植物中でのN−グリカンのヒト化及び最適化のための組成物及び方法
高等植物中でタンパク質のN−グリコシル化パターンを変化させる方法を提供する。その方法は、植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現の阻害をもたらす組換え構築物を植物中に導入するステップを含む。これらの構築物を使用してこれらの酵素の両方、及びそのアイソフォームの発現を阻害又は抑制すると、有利には、植物の成長及び発達に影響せずに「ヒト化」N−グリコシル化パターンを有する内因性の異種タンパク質が産生する。このタンパク質N−グリコシル化パターンを有する、安定に形質転換された高等植物を提供する。実質的に同種のグリコシル化プロファイルを有し、G0グリコフォームについて実質的に同種である、モノクローナル抗体組成物を含めた糖タンパク質組成物も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
実質的に同種のN−グリコシル化プロファイルを含む糖タンパク質組成物であって、前記プロファイル中に存在するN−グリカン種の少なくとも90%がGlcNAc2Man3GlcNAc2(G0)であり、前記プロファイルが微量の前駆N−グリカン種を含み、前記前駆N−グリカン種が、Man3GlcNAc2、GlcNac1が1,3マンノース腕に結合しているGlcNac1Man3GlcNAc2(MGn)、GlcNac1が1,6マンノース腕に結合しているGlcNac1Man3GlcNAc2(GnM)、及びその任意の組合せからなる群から選択される糖タンパク質組成物。
【請求項2】
糖タンパク質がイムノグロブリンである、請求項1に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項3】
イムノグロブリンが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4領域からなる群から選択されるFc領域を含む、請求項2に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項4】
イムノグロブリンがモノクローナル抗体である、請求項2に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項5】
モノクローナル抗体が、CD20及びERBB2(HER2)からなる群から選択される抗原と結合する、請求項4に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項6】
イムノグロブリンがFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項2〜5のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項7】
イムノグロブリンが抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項2〜6のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項8】
イムノグロブリンが補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す、請求項2〜7のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項9】
実質的に同種の糖タンパク質組成物であって、前記組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも90%がG0グライコフォームによって表され、前記組成物が微量の前駆グリコフォームを含む糖タンパク質組成物。
【請求項10】
糖タンパク質がイムノグロブリンである、請求項9に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項11】
イムノグロブリンが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4領域からなる群から選択されるFc領域を含む、請求項10に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項12】
イムノグロブリンがモノクローナル抗体である、請求項10に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項13】
モノクローナル抗体が、CD20及びERBB2(HER2)からなる群から選択される抗原と結合する、請求項12に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項14】
イムノグロブリンがFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項10〜13のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項15】
イムノグロブリンが抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項10〜14のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項16】
イムノグロブリンが補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す、請求項10〜15のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項17】
請求項1〜16のいずれかに記載の糖タンパク質組成物を含む医薬品組成物。
【請求項18】
請求項1〜16のいずれかに記載の糖タンパク質組成物を含む宿主細胞。
【請求項19】
宿主細胞が植物宿主細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項20】
植物がウキクサである、請求項19に記載の宿主細胞。
【請求項21】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(ii)前記FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項22】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含み、スペーサー配列が配列番号1のnt986〜1444を含む、請求項21又は請求項22に記載の方法。
【請求項24】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(ii)前記センスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、前記第1ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項25】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害するステップをさらに含む、請求項21〜25のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
XylTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記XylTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でXylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)前記XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項29又は請求項30に記載の方法。
【請求項32】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写される、請求項28に記載の方法。
【請求項33】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項32に記載の方法。
【請求項34】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号6又は配列番号21の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(ii)前記XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項35】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項34又は請求項35に記載の方法。
【請求項37】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(ii)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項38】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項37に記載の方法。
【請求項39】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害するステップをさらに含む、請求項34〜38のいずれかに記載の方法。
【請求項40】
FucTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記FucTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)(a)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(b)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(ii)前記キメラ順方向断片の前記第2断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項42】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
(a)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt944〜1443を含む、又は
(b)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt627〜1126を含む、
請求項42又は請求項43に記載の方法。
【請求項45】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)(a)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(b)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(ii)前記キメラ順方向断片の前記第2断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項46】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
第1断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項48】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項50】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項49に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項51】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項49又は請求項50に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項52】
配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項49〜51のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項53】
スペーサー配列が配列番号1の(nt)986〜1444を含む、請求項52に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項54】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記センスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第1ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるヌクレオチド構築物。
【請求項55】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項54に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項56】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項49〜55のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項57】
第2ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号4若しくは配列番号19で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(b)配列番号5若しくは配列番号20で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項58】
第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第2ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項59】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項58に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項60】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項58又は請求項59に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項61】
第2ヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項58〜60のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項62】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項61に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項63】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項62に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項64】
第2ヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項58〜60のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項65】
第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第2ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写される、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項66】
第2ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項65に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項67】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第2ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項68】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項67に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項69】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項67又は請求項68に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項70】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項67〜69のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項71】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項70に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項72】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第2ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるヌクレオチド構築物。
【請求項73】
第2ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項72に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項74】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項67〜73のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項75】
第1ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(b)配列番号2で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項74に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項76】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)(i)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記XylTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項77】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項76に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項78】
スペーサー配列が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項76又は請求項77に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項79】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項76〜78のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項80】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項76〜79のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項81】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項76に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項82】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項81に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項83】
キメラ順方向断片が
(a)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943、又は
(b)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626
を含む、請求項81又は請求項82に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項84】
スペーサー配列が配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項81〜83のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項85】
ヌクレオチド断片が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項84に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項86】
(a)キメラ順方向断片が配列番号1のnt254〜855及び配列番号4のnt318〜943を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt944〜1443を含む、又は
(b)キメラ順方向断片が配列番号1のnt254〜855及び配列番号19のnt1〜626を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt627〜1126を含む、
請求項85に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項87】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向で作動的に連結した
(a)(i)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記FucTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項88】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項87に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項89】
スペーサー配列が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項87又は請求項88に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項90】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項87〜89のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項91】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項87〜90のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項92】
第1断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項87に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項93】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項92に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項94】
スペーサー配列が、配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項92又は請求項93に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項95】
ヌクレオチド断片が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項94に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項96】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記FucTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項97】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項96に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項98】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項96又は請求項97に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項99】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項96に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項100】
FucT順方向断片が、配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項99に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項101】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項100に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項102】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項100又は請求項101に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項103】
第1ポリヌクレオチド配列のスペーサー配列が、配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項100〜102のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項104】
配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項103に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項105】
スペーサー配列が配列番号1のnt986〜1444を含む、請求項104に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項106】
植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記XylTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項107】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項106に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項108】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項106又は請求項107に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項109】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項106に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項110】
XylT順方向断片が、配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項109に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項111】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項110に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項112】
XylT順方向断片が、配列番号4のヌクレオチドnt318〜1052、又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項110又は請求項111に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項113】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項110〜112のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項114】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項113に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項115】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)前記XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項114に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項116】
対象とするポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをさらに含み、前記対象とするポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項49〜115のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項117】
対象とするポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項116に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項118】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項117に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項119】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項117に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項120】
請求項49〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項121】
そのゲノム中に安定に組み込まれた請求項49〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含む植物又は植物細胞。
【請求項122】
植物が単子葉類であり、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項121に記載の植物又は植物細胞。
【請求項123】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項122に記載の植物又は植物細胞。
【請求項124】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項123に記載の植物又は植物細胞。
【請求項125】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項124に記載の植物又は植物細胞。
【請求項126】
植物が双子葉類であり、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項121に記載の植物又は植物細胞。
【請求項127】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項50〜95のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項128】
高等植物が、少なくとも1つの対象とする異種ポリペプチドを発現する植物宿主である、請求項127に記載の方法。
【請求項129】
対象とする異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその変異体である、請求項128に記載の方法。
【請求項130】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項129に記載の方法。
【請求項131】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項129に記載の方法。
【請求項132】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する、対象とする異種ポリペプチドを発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項116〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項133】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項134】
N−グリコシル化パターンが、β1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項135】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基及びβ1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項136】
高等植物中で異種哺乳動物糖タンパク質を産生する方法であって、前記異種哺乳動物糖タンパク質では、前記高等植物中で産生されたときに、α1,3−フコース及びβ1,2−キシロース残基と、前記糖タンパク質のN−グリカンとの結合が低下し、
(a)前記糖タンパク質として翻訳後プロセシングされる哺乳動物ポリペプチドをコードする配列、及び請求項50〜79のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを前記植物中に導入するステップと、
(b)前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップと
を含む方法。
【請求項137】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項136に記載の方法。
【請求項138】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項136に記載の方法。
【請求項139】
高等植物が単子葉類である、請求項127〜138のいずれかに記載の方法。
【請求項140】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項139に記載の方法。
【請求項141】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項140に記載の方法。
【請求項142】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項141に記載の方法。
【請求項143】
高等植物が双子葉類である、請求項127〜138のいずれかに記載の方法。
【請求項144】
高等植物中で産生された糖タンパク質のN−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法であって、前記植物中に請求項50〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップと、前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップとを含む方法。
【請求項145】
糖タンパク質が内因性糖タンパク質である、請求項144に記載の方法。
【請求項146】
糖タンパク質が異種糖タンパク質である、請求項144に記載の方法。
【請求項147】
異種糖タンパク質が哺乳動物糖タンパク質である、請求項146に記載の方法。
【請求項148】
哺乳動物糖タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項147に記載の方法。
【請求項149】
哺乳動物糖タンパク質が、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項147に記載の方法。
【請求項150】
プロファイル内のN−グリカンの少なくとも90%がGlcNAc2Man3GlcNAc2(G0)であり、前記プロファイルに、フコース、キシロース、又はフコースとキシロースの両方が結合したN−グリカン種がない、請求項144〜149のいずれかに記載の方法。
【請求項151】
プロファイル内のN−グリカンの少なくとも95%がG0である、請求項150に記載の方法。
【請求項152】
高等植物が単子葉類である、請求項144〜151のいずれかに記載の方法。
【請求項153】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項152に記載の方法。
【請求項154】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項153に記載の方法。
【請求項155】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項154に記載の方法。
【請求項156】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の生産をスケールアップしても維持され、生産スケールが少なくとも6,500倍に増大する、請求項153〜155のいずれかに記載の方法。
【請求項157】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を行っても維持される、請求項153〜156のいずれかに記載の方法。
【請求項158】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を少なくとも8ヶ月行っても維持される、請求項157に記載の方法。
【請求項159】
高等植物が双子葉類である、請求項144〜151のいずれかに記載の方法。
【請求項160】
抗体の投与に伴う補体活性化と関係する1つ又は複数の有害な副作用を低減する方法であって、実質的に同種の抗体組成物の形態で前記抗体を投与するステップを含み、前記組成物中に存在する前記抗体の少なくとも90%がG0グライコフォームによって表され、前記組成物が前駆グライコフォームによって表される微量の前記抗体を含み、前記組成物内の前記抗体が補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す方法。
【請求項161】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項160に記載の方法。
【請求項162】
モノクローナル抗体がCD20抗原と結合する、請求項161に記載の方法。
【請求項163】
抗体がFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項160〜162のいずれかに記載の方法。
【請求項164】
抗体が抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項160〜163のいずれかに記載の方法。
【請求項165】
請求項136〜159のいずれかに記載の方法に従って産生された糖タンパク質を含む組成物。
【請求項1】
実質的に同種のN−グリコシル化プロファイルを含む糖タンパク質組成物であって、前記プロファイル中に存在するN−グリカン種の少なくとも90%がGlcNAc2Man3GlcNAc2(G0)であり、前記プロファイルが微量の前駆N−グリカン種を含み、前記前駆N−グリカン種が、Man3GlcNAc2、GlcNac1が1,3マンノース腕に結合しているGlcNac1Man3GlcNAc2(MGn)、GlcNac1が1,6マンノース腕に結合しているGlcNac1Man3GlcNAc2(GnM)、及びその任意の組合せからなる群から選択される糖タンパク質組成物。
【請求項2】
糖タンパク質がイムノグロブリンである、請求項1に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項3】
イムノグロブリンが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4領域からなる群から選択されるFc領域を含む、請求項2に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項4】
イムノグロブリンがモノクローナル抗体である、請求項2に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項5】
モノクローナル抗体が、CD20及びERBB2(HER2)からなる群から選択される抗原と結合する、請求項4に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項6】
イムノグロブリンがFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項2〜5のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項7】
イムノグロブリンが抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項2〜6のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項8】
イムノグロブリンが補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す、請求項2〜7のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項9】
実質的に同種の糖タンパク質組成物であって、前記組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも90%がG0グライコフォームによって表され、前記組成物が微量の前駆グリコフォームを含む糖タンパク質組成物。
【請求項10】
糖タンパク質がイムノグロブリンである、請求項9に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項11】
イムノグロブリンが、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4領域からなる群から選択されるFc領域を含む、請求項10に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項12】
イムノグロブリンがモノクローナル抗体である、請求項10に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項13】
モノクローナル抗体が、CD20及びERBB2(HER2)からなる群から選択される抗原と結合する、請求項12に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項14】
イムノグロブリンがFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項10〜13のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項15】
イムノグロブリンが抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項10〜14のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項16】
イムノグロブリンが補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す、請求項10〜15のいずれかに記載の糖タンパク質組成物。
【請求項17】
請求項1〜16のいずれかに記載の糖タンパク質組成物を含む医薬品組成物。
【請求項18】
請求項1〜16のいずれかに記載の糖タンパク質組成物を含む宿主細胞。
【請求項19】
宿主細胞が植物宿主細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項20】
植物がウキクサである、請求項19に記載の宿主細胞。
【請求項21】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(ii)前記FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項22】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含み、スペーサー配列が配列番号1のnt986〜1444を含む、請求項21又は請求項22に記載の方法。
【請求項24】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(ii)前記センスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、前記第1ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項25】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害するステップをさらに含む、請求項21〜25のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
XylTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記XylTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記XylTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でXylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップを含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項27に記載の方法。
【請求項29】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)前記XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項29又は請求項30に記載の方法。
【請求項32】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写される、請求項28に記載の方法。
【請求項33】
XylTの発現又は機能を阻害することができるヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項32に記載の方法。
【請求項34】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号6又は配列番号21の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(ii)前記XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項35】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項34又は請求項35に記載の方法。
【請求項37】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(ii)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、前記XylTの発現又は機能を阻害することができる前記ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項38】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項37に記載の方法。
【請求項39】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害するステップをさらに含む、請求項34〜38のいずれかに記載の方法。
【請求項40】
FucTの発現又は機能が、
(a)ポリヌクレオチド又はポリペプチドをウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に導入する方法であって、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で前記FucTの発現又は機能を阻害する方法、
(b)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を消失させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法、及び
(c)ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中の遺伝子を突然変異させる方法であって、前記遺伝子が前記FucTをコードする方法
からなる群から選択される方法によって阻害される、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)(a)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(b)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(ii)前記キメラ順方向断片の前記第2断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項42】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
(a)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt944〜1443を含む、又は
(b)キメラ順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt627〜1126を含む、
請求項42又は請求項43に記載の方法。
【請求項45】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中で産生された異種ポリペプチドのN−グリコシル化パターンを変化させる方法であって、
(a)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中に、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物を導入するステップであって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(i)(a)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(b)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(ii)前記キメラ順方向断片の前記第2断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(iii)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むステップと、
(b)前記異種ポリペプチドの発現に適した条件下で前記ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒を培養するステップと
を含む方法。
【請求項46】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
第1断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項45に記載の方法。
【請求項48】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項50】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項49に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項51】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項49又は請求項50に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項52】
配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項49〜51のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項53】
スペーサー配列が配列番号1の(nt)986〜1444を含む、請求項52に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項54】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第1ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号1の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記センスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第1ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるヌクレオチド構築物。
【請求項55】
第1ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項54に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項56】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項49〜55のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項57】
第2ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号4若しくは配列番号19で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(b)配列番号5若しくは配列番号20で示すヌクレオチド配列、又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項58】
第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)約200〜約700のヌクレオチドを含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第2ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含む、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項59】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項58に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項60】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項58又は請求項59に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項61】
第2ヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項58〜60のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項62】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項61に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項63】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項62に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項64】
第2ヌクレオチド配列内のスペーサー配列がイントロンを含む、請求項58〜60のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項65】
第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第2ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写される、請求項56に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項66】
第2ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項65に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項67】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第2ヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項68】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項67に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項69】
XylT順方向断片が配列番号4のヌクレオチド(nt)318〜1052又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項67又は請求項68に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項70】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜約700のヌクレオチドを含む、請求項67〜69のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項71】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項70に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項72】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ヌクレオチド配列、及び植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第2ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第1プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能する第2プロモーターと作動的に連結し、前記第2ヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)配列番号4又は配列番号19の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列と、
(b)前記項目(a)のセンスヌクレオチド配列の少なくとも19個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列と
を含み、
前記第2ヌクレオチド配列が、約200塩基対より短い塩基対ステムの長さを有する小さなヘアピンRNAとして転写されるヌクレオチド構築物。
【請求項73】
第2ヌクレオチド配列と作動的に連結したプロモーターが3型RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項72に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項74】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項67〜73のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項75】
第1ヌクレオチド配列が、
(a)配列番号1で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(b)配列番号2で示すヌクレオチド配列又はその相補体、
(c)前記項目(a)又は(b)の配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
(d)前記項目(a)〜(c)のいずれか1つのヌクレオチド配列の断片であって、前記ヌクレオチド配列の少なくとも75個の連続したヌクレオチドを含む断片
からなる群から選択される配列を含む、請求項74に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項76】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)(i)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記XylTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項77】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項76に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項78】
スペーサー配列が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項76又は請求項77に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項79】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項76〜78のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項80】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項76〜79のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項81】
第1断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項76に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項82】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項81に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項83】
キメラ順方向断片が
(a)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号4のnt318〜943、又は
(b)配列番号1のヌクレオチド(nt)254〜855及び配列番号19のnt1〜626
を含む、請求項81又は請求項82に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項84】
スペーサー配列が配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項81〜83のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項85】
ヌクレオチド断片が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項84に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項86】
(a)キメラ順方向断片が配列番号1のnt254〜855及び配列番号4のnt318〜943を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt944〜1443を含む、又は
(b)キメラ順方向断片が配列番号1のnt254〜855及び配列番号19のnt1〜626を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt627〜1126を含む、
請求項85に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項87】
ウキクサ植物又はウキクサ植物細胞若しくは根粒中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)及びβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる融合ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、前記融合ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結し、前記融合ポリヌクレオチドが、5’から3’の方向で作動的に連結した
(a)(i)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第1断片と、
(ii)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む第2断片と
を含むキメラ順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記FucTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記融合ポリヌクレオチドが転写されるような十分な長さ及び前記キメラ順方向断片との十分な相補性を有する逆方向断片と
を含むヌクレオチド構築物。
【請求項88】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項87に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項89】
スペーサー配列が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項87又は請求項88に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項90】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項87〜89のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項91】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項87〜90のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項92】
第1断片が、配列番号4又は配列番号19の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含み、第2断片が、配列番号1の約500〜約650個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約650個の連続したヌクレオチドを含む、請求項87に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項93】
逆方向断片が、キメラ順方向断片の相補体、又は前記キメラ順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項92に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項94】
スペーサー配列が、配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項92又は請求項93に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項95】
ヌクレオチド断片が、キメラ順方向断片の第2断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項94に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項96】
植物中でα1,3−フコシルトランスフェラーゼ(FucT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記FucTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むFucT順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記FucTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記FucT順方向断片との十分な相補性を有するFucT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項97】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項96に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項98】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項96又は請求項97に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項99】
FucTが、
(a)配列番号3で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号3で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがFucT活性を有する、請求項96に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項100】
FucT順方向断片が、配列番号1又は配列番号2の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項99に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項101】
FucT逆方向断片が、FucT順方向断片の相補体、又は前記FucT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項100に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項102】
FucT順方向断片が配列番号1のヌクレオチド(nt)255〜985を含む、請求項100又は請求項101に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項103】
第1ポリヌクレオチド配列のスペーサー配列が、配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項100〜102のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項104】
配列番号1で示す配列のヌクレオチド断片が、FucT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項103に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項105】
スペーサー配列が配列番号1のnt986〜1444を含む、請求項104に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項106】
植物中でβ1,2−キシロシルトランスフェラーゼ(XylT)の発現又は機能を阻害することができる第1ポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、前記第1ポリヌクレオチド配列が、5’から3’の方向に作動的に連結した
(a)前記XylTをコードするポリヌクレオチドの約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含むXylT順方向断片と、
(b)長さが約200〜約700のヌクレオチドである、前記XylTをコードする前記ポリヌクレオチドの断片を含むスペーサー配列と、
(c)ヘアピンRNA構造を形成することができるRNA分子として前記第1ポリヌクレオチド配列が転写されるような十分な長さ及び前記XylT順方向断片との十分な相補性を有するXylT逆方向断片と
を含み、
前記第1ポリヌクレオチド配列が、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結しているヌクレオチド構築物。
【請求項107】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項106に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項108】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項106又は請求項107に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項109】
XylTが、
(a)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列、及び
(b)配列番号6又は配列番号21で示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、前記ポリペプチドがXylT活性を有する、請求項106に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項110】
XylT順方向断片が、配列番号4、配列番号5、配列番号19、又は配列番号20の約500〜約800個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する約500〜約800個の連続したヌクレオチドを含む、請求項109に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項111】
XylT逆方向断片が、XylT順方向断片の相補体、又は前記XylT順方向断片の相補体と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項110に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項112】
XylT順方向断片が、配列番号4のヌクレオチドnt318〜1052、又は配列番号19のnt1〜734を含む、請求項110又は請求項111に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項113】
第1ポリヌクレオチド配列内のスペーサー配列が、配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片を含む、請求項110〜112のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項114】
配列番号4又は配列番号19で示す配列のヌクレオチド断片が、XylT順方向断片のすぐ下流に約200〜700のヌクレオチドを含む、請求項113に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項115】
(a)XylT順方向断片が配列番号4のnt318〜1052を含み、スペーサー配列が配列番号4のnt1053〜1599を含む、又は
(b)前記XylT順方向断片が配列番号19のnt1〜734を含み、前記スペーサー配列が配列番号19のnt735〜1282を含む、
請求項114に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項116】
対象とするポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをさらに含み、前記対象とするポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能するプロモーターと作動的に連結している、請求項49〜115のいずれかに記載のヌクレオチド構築物。
【請求項117】
対象とするポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項116に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項118】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項117に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項119】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項117に記載のヌクレオチド構築物。
【請求項120】
請求項49〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項121】
そのゲノム中に安定に組み込まれた請求項49〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含む植物又は植物細胞。
【請求項122】
植物が単子葉類であり、又は植物細胞が単子葉類に由来する、請求項121に記載の植物又は植物細胞。
【請求項123】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項122に記載の植物又は植物細胞。
【請求項124】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項123に記載の植物又は植物細胞。
【請求項125】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項124に記載の植物又は植物細胞。
【請求項126】
植物が双子葉類であり、又は植物細胞が双子葉類に由来する、請求項121に記載の植物又は植物細胞。
【請求項127】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項50〜95のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項128】
高等植物が、少なくとも1つの対象とする異種ポリペプチドを発現する植物宿主である、請求項127に記載の方法。
【請求項129】
対象とする異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチド又は生物学的に活性のあるその変異体である、請求項128に記載の方法。
【請求項130】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項129に記載の方法。
【請求項131】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項129に記載の方法。
【請求項132】
高等植物を安定に形質転換して、変化したN−グリコシル化パターンを有する、対象とする異種ポリペプチドを発現させる方法であって、前記高等植物中に請求項116〜119のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップを含む方法。
【請求項133】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項134】
N−グリコシル化パターンが、β1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項135】
N−グリコシル化パターンが、α1,3−フコース残基及びβ1,2−キシロース残基と、異種ポリペプチドと結合したN−グリカンとの結合の低下を特徴とする、請求項132に記載の方法。
【請求項136】
高等植物中で異種哺乳動物糖タンパク質を産生する方法であって、前記異種哺乳動物糖タンパク質では、前記高等植物中で産生されたときに、α1,3−フコース及びβ1,2−キシロース残基と、前記糖タンパク質のN−グリカンとの結合が低下し、
(a)前記糖タンパク質として翻訳後プロセシングされる哺乳動物ポリペプチドをコードする配列、及び請求項50〜79のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を含むポリヌクレオチドを含む発現カセットを前記植物中に導入するステップと、
(b)前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップと
を含む方法。
【請求項137】
哺乳動物ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項136に記載の方法。
【請求項138】
哺乳動物ポリペプチドが、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項136に記載の方法。
【請求項139】
高等植物が単子葉類である、請求項127〜138のいずれかに記載の方法。
【請求項140】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項139に記載の方法。
【請求項141】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項140に記載の方法。
【請求項142】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項141に記載の方法。
【請求項143】
高等植物が双子葉類である、請求項127〜138のいずれかに記載の方法。
【請求項144】
高等植物中で産生された糖タンパク質のN−グリコシル化プロファイルの異種性を低下させる方法であって、前記植物中に請求項50〜99のいずれかに記載のヌクレオチド構築物を導入するステップと、前記糖タンパク質の発現に適した条件下で前記植物を培養するステップとを含む方法。
【請求項145】
糖タンパク質が内因性糖タンパク質である、請求項144に記載の方法。
【請求項146】
糖タンパク質が異種糖タンパク質である、請求項144に記載の方法。
【請求項147】
異種糖タンパク質が哺乳動物糖タンパク質である、請求項146に記載の方法。
【請求項148】
哺乳動物糖タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項147に記載の方法。
【請求項149】
哺乳動物糖タンパク質が、インターフェロン、エリスロポエチン(EPO)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、プラスミノーゲン、血液凝固因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、及び治療用イムノグロブリンからなる群から選択される、請求項147に記載の方法。
【請求項150】
プロファイル内のN−グリカンの少なくとも90%がGlcNAc2Man3GlcNAc2(G0)であり、前記プロファイルに、フコース、キシロース、又はフコースとキシロースの両方が結合したN−グリカン種がない、請求項144〜149のいずれかに記載の方法。
【請求項151】
プロファイル内のN−グリカンの少なくとも95%がG0である、請求項150に記載の方法。
【請求項152】
高等植物が単子葉類である、請求項144〜151のいずれかに記載の方法。
【請求項153】
単子葉類がウキクサ科の構成要素である、請求項152に記載の方法。
【請求項154】
単子葉類が、スピロデラ属、ウォルフィア属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属、及びレムナ属からなる群から選択される属に由来する、請求項153に記載の方法。
【請求項155】
単子葉類が、コウキクサ、ヒナウキクサ、ナンゴクアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種の構成要素である、請求項154に記載の方法。
【請求項156】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の生産をスケールアップしても維持され、生産スケールが少なくとも6,500倍に増大する、請求項153〜155のいずれかに記載の方法。
【請求項157】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を行っても維持される、請求項153〜156のいずれかに記載の方法。
【請求項158】
N−グリコシル化プロファイルの異種性の低下が植物の連続的クローン培養を少なくとも8ヶ月行っても維持される、請求項157に記載の方法。
【請求項159】
高等植物が双子葉類である、請求項144〜151のいずれかに記載の方法。
【請求項160】
抗体の投与に伴う補体活性化と関係する1つ又は複数の有害な副作用を低減する方法であって、実質的に同種の抗体組成物の形態で前記抗体を投与するステップを含み、前記組成物中に存在する前記抗体の少なくとも90%がG0グライコフォームによって表され、前記組成物が前駆グライコフォームによって表される微量の前記抗体を含み、前記組成物内の前記抗体が補体依存性細胞傷害(CDC)活性の低下を示す方法。
【請求項161】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項160に記載の方法。
【請求項162】
モノクローナル抗体がCD20抗原と結合する、請求項161に記載の方法。
【請求項163】
抗体がFcγRIIIに対する結合親和性の増大を示す、請求項160〜162のいずれかに記載の方法。
【請求項164】
抗体が抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の増大を示す、請求項160〜163のいずれかに記載の方法。
【請求項165】
請求項136〜159のいずれかに記載の方法に従って産生された糖タンパク質を含む組成物。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41A】
【図41B】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51A】
【図51B】
【図52】
【図53】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41A】
【図41B】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51A】
【図51B】
【図52】
【図53】
【公表番号】特表2009−526520(P2009−526520A)
【公表日】平成21年7月23日(2009.7.23)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−550562(P2008−550562)
【出願日】平成19年1月17日(2007.1.17)
【国際出願番号】PCT/US2007/060646
【国際公開番号】WO2007/084926
【国際公開日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【出願人】(506005466)バイオレックス セラピュティックス インク (5)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年7月23日(2009.7.23)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年1月17日(2007.1.17)
【国際出願番号】PCT/US2007/060646
【国際公開番号】WO2007/084926
【国際公開日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【出願人】(506005466)バイオレックス セラピュティックス インク (5)
【Fターム(参考)】
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