希釈液をスプレー処理したのち、薬害が生じたタイミングで薬害判定を行った。
【００５５】
（２）薬害判定
薬害の程度に応じてインデックスを各実験回で規定し、5段階評価を行った（最も軽度が０、最も重度が４）。評価結果を平均し、数値ごとに4段階に分類した。0〜1.4は（-）、1.5〜4は（+）、4.1〜6.0は（++）、6.1〜8.0は（+++）と表記した。
表３及び図８に示すとおり、アブラナ科植物やマメ科植物において顕著な薬害軽減効果が確認できた。
【００５６】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤。
【請求項２】
植物ストレスが植物薬害ストレスであることを特徴とする請求項１に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項３】
前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、請求項１又は２に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項４】
硫酸化合物が無機硫酸化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項５】
アンモニウム化合物が無機アンモニウム化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項６】
硫酸化合物及びアンニモウム化合物の両方を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項７】
無機硫酸化合物又は無機アンモニウム化合物が、硫酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、又は塩化アンモニウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項８】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物が、硫酸アンモニウム、又は硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物であることを特徴とする、請求項６に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項９】
植物薬害ストレスが、亜鉛化合物、銅化合物、又は鉄化合物による薬害ストレスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１０】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物を、硫酸基及びアンモニウム基換算で、各々１ｍＭ〜１００ｍＭ含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１１】
さらに、植物ストレスの原因となるミネラルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１２】
植物の葉、花、根、又は果実に施用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１３】
葉面散布により植物に施用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤を植物に施用することを特徴とする、植物のストレスを軽減する方法。
【請求項１５】
前記植物ストレスが、植物薬害ストレスであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ストレス軽減剤を、葉面散布により植物に施用することを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
硫酸化合物もしくはアンモニウム化合物、又はこれらの両方を有効成分として含有する、植物ストレス軽減剤。
【請求項２】
植物ストレスが植物薬害ストレスであることを特徴とする請求項１に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項３】
前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、請求項１又は２に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項４】
硫酸化合物が無機硫酸化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項５】
アンモニウム化合物が無機アンモニウム化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項６】
硫酸化合物及びアンニモウム化合物の両方を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項７】
無機硫酸化合物又は無機アンモニウム化合物が、硫酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、又は塩化アンモニウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項８】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物が、硫酸アンモニウム、又は硫酸化合物及びアンモニウム化合物を含む発酵副生物であることを特徴とする、請求項６に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項９】
植物薬害ストレスが、亜鉛化合物、銅化合物、又は鉄化合物による薬害ストレスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１０】
硫酸化合物及びアンモニウム化合物を、硫酸基及びアンモニウム基換算で、各々１ｍＭ〜１００ｍＭ含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１１】
さらに、植物ストレスの原因となるミネラルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１２】
植物の葉、花、根、又は果実に施用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１３】
葉面散布により植物に施用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の植物ストレス軽減剤を植物に施用することを特徴とする、植物のストレスを軽減する方法。
【請求項１５】
前記植物ストレスが、植物薬害ストレスであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬害ストレスがミネラルによる薬害ストレスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ストレス軽減剤を、葉面散布により植物に施用することを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−４９６３１（Ｐ２０１３−４９６３１Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９１０５６（Ｐ２００９−２９１０５６）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]