植物性グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ遺伝子、およびそれを運搬するトランスジェニック植物
本発明は、増強された成長速度、種子および果実の収量、ならびに総バイオマス収量を示すトランスジェニック植物、また、成長が増強されたトランスジェニック植物を産生する方法に関する。一実施形態においては、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）を過剰に発現するために設計されたトランスジェニック植物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔連邦政府が後援する研究または開発に基づいてなされる発明に対する権利に関する明細書〕
本発明は、米国エネルギー省がカルフォルニア大学の理事に対して与えた規約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６、および米国エネルギー省がロスアラモス国家安全保障有限責任会社に対して与えた規約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ＮＡ２５３９６に基づく支援によってなされた。政府は本発明の所定の権利を有する。
【０００２】
〔関連文献〕
本明細書は、２００８年８月２９日に提出された米国仮特許番号第６１／１９０，５８１号に対して優先権を主張するものである。
【０００３】
〔背景技術〕
世界的に人口が増加し、使用可能な農地が失われるか、または使用不能になり続けるため、より効率的で、かつ、地球に優しい農業システムに対する必要性は、人類にとって興味のある最優先事項である。収量、タンパク質含有量、および植物の成長速度を向上させることは、目下の課題により効果的に対処し得る農業システムの開発において主な目的になっている。
【０００４】
近年では、十分に開発された多くの農作物の生産量は横這い状態になる傾向にあるため、改良された農作物の生産技術の重要性が高まるばかりである。多くの農作業は、コストおよび収益が農作物の迅速な回転率または市場までの時間に依存することから、時間に注意を払っている。そのため、価値の高い農作物（穀物、野菜、ベリーおよび他の果物など）に関する多くの農業ビジネスにとって、植物の早い成長が経済的に重要な目標である。
【０００５】
遺伝子工学は、いまだ持続的な農業技術の開発において賛否両論があるもののますます重要な役割を果たしており、今後もその役割を果たし続ける。近年、数多くの遺伝的に改変された植物および関連技術が開発されており、今日では当該植物および関連技術の多くが広く用いられている（Factsheet: Genetically Modified Crops in the United States, Pew Initiative on Food and Biotechnology, August 2004, http://pewagbiotech.org/resources/factsheets）。現在、採用されるトランスジェニック植物の種類は非常に多く、また増加しており、２００６年には約２億５０００万エーカーでトランスジェニック植物を栽培している。
【０００６】
トランスジェニック植物技術の承認は徐々に増加しているかもしれないが（特に、米国、カナダおよびオーストラリアにおいて）、世界中の多くの地域（特に、ヨーロッパ）では農業における遺伝的に改変された植物の導入は未だに遅れている。そのため、信頼性があり、永続的な農業の方針を追い求めることと一致して、毒素または他の潜在的に問題のある物質を植物および／または環境に取り込むことのない遺伝的に設計された植物の開発への強い関心がある。また、目的（除草剤耐性、ペストおよび疾病抵抗性、ならびに全体的な収穫率を改良することなど）達成のコストを最小限にすることへの強い関心がある。したがって、これらの目的を満足させることが可能なトランスジェニック植物に関する必要性がいまだにある。
【０００７】
植物の早い成長という目標は、様々な植物調節システムに関する数多くの研究によって追求されている。この調節システムの多くはいまだ完全には理解されていない。特に、炭素および窒素の代謝を調整する植物調節機構は、完全に明らかになっていない。これらの調節機構は植物の成長および発達に欠かせない影響力があると推定される。
【０００８】
光合成生物における炭素および窒素の代謝は、植物資源およびエネルギーの効果的な利用を保証する調整方法において調節されなければならない。炭素および窒素の代謝に関する従来の理解は、所定のステップおよびより大きなシステムのサブシステムである代謝経路の詳細を含む。光合成生物において、炭素代謝はＣＯ２固定によって始まり、２つの主な処理（Ｃ−３代謝およびＣ−４代謝と呼ばれる）によって進行する。Ｃ−３代謝を伴う植物において、酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ribulose bisphosphate carboxylase：RuBisCo）は、ＣＯ２とリブロース二リン酸との結合を触媒し、３−ホスホグリセリン酸塩を産生する。当該３−ホスホグリセリン酸塩は、植物が炭素含有化合物を合成するために用いる３炭素化合物（Ｃ−３）である。Ｃ−４代謝を伴う植物において、ＣＯ２は、酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される反応において、ホスホエノールピルビン酸塩と結合されて４炭素を含有する酸を形成する。この酸は、脱炭酸されてＣＯ２を放出する場である維管束鞘細胞に輸送されて、その後、Ｃ−３植物に用いられた同じ反応中でリブロース二リン酸と結合される。
【０００９】
数多くの研究では、様々な代謝産物が窒素代謝の植物調整に重要であることがわかっている。これらの化合物としては、有機酸であるリンゴ酸、ならびにアミノ酸であるグルタミン酸およびグルタミンが挙げられる。窒素は、酵素であるグルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase：ＧＳ）の働きによって光合成生物に吸収される。グルタミンシンテターゼは、アンモニアとグルタミン酸との結合を触媒し、グルタミンを作る。ＧＳは、植物における窒素吸収に重要な役割を果たしており、グルタミン酸に対するアンモニアの付加を触媒することによってＡＴＰ依存性反応の中でグルタミンを作り出す（Miflin and Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No. 370, pp. 979-987）。また、ＧＳは、光吸収ならびにタンパク質および窒素輸送化合物の機能停止の結果として放出されたアンモニアを再吸収する。ＧＳ酵素は２つの一般分類に分けられ得る。その１つは細胞質の形態（ＧＳ１）を表し、もう１つは色素体（すなわち、葉緑体）の形態（ＧＳ２）を表す。
【００１０】
これまでの研究では、ＧＳ１の増大した発現量がＧＳ活性および植物成長のレベルを増加させることを証明しているが、報告は一貫性が欠けている。例えば、Fuentesらには、タバコ中のＣａＭＶ Ｓ３５プロモーターによるアルファルファＧＳ１（細胞質の形態）の過剰発現は、葉組織内におけるＧＳ発現およびＧＳ活性のレベルを増加させたり、窒素欠乏状態で成長を増大させたりするが、最適な窒素肥沃状態における成長に影響を及ぼさないことが報告されている（Fuentes et al., 2001, J. Exp. Botany 52: 1071-81）。Templeらには、非常に高いレベルのＧＳ転写産物を含有する全長アルファルファＧＳ１をコードする配列を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物、および活性な酵素に組み込まれるＧＳポリペプチドについて報告されているが、成長における表現型の作用について報告されていない（Temple et al., 1993, Molecular and General Genetics 236: 315-325）。Corruziらには、ＣａＭＶ Ｓ３５プロモーターの制御下でエンドウマメの細胞質ゾルＧＳ１導入遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックタバコが、増加されたＧＳ活性、増加された細胞質ゾルＧＳタンパク質、および改善された成長特性を示すことが報告されている（米国特許出願第６，１０７，５４７号明細書）。さらに最近、Unkeferらには、葉状組織内においてアルファルファＧＳ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物（葉から根において増大されたＧＳ活性に関してスクリーニングした後、増大したＳ１導入遺伝子のコピー数が得られるように、自家受粉によって遺伝的に分離した植物）が、それらの葉状部位において増大された量の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンを製造することを見出したことが報告されている。当該２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンは、野生型のタバコ植物全体に顕著に増大された成長速度を導くことが見出されている（米国特許出願第６，５５５，５００号明細書、米国特許出願第６，５９３，２７５号明細書、米国特許出願第６，８３１，０４０号明細書を参照）。
【００１１】
さらに、Unkeferらには、植物の発育を改良するための２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（また、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）として知られる）の使用について記載されている（米国特許第６，５５５，５００号明細書、米国特許第６，５９３，２７５号明細書、米国特許第６，８３１，０４０号明細書）。特に、Unkeferらには、葉状組織（根幹組織に関連する）における増加された濃度の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンが、植物発育特性を増強させることになる事象のカスケードの引き金になることが開示されている。Unkeferらには、２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの葉状濃度が植物発育特性を増強させる引き金となるために増加され得る（具体的には、植物の葉状部分に直接２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの溶液を投与し、葉組織に特異的にグルタミンシンテターゼを過剰発現させることによって）方法が記載されている。
【００１２】
動物の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に関連があることが知られる数多くのトランスアミナーゼおよびヒドロリアーゼ酵素は、動物の肝組織および膵組織において同定されている（Cooper and Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, pages 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304）。植物では２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生化学的合成が知られているが、十分に特性が示されていない。さらに、植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの機能、およびその液溜まりの大きさ（組織濃度）の重要性は知られていない。結局、当該技術では、どのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が存在し得るか、および／またはどのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が植物中で２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成を触媒するときに機能し得ることに関してはっきりと明確な指針を提供しておらず、当該植物トランスアミナーゼが報告されたり、単離または特徴づけられたりしていない。
【００１３】
〔発明の概要〕
本発明は、増強された成長速度、種子および果実の収量、ならびに総バイオマス収量を示すトランスジェニック植物、また、成長が増強されたトランスジェニック植物を産生する方法に関する。一実施形態においては、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）を過剰に発現するために設計されたトランスジェニック植物が提供される。
【００１４】
出願人は、酵素であるグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（２−オキソグルタラメート）シンテターゼの触媒として同定する。２−オキソグルタラメートは、光合成用途、炭素固定および窒素代謝に関連のある多数の遺伝子の機能を調節する強力なシグナル代謝産物である。
【００１５】
シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの濃度を特異的に増加させることによって（すなわち、葉状組織において）、本発明の導入遺伝子植物は短期間でより高い総収量を生産することが可能であるため、幅広い農作物にわたって増強された生産性を有する農業を提供し得る。重要なことに、今日までに説明されている多くのトランスジェニック植物とは異なり、本発明は天然の植物酵素をコードする天然の植物遺伝子を利用する。本発明のトランスジェニック植物の増強された成長特性は、植物に追加のＧＰＴ能力を取り込むことによって本質的に達成される。このように、本発明のトランスジェニック植物は、有毒な物質、成長ホルモン、ウイルス性または細菌性の遺伝産物のいずれも発現せず、またそれゆえ、世界の一部の地域においてこれまで遅れていたトランスジェニック植物の採用についての多くの懸念がなくなる。
【００１６】
一実施形態において、本発明はＧＰＴ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供しており、ここで、当該ＧＰＴ導入遺伝子は植物プロモーターに対して操作可能に結合される。特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列、ならびに、（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％同一であり、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードする。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は植物のゲノムに取り込まれている。本発明のトランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。
【００１８】
また、本発明は、本発明のトランスジェニック植物の任意の世代の種子を提供しており、ここで、当該子孫はＧＰＴ導入遺伝子を含む。同様に、本発明は、本発明のトランスジェニック植物の任意の世代の種子を提供しており、ここで、上記種子はＧＰＴ導入遺伝子を含む。本発明のトランスジェニック植物は、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較した場合に、１つ以上の増強された成長特性率を示し得る。当該成長特性率としては、増強された成長速度に制限されず、バイオマス収量、種子収量、花または花芽の収量、果実またはさやの収量、大型の葉が挙げられる。また、本発明のトランスジェニック植物は、増大されたＧＰＴ活性のレベルおよび／または増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示し得る。いくつかの実施形態において、本発明のトランスジェニック植物は、向上された窒素利用効率を示す。
【００１９】
また、本発明のトランスジェニック植物およびその種子を生産する方法を提供しており、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長特性、向上された窒素利用効率、および塩または塩分を含む環境において発芽または成長に対して増大された耐性を有する植物の生産に関する方法を含む。
【００２０】
〔図面の簡単な説明〕
図１．窒素吸収および２−オキソグルタラメート化学合成：概略的な代謝経路。
【００２１】
図２．野生型のタバコ植物に対して、ＧＰＴを過剰発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。左から右に向かって、野生型植物、アルファルファＧＳ１導入遺伝子、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例３参照。
【００２２】
図３．野生型のトマト植物に対してＧＰＴを過剰に発現するトランスジェニックミクロトームトマト植物の比較を示す写真である。（Ａ）野生型植物、（Ｂ）シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例４を参照。
【００２３】
図４．野生型のタバコ植物（上の葉）とＧＰＴトランスジェニックのタバコ植物（下の葉）との葉の大きさの比較を示す写真である。
【００２４】
〔発明の詳細な説明〕
（定義）
特に規定されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語、注釈、および他の科学専門用語は、本発明に関連する分野の当業者に通常理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味を有する用語が本明細書において定義づけされており、関係を明らかにしたり、および／または整えたりする。また、本明細書においてそのような定義に含まれるものは、当該分野において一般的に理解されるものに対して実質的に差異を表すために必ずしも説明されるべきではない。本明細書において説明されるか、または参照される技術および方法は、従来の理論を用いて当業者に一般的に十分理解され、通常用いられる。当該技術および方法としては、例えば、Sambrookらにおいて広く用いられる分子クローニングの手法などがあり、分子クローニング：A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y、分子生物学における従来のプロトコル（Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001）、トランスジェニック植物：方法およびプロトコル（Leandro Pena, ed., Humana Press, 1st edition, 2004）、およびアグロバクテリウムプロトコル（Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006）が挙げられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む方法は、他に記載されていない限り、工業的に規定されるプロトコルおよび／またはパラメータによって一般的に実施される。
【００２５】
用語「核酸」は、一本鎖か、または二本鎖いずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を指す。特に制限されない限り、用語「ポリヌクレオチド」は天然ヌクレオチドの公知の類似物を含んでいる核酸を包含する。当該類似物は、参照核酸と同様の結合特性を有しており、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される。また、他に指示されない限り、特定の核酸配列は保存的に改変されたそれらのバリアント（例えば、変質コドン置換体）および相補的な配列、ならびに明示的に示された配列を暗に含む。具体的には、変質コドン置換体は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位に生成している配列が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されることによって取得され得る（Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子にコードされるｍＲＡＮと同義的に用いられる。
【００２６】
用語「プロモーター」は、操作可能に結合された核酸の転写を方向づける核酸制御配列のアレイを指す。本明細書において用いられるとき、「植物プロモーター」とは植物の中で機能するプロモーターである。プロモーターは、転写の開始領域（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ因子など）付近の核酸配列を必然的に含む。また、プロモーターは、任意により、末端部のエンハンサー因子またはレセプター因子を含む。当該エンハンサー因子またはレセプター因子は、転写の開始領域からほぼ数千塩基対に配置され得る。「恒常的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下および発生条件下において活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生調節下において活性なプロモーターである。用語「操作可能に結合された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と、第２の核酸配列との機能的な結合を指す。ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を方向づける。
【００２７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に用いられており、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーの人為的な化学擬態であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成的なアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸とある程度同様に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたアミノ酸、および後修飾されるアミノ酸である。そのようなアミノ酸としては、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンが挙げられる。アミノ酸類似物とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合するα炭素）を有する化合物を指す。当該アミノ酸類似物としては、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。当該類似物は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸のような同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸とある程度同じように機能する化学物質を指す。
【００２９】
本明細書において、アミノ酸は、一般的に知られる３つの文字記号か、または国際純正応用化学連合−国際生化学連合（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ）生化学命名委員によって推奨されている１つの記号によって表され得る。同様に、ヌクレオチドは一般的に認められている１つの文字コードによって表され得る。
【００３０】
用語「植物」は、植物全体、植物組織（例えば、葉、幹、花、根など）、種子および植物細胞、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に用いられ得る植物の分類は、通常、形質転換技術に影響を受け易い高等植物の分類と同様である。当該高等植物としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）および裸子植物が挙げられる。これらは、多様な倍数性段階（多数体、二倍体、半数体および半接合が挙げられる）の植物を含む。
【００３１】
用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」は本明細書において同義的に用いられており、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することに関連するポリヌクレオチドをコードする遺伝子の全長か、もしくは一部の長さのポリヌクレオチド配列を指す。当該「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」としては、翻訳（コーディング）配列および非翻訳配列、ならびにそれらの相補体を共に包含するポリヌクレオチドが挙げられる。用語「ＧＰＴコード配列」は、転写されてＧＰＴタンパク質をコードする遺伝子の一部を指す。用語「ターゲッティング配列」は、タンパク質を細胞の細胞内コンパートメント（例えば、植物細胞内の葉緑体）に方向づけるタンパク質のアミノ末端部を指す。さらに、ＧＰＴポリヌクレオチドは、規定条件下でＧＰＴポリヌクレオチドと、またはＧＰＴポリヌクレオチド由来のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせる能力によって規定される。
【００３２】
「ＧＰＴ導入遺伝子」は、核酸分子をもち、トランスジェニック植物または植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるか、またはＧＰＴポリヌクレオチドをもつトランスジェニック植物の原種植物またはその植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるＧＰＴポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
【００３３】
本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの例は本明細書に示されており、当該ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、シロイヌナズナ、イネ、オオムギ、バンブー、ダイズ、ブドウ、およびゼブラフィッシュのＧＰＴが挙げられる。
【００３４】
部分長ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、Ｎ末端またはＣ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするポリヌクレオチド配列、成熟ＧＰＴ（ターゲッティング配列を含まない）をコードするポリヌクレオチド配列、およびＧＰＴのドメインをコードする配列が挙げられる。Ｎ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするＧＰＴポリヌクレオチドの例としては、シロイヌナズナの−３０コンストラクト、−４５コンストラクト、および−５６コンストラクトが挙げられる。これらは、配列番号２の全長ＧＰＴ構造のアミノ酸からそれぞれ最初の３０、４５、および５６のアミノ酸が除去されているコード配列である。
【００３５】
形質転換された細胞およびトランスジェニック植物の生産において、本発明のＧＰＴポリヌクレオチドを用いるとき、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はないが、以下にさらに述べるように、由来する本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの遺伝子の配列と「実質的に同一」でありさえすればよいことを当業者は理解する。用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」は、厳密に言うと、当該実質的に同一のバリアントを包含する。同様に、当業者は、コドン縮重のために数多くのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし、すべての当該ポリヌクレオチド配列が用語ＧＰＴポリヌクレオチドの中に含まれると意図されることを理解する。さらに、具体的にいうと、当該用語は、本明細書において開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり、野生型ＧＰＴポリペプチドの突然変異によるか、またはＧＰＴポリペプチドの機能（例えば、ＧＰＴポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的な置換に起因する）を保持するポリペプチドをコードする配列（後述のように決定される）を含む。よって、用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」もまた、当該実質的に同一のバリアントを含む。
【００３６】
用語「保存的に改変されたバリアント」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両者に適用できる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントは同一の、または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または実質的に同一の配列に対してアミノ酸配列をコードしない核酸を指す。遺伝コードの縮退が原因で、数多くの機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。
【００３７】
このように、コドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、当該コドンは、コードされるタンパク質が変更されることなく対応する任意のコドンへ変換され得る。当該核酸バリアントは「サイレントバリアント」であり、保存的に修飾されるバリアントの一種である。また、本明細書においてポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、当該核酸の起こり得るサイレントバリアントすべてを表現する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに関するコドンのみであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに関するコドンのみであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を産生するように修飾され得ることを理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列のサイレントのバリエーションはそれぞれ記載される各配列に関与している。
【００３８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解する。当該置換、欠失または付加では、コードされた配列のうち１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変更、付加または削除しており、「保存的に修飾されたバリアント」において、変更は化学的に類似しているアミノ酸とのアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似しているアミノ酸を示す同類置換表は、本技術分野において公知である。当該保存的に修飾されたバリアントは本発明の多形性バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、取り除かれない。
【００３９】
以下の８つの群は互いに同類置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。
【００４０】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、組織体の様々な段階の観点から説明され得る。この組織体の一般的な議論に関しては、例えば、 Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) およびCantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照すればよい。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は局所的に配置されたポリペプチド内の３次元構造を指す。これらの構造は、通常ドメインとして知られる。ドメインはポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチドの一部であり、典型的に、２５からおよそ５００のアミノ酸長である。標準的なドメインは、さらに小さなユニットの組織体からなる（例えば、β−シートおよびα−ヘリックスの一帯）。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有の関係によって形成される三次元構造を指す。
【００４１】
用語「単離された」は、野生型か、もしくは天然の状態において見られるような物質と通常同時に生じる成分から、実質的または本質的に遊離した物質を指す。しかしながら、当該用語「単離された」は、電気泳動ゲルか、または別の分離培地に存在する成分を指すことを意図するものではない。単離された成分は、この分離培地から離れて、別の用途に使用する状態にあるか、またはすでに新たな用途／環境において使用されている状態にある。「単離された」抗体は、特定されて自然環境の成分から分離されるか、および／または回収された抗体である。
【００４２】
自然環境の汚染成分は、診断上の抗体の利用、または薬学的な抗体の利用に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性の溶質もしくは非タンパク性の溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法で測定したとき、９５％（抗体重量）以上であり、最も好ましくは９９％（重量）以上に精製されるか、（２）回転キャップ配列決定装置によって少なくとも１５残基のＮ末端のアミノ酸配列または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な量に精製されるか、または（３）クマシーブルー、または好ましくは銀染色により還元条件または非還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製される。自然環境の抗体の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体としては、組換え細胞内のインシチュにある抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００４３】
核酸の一部に対して用いられるとき、用語「異種」とは、当該核酸が２つ以上のサブ配列（天然において、互いに同じ関係に見られない）を含むことを示す。例えば、新たな機能的な核酸を作るために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、１つの原料からのタンパク質をコードする核酸、および別の原料からのペプチド配列をコードする核酸）を有している核酸が、典型的に組換えにより作られる。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が、天然において互いに同じ関係に見られない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００４４】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、用語「同一の」または割合の「同一性」とは、比較領域全体を比較して整列させたときか、または配列比較アルゴリズムもしくは手動の配列検査および目視によって測定されるような領域を指定したとき、最大限の一致を考慮して同一か、または同じ（すなわち、特定の領域全体で約７０％の同一性、好ましくは約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％の同一性である）アミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で含む２つ以上の配列またはサブ配列を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。
【００４５】
配列同一性の割合がポリペプチドに関して用いられるとき、同一でない残基部分はしばしばアミノ酸の同類置換によって異なるということが理解される。ここで、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基と置き換えられるため、ポリペプチドの機能特性は変化しない。配列が同類置換ではない場合、保存的な天然の置換に関して修正するために、配列同一性の割合が上流に向かって修正され得る。
【００４６】
配列比較に関して、典型的に１つの配列は基準配列として働き、試験配列は当該基準配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および基準配列はコンピュータに入力され、サブ配列座標が指定され、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。初期設定プログラムのパラメータが用いられるか、または代替的なパラメータが指定される。そして、配列比較アルゴリズムは、当該プログラムのパラメータに基づき、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。
【００４７】
本明細書において用いられるとき、「比較領域（comparison window）」は、２つの配列を最適に配列させた後、同数の連続した位置の基準配列と比較され得る配列のうち、２０から６００、通常は約５０から約２００、より通常は約１００から約１５０からなる群から選択される複数の連続した位置の任意の１つのセグメントに関する。比較のための配列の配置方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適な配置は、例えば、Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同配置アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似方法に関する研究によって、これらアルゴリズム（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータ制御の実施によって、または手動の位置合わせによって、および目視（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照）によって、実行され得る。
【００４８】
配列同一性および配列類似性の割合の測定に適したアルゴリズムの好ましい例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（それぞれ、Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402および Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、典型的に本明細書に記載される初期パラメータとともに使用され、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性の割合を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターによって公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリシーケンスにおいて長さＷの短いワードを特定することによって、ハイスコアの配列ペア（high scoring sequence pairs：ＨＳＰｓ）を特定することを含む。ここで、当該クエリシーケンスは、データベースシーケンスにおいて同じ長さのワードとともに配列されたとき、ある正の数の基準スコアＴと一致するか、または満足する。Ｔは、基準点に近いワードとみなされる（上述のAltschul ら）。これら冒頭付近のワードのヒットは、当該ワードを含んでいる長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するための根源として働く。当該ワードのヒットは、累積の配列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列に関して、累積のスコアはパラメータＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）、およびパラメータＮ（一致しない残基に関するペナルティスコア；常に＜０）によって算出される。アミノ酸配列に関して、採点マトリクスが用いられて、累積のスコアを算出する。それぞれの方向におけるワードのヒットの拡張は、累積の配列スコアが数量Ｘによって達成される最大値から低減したときか、累積スコアが１つ以上の負に採点された残基の配列の累積のためにゼロもしくはそれ以下になったときか、またはいずれかの配列の末端が標的に到達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ，ＴおよびＸは、配列の検出感度および配列の速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）では、ワード長（Ｗ）１１を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、ワード長３を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、および５０をＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) 配置（Ｂ）、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。
【００４９】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性に関して統計に基づく分析を実行する（例えば、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つには、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））がある。この最小合計確率は、２つのヌクレオチド配列間か、または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然生じ得ることによる確率の表れを示す。例えば、核酸は、参照核酸との試験核酸の比較において最小合計確率が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１以下である場合に、基準配列と類似しているとみなされる。
【００５０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、典型的に、核酸の複合混合物においてその標的サブ配列へハイブリダイズするが、別の配列にハイブリダイズしないプローブにおける条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な環境において異なる。長い配列は特に高い温度にてハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な指針は、Tijssen（生化学および分子生物学における技術――核酸によるハイブリダイゼーション、「ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイの概論」（１９９３））において見出される。一般的に、高いストリンジェント条件では、特定の配列に関して、規定されたイオン強度のｐＨにおいて融解点（Ｔｍ）以下の約５〜１０℃になるよう選択される。Ｔｍは、５０％のプローブが平衡状態でのターゲットシーケンスに対するターゲットハイブリダイズに相補的な温度である（ターゲットシーケンスが過度に存在し、Ｔｍにおいて５０％のプローブが平衡状態にあるとき）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン以下、典型的には、ｐＨ７．０から８．３において約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関しては温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）に関しては少なくとも約６０℃であることが条件である。また、ストリンジェントな条件は、不安定化試薬（ホルムアミドなど）の付加によって達成され得る。選択的な、または特定のハイブリダイゼーションに関して、ポジティブシグナルは少なくとも２倍のバックグラウンドであり、好ましくは１０倍のバックグラウンドのハイブリダイゼーションである。
【００５１】
ストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるのであれば、実質的に同一のままである。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容されるコドンの最大量の縮退によって作られるときに、生じる。そのような場合において、核酸は適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において典型的にハイブリダイズする。
【００５２】
ＧＰＴポリペプチドを含んでいるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列によって、ストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロットにおいて同定され得る。この目的に関して、当該ハイブリダイゼーションに最適なストリンジェントな条件としては、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液において、３７℃でのハイブリダイゼーション、および少なくとも約５０℃、通常、約５５℃から約６０℃の温度で２０分間０．２ Ｘ ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄を含む。
【００５３】
２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというさらなる目安としては、基準配列（一対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅される）がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件においてプローブとして使用されるとき、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから試験配列を単離することが可能であるか、または、例えばノウザンもしくはサザンブロットで試験配列を同定することが可能であるかである。
【００５４】
（トランスジェニック植物）
本発明は、農学的な性質が十分に向上している新規なトランスジェニック植物を提供する。十分に向上した農学的な性質は、促進された生育、増大した成熟植物の生体重および全現存量、より早期かつより豊富な量の開花、ならびに果実および種子におけるより多くの収量を含む。本発明のトランスジェニック植物は、１つ以上の発現可能な遺伝的コンストラクトを植物に対して導入することにより生成される。この遺伝的コンストラクトは、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現を促進することができる。本発明は、異種のシロイヌナズナのＧＰＴ遺伝子を保有し、かつ発現するトランスジェニックタバコ植物の生成によって実証されている（後述する実施例２）。また、同じ代謝経路、すなわちシグナル代謝産物２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（2-hydroxy-5-oxoproline）の生合成、において機能するＧＰＴホモログは、全ての植物種に含まれていることが期待される。このように、本発明の実施において、ＧＰＴホモログまたはその機能的な変異体をコードする全ての植物遺伝子が、本発明のトランスジェニック植物の生成に有用であり得る。
【００５５】
本発明における安定な形質転換の実施形態では、発現可能な遺伝的コンストラクトの１つ以上のコピーが宿主植物ゲノム中に組み込まれるようになる。これによって、植物内におけるＧＰＴ酵素能力を増加させる。これは、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）の合成、言い換えればシグナル代謝遺伝子発現、の増加を仲介するのに役立つ。その結果、植物の生育が増大し、かつ他の農学的な性質が向上する。２−オキソグルタラメートは、代謝産物であり、遺伝子発現、代謝および植物生育における極めて強力なエフェクターである（米国特許第６，５５５，５００号）。そして、この代謝産物は、炭素および窒素の代謝システムの調整において極めて重要な役割を果たし得る（Lancien et al., 2000, Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation, Plant Physiol. 123: 817-824）。図１に示す２−オキソグルタラメート経路の概略図も参照されたい。
【００５６】
本発明の一局面において、出願人らは、シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素をコードする核酸分子を同定した（後述する実施例１を参照）。そして、発現された組換え酵素が活性を有し、シグナル代謝産物、２−オキソグルタラメートの合成を促進させ得ることを最初に示した（後述する実施例２）。さらに、出願人らは、このシロイヌナズナのグルタミントランスアミナーゼ遺伝子を、形質転換された異種植物において過剰発現させた結果、ＣＯ２固定の割合を向上させ、かつ生育特性を増加させることを最初に示した（後述する実施例３）。
【００５７】
また、本明細書に記載するように（後述する実施例３を参照）、トランスジェニックタバコ植物において、シロイヌナズナのＧＰＴコード配列の全長を含む導入遺伝子を過剰発現させると、ＣＯ２固定を速め、かつ全タンパク質、グルタミンおよび２−オキソグルタラメートの量を増加させる結果となる。また、これらのトランスジェニック植物は、野生型の植物よりも速く生育する（図２）。同様に、トマト植物に関する予備試験では（後述する実施例４を参照）、シロイヌナズナのＧＰＴ導入遺伝子が形質転換されたトマト植物は、野生型のコントロール植物と比較して、生育速度、開花、および種子収量の顕著な向上を示した（図３および後述する実施例４）。
【００５８】
上述したトランスジェニックタバコ植物に加えて、トマト、コショウ、マメ類、ササゲ、アルファルファ、カンタループ、カボチャ、シロイヌナズナおよびカミレナ（Camilena）の２種において、ＧＰＴを含み、かつ向上された生育特性を示す他の種々のトランスジェニック植物種が生成された（共同所有され、同時係属された出願であり、その内容の全てが本願に引用して援用される、２００９年８月３１日に提出された事件整理番号Ｓ−１１２，９８３を参照）。上述のトランスジェニック植物は、種々の形質転換方法を用いて生成された。種々の形質転換方法は、アグロバクテリウム媒介されたカルス、花の浸漬、種子の播種、さやの播種、および花の直接の接種、これらの組合せ、ならびに種々のＧＰＴ導入遺伝子を用いた、１種類の導入遺伝子を持つ植物における有性の異種交配を介する方法を含む。
【００５９】
本発明はまた、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法を提供する。一実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、コードされたＧＰＴを発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な適切なプロモーターの制御下にある。他の実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む１個以上の核酸コンストラクトまたは発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、ＧＰＲ導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な１個以上の適切なプロモーター（および、任意に、他の制御エレメント）の制御下にある。
【００６０】
多数のＧＰＴポリヌクレオチドが、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。ＧＰＴタンパク質は、種々の植物種の間で高く保存されており、密接に関連している非植物のＧＰＴ（例えばゼブラフィッシュのＧＰＴ）もまた使用され得ることは、本明細書に記載の実験データから明らかである。ＧＰＴに関して、異なる種由来の多数のＧＰＴポリヌクレオチドが活性を有しかつＧＰＴ導入遺伝子として有用であることが示されている。
【００６１】
特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、シロイヌナズナ由来のＧＰＴ（例えば配列番号２、配列番号２１および配列番号３０に示すＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列；配列番号１と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列；ならびにアミノ末端の３０〜５６アミノ酸残基がトランケートされた、配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６２】
他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ブドウ由来のＧＰＴ（例えば配列番号９および配列番号３１に示すブドウＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号８に示す塩基配列；配列番号８と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号９もしくは配列番号３１に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６３】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、イネ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１１および配列番号３２に示すイネＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１１もしくは配列番号３２に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６４】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ダイズ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１３、配列番号３３または配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すダイズＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１２に示す塩基配列；配列番号１２と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１３もしくは配列番号３３もしくは配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６５】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、オオムギ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１５および配列番号３４に示すオオムギＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１５もしくは配列番号３４に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６６】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ゼブラフィッシュ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１７および配列番号３５に示すゼブラフィッシュＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１６に示す塩基配列；配列番号１６と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１７もしくは配列番号３５に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６７】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、バンブー由来のＧＰＴ（例えば配列番号３６に示すバンブーＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号３６に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６８】
本発明の実施におけるＧＰＴ導入遺伝子としての使用に適した他のＧＰＴポリヌクレオチドは、種々の方法により取得され得る。種々の方法とは、当業者によって理解され得るように、組換え発現システム（すなわち、大腸菌（E. coli）（実施例２０〜２３を参照）、植物体における一過性の発現システム（実施例１９を参照）、または遺伝子導入植物における（実施例１〜１８を参照））において、ＧＰＴの発現を導く能力についてＧＰＴ活性を用いて試験する方法である。
【００６９】
（導入遺伝子コンストラクト／発現ベクター）
本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、所望の導入遺伝子に関する遺伝子コード配列は、形質転換された植物細胞内で導入遺伝子配列の発現を導くことができる核酸コンストラクト（本明細書中において、（導入遺伝子）発現ベクター、発現カセット、発現コンストラクトまたは遺伝的コンストラクトとしても交換可能に引用される）中に組み込まれなければならない。所定の導入遺伝子を保有する核酸コンストラクトは、多数の公知の方法を用いて、植物細胞または種々の細胞内に導入され得る。公知の方法は、限定されないが、エレクトロポレーション、ＤＮＡボンバードメントまたは遺伝子銃、マイクロインジェクション、ならびに種々のＤＮＡベースのベクター（例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のベクター）の使用を介する方法を含む。形質転換植物細胞中にいったん導入されると、核酸コンストラクトは、一過的に、あるいは安定的に、組み込まれた導入遺伝子（すなわちＧＰＴ）の発現を導くであろう。安定的に発現させることが好ましく、安定的な発現は、核酸コンストラクトをクロモソームに組み込ませることができる植物の形質転換ベクターを利用することにより達成される。一度植物細胞への形質転換が成功すれば、これを栽培することによりトランスジェニック植物を再生し得る。
【００７０】
形質転換植物における挿入遺伝子の本質的な発現または発現誘導の促進に適した、多数の発現ベクターが知られている。さらに、種々の一過性の発現ベクターおよびシステムが知られている。大体において、遺伝子の形質転換における特定の方法に使用するために、適切な発現ベクターが選択される（以下を参照）。概して、トランスジェニック植物を生成するための典型的な植物発現ベクターは、プロモーターの発現制御コントロール下にある所定の導入遺伝子、形質転換体の選択を助けるための選択マーカー、および転写終結配列を含み得る。
【００７１】
より具体的には、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するための核酸コンストラクトの基本要素は、以下である：形質転換植物細胞において（１つもしくは複数の）導入遺伝子の機能的な発現を促進することができる適切なプロモーター、このプロモーターに実施可能に連結された（１つもしくは複数の）導入遺伝子（すなわちＧＰＴコード配列）、好ましくは、この導入遺伝子に実施可能に連結された適切な転写終結配列（すなわちノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター）、および典型的にこの導入遺伝子の発現を制御するために有用な他の要素、ならびに所望のトランスジェニック産物を選択するために適した１つ以上の選択マーカー遺伝子（すなわち抗生物質耐性遺伝子）。
【００７２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、トランスジェニック植物を生成するために使用する初期の形質転換システムであるため、アグロバクテリウム形質転換用に設計された多数のベクターが存在する。安定な形質転換のため、アグロバクテリウムのシステムは、大腸菌およびアグロバクテリウムの両方で操作可能なプラスミドである「バイナリー」ベクターを利用する。このベクターは、典型的に、形質転換された植物を回収するための１つ以上の選択マーカーを含有する（Hellens et al., 2000, Technical focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5:446-451）。アグロバクテリウム形質転換システムに使用するバイナリーベクターは、典型的に、Ｔ−ＤＮＡのボーダー領域、マルチクローニングサイト、大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのための複製機能、ならびに選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含む。
【００７３】
いわゆる「スーパー−バイナリー」ベクターは、高い形質転換効率を提供し、一般的にＴｉ由来の別の病原性遺伝子を含む（Komari et al., 2006, Methods Mol. Biol. 343: 15-41）。スーパーバイナリーベクターは、一般的に、低い形質転換効率を示す植物（例えば穀類）に用いられる。別の病原性遺伝子は、限定されないが、ｖｉｒＢ，ｖｉｒＥ，およびｖｉｒＧを含む（Vain et al., 2004, The effect of additional virulence genes on transformation efficiency, transgene integration and expression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system. Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul et al., 2000, Additional virulence genes influence transgene expression: transgene copy number, integration pattern and expression. J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park et al., 2000, Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin et al., 1987, Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169: 4417-4425）。
【００７４】
本明細書において実証された実施形態（後述する実施例を参照）では、挿入される導入遺伝子をＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下に配置する発現ベクターが使用される。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを利用する多数の発現ベクターが知られており、および／または市販されている。
【００７５】
（植物プロモーター）
用語「プロモーター」は、ゲノム配列において、遺伝子の転写開始部位（transcription start site：ＴＳＳ）の上流にある領域に対し名づけられた。しかし、ＴＳＳの下流の配列もまた同様に転写開始に影響を与え得る。プロモーター要素は、転写開始点、転写の特異性および割合を選択する。ＴＳＳからの距離に基づいて、用語「近位プロモーター」（ＴＳＳの周りの数百塩基）および「遠位プロモーター」（ＴＳＳの千塩基以上上流）もまた使用される。近位プロモーターおよび遠位プロモーターは、細胞−、組織−、臓器−、発生段階および環境ファクター−特異的な転写制御における複雑なプロセスに関与する種々の要素の組を含む。ＴＳＳの選択を制御する多くのプロモーター要素は、近位プロモーター内に位置する。
【００７６】
植物内で機能する多数のプロモーターが公知である。ＧＰＴ導入遺伝子コンストラクトを構築する際、選択されるプロモーターは、恒常的な非特異的プロモーターであってもよく、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓリボソーマルプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）であってもよい。このプロモーターは、植物内における導入遺伝子の発現のために広く使用されている。他の強力な恒常的プロモーターの具体例は、限定されないが、イネのアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター、Ｔｉプラスミドのノパリン合成酵素プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびスクロース合成酵素プロモーターを含む。
【００７７】
あるいは、ある実施形態において、導入遺伝子コンストラクトにより形質転換させたい植物細胞、導入遺伝子の所望の発現量、導入遺伝子を発現させたい組織または細胞内コンパートメント、目標とする発生段階などに基づいてプロモーターを選択することが望ましい。
【００７８】
例えば、光合成組織およびコンパートメントにおいて発現させたいときには、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ（ribulose bisphosphate carboxylase：ＲｕＢｉｓＣｏ）遺伝子のプロモーターが使用され得る。種子で発現させたいときには、種々の貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターが使用され得る。果実内で発現させるためには、果実特異的なプロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）が使用され得る。他の組織特異的プロモーターの具体例は、レクチンをコードするプロモーター（Vodkin et al., 1983, Cell 34:1023-31; Lindstrom et al., 1990, Developmental Genetics 11:160-167）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１（Vogel et al, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13:Part D; Dennis et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12(9): 3983-4000）、トウモロコシの集光性複合体（Simpson, 1986, Science, 233: 34-38; Bansal et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654-3658）、トウモロコシの熱ショックタンパク質（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; Rochester et al., 1986, EMBO J., 5: 451-458）、エンドウマメのスモールサブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Poulsen et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205(2): 193-200; Cashmore et al., 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, New York, pp 29-38）、Ｔｉプラスミドのマンノピン合成酵素およびＴｉプラスミドのノパリン合成酵素（Langridge et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3219-3223）、ペチュニアのカルコンイソメラーゼ（Van Tunen et al., 1988, EMBO J. 7(5): 1257-1263）、マメのグリシンリッチタンパク質１（Keller et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1309-1314）、トランケートされたＣａＭＶ ３５ｓ（Odell et al., 1985, supra）、ポテトのパタチン（Wenzler et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50）、根細胞（Conkling et al., 1990, Plant Physiol. 93: 1203-1211）、トウモロコシのゼイン（Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426; Kriz et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 207(1): 90-98; Wandelt and Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17(6): 2354; Langridge and Feix, 1983, Cell 34: 1015-1022; Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426）、グロブリン−１（Belanger and Kriz, 1991, Genetics 129: 863-872）、α−チューブリン（Carpenter et al., 1992, Plant Cell 4(5): 557-571; Uribe et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37(6): 1069-1078）、ｃａｂ（Sullivan, et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(3): 431-440）、ＰＥＰＣａｓｅ（Hudspeth and Grula, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589）、Ｒ遺伝子複合体（Chandler et al., 1989, The Plant Cell 1: 1175-1183）、カルコン合成酵素（Franken et al., 1991, EMBO J. 10(9): 2605-2612）およびグルタミン合成酵素プロモーター（U.S. Pat. No. 5,391,725; Edwards et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463; Brears et al., 1991, Plant J. 1(2): 235-244）を含む。
【００７９】
恒常的プロモーターに加えて、トランスジェニック植物が再生し、成熟し、開花するなどに従って導入遺伝子の発現を制御したい場合には、種々の誘導性プロモーター配列が使用され得る。このような誘導性プロモーターの具体例は、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（すなわち、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；例えばBevan et al., 1989, EMBO J. 8(7): 899-906を参照）、創傷応答遺伝子（すなわち、細胞壁タンパク質の遺伝子）、化学的誘導性遺伝子（すなわち、硝酸還元酵素、キチナーゼ）および暗誘導性遺伝子（すなわち、アスパラギン合成酵素；例えば、米国特許第５，２５６，５５８号を参照）のプロモーターを含む。また、主要なクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ｃａｂ）をコードする遺伝子ファミリー、およびリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃＳ）のスモールサブユニットをコードする遺伝子ファミリーを含む多くの植物の核内遺伝子は、光によって活性化される（例えば、Tobin and Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439.を参照）。
【００８０】
他の誘導性プロモーターは、ＡＢＡ誘導性プロモーターおよび膨圧誘導性プロモーター、オーキシン結合タンパク質遺伝子プロモーター（Schwob et al., 1993, Plant J. 4(3): 423-432）、ＵＤＰグルコース フラボノイド グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ralston et al., 1988, Genetics 119(1): 185-197）；ＭＰＩプロテイナーゼインヒビタープロモーター（Cordero et al., 1994, Plant J. 6(2): 141-150）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29(6): 1293-1298; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol. 29(5): 412-421; Martinez et al.,1989, J. Mol. Biol. 208(4): 551-565）、およびエンドウマメ由来の光誘導性プラスチド グルタミン合成酵素遺伝子（米国特許第５，３９１，７２５号；Edwards et al., 1990, supra）を含む。
【００８１】
トランスジェニック植物技術において使用される植物プロモーターのレビューについては、Potenza et al., 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol - Plant, 40(1): 1-22を参照されたい。植物の合成プロモーター工学のレビューについては、例えば、Venter, M., 2007, Trends Plant Sci., 12(3): 118-124を参照されたい。
【００８２】
（グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）導入遺伝子）
本発明は、シグナル代謝産物である２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に直接的に機能する、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素を含む植物を最初に開示する。これまで、機能が明らかになった植物のトランスアミナーゼは全く記載されていない。出願人は、いくつかの植物種および動物種由来のＧＰＴポリヌクレオチドコード配列を同定し、試験した。そして、この遺伝子を宿主植物に組み込み、生育がより速く、葉のタンパク質量が向上され、そしてＣＯ２固定速度がより速い、生育特性が顕著に向上されている異種性のトランスジェニック植物とすることに成功した。
【００８３】
シグナル代謝産物２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生合成を包含する同様の代謝経路で機能するＧＰＴは、全ての植物種に含まれていることが期待される。したがって、本発明の実施において、ＧＰＴホモログまたはその機能的な変異体をコードするあらゆる植物の遺伝子は、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために有用であり得る。さらに、種々の植物ＧＰＴタンパク質構造と、ゼブラフィッシュ（Danio rerio（Zebra fish））由来の推定上の（および生物学的に活性な）ＧＰＴホモログとの間の構造的な同一性、を考慮すれば（実施例２２を参照）、他の非植物ＧＰＴホモログは、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するためのＧＰＴ導入遺伝子の調製に使用され得る。配列番号３０に示すシロイヌナズナの成熟タンパク質配列と（ＢＬＡＳＴアラインメントにより）個々に比較された際、以下の成熟ＧＰＴタンパク質配列について、以下の配列同一性および相同性（ＢＬＡＳＴ「陽性」、類似アミノ酸を含む）が得られた。
【００８４】
【表１】
【００８５】
ＧＰＴタンパク質構造では多くの植物種を超えて特徴が保存されていることを強調するように、この保存は、上述した植物種内だけでなく、ゼブラフィッシュおよびクラミドモナス由来の推定上の非ヒトＧＰＴｓにまで及んで見られる。ゼブラフィッシュの場合、同一性の範囲は非常に高い（配列番号３０で示すシロイヌナズナの成熟ＧＰＴとアミノ酸配列で８３％の同一性、かつ類似アミノ酸残基を計算に加えれば９２％の相同性）。ゼブラフィッシュの成熟ＧＰＴは、大腸菌においてこれを発現させ、かつ生物学的活性（２−オキソグルタラメート合成）を証明することにより確認された。
【００８６】
推定上のＧＰＴホモログが、本発明における生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために適しているかどうかを調べるために、まずそのコード配列を大腸菌あるいは他の適した宿主内で発現させ、そして合成される２−オキソグルタラメートシグナル代謝産物の量が増加するかどうかを調べる必要がある（実施例１９〜２３を参照）。このような増加が示される場合には、次にそのコード配列を、同種の植物宿主および異種の植物宿主の両方に導入させた後に生育特性を評価してもよい。この目的のために、２−オキソグルタラメートを特異的に検出することができるあらゆるアッセイを使用することができる。あらゆるアッセイは、限定されないが、後述する実施例２に記載のＮＭＲおよびＨＰＬＣアッセイを含む。また、成熟ＧＰＴ活性を直接測定するためのアッセイを用いてもよい。
【００８７】
本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、２−オキソグルタラメート合成活性を有するあらゆる植物ＧＰＴが、植物細胞を形質転換するために使用され得る。植物種間における構造的な相同性のレベルは高いと考えられ、種々の植物ＧＰＴタンパク質と、ゼブラフィッシュの推定上のＧＰＴホモログとの間の密接な相同性によって証明されるように、この高いレベルは、植物を超えて及ぶと考えられる。したがって、種々の植物ＧＰＴ遺伝子が、種々の異種の植物種において生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。さらに、同種植物においてＧＰＴ導入遺伝子を発現させた場合には、異種細胞においては起こりえないであろう何らかの方法で、同種細胞内の制御が、導入遺伝子の発現を減じ得る可能性もある。しかし、たいていは生育特性が所望に向上される結果になることが期待されるであろう（すなわち、イネのグルタミントランスアミナーゼを、トランスジェニックイネ植物内で過剰発現させる）。
【００８８】
（転写終結）
好ましい実施形態において、転写終結を導き、ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を正常にさせるために、３’転写終結配列が導入遺伝子の下流に組み込まれる。好適な転写終結因子は、植物において機能することが知られている転写終結因子であり、限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素（nopaline synthase：ＮＯＳ）およびオクトピン合成酵素（octopine synthase：ＯＣＳ）遺伝子、オクトピン合成酵素遺伝子由来のＴ７転写産物、ジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼインヒビターＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーターおよびエンドウマメのｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。さらに、天然の遺伝子における転写終結因子が使用され得る。ある実施形態では、実施例として後述するが、ノパリン合成酵素の転写終結因子が使用される。
【００８９】
（選択マーカー）
選択マーカーは、形質転換体を選抜する手段を可能にするために、導入遺伝子の発現ベクターに通常含まれる。種々のタイプのマーカーが使用可能であるが、種々のネガティブセレクションマーカーが通常利用される。ネガティブセレクションマーカーは、形質転換されていない細胞を阻害し、または殺す選択剤に対する耐性を付与するマーカーを含み、例えば、抗生物質（例えばカナマイシン、ゲンタマイシン、アナマイシン（anamycin）、ハイグロマイシンおよびハイグロマイシンＢ）に対する耐性、または除草剤（例えばスルホニル尿素、グルホシネート（gulfosinate）、ホスフィノトリシンおよびグリフォセート）に対する耐性を付与する遺伝子を含む。スクリーニング可能なマーカーは、例えば、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ow et al., 1986, Science 234: 856-859）およびアントシアニン色素の生産もしくは制御に関わるタンパク質をコードする種々の遺伝子（例えば米国特許第６，５７３，４３２号を参照）を含む。大腸菌のグルクロニダーゼ遺伝子（ｇｕｓ，ｇｕｓＡまたはｕｉｄＡ）は、植物の遺伝子導入において広く使用されてきた選択マーカーである。この大きな理由は、グルクロニダーゼ酵素の安定性、高い感受性および検出の容易性（例えば、蛍光定量的方法、分光光度的方法、種々の組織化学的方法）にある。さらに、最も高等な植物種には、検出可能なグルクロニダーゼが基本的に存在しない。
【００９０】
（形質転換の手法およびシステム）
本発明における導入遺伝子の発現ベクターコンストラクトを、植物または植物細胞に導入するための種々の方法は、当業者によく知られており、あらゆる形質転換可能な植物または植物細胞が標的として利用され得る。
【００９１】
アグロバクテリウムによって媒介される形質転換は、おそらく植物の遺伝子導入に利用される最も一般的な方法である。そして、アグロバクテリウムに媒介される、多数の植物における形質転換プロトコルは、広く文献に記載されている（例えば、Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006を参照）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、腫瘤を誘導するＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」、「トランスファーＤＮＡ」）の小断片の植物細胞への挿入を介して、非常に多数の双子葉植物種において腫瘤（クラウンゴール疾患）を引き起こすグラム陰性土壌細菌である。Ｔ−ＤＮＡは、植物ゲノム中の半ランダムな位置に組み込まれ、そして最終的にそこに安定的に組み込まれ得る。Ｔ−ＤＮＡボーダーとよばれる直接繰り返しＤＮＡ配列が、Ｔ−ＤＮＡの左端および右端を規定している。Ｔ−ＤＮＡは、「バイナリーベクター」システムを作り出すために、Ｔｉプラスミドの残りの部分から物理的に分離されることができる。
【００９２】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物、単子葉植物、およびこれらの細胞を安定的に形質転換するために使用され得る（Rogers et al., 1986, Methods Enzymol., 118: 627-641; Hernalsteen et al., 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426-434）。アグロバクテリアにＤＮＡを導入する種々の方法が知られており、エレクトロポレーション、凍結融解法、および三親接合（triparental mating）を含む。外部ＤＮＡをアグロバクテリウム内に配置する最も効率的な方法は、エレクトロポレーションを介する方法である（Wise et al., 2006, Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium, Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 43-53）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの大部分は組み込まれないことを考慮すれば、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換を使用することにより、組み込まれていない導入遺伝子コンストラクト分子の転写能力を介した導入遺伝子の一過的な発現を得ることができる（Helens et al., 2005, Plant Methods 1:13）。
【００９３】
多数のアグロバクテリウム形質転換ベクターおよび方法が記載されてきた（Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7(5): 193-5）。そして、これらの多くのベクターは商業的に手に入れることができる（例えばインビトロジェン）。さらに、より多くの「オープンソース」のアグロバクテリウム形質転換ベクターが使用可能である（例えばｐＣａｍｂｉａベクター；Ｃａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。また、本明細書中に上述した「導入遺伝子コンストラクト」の項を参照されたい。さらに実施例に記載した特定の実施形態において、生育が向上したタバコおよびトマトのトランスジェニック植物を生成するために、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）において、ｐＭＯＮ３１６由来のベクターが使用された。
【００９４】
本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用され得る、他に一般に使用される形質転換法は、限定されないが、微粒子銃（microprojectile bombardmentもしくはbiolistic）形質転換法、カルシウムによるネイキッドＤＮＡのプロトプラスト形質転換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; Shimamoto et al., 1989, Nature, 338: 274-276）を含む。
【００９５】
微粒子銃形質転換は、ＤＮＡによってコートされた数百万個の金属粒子を、微粒子銃装置（もしくは「遺伝子銃」）を用いて標的の細胞または組織に注入する。様々な種類の微粒子銃が商業的に入手可能である。いったん細胞中に入れば、ＤＮＡが粒子から溶出され、一部が安定的に細胞の１つ以上のクロモソーム中に組み込まれ得る（レビューのために、Kikkert et al., 2005, Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJを参照）。
【００９６】
エレクトロポレーションは、短い、高強度の電場を利用して、細胞膜の脂質二重層を可逆的に透過可能にする技術である（例えば、Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al.,1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99を参照）。この技術は、細菌の膜に水溶性の細孔を作り出すことにより行なう。細孔は、ＤＮＡ分子（および他の高分子）が細胞に入るのに充分な大きさのサイズである。そして、導入遺伝子発現コンストラクト（Ｔ−ＤＮＡ等）は、植物ゲノムＤＮＡ中に安定的に組み込まれることができ、形質転換細胞の生成が導かれ、その後に形質転換細胞はトランスジェニック植物に再生され得る。
【００９７】
より新しい形質転換法は、いわゆる「フローラルディップ（floral dip）」法を含む。フローラルディップ法は、他の一般に使用される全ての形質転換方法のように植物組織培養が要求されず、単純性が期待される（Bent et al., 2006, Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method, Methods Mol Biol, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 87-103; Clough and Bent, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743）。しかしながら、シロイヌナズナを除いて、これらの方法は、広範囲の種類の植物種にわたって広く使用されていない。簡単にいえば、フローラルディップによる形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの適切な菌株を用いて、開花している植物を浸漬し、もしくは開花している植物に噴霧することにより成し遂げられる。その後、３つのＴ０植物から回収した種子を発芽させ、トランスジェニックＴ１個体を同定して選択した。実施例１６は、花の浸漬によりシロイヌナズナを接種し、トランスジェニックシロイヌナズナ植物を生成したことを示す。
【００９８】
他の形質転換法は、アグロバクテリウムベクター等を用いて、生育中の植物の種子または苗を形質転換させる方法を含む。例えば、このようなベクターは、ベクター（すなわちアグロバクテリア）の懸濁液または混合物を、生育中の種子のさやにおける空洞中に直接的に注入することによって、生育中の種子を形質転換するために使用し得る（Wang and Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Reporter 15: 209-215）。苗は、Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol. Reporter 27: 20-28に記載のように形質転換され得る。発芽した種子は、Chee et al., 1989, Plant Pysiol. 91: 1212-1218に記載のように形質転換され得る。ベクターが果実または生育中の果実内に注入される果実内部法もまた使用し得る。他の形質転換法は、花器官をベクター接種のための標的とする方法、例えば花接種法などをも含む。
【００９９】
上述した植物形質転換法は、導入遺伝子を多くの種類の植物細胞および組織に導入するために使用され得る。植物細胞および組織は、限定されないが、植物全体、葉緑体を含む組織および器官の移植片、葉緑体を含む組織および器官の移植片、開花組織および細胞、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、小胞子などの未成熟の胚および配偶子細胞、花粉、精子および卵細胞、上述した組織の培養細胞、再生された繁殖性のトランスジェニック植物が生成され得る他のあらゆる細胞を含む。カルスは、組織源から生じる。組織源は、限定されないが、未成熟の胚、苗の頂端分裂組織、小胞子などを含む。カルスとして増殖可能な細胞もまた、遺伝的形質転換を受ける細胞である。
【０１００】
形質転換された植物細胞、組織および器官から個々の植物を再生する方法は、多くの植物種について知られており、かつ記載されている。
【０１０１】
例として、形質転換された小植物（形質転換細胞または組織由来）を、形質転換法に使用する選択剤（つまり、およびカナマイシンなどの抗生物質）が添加された植え付け可能な生育培地において培養する。この形質転換された小植物を、根を下ろした後に土壌に移し、十分に成長させる。開花した後、成熟植物に好ましくは自家受粉させる。そして、その結果生じた種子を回収し、次の世代を生育させるために使用する。実施例３〜６は、トランスジェニックタバコ植物およびトランスジェニックトマト植物の再生について記載する。
【０１０２】
Ｔ０トランスジェニック植物は、第１の形質転換体もしくは第２の形質転換体の自家受粉によって、または他の植物（形質転換植物もしくは非形質転換植物）の第１もしくは第２の形質転換体の雌雄交雑によって、次の世代（例えば、Ｔ１、Ｔ２など）を生成するために使用され得る。
【０１０３】
（生育が向上されたトランスジェニック植物の選抜）
トランスジェニック植物は、標準的な方法を用いて選抜され、スクリーニングされ、そして同定され得る。本発明の好ましいトランスジェニック植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を示す１つ以上の表現型の特徴を提示し得る。トランスジェニック植物は、通常、形質転換体を選抜するために、選択圧下で再生され、その後にトランスジェニック植物生成が行なわれる。さらに、使用される選択圧は、所望の導入遺伝子発現コンストラクトまたはカセットの存在を確認するために、Ｔ０世代を超えて使用され得る。
【０１０４】
Ｔ０形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換に用いる導入遺伝子発現コンストラクトに含まれるマーカー遺伝子の遺伝的組成物、および／またはマーカー遺伝子によりコードされる表現型の特徴を選抜し、またはスクリーニングすることにより、同定され、かつ単離され得る。例えば、遺伝的コンストラクトによって耐性を付与することができる抗生物質または除草剤の抑圧的な量を含む生育培地において、形質転換されている可能性のある植物、組織または細胞を生育させることによって、選抜が行なわれ得る。さらに、形質転換された植物細胞、組織および植物は、導入遺伝子発現コンストラクト内に存在し得るマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ等）の活性をスクリーニングすることによっても同定され得る。
【０１０５】
周知のとおり、所望の導入遺伝子発現コンストラクトを含む植物を同定するために、種々の物理的方法および生化学的方法が使用され得る。これらの方法の具体例は、例えば以下を含む：導入遺伝子、導入遺伝子発現コンストラクトまたはその要素を同定するためのサザンブロット解析または種々の核酸増幅法（いわゆるＰＣＲ）；ＲＮＡ転写産物を検出しかつ決定するためのノザンブロッティング、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅法；導入遺伝子によってコードされかつ発現されるタンパク質を同定するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、酵素免疫測定。
【０１０６】
他の手段では、形質転換体を同定するために、標的植物における導入遺伝子の発現により改変されることが知られている遺伝子、タンパク質および／または代謝化合物の発現量が使用され得る。本発明に係る一実施形態において、シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの量の増加は、所望の形質転換体をスクリーニングするために使用され得る。
【０１０７】
最後に、本発明の形質転換植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を用いてスクリーニングされ得る。実際、特にその後の自家受粉、異種交配および戻し交配による植物を同定する際には、最も速い生育速度、最も高い種子の収量などを有する形質転換ラインを同定するために、ある一定の表現型のスクリーニングが通常望ましい。この目的のために、種々のパラメータが使用できる。パラメータは、限定されないが、生育速度、全生体重、乾燥重量、種子および果実の収量（数、重量）、種子および／または種子のさやのサイズ、種子のさやの収量（例えば数、重量）、葉のサイズ、植物のサイズ、開花の向上、開花の時期、全体のタンパク質量（種子、果実、植物組織内）、特定のタンパク質量（すなわちＧＳ）、窒素量、遊離アミノ酸、および特定の代謝化合物量（すなわち２−オキソグルタラメート）を含む。一般的に、これらの表現型の測定値は、親と同一もしくは類似の植物ライン、形質転換されていない植物と同一もしくは類似の植物、または野生型植物と同一もしくは類似の植物（すなわち、標準の植物もしくは親植物）から得られた測定値と比較される。好ましくは、そして少なくとも最初に、標的トランスジェニック植物における選択された表現型の特徴の測定は、標準の植物もしくは親植物における同じ特徴の測定と並行に行なわれる。通常、特定の表現型の特徴について、トランスジェニック植物における表現型の好ましさおよび／または優位性を確立するために、複数の植物が使用される。
【０１０８】
好ましくは、最初の形質転換体は、導入遺伝子の遺伝子型が先祖の形質を維持する（すなわち、植物が、導入遺伝子について同型となる）まで、選択された後にＴ１およびこれに続く世代を自家受粉により生成するために使用される。実際には、これは、３または４世代について自家受粉させ、各世代において所望の形質についてスクリーニングし、そしてそれら個々を自家受粉させることにより成し遂げられる。
【０１０９】
安定なトランスジェニックラインは、いくつもの所望の形質を有する変種を作り出すために交雑され、かつ戻し交配されてもよい。変種は、積み重ねられた導入遺伝子を有する変種、導入遺伝子のマルチコピーを有する変種などを含む。さらに、安定なトランスジェニック植物は、これらの植物に導入遺伝子もしくは親の導入遺伝子のさらなるコピーをさらに形質転換することによって、遺伝的にさらに改変されてもよい。また、所定の導入遺伝子もしくは複数の導入遺伝子のマルチコピーを導入する形質転換を１回行なうことによって、トランスジェニック植物を作り出すことが検討される。種々の一般的な育種方法は、当業者によく知られている（例えばBreeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)を参照）。
【０１１０】
〔実施例〕
本発明の様々な態様を、いくつかの実施例によりさらに記載および説明するが、いずれも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
＜実施例１：シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）遺伝子の単離＞
シグナル代謝産物である２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与する植物酵素を見出す試みとして、出願人らは、推定される植物酵素が、２−オキソグルタラメートの合成に関与していると特徴づけられているヒトのタンパク質と、ある程度の構造上の関連性を有しているであろうとの仮説を立てた。ヒトのパンパク質であるグルタミントランスアミナーゼＫ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６４）（文献では、システイン共役β―リアーゼ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、等ともいわれている）は、ハロゲン化した生体異物のシステイン共役の処理に関与していることがわかっている（Perry et al., 1995, FEBS Letters 360:277-280）。ヒトのシステイン共役β―リアーゼは、窒素代謝に関与する活性を有するよりも、むしろヒトおよび動物において解毒活性を有する（参照）。とはいえ、２−オキソグルタラメートの合成におけるこのタンパク質の潜在的な関与は重要であった。
【０１１２】
ヒトのシステイン共役β―リアーゼのタンパク質配列を用いて、ＴＩＧＲシロイヌナズナ植物のタンパク質配列のデータベースを検索して、関連する可能性がある１つの配列、すなわち、シロイヌナズナの遺伝子のＡｔ１ｑ７７６７０に位置する部分的な配列によりコードされるポリペプチドを同定した。このポリペプチドは、アライメントした領域で約３６％の配列相同性を共有する。
【０１１３】
全長の遺伝子コーディング領域は、下記のプライマーによりシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
【０１１４】
5’- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3’
5’- GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3’
これらのプライマーは、後述のトランスジェニック植物を作成するための発現ベクターでのサブクローニングを促進するため、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）およびＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）の制限酵素部位を含むように設計した。ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、次の条件により高性能のＰＣＲを行なった：まず９４Ｃで４分間変性し、９４Ｃで３０秒間の変性、５５Ｃで３０秒間のアニーリング、および７２Ｃで９０秒の伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２Ｃで７分間伸長反応させる。増幅産物はＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法で単離して、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus：ＣａＭＶ）３５Ｓの構成的プロモーターおよびノパリンシンターゼ（nopaline synthase：ＮＯＳ）３’ターミネーターを含むベクターｐＭｏｎ３１６（Rogers, et. al. 1987 Methods in Enzymology 153:253-277）にライゲーションした。ライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、挿入されたことを確認するために形質転換体の配列を決定した。
【０１１５】
１．３ｋｂのｃＤＮＡを単離して配列を決定したところ、推定される葉緑体のシグナル配列を含む、長さ４４０アミノ酸の全長タンパク質をコードすることを見出した。
【０１１６】
＜実施例２：生物学的に活性なシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼの産生＞
上述の実施例１に記載したように、単離したｃＤＮＡによりコードされたタンパク質が、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することが可能か否かを調べるため、当該ｃＤＮＡを大腸菌で発現させて、２−オキソグルタラメートの合成能を標準的な方法で検定した。
【０１１７】
（２−オキソグルタラメートのＮＭＲアッセイ）
簡潔にいえば、精製したタンパク質の産物を、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００ｍＭ グルタミン、１００ｍＭ グリオキシル酸および２００マイクロＭ ピリドキサル５’−リン酸を含む反応液に加えた。試験するタンパク質を加えていない反応液をコントロールとして用いた。試験反応液およびコントロール反応液を３７℃で２０時間インキュベートし、遠心分離によって浄化して沈殿物を取り除いた。化学的に合成した標準の２−オキソグルタラメートを参照として、１３ＣＮＭＲを用いて、２−オキソグルタラメートの存在と量を分析するために上清を試験した。反応産物は２−オキソグルタラメートおよびグリシンであり、一方、基質（グルタミンおよびグリオキシル酸）は存在比が減少した。サイクリック２−オキソグルタラメートは、オープンチェーンのグルタミン前駆体から容易に区別できる、まったく異なるシグナルを生じさせた。
【０１１８】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
ＧＰＴ活性に関する代替的なアッセイは、Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いて２−オキソグルタラメート産物を測定した。簡潔にいえば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ＦＡＤ、１０ｍＭ システインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む、変性抽出バッファーを用いた。検査物質からの組織サンプル（すなわち、植物組織）を約１／３の比率（ｗ／ｖ）で抽出バッファーに加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡによって停止させた。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、その上清を用いてＨＰＬＣ（０．０１Ｎ ｈ２ＳＯ４の移動相、約０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速、４０℃、でのＩＯＮ−３００ ７．８ｍｍ ＩＤ Ｘ ３０ｃｍ Ｌ ｃｏｌｕｍｎを用いる）によって２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なう。
【０１１９】
（ＮＭＲアッセイの結果）
本実験は、試験タンパク質が２−オキソグルタラメートの合成を触媒することができるということを証明した。ゆえに、これらのデータは、単離したｃＤＮＡが、植物において２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与するグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼをコードするということを示す。よって、試験タンパク質はシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、すなわちＧＰＴといえる。
【０１２０】
シロイヌナズナＧＰＴのコード配列のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＧＰＴパンパク質の翻訳されたアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【０１２１】
＜実施例３：シロイヌナズナのＧＰＴを過剰発現するトランスジェニックタバコ植物の作成＞
（植物の発現ベクターｐＭＯＮ−ＰＪＵの生成）
簡潔に、植物の発現ベクターｐＭｏｎ３１６−ＰＪＵを以下のように作製した。単離したシロイヌナズナのＧＰＴをコードするｃＤＮＡ（実験例１）をｐＭｏｎ３１６ベクターのＣｌａＩ−ＫｐｎＩポリリンカー部位に入れて、クローニングした。これにより、ＧＰＴ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）転写ターミネーターの制御下におかれる。選択マーカーを提供するためにカナマイシン耐性遺伝子を加えた。
【０１２２】
（アグロバクテリウムを介した植物の形質転換）
ｐＭＯＮ−ＰＪＵおよびコントロールベクターｐＭｏｎ３１６（挿入したＤＮＡなし）は標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のｐＴｉＴＴ３７ＡＳＥに形質転換し、続いて抗生物質スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーをＰＣＲによって試験し、プラスミドを含むことを確認した。
【０１２３】
ニコチアナ・タバカムｃｖクサンチ（Nicotiana tabacum cv Xanthi）植物を、Horschらのリーフディスク形質転換法（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）を用いて、アグロバクテリウムを形質転換したｐＭＯＮ−ＰＪＵにより形質転換させた。つまり、無菌のリーフディスクに接種し、２日間培養して、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのクラファラン（clafaran）を含んでいる選択ＭＳ培地に移植した。選択培地中で根を形成する能力により形質転換体を確認した。
【０１２４】
（ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物の生成）
無菌の葉の切片を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（Ｍ＆Ｓ）培地上でカルスに発達させ、そこから形質転換小植物体が出現した。。そして、これらの小植物体を発根可能な選択培地（選択試薬としてカナマイシンを含むＭ＆Ｓ培地）に移植した。その後、正常で、発根した、形質転換したタバコの小植物体を土壌に移植し、成熟期まで生育させて、花が咲いた植物を自家受精させて、得られた種子を収穫した。成長期の間、植物の成長表現型を調べ、多くの若いトランスジェニック植物でＣＯ２固定速度を測定した。
【０１２５】
（Ｔ１およびＴ２世代のＧＰＴトランスジェニック植物の生成）
トランスジェニックタバコ植物のＴ０世代から収穫した種子を、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＭ＆Ｓ培地で発芽させて、導入遺伝子の質を高めた。種子のうち少なくとも１／４がこの培地で発芽せず（カナマイシンは、通常の遺伝子分離の結果もたらされ得る、耐性のない種子の発芽を阻害すると期待される）、残りの種子のうち半分以上がカナマイシンに対して感受性（ごく弱い）を示したため取り去られた。
【０１２６】
生き残った植物（Ｔ１世代）を成長させ、これらの植物をＴ２世代の種子を生産するために自家受精させた。Ｔ１世代からの種子は、形質転換体の系統のためにカナマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）が追加されたＭＳ培地で発芽させた。１４日後、種子を砂地に移し、２５ｍＭの硝酸カリウムが追加された４分の１の濃度のホーグランド栄養液を与えた。これを９００マイクロモル／ｍ２／秒の光の強さで１６時間の明期および８時間の暗期という光周期にして、２４℃で成長させた。それらを砂地培養に移植した１４日後に収穫した。
【０１２７】
（ＧＰＴトランスジェニック植物のキャラクタリゼーション）
収穫されたトランスジェニック植物（ＧＰＴ形質転換体およびベクターコントロール形質転換体の両方）を根および葉のグルタミンシンセターゼ活性、乾燥させていない植物の総量、根および葉の総タンパク質ならびにＣＯ２固定速度（Knight et al., 1988, Plant Physiol. 88: 333）を分析した。形質転換していない野生型Ａ．ツメファシエンス植物もベースラインコントロールを設けるため、同じパラメータで分析した。
【０１２８】
生育特性の結果は、下記の表１に示す。さらに、野生型のコントロール植物と比較したＧＰＴトランスジェニック植物の写真を図２に示す（ＧＳ１トランスジェニックタバコ植物と一緒に示す）。評価した全パラメータにわたって、ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物は促進された生育特性を示す。特に、ＧＰＴトランスジェニック植物は、野生型のコントロール植物と比較して、ＣＯ２固定速度において５０％増を示し、葉の組織におけるグルタミンシンセターゼ活性は２倍を示した。さらに、葉と根とのＧＳ比は、トランスアミナーゼのトランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較してほぼ３倍に増加した。生体重および全タンパク質量も、トランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較して、それぞれ約５０％および８０％（葉）増加した。これらのデータは、シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子が過剰発現したタバコ植物が、有意に促進された成長とＣＯ２固定速度を獲得することを実証する。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
データ＝３個体の平均値である。
【０１３１】
野生型−コントロール植物；再生または形質転換されていない。
【０１３２】
ＰＮ１系統は導入遺伝子を有していないコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。
【０１３３】
再生および形質転換の処理に対するコントロール。ＰＮ９系統はシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を有するコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。
【０１３４】
＜実施例４：シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト植物の生成＞
シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト（Lycopersicon esculentum）（マイクロトムトマト）植物を、実施例３で記載したベクターおよび方法を用いて作成した。Ｔ０トランスジェニックトマト植物を作成し、成熟期まで生育させた。トランスジェニックトマト植物の初期生育特性のデータを表２に示す。トランスジェニック植物は野生型のコントロール植物と比較して、成長速度、開花および種子の収穫量の有意な促進を示した。さらに、トランスジェニック植物は複数の主茎を発達させた、一方、野生型の植物は単数の主茎を発達させた。野生型の植物と比較したＧＰＴトランスジェニックトマト植物の写真を図３に示す。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
＜実施例５：植物体におけるオオムギＧＰＴ導入遺伝子の活性＞
本実施例では、オオムギのＧＰＴの推定コード配列を、植物体への一過性発現アッセイによって導入遺伝子コンストラクトから単離し、発現させた。生物学的に活性な組換えオオムギＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１３７】
オオムギ（Hordeum vulgare）ＧＰＴのコード配列を決定し、合成した。この実施例で用いるオオムギＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１４に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１３８】
オオムギＧＰＴのコード配列を１３０５．１カンビアベクターに挿入し、標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株のＬＢＡ４０４に形質転換し、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーを解析のために選択した。
【０１３９】
タバコ葉の一過性発現アッセイは、形質転換したアグロバクテリウム（１．５−２．０ ＯＤ６５０）の懸濁液を、急速に成長するタバコ葉へ注入することから成る。皮内注射は有意な量の葉の表面がアグロバクテリウムにさらされることを確実にするため、葉の表面にわたる格子内で行った。植物を３−５日間生育させて、組織を他の全ての組織抽出で説明したように抽出し、ＧＰＴ活性を測定した。
【０１４０】
接種した葉の組織のＧＰＴ活性（１２１７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）は、コントロール植物の葉の組織で測定した活性（４０７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）の３倍であり、ダイズ（Hordeum）ＧＰＴコンストラクトはトランスジェニック植物において機能的なＧＰＴを直接発現することができることを示した。
【０１４１】
＜実施例６：組換えイネＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、イネのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えイネＧＰＴが作成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１４２】
〔材料と方法〕
（イネＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
イネ（Oryza sativia）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで成長させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して集菌した。そして、合計２５×１０６個の細胞の生物学的活性に関して、以下のＮＭＲアッセイによって分析した。形質転換していない野生型の大腸菌細胞をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１４３】
本実施例で用いるイネＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１０に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【０１４４】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いてＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの産生量を測定した。つまり、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ピリドキサルリン酸、１０ｍＭ システインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む変性抽出バッファーを用いた。サンプル（大腸菌細胞２５×１０６個の溶菌液）を抽出バッファーに約１／３比率（ｗ／ｖ）で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡで停止した。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、上清を用いて、０．０１Ｎ ｈ２ＳＯ４の移動相、流速約０．２ｍｌ／分、４０℃においてＩＯＮ−３００ ７．８ｍｍ ＩＤ Ｘ ３０ｃｍ Ｌ ｃｏｌｕｍｎを用いたＨＰＬＣにより、２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なった。
【０１４５】
標準の２−オキソグルタラメートとのＮＭＲアッセイの比較は、シロイヌナズナの全長配列が、２−オキソグルタラメート合成活性を持つＧＰＴを発現することを立証するために用いた。つまり、アッセイの産物（発現ＧＰＴに対する応答において合成された分子）および標準の２−オキソグルタラメートが同じ保持時間で溶出することを確認することによって、上記のＨＰＬＣアッセイを有効なものとするために、化学的合成により標準の２−オキソグルタラメート（ＮＭＲで確認した構造）を作製した。加えて、アッセイ産物および標準の化合物を共に混合すると単一のピークとして溶出した。さらに、ＨＰＬＣアッセイの有効化は、基質であるグルタミンの消失のモニタリングおよびグルタミンの消費と２−オキソグルタラメートの生成との間に１：１のモル比があることを示すことも含んでいた。分析の工程には常に２つのコントロールを含んでおり、１つは酵素の添加がなく、１つはグルタミンの添加がない。第一に、２−オキソグルタラメートの生成物は酵素の存在に依存することを示し、第二に２−オキソグルタラメートの生成は基質であるグルタミンに依存することを示す。
【０１４６】
（結果）
配列番号１０のイネＧＰＴコード配列の発現は、２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１．７２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えイネＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８６倍の活性レベルの増加がみられた。
【０１４７】
＜実施例７：組換えダイズＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ダイズのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えダイズＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１４８】
（材料と方法）
（ダイズＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
ダイズ（Glycine max）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターを形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１４９】
本実施例で用いるダイズＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１２に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０１５０】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
上記の実施例２０に記載したように、ＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの生成を判定するためにＨＰＬＣを用いた。
【０１５１】
（結果）
配列番号１２のダイズＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的に活性な組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、３１．９ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えダイズＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１６００倍近くの活性レベルの増加がみられた。
【０１５２】
＜実施例８：組換えゼブラフィッシュＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ゼブラフィッシュのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的活性のある組換えゼブラフィッシュＧＰＴが作成され、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１５３】
（材料と方法）
（ゼブラフィッシュＧＰＴコード配列および大腸菌における発現）
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１５４】
この実施例で用いるゼブラフィッシュＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１６に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
【０１５５】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
上記の実施例２０に記載したように、ＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの生成を判定するためにＨＰＬＣを用いた。
【０１５６】
（結果）
配列番号１６のゼブラフィッシュＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、２８．６ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えゼブラフィッシュＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１４００倍以上の活性レベルの増加がみられた。
【０１５７】
＜実施例９：トランケートされた組換えシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
この実施例では、シロイヌナズナのＧＰＴの推定コード配列の異なる２つの断片を構築し、推定される葉緑体のシグナルペプチドが欠失しているまたはトランケートされたＧＰＴタンパク質の活性を評価するために、大腸菌で発現させた。最初の３０個のアミノ末端のアミノ酸残基または最初の４５個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失するようにトランケートされた、シロイヌナズナＧＰＴの全長アミノ酸配列の配列番号１に対応する組換え断片ＧＰＴタンパク質は、無事に発現し、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒する生物学的活性を示した。
【０１５８】
（材料と方法）
（トランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
配列番号１のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＧＰＴコード配列の断片のＤＮＡコード配列を構築し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。本実施例で用いたトランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列のＤＮＡ配列を配列番号２０（−４５ＡＡコンストラクト）に示し、対応するトランケートされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、実施例２０に記載したように、ＨＰＬＣアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１５９】
配列番号２０のトランケートされた−４５のシロイヌナズナＧＰＴコード配列の発現は、生物学的活性（２−オキソグルタラメートの合成を触媒する生物学的活性）を持つ、組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１６．１ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性がトランケートされた−４５のＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８００倍以上の活性レベルの増加がみられた。比較として、同じＥ．ｃｏｌｉで発現するシロイヌナズナ遺伝子の全長コード配列では、２．８ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が生じ、トランケートされた組換えＧＰＴタンパク質のおよそ１／５の活性がみられた。
【０１６０】
この明細書中で引用されている全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物または特許出願が参照として組み込まれると明確におよび個々に表示されているように、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
この発明は本明細書で明らかにされた具体例によって範囲を限定されるものではなく、具体例は発明の個々の態様の一例とする意図であり、機能的に同等のものはいずれも発明の範囲内である。本明細書に記載されたもの加えて、発明のモデルおよび方法の様々な変更が前記の説明および手引きから、当業者にとって明白になるであろうし、同様に発明の範囲に含まれることを意図する。そのような変更または他の具体例は、発明の正当な範囲および趣旨から離れることなく実施され得る。
【０１６２】
〔配列表〕
【０１６３】
【表４】
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
【表６】
【０１６６】
【表７】
【０１６７】
【表８】
【０１６８】
【表９】
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
【表１１】
【０１７１】
【表１２】
【０１７２】
【表１３】
【０１７３】
【表１４】
【０１７４】
【表１５】
【０１７５】
【表１６】
【０１７６】
【表１７】
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
【表１９】
【０１７９】
【表２０】
【０１８０】
【表２１】
【０１８１】
【表２２】
【０１８２】
【表２３】
【０１８３】
【表２４】
【０１８４】
【表２５】
【０１８５】
【表２６】
【０１８６】
【表２７】
【０１８７】
【表２８】
【０１８８】
【表２９】
【０１８９】
【表３０】
【０１９０】
【表３１】
【０１９１】
【表３２】
【０１９２】
【表３３】
【０１９３】
【表３４】
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】窒素吸収および２−オキソグルタラメート化学合成の概略的な代謝経路を示す図である。
【図２】野生型のタバコ植物に対して、ＧＰＴを過剰発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。
【図３】野生型のトマト植物に対してＧＰＴを過剰に発現するトランスジェニックミクロトームトマト植物の比較を示す写真である。
【図４】野生型のタバコ植物（上の葉）とＧＰＴトランスジェニックのタバコ植物（下の葉）との葉の大きさの比較を示す写真である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔連邦政府が後援する研究または開発に基づいてなされる発明に対する権利に関する明細書〕
本発明は、米国エネルギー省がカルフォルニア大学の理事に対して与えた規約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６、および米国エネルギー省がロスアラモス国家安全保障有限責任会社に対して与えた規約番号ＤＥ−ＡＣ５２−０６ＮＡ２５３９６に基づく支援によってなされた。政府は本発明の所定の権利を有する。
【０００２】
〔関連文献〕
本明細書は、２００８年８月２９日に提出された米国仮特許番号第６１／１９０，５８１号に対して優先権を主張するものである。
【０００３】
〔背景技術〕
世界的に人口が増加し、使用可能な農地が失われるか、または使用不能になり続けるため、より効率的で、かつ、地球に優しい農業システムに対する必要性は、人類にとって興味のある最優先事項である。収量、タンパク質含有量、および植物の成長速度を向上させることは、目下の課題により効果的に対処し得る農業システムの開発において主な目的になっている。
【０００４】
近年では、十分に開発された多くの農作物の生産量は横這い状態になる傾向にあるため、改良された農作物の生産技術の重要性が高まるばかりである。多くの農作業は、コストおよび収益が農作物の迅速な回転率または市場までの時間に依存することから、時間に注意を払っている。そのため、価値の高い農作物（穀物、野菜、ベリーおよび他の果物など）に関する多くの農業ビジネスにとって、植物の早い成長が経済的に重要な目標である。
【０００５】
遺伝子工学は、いまだ持続的な農業技術の開発において賛否両論があるもののますます重要な役割を果たしており、今後もその役割を果たし続ける。近年、数多くの遺伝的に改変された植物および関連技術が開発されており、今日では当該植物および関連技術の多くが広く用いられている（Factsheet: Genetically Modified Crops in the United States, Pew Initiative on Food and Biotechnology, August 2004, http://pewagbiotech.org/resources/factsheets）。現在、採用されるトランスジェニック植物の種類は非常に多く、また増加しており、２００６年には約２億５０００万エーカーでトランスジェニック植物を栽培している。
【０００６】
トランスジェニック植物技術の承認は徐々に増加しているかもしれないが（特に、米国、カナダおよびオーストラリアにおいて）、世界中の多くの地域（特に、ヨーロッパ）では農業における遺伝的に改変された植物の導入は未だに遅れている。そのため、信頼性があり、永続的な農業の方針を追い求めることと一致して、毒素または他の潜在的に問題のある物質を植物および／または環境に取り込むことのない遺伝的に設計された植物の開発への強い関心がある。また、目的（除草剤耐性、ペストおよび疾病抵抗性、ならびに全体的な収穫率を改良することなど）達成のコストを最小限にすることへの強い関心がある。したがって、これらの目的を満足させることが可能なトランスジェニック植物に関する必要性がいまだにある。
【０００７】
植物の早い成長という目標は、様々な植物調節システムに関する数多くの研究によって追求されている。この調節システムの多くはいまだ完全には理解されていない。特に、炭素および窒素の代謝を調整する植物調節機構は、完全に明らかになっていない。これらの調節機構は植物の成長および発達に欠かせない影響力があると推定される。
【０００８】
光合成生物における炭素および窒素の代謝は、植物資源およびエネルギーの効果的な利用を保証する調整方法において調節されなければならない。炭素および窒素の代謝に関する従来の理解は、所定のステップおよびより大きなシステムのサブシステムである代謝経路の詳細を含む。光合成生物において、炭素代謝はＣＯ２固定によって始まり、２つの主な処理（Ｃ−３代謝およびＣ−４代謝と呼ばれる）によって進行する。Ｃ−３代謝を伴う植物において、酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ribulose bisphosphate carboxylase：RuBisCo）は、ＣＯ２とリブロース二リン酸との結合を触媒し、３−ホスホグリセリン酸塩を産生する。当該３−ホスホグリセリン酸塩は、植物が炭素含有化合物を合成するために用いる３炭素化合物（Ｃ−３）である。Ｃ−４代謝を伴う植物において、ＣＯ２は、酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって触媒される反応において、ホスホエノールピルビン酸塩と結合されて４炭素を含有する酸を形成する。この酸は、脱炭酸されてＣＯ２を放出する場である維管束鞘細胞に輸送されて、その後、Ｃ−３植物に用いられた同じ反応中でリブロース二リン酸と結合される。
【０００９】
数多くの研究では、様々な代謝産物が窒素代謝の植物調整に重要であることがわかっている。これらの化合物としては、有機酸であるリンゴ酸、ならびにアミノ酸であるグルタミン酸およびグルタミンが挙げられる。窒素は、酵素であるグルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase：ＧＳ）の働きによって光合成生物に吸収される。グルタミンシンテターゼは、アンモニアとグルタミン酸との結合を触媒し、グルタミンを作る。ＧＳは、植物における窒素吸収に重要な役割を果たしており、グルタミン酸に対するアンモニアの付加を触媒することによってＡＴＰ依存性反応の中でグルタミンを作り出す（Miflin and Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, No. 370, pp. 979-987）。また、ＧＳは、光吸収ならびにタンパク質および窒素輸送化合物の機能停止の結果として放出されたアンモニアを再吸収する。ＧＳ酵素は２つの一般分類に分けられ得る。その１つは細胞質の形態（ＧＳ１）を表し、もう１つは色素体（すなわち、葉緑体）の形態（ＧＳ２）を表す。
【００１０】
これまでの研究では、ＧＳ１の増大した発現量がＧＳ活性および植物成長のレベルを増加させることを証明しているが、報告は一貫性が欠けている。例えば、Fuentesらには、タバコ中のＣａＭＶ Ｓ３５プロモーターによるアルファルファＧＳ１（細胞質の形態）の過剰発現は、葉組織内におけるＧＳ発現およびＧＳ活性のレベルを増加させたり、窒素欠乏状態で成長を増大させたりするが、最適な窒素肥沃状態における成長に影響を及ぼさないことが報告されている（Fuentes et al., 2001, J. Exp. Botany 52: 1071-81）。Templeらには、非常に高いレベルのＧＳ転写産物を含有する全長アルファルファＧＳ１をコードする配列を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物、および活性な酵素に組み込まれるＧＳポリペプチドについて報告されているが、成長における表現型の作用について報告されていない（Temple et al., 1993, Molecular and General Genetics 236: 315-325）。Corruziらには、ＣａＭＶ Ｓ３５プロモーターの制御下でエンドウマメの細胞質ゾルＧＳ１導入遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックタバコが、増加されたＧＳ活性、増加された細胞質ゾルＧＳタンパク質、および改善された成長特性を示すことが報告されている（米国特許出願第６，１０７，５４７号明細書）。さらに最近、Unkeferらには、葉状組織内においてアルファルファＧＳ１を過剰発現するトランスジェニックタバコ植物（葉から根において増大されたＧＳ活性に関してスクリーニングした後、増大したＳ１導入遺伝子のコピー数が得られるように、自家受粉によって遺伝的に分離した植物）が、それらの葉状部位において増大された量の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンを製造することを見出したことが報告されている。当該２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンは、野生型のタバコ植物全体に顕著に増大された成長速度を導くことが見出されている（米国特許出願第６，５５５，５００号明細書、米国特許出願第６，５９３，２７５号明細書、米国特許出願第６，８３１，０４０号明細書を参照）。
【００１１】
さらに、Unkeferらには、植物の発育を改良するための２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（また、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）として知られる）の使用について記載されている（米国特許第６，５５５，５００号明細書、米国特許第６，５９３，２７５号明細書、米国特許第６，８３１，０４０号明細書）。特に、Unkeferらには、葉状組織（根幹組織に関連する）における増加された濃度の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンが、植物発育特性を増強させることになる事象のカスケードの引き金になることが開示されている。Unkeferらには、２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの葉状濃度が植物発育特性を増強させる引き金となるために増加され得る（具体的には、植物の葉状部分に直接２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの溶液を投与し、葉組織に特異的にグルタミンシンテターゼを過剰発現させることによって）方法が記載されている。
【００１２】
動物の２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に関連があることが知られる数多くのトランスアミナーゼおよびヒドロリアーゼ酵素は、動物の肝組織および膵組織において同定されている（Cooper and Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, pages 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304）。植物では２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生化学的合成が知られているが、十分に特性が示されていない。さらに、植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの機能、およびその液溜まりの大きさ（組織濃度）の重要性は知られていない。結局、当該技術では、どのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が存在し得るか、および／またはどのような（複数の）トランスアミナーゼまたは（複数の）加水分解酵素が植物中で２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成を触媒するときに機能し得ることに関してはっきりと明確な指針を提供しておらず、当該植物トランスアミナーゼが報告されたり、単離または特徴づけられたりしていない。
【００１３】
〔発明の概要〕
本発明は、増強された成長速度、種子および果実の収量、ならびに総バイオマス収量を示すトランスジェニック植物、また、成長が増強されたトランスジェニック植物を産生する方法に関する。一実施形態においては、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）を過剰に発現するために設計されたトランスジェニック植物が提供される。
【００１４】
出願人は、酵素であるグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を植物における２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（２−オキソグルタラメート）シンテターゼの触媒として同定する。２−オキソグルタラメートは、光合成用途、炭素固定および窒素代謝に関連のある多数の遺伝子の機能を調節する強力なシグナル代謝産物である。
【００１５】
シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの濃度を特異的に増加させることによって（すなわち、葉状組織において）、本発明の導入遺伝子植物は短期間でより高い総収量を生産することが可能であるため、幅広い農作物にわたって増強された生産性を有する農業を提供し得る。重要なことに、今日までに説明されている多くのトランスジェニック植物とは異なり、本発明は天然の植物酵素をコードする天然の植物遺伝子を利用する。本発明のトランスジェニック植物の増強された成長特性は、植物に追加のＧＰＴ能力を取り込むことによって本質的に達成される。このように、本発明のトランスジェニック植物は、有毒な物質、成長ホルモン、ウイルス性または細菌性の遺伝産物のいずれも発現せず、またそれゆえ、世界の一部の地域においてこれまで遅れていたトランスジェニック植物の採用についての多くの懸念がなくなる。
【００１６】
一実施形態において、本発明はＧＰＴ導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供しており、ここで、当該ＧＰＴ導入遺伝子は植物プロモーターに対して操作可能に結合される。特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列、ならびに、（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％同一であり、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードする。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は植物のゲノムに取り込まれている。本発明のトランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。
【００１８】
また、本発明は、本発明のトランスジェニック植物の任意の世代の種子を提供しており、ここで、当該子孫はＧＰＴ導入遺伝子を含む。同様に、本発明は、本発明のトランスジェニック植物の任意の世代の種子を提供しており、ここで、上記種子はＧＰＴ導入遺伝子を含む。本発明のトランスジェニック植物は、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較した場合に、１つ以上の増強された成長特性率を示し得る。当該成長特性率としては、増強された成長速度に制限されず、バイオマス収量、種子収量、花または花芽の収量、果実またはさやの収量、大型の葉が挙げられる。また、本発明のトランスジェニック植物は、増大されたＧＰＴ活性のレベルおよび／または増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示し得る。いくつかの実施形態において、本発明のトランスジェニック植物は、向上された窒素利用効率を示す。
【００１９】
また、本発明のトランスジェニック植物およびその種子を生産する方法を提供しており、類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長特性、向上された窒素利用効率、および塩または塩分を含む環境において発芽または成長に対して増大された耐性を有する植物の生産に関する方法を含む。
【００２０】
〔図面の簡単な説明〕
図１．窒素吸収および２−オキソグルタラメート化学合成：概略的な代謝経路。
【００２１】
図２．野生型のタバコ植物に対して、ＧＰＴを過剰発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。左から右に向かって、野生型植物、アルファルファＧＳ１導入遺伝子、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例３参照。
【００２２】
図３．野生型のトマト植物に対してＧＰＴを過剰に発現するトランスジェニックミクロトームトマト植物の比較を示す写真である。（Ａ）野生型植物、（Ｂ）シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子。後述する実施例４を参照。
【００２３】
図４．野生型のタバコ植物（上の葉）とＧＰＴトランスジェニックのタバコ植物（下の葉）との葉の大きさの比較を示す写真である。
【００２４】
〔発明の詳細な説明〕
（定義）
特に規定されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語、注釈、および他の科学専門用語は、本発明に関連する分野の当業者に通常理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味を有する用語が本明細書において定義づけされており、関係を明らかにしたり、および／または整えたりする。また、本明細書においてそのような定義に含まれるものは、当該分野において一般的に理解されるものに対して実質的に差異を表すために必ずしも説明されるべきではない。本明細書において説明されるか、または参照される技術および方法は、従来の理論を用いて当業者に一般的に十分理解され、通常用いられる。当該技術および方法としては、例えば、Sambrookらにおいて広く用いられる分子クローニングの手法などがあり、分子クローニング：A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y、分子生物学における従来のプロトコル（Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001）、トランスジェニック植物：方法およびプロトコル（Leandro Pena, ed., Humana Press, 1st edition, 2004）、およびアグロバクテリウムプロトコル（Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006）が挙げられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む方法は、他に記載されていない限り、工業的に規定されるプロトコルおよび／またはパラメータによって一般的に実施される。
【００２５】
用語「核酸」は、一本鎖か、または二本鎖いずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を指す。特に制限されない限り、用語「ポリヌクレオチド」は天然ヌクレオチドの公知の類似物を含んでいる核酸を包含する。当該類似物は、参照核酸と同様の結合特性を有しており、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される。また、他に指示されない限り、特定の核酸配列は保存的に改変されたそれらのバリアント（例えば、変質コドン置換体）および相補的な配列、ならびに明示的に示された配列を暗に含む。具体的には、変質コドン置換体は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位に生成している配列が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されることによって取得され得る（Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子にコードされるｍＲＡＮと同義的に用いられる。
【００２６】
用語「プロモーター」は、操作可能に結合された核酸の転写を方向づける核酸制御配列のアレイを指す。本明細書において用いられるとき、「植物プロモーター」とは植物の中で機能するプロモーターである。プロモーターは、転写の開始領域（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ因子など）付近の核酸配列を必然的に含む。また、プロモーターは、任意により、末端部のエンハンサー因子またはレセプター因子を含む。当該エンハンサー因子またはレセプター因子は、転写の開始領域からほぼ数千塩基対に配置され得る。「恒常的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下および発生条件下において活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境または発生調節下において活性なプロモーターである。用語「操作可能に結合された」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と、第２の核酸配列との機能的な結合を指す。ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を方向づける。
【００２７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に用いられており、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーの人為的な化学擬態であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成的なアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸とある程度同様に機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたアミノ酸、および後修飾されるアミノ酸である。そのようなアミノ酸としては、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンが挙げられる。アミノ酸類似物とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合するα炭素）を有する化合物を指す。当該アミノ酸類似物としては、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。当該類似物は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸のような同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸とある程度同じように機能する化学物質を指す。
【００２９】
本明細書において、アミノ酸は、一般的に知られる３つの文字記号か、または国際純正応用化学連合−国際生化学連合（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ）生化学命名委員によって推奨されている１つの記号によって表され得る。同様に、ヌクレオチドは一般的に認められている１つの文字コードによって表され得る。
【００３０】
用語「植物」は、植物全体、植物組織（例えば、葉、幹、花、根など）、種子および植物細胞、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に用いられ得る植物の分類は、通常、形質転換技術に影響を受け易い高等植物の分類と同様である。当該高等植物としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）および裸子植物が挙げられる。これらは、多様な倍数性段階（多数体、二倍体、半数体および半接合が挙げられる）の植物を含む。
【００３１】
用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」は本明細書において同義的に用いられており、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することに関連するポリヌクレオチドをコードする遺伝子の全長か、もしくは一部の長さのポリヌクレオチド配列を指す。当該「ＧＰＴポリヌクレオチド」および「ＧＰＴ核酸」としては、翻訳（コーディング）配列および非翻訳配列、ならびにそれらの相補体を共に包含するポリヌクレオチドが挙げられる。用語「ＧＰＴコード配列」は、転写されてＧＰＴタンパク質をコードする遺伝子の一部を指す。用語「ターゲッティング配列」は、タンパク質を細胞の細胞内コンパートメント（例えば、植物細胞内の葉緑体）に方向づけるタンパク質のアミノ末端部を指す。さらに、ＧＰＴポリヌクレオチドは、規定条件下でＧＰＴポリヌクレオチドと、またはＧＰＴポリヌクレオチド由来のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせる能力によって規定される。
【００３２】
「ＧＰＴ導入遺伝子」は、核酸分子をもち、トランスジェニック植物または植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるか、またはＧＰＴポリヌクレオチドをもつトランスジェニック植物の原種植物またはその植物胚、組織もしくは種子に対して外因性であるＧＰＴポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
【００３３】
本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの例は本明細書に示されており、当該ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、シロイヌナズナ、イネ、オオムギ、バンブー、ダイズ、ブドウ、およびゼブラフィッシュのＧＰＴが挙げられる。
【００３４】
部分長ＧＰＴポリヌクレオチドとしては、Ｎ末端またはＣ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするポリヌクレオチド配列、成熟ＧＰＴ（ターゲッティング配列を含まない）をコードするポリヌクレオチド配列、およびＧＰＴのドメインをコードする配列が挙げられる。Ｎ末端がトランケートしたＧＰＴをコードするＧＰＴポリヌクレオチドの例としては、シロイヌナズナの−３０コンストラクト、−４５コンストラクト、および−５６コンストラクトが挙げられる。これらは、配列番号２の全長ＧＰＴ構造のアミノ酸からそれぞれ最初の３０、４５、および５６のアミノ酸が除去されているコード配列である。
【００３５】
形質転換された細胞およびトランスジェニック植物の生産において、本発明のＧＰＴポリヌクレオチドを用いるとき、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はないが、以下にさらに述べるように、由来する本発明のＧＰＴポリヌクレオチドの遺伝子の配列と「実質的に同一」でありさえすればよいことを当業者は理解する。用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」は、厳密に言うと、当該実質的に同一のバリアントを包含する。同様に、当業者は、コドン縮重のために数多くのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし、すべての当該ポリヌクレオチド配列が用語ＧＰＴポリヌクレオチドの中に含まれると意図されることを理解する。さらに、具体的にいうと、当該用語は、本明細書において開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり、野生型ＧＰＴポリペプチドの突然変異によるか、またはＧＰＴポリペプチドの機能（例えば、ＧＰＴポリペプチドにおけるアミノ酸の保存的な置換に起因する）を保持するポリペプチドをコードする配列（後述のように決定される）を含む。よって、用語「ＧＰＴポリヌクレオチド」もまた、当該実質的に同一のバリアントを含む。
【００３６】
用語「保存的に改変されたバリアント」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両者に適用できる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントは同一の、または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または実質的に同一の配列に対してアミノ酸配列をコードしない核酸を指す。遺伝コードの縮退が原因で、数多くの機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべてアミノ酸アラニンをコードする。
【００３７】
このように、コドンによってアラニンが指定されるすべての位置において、当該コドンは、コードされるタンパク質が変更されることなく対応する任意のコドンへ変換され得る。当該核酸バリアントは「サイレントバリアント」であり、保存的に修飾されるバリアントの一種である。また、本明細書においてポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、当該核酸の起こり得るサイレントバリアントすべてを表現する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに関するコドンのみであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに関するコドンのみであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を産生するように修飾され得ることを理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列のサイレントのバリエーションはそれぞれ記載される各配列に関与している。
【００３８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解する。当該置換、欠失または付加では、コードされた配列のうち１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変更、付加または削除しており、「保存的に修飾されたバリアント」において、変更は化学的に類似しているアミノ酸とのアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似しているアミノ酸を示す同類置換表は、本技術分野において公知である。当該保存的に修飾されたバリアントは本発明の多形性バリアント、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、取り除かれない。
【００３９】
以下の８つの群は互いに同類置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。
【００４０】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、組織体の様々な段階の観点から説明され得る。この組織体の一般的な議論に関しては、例えば、 Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) およびCantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)を参照すればよい。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は局所的に配置されたポリペプチド内の３次元構造を指す。これらの構造は、通常ドメインとして知られる。ドメインはポリペプチドの小型の単位を形成するポリペプチドの一部であり、典型的に、２５からおよそ５００のアミノ酸長である。標準的なドメインは、さらに小さなユニットの組織体からなる（例えば、β−シートおよびα−ヘリックスの一帯）。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有の関係によって形成される三次元構造を指す。
【００４１】
用語「単離された」は、野生型か、もしくは天然の状態において見られるような物質と通常同時に生じる成分から、実質的または本質的に遊離した物質を指す。しかしながら、当該用語「単離された」は、電気泳動ゲルか、または別の分離培地に存在する成分を指すことを意図するものではない。単離された成分は、この分離培地から離れて、別の用途に使用する状態にあるか、またはすでに新たな用途／環境において使用されている状態にある。「単離された」抗体は、特定されて自然環境の成分から分離されるか、および／または回収された抗体である。
【００４２】
自然環境の汚染成分は、診断上の抗体の利用、または薬学的な抗体の利用に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性の溶質もしくは非タンパク性の溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）ローリー法で測定したとき、９５％（抗体重量）以上であり、最も好ましくは９９％（重量）以上に精製されるか、（２）回転キャップ配列決定装置によって少なくとも１５残基のＮ末端のアミノ酸配列または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な量に精製されるか、または（３）クマシーブルー、または好ましくは銀染色により還元条件または非還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製される。自然環境の抗体の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体としては、組換え細胞内のインシチュにある抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００４３】
核酸の一部に対して用いられるとき、用語「異種」とは、当該核酸が２つ以上のサブ配列（天然において、互いに同じ関係に見られない）を含むことを示す。例えば、新たな機能的な核酸を作るために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、１つの原料からのタンパク質をコードする核酸、および別の原料からのペプチド配列をコードする核酸）を有している核酸が、典型的に組換えにより作られる。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が、天然において互いに同じ関係に見られない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００４４】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、用語「同一の」または割合の「同一性」とは、比較領域全体を比較して整列させたときか、または配列比較アルゴリズムもしくは手動の配列検査および目視によって測定されるような領域を指定したとき、最大限の一致を考慮して同一か、または同じ（すなわち、特定の領域全体で約７０％の同一性、好ましくは約７５％、約８０％、約８５％、約９０％もしくは約９５％の同一性である）アミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で含む２つ以上の配列またはサブ配列を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。また、この定義は、試験配列が基準配列と実質的に同一であるとき、実質的に配列相補性またはサブ配列相補性を有している試験配列の相補体を指す。
【００４５】
配列同一性の割合がポリペプチドに関して用いられるとき、同一でない残基部分はしばしばアミノ酸の同類置換によって異なるということが理解される。ここで、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基と置き換えられるため、ポリペプチドの機能特性は変化しない。配列が同類置換ではない場合、保存的な天然の置換に関して修正するために、配列同一性の割合が上流に向かって修正され得る。
【００４６】
配列比較に関して、典型的に１つの配列は基準配列として働き、試験配列は当該基準配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および基準配列はコンピュータに入力され、サブ配列座標が指定され、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。初期設定プログラムのパラメータが用いられるか、または代替的なパラメータが指定される。そして、配列比較アルゴリズムは、当該プログラムのパラメータに基づき、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。
【００４７】
本明細書において用いられるとき、「比較領域（comparison window）」は、２つの配列を最適に配列させた後、同数の連続した位置の基準配列と比較され得る配列のうち、２０から６００、通常は約５０から約２００、より通常は約１００から約１５０からなる群から選択される複数の連続した位置の任意の１つのセグメントに関する。比較のための配列の配置方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適な配置は、例えば、Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同配置アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似方法に関する研究によって、これらアルゴリズム（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピュータ制御の実施によって、または手動の位置合わせによって、および目視（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照）によって、実行され得る。
【００４８】
配列同一性および配列類似性の割合の測定に適したアルゴリズムの好ましい例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（それぞれ、Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402および Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている）が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、典型的に本明細書に記載される初期パラメータとともに使用され、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性の割合を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターによって公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリシーケンスにおいて長さＷの短いワードを特定することによって、ハイスコアの配列ペア（high scoring sequence pairs：ＨＳＰｓ）を特定することを含む。ここで、当該クエリシーケンスは、データベースシーケンスにおいて同じ長さのワードとともに配列されたとき、ある正の数の基準スコアＴと一致するか、または満足する。Ｔは、基準点に近いワードとみなされる（上述のAltschul ら）。これら冒頭付近のワードのヒットは、当該ワードを含んでいる長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するための根源として働く。当該ワードのヒットは、累積の配列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列に関して、累積のスコアはパラメータＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）、およびパラメータＮ（一致しない残基に関するペナルティスコア；常に＜０）によって算出される。アミノ酸配列に関して、採点マトリクスが用いられて、累積のスコアを算出する。それぞれの方向におけるワードのヒットの拡張は、累積の配列スコアが数量Ｘによって達成される最大値から低減したときか、累積スコアが１つ以上の負に採点された残基の配列の累積のためにゼロもしくはそれ以下になったときか、またはいずれかの配列の末端が標的に到達したときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ，ＴおよびＸは、配列の検出感度および配列の速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）では、ワード長（Ｗ）１１を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、ワード長３を初期設定値、１０を期待値（Ｅ）、および５０をＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) 配置（Ｂ）、１０を期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較として用いる。
【００４９】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性に関して統計に基づく分析を実行する（例えば、Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つには、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））がある。この最小合計確率は、２つのヌクレオチド配列間か、または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然生じ得ることによる確率の表れを示す。例えば、核酸は、参照核酸との試験核酸の比較において最小合計確率が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、最も好ましくは約０．００１以下である場合に、基準配列と類似しているとみなされる。
【００５０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、典型的に、核酸の複合混合物においてその標的サブ配列へハイブリダイズするが、別の配列にハイブリダイズしないプローブにおける条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な環境において異なる。長い配列は特に高い温度にてハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な指針は、Tijssen（生化学および分子生物学における技術――核酸によるハイブリダイゼーション、「ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイの概論」（１９９３））において見出される。一般的に、高いストリンジェント条件では、特定の配列に関して、規定されたイオン強度のｐＨにおいて融解点（Ｔｍ）以下の約５〜１０℃になるよう選択される。Ｔｍは、５０％のプローブが平衡状態でのターゲットシーケンスに対するターゲットハイブリダイズに相補的な温度である（ターゲットシーケンスが過度に存在し、Ｔｍにおいて５０％のプローブが平衡状態にあるとき）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン以下、典型的には、ｐＨ７．０から８．３において約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関しては温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド以上）に関しては少なくとも約６０℃であることが条件である。また、ストリンジェントな条件は、不安定化試薬（ホルムアミドなど）の付加によって達成され得る。選択的な、または特定のハイブリダイゼーションに関して、ポジティブシグナルは少なくとも２倍のバックグラウンドであり、好ましくは１０倍のバックグラウンドのハイブリダイゼーションである。
【００５１】
ストリンジェントな条件において互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるのであれば、実質的に同一のままである。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容されるコドンの最大量の縮退によって作られるときに、生じる。そのような場合において、核酸は適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において典型的にハイブリダイズする。
【００５２】
ＧＰＴポリペプチドを含んでいるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示されるＧＰＴポリヌクレオチド配列によって、ストリンジェントな条件下での標準的なサザンブロットにおいて同定され得る。この目的に関して、当該ハイブリダイゼーションに最適なストリンジェントな条件としては、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液において、３７℃でのハイブリダイゼーション、および少なくとも約５０℃、通常、約５５℃から約６０℃の温度で２０分間０．２ Ｘ ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄を含む。
【００５３】
２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるというさらなる目安としては、基準配列（一対のオリゴヌクレオチドプライマーによって増幅される）がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件においてプローブとして使用されるとき、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから試験配列を単離することが可能であるか、または、例えばノウザンもしくはサザンブロットで試験配列を同定することが可能であるかである。
【００５４】
（トランスジェニック植物）
本発明は、農学的な性質が十分に向上している新規なトランスジェニック植物を提供する。十分に向上した農学的な性質は、促進された生育、増大した成熟植物の生体重および全現存量、より早期かつより豊富な量の開花、ならびに果実および種子におけるより多くの収量を含む。本発明のトランスジェニック植物は、１つ以上の発現可能な遺伝的コンストラクトを植物に対して導入することにより生成される。この遺伝的コンストラクトは、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（glutamine phenylpyruvate transaminase：ＧＰＴ）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現を促進することができる。本発明は、異種のシロイヌナズナのＧＰＴ遺伝子を保有し、かつ発現するトランスジェニックタバコ植物の生成によって実証されている（後述する実施例２）。また、同じ代謝経路、すなわちシグナル代謝産物２−ヒドロキシ−５−オキソプロリン（2-hydroxy-5-oxoproline）の生合成、において機能するＧＰＴホモログは、全ての植物種に含まれていることが期待される。このように、本発明の実施において、ＧＰＴホモログまたはその機能的な変異体をコードする全ての植物遺伝子が、本発明のトランスジェニック植物の生成に有用であり得る。
【００５５】
本発明における安定な形質転換の実施形態では、発現可能な遺伝的コンストラクトの１つ以上のコピーが宿主植物ゲノム中に組み込まれるようになる。これによって、植物内におけるＧＰＴ酵素能力を増加させる。これは、２−オキソグルタラメート（2-oxoglutaramate）の合成、言い換えればシグナル代謝遺伝子発現、の増加を仲介するのに役立つ。その結果、植物の生育が増大し、かつ他の農学的な性質が向上する。２−オキソグルタラメートは、代謝産物であり、遺伝子発現、代謝および植物生育における極めて強力なエフェクターである（米国特許第６，５５５，５００号）。そして、この代謝産物は、炭素および窒素の代謝システムの調整において極めて重要な役割を果たし得る（Lancien et al., 2000, Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation, Plant Physiol. 123: 817-824）。図１に示す２−オキソグルタラメート経路の概略図も参照されたい。
【００５６】
本発明の一局面において、出願人らは、シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素をコードする核酸分子を同定した（後述する実施例１を参照）。そして、発現された組換え酵素が活性を有し、シグナル代謝産物、２−オキソグルタラメートの合成を促進させ得ることを最初に示した（後述する実施例２）。さらに、出願人らは、このシロイヌナズナのグルタミントランスアミナーゼ遺伝子を、形質転換された異種植物において過剰発現させた結果、ＣＯ２固定の割合を向上させ、かつ生育特性を増加させることを最初に示した（後述する実施例３）。
【００５７】
また、本明細書に記載するように（後述する実施例３を参照）、トランスジェニックタバコ植物において、シロイヌナズナのＧＰＴコード配列の全長を含む導入遺伝子を過剰発現させると、ＣＯ２固定を速め、かつ全タンパク質、グルタミンおよび２−オキソグルタラメートの量を増加させる結果となる。また、これらのトランスジェニック植物は、野生型の植物よりも速く生育する（図２）。同様に、トマト植物に関する予備試験では（後述する実施例４を参照）、シロイヌナズナのＧＰＴ導入遺伝子が形質転換されたトマト植物は、野生型のコントロール植物と比較して、生育速度、開花、および種子収量の顕著な向上を示した（図３および後述する実施例４）。
【００５８】
上述したトランスジェニックタバコ植物に加えて、トマト、コショウ、マメ類、ササゲ、アルファルファ、カンタループ、カボチャ、シロイヌナズナおよびカミレナ（Camilena）の２種において、ＧＰＴを含み、かつ向上された生育特性を示す他の種々のトランスジェニック植物種が生成された（共同所有され、同時係属された出願であり、その内容の全てが本願に引用して援用される、２００９年８月３１日に提出された事件整理番号Ｓ−１１２，９８３を参照）。上述のトランスジェニック植物は、種々の形質転換方法を用いて生成された。種々の形質転換方法は、アグロバクテリウム媒介されたカルス、花の浸漬、種子の播種、さやの播種、および花の直接の接種、これらの組合せ、ならびに種々のＧＰＴ導入遺伝子を用いた、１種類の導入遺伝子を持つ植物における有性の異種交配を介する方法を含む。
【００５９】
本発明はまた、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法を提供する。一実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、コードされたＧＰＴを発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な適切なプロモーターの制御下にある。他の実施形態において、生育および他の農学的性質が向上されたトランスジェニック植物を生成する方法は、ＧＰＴ導入遺伝子をコードする核酸分子を含む１個以上の核酸コンストラクトまたは発現カセットを植物細胞に導入することにより形質転換された植物細胞を生産する工程と、ＧＰＲ導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物を取得する工程とを含む。ＧＰＴ導入遺伝子は、この導入遺伝子の発現を促進することが可能な１個以上の適切なプロモーター（および、任意に、他の制御エレメント）の制御下にある。
【００６０】
多数のＧＰＴポリヌクレオチドが、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。ＧＰＴタンパク質は、種々の植物種の間で高く保存されており、密接に関連している非植物のＧＰＴ（例えばゼブラフィッシュのＧＰＴ）もまた使用され得ることは、本明細書に記載の実験データから明らかである。ＧＰＴに関して、異なる種由来の多数のＧＰＴポリヌクレオチドが活性を有しかつＧＰＴ導入遺伝子として有用であることが示されている。
【００６１】
特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、シロイヌナズナ由来のＧＰＴ（例えば配列番号２、配列番号２１および配列番号３０に示すＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列；配列番号１と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列；ならびにアミノ末端の３０〜５６アミノ酸残基がトランケートされた、配列番号２に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６２】
他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ブドウ由来のＧＰＴ（例えば配列番号９および配列番号３１に示すブドウＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号８に示す塩基配列；配列番号８と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号９もしくは配列番号３１に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６３】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、イネ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１１および配列番号３２に示すイネＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１１もしくは配列番号３２に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６４】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ダイズ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１３、配列番号３３または配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すダイズＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１２に示す塩基配列；配列番号１２と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１３もしくは配列番号３３もしくは配列番号３３のＮ末端にイソロイシンがさらに付加された配列に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６５】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、オオムギ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１５および配列番号３４に示すオオムギＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列；配列番号１０と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１５もしくは配列番号３４に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６６】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、ゼブラフィッシュ由来のＧＰＴ（例えば配列番号１７および配列番号３５に示すゼブラフィッシュＧＰＴｓ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号１６に示す塩基配列；配列番号１６と少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する塩基配列であって、ＧＰＴ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；配列番号１７もしくは配列番号３５に示すポリペプチド、またはこれらと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６７】
さらに他の特定の実施形態において、ＧＰＴ導入遺伝子は、バンブー由来のＧＰＴ（例えば配列番号３６に示すバンブーＧＰＴ）をコードするＧＰＴポリヌクレオチドである。このＧＰＴ導入遺伝子は、配列番号３６に示すポリペプチド、またはこれと少なくとも７５％およびより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するとともにＧＰＴ活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列によってコードされ得る。
【００６８】
本発明の実施におけるＧＰＴ導入遺伝子としての使用に適した他のＧＰＴポリヌクレオチドは、種々の方法により取得され得る。種々の方法とは、当業者によって理解され得るように、組換え発現システム（すなわち、大腸菌（E. coli）（実施例２０〜２３を参照）、植物体における一過性の発現システム（実施例１９を参照）、または遺伝子導入植物における（実施例１〜１８を参照））において、ＧＰＴの発現を導く能力についてＧＰＴ活性を用いて試験する方法である。
【００６９】
（導入遺伝子コンストラクト／発現ベクター）
本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、所望の導入遺伝子に関する遺伝子コード配列は、形質転換された植物細胞内で導入遺伝子配列の発現を導くことができる核酸コンストラクト（本明細書中において、（導入遺伝子）発現ベクター、発現カセット、発現コンストラクトまたは遺伝的コンストラクトとしても交換可能に引用される）中に組み込まれなければならない。所定の導入遺伝子を保有する核酸コンストラクトは、多数の公知の方法を用いて、植物細胞または種々の細胞内に導入され得る。公知の方法は、限定されないが、エレクトロポレーション、ＤＮＡボンバードメントまたは遺伝子銃、マイクロインジェクション、ならびに種々のＤＮＡベースのベクター（例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のベクター）の使用を介する方法を含む。形質転換植物細胞中にいったん導入されると、核酸コンストラクトは、一過的に、あるいは安定的に、組み込まれた導入遺伝子（すなわちＧＰＴ）の発現を導くであろう。安定的に発現させることが好ましく、安定的な発現は、核酸コンストラクトをクロモソームに組み込ませることができる植物の形質転換ベクターを利用することにより達成される。一度植物細胞への形質転換が成功すれば、これを栽培することによりトランスジェニック植物を再生し得る。
【００７０】
形質転換植物における挿入遺伝子の本質的な発現または発現誘導の促進に適した、多数の発現ベクターが知られている。さらに、種々の一過性の発現ベクターおよびシステムが知られている。大体において、遺伝子の形質転換における特定の方法に使用するために、適切な発現ベクターが選択される（以下を参照）。概して、トランスジェニック植物を生成するための典型的な植物発現ベクターは、プロモーターの発現制御コントロール下にある所定の導入遺伝子、形質転換体の選択を助けるための選択マーカー、および転写終結配列を含み得る。
【００７１】
より具体的には、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するための核酸コンストラクトの基本要素は、以下である：形質転換植物細胞において（１つもしくは複数の）導入遺伝子の機能的な発現を促進することができる適切なプロモーター、このプロモーターに実施可能に連結された（１つもしくは複数の）導入遺伝子（すなわちＧＰＴコード配列）、好ましくは、この導入遺伝子に実施可能に連結された適切な転写終結配列（すなわちノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター）、および典型的にこの導入遺伝子の発現を制御するために有用な他の要素、ならびに所望のトランスジェニック産物を選択するために適した１つ以上の選択マーカー遺伝子（すなわち抗生物質耐性遺伝子）。
【００７２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、トランスジェニック植物を生成するために使用する初期の形質転換システムであるため、アグロバクテリウム形質転換用に設計された多数のベクターが存在する。安定な形質転換のため、アグロバクテリウムのシステムは、大腸菌およびアグロバクテリウムの両方で操作可能なプラスミドである「バイナリー」ベクターを利用する。このベクターは、典型的に、形質転換された植物を回収するための１つ以上の選択マーカーを含有する（Hellens et al., 2000, Technical focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5:446-451）。アグロバクテリウム形質転換システムに使用するバイナリーベクターは、典型的に、Ｔ−ＤＮＡのボーダー領域、マルチクローニングサイト、大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスのための複製機能、ならびに選択マーカーおよびレポーター遺伝子を含む。
【００７３】
いわゆる「スーパー−バイナリー」ベクターは、高い形質転換効率を提供し、一般的にＴｉ由来の別の病原性遺伝子を含む（Komari et al., 2006, Methods Mol. Biol. 343: 15-41）。スーパーバイナリーベクターは、一般的に、低い形質転換効率を示す植物（例えば穀類）に用いられる。別の病原性遺伝子は、限定されないが、ｖｉｒＢ，ｖｉｒＥ，およびｖｉｒＧを含む（Vain et al., 2004, The effect of additional virulence genes on transformation efficiency, transgene integration and expression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system. Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul et al., 2000, Additional virulence genes influence transgene expression: transgene copy number, integration pattern and expression. J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park et al., 2000, Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin et al., 1987, Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169: 4417-4425）。
【００７４】
本明細書において実証された実施形態（後述する実施例を参照）では、挿入される導入遺伝子をＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下に配置する発現ベクターが使用される。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを利用する多数の発現ベクターが知られており、および／または市販されている。
【００７５】
（植物プロモーター）
用語「プロモーター」は、ゲノム配列において、遺伝子の転写開始部位（transcription start site：ＴＳＳ）の上流にある領域に対し名づけられた。しかし、ＴＳＳの下流の配列もまた同様に転写開始に影響を与え得る。プロモーター要素は、転写開始点、転写の特異性および割合を選択する。ＴＳＳからの距離に基づいて、用語「近位プロモーター」（ＴＳＳの周りの数百塩基）および「遠位プロモーター」（ＴＳＳの千塩基以上上流）もまた使用される。近位プロモーターおよび遠位プロモーターは、細胞−、組織−、臓器−、発生段階および環境ファクター−特異的な転写制御における複雑なプロセスに関与する種々の要素の組を含む。ＴＳＳの選択を制御する多くのプロモーター要素は、近位プロモーター内に位置する。
【００７６】
植物内で機能する多数のプロモーターが公知である。ＧＰＴ導入遺伝子コンストラクトを構築する際、選択されるプロモーターは、恒常的な非特異的プロモーターであってもよく、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓリボソーマルプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）であってもよい。このプロモーターは、植物内における導入遺伝子の発現のために広く使用されている。他の強力な恒常的プロモーターの具体例は、限定されないが、イネのアクチン１プロモーター、ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター、Ｔｉプラスミドのノパリン合成酵素プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびスクロース合成酵素プロモーターを含む。
【００７７】
あるいは、ある実施形態において、導入遺伝子コンストラクトにより形質転換させたい植物細胞、導入遺伝子の所望の発現量、導入遺伝子を発現させたい組織または細胞内コンパートメント、目標とする発生段階などに基づいてプロモーターを選択することが望ましい。
【００７８】
例えば、光合成組織およびコンパートメントにおいて発現させたいときには、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ（ribulose bisphosphate carboxylase：ＲｕＢｉｓＣｏ）遺伝子のプロモーターが使用され得る。種子で発現させたいときには、種々の貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーターが使用され得る。果実内で発現させるためには、果実特異的なプロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）が使用され得る。他の組織特異的プロモーターの具体例は、レクチンをコードするプロモーター（Vodkin et al., 1983, Cell 34:1023-31; Lindstrom et al., 1990, Developmental Genetics 11:160-167）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１（Vogel et al, 1989, J. Cell. Biochem. (Suppl. 0) 13:Part D; Dennis et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12(9): 3983-4000）、トウモロコシの集光性複合体（Simpson, 1986, Science, 233: 34-38; Bansal et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654-3658）、トウモロコシの熱ショックタンパク質（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812; Rochester et al., 1986, EMBO J., 5: 451-458）、エンドウマメのスモールサブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Poulsen et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205(2): 193-200; Cashmore et al., 1983, Gen. Eng. Plants, Plenum Press, New York, pp 29-38）、Ｔｉプラスミドのマンノピン合成酵素およびＴｉプラスミドのノパリン合成酵素（Langridge et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3219-3223）、ペチュニアのカルコンイソメラーゼ（Van Tunen et al., 1988, EMBO J. 7(5): 1257-1263）、マメのグリシンリッチタンパク質１（Keller et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1309-1314）、トランケートされたＣａＭＶ ３５ｓ（Odell et al., 1985, supra）、ポテトのパタチン（Wenzler et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 41-50）、根細胞（Conkling et al., 1990, Plant Physiol. 93: 1203-1211）、トウモロコシのゼイン（Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426; Kriz et al., 1987, Mol. Gen. Genet. 207(1): 90-98; Wandelt and Feix, 1989, Nuc. Acids Res. 17(6): 2354; Langridge and Feix, 1983, Cell 34: 1015-1022; Reina et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(21): 6426）、グロブリン−１（Belanger and Kriz, 1991, Genetics 129: 863-872）、α−チューブリン（Carpenter et al., 1992, Plant Cell 4(5): 557-571; Uribe et al., 1998, Plant Mol. Biol. 37(6): 1069-1078）、ｃａｂ（Sullivan, et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(3): 431-440）、ＰＥＰＣａｓｅ（Hudspeth and Grula, 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589）、Ｒ遺伝子複合体（Chandler et al., 1989, The Plant Cell 1: 1175-1183）、カルコン合成酵素（Franken et al., 1991, EMBO J. 10(9): 2605-2612）およびグルタミン合成酵素プロモーター（U.S. Pat. No. 5,391,725; Edwards et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463; Brears et al., 1991, Plant J. 1(2): 235-244）を含む。
【００７９】
恒常的プロモーターに加えて、トランスジェニック植物が再生し、成熟し、開花するなどに従って導入遺伝子の発現を制御したい場合には、種々の誘導性プロモーター配列が使用され得る。このような誘導性プロモーターの具体例は、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（すなわち、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；例えばBevan et al., 1989, EMBO J. 8(7): 899-906を参照）、創傷応答遺伝子（すなわち、細胞壁タンパク質の遺伝子）、化学的誘導性遺伝子（すなわち、硝酸還元酵素、キチナーゼ）および暗誘導性遺伝子（すなわち、アスパラギン合成酵素；例えば、米国特許第５，２５６，５５８号を参照）のプロモーターを含む。また、主要なクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ｃａｂ）をコードする遺伝子ファミリー、およびリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ（ｒｂｃＳ）のスモールサブユニットをコードする遺伝子ファミリーを含む多くの植物の核内遺伝子は、光によって活性化される（例えば、Tobin and Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439.を参照）。
【００８０】
他の誘導性プロモーターは、ＡＢＡ誘導性プロモーターおよび膨圧誘導性プロモーター、オーキシン結合タンパク質遺伝子プロモーター（Schwob et al., 1993, Plant J. 4(3): 423-432）、ＵＤＰグルコース フラボノイド グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ralston et al., 1988, Genetics 119(1): 185-197）；ＭＰＩプロテイナーゼインヒビタープロモーター（Cordero et al., 1994, Plant J. 6(2): 141-150）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29(6): 1293-1298; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol. 29(5): 412-421; Martinez et al.,1989, J. Mol. Biol. 208(4): 551-565）、およびエンドウマメ由来の光誘導性プラスチド グルタミン合成酵素遺伝子（米国特許第５，３９１，７２５号；Edwards et al., 1990, supra）を含む。
【００８１】
トランスジェニック植物技術において使用される植物プロモーターのレビューについては、Potenza et al., 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol - Plant, 40(1): 1-22を参照されたい。植物の合成プロモーター工学のレビューについては、例えば、Venter, M., 2007, Trends Plant Sci., 12(3): 118-124を参照されたい。
【００８２】
（グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）導入遺伝子）
本発明は、シグナル代謝産物である２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの合成に直接的に機能する、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）酵素を含む植物を最初に開示する。これまで、機能が明らかになった植物のトランスアミナーゼは全く記載されていない。出願人は、いくつかの植物種および動物種由来のＧＰＴポリヌクレオチドコード配列を同定し、試験した。そして、この遺伝子を宿主植物に組み込み、生育がより速く、葉のタンパク質量が向上され、そしてＣＯ２固定速度がより速い、生育特性が顕著に向上されている異種性のトランスジェニック植物とすることに成功した。
【００８３】
シグナル代謝産物２−ヒドロキシ−５−オキソプロリンの生合成を包含する同様の代謝経路で機能するＧＰＴは、全ての植物種に含まれていることが期待される。したがって、本発明の実施において、ＧＰＴホモログまたはその機能的な変異体をコードするあらゆる植物の遺伝子は、本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために有用であり得る。さらに、種々の植物ＧＰＴタンパク質構造と、ゼブラフィッシュ（Danio rerio（Zebra fish））由来の推定上の（および生物学的に活性な）ＧＰＴホモログとの間の構造的な同一性、を考慮すれば（実施例２２を参照）、他の非植物ＧＰＴホモログは、本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用するためのＧＰＴ導入遺伝子の調製に使用され得る。配列番号３０に示すシロイヌナズナの成熟タンパク質配列と（ＢＬＡＳＴアラインメントにより）個々に比較された際、以下の成熟ＧＰＴタンパク質配列について、以下の配列同一性および相同性（ＢＬＡＳＴ「陽性」、類似アミノ酸を含む）が得られた。
【００８４】
【表１】
【００８５】
ＧＰＴタンパク質構造では多くの植物種を超えて特徴が保存されていることを強調するように、この保存は、上述した植物種内だけでなく、ゼブラフィッシュおよびクラミドモナス由来の推定上の非ヒトＧＰＴｓにまで及んで見られる。ゼブラフィッシュの場合、同一性の範囲は非常に高い（配列番号３０で示すシロイヌナズナの成熟ＧＰＴとアミノ酸配列で８３％の同一性、かつ類似アミノ酸残基を計算に加えれば９２％の相同性）。ゼブラフィッシュの成熟ＧＰＴは、大腸菌においてこれを発現させ、かつ生物学的活性（２−オキソグルタラメート合成）を証明することにより確認された。
【００８６】
推定上のＧＰＴホモログが、本発明における生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために適しているかどうかを調べるために、まずそのコード配列を大腸菌あるいは他の適した宿主内で発現させ、そして合成される２−オキソグルタラメートシグナル代謝産物の量が増加するかどうかを調べる必要がある（実施例１９〜２３を参照）。このような増加が示される場合には、次にそのコード配列を、同種の植物宿主および異種の植物宿主の両方に導入させた後に生育特性を評価してもよい。この目的のために、２−オキソグルタラメートを特異的に検出することができるあらゆるアッセイを使用することができる。あらゆるアッセイは、限定されないが、後述する実施例２に記載のＮＭＲおよびＨＰＬＣアッセイを含む。また、成熟ＧＰＴ活性を直接測定するためのアッセイを用いてもよい。
【００８７】
本発明に係るトランスジェニック植物を生成するために、２−オキソグルタラメート合成活性を有するあらゆる植物ＧＰＴが、植物細胞を形質転換するために使用され得る。植物種間における構造的な相同性のレベルは高いと考えられ、種々の植物ＧＰＴタンパク質と、ゼブラフィッシュの推定上のＧＰＴホモログとの間の密接な相同性によって証明されるように、この高いレベルは、植物を超えて及ぶと考えられる。したがって、種々の植物ＧＰＴ遺伝子が、種々の異種の植物種において生育が向上されたトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。さらに、同種植物においてＧＰＴ導入遺伝子を発現させた場合には、異種細胞においては起こりえないであろう何らかの方法で、同種細胞内の制御が、導入遺伝子の発現を減じ得る可能性もある。しかし、たいていは生育特性が所望に向上される結果になることが期待されるであろう（すなわち、イネのグルタミントランスアミナーゼを、トランスジェニックイネ植物内で過剰発現させる）。
【００８８】
（転写終結）
好ましい実施形態において、転写終結を導き、ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を正常にさせるために、３’転写終結配列が導入遺伝子の下流に組み込まれる。好適な転写終結因子は、植物において機能することが知られている転写終結因子であり、限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素（nopaline synthase：ＮＯＳ）およびオクトピン合成酵素（octopine synthase：ＯＣＳ）遺伝子、オクトピン合成酵素遺伝子由来のＴ７転写産物、ジャガイモまたはトマト由来のプロテアーゼインヒビターＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーターおよびエンドウマメのｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターを含む。さらに、天然の遺伝子における転写終結因子が使用され得る。ある実施形態では、実施例として後述するが、ノパリン合成酵素の転写終結因子が使用される。
【００８９】
（選択マーカー）
選択マーカーは、形質転換体を選抜する手段を可能にするために、導入遺伝子の発現ベクターに通常含まれる。種々のタイプのマーカーが使用可能であるが、種々のネガティブセレクションマーカーが通常利用される。ネガティブセレクションマーカーは、形質転換されていない細胞を阻害し、または殺す選択剤に対する耐性を付与するマーカーを含み、例えば、抗生物質（例えばカナマイシン、ゲンタマイシン、アナマイシン（anamycin）、ハイグロマイシンおよびハイグロマイシンＢ）に対する耐性、または除草剤（例えばスルホニル尿素、グルホシネート（gulfosinate）、ホスフィノトリシンおよびグリフォセート）に対する耐性を付与する遺伝子を含む。スクリーニング可能なマーカーは、例えば、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ow et al., 1986, Science 234: 856-859）およびアントシアニン色素の生産もしくは制御に関わるタンパク質をコードする種々の遺伝子（例えば米国特許第６，５７３，４３２号を参照）を含む。大腸菌のグルクロニダーゼ遺伝子（ｇｕｓ，ｇｕｓＡまたはｕｉｄＡ）は、植物の遺伝子導入において広く使用されてきた選択マーカーである。この大きな理由は、グルクロニダーゼ酵素の安定性、高い感受性および検出の容易性（例えば、蛍光定量的方法、分光光度的方法、種々の組織化学的方法）にある。さらに、最も高等な植物種には、検出可能なグルクロニダーゼが基本的に存在しない。
【００９０】
（形質転換の手法およびシステム）
本発明における導入遺伝子の発現ベクターコンストラクトを、植物または植物細胞に導入するための種々の方法は、当業者によく知られており、あらゆる形質転換可能な植物または植物細胞が標的として利用され得る。
【００９１】
アグロバクテリウムによって媒介される形質転換は、おそらく植物の遺伝子導入に利用される最も一般的な方法である。そして、アグロバクテリウムに媒介される、多数の植物における形質転換プロトコルは、広く文献に記載されている（例えば、Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2nd edition, 2006を参照）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、腫瘤を誘導するＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」、「トランスファーＤＮＡ」）の小断片の植物細胞への挿入を介して、非常に多数の双子葉植物種において腫瘤（クラウンゴール疾患）を引き起こすグラム陰性土壌細菌である。Ｔ−ＤＮＡは、植物ゲノム中の半ランダムな位置に組み込まれ、そして最終的にそこに安定的に組み込まれ得る。Ｔ−ＤＮＡボーダーとよばれる直接繰り返しＤＮＡ配列が、Ｔ−ＤＮＡの左端および右端を規定している。Ｔ−ＤＮＡは、「バイナリーベクター」システムを作り出すために、Ｔｉプラスミドの残りの部分から物理的に分離されることができる。
【００９２】
アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物、単子葉植物、およびこれらの細胞を安定的に形質転換するために使用され得る（Rogers et al., 1986, Methods Enzymol., 118: 627-641; Hernalsteen et al., 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426-434）。アグロバクテリアにＤＮＡを導入する種々の方法が知られており、エレクトロポレーション、凍結融解法、および三親接合（triparental mating）を含む。外部ＤＮＡをアグロバクテリウム内に配置する最も効率的な方法は、エレクトロポレーションを介する方法である（Wise et al., 2006, Three Methods for the Introduction of Foreign DNA into Agrobacterium, Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 43-53）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの大部分は組み込まれないことを考慮すれば、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換を使用することにより、組み込まれていない導入遺伝子コンストラクト分子の転写能力を介した導入遺伝子の一過的な発現を得ることができる（Helens et al., 2005, Plant Methods 1:13）。
【００９３】
多数のアグロバクテリウム形質転換ベクターおよび方法が記載されてきた（Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7(5): 193-5）。そして、これらの多くのベクターは商業的に手に入れることができる（例えばインビトロジェン）。さらに、より多くの「オープンソース」のアグロバクテリウム形質転換ベクターが使用可能である（例えばｐＣａｍｂｉａベクター；Ｃａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。また、本明細書中に上述した「導入遺伝子コンストラクト」の項を参照されたい。さらに実施例に記載した特定の実施形態において、生育が向上したタバコおよびトマトのトランスジェニック植物を生成するために、Ｈｏｒｓｃｈらのリーフディスク形質転換システム（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）において、ｐＭＯＮ３１６由来のベクターが使用された。
【００９４】
本発明に係るトランスジェニック植物の生成に使用され得る、他に一般に使用される形質転換法は、限定されないが、微粒子銃（microprojectile bombardmentもしくはbiolistic）形質転換法、カルシウムによるネイキッドＤＮＡのプロトプラスト形質転換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション（Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; Shimamoto et al., 1989, Nature, 338: 274-276）を含む。
【００９５】
微粒子銃形質転換は、ＤＮＡによってコートされた数百万個の金属粒子を、微粒子銃装置（もしくは「遺伝子銃」）を用いて標的の細胞または組織に注入する。様々な種類の微粒子銃が商業的に入手可能である。いったん細胞中に入れば、ＤＮＡが粒子から溶出され、一部が安定的に細胞の１つ以上のクロモソーム中に組み込まれ得る（レビューのために、Kikkert et al., 2005, Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJを参照）。
【００９６】
エレクトロポレーションは、短い、高強度の電場を利用して、細胞膜の脂質二重層を可逆的に透過可能にする技術である（例えば、Fisk and Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, in: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Pena, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 79-90; Fromm et al.,1987, Electroporation of DNA and RNA into plant protoplasts, in Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press, London, UK, pp. 351-366; Joersbo and Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays, in Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, London, UK, pp. 92-99を参照）。この技術は、細菌の膜に水溶性の細孔を作り出すことにより行なう。細孔は、ＤＮＡ分子（および他の高分子）が細胞に入るのに充分な大きさのサイズである。そして、導入遺伝子発現コンストラクト（Ｔ−ＤＮＡ等）は、植物ゲノムＤＮＡ中に安定的に組み込まれることができ、形質転換細胞の生成が導かれ、その後に形質転換細胞はトランスジェニック植物に再生され得る。
【００９７】
より新しい形質転換法は、いわゆる「フローラルディップ（floral dip）」法を含む。フローラルディップ法は、他の一般に使用される全ての形質転換方法のように植物組織培養が要求されず、単純性が期待される（Bent et al., 2006, Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method, Methods Mol Biol, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 87-103; Clough and Bent, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743）。しかしながら、シロイヌナズナを除いて、これらの方法は、広範囲の種類の植物種にわたって広く使用されていない。簡単にいえば、フローラルディップによる形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの適切な菌株を用いて、開花している植物を浸漬し、もしくは開花している植物に噴霧することにより成し遂げられる。その後、３つのＴ０植物から回収した種子を発芽させ、トランスジェニックＴ１個体を同定して選択した。実施例１６は、花の浸漬によりシロイヌナズナを接種し、トランスジェニックシロイヌナズナ植物を生成したことを示す。
【００９８】
他の形質転換法は、アグロバクテリウムベクター等を用いて、生育中の植物の種子または苗を形質転換させる方法を含む。例えば、このようなベクターは、ベクター（すなわちアグロバクテリア）の懸濁液または混合物を、生育中の種子のさやにおける空洞中に直接的に注入することによって、生育中の種子を形質転換するために使用し得る（Wang and Waterhouse, 1997, Plant Mol. Biol. Reporter 15: 209-215）。苗は、Yasseem, 2009, Plant Mol. Biol. Reporter 27: 20-28に記載のように形質転換され得る。発芽した種子は、Chee et al., 1989, Plant Pysiol. 91: 1212-1218に記載のように形質転換され得る。ベクターが果実または生育中の果実内に注入される果実内部法もまた使用し得る。他の形質転換法は、花器官をベクター接種のための標的とする方法、例えば花接種法などをも含む。
【００９９】
上述した植物形質転換法は、導入遺伝子を多くの種類の植物細胞および組織に導入するために使用され得る。植物細胞および組織は、限定されないが、植物全体、葉緑体を含む組織および器官の移植片、葉緑体を含む組織および器官の移植片、開花組織および細胞、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、小胞子などの未成熟の胚および配偶子細胞、花粉、精子および卵細胞、上述した組織の培養細胞、再生された繁殖性のトランスジェニック植物が生成され得る他のあらゆる細胞を含む。カルスは、組織源から生じる。組織源は、限定されないが、未成熟の胚、苗の頂端分裂組織、小胞子などを含む。カルスとして増殖可能な細胞もまた、遺伝的形質転換を受ける細胞である。
【０１００】
形質転換された植物細胞、組織および器官から個々の植物を再生する方法は、多くの植物種について知られており、かつ記載されている。
【０１０１】
例として、形質転換された小植物（形質転換細胞または組織由来）を、形質転換法に使用する選択剤（つまり、およびカナマイシンなどの抗生物質）が添加された植え付け可能な生育培地において培養する。この形質転換された小植物を、根を下ろした後に土壌に移し、十分に成長させる。開花した後、成熟植物に好ましくは自家受粉させる。そして、その結果生じた種子を回収し、次の世代を生育させるために使用する。実施例３〜６は、トランスジェニックタバコ植物およびトランスジェニックトマト植物の再生について記載する。
【０１０２】
Ｔ０トランスジェニック植物は、第１の形質転換体もしくは第２の形質転換体の自家受粉によって、または他の植物（形質転換植物もしくは非形質転換植物）の第１もしくは第２の形質転換体の雌雄交雑によって、次の世代（例えば、Ｔ１、Ｔ２など）を生成するために使用され得る。
【０１０３】
（生育が向上されたトランスジェニック植物の選抜）
トランスジェニック植物は、標準的な方法を用いて選抜され、スクリーニングされ、そして同定され得る。本発明の好ましいトランスジェニック植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を示す１つ以上の表現型の特徴を提示し得る。トランスジェニック植物は、通常、形質転換体を選抜するために、選択圧下で再生され、その後にトランスジェニック植物生成が行なわれる。さらに、使用される選択圧は、所望の導入遺伝子発現コンストラクトまたはカセットの存在を確認するために、Ｔ０世代を超えて使用され得る。
【０１０４】
Ｔ０形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換に用いる導入遺伝子発現コンストラクトに含まれるマーカー遺伝子の遺伝的組成物、および／またはマーカー遺伝子によりコードされる表現型の特徴を選抜し、またはスクリーニングすることにより、同定され、かつ単離され得る。例えば、遺伝的コンストラクトによって耐性を付与することができる抗生物質または除草剤の抑圧的な量を含む生育培地において、形質転換されている可能性のある植物、組織または細胞を生育させることによって、選抜が行なわれ得る。さらに、形質転換された植物細胞、組織および植物は、導入遺伝子発現コンストラクト内に存在し得るマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ等）の活性をスクリーニングすることによっても同定され得る。
【０１０５】
周知のとおり、所望の導入遺伝子発現コンストラクトを含む植物を同定するために、種々の物理的方法および生化学的方法が使用され得る。これらの方法の具体例は、例えば以下を含む：導入遺伝子、導入遺伝子発現コンストラクトまたはその要素を同定するためのサザンブロット解析または種々の核酸増幅法（いわゆるＰＣＲ）；ＲＮＡ転写産物を検出しかつ決定するためのノザンブロッティング、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅法；導入遺伝子によってコードされかつ発現されるタンパク質を同定するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、酵素免疫測定。
【０１０６】
他の手段では、形質転換体を同定するために、標的植物における導入遺伝子の発現により改変されることが知られている遺伝子、タンパク質および／または代謝化合物の発現量が使用され得る。本発明に係る一実施形態において、シグナル代謝産物２−オキソグルタラメートの量の増加は、所望の形質転換体をスクリーニングするために使用され得る。
【０１０７】
最後に、本発明の形質転換植物は、向上された生育および／または他の所望の農学的性質を用いてスクリーニングされ得る。実際、特にその後の自家受粉、異種交配および戻し交配による植物を同定する際には、最も速い生育速度、最も高い種子の収量などを有する形質転換ラインを同定するために、ある一定の表現型のスクリーニングが通常望ましい。この目的のために、種々のパラメータが使用できる。パラメータは、限定されないが、生育速度、全生体重、乾燥重量、種子および果実の収量（数、重量）、種子および／または種子のさやのサイズ、種子のさやの収量（例えば数、重量）、葉のサイズ、植物のサイズ、開花の向上、開花の時期、全体のタンパク質量（種子、果実、植物組織内）、特定のタンパク質量（すなわちＧＳ）、窒素量、遊離アミノ酸、および特定の代謝化合物量（すなわち２−オキソグルタラメート）を含む。一般的に、これらの表現型の測定値は、親と同一もしくは類似の植物ライン、形質転換されていない植物と同一もしくは類似の植物、または野生型植物と同一もしくは類似の植物（すなわち、標準の植物もしくは親植物）から得られた測定値と比較される。好ましくは、そして少なくとも最初に、標的トランスジェニック植物における選択された表現型の特徴の測定は、標準の植物もしくは親植物における同じ特徴の測定と並行に行なわれる。通常、特定の表現型の特徴について、トランスジェニック植物における表現型の好ましさおよび／または優位性を確立するために、複数の植物が使用される。
【０１０８】
好ましくは、最初の形質転換体は、導入遺伝子の遺伝子型が先祖の形質を維持する（すなわち、植物が、導入遺伝子について同型となる）まで、選択された後にＴ１およびこれに続く世代を自家受粉により生成するために使用される。実際には、これは、３または４世代について自家受粉させ、各世代において所望の形質についてスクリーニングし、そしてそれら個々を自家受粉させることにより成し遂げられる。
【０１０９】
安定なトランスジェニックラインは、いくつもの所望の形質を有する変種を作り出すために交雑され、かつ戻し交配されてもよい。変種は、積み重ねられた導入遺伝子を有する変種、導入遺伝子のマルチコピーを有する変種などを含む。さらに、安定なトランスジェニック植物は、これらの植物に導入遺伝子もしくは親の導入遺伝子のさらなるコピーをさらに形質転換することによって、遺伝的にさらに改変されてもよい。また、所定の導入遺伝子もしくは複数の導入遺伝子のマルチコピーを導入する形質転換を１回行なうことによって、トランスジェニック植物を作り出すことが検討される。種々の一般的な育種方法は、当業者によく知られている（例えばBreeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)を参照）。
【０１１０】
〔実施例〕
本発明の様々な態様を、いくつかの実施例によりさらに記載および説明するが、いずれも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
＜実施例１：シロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）遺伝子の単離＞
シグナル代謝産物である２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与する植物酵素を見出す試みとして、出願人らは、推定される植物酵素が、２−オキソグルタラメートの合成に関与していると特徴づけられているヒトのタンパク質と、ある程度の構造上の関連性を有しているであろうとの仮説を立てた。ヒトのパンパク質であるグルタミントランスアミナーゼＫ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６４）（文献では、システイン共役β―リアーゼ、キヌレニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、等ともいわれている）は、ハロゲン化した生体異物のシステイン共役の処理に関与していることがわかっている（Perry et al., 1995, FEBS Letters 360:277-280）。ヒトのシステイン共役β―リアーゼは、窒素代謝に関与する活性を有するよりも、むしろヒトおよび動物において解毒活性を有する（参照）。とはいえ、２−オキソグルタラメートの合成におけるこのタンパク質の潜在的な関与は重要であった。
【０１１２】
ヒトのシステイン共役β―リアーゼのタンパク質配列を用いて、ＴＩＧＲシロイヌナズナ植物のタンパク質配列のデータベースを検索して、関連する可能性がある１つの配列、すなわち、シロイヌナズナの遺伝子のＡｔ１ｑ７７６７０に位置する部分的な配列によりコードされるポリペプチドを同定した。このポリペプチドは、アライメントした領域で約３６％の配列相同性を共有する。
【０１１３】
全長の遺伝子コーディング領域は、下記のプライマーによりシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
【０１１４】
5’- CCCATCGATGTACC TGGACATAAATGGTGTGATG-3’
5’- GATGGTACCTCAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC-3’
これらのプライマーは、後述のトランスジェニック植物を作成するための発現ベクターでのサブクローニングを促進するため、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）およびＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）の制限酵素部位を含むように設計した。ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて、次の条件により高性能のＰＣＲを行なった：まず９４Ｃで４分間変性し、９４Ｃで３０秒間の変性、５５Ｃで３０秒間のアニーリング、および７２Ｃで９０秒の伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２Ｃで７分間伸長反応させる。増幅産物はＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法で単離して、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus：ＣａＭＶ）３５Ｓの構成的プロモーターおよびノパリンシンターゼ（nopaline synthase：ＮＯＳ）３’ターミネーターを含むベクターｐＭｏｎ３１６（Rogers, et. al. 1987 Methods in Enzymology 153:253-277）にライゲーションした。ライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、挿入されたことを確認するために形質転換体の配列を決定した。
【０１１５】
１．３ｋｂのｃＤＮＡを単離して配列を決定したところ、推定される葉緑体のシグナル配列を含む、長さ４４０アミノ酸の全長タンパク質をコードすることを見出した。
【０１１６】
＜実施例２：生物学的に活性なシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼの産生＞
上述の実施例１に記載したように、単離したｃＤＮＡによりコードされたタンパク質が、２−オキソグルタラメートの合成を触媒することが可能か否かを調べるため、当該ｃＤＮＡを大腸菌で発現させて、２−オキソグルタラメートの合成能を標準的な方法で検定した。
【０１１７】
（２−オキソグルタラメートのＮＭＲアッセイ）
簡潔にいえば、精製したタンパク質の産物を、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００ｍＭ グルタミン、１００ｍＭ グリオキシル酸および２００マイクロＭ ピリドキサル５’−リン酸を含む反応液に加えた。試験するタンパク質を加えていない反応液をコントロールとして用いた。試験反応液およびコントロール反応液を３７℃で２０時間インキュベートし、遠心分離によって浄化して沈殿物を取り除いた。化学的に合成した標準の２−オキソグルタラメートを参照として、１３ＣＮＭＲを用いて、２−オキソグルタラメートの存在と量を分析するために上清を試験した。反応産物は２−オキソグルタラメートおよびグリシンであり、一方、基質（グルタミンおよびグリオキシル酸）は存在比が減少した。サイクリック２−オキソグルタラメートは、オープンチェーンのグルタミン前駆体から容易に区別できる、まったく異なるシグナルを生じさせた。
【０１１８】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
ＧＰＴ活性に関する代替的なアッセイは、Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いて２−オキソグルタラメート産物を測定した。簡潔にいえば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ＦＡＤ、１０ｍＭ システインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む、変性抽出バッファーを用いた。検査物質からの組織サンプル（すなわち、植物組織）を約１／３の比率（ｗ／ｖ）で抽出バッファーに加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡによって停止させた。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、その上清を用いてＨＰＬＣ（０．０１Ｎ ｈ２ＳＯ４の移動相、約０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速、４０℃、でのＩＯＮ−３００ ７．８ｍｍ ＩＤ Ｘ ３０ｃｍ Ｌ ｃｏｌｕｍｎを用いる）によって２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なう。
【０１１９】
（ＮＭＲアッセイの結果）
本実験は、試験タンパク質が２−オキソグルタラメートの合成を触媒することができるということを証明した。ゆえに、これらのデータは、単離したｃＤＮＡが、植物において２−オキソグルタラメートの合成に直接的に関与するグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼをコードするということを示す。よって、試験タンパク質はシロイヌナズナのグルタミンフェニルピルビン酸トランスアミナーゼ、すなわちＧＰＴといえる。
【０１２０】
シロイヌナズナＧＰＴのコード配列のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＧＰＴパンパク質の翻訳されたアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【０１２１】
＜実施例３：シロイヌナズナのＧＰＴを過剰発現するトランスジェニックタバコ植物の作成＞
（植物の発現ベクターｐＭＯＮ−ＰＪＵの生成）
簡潔に、植物の発現ベクターｐＭｏｎ３１６−ＰＪＵを以下のように作製した。単離したシロイヌナズナのＧＰＴをコードするｃＤＮＡ（実験例１）をｐＭｏｎ３１６ベクターのＣｌａＩ−ＫｐｎＩポリリンカー部位に入れて、クローニングした。これにより、ＧＰＴ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）転写ターミネーターの制御下におかれる。選択マーカーを提供するためにカナマイシン耐性遺伝子を加えた。
【０１２２】
（アグロバクテリウムを介した植物の形質転換）
ｐＭＯＮ−ＰＪＵおよびコントロールベクターｐＭｏｎ３１６（挿入したＤＮＡなし）は標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス株のｐＴｉＴＴ３７ＡＳＥに形質転換し、続いて抗生物質スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーをＰＣＲによって試験し、プラスミドを含むことを確認した。
【０１２３】
ニコチアナ・タバカムｃｖクサンチ（Nicotiana tabacum cv Xanthi）植物を、Horschらのリーフディスク形質転換法（Horsch et al.,1995, Science 227:1229-1231）を用いて、アグロバクテリウムを形質転換したｐＭＯＮ−ＰＪＵにより形質転換させた。つまり、無菌のリーフディスクに接種し、２日間培養して、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５００μｇ／ｍｌのクラファラン（clafaran）を含んでいる選択ＭＳ培地に移植した。選択培地中で根を形成する能力により形質転換体を確認した。
【０１２４】
（ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物の生成）
無菌の葉の切片を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ（Ｍ＆Ｓ）培地上でカルスに発達させ、そこから形質転換小植物体が出現した。。そして、これらの小植物体を発根可能な選択培地（選択試薬としてカナマイシンを含むＭ＆Ｓ培地）に移植した。その後、正常で、発根した、形質転換したタバコの小植物体を土壌に移植し、成熟期まで生育させて、花が咲いた植物を自家受精させて、得られた種子を収穫した。成長期の間、植物の成長表現型を調べ、多くの若いトランスジェニック植物でＣＯ２固定速度を測定した。
【０１２５】
（Ｔ１およびＴ２世代のＧＰＴトランスジェニック植物の生成）
トランスジェニックタバコ植物のＴ０世代から収穫した種子を、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＭ＆Ｓ培地で発芽させて、導入遺伝子の質を高めた。種子のうち少なくとも１／４がこの培地で発芽せず（カナマイシンは、通常の遺伝子分離の結果もたらされ得る、耐性のない種子の発芽を阻害すると期待される）、残りの種子のうち半分以上がカナマイシンに対して感受性（ごく弱い）を示したため取り去られた。
【０１２６】
生き残った植物（Ｔ１世代）を成長させ、これらの植物をＴ２世代の種子を生産するために自家受精させた。Ｔ１世代からの種子は、形質転換体の系統のためにカナマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）が追加されたＭＳ培地で発芽させた。１４日後、種子を砂地に移し、２５ｍＭの硝酸カリウムが追加された４分の１の濃度のホーグランド栄養液を与えた。これを９００マイクロモル／ｍ２／秒の光の強さで１６時間の明期および８時間の暗期という光周期にして、２４℃で成長させた。それらを砂地培養に移植した１４日後に収穫した。
【０１２７】
（ＧＰＴトランスジェニック植物のキャラクタリゼーション）
収穫されたトランスジェニック植物（ＧＰＴ形質転換体およびベクターコントロール形質転換体の両方）を根および葉のグルタミンシンセターゼ活性、乾燥させていない植物の総量、根および葉の総タンパク質ならびにＣＯ２固定速度（Knight et al., 1988, Plant Physiol. 88: 333）を分析した。形質転換していない野生型Ａ．ツメファシエンス植物もベースラインコントロールを設けるため、同じパラメータで分析した。
【０１２８】
生育特性の結果は、下記の表１に示す。さらに、野生型のコントロール植物と比較したＧＰＴトランスジェニック植物の写真を図２に示す（ＧＳ１トランスジェニックタバコ植物と一緒に示す）。評価した全パラメータにわたって、ＧＰＴトランスジェニックタバコ植物は促進された生育特性を示す。特に、ＧＰＴトランスジェニック植物は、野生型のコントロール植物と比較して、ＣＯ２固定速度において５０％増を示し、葉の組織におけるグルタミンシンセターゼ活性は２倍を示した。さらに、葉と根とのＧＳ比は、トランスアミナーゼのトランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較してほぼ３倍に増加した。生体重および全タンパク質量も、トランスジェニック植物では野生型のコントロールと比較して、それぞれ約５０％および８０％（葉）増加した。これらのデータは、シロイヌナズナＧＰＴ導入遺伝子が過剰発現したタバコ植物が、有意に促進された成長とＣＯ２固定速度を獲得することを実証する。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
データ＝３個体の平均値である。
【０１３１】
野生型−コントロール植物；再生または形質転換されていない。
【０１３２】
ＰＮ１系統は導入遺伝子を有していないコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。
【０１３３】
再生および形質転換の処理に対するコントロール。ＰＮ９系統はシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を有するコンストラクトで形質転換した後、再生により生成した。
【０１３４】
＜実施例４：シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト植物の生成＞
シロイヌナズナＧＰＴ遺伝子を持つトランスジェニックトマト（Lycopersicon esculentum）（マイクロトムトマト）植物を、実施例３で記載したベクターおよび方法を用いて作成した。Ｔ０トランスジェニックトマト植物を作成し、成熟期まで生育させた。トランスジェニックトマト植物の初期生育特性のデータを表２に示す。トランスジェニック植物は野生型のコントロール植物と比較して、成長速度、開花および種子の収穫量の有意な促進を示した。さらに、トランスジェニック植物は複数の主茎を発達させた、一方、野生型の植物は単数の主茎を発達させた。野生型の植物と比較したＧＰＴトランスジェニックトマト植物の写真を図３に示す。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
＜実施例５：植物体におけるオオムギＧＰＴ導入遺伝子の活性＞
本実施例では、オオムギのＧＰＴの推定コード配列を、植物体への一過性発現アッセイによって導入遺伝子コンストラクトから単離し、発現させた。生物学的に活性な組換えオオムギＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１３７】
オオムギ（Hordeum vulgare）ＧＰＴのコード配列を決定し、合成した。この実施例で用いるオオムギＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１４に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１３８】
オオムギＧＰＴのコード配列を１３０５．１カンビアベクターに挿入し、標準的なエレクトロポレーション法（McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9:155-159）を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株のＬＢＡ４０４に形質転換し、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢプレートに塗り広げた。アグロバクテリウムの抗生物質耐性コロニーを解析のために選択した。
【０１３９】
タバコ葉の一過性発現アッセイは、形質転換したアグロバクテリウム（１．５−２．０ ＯＤ６５０）の懸濁液を、急速に成長するタバコ葉へ注入することから成る。皮内注射は有意な量の葉の表面がアグロバクテリウムにさらされることを確実にするため、葉の表面にわたる格子内で行った。植物を３−５日間生育させて、組織を他の全ての組織抽出で説明したように抽出し、ＧＰＴ活性を測定した。
【０１４０】
接種した葉の組織のＧＰＴ活性（１２１７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）は、コントロール植物の葉の組織で測定した活性（４０７ｎｍｏｌ／ｇＦＷｔ／ｈ）の３倍であり、ダイズ（Hordeum）ＧＰＴコンストラクトはトランスジェニック植物において機能的なＧＰＴを直接発現することができることを示した。
【０１４１】
＜実施例６：組換えイネＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、イネのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えイネＧＰＴが作成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１４２】
〔材料と方法〕
（イネＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
イネ（Oryza sativia）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで成長させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して集菌した。そして、合計２５×１０６個の細胞の生物学的活性に関して、以下のＮＭＲアッセイによって分析した。形質転換していない野生型の大腸菌細胞をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１４３】
本実施例で用いるイネＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１０に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
【０１４４】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161(2): 807-809の変性に続いて、ＨＰＬＣを用いてＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの産生量を測定した。つまり、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ピリドキサルリン酸、１０ｍＭ システインおよび〜１．５％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含む変性抽出バッファーを用いた。サンプル（大腸菌細胞２５×１０６個の溶菌液）を抽出バッファーに約１／３比率（ｗ／ｖ）で加え、３７℃で３０分間インキュベートし、２００μＭの２０％ＴＣＡで停止した。約５分後、アッセイ溶液を遠心分離し、上清を用いて、０．０１Ｎ ｈ２ＳＯ４の移動相、流速約０．２ｍｌ／分、４０℃においてＩＯＮ−３００ ７．８ｍｍ ＩＤ Ｘ ３０ｃｍ Ｌ ｃｏｌｕｍｎを用いたＨＰＬＣにより、２−オキソグルタラメートを定量した。注入量は約２０μｌであり、保持時間はおよそ３８分から３９分である。検出は２１０ｎｍのＵＶ光で行なった。
【０１４５】
標準の２−オキソグルタラメートとのＮＭＲアッセイの比較は、シロイヌナズナの全長配列が、２−オキソグルタラメート合成活性を持つＧＰＴを発現することを立証するために用いた。つまり、アッセイの産物（発現ＧＰＴに対する応答において合成された分子）および標準の２−オキソグルタラメートが同じ保持時間で溶出することを確認することによって、上記のＨＰＬＣアッセイを有効なものとするために、化学的合成により標準の２−オキソグルタラメート（ＮＭＲで確認した構造）を作製した。加えて、アッセイ産物および標準の化合物を共に混合すると単一のピークとして溶出した。さらに、ＨＰＬＣアッセイの有効化は、基質であるグルタミンの消失のモニタリングおよびグルタミンの消費と２−オキソグルタラメートの生成との間に１：１のモル比があることを示すことも含んでいた。分析の工程には常に２つのコントロールを含んでおり、１つは酵素の添加がなく、１つはグルタミンの添加がない。第一に、２−オキソグルタラメートの生成物は酵素の存在に依存することを示し、第二に２−オキソグルタラメートの生成は基質であるグルタミンに依存することを示す。
【０１４６】
（結果）
配列番号１０のイネＧＰＴコード配列の発現は、２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１．７２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えイネＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８６倍の活性レベルの増加がみられた。
【０１４７】
＜実施例７：組換えダイズＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ダイズのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的に活性な組換えダイズＧＰＴが生成され、ＨＰＬＣで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１４８】
（材料と方法）
（ダイズＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
ダイズ（Glycine max）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターを形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１４９】
本実施例で用いるダイズＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１２に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０１５０】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
上記の実施例２０に記載したように、ＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの生成を判定するためにＨＰＬＣを用いた。
【０１５１】
（結果）
配列番号１２のダイズＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的に活性な組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、３１．９ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えダイズＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１６００倍近くの活性レベルの増加がみられた。
【０１５２】
＜実施例８：組換えゼブラフィッシュＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
本実施例では、ゼブラフィッシュのＧＰＴの推定コード配列を単離し、大腸菌で発現させた。生物学的活性のある組換えゼブラフィッシュＧＰＴが作成され、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒した。
【０１５３】
（材料と方法）
（ゼブラフィッシュＧＰＴコード配列および大腸菌における発現）
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）のＧＰＴコード配列を決定し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、下記のＮＭＲアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１５４】
この実施例で用いるゼブラフィッシュＧＰＴのコード配列のＤＮＡ配列を配列番号１６に示し、コードされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
【０１５５】
（２−オキソグルタラメートのＨＰＬＣアッセイ）
上記の実施例２０に記載したように、ＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞における２−オキソグルタラメートの生成を判定するためにＨＰＬＣを用いた。
【０１５６】
（結果）
配列番号１６のゼブラフィッシュＧＰＴコード配列の発現は２−オキソグルタラメート合成触媒の生物学的活性を持つ組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、２８．６ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が組換えゼブラフィッシュＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、１４００倍以上の活性レベルの増加がみられた。
【０１５７】
＜実施例９：トランケートされた組換えシロイヌナズナＧＰＴ遺伝子コード配列の単離および発現ならびに生物学的活性の解析＞
この実施例では、シロイヌナズナのＧＰＴの推定コード配列の異なる２つの断片を構築し、推定される葉緑体のシグナルペプチドが欠失しているまたはトランケートされたＧＰＴタンパク質の活性を評価するために、大腸菌で発現させた。最初の３０個のアミノ末端のアミノ酸残基または最初の４５個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失するようにトランケートされた、シロイヌナズナＧＰＴの全長アミノ酸配列の配列番号１に対応する組換え断片ＧＰＴタンパク質は、無事に発現し、ＮＭＲで確認したところ、２−オキソグルタラメートの増加した合成を触媒する生物学的活性を示した。
【０１５８】
（材料と方法）
（トランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列と大腸菌における発現）
配列番号１のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のＧＰＴコード配列の断片のＤＮＡコード配列を構築し、合成して、ＰＥＴ２８ベクターに導入し、大腸菌で発現させた。本実施例で用いたトランケートされたシロイヌナズナＧＰＴコード配列のＤＮＡ配列を配列番号２０（−４５ＡＡコンストラクト）に示し、対応するトランケートされたＧＰＴタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。つまり、大腸菌細胞を発現ベクターにより形質転換し、ＬＢ培養液で一晩培養した形質転換体を希釈し、ＯＤ０．４まで培養して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクシド（０．４μＭ）で誘導して発現させ、３時間培養して、集菌した。合計２５×１０６個の細胞により、実施例２０に記載したように、ＨＰＬＣアッセイを用いて生物学的活性を分析した。形質転換していない野生型の大腸菌をコントロールとして分析した。追加のコントロールには、空のベクターで形質転換した大腸菌細胞を用いた。
【０１５９】
配列番号２０のトランケートされた−４５のシロイヌナズナＧＰＴコード配列の発現は、生物学的活性（２−オキソグルタラメートの合成を触媒する生物学的活性）を持つ、組換えＧＰＴタンパク質の過剰発現という結果になった。特に、１６．１ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性がトランケートされた−４５のＧＰＴを過剰発現している大腸菌細胞においてみられ、コントロールの大腸菌細胞における、わずか０．０２ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性に比べて、８００倍以上の活性レベルの増加がみられた。比較として、同じＥ．ｃｏｌｉで発現するシロイヌナズナ遺伝子の全長コード配列では、２．８ｎｍｏｌの２−オキソグルタラメートの活性が生じ、トランケートされた組換えＧＰＴタンパク質のおよそ１／５の活性がみられた。
【０１６０】
この明細書中で引用されている全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物または特許出願が参照として組み込まれると明確におよび個々に表示されているように、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
この発明は本明細書で明らかにされた具体例によって範囲を限定されるものではなく、具体例は発明の個々の態様の一例とする意図であり、機能的に同等のものはいずれも発明の範囲内である。本明細書に記載されたもの加えて、発明のモデルおよび方法の様々な変更が前記の説明および手引きから、当業者にとって明白になるであろうし、同様に発明の範囲に含まれることを意図する。そのような変更または他の具体例は、発明の正当な範囲および趣旨から離れることなく実施され得る。
【０１６２】
〔配列表〕
【０１６３】
【表４】
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
【表６】
【０１６６】
【表７】
【０１６７】
【表８】
【０１６８】
【表９】
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
【表１１】
【０１７１】
【表１２】
【０１７２】
【表１３】
【０１７３】
【表１４】
【０１７４】
【表１５】
【０１７５】
【表１６】
【０１７６】
【表１７】
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
【表１９】
【０１７９】
【表２０】
【０１８０】
【表２１】
【０１８１】
【表２２】
【０１８２】
【表２３】
【０１８３】
【表２４】
【０１８４】
【表２５】
【０１８５】
【表２６】
【０１８６】
【表２７】
【０１８７】
【表２８】
【０１８８】
【表２９】
【０１８９】
【表３０】
【０１９０】
【表３１】
【０１９１】
【表３２】
【０１９２】
【表３３】
【０１９３】
【表３４】
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】窒素吸収および２−オキソグルタラメート化学合成の概略的な代謝経路を示す図である。
【図２】野生型のタバコ植物に対して、ＧＰＴを過剰発現しているトランスジェニックタバコ植物の比較を示す写真である。
【図３】野生型のトマト植物に対してＧＰＴを過剰に発現するトランスジェニックミクロトームトマト植物の比較を示す写真である。
【図４】野生型のタバコ植物（上の葉）とＧＰＴトランスジェニックのタバコ植物（下の葉）との葉の大きさの比較を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物プロモーターに対して操作可能に結合されているＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、トランスジェニック植物。
【請求項２】
上記ＧＰＴ導入遺伝子は、
（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列、ならびに、
（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％同一であり、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
上記ＧＰＴ導入遺伝子は植物のゲノムに取り込まれている、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
単子葉植物である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
双子葉植物である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
請求項３に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の子孫であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、子孫。
【請求項７】
請求項３に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の種子であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、種子。
【請求項８】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長速度を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたバイオマス収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された種子の収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された花または花芽の収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された果実またはさやの収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して大型の葉を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＰＴ活性を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＳ活性を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して向上された窒素利用効率を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長特性を有する植物を生産する方法であって、
（ａ）植物にＧＰＴ導入遺伝子を導入して、発現させる工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を含まない同一種の植物と比較して増大された成長特性を有する植物を選抜する工程と、
を包含する方法。
【請求項１９】
上記増大された成長特性は、増大されたバイオマス、早期の開花、早期の発芽、増大された草高、増大された開花、増大された発芽、大型の葉、増大された果実またはさやの収量、および増大された種子の収量からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して向上された窒素利用効率を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）植物にＧＰＴ導入遺伝子を導入し、発現させる工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を含まない同一種の植物と比較して増大された窒素利用効率を有する植物を選抜する工程と、
を包含する方法。
【請求項２１】
種子から植物を繁殖させた後、当該植物から種子を選抜して収穫する工程をさらに包含する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
植物プロモーターに対して操作可能に結合されているＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、トランスジェニック植物。
【請求項２】
上記ＧＰＴ導入遺伝子は、
（ａ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列、ならびに、
（ｂ）配列番号２、配列番号９、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のいずれか１つと少なくとも７５％同一であり、かつ、ＧＰＴ活性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
上記ＧＰＴ導入遺伝子は植物のゲノムに取り込まれている、請求項１または２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
単子葉植物である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
双子葉植物である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
請求項３に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の子孫であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、子孫。
【請求項７】
請求項３に記載のトランスジェニック植物の任意の世代の種子であって、
上記ＧＰＴ導入遺伝子を含んでいる、種子。
【請求項８】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長速度を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたバイオマス収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された種子の収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された花または花芽の収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された果実またはさやの収量を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して大型の葉を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＰＴ活性を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大されたＧＳ活性を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増大された２−オキソグルタラメートのレベルを示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して向上された窒素利用効率を示す、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して増強された成長特性を有する植物を生産する方法であって、
（ａ）植物にＧＰＴ導入遺伝子を導入して、発現させる工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を含まない同一種の植物と比較して増大された成長特性を有する植物を選抜する工程と、
を包含する方法。
【請求項１９】
上記増大された成長特性は、増大されたバイオマス、早期の開花、早期の発芽、増大された草高、増大された開花、増大された発芽、大型の葉、増大された果実またはさやの収量、および増大された種子の収量からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
類似の野生型植物または非形質転換植物と比較して向上された窒素利用効率を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）植物にＧＰＴ導入遺伝子を導入し、発現させる工程と、
（ｂ）ＧＰＴ導入遺伝子を含まない同一種の植物と比較して増大された窒素利用効率を有する植物を選抜する工程と、
を包含する方法。
【請求項２１】
種子から植物を繁殖させた後、当該植物から種子を選抜して収穫する工程をさらに包含する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５０１１９０（Ｐ２０１２−５０１１９０Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５２７７（Ｐ２０１１−５２５２７７）
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５５５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５４６５
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１１０５３６９８）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，リミテッド ライアビリティー カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＥＣＵＲＩＴＹ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬＣ／ＩＰ−ＭＳ Ａ１８７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ ８７５４５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１０５３７１３）ユニバーシティ オブ メイン システム ボード オブ トラスティーズ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＡＩＮＥ ＳＹＳＴＥＭ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ
【住所又は居所原語表記】１６ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂａｎｇｏｒ，Ｍａｉｎｅ ０４４０１，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５５５５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５４６５
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５１１０５３６９８）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，リミテッド ライアビリティー カンパニー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＬＯＳ ＡＬＡＭＯＳ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＥＣＵＲＩＴＹ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬＣ／ＩＰ−ＭＳ Ａ１８７，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ ８７５４５，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５１１０５３７１３）ユニバーシティ オブ メイン システム ボード オブ トラスティーズ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＡＩＮＥ ＳＹＳＴＥＭ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ
【住所又は居所原語表記】１６ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂａｎｇｏｒ，Ｍａｉｎｅ ０４４０１，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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