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植物中でのN−グリカンのヒト化及び最適化のための組成物及び方法
説明

植物中でのN−グリカンのヒト化及び最適化のための組成物及び方法

高等植物中でタンパク質のN−グリコシル化パターンを変化させる方法を提供する。その方法は、植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現の阻害をもたらす組換え構築物を植物中に導入するステップを含む。これらの構築物を使用してこれらの酵素の両方、及びそのアイソフォームの発現を阻害又は抑制すると、有利には、植物の成長及び発達に影響せずに「ヒト化」N−グリコシル化パターンを有する内因性の異種タンパク質が産生する。このタンパク質N−グリコシル化パターンを有する、安定に形質転換された高等植物を提供する。実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、G0グライコフォームについて実質的に同種である、モノクローナル抗体組成物を含めた糖タンパク質組成物も提供する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
変化したN−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現するように安定に形質転換されているトランスジェニック高等植物であって、前記変化したN−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース及びβ1,2−キシロース残基と、前記糖タンパク質のN−グリカンとの結合の低下を特徴とするトランスジェニック高等植物。
【請求項2】
N−グリカンにフコース及びキシロース残基がない、請求項1に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項3】
変化したN−グリコシル化パターンを有する哺乳動物糖タンパク質を産生する能力を有する、請求項1又は2に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項4】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項3に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項5】
モノクローナル抗体の変化したN−グリコシル化パターンによって、前記モノクローナル抗体が、FcγRIIIに対する結合親和性の増大、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の増大、補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下、又はその任意の組合せを示す、請求項4に記載のトランスジェニック高等植物。
【請求項6】
変化したN−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現するウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒であって、前記変化したN−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基、β1,2−キシロース残基、又はα1,3−フコース残基とβ1,2−キシロース残基の両方と、前記糖タンパク質のN−グリカンとの結合の低下を特徴とするウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項7】
N−グリカンにフコース残基がなく、キシロース残基がなく、又は前記フコース及びキシロース残基がない、請求項6に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項8】
所望の哺乳動物糖タンパク質を産生する能力を有する、請求項6又は請求項7に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項9】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項8に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項10】
モノクローナル抗体の変化したN−グリコシル化パターンによって、前記モノクローナル抗体が、FcγRIIIに対する結合親和性の増大、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の増大、補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下、又はその任意の組合せを示す、請求項9に記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒。
【請求項11】
請求項6〜10のいずれかに記載のウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒により産生された糖タンパク質を含む組成物。
【請求項12】
N−グリカンにフコース及びキシロース残基がない、請求項11に記載の組成物。
【請求項13】
糖タンパク質が、G0グリカン種と対応する単一の主たるピークの存在を特徴とするN−グリコシル化プロファイルを有する、請求項12に記載の組成物。
【請求項14】
糖タンパク質が、所望のモノクローナル抗体である、請求項13に記載の組成物。
【請求項15】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも1つのα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害するステップであって、前記FucTが配列番号3で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項16】
FucTが配列番号3で示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項17】
FucTが配列番号3で示すアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項18】
FucTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記FucTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項15に記載の方法。
【請求項19】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項18に記載の方法。
【請求項20】
第1ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(b)配列番号2で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項22】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含み、スペーサー配列がイントロンを含む、請求項21又は22に記載の方法。
【請求項24】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも1つのβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害するステップをさらに含み、前記XyltTが配列番号6又は配列番号21で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項25】
XylTが配列番号6又は配列番号21で示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
XylTが配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項27】
XylTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記XylTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項24に記載の方法。
【請求項28】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でXylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、
(a)配列番号4、配列番号19で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(b)配列番号5、配列番号20で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項31】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項30又は31に記載の方法。
【請求項33】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくはノジュール中でFucT及びXylTの発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入し、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項24に記載の方法。
【請求項34】
融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)(i)FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を順不同で含むキメラ順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項35に記載の方法。
【請求項37】
(a)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
(b)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項34又は35に記載の方法。
【請求項38】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で少なくとも1つのβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害するステップであって、前記XyltTが配列番号6又は配列番号21で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項39】
XylTが配列番号6又は配列番号21で示す配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項40】
XylTが配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
XylTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記XylTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項38に記載の方法。
【請求項42】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でXylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、
(a)配列番号4、配列番号19で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(b)配列番号5、配列番号20で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号21の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700ヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項45】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項44に記載の方法。
【請求項46】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列がイントロンである、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列がイントロンである、
請求項44又は45に記載の方法。
【請求項47】
異種ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項15〜46のいずれかに記載の方法。
【請求項48】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
【請求項50】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列と、植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列とを含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列及び前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する少なくとも1つのプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項51】
第1ヌクレオチド配列が第1プロモーターと作動的に連結し、第2ヌクレオチド配列が第2プロモーターと作動的に連結している、請求項50に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項52】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項51に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項53】
第1ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(b)配列番号2で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項52に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項54】
第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含む、請求項52に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項55】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項54に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項56】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項54又は55に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項57】
第1ヌクレオチド配列のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項54〜56のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項58】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項52〜57のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項59】
第2ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号4若しくは配列番号19で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(b)配列番号5若しくは配列番号20で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項58に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項60】
第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第2ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項58に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項61】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項60に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項62】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項60又は61に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項63】
第2ヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項60〜62のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項64】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項65】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項64に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項66】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項64又は65に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項67】
融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)(i)FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項64〜66のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項68】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項67に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項69】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項67又は68に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項70】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項67に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項71】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項70に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項72】
キメラ順方向断片が、
(a)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943、又は
(b)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626
を含む、請求項70又は71に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項73】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項70〜72のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項74】
融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向で作動的に連結した
(a)(i)XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含む、請求項64〜66のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項75】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項74に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項76】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項74又は75に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項77】
第1断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項74に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項78】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項77に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項79】
スペーサー配列がイントロンを含む、請求項77又は請求項78に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項80】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項81】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項80に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項82】
第1ポリヌクレオチドのスペーサー配列がイントロンを含む、請求項80又は81に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項83】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項80に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項84】
FucT順方向断片が、配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項83に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項85】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項84に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項86】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項84又は85に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項87】
第1ポリヌクレオチド配列のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項84〜86のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項88】
植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700ヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項89】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項88に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項90】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項88又は89に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項91】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項88に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項92】
XylT順方向断片が、配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項91に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項93】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項92に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項94】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチドnt318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項92又は93に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項95】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項92〜94のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項96】
所望のポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをさらに含み、前記所望のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項50〜95のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項97】
所望のポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項96に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項98】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項97に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項99】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項97に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項100】
請求項50〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項101】
そのゲノム中に安定に組み込まれた請求項50〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含む植物又は植物細胞。
【請求項102】
植物が単子葉類であるか、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項101に記載の植物又は植物細胞。
【請求項103】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項102に記載の植物又は植物細胞。
【請求項104】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項103に記載の植物又は植物細胞。
【請求項105】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項104に記載の植物又は植物細胞。
【請求項106】
植物が双子葉類であるか、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項101に記載の植物又は植物細胞。
【請求項107】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項50〜95のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項108】
高等植物が、少なくとも1つの所望の異種ポリペプチドを発現する植物宿主である、請求項107に記載の方法。
【請求項109】
所望の異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその変異体である、請求項108に記載の方法。
【請求項110】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項109に記載の方法。
【請求項111】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項109に記載の方法。
【請求項112】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する、所望の異種ポリペプチドを発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項96〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項113】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項112に記載の方法。
【請求項114】
N−グリコシル化パターンが、β1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項112に記載の方法。
【請求項115】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基及びβ1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項112に記載の方法。
【請求項116】
高等植物中で異種哺乳動物糖タンパク質を産生する方法であって、前記異種哺乳動物糖タンパク質では、前記高等植物中で産生されたときに、α1,3−フコース及びβ1,2−キシロース残基と、前記糖タンパク質のN−グリカンとの結合が低下し、
(a)前記糖タンパク質として翻訳後プロセシングされる哺乳動物ポリペプチドをコードする配列、及び請求項50〜79のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むポリヌクレオチドとを含む発現カセットを前記植物中に導入するステップと、
(b)前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップと
を含む方法。
【請求項117】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項116に記載の方法。
【請求項118】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
【請求項119】
高等植物が単子葉類である、請求項107〜118のいずれかに記載の方法。
【請求項120】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項119に記載の方法。
【請求項121】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項120に記載の方法。
【請求項122】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項121に記載の方法。
【請求項123】
高等植物が双子葉類である、請求項107〜118のいずれかに記載の方法。
【請求項124】
高等植物中で産生された糖タンパク質のN−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法であって、前記植物中に請求項50〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップと、前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップとを含む方法。
【請求項125】
糖タンパク質が内因性糖タンパク質である、請求項124に記載の方法。
【請求項126】
糖タンパク質が異種糖タンパク質である、請求項124に記載の方法。
【請求項127】
異種糖タンパク質が哺乳動物糖タンパク質である、請求項126に記載の方法。
【請求項128】
哺乳動物糖タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項127に記載の方法。
【請求項129】
哺乳動物糖タンパク質が、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項127に記載の方法。
【請求項130】
高等植物が単子葉類である、請求項124〜132のいずれかに記載の方法。
【請求項131】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項130に記載の方法。
【請求項132】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項131に記載の方法。
【請求項133】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項132に記載の方法。
【請求項134】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の生産をスケールアップしても維持され、生産スケールが少なくとも6,500倍に増大する、請求項131〜133のいずれかに記載の方法。
【請求項135】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を行っても維持される、請求項131〜134のいずれかに記載の方法。
【請求項136】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を少なくとも8カ月行っても維持される、請求項135に記載の方法。
【請求項137】
高等植物が双子葉類である、請求項124〜132のいずれかに記載の方法。
【請求項138】
単離されたポリヌクレオチドであって、
(a)配列番号1又は配列番号2で示すヌクレオチド配列、
(b)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20で示すヌクレオチド配列、
(c)配列番号3、配列番号6、又は配列番号21で示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(d)配列番号1又は配列番号2で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を含むヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(e)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を含むヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(f)配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号19、若しくは配列番号20の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列、又はその相補体、
(g)配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列及びその相補体、
(h)配列番号3で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがFucT活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(i)配列番号6又は配列番号21で示す配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチドがXylT活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、並びに
(j)前記項目(a)〜(i)のいずれか1つのヌクレオチド配列の相補体
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項139】
請求項138に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項140】
ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項139に記載の発現カセット。
【請求項141】
請求項140に記載の発現カセットを含む植物又は植物細胞。
【請求項142】
植物が単子葉類であるか、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項141に記載の植物又は植物細胞。
【請求項143】
単子葉類がウキクサ科のメンバーである、請求項142に記載の植物又は植物細胞。
【請求項144】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項143に記載の植物又は植物細胞。
【請求項145】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項144に記載の植物又は植物細胞。
【請求項146】
植物が双子葉類であるか、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項141に記載の植物又は植物細胞。
【請求項147】
ポリヌクレオチドが植物又は植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、請求項141〜146のいずれかに記載の植物又は植物細胞。
【請求項148】
単離されたポリペプチドであって、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)活性を有するアミノ酸配列、
(c)配列番号3の少なくとも20個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがFucT活性を有するアミノ酸配列、
(d)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、
(e)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)活性を有するアミノ酸配列、及び
(f)配列番号6又は配列番号21の少なくとも20個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドがXylT活性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項149】
請求項116〜137のいずれかに記載の方法に従って産生された糖タンパク質を含む組成物。

【図1】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図3】
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【図4A】
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【図4B】
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【図4C】
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【図4D】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29A】
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【図29B】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41A】
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【図41B】
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【図42】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51A】
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【図51B】
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【図52】
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【図53】
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【公表番号】特表2009−523432(P2009−523432A)
【公表日】平成21年6月25日(2009.6.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−550560(P2008−550560)
【出願日】平成19年1月17日(2007.1.17)
【国際出願番号】PCT/US2007/060642
【国際公開番号】WO2007/084922
【国際公開日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【出願人】(506005466)バイオレックス セラピュティックス インク (5)
【Fターム(参考)】